JPWO2015056804A1 - 効率的な人工多能性幹細胞の樹立方法 - Google Patents
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Abstract
Description
しかしながら、iPS細胞の樹立効率は未だに十分とは言えず、また、多くの初期化細胞が十分な初期化を達成できない理由も明らかとなっていない。
(1)人工多能性幹細胞の樹立効率の改善方法であって、体細胞の核初期化工程においてSTAT1の機能を阻害することを含む、方法、
(2)STAT1の化学的阻害物質を体細胞に接触させることによりSTAT1の機能を阻害する、(1)に記載の方法、
(3)前記阻害物質がEGC(epigallocatechin)である、(2)に記載の方法、
(4)STAT1に対するsiRNA、shRNAおよびそれらをコードするDNAからなる群より選択される核酸を体細胞に接触させることによりSTAT1の機能を阻害する、(1)に記載の方法、
(5)STAT1の機能阻害物質を含有してなる、人工多能性幹細胞の樹立効率改善剤、
(6)前記阻害物質がSTAT1の化学的阻害物質である、(5)に記載の剤、
(7)前記阻害物質がEGC(epigallocatechin)である、(6)に記載の剤、
(8)前記阻害物質がSTAT1に対するsiRNA、shRNAおよびそれらをコードするDNAからなる群より選択される核酸である、(5)に記載の剤、
(9)体細胞に核初期化物質およびSTAT1の機能阻害物質を接触させることを含む、人工多能性幹細胞の製造方法、
(10)前記阻害物質が化学的阻害物質である、(9)に記載の方法、
(11)前記阻害物質がEGC(epigallocatechin)である、(10)に記載の方法、
(12)前記阻害物質がSTAT1に対するsiRNA、shRNAおよびそれらをコードするDNAからなる群より選択される核酸である、(9)に記載の方法、
(13)核初期化物質がOct3/4、KlfファミリーメンバーおよびSoxファミリーメンバー、またはそれらをコードする核酸を含み、当該Klfファミリーメンバーが、Klf1、Klf2、Klf4またはKlf5、好ましくはKlf2またはKlf4であり、当該Soxファミリーメンバーが、Sox1、Sox2、Sox3、Sox15、Sox17またはSox18、好ましくはSox1、Sox2、Sox3、Sox15またはSox17である、(9)〜(12)のいずれかに記載の方法、および
(14)核初期化物質がさらにMycファミリーメンバー、またはそれをコードする核酸を含み、当該Mycファミリーメンバーが、c-Myc、c-MycT58A(活性型変異体)、N-MycまたはL-Mycである、(13)に記載の方法。
STAT1の機能を阻害する手段は特に制限されないが、好ましくは、体細胞にSTAT1の機能阻害物質を接触させる方法が挙げられる。
本発明においてiPS細胞作製のための出発材料として用いることのできる体細胞は、哺乳動物(例えば、ヒト、マウス、サル、ウシ、ブタ、ラット、イヌ等)由来の生殖細胞以外のいかなる細胞であってもよく、例えば、角質化する上皮細胞(例えば、角質化表皮細胞)、粘膜上皮細胞(例えば、舌表層の上皮細胞)、外分泌腺上皮細胞(例えば、乳腺細胞)、ホルモン分泌細胞(例えば、副腎髄質細胞)、代謝・貯蔵用の細胞(例えば、肝細胞)、境界面を構成する内腔上皮細胞(例えば、I型肺胞細胞)、内鎖管の内腔上皮細胞(例えば、血管内皮細胞)、運搬能をもつ繊毛のある細胞(例えば、気道上皮細胞)、細胞外マトリックス分泌用細胞(例えば、線維芽細胞)、収縮性細胞(例えば、平滑筋細胞)、血液と免疫系の細胞(例えば、Tリンパ球)、感覚に関する細胞(例えば、桿細胞)、自律神経系ニューロン(例えば、コリン作動性ニューロン)、感覚器と末梢ニューロンの支持細胞(例えば、随伴細胞)、中枢神経系の神経細胞とグリア細胞(例えば、星状グリア細胞)、色素細胞(例えば、網膜色素上皮細胞)、およびそれらの前駆細胞(組織前駆細胞)等が挙げられる。細胞の分化の程度や細胞を採取する動物の齢などに特に制限はなく、未分化な前駆細胞(体性幹細胞も含む)であっても、最終分化した成熟細胞であっても、同様に本発明における体細胞の起源として使用することができる。ここで未分化な前駆細胞としては、例えば、神経幹細胞、造血幹細胞、間葉系幹細胞、歯髄幹細胞等の組織幹細胞(体性幹細胞)が挙げられる。
本明細書において「STAT1の機能阻害物質」とは、(1)STAT1タンパク質の機能もしくは(2)STAT1遺伝子の発現を阻害し得る限り、いかなる物質であってもよい。すなわち、STAT1タンパク質に直接作用してその機能を阻害する物質や、STAT1遺伝子に直接作用してその発現を阻害する物質のみならず、STAT1のシグナル伝達に関与する因子に作用することにより、結果的にSTAT1タンパク質の機能やSTAT1遺伝子の発現を阻害する物質も、本明細書における「STAT1の機能阻害物質」に含まれる。
本明細書において「化学的阻害物質」とは、アンチセンス効果、RNA干渉、リボザイム作用などによる発現阻害や、抗原抗体反応、ドミナントネガティブ効果などによる機能阻害を含む、生物学的作用を介して阻害効果を発揮する物質以外の阻害物質を意味し、典型的には、非タンパク性かつ非核酸性の低分子阻害物質である。本発明で使用しうる「STAT1の化学的阻害物質」としては、(2R,3S,4S,5R)-2-(6-amino-2-fluoro-9H-purin-9-yl)-5-(hydroxymethyl)-tetrahydrofuran-3,4-diol(別名、Fludarabine);peptidomimetics (Gunning PT, et al., Bioorg Med Chem Lett, 17(7):1875-8 (2007));4-(3'-bromo-4'-hydroxylphenyl)-amino-6,7-dimethoxyquinazoline(WHI-P154)(Sareila O et al., Int Immunopharmacol., 8(1):100-8 (2008);Outi Sareila, et al., Mediators Inflamm., (2):16161 (2006));α-Cyano-(3,4-dihydroxy)-N-benzylcinnamide (AG-490 (別名、Tyrphostin B42))(Outi Sareila, et al., Mediators Inflamm., (2):16161 (2006));カテキン類[例えば、epigallocatechin (EGC) (本明細書においては、特にことわらない限り、フリー体およびエステル体(例えば、epigallocatechin gallate (EGCG))を包含する意味で用いる。) (Paul A. Townsend, et al., FASEB J., 18(13):1621-3 (2004); Menegazzi M. et al., FASEB J., 15(7):1309-11(2001))]などが挙げられるが、これらに限定されない。好ましくは、EGCである。これらは市販されており、例えば、EGCは、Sigma‐aldrich(E4143)などから入手可能である。
STAT1は通常転写アクチベーター活性を有するが、本明細書において「STAT1のドミナントネガティブ変異体」は、体細胞に内在する野生型STAT1タンパク質と競合的に作用して、その機能を阻害する限り、いかなる物質であってもよい。例えば、ヒトおよびマウスにおけるSTAT1のリン酸化部位である727位のセリンをアラニンに点変異させたSTAT1S727Aなどが挙げられる(Zilong Wen, et al., Cell, 82(2):241-50 (1995))。
その他、エレクトロポレーション法、セミインタクトセル法(Kano, F. et al. Methods in Molecular Biology, Vol. 322, 357-365(2006))、Wr-t ペプチドによる導入法(Kondo, E. et al., Mol. Cancer Ther. 3(12), 1623-1630(2004))などのタンパク質導入法も用いることができる。
しかしながら、体細胞への導入の容易さを考慮すると、STAT1のドミナントネガティブ変異体は、タンパク質自体としてよりも、それをコードする核酸の形態で用いることがむしろ好ましい。したがって、本発明の別の好ましい実施態様において、STAT1機能阻害物質は、STAT1のドミナントネガティブ変異体をコードする核酸である。該核酸はDNAであってもRNAであってもよく、あるいはDNA/RNAキメラであってもよいが、好ましくはDNAである。また、該核酸は二本鎖であっても、一本鎖であってもよい。STAT1のドミナントネガティブ変異体をコードするcDNAは、該変異体タンパク質の作製について上記した手法によりクローニングすることができる。
尚、アデノウイルスやプラスミドを用いる場合でも、導入遺伝子が染色体に組み込まれることがあるので、結局はサザンブロットやPCRにより染色体への遺伝子挿入がないことを確認する必要がある。そのため、上記Cre-loxPシステムのように、いったん染色体に導入遺伝子を組み込んだ後に、該遺伝子を除去する手段を用いることは好都合であり得る。別の好ましい一実施態様においては、トランスポゾンを用いて染色体に導入遺伝子を組み込んだ後に、プラスミドベクターもしくはアデノウイルスベクターを用いて細胞に転移酵素を作用させ、導入遺伝子を完全に染色体から除去する方法が用いられ得る。好ましいトランスポゾンとしては、例えば、鱗翅目昆虫由来のトランスポゾンであるpiggyBac等が挙げられる。piggyBacトランスポゾンを用いる具体的手段は、Kaji, K. et al., Nature, 458: 771-775 (2009)、Woltjen et al., Nature,458: 766-770 (2009) に開示されている。
該エピソーマルベクターとしては、例えば、EBV、SV40等に由来する自律複製に必要な配列をベクター要素として含むベクターが挙げられる。自律複製に必要なベクター要素としては、具体的には、複製開始点と、複製開始点に結合して複製を制御するタンパク質をコードする遺伝子であり、例えば、EBVにあっては複製開始点oriPとEBNA-1遺伝子、SV40にあっては複製開始点oriとSV40 large T antigen遺伝子が挙げられる。
また、エピソーマル発現ベクターは、STAT1ドミナントネガティブ変異体をコードする核酸の転写を制御するプロモーターを含む。該プロモーターとしては、前記と同様のプロモーターが用いられ得る。また、エピソーマル発現ベクターは、前記と同様に、所望によりエンハンサー、ポリA付加シグナル、選択マーカー遺伝子などをさらに含有していてもよい。選択マーカー遺伝子としては、例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、ピューロマイシン耐性遺伝子等が挙げられる。
エピソーマルベクターは、例えばリポフェクション法、リポソーム法、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム共沈殿法、DEAEデキストラン法、マイクロインジェクション法、遺伝子銃法などを用いて該ベクターを細胞に導入することができる。具体的には、例えばScience, 324: 797-801 (2009)等に記載される方法を用いることができる。
iPS細胞から導入遺伝子の複製に必要なベクター要素が除去されたか否かの確認は、該ベクター要素内部および/またはloxP配列近傍の塩基配列を含む核酸をプローブまたはプライマーとして用い、該iPS細胞から単離したエピソーム画分を鋳型としてサザンブロット分析またはPCR分析を行い、バンドの有無または検出バンドの長さを調べることにより実施することができる。エピソーム画分の調製は当該分野で周知の方法と用いて行えばよく、例えば、Science, 324: 797-801 (2009)等に記載される方法を用いることができる。
ここでSTAT1経路とは、STAT1を活性化し得るあらゆる上流のシグナル伝達パスウェイおよび活性化STAT1によって媒介されるあらゆる下流のシグナル伝達パスウェイを包含する意味で用いられる。したがって、STAT1経路阻害物質には、上記シグナル伝達パスウェイのいずれかまたは両方を阻害するいかなる物質も含まれる。
STAT1タンパク質の機能を阻害するその他の物質として、例えば、抗STAT1アンタゴニスト抗体もしくはそれをコードする核酸が挙げられる。抗STAT1アンタゴニスト抗体はポリクローナル抗体、モノクローナル抗体の何れであってもよい。抗体のアイソタイプは特に限定されないが、好ましくはIgG、IgMまたはIgA、特に好ましくはIgGが挙げられる。また、該抗体は、完全抗体分子の他、例えばFab、Fab'、F(ab’)2等のフラグメント、scFv、scFv-Fc、ミニボディー、ダイアボディー等の遺伝子工学的に作製されたコンジュゲート分子、あるいはポリエチレングリコール(PEG)等の蛋白質安定化作用を有する分子等で修飾されたそれらの誘導体などであってもよい。抗STAT1アンタゴニスト抗体は、STAT1またはその部分ペプチドを抗原として用い、自体公知の抗体または抗血清の製造法に従って製造することができる。また、公知の抗STAT1アンタゴニスト抗体として、例えば、sc-464、sc-346(Santa Cruz Biotechnology)、#9172(Cell Signaling Technology)等が挙げられる。抗STAT1アンタゴニスト抗体をコードする核酸は、抗STAT1モノクローナル抗体産生ハイブリドーマから常法により単離することができる。得られるH鎖及びL鎖遺伝子を連結して単鎖抗体をコードする核酸を作製することもできる。
STAT1に対するsiRNAは、下記のNCBI accession numbersで示されたマウスまたはヒトの各STAT1 cDNA配列情報に基づいて、例えば、Elbashirら(Genes Dev., 15, 188-200 (2001))の提唱する規則に従って設計することができる。
マウス ヒト
NM_001205313.1 NM_007315.3
NM_001205314.1 NM_139266.2
NM_009283.4
siRNAを発現するベクターには、タンデムタイプとステムループ(ヘアピン)タイプとがある。前者はsiRNAのセンス鎖の発現カセットとアンチセンス鎖の発現カセットをタンデムに連結したもので、細胞内で各鎖が発現してアニーリングすることにより2本鎖のsiRNA(dsRNA)を形成するというものである。一方、後者はshRNAの発現カセットをベクターに挿入したもので、細胞内でshRNAが発現しdicerによるプロセシングを受けてdsRNAを形成するというものである。プロモーターとしては、polII系プロモーター(例えば、CMV前初期プロモーター)を使用することもできるが、短いRNAの転写を正確に行わせるために、polIII系プロモーターを使用するのが一般的である。polIII系プロモーターとしては、マウスおよびヒトのU6-snRNAプロモーター、ヒトH1-RNase P RNAプロモーター、ヒトバリン-tRNAプロモーターなどが挙げられる。また、転写終結シグナルとして4個以上Tが連続した配列が用いられる。
STAT1遺伝子の発現を阻害する他の物質として、STAT1に対するアンチセンス核酸やリボザイムが挙げられる。
本発明において「核初期化物質」とは、体細胞に導入することにより該体細胞からiPS細胞を誘導することができる物質(群)であれば、タンパク性因子またはそれをコードする核酸(ベクターに組み込まれた形態を含む)、あるいは低分子化合物等のいかなる物質から構成されてもよい。核初期化物質がタンパク性因子またはそれをコードする核酸の場合、好ましくは以下の組み合わせが例示される(以下においては、タンパク性因子の名称のみを記載する)。
(1) Oct3/4, Klf4, c-Myc
(2) Oct3/4, Klf4, c-Myc, Sox2(ここで、Sox2はSox1, Sox3, Sox15, Sox17またはSox18、好ましくはSox1, Sox3, Sox15または Sox17、より好ましくはSox1またはSox3で置換可能である。また、Klf4はKlf1, Klf2またはKlf5、好ましくはKlf2で置換可能である。さらに、c-MycはT58A(活性型変異体), N-Myc, L-Mycで置換可能である。)
(3) Oct3/4, Klf4, c-Myc, Sox2, Fbx15, Nanog, Eras, ECAT15-2, TclI, β-catenin (活性型変異体S33Y)
(4) Oct3/4, Klf4, c-Myc, Sox2, TERT, SV40 Large T antigen(以下、SV40LT)
(5) Oct3/4, Klf4, c-Myc, Sox2, TERT, HPV16 E6
(6) Oct3/4, Klf4, c-Myc, Sox2, TERT, HPV16 E7
(7) Oct3/4, Klf4, c-Myc, Sox2, TERT, HPV6 E6, HPV16 E7
(8) Oct3/4, Klf4, c-Myc, Sox2, TERT, Bmil
(以上、WO 2007/069666を参照(但し、上記(2)の組み合わせにおいて、Sox2からSox18への置換、Klf4からKlf1もしくはKlf5への置換については、Nature Biotechnology, 26, 101-106 (2008)を参照)。「Oct3/4, Klf4, c-Myc, Sox2」の組み合わせについては、Cell, 126, 663-676 (2006)、Cell, 131, 861-872 (2007) 等も参照。「Oct3/4, Klf2(またはKlf5), c-Myc, Sox2」の組み合わせについては、Nat. Cell Biol., 11, 197-203 (2009)も参照。「Oct3/4, Klf4, c-Myc, Sox2, hTERT, SV40LT」の組み合わせについては、Nature, 451, 141-146 (2008)も参照。)
(9) Oct3/4, Klf4, Sox2(Nature Biotechnology, 26, 101-106 (2008)を参照)(ここで、Sox2はSox1, Sox3, Sox15, Sox17またはSox18で置換可能である。また、Klf4はKlf1, Klf2またはKlf5で置換可能である。)
(10) Oct3/4, Sox2, Nanog, Lin28(Science, 318, 1917-1920 (2007)を参照)
(11) Oct3/4, Sox2, Nanog, Lin28, hTERT, SV40LT(Stem Cells, 26, 1998-2005 (2008)を参照)
(12) Oct3/4, Klf4, c-Myc, Sox2, Nanog, Lin28(Cell Research (2008) 600-603を参照)
(13) Oct3/4, Klf4, c-Myc, Sox2, SV40LT(Stem Cells, 26, 1998-2005 (2008)も参照)
(14) Oct3/4, Klf4(Nature 454:646-650 (2008)、Cell Stem Cell, 2:525-528(2008)を参照)
(15) Oct3/4, c-Myc(Nature 454:646-650 (2008)を参照)
(16) Oct3/4, Sox2 (Nature, 451, 141-146 (2008), WO2008/118820を参照)
(17) Oct3/4, Sox2, Nanog (WO2008/118820を参照)
(18) Oct3/4, Sox2, Lin28 (WO2008/118820を参照)
(19) Oct3/4, Sox2, c-Myc, Esrrb (ここで、EsrrbはEsrrgで置換可能である。Nat. Cell Biol., 11, 197-203 (2009) を参照)
(20) Oct3/4, Sox2, Esrrb (Nat. Cell Biol., 11, 197-203 (2009) を参照)
(21) Oct3/4, Klf4, L-Myc
(22) Oct3/4, Nanog
(23) Oct3/4 (Cell 136: 411-419 (2009)、Nature, 08436, doi:10.1038 published online(2009))
(24) Oct3/4, Klf4, c-Myc, Sox2, Nanog, Lin28, SV40LT(Science, 324: 797-801 (2009)を参照)
(25) Oct3/4, Sox2, Klf4, L-Myc, Lin28
(26) Oct3/4, Sox2, Klf4, L-Myc, Lin28, Glis1
遺伝子名 マウス ヒト
L-Myc NM_008506 NM_001033081
Lin28 NM_145833 NM_024674
Lin28b NM_001031772 NM_001004317
Esrrb NM_011934 NM_004452
Esrrg NM_011935 NM_001438
Glis1 NM_147221 NM_147193
上記STAT1の機能阻害物質に加え、公知の他の樹立効率改善物質を体細胞に接触させることにより、iPS細胞の樹立効率をより高めることが期待できる。
前記で核酸性の発現阻害剤はsiRNAもしくはshRNAをコードするDNAを含む発現ベクターの形態であってもよい。
体細胞の核初期化工程において低酸素条件下で細胞を培養することにより、iPS細胞の樹立効率をさらに改善することができる。本明細書において「低酸素条件」とは、細胞を培養する際の雰囲気中の酸素濃度が、大気中のそれよりも有意に低いことを意味する。具体的には、通常の細胞培養で一般的に使用される5-10% CO2/95-90%大気の雰囲気中の酸素濃度よりも低い酸素濃度の条件が挙げられ、例えば雰囲気中の酸素濃度が18%以下の条件が該当する。好ましくは、雰囲気中の酸素濃度は15%以下(例、14%以下、13%以下、12%以下、11%以下など)、10%以下(例、9%以下、8%以下、7%以下、6%以下など)、または5%以下(例、4%以下、3%以下、2%以下など)である。また、雰囲気中の酸素濃度は、好ましくは0.1%以上(例、0.2%以上、0.3%以上、0.4%以上など)、0.5%以上(例、0.6%以上、0.7%以上、0.8%以上、0.95以上など)、または1%以上(例、1.1%以上、1.2%以上、1.3%以上、1.4%以上など)である。
ヒトの皮膚由来線維芽細胞(HDF 1616株)に対して、Takahashi, K.ら, Cell, 131: 861-872 (2007) に記載の方法に従い、レンチウイルス (pLenti6/UbC-Slc7a1) を用いて、マウスエコトロピックウイルスレセプターSlc7a1遺伝子を発現させた。この細胞を0.1% ゼラチン (Sigma) でコートした6 well培養プレート (Falcon) の各wellに、1 well当り1.0 x 105細胞で播種した。翌日、Takahashi, K.ら, Cell, 131: 861-872 (2007) に記載の方法に従い、ヒト由来の4遺伝子(Oct3/4, Klf4, Sox2, c-Myc)をレトロウイルスで導入した。続いて、感染2日目に、Lipofectamine RNAiMax (Invitrogen)を用いて、STAT1に対するsiRNAを導入した。STAT1に対するsiRNA としては、Invitrogen社から購入した、Invitrogen Stealth RNAiTM siRNA、oligo ID: HSS110273またはHSS186128を用いた。陰性対照として、非特異的siRNA(Sicontrol; Stealth RNAiTMsiRNA Negative Control, Med GC、製品番号12935-300(Invitrogen)より購入)を導入した。得られた細胞を感染4日目に、あらかじめフィーダー細胞を播いておいた100 mmディッシュに2.0 x 105細胞で播種した。
感染16日目(4遺伝子の導入から16日目)にiPS細胞コロニー数を測定した結果を図1および2に示す。4遺伝子の導入において、それぞれのsiRNAによりSTAT1を阻害することで、Sicontrol(対照)群と比較して有意にヒトiPS細胞コロニー数が増大することが確認された。
ヒトの皮膚由来線維芽細胞(HDF 1616株)に対して、Takahashi, K.ら, Cell, 131: 861-872 (2007) に記載の方法に従い、レンチウイルス (pLenti6/UbC-Slc7a1) を用いて、マウスエコトロピックウイルスレセプターSlc7a1遺伝子を発現させた。この細胞を0.1% ゼラチン (Sigma) でコートした6 well培養プレート (Falcon) の各wellに、1 well当り1.0 x 105細胞で播種した。翌日、Takahashi, K.ら, Cell, 131: 861-872 (2007) に記載の方法に従い、ヒト由来の4遺伝子(Oct3/4, Sox2, Klf4, c-Myc)をレトロウイルスで導入し、感染4日目に、あらかじめフィーダー細胞を播いておいた100 mmディッシュに2.0 x 105細胞で播種した。STAT1阻害剤の作用効果を検討するため、感染5日目から24日目まで、EGC(epigallocatechin)(Sigma‐aldrich, E4143)のDMSO溶液をEGC濃度が10μMとなるように添加した培地中で細胞を培養し、DMSOのみを添加した場合と樹立効率の比較検討を行った。
感染24日目(4遺伝子の導入から24日目)にiPS細胞コロニー数を測定した結果を図3に示す。4遺伝子の導入において、EGC(epigallocatechin)を添加することで、DMSO(対照)群と比較して有意にヒトiPS細胞コロニー数が増大することが確認された。
ここで述べられた特許および特許出願明細書を含む全ての刊行物に記載された内容は、ここに引用されたことによって、その全てが明示されたと同程度に本明細書に組み込まれるものである。
Claims (14)
- 人工多能性幹細胞の樹立効率の改善方法であって、体細胞の核初期化工程においてSTAT1の機能を阻害することを含む、方法。
- STAT1の化学的阻害物質を体細胞に接触させることによりSTAT1の機能を阻害する、請求項1に記載の方法。
- 前記阻害物質がEGC(epigallocatechin)である、請求項2に記載の方法。
- STAT1に対するsiRNA、shRNAおよびそれらをコードするDNAからなる群より選択される核酸を体細胞に接触させることによりSTAT1の機能を阻害する、請求項1に記載の方法。
- STAT1の機能阻害物質を含有してなる、人工多能性幹細胞の樹立効率改善剤。
- 前記阻害物質がSTAT1の化学的阻害物質である、請求項5に記載の剤。
- 前記阻害物質がEGC(epigallocatechin)である、請求項6に記載の剤。
- 前記阻害物質がSTAT1に対するsiRNA、shRNAおよびそれらをコードするDNAからなる群より選択される核酸である、請求項5に記載の剤。
- 体細胞に核初期化物質およびSTAT1の機能阻害物質を接触させることを含む、人工多能性幹細胞の製造方法。
- 前記阻害物質が化学的阻害物質である、請求項9に記載の方法。
- 前記阻害物質がEGC(epigallocatechin)である、請求項10に記載の方法。
- 前記阻害物質がSTAT1に対するsiRNA、shRNAおよびそれらをコードするDNAからなる群より選択される核酸である、請求項9に記載の方法。
- 核初期化物質がOct3/4、KlfファミリーメンバーおよびSoxファミリーメンバー、またはそれらをコードする核酸を含み、当該Klfファミリーメンバーが、Klf1、Klf2、Klf4またはKlf5であり、当該Soxファミリーメンバーが、Sox1、Sox2、Sox3、Sox15、Sox17またはSox18である、請求項9〜12のいずれか1項に記載の方法。
- 核初期化物質がさらにMycファミリーメンバー、またはそれをコードする核酸を含み、当該Mycファミリーメンバーが、c-Myc、c-MycT58A(活性型変異体)、N-MycまたはL-Mycである、請求項13に記載の方法。
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