WO2015055900A2 - Procédé et dispositif de mesure optique - Google Patents

Procédé et dispositif de mesure optique Download PDF

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WO2015055900A2
WO2015055900A2 PCT/FR2014/000220 FR2014000220W WO2015055900A2 WO 2015055900 A2 WO2015055900 A2 WO 2015055900A2 FR 2014000220 W FR2014000220 W FR 2014000220W WO 2015055900 A2 WO2015055900 A2 WO 2015055900A2
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Gabriel Y Sirat
Lionel Moisan
Clement FALLET
Julien CARON
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Bioaxial Sas
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Definitions

  • the present invention relates to a method and an optical measuring device. It finds applications in all fields of imaging, in particular but not limited to the field of Microscopy, including but not limited to the fields of Biology, Medicine, Pharmacy, Semiconductors, Study. materials, metrology, control, measurement and observation, and all information acquisition processes from optical observations, in the macroscopic or microscopic domain.
  • An Optical Microscope is an optical instrument typically used to view, analyze, or measure objects that are too small to be viewed by the naked eye.
  • optical diffraction limit optical diffraction limit
  • Rayleigh criterion Rayleigh criterion
  • Airy disc and its radius and diameter.
  • super-resolution superrésolu
  • imaging of super-resolution and super-resolution microscopy to describe the acquisition of optical data, imaging, microscopy or artificial vision, to a higher resolution the optical diffraction limit.
  • fluorescence and for fluorophores.
  • Optical Microscopy consists of the illumination, by a light source, not shown, using a Microscope, 10, of a biological or non-biological sample, 1 1, and the measurement as a function of time, using a visual observation or a detection module, 12, light emitted, re-emitted, scattered or reflected or transmitted by the sample.
  • the sample consists of one - or a plurality - of different biological object entities, 13 and 14, positioned at different positions. Examples of such objects are, among others, a cell, a virus, a protein and a DNA fragment.
  • the artificial sample can be, for example, a semiconductor element
  • Microscopy is segmented into different modalities with different characteristics and purposes. Numerous descriptions of the various modalities, their characteristics and their advantages exist extensively in the literature and can be found for example on the web of the Zeiss, Leica, Nikon or Olympus companies.
  • one of them is to distinguish the modes of Microscopy devolving to visualize tiny point sources of those devolved to measure continuous objects.
  • the case of tiny point sources is a priori much simpler.
  • the object consists of a small number of luminous points; these can be described by a small number of parameters - the descriptors defined later - greatly simplifying the physical problem and the algorithmic complexity.
  • the case of a continuous object, described by a spatial distribution - or spatio-temporal, if one takes into account the continuous dynamics, is different and is also described in this patent application.
  • Fluorescence microscopy is one of the modalities of microscopy; in many applications it has replaced other microscopy techniques.
  • a fluorescence microscope is an optical microscope used to study the properties of objects, or organic or inorganic substances using fluorescence phenomena instead of, or in addition to other modalities such as reflection and absorption.
  • the sample is illuminated by light of wavelength, or specific wavelengths, which is absorbed by the point sources, thereby inducing light emission at different wavelengths and higher.
  • the illumination light is separated from the emitted fluorescence, which is lower, by the use of a spectral emission filter.
  • Fluorescence microscopy studies light emitted by small point sources, fluorophores. However, when the density of the fluorophores is high, the fluorophores are no longer analyzed individually but treated as a continuous object. It is important to note at this stage that the same system allows the observation of continuous objects, and is not limited to the observation of point sources.
  • Fluorophores have become an important tool in the visualization of biological objects. Activity and biological information including details above the 200 nm resolution limit are systematically visualized and measured using fluorescence microscopy. This resolution limit is derived from the Rayleigh criterion, which in the best case reaches 200nm in specially designed systems.
  • optical techniques including fluorescence microscopy, are unable to visualize details smaller than the Rayleigh criterion, the order of 200 nm.
  • the main implementations of fluorescence microscopy are the confocal microscope, often used in a scanning or rotating disk configuration and the large-field imaging microscope.
  • FIG. 2 is a simplified representation of a confocal fluorescence microscope of the prior art 200.
  • FIG. 2 A confocal fluorescence microscope, FIG. 2, is an optical instrument. Its main hardware components are shown in the figure. 2. They include:
  • the light source, 20, which may be an arc lamp or a laser, creates light energy necessary for fluorescence.
  • the optomechanical frame is the support for all optical elements and includes auxiliary optics and alignment capabilities. It also includes optical elements, not shown, capable of shaping the beam, to allow its focusing of a point of minimum size, by means of the objective of the microscope.
  • It may also comprise, in a confocal scanning fluorescence microscope, a scan mechanism, spatial or angular, not shown to modify the position of the point source with respect to the object to be measured.
  • the scanning mechanism can alternatively:
  • optically scanning the beam on the object for example using a set of galvanometric mirrors or acousto-optical translators, or using any combination of these translational means, mechanical or optical.
  • the information is collected point-to-point, using the scanning mechanism.
  • It may also comprise, in a confocal microscope of rotating disc fl uorescence, a rotating disk, comprising a plurality of microscopic holes, allowing the simultaneous projection of a plurality of points.
  • a confocal microscope of " rotating disk fluorescence a set of points, corresponding to the holes
  • the filter cube, 21, channels the different optical signals and avoids contamination of the fluorescence signal by the excitation light.
  • the filter cube is decomposed into: excitation filter, 210, dichroic mirror, 21 1, and emission filter, 212.
  • the filters and the dichroic mirror are chosen according to the excitation wavelength and emission spectral characteristics of the fluorophore.
  • the microscope objective, 22, focuses the light created by the source in the focal plane of the lens, 24, into a light distribution of reduced size, the optimum light distribution consisting of an Airy disc.
  • the microscope objective, 22, also collects back the fluorescent light emitted by the fluorophores.
  • the system can be decanned, i.e., the back light can pass through the scanning mechanism to compensate for translation due to scanning.
  • a detector lens, 25, creates, in the image plane of the detector 26, a magnified image of the focal plane of the objective, 24.
  • a confocal hole, 27, is theoretically placed in the image plane of the detector, 26. In most practical systems, the confocal hole, 27, is placed in an intermediate imaging plane (not shown) and reimaged on the image plane of the detector , 26.
  • the detector assembly, 23, detects the overall fluorescent intensity in the illuminated volume, and transforms it into a digital signal.
  • the detector assembly consists of a single element detector, such as a PMT or SPAD.
  • the detector assembly consists of a matrix of detection elements, such as a CCD, an EMCCD, a CMOS or a SPAD matrix.
  • All the components mounted from the light source to the dichroic filter is the lighting path, 201. All components mounted from the dichroic filter to the detector assembly are the detection channel 202.
  • the basic optical process of a confocal microscope can be segmented into six steps:
  • Fluorescence microscopes are available from several manufacturers, such as, for example, Nikon, Zeiss, Leica or Olympus. Fluorescence microscopes can be either standard microscopes suitable for fluorescence or specific microscopes optimized for fluorescence. Modern microscopes are versatile instruments capable of operating in many different modalities, including, but not limited to, fluorescence modalities, using the same optomechanical platform and most components. Most fluorescence microscopes are developed as an open platform, capable of performing several additional features with minimal modifications. Other fluorescence microscopes are dedicated instruments, customized to a specific task, such as medical or pharmaceutical diagnosis.
  • the new superresolution techniques allow them to obtain information beyond the resolution limit.
  • the main problem of all the existing techniques of superresolution is that the envelope of performances, expressed in terms of lateral resolution, longitudinal resolution, speed, necessary luminous intensity, photo-toxicity in the biological object, ability to measure different objects, is very similar.
  • these instruments can generally only observe a small proportion of biological specimens, due to strong operational imitations, such as for some of them a shallow depth of field or very high intensities harmful to the cells.
  • a first aspect of this invention relates to an optical measuring method for determining the spatial distribution or location of re-emitting sources on a sample, the sample having at least one re-emitting source, said at least one re-emitting source re-emitting light as a function of the light projected onto the sample, according to a determined law, by a first light source comprising a first laser, and the retransmitting source being able to be depleted or activated by the action of a second light source, comprising a second laser, the method comprising:
  • the wavelength of one of the lasers being tuned to the excitation wavelength of the at least one re - emitting source and the wavelength of the second laser being tuned to the length of depletion or activation wave of said at least one re-emitting source
  • the method further comprises the algorithmic analysis of the images to obtain spatial distribution information or location of the at least one retransmitter source.
  • a second aspect of the invention relates to the chromatography of the optical measuring method according to the first aspect of the invention so as to allow the use of the optical measuring method at different wavelengths of excitation and depletion, so as to selectively exciting the re-emitting sources according to a wavelength selective marking.
  • Another aspect of the invention relates to the realization of a STED or RELSOFT superresolution system using an optical achromatic common optical path measuring method capable of different beamshaping on different beams according to their polarization. .
  • Another aspect of the invention relates to the collocation of all lasers using an optical bench preferably using an optical fiber system to collocate the beams before shaping them by the optical method described in the previous aspects.
  • Another aspect of the invention relates to the realization of the method according to the first aspect by means of conical diffraction.
  • the compact light distribution of the first excitation laser is of different topological familiar from that of the second depletion or activation laser.
  • said at least two compact light distributions of different topoiog.'ques are created by an interference between a regular wave and a singular wave, or between two singular waves, and a spatial differentiation between said at least two distributions is created by varying at least one of the following parameters:
  • the projection of light distributions of different topological families is carried out by a conical diffraction or an assembly of uniaxial crystals.
  • the projection of light distributions of different topologies is performed by a conical diffraction in a thin crystal.
  • the optical fiber comprises a photonic fiber.
  • the optical fiber comprises a fiber with a low number of modes, "fe modes fiber” in English.
  • An embodiment of the method described above comprising the control of the lasers to jointly create a sequence of excitation distributions and a sequence of depletion or activation distributions, the two sequences being synchronized
  • An embodiment of the method described above comprising controlling the lasers to jointly create a sequence of excitation distributions and a sequence depletion or activation distributions, the two sequences being synchronized, and a singular excitation distribution being simultaneous to a singular depletion distribution
  • An embodiment of the method described above comprising controlling the lasers to jointly create an excitation distribution sequence and a depletion or activation distribution sequence, one of the excitation distributions being a super-oscillation.
  • An embodiment of the method described above comprising controlling the lasers to create simultaneously or following a sequence of excitation distributions and a sequence of depletion or activation distributions, the set of depletion or activation distributions being equivalent or similar to a vortex.
  • Another aspect of this invention relates to a measuring device for determining the spatial distribution or location of re-emitting sources on a sample, the sample having at least one re-emitting source, said at least one re-emitting source re-emitting light according to the light projected onto the sample by a first laser, according to a determined law, and the retransmitting source being able to be depleted or activated by the action of a second laser, the device comprising:
  • the wavelength of the first laser being tuned to the excitation wavelength of the at least one re-emitting source and the wavelength of the second laser being tuned to the length of depletion or activation wave of said at least one re-emitting source
  • a polarization sub-module for each laser, of a different polarization state
  • an achromatic projection module making it possible to create for each laser a compact light distribution propagating along the same optical path for all the lasers
  • a detection module adapted to detect light re-emitted by said at least one source of the sample
  • a generation module able to generate at least one optical image, from the detected light
  • an algorithmic analysis module capable of analyzing images to obtain location information of said at least one re-emitting source.
  • the compact light distribution of the excitation laser is of topological family different from that of the depletion or activation laser.
  • the projection module is capable of creating said at least two compact light distributions of different topological families by interference between a regular wave and a singular wave, or between two singular waves, and a spatial differentiation. between said at least two distributions is created by varying at least one of the following parameters:
  • the projection module comprises at least one conical crystal for projecting light distributions of families of different topologies by a conical diffraction or an assembly of uniaxial crystals.
  • the optical fiber comprises a photonic fiber.
  • the coupling of light from lasers is accomplished by an optical submodule, through a single fiber or a single optical path
  • the optical fiber comprises a fiber with limited number of modes, "few modes fiber" in English.
  • said at least one conical crystal is a thin crystal.
  • the lasers are configured to jointly create a sequence of excitation distributions and a sequence of depletion or activation distributions, the two sequences being synchronized.
  • the lasers are configured to jointly create a sequence of excitation distributions and a sequence of depletion or activation distributions, the two sequences being synchronized, and a singular excitation pattern being simultaneous to a singular distribution of depletion
  • the lasers are configured to jointly create a sequence of excitation distributions and a sequence of depletion or activation distributions, one of the excitation distributions being a super-oscillation.
  • the lasers are configured to jointly create, simultaneously or in accordance with a sequence of excitation distributions and a sequence of depletion or activation distributions, the set of depletion or activation distributions. being equivalent or similar to a vortex.
  • Another aspect of the invention relates to an optical measuring method for determining the spatial distribution or the location of retransmitter sources on a sample, the sample comprising at least one re-emitting source, said at least one re-emitting source re-emitting light according to the light projected onto the sample, according to a determined law, by a first light source comprising a first laser, and said at least one re - emitting source being able to be depleted or activated by the action of a second light source, comprising a second laser the process comprising:
  • the wavelength of the first laser being tuned to the excitation wavelength of the at least one re - emitting source and the wavelength of the second laser being tuned over the length of wave of depletion or activation of said at least one re-emitting source
  • the projection comprises, for the first laser, a compact light distribution, and for the second laser, two compact distributions, one of which has a zero intensity propagating axially in a motion. of spiral.
  • the two depletion-generating distributions come from two independent lasers at the same wavelength or at a near wavelength.
  • the projection on the sample is carried out by means of a projection optical apparatus.
  • achromatic lens comprising an optical element having the function of segmenting an optical beam into a plurality of independent beams, the projection comprising for both lasers a matrix of compact and collocated light distributions,
  • the optical element comprises a matrix of microlenses.
  • the achromatic projection optical apparatus comprises a duplication element making it possible to duplicate the light distributions laterally for the two lasers of a matrix of compact and collocated light distributions.
  • the duplicating element comprises a beam splitter transmission network or a scream:
  • the achromatic optical projection apparatus includes at least one additional optical element, having the function of creating two or more beams laterally or axially offset from an incident beam for both. lasers of a matrix of compact and collocated lympanic distributions.
  • an additional beam derived from the depletion laser or a device comprising a second depletion laser contains one of the light distributions with high axial dependence such as Stokes or another distribution described in this invention. to reduce the axial size of the emitter volume.
  • a dynamic polarization element is used before or after the biaxial crystal to correct the dynamic movement of the pupil, which in some cases can be created during the optical scanning of the confocal microscope. This pupil movement effect being in some implementations STED technologists one of the limits of performance, without the need for an additional scanning system.
  • two or more light distributions located at different wavelengths are projected using an original or modified LatSRCS module.
  • the first light distribution makes it possible to make the scene parsimonious, ie to isolate emitters by means of a physical effect, so as to create regions in which one can hypothesize parsimony is ie the presence of an isolated transmitter or a small number of transmitters.
  • the physical effects that will achieve this parsimony will be the same or will be derived effects, effects used to create parsimony for single transmitter location microscopy techniques.
  • the microscope platform which has been described is coupled to an electron microscopy system (CLEM-Correlative Light Electron Microscopy), or any other similar system such as TEM (Transmission Electron Microscopy), or ⁇ (Electron Beam Microscopy), or SEM (Scannmg Electron Microscopy).
  • CLEM-Correlative Light Electron Microscopy or any other similar system such as TEM (Transmission Electron Microscopy), or ⁇ (Electron Beam Microscopy), or SEM (Scannmg Electron Microscopy).
  • distributions having a strong axial dependence such as stokes are used. and the so-called "half-moon offset" distributions for characterizing the axial dependence of a point in the case of a location microscopy system.
  • one uses distributions having a strong axial dependence such as stokes. and distributions called "staggered half-moons" to characterize the axial dependence of a point in the event of a localization microscopy system in which we uti l ized original LatSRC module or modi fied to make your parsimonious scene locally and measure the position of the sources rebroadcasting parsimonious with the help of one of PS1T type techniques.
  • a technique is realized of dark Laquel tracking in the track of a poi nt is carried out by projection of a vortex or any other distribution containing one or zero pl ultiple d Optical intensity and compensation dynamic soft tively of a detected transmitter when the transmitter is found outside the zero optical intensity aforesaid.
  • a cascade of Wollaston prisms of different beam splittings is used to separate an incident beam into a large number of emerging beams.
  • the same effect can be obtained by modifying the Wollaston prism, to create the composite Wollaston prism, by adding uniaxial crystal pieces whose index and orientation of the birefringence are chosen. It is thus possible to construct a prism of a single block of uniaxial crystal that can separate an incident beam into 2 "emergent beams (e.g., eight or sixteen), which are contained in a plane, and separated by equal angles. on the sample, we obtain 2 "points aligned and also separated.
  • the method further comprises the algorithmic analysis of the images to obtain spatial distribution information or location of said at least one re-emitting source.
  • Another aspect of the invention relates to an optical measuring device for determining the spatial distribution or location of re-emitting sources on a sample, the sample comprising at least one re-emitting source, said at least one re-emitting source re-emitting light depending on light projected onto the sample, according to a given law, by a first light source comprising a first laser, and said at least one re - emitting source capable of being depieted or activated by the action of a second light source, comprising a second light source; laser, the device comprising:
  • the wavelength of the first laser being tuned to the excitation wavelength of said at least one re-emitting source and the wavelength of the second laser being tuned along the length of depletion or activation wave of said at least one re-emitting source
  • an achromatic projection module for creating light distributions for the first laser and the second laser
  • a detection module for detecting light re - emitted by said at least one re - emitting source of the sample
  • the projection module is capable of creating a compact light distribution for the first laser, and for the second laser of two compact distributions, one of them having a zero intensity propagating. axially following a spiral movement.
  • the two depletion-generating distributions come from two independent lasers at the same wavelength or at a near wavelength.
  • the achromatic projection module comprises an optical element having the function of segmenting an optical beam into a plurality of independent beams, the projection comprising for the two lasers a matrix of compact and stable light distributions. located.
  • the optical element comprises a matrix of microlenses.
  • the achromatic projection module comprises a duplication element making it possible to duplicate the light distributions laterally for the two lasers of a matrix of compact and collocated light distributions.
  • the duplicating element comprises a beam splitter transmission network or a uniaxial crystal.
  • the achromatic projection module comprises at least one additional optical element, having the function of creating, from an incident beam, two or more beams that are laterally or axially offset, for the two lasers. a matrix of compact and collocated light distributions,
  • the device further comprises an algorithmic analysis module capable of analyzing the images for obtain spatial distribution information or location of said at least one re-reader source.
  • Another aspect of the invention relates to an optical and / or optoelectronic system, comprising
  • an image acquisition module for acquiring a set of different and differentiated images, originating from the same spatial region of an object, two - dimensional or three - dimensional,
  • Fig. 1 is a simplified representation in perspective of a confocal fluorescence microscope of the prior art, also used as a support of the invention
  • Fig. 2 is a simplified pictorial representation of a fluorescence microscopy superresolution system, according to an embodiment of the present invention
  • Fig. 3 is a simplified schematic illustration of a setup of a conical diffraction module according to an embodiment of the present invention
  • Fig. 4 is a simplified pictorial representation of the two measurement paradigms according to embodiments of the invention and confocal microscopy;
  • Fig. 5 is a simplified pictorial representation of a particular embodiment of the SRCDP microscopy platform
  • Fig. 6a is a simplified schematic illustration of a lateral module of
  • Fig. 6b is a simplified schematic illustration of another embodiment of a superresolution side module, according to an embodiment of the present invention.
  • Fig. Figure 7 presents light distribution tables of a conical diffraction module as a function of the polarization of the input and output polarizers for several values of the tapered diffraction parameter, po. These light distributions were calculated by simulation of the equations developed by Berry, [2];
  • Fig. 8 is a diagrammatic illustration of one of the dark tracking embodiments.
  • Fig. 9 is a simplified schematic illustration of a fluorophore data super-resolution algorithm method, in accordance with an embodiment of the present invention.
  • Fig. 10 is a simplified schematic illustration of calculating the descriptors
  • Fig. 11 is a simplified schematic illustration of the control module of the SRCDP platform.
  • superoscillations are that of Yakir Aaronov and Sir ichael Berry.
  • a super-oscillation is a phenomenon in which a signal that is generally band-limited may contain local segments that oscillate more rapidly than its faster Fourier components.
  • the center or centroid of a light distribution is the center of gravity of the intensity.
  • the diameter of a light distribution is the diameter of the first intensity zero, for regular and singular waves, without taking into account the central zero of the singular wave.
  • Two light distributions are collocated if their centers coincide or are separated by a small spatial value relative to the size of the light distribution.
  • lens whose definition is enlarged, to include all the optical means that transmit, refract or reflect light, optical auxiliary - optical sub-module aimed at interfacing and adjusting either the geometrical parameters or the phase and / or polarization parameters between two other submodules or optical modules -, polarizer, analyzer, delay plate, beamspl itter beam splitter in English, polarizing and non-polarizing , beam combiner beam combine in English, polarizing and non-polarizing.
  • TIRF Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy
  • a partial polarizer to describe an element or a module whose absorption is different for the two linear polarizations - linear dichroism - or for the two circular polarizations - circular dichroism.
  • dynamic polarization or phase elements include, but are not limited to: rotating wave blades on their axis, light valves based on liquid crystal technologies, electro-optical devices, also known as Pockels cells, cells of Kerr, resonant electro-optical devices, magneto-optical devices, also known as Faraday cells, acousto- or elasto-optical devices or any combination thereof.
  • electro-optical devices also known as Pockels cells
  • cells of Kerr cells of Kerr
  • magneto-optical devices also known as Faraday cells
  • polarization or phase dispersive elements to describe elements whose polarization state is wavelength dependent.
  • the simplest of the polarization dispersive submodules is the multimode or thick wave plate.
  • centroid algorithm we will refer to the "centroid algorithm” to describe the usual procedure for measuring the centroid and possibly the width (FWHM) of a light distribution.
  • This algorithm has its source in Astronomy and Astrometry, and allowed the measurement of the position of the stars with a very great precision.
  • This algorithm is used today in the whole of optical instrumentation, including in superresolution biology.
  • an electronic image for describing the spatial distribution of charges for a CCD, current for a CMOS or events for a SPAD, created by the optical image, at a given moment, in a detection plane,
  • microimages images of size substantially equal to a small number of diameters of the Airy disk, typically less than 5 diameters, and / or with a low number of pixels. typically 4 * 4 to 32 * 32.
  • the indices m and n represent the indices of the pixels: the origin of the pixels will be chosen as the projection of the center of the analysis volume defined in a subsequent paragraph.
  • Polarimetry refers to the measurement of the polarization state of the incident light.
  • the state of polarization of the incident light can be described by the Stokes parameters, a set of values, introduced by George Gabriel Stokes in 1852, and used in Optics.
  • ⁇ ( ⁇ , ⁇ ) ⁇ ( ⁇ , ⁇ ). ⁇ [ ⁇ ⁇ ( ⁇ , ⁇ )) ⁇ ( ⁇ , ⁇ ) (EQ.1)
  • Gaussians, Hermite-Gaussians, and Laguerre-Gaussians are known to the Man of Art.
  • a singular wave comprises zero intensity at its center and an azimuthal phase variation of a multiple of 2%.
  • beam shaping to describe the transformation of a waveform of given form and topology into a wave of another form or topology, and in particular the transformation of a regular wave into singular and vice versa.
  • a light distribution, punctual the, will be considered compact if it fulfills one of the conditions of compactness defined below, by two alternative and not exclusive conditions:
  • a luminous domain containing more than 65% of the energy is delimited by a line of zero intensity in a circle of radius less than twice the radius of Airy,
  • Azimuthal amplitude distributions of order t also called Laguerre-Gauss distribution
  • the polarization and optionally azimuthal phase-shift distributions are also referred to as radially Laguerre-Gausspolarized modes.
  • the azimuthal orders C of the amplitude of the two different light distributions The azimuth orders £ of the polarization or phase of the two light distributions different.
  • two light distributions projected on a given volume will be deemed to have different topologies if, in a substantial part of the surface illuminated together, the gradients are of reversed direction.
  • a luminous nano-transmitter is a small secondary transmitter, attached to an object; it is substantially smaller in size than a fraction of a wavelength, typically but not limited to less than one fifth of the wavelength; a light nano-transmitter absorbs the incident energy and re-emits light at the same wavelength as the incident light or at different wavelengths; the light emitted by the nanoemitter may be coherent, partially coherent or incoherent with the light absorbed.
  • the main examples of light nanoemitters are fluorophores and nanoparticles, but they also include a large number of other elements.
  • the physical mechanisms that can create a nano-transmitter are numerous; they include but are not limited to absorption, dissemination or reflection,
  • RESOLFT photo activation and photo depletion phenomena, fluorescence with two or more photons, elastic or non-elastic diffusion, Raman scattering, or other physical mechanisms known to those skilled in the art.
  • light emission we will use the term light emission to describe the emission of electromagnetic waves by the light nanoemitter, whether the light is coherent, incoherent or partially coherent.
  • nanoemitters including scattering, absorbing and reflective particles, attached to a biological or organic entity; the action of a scattering particle, reflecting or absorbing on the field
  • electromagnetic can indeed be described as the creation with a reverse phase, following the principle of Babinet, for an absorbent particle of an auxiliary secondary field, emerging from the particle, superimposed on the incident electromagnetic field.
  • a nanoemitter denotes the set of information describing a nanoemitter as a point source at a given time. Since the nano-transmitter is considered as a point source, all the information representing it contains a number of parameters, namely: its position in space, its intensity, the spectral, intensity, coherence, phase and polarization characteristics of the light emitted by the fluorophore, as a function of the incident light.
  • the object is represented, as usual in image processing, by a matrix of intensities.
  • the remainder of the description only refers to the simplest case, that in which the nanoemitter is a fluorophore and the physical interaction is one-photon fluorescence.
  • this description should be understood as a simplified illustration of a general description of the methods and concepts applicable to all light nanoemitters previously mentioned or known to those skilled in the art, whatever the underlying physical phenomenon .
  • the nanoemitter samples the incident field or intensity at a precise three - dimensional position, without influencing the entire spatial distribution of the incident intensity.
  • the Figure. 1 represents a set of nanoemitters or structured objects, positioned on a given biological object, 1 5 and 16 on the one hand and 1 7 and 1 8 on the other hand.
  • the light emitted may consist of a continuous distribution, not shown in Figure 1, or any combination of nanoemitters, structured objects or continuous distribution.
  • the set of nanoemitters, structured objects or continuous distribution is referenced as a set of objects bright biological "; They represent a map of the biological object, in the sense defined by Alfred Korzybski in general semantics. It is, however, common practice to simplify the description, to reference the luminous biological object as the biological object itself, when no ambiguity can appear.
  • the luminous biological object contains many relevant information related to the biological object, mainly spatiotemporal information, the position of the object and its orientation as a function of time, and morphological information, for example in the case of the biological object. split of a cell in two.
  • the measurement system will make it possible to calculate the measured map, and perform an evaluation of the descriptors of any combination of nanoemitters, structured objects or an evaluation of the spatial distribution of continuous distributions.
  • This measured map differs from the original map due to noise, measurement conditions, system limitations, or measurement uncertainty.
  • This information of the measured map can be elaborated later in different levels of abstraction.
  • This first level of abstraction which describes the direct results of the measurement, does not contain, a priori, any biological information but the results of a physical measurement described by nanoemitters, structured objects or continuous distributions, which could I have to represent any tagged entity.
  • the second level the level of geometric abstraction structures nanoemitters, structured objects or continuous distributions as geometric objects. It consists of a description of luminous objects and their dynamic characteristics, such as their position or orientation, or their morphology. At this level, the information is still a physical and geometric information describing a set of objects.
  • the geometrical information uses the measured map and auxiliary information, potentially external to the system, on the relationship between light points and objects.
  • the level of biological abstraction allows a certain apprehension of the biological reality thanks to a constitutive relation between the measured objects and corresponding biological entities. It contains a set of information about the biological object, mainly the position and its dynamics, shape and morphology.
  • Biological information uses the measured map and geometric information, and auxiliary information, potentially external to the system, on the relationship of light points and objects to biological entities. A number of conclusions about the biological functionality of the sample can be obtained at this level.
  • the level of functional abstraction allows an apprehension of the biological reality.
  • An additional level of information can be defined including the process of control and instrumentation; in fact, a more advanced control and instrumentation process can be defined, allowing to go back to a more structured biological information, through an automation of the data acquisition process.
  • An example of such processes is described by Steven Finkbeiner under the name "Robotic Microscopy Systems”.
  • Conical diffraction describes the propagation of a light beam in the direction of the optical axis of a biaxial crystal.
  • cone diffraction mounting refers to a diffraction grating arrangement in which the grating is mounted on a curved surface.
  • Conical diffraction has attracted considerable theoretical and experimental interest, but "no practical application seems to have been found" [9].
  • conical diffraction has been observed in biaxial crystals.
  • a conical crystal to describe an inorganic or organic biaxial crystal exhibiting the conical diffraction phenomenon.
  • biaxed crystals include, Aragonite, KP, TA, BiW, LBO, NbO3, MDT, YCOB, BIBO, DAST, POM, NPP, LAP, LiInS2 and LiInSe2.
  • these effects can be used within the described devices.
  • These effects include polymers, liquid crystals, and externally induced birefringence effects.
  • the polymers include but are not limited to: stretched polymer sheets and cascade polymerization, [10]; the liquid crystals include but are not limited to: the thermotropic biaxial nematic phase, [1 1]; the external effects of induced birefringence include, but are not limited to: the application of an electric field creating an electro-optical effect, on a non-centrosymmetric cubic crystal, and the photoelastic modulator.
  • phase in the vortex created by conical diffraction is a geometrical phase and is therefore intrinsically achromatic.
  • the additional chromatic effects are the dispersion of the optical axis and the dependence of the various parameters present in the equations of the conical diffraction as a function of the wavelength.
  • the chromatic dispersion of the optical axis creates an angle of the optical axis of the crystal, depending on the wavelength, with respect to the optical axis of the system. It is due, in most cases, to the dispersion of the refractive indices.
  • the refractive indices depend on the wavelength, according to the Sellmeier equations.
  • the angle of the optical axis therefore varies as a function of wavelength, it creates an angle of chromatic inclination of the optical axis in the plane created by the crystallographic x and z axes.
  • ⁇ 0 can vary greatly depending on the wavelength in some organic crystals such as DAST.
  • Compensation of the chromatic dispersion of the optical axis can be performed using geometrical optics.
  • Chromatic dispersion of the direction of the optical axis can be compensated using natural dispersion of glass or other optical materials, or using networks or prisms.
  • the achromatization procedure does not differ from the standard procedure for correcting any chromatic aberration in geometric optics. This procedure can be designed and optimized using one of the available commercial optical software by defining suitable target functions. .
  • a different concept of achromatization is based on the use of two different materials, having inverse conical diffraction effects, with high and low chromatic dispersions.
  • the fundamental transfer function is identical to the unit and thus trivially independent of wavelength.
  • the vortex transfer function depends on the wavelength and can be represented by a chromatic factor equal to ⁇ ( ⁇ ).
  • the fundamental wave depends on the wavelength and the vortex wave is almost independent of it. Indeed, the simulations show that the shape of the vortex wave is only slightly modified by a variation of the parameter, ⁇ from 0.5 to 0.75.
  • the shape of the fundamental wave depends on wavelength and this effect must be taken into account in the design of systems using the two waves, fundamental and vortex.
  • FIG. 3 is a simplified schematic illustration of a configuration of a conical diffraction module, 300, according to an embodiment of the present invention.
  • the incident light, 30, is supposed to be collimated, even if other conditions can be adapted using simple optical means.
  • the setup itself includes a first lens, 31, a conical crystal, 32 and an optional lens 33.
  • the first two lenses, 31 and 33 are preferably configured as a Kepler telescope 1: 1.
  • numerical aperture of the first lens, 31, in the image space, shown below as Uo determines the parameters of the conical effect across the conical radius, defined below.
  • a conical imaging plane 35 is placed at the focal plane of the first lens 31; a polarizer, or partial polarizer, 29, described above, may also be added. However, in some optical systems where the incident light is already polarized, this element is not necessary.
  • a focusing lens, 36 determines the final size of the light spot. It can be a goal external microscope, or may be fused with the second lens 33. as implemented in another embodiment of this invention.
  • the distribution of the projected light on the sample is, as a first approximation, neglecting the vector effects, a reduced image of the distribution of light in the image plane.
  • the influence of vector effects will be discussed below.
  • the scale ratio or magnification is determined by a microscope objective.
  • the behavior of the electric field emerging from the conical crystal 32 is entirely characterized by a single parameter, the conical radius, Ro; the conical radius depends on the material and the thickness of the crystal.
  • Uo being the numerical aperture of the system.
  • po ⁇ 0.5 we are referring here to a thin conical crystal; for po "1, we refer here to the shape of a linear thin conical crystal, for po ⁇ 0.5 and> 1, to a sinusoidal thin conical crystal and for 1 ⁇ po ⁇ 6, to a mean conical crystal.
  • the emergent wave of the thin conical crystal, E (p, OR), expressed in normalized coordinates for a circularly polarized wave, is constituted by the superposition of two waves, referenced here as the fundamental wave, Ep (p), a wave regular, and the vortex wave, Ev (P, 0R), a singular wave; these two waves are coherent with each other, collocated, circularly polarized and chiral and inverse:
  • EF (p) is the scalar fundamental amplitude
  • the fundamental wave can be approximated by an Airy spot and the vortex wave can be approximated to a linear vortex, represented by:
  • FIGS. 4a to 4c are a simplified representation of the concept of volume confinement of the confocal microscope.
  • the functionality of the volume confinement is to limit, in the three spatial dimensions, the observed region of the sample to a volume of the smallest possible size, the volume of analysis.
  • the volume confinement feature limits the volume of analysis by the combination of two effects: the confinement of light projected onto a small area, ideally from the airy task, 50, and the elimination of light. defocused by the confocal hole, 28 of Figure 2. The superposition of these two effects creates a small volume, the analysis volume, 60. This volume determines the size of the elementary region detected by the system.
  • nanoemitters 53 to 59 consisting of a set of nanoemitters, 53 to 59.
  • the light emitted by the nanoemitters 58 and 59 lying in the conjugate plane of the confocal hole 28 of FIG. 2 is blocked, almost completely, by the confocal hole 28 of FIG.
  • the reference “i” The axes referenced “i” represent a Cartesian coordinate system centered on the center of the analysis volume, 61.
  • the referential "a” represent a Cartesian coordinate system centered, for each light nanoemitter, on the light nanoemitter considered as a discrete point, 62,
  • the center of the vortex will generally be defined as the center of the analysis volume.
  • At least one embodiment of the invention uses conical diffraction to realize the fundamental optical modules of the art.
  • optical semaphore to describe an optical element, passive or active, capable of channeling the incident light to different channels or detectors as a function of a property of light.
  • the simplest case is a dichroic plate that separates the light into two channels depending on the wavelength.
  • the PDOS will be determined by a series of transfer functions, Ti (x, y, z) depending, for each channel or detector i, of the position of the transmitter (x, y, z) in a reference volume.
  • the order of the PDOS will be the number of channels or detectors.
  • the PDOS will be lossless in lossless English, in an analysis volume, if the sum of the transfer functions, Ti (x, y, z) is equal to unity in the analysis volume.
  • the confocal hole, described by Minsky, [1 5], is considered in this embodiment of the invention as a degenerate PDOS of order 1.
  • PDOS dependence is a complex function of lateral and longitudinal positions.
  • LPDOS Longitudinal Position Depends Optical Semaphore
  • optical semaphore depending on the longitudinal position
  • the LPDOS will be determined by a series of transfer functions, Ti (z) depending, for each channel or detector i, on the longitudinal position of the transmitter (z), in a reference volume.
  • Ti (z) depending, for each channel or detector i, on the longitudinal position of the transmitter (z), in a reference volume.
  • the order of the PDOS will be the number of channels or detectors.
  • the LPDOS will be "lossless”, lossless in English, in an analysis volume, if the sum of the transfer function, Ti (z) is equal to unity in the analysis volume.
  • the LPDOS will often be coupled to a stop, limiting the lateral field of the system.
  • a main use of optical fibers is the exclusive transmission of the mode
  • Photonic Crystal Fiber acronym PCF - allows the simultaneous transmission or not, more complex modes, including vortex modes, with a vorticity equal to or less than 2. It would be possible to deport optical distributions created by optical diffraction using optical fibers, allowing a major simplification of the optical system.
  • the dual-core photonic crystal fibers, [16] allow interaction between two modes, one of which can be a vortex, and provide an additional physical mechanism for creating diversified transfer functions.
  • the object can be illuminated with monochromatic light and using, for example, a conventional laser or a lamp.
  • the object can also be illuminated at several wavelengths, either discretely, for example using several lasers, or continuously, for example using a lamp or a laser having a wider spectrum.
  • Achromatization is also possible for optical systems based on uniaxial crystals, and for almost all alternative implementations of this invention, with, for each of them, more practical or practical complexity. smaller.
  • FRET Förster-Förster energy transfer
  • the light from one or more incident laser beams is separated using a light splitter into two beams, the main beam that will accomplish the functionality of the PSIT system, and an additional weak beam.
  • intensity used to measure the position of the laser beam using a camera or position detector. This device makes it possible to measure in real time the position of the laser independently of any error of wobble or other mechanical error with a very high precision.
  • nonlinear interactions include but are not limited to two-photon interaction phenomena, emission-depletion, blinking, and photoactivation effects upon which the RESOLFT family of technology and the family of "localization microscopy" technologies.
  • CW STED the pulsed laser used in the first version of STED is replaced by a continuous laser - simpler.
  • the "gated STED” the emitted photons are discriminated according to their emission time to separate the photons emitted from fluorophores that have not received enough time the depletion beam; the "modulated STED” utilizes an intensity modulated excitation beam in combination with synchronous detection dependent on the modulation frequency. This makes it possible to discriminate the fluorescence signal created by the excitation beam of the residual fluorescence caused by the depletion beam.
  • phase plate The donut - or vortex - was created, in the first version of the STED, using a spatially varying phase blade, "phase plate" in English.
  • This implementation requires the use of two separate optical paths for the two beams, the excitation beam and the depletion beam.
  • This optical assembly is complex, highly dependent on any mechanical drift, and creates complex optical alignments.
  • the developed system requires high technicality and the cost of the system is important.
  • this implementation is chromatic, because the phase plate adapted to a wavelength will not be at another wavelength. Since the optical system is not achromatic, the use of a two-wavelength depletion STED requires an even more complex optical system.
  • Bokhor et al. [24] proposes the use of a chromatic annular separation of pre - aligned beams; however this solution blocks some of the depletion light,
  • Hoeffman proposes the use of a module containing the vortex - forming optical elements in the optical path of the depletion laser, to simplify the alignment
  • Reuss et al. [27] introduces a beamforming device placed directly opposite the objective lens.
  • This device is based on the use of crystals birefringents, mounted as a segmented wave iame, consisting of four segments.
  • the thickness parameter of the blade By a choice of the thickness parameter of the blade, it is possible to realize a member consisting of a phase plate for depletion and a neutral blade for excitation.
  • This technology is marketed under the name EasyDonut by Abberior [28].
  • the initial laser beams are in the form of a regular distribution and in the majority of the cases of a Gaussian distribution. These initial laser beams will subsequently be transformed into an excitation beam, a regular wave, and into a depletion beam, a singular wave, by a suitable optical system, described by the various inventors. Collocating these beams upstream when they are still in Gaussian distribution form is relatively simple. Collocating these beams downstream when they have been transformed into a regular and singular wave is much more complex. Collocating these beams upstream can be done commercially by laser bench systems using fiber-based techniques. It is therefore relatively easy as it is also done in all confocal microscopes, to create a set of laser outputs at different wavelengths of the same optical fiber and therefore collocated very precisely.
  • the solution proposed in embodiments of the present invention makes it possible to rely on this collocation upstream, greatly simplifying the system and allowing the realization of a STED at several wavelengths, intrinsically.
  • the ability to Achymatic beam shaping, to obtain for a polarization a regular wave and for another polarization, a singular wave, on all visible or infrared light, differ for the different polarizations, is new.
  • the PSIT module allows the realization of such an optical system that combines the properties of common optical path, achromaticity and "beam shaping". To our knowledge, there is not in fact a system with common path, achromatic and allowing a different beam shaping for different beams, in the literature. Such a system would certainly improve the simplicity of design and use of STED.
  • Embodiments of the disclosed invention allow the integration and fusion of additional information external to the described platform, optical or contextual, to obtain an improvement in the accuracy of the information collected from the sample for one.
  • the spectral diversity extends the range of available information.
  • optical integral information the information that could be retrieved from optical or electromagnetic wave measurements, on a target, by an observer, from a given point of view.
  • This information contains very many parameters of the object, related to its position, the materials that compose it, its temperature, or its orientation.
  • the optical integral information does not contain, on the other hand, information on regions of the object that do not have an optical path towards the observer, for example an element positioned in an opaque box, or a physical information that does not no optical transcription.
  • Embodiments of the present invention such as detecting the presence of two points of the same intensity, by projecting a vortex at the center of gravity of the light distribution created by the fundamental wave, are not limited in resolution. a priori and could ideally - with an infinite number of photons - obtain any resolution, as we will describe later for a specific case.
  • PSIT a projection method of a sequence of light intensities differing topologically, in English: "Projected Sequence (s) of Intensities with various Topoiogies"; the PSIT method can also be used to project sequences of light intensities differing topologically, at two or more wavelengths, sequentially or
  • the SRCDP platform "Super Resolution using the Conical Diffraction Platform" is a Microscopy platform using optical modules based on conic diffraction.
  • LatSRCS LatSRCS
  • the SRCDP platform consists mainly of two hardware modules, two new and complementary optical modules, the LatSRCS and LongSRCS optical modules, mounted on a microscope, and an algorithmic module, SRCDA, to reconstruct the information. superresolute sample.
  • the SRCDP platform includes an enhanced detection module, a system control module, and computer and software support.
  • certain embodiments of the invention relate to a large number of alternative implementations of the PSIT and PDOS methods, the SRCD platform, the LatSRCS and LongSRCS optical modules and the algorithmic SRCDA.
  • the function of the confocal microscope is to limit, in the three spatial dimensions, the observed region of the sample to a volume of the smallest possible size, the volume of analysis.
  • the acquired information is a single intensity value for the entire analysis volume, designed as a single entity. More clearly, the detailed information of the position of the nanoemitters within the analysis volume is not accessible, a priori, in a confocal microscope. It was generally accepted that no additional optical information could be created that would have allowed additional discrimination within the illuminated volume.
  • Figure 4d is a simplified conceptual representation of the measurement paradigm according to at least one embodiment of the invention.
  • the measurement paradigm is much more ambitious than that of the confocal fluorescence microscope, shown schematically in Figure 4a.
  • an analysis volume, 60 is created at the focal plane of the microscope objective, 22; it contains a sparse object, 51, consisting of several nanoemitters, 53 to 59; the result of the system is a reconstructed parsimonious object, 63, and a list of nanoemitters and a list of their attributes, 64.
  • a parsimonious object in figure 4d is for the purpose of illustration and this figure would have perfectly able to represent a continuous object, mutatis mutandis.
  • an analysis volume, 60 is created in the focal plane of the microscope objective, it contains a sparse object, 5 1, including several nanoemitters, 53 to 59; one or more depletion waves, 2000, reduce by a depletion effect, the analysis volume to a smaller volume represented by 2001. Only one of the nanoemitters in the scheme emits, and this allows us to obtain a complete image of the object.
  • the composite optical process comprises performing a series of optical measurement processes, controlled by the system control module, by varying the illumination sequences and / or the channel functionalities and / or the position of the optical sequence. it is based on measured data or external information.
  • An example of an optical process composed according to one embodiment of the invention will be detailed below.
  • a PSIT measurement method a sequence of light distributions of different topologies is projected on the analysis volume.
  • the PS1T measurement method performs the following functions:
  • the emission sequence consists of at least two point light distributions of different topological families.
  • the emission sequence is projected on a biological sample marked by nanoemiters.
  • the emergent light emission of each nanoemitter is dependent, for each nanoemitter, on the intensity, in the incoherent case, or on the electromagnetic field in the coherent case, incidents at the spatial position, three-dimensional luminous nanoemitter aforesaid sampling property of the light nanoemitter previously discussed.
  • the PSIT method according to this embodiment makes it possible to acquire essentially lateral information, that is to say the lateral position of each of the nanoemitters.
  • the PSIT method is implemented by projecting light distributions of different topologies created by conical diffraction and modified by a variation of the input and output polarization states.
  • the PSIT method can also be used to project sequences of light intensities that differ topologically, at two or more wavelengths, sequentially or simultaneously.
  • a PDOS method comprises the distribution by an "optical semaphore" of the light reemitted by the nanoemitters or by the continuous object between at least two detectors.
  • the function of the optical semaphore is to separate on different detectors different regions of the flight ume of analysis.
  • the semaphore Optical creates, for each detector, a light transfer function emitted by a light nanoemitter, depending on the position in the space of the light nanoemitter and different for the different detectors.
  • the PDOS method is implemented to separate on different detectors the collimated, emergent light of nanoemiters positioned at the focal plane of the objective, of emerging non-collimated light of nanoemitters lying below or beyond the focal plane.
  • the PDOS method makes it possible to acquire essentially longitudinal information, that is to say the longitudinal position of each of the nanoemitters.
  • the method according to embodiments of the invention realizes a transfer function transforming the spatial distribution in the nanoemitter space into the raw information consisting of a set of images.
  • Algorithmic performs the inverse operation: it reconstructs the spatial distribution in the nanoemitter space from the set of images composing the raw information.
  • the intermediate result, the raw information, is obtained at the end of the detection step.
  • the raw information consists of a set of images Aop (m, n), representing for the light distribution o, the image coming from the detection channel p.
  • the measurement process analyzes a small volume in an object of much larger size. It will therefore require the addition of additional modules, similar to those of a confocal microscope including a scanning process, a software module for integration, analysis and visualization of point data in surfaces and / or in three-dimensional objects.
  • the algorithmic solves an inverse problem or parameter estimation.
  • the equations of the model are known and one has a priori model, parametric or not, on the configuration of nanoemitters.
  • the most natural model is to assume a small number of nanoemitters (sparse object), but one can also use continuous models, assuming the presence of structures
  • One embodiment of the invention is a hardware and algorithmic platform referenced as the SRCDP platform 500, illustrated in Figure 5.
  • the SRCDP platform, 500 implements the method according to one embodiment of the invention, by combining the two methods PSIT and PDOS described above.
  • the SRCDP platform observes, Figure 5, a biological sample, 1 1, integrating a set of nanoemitters.
  • the result of the observation of the biological sample by the SRCDP platform is the acquisition of superresolution information representative of the observed sample.
  • the SRCDP platform, 500, Figure 5 mainly includes:
  • a confocal200 microscope adapted or optimized, similar to the confocal microscope, previously described, and comprising all the appropriate components, as previously described.
  • the two novel optical modules are the LatSRCS, 700, and LongSRCS, 800 optical modules, described in detail later with reference to Figures 6 and 8, respectively.
  • the LatSRCS 700 optical module implements the illumination steps necessary for the implementation of the PSIT method according to one embodiment of the invention.
  • the LongSRCS optical module, 800 implements the steps of distributing the emerging light intensity into a plurality of images of the PDOS method according to one embodiment of the invention and,
  • the optical module, LatSRCS, 700 is an optical module, projecting on a plurality of nanoemitters of a sample, a sequence of compact light distributions of different topology.
  • Each nano - transmitter fluoresces with a sequence of fluorescent light intensities depending on the intensity incident on the nanoemitter and characterizing the lateral position of the nanoemitter.
  • compact light distributions of different topologies are created by interference, with varying amplitudes and phases between a regular wave and a singular wave.
  • the regular and singular waves are created by a thin conical crystal.
  • the LatSRCS optical module, 700 is positioned in the illumination path of the confocal microscope 200; it projects a sequence of compact light distributions of different topologies on the sample 1 1 using the objective of the confocal microscope 200.
  • the incident intensity at a specific position on the sample 1 1 will be proportional to, for each light distribution, a specific combination of Stokes parameters.
  • the LatSRCS Optical Module, 700 utilizes an inherent feature, described previously, specific to the nanoemitter, which samples the incident light intensity at its precise position (from the nanoemitter) and re-emits a fluorescent light dependent on the incident light. It is remarkable that the measured information is directly related to the position of the nano-transmitter within the compact light distribution. This information is fixed by the functionality of the nanoemitter, its property of absorbing and reemitting light, which break the optical chain. This information is carried by the fluorescent light, in the form of an emerging light distribution, recoverable by a detection assembly 65.
  • the intensity of the fluorescent light re-emitted varies in the same proportions.
  • the sequence of the re-emitted fluorescent light will be proportional to the sequence of compact light distributions of different topologies. From this information, it is possible to recover the position of the nanoemitter, as explained below.
  • the PSIT method refers to the projection of a sequence of compact light distributions of different topologies in a microscope, the interaction with the parsimonious object or the continuous object, the collection of the light re-emitted by the objective of the microscope, 22, the detection of light, fluorescent or not, by the improved detection assembly 65, and the analysis of the information by an appropriate algorithm.
  • the enhanced detection set, 65 consists of a single detector, and recovers only the overall intensity in As a function of time, in other embodiments, the enhanced detection set consists of a small area of pixels and also retrieves the spatial distribution of the fluorescent light.
  • the set of information retrieved consisting of a plurality of images, designated as the superresolution side images.
  • the contribution of a nanoemitter positioned in the illuminated volume to a specific superresolution side image is proportional to a combination of the Stokes parameters of the incident light at the position of the nanoemitter.
  • the superresolution side images the information created by the compact light distributions of different topologies is new, and was not present in the prior art. This new information makes it possible to refine the position of the nanoemitters or the spatial distribution of the continuous object, to quantify the number of nanoemiters present in the illuminated volume and to differentiate several nanoemitters present in the same volume.
  • FIG. 6a is a simplified schematic illustration of a LatSRCS optics module, 700, in accordance with one embodiment of the present invention.
  • FIG. 6a shows an optical module, LatSRCS, 700, it includes all the components of the conical diffraction module, of FIG. 3, which are implemented in the same way as in the conical diffraction module 300.
  • the optics of FIG. the light source of the scanning confocal microscope is assumed to be achromatic and in infinite conjugation, although other conditions may be adapted using auxiliary optics.
  • the incident light entering from the light source is parallel, 30.
  • the optical module 700 itself comprises a first lens, 31, an achromatic 32, or a subset achromatically realizing the functionality of a conical crystal as explained above, and a second lens 33; a partial polarizer, 29, described above, can also be added.
  • the first two lenses, 31 and 33 are preferably configured as a 1: 1 Kepler telescope; the conical imaging plane, 35, is placed in the common focal plane of the lenses 31 and 33.
  • the numerical aperture of the first lens, 31, determines the parameters of the conical diffraction effect through the conical standard radius, defined below.
  • the second objective, 33 restores the parallelism of the light, to inject it under the microscope. It further comprises a polarization control submodule 71, including, for example, a rotating quarter wave plate, a pair of liquid crystal light valves or a Pockels cell, 72, and an analyzer 73.
  • the information of Stokes parameters can be transformed into sequential information, through a sequence of distributions spatially differentiated luminaries, and bearing sequential information, as described above.
  • this figure shows the light distributions, created through a 0.388 standard conic tapered crystal, calculated by a scalar approximation, for different input and output polarization states, including as input or at the output is a circular or linear polarizer or a radial or azimuth polarizer.
  • These light distributions were calculated in an intermediate imaging plane and not at the focal point of the lens to separate conical refraction from vector effects.
  • the polarization states - input and output - are characterized by their angle for linear polarizations and by their chirality for circular polarizations.
  • this figure shows the light distributions, created through a conically standardized tapered crystal of 0.818, calculated by a scalar approximation, for different input and output polarization states, including as input or at the output is a circular or linear polarizer or a radial or azimuth polarizer.
  • These light distributions were calculated using the Diffract software of the research company. These light distributions were calculated in an intermediate imaging plane and not at the focal point of the lens to separate conical refraction from vector effects.
  • the input and output polarization states are characterized by their angle for linear polarizations and by their chirality for circular polarizations.
  • the different light distributions are produced by modifying the input or output polarization.
  • the different light distributions follow the same optical path and the optical system creating these distributions is a common path optical system, as we have defined it previously.
  • the elementary light distributions described in Figure 7 can be obtained in several different ways. In addition, some of them can be obtained as a linear combination of other elementary light distributions; for example the vortex can be obtained by any sum of two orthogonal "half-moon" light distributions.
  • New light distributions can also be obtained as mathematical combinations of elementary light distributions.
  • the light distribution "pseudo-vortex", calculated from arithmetic combinations of four distributions in "crescent moon” has the distinction of having a very strong curvature at the origin.
  • the PSIT Method was initially designed to allow lateral super-resolution; however, the PSIT method can also be used to obtain the longitudinal position of a nanoemitter. Indeed, some elementary light distributions are relatively insensitive - within reasonable limits - to a variation of the longitudinal position of the nanoemitter, while others are very sensitive. A sequence of compact light distributions, some of them independent and some of them dependent on the longitudinal position, would make it possible to go back to the longitudinal position of the nanoemitters.
  • some more complex elementary light distributions consisting of more complex superimpositions of waves, exist with a strong longitudinal dependence; for example, the "dark three-dimensional spots” described by Zhang, [29], create a black spot surrounded in three dimensions by a luminous sphere.
  • These "dark three - dimensional spots” consist of a superposition of Laguerre - Gauss functions, which can be realized inside a laser cavity or with a hologram or a phase plate, as suggested by Zhang or using conical or uniaxial crystals as suggested by the inventor.
  • Conical diffraction can be used to change and shape the PSF so that it has lateral and axial variations.
  • the incident beam is transformed into two Bessel beams: a Bo part (fundamental mode) and a B i part (vortex mode). All homogeneously polarized incident beams can decompose on the orthogonal basis composed of circular right and left circular polarizations.
  • the outgoing beam is the sum of the contributions of the two components, one giving rise to a part Bo and the other to a part Bi.
  • Different combinations of Bo and Bi can be realized by choosing the polarizations at the input and output, which allows to obtain PSF of different forms.
  • the input polarization and the output polarization are elliptic with an orientation of the major axes of each ellipse having an angle of 90 ° between them.
  • some have significant variation along the Z axis, and these variations can be exploited to measure the position of a transmitter with high axial accuracy.
  • the distributions with a single lobe present a rotation effect along the Z axis.
  • the theory developed so far describes the light distribution in the imaging plane of the microscope, 35.
  • the distribution of the light projected onto the sample is, according to the theory of geometrical imaging, a reduced image of the distribution of light in the image plane.
  • the output bias adaptation sub-module, 74 to control the output bias.
  • output polarization with circular symmetry substantially reduces vector effects.
  • Such polarization can be circular, radial or azimuthal.
  • the output polarization adaptation sub-module 74 is simply a four-wave delay plate.
  • the longitudinal polarization elements have a vortex symmetry and blend harmoniously into the system with only a small change in the shape of the Stokes parameters, even for microscope objectives with very high numerical aperture.
  • the output polarization adaptation sub-module, 74 may be variable and adapt to the topology and symmetry of each of the compact light distributions.
  • a Wollaston prism can be used to separate an incident beam into two emerging beams separated by an angle. Using multiple prisms in cascade, or can thus separate an incident beam into a large number of emerging beams. The same effect can be obtained by modifying the Wollaston prism, to create the composite Wollaston prism, by adding uniaxial crystal pieces whose index and orientation of the birefringence are chosen. It is thus possible to construct a prism of a single uniaxial crystal block which can separate an incident beam into 2 n emergent beams (e.g. eight or sixteen) which are contained in a plane, and separated by equal angles. Once focused on the sample, we obtain 2 n points aligned and also separated. If the incident beam passed through a LatS C module these 2 "points are not 2" Airy tasks, but the distributions created by the module and are all identical.
  • the PDOS method was initially designed to allow longitudinal superresolution; however, the PDOS method can also be used to obtain the lateral position of a nanoemitter. Indeed, the elementary light distributions are also sensitive to a variation of the lateral position of the nanoemitter. For a flat sample, in the case where light projection is not feasible, the PDOS method can replace the PSIT method to make superresolved measurements.
  • the detector In confocal scanning microscopy the detector is a detector consisting of a single element such as a PMT or a SPAD. The acquisition time of the detector is determined by the scanning mechanism.
  • An improved detection module, 65 can be implemented using small-sized, low-pixel detectors. Such a module would not have been feasible ten or twenty years ago, because of the lack of adequate technologies. Today, high-speed, low-pixel, small-size detectors with low noise characteristics are available on a number of technologies. SPAD matrices with a low pixel count, such as 32 * 32, have been recently demonstrated with acquisition rates up to 1 MHz.
  • the improved detector module 65 can also be implemented using CCD, EMCCD or CMOS sensors.
  • CCD, CMOS EMCCD detectors can be used by using region of interest, sub-fenestration or "binning” functions, “crop” or “fast kinetics” modes, available for certain detectors.
  • the spatio-temporal information referenced here is the position and the time of the impact of each fluorescent photon.
  • spatio-temporal information is corrupted by detector noise, which creates erroneous photons, and by inefficient detection, which creates photons that are not detected, reducing performance.
  • the SPAD matrices for each photon, the pixel that has detected it and the impact time are received, ie the complete spatio-temporal information is available.
  • CCD, CMOS or EMCCD detectors the acquisition of several frames is necessary to approximate the spatio-temporal information.
  • detectors in many cases the detectors may be either physically separated or consisting of different zones on the same detector, or a combination of the two previous cases.
  • the reconstruction algorithm that we have detailed applies not only in the case of a given field analyzed using the PS1T and PDOS methods, but also in the case of a larger field analyzed by scanning.
  • the direct model is enriched by the fact that overlap between the different positions of the projected signals makes it possible to take into account, at a given point, more measurements.
  • the taking into account of offset projected signals does not however bring any additional complexity, since these off-set signals only add to the list of projected signals.
  • Multi-image system including the E-LSE reconstruction algorithm
  • multi-image system the set of optical and optoelectronic systems, in which a set of different images and differentiated, derived from the same spatial region of the object, two-dimensional or three-dimensional - are recorded and analyzed through an appropriate algorithm to analyze the spatial - and / or spectral - distribution of the emitting spatial region.
  • This differentiation may be due to the spatially different illumination projection, as previously described; it can also be due to a variation of the spectral content of illumination; it can also be due to a natural movement or imposed from outside objects.
  • the proposed algorithm makes it possible, from the images recorded by the camera (or the cameras) following the excitation of the sample by all the selected illuminations, to reconstruct a high-resolution image, two-dimensional or three-dimensional, of the image. 'sample.
  • This algorithm is based on the combination of several principles:
  • the algorithm uses as input the measurements made on the sample, but also data inherent in the system that are obtained after a so-called calibration step. In this step, measurements are made on a reference sample in order to accurately measure the illumination functions and the optical spot (Point Spread Function) of return of the optical system.
  • Each quantity of type u, (x, y) is determined during the calibration step: it represents the intensity emitted at the pixel of the camera by an emitter located at the pixel x of the high resolution image, in response to a index illumination (/ so code at both the position of the i llumination signal, but also its shape).
  • the positive real B corresponds to the intensity of the continuous background, which generally results from both the sample (diffuse fluorescence for example) but also from the sensor.
  • the quantities m / y) simply correspond to the measurements (images recorded by the camera): m / y) is the intensity measured at the pixel y of the index image i, that is to say the image recorded after index illumination).
  • the proposed algorithm consists of changing the emitters represented by the vectors x and / in accordance with the law given by the density ⁇ ( ⁇ , ⁇ ).
  • the algorithm is iterative: at each iteration, one of the transmitters is perturbed (in position or in intensity) and this disturbance is accepted or not according to the principle of the Metropolis-Hastings algorithm [3J.
  • the reconstructed image is obtained by averaging, with equal weight for each iteration, the transmitters thus constructed. If x J and X s respectively correspond to the position and the intensity of the emitters at the iteration j of the algorithm, then the image / reconstructed after N iterations is given by
  • the results of the algorithm can be transmitted to the user either as an image or as digital or graphical data.
  • the same reconstruction algorithm can be used in a second version including a set of additional parameters describing global spatial region parameters of the object either known a priori or determined a posteriori.
  • This algorithm in its two versions, can be used in all multi-image systems, in which a set of different and differentiated images, coming from the same spatial region of f object, two-dimensional or three-dimensional - are recorded and analyzed.
  • the optical process composed according to at least one embodiment of the invention is a logical complement of the SRCDA algorithm. Indeed, the reconstruction obtained by the algorithm SRCDA can lead to the conclusion that an additional image would improve the performance of the measurement.
  • the SRCDP microscopy platform allows the acquisition of one or more complementary images chosen from a set of light distributions of the PS1T or PDOS methods.
  • the PSIT method can be used as a technique for measuring the position of a nano-transmitter with high precision.
  • a nanoemitter positioned at the x, y position in Cartesian coordinates and p, ⁇ in polar coordinates.
  • An illumination sequence consisting of a fundamental wave, and a pair of distributions called "half-moons", aligned along orthogonal axes is projected on the nanoemitter.
  • the preprocessing procedure creates two images:
  • a "top hat” image consisting of the sum of the three images in the sequence
  • a vortex image consisting of the sum of the two half-moon images.
  • a first descriptor is the Cartesian position calculated using the centroid algorithm on the top-hat image.
  • the radial position ⁇ can be measured univocally by measuring a parameter, p a , equal to the normal tangent arc of a factor ⁇ , of the intensity ratio between the normalized intensity emitted by the nano-transmitter illuminated by the vortex wave, IV. and the normalized intensity emitted by the nanoemitter illuminated by the fundamental wave, IF.
  • a parameter p a
  • ⁇ the normal tangent arc of a factor ⁇
  • the azimuthal position can be measured by measuring the intensity ratio between the total intensity emitted by the nanoemitter illuminated by the first half - moon distribution, 1H, and the total intensity emitted by the nanoemitter illuminated by the second half moon distribution. , Ive.
  • the relationship between these two intensities is a geometric law in square tangent:
  • This redundancy is a measure of qualifying the observed object as a single point and of separating this case from other objects potentially present on the sample.
  • a direct application of the use of the PSIT method according to one embodiment of the invention for measuring the position of a nanoemitter with high precision is the integration of this measurement technique into a new technique of stochastic optical reconstruction. local.
  • One of the limits of the applicability of stochastic techniques is the measurement process, which requires a large number of images and therefore a long measurement time and high phototoxicity.
  • the use of the PSIT technique according to at least one embodiment of the invention which makes it possible to measure the position of a light transmitter, at a much higher resolution than the Airy disk, at rates up to the micro or nanoseconds allows the extension stochastic techniques to many new applications.
  • the resulting images of the use of the PSIT method can also be processed using the generalized Hough method, allowing to recognize structured objects, line, circle or others, in an image.
  • 80 represents the initialization phase, i.e., the detection of the transmitter using a confocal scanner or any other known optical method.
  • 81 represents the positioning phase of the vortex beam on the transmitter;
  • 82 represents the case where the emitter moves with respect to the center of the vortex and is excited by a fraction of the beam creating a fluorescence which can be detected;
  • 83 represents the repositioning of the emitter at the center of the vortex beam such that no fluorescence is created and detected (recorded position Xi, Yi) and 84 corresponds to a feedback loop in which an independent location system reposition the element followed at a corrected position.
  • the light distributions used by this technique are vortices generated by conical diffraction.
  • this technique can use other vortices or other distributions generated by conic diffraction.
  • the position of the molecule is first detected by a classical confocal image at ⁇ .
  • the position of the scanner is then adjusted to stimulate the sample so that the center of the vortex coincides exactly with the position of the emitter.
  • the fluorescence signal is detected by a very sensitive camera (eg EMCCD or sCMOS), or PMT, allowing a detection of the low amplitude signal of the transmitter thanks to an important quantum efficiency.
  • the localization process is based on the absence of a fluorescent signal when the transmitter is exactly in the center of the vortex.
  • the fact that the intensity gradient is important near the center of the vortex allows a precise location of the transmitter. If the transmitter moves slightly, the intensity it absorbs will no longer be zero, and it will emit a fluorescent signal whose position and intensity are deduced from the image.
  • a feedback loop then makes it possible to refocus the vortex on the transmitter and to memorize the position of the transmitter.
  • the feedback loop can be executed at the speed of execution of the camera (up to 1 kHz) or the detector (several MHz), which makes it possible to follow a molecule in real time and over a long period of time.
  • the localization can be conducted over a long period of time, bleaching being less likely to occur with such small doses of light.
  • Location accuracy is highly dependent on the signal - to - noise ratio of the image, so background noise (camera noise and autofluorescence signal) must be taken into account.
  • ⁇ and ⁇ 2 We propagate two beams together with different topologies that depend on their wavelength.
  • the first ( ⁇ ) has a classical Gaussian form and makes it possible to obtain a global confocal image of the sample.
  • the second ( ⁇ 2 ) is a vortex beam used for DarkTracking.
  • centroid will measure the center of gravity of the light distribution, which will be at the origin
  • the descriptors p and ⁇ enable us to measure the characteristics of two points at a resolution much higher than that defined by the Rayleigh criterion. Moreover, using a compound process, it is possible to separate this case from the vast majority of cases of 3 points or more. An additional light distribution may be projected onto the sample, a half-moon inclined at an angle ⁇ ; the hypothesis of the presence of two points will be confirmed or invalidated according to the results of this image. In fact, the measured energy will be zero for only two points, for a line or for a series of points aligned in the direction of the angle ⁇ .
  • FIG. 6b is a simplified schematic illustration of a modified LatSRCS optical module, achromatic or otherwise, 700, according to an embodiment of the present invention.
  • This module differs from the implementation of a LatSRCS optical module, 700, previously described and shown in Figure 6a, by adding several elements before the module:
  • lasers 79a, 79b and 79c, optionally at different wavelengths
  • optical fibers, 78a, 78b and 78c originating from lasers 79a, 79b and 79c, optionally, polarization control sub-modules 77a, 77b and 77c for statically or dynamically changing the polarization of the lasers 79a, 79b and 79c, the polarization control submodules being positionable before or after the fiber;
  • the polarization control sub-modules 77a, 77b and 77c may not be necessary and the polarization of the light coming from the fiber is determined. by the relative position of the laser and the fiber,
  • a "laser combiner” (76a), combining two or more laser sources optionally through optical fibers, 78a, 78b and 78c, into a common output fiber, 76b,
  • an optical element, 75 for transforming the light from the fiber into collimated light that can be used by the rest of the LatSRCS module, 700, similarly to that described above.
  • the two optical elements 3 1 and 75 can be integrated into a single element, or even removed if the output parameters of the common fiber are adequate.
  • the common fiber, 76b may not be necessary for some implementations.
  • the excitation and depletion waves propagate along two orthogonal linear polarizations and a quarter-wave plate - optionally achromatic - is positioned at the entrance of the system to transform these polarizations into polarizations.
  • a quarter-wave plate - optionally achromatic - is positioned at the entrance of the system to transform these polarizations into polarizations.
  • circular orthogonal to obtain, for one a fundamental wave and for the other a vortex.
  • the peer control sub-modules, 77a, 77b and 77c can be operated to simultaneously create sequences of light distributions, identical or different, for the excitation path and the depletion path.
  • the intensity of the lasers can be modulated, creating a complex timing diagram of the intensity of each laser, the excitation light distribution sequence and the sequence of light depletion distributions.
  • using a confocal microscope and an original or modified LatSRCS module, achromatic or not one projects sequentially:
  • the difference image consisting of the weighted subtraction of these two images.
  • This difference image if we choose the right parameters, will have a size - in terms of PSF - finer than a conventional STED, while requiring only a relatively low depletion intensity. Indeed, the purpose of the vortex depletion will no longer be to reduce the size of an Airy spot, thus requiring significant energy, as in the conventional STED or RESOLFT, but to reduce the excess energy present. in the excitation vortex with respect to the Airy distribution or the fundamental one. Moreover, the depletion of the Airy or of the fundamental, will be coupled with the subtraction of the negative image, created by the excitation vortex, which is equivalent to the mathematical subtraction of the two illuminations. Reducing the size of the resulting PSF will be the combination of these two effects.
  • this preferred embodiment may in some cases overcome the need to trigger excitation as needed in the "Gated STED". Indeed, the photons arrived before the complete application of the depletion, can be taken into account by an adequate choice of parameters, without requiring the addition of a complex and binding system. Finally, the need to modulate the STED, "ModSted” can also be avoided because the emission photons emitted by the depletion vortex do not differ substantially from those emitted by the excitation vortex and can also be compensated.
  • an excitation beam sequence, a depletion beam sequence are simultaneously projected, the two beam sequences being able to differ in their polarization, creating lminous distributions of different topologies.
  • This device makes it possible to produce a sequence of light distributions of sizes smaller than those which would have been obtained without the beam of
  • the algorithmic SRCDA will be used in this implementation to determine the spatial distribution or the position of point emitters.
  • an excitation beam is simultaneously projected under shape of an Airy and a depletion beam in the form of a vortex, the two beams differing in their polarization.
  • This device makes it possible, without dynamic elements, to produce a totally achromatic STED device.
  • an excitation beam sequence, a depletion beam sequence are simultaneously projected, the two beam sequences being able to differ. by their polarization, creating light distributions of different topologies.
  • the LatSRCS module makes it possible to produce a sequence of light distributions of smaller sizes than would have been obtained without the depletion beam.
  • the LongSRCS module implements the PDOS method so as to separate on different detectors the collimated light, emerging from nanoemitters positioned at the focal plane of the objective, of the emerging thinned non-collared light of nanoemitters lying below or beyond of the focal plane.
  • the PDOS method in this implementation, makes it possible to acquire essentially longitudinal information, ie the longitudinal position of each of the nanoemitters, complementary to the lateral information obtained with the aid of the original or modified LatSRCS module.
  • the algorithmic SRCDA will be used in this implementation to determine the spatial distribution or the position of point emitters.
  • a dynamic polarization element is used before or after the biaxial crystal to correct the dynamic movement of the pupil, which in some cases can be created during the optical scanning of the confocal microscope .
  • This pupil movement effect being in some implementations of STED technologists one of the limits of performance, without the need for an additional scanning system.
  • the first light distribution makes the scene parsimonious, that is to say to isolate emitters by means of a physical effect, which dilutes the density of the emitters capable of emitting fluorescence, so as to create regions in which the parsimony hypothesis is valid, ie the presence of an isolated transmitter or a small number of transmitters.
  • the physical effects that will achieve this parsimony will be the same or will be derived effects, effects used to create parsimony for unique transmitter location microscopy techniques. These techniques include, for example, PALM STORM, DSTORM, FPALM and others.
  • the second light distribution at another wavelength will create a fluorescence whose intensity will be variable over time.
  • This The second light distribution will use one of the PSIT techniques, either a discrete distribution sequence or a sequence of continuous distributions.
  • the light will be detected either by a matrix detector or by a single detector.
  • the most likely implementation will be the use of a single detector; in this case, the lateral position information xy and potentially the longitudinal distribution information z can be obtained by intensity ratios.
  • harmonic time distributions in which the electro-optical cells are actuated by a sinusoidal voltage.
  • the xy position can be retrieved using a measurement of the temporal harmonics of the signal measured by the detector, which may be a single detector, which indirectly contain the lateral position information.
  • the creation successively or simultaneously of two - or more - depletion light distributions can advantageously replace the depletion vortex in all RELSOFT or STED modes.
  • One of the possible effects is the improvement of the shape of the light distribution of depletion taking into account the vector effects. It is also possible to create a number larger than 2 of distributions called "half-moons", to explore different states of polarization.
  • the Control Module, 1,100 using the Systemic Control Procedure, 1,101, monitors and modifies the optical parameters of the SRCDP, 500 platform, the electronic parameters of the Enhanced Detection Set, 65, and the mathematical parameters algorithmic procedures SRCDA, 900, to optimize emerging information, according to criteria defined by the system or by the user.
  • the control is performed by varying the control systems 1 102, 1 103 and 1 104, the various elements of the platform, 600, 800 and 900.
  • the control system, 1 100 will also use, if available information external, 1 105, relayed by the computer support.
  • the embodiments of the invention described can be integrated on a confocal fluorescence microscope.
  • the superresolution system according to embodiments of the invention consists of a new measurement mode, in addition to or in replacement of the existing modalities of microscopy.
  • the superresolution system according to embodiments of the invention can just as easily be integrated on the other microscopy platforms.
  • These microscopy platforms include but are not limited to: wide field microscopes, "wide field microscope”, dark field microscopes, “dark field microscope”, polarization microscopes, phase difference microscopes Differential interference microscopes, stereoscopic microscopes, Raman microscopes, microscopes dedicated to a specific task, such as live cell imaging, cell sorting, cell motility or any other instrument. optical microscopy.
  • the microscope platform that has been described is coupled to an electron microscopy system (CLEM-Correlative Light Electron Microscopy), or any other similar system such as Transmission Electron Microscopy (TEM), or EBM (Electron Beam Microscopy), or SEM (Scanning Electron Microscopy)
  • CLEM-Correlative Light Electron Microscopy or any other similar system such as Transmission Electron Microscopy (TEM), or EBM (Electron Beam Microscopy), or SEM (Scanning Electron Microscopy)
  • the microscope platform is a complete SRCDP platform, and includes a LongSRCS module, implementing the PDOS method and using the SRCDA algorithm.
  • the microscope platform is a partial SRCDP platform, and uses the algorithm SRCDA. In another embodiment of the invention, the microscope platform is a partial SRCDP platform, and uses the control module.
  • the microscope platform further includes a LongSRCS module, implementing the PDOS method.
  • optical fibers The advantageous use of optical fibers is the transmission of the fundamental mode, the TEMyo mode and only it.
  • certain configurations of optical fibers mainly but not exclusively based on fibers called "Photonic Crystal Fiber” (in English) allows the simultaneous transmission or not, more complex modes, including vortex modes. It would therefore be possible to deport the optical distributions created by the conical refraction with the aid of optical fibers, allowing a major simplification of the optical system.
  • some dual-core photonic crystal fibers [16] allow interaction between two modes, one of which may be a vortex, and provide an additional physical mechanism for creating transfer functions. diversified.
  • Superresolution techniques are based on the measurement of point sources, smaller than a fraction of a wavelength.
  • Superresolution techniques according to described embodiments allow the measurement of point sources, but also of structured objects, for example and mainly line segments, circles or even continuous objects. In Biology, this extension will allow the measurement of important biological entities, such as filaments, neurons and some microtubules.
  • Embodiments of the invention can be applied, by choosing a different optical system, to many medical applications, for example but not limited to ophthalmological observation.
  • This field of application corresponds to the measurement of biological or medical objects of micron resolution, the resolution being between 1 and 10 ⁇ .
  • embodiments of the invention may be applied, as explained later, through an optical fiber. This allows many additional applications, for example but not limited to gastric and gastroenterological observation, and observation of the colon and urinary tract.

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Abstract

L'invention propose un procédé optique de mesure et un dispositif optique de mesure pour déterminer la distribution spatiale ou spatiotemporelle d'un échantillon, l'échantillon comportant au moins une source réémettrice ledit au moins une source réémettrice réémettant de la lumière en fonction de la lumière projetée sur l'échantillon, suivant une loi déterminée, par une première source lumineuse comprenant un premier laser, et la source réémettrice pouvant être déplétée ou activée par l 'action d'une seconde source lumineuse, comprenant un second laser, le procédé comportant : l ' utilisation des deux lasers, la longueur d'onde d'un des lasers étant accordée sur la longueur d'onde d'excitation dudit au moins une source réémettrice et la longueur d'onde du second laser étant accordée sur la longueur d'onde de déplétion ou d'activation dudit au moins une source réémettrice, la réalisation, à l 'aide d'un sous module de polarisation, pour chaque laser, un état de polarisation contrôlé, la projection sur l'échantillon, au moyen d'un appareil optique de projection achromatique, d'au moins deux distributions lumineuses compactes de familles topologiques différentes, se propageant suivant le même chemin optique, la détection de la lumière réémise par ledit au moins une source réémettrice de l'échantillon; la génération, d'au moins une image optique, à partir de la lumière détectée; et l'analyse algorithmique des images optiques pour obtenir une information de localisation dudit au moins une source réémettrice. De plus, l'invention décrit la réalisation de l'appareil optique de projection achromatique cité, à l'aide de modules basés sur la diffraction conique ou sur d'autres effets optiques.

Description

PROCEDE ET DISPOSITIF DE MESURE OPTIQUE
La présente invention concerne un procédé et un dispositif de mesure optique. Elle trouve des applications dans tous les domaines de imagerie, en particulier mais non limitée au domaine de la Microscopie, incluant mais non limité aux domaines de la Biologie, de la Médecine, de la Pharmacie, des Semiconducteurs, de l'Etude. des matériaux, de la Métrologie, du contrôle, de la mesure et de l 'observation et à l'ensemble des processus d'acquisition de l 'information à partir d 'observations optiques, dans le domaine macroscopique ou microscopique.
Un Microscope optique est un instrument optique utilisé en général pour voir, analyser ou mesurer les objets trop petits pour être visualisés par l'œil nu.
Nous util iserons le terme biologique pour décrire toute entité de la Science du vivant, quelle que soit sa provenance, humaine, animale ou végétale et la finalité de son observation, recherche, diagnostique ou thérapeutique. Ce terme inclut les utilisations médicales de la technique décrite. La Microscopie est util isée dans le domaine de la
Biologie, par exemple, pour observer, étudier et mesurer des entités (objets) biologiques et leur dynamique.
Nous util iserons, par extension, le terme de Vision artificielle pour décrire l'ensemble des applications de mesure, métrologie ou observation d'objets ou éléments produits ou construits ou réalisés par un être humain ou une machine, par exemple, pour observer, étudier et mesurer des Semiconducteurs ou pour caractériser les matériaux.
Les définitions usuelles sont utilisées pour: limite de diffraction optique, critère de Rayleigh, disque d'Airy et ses rayon et diamètre. Nous utilisons dans le contexte de l' invention les termes de superrésolution, superrésolu, d' imagerie de superrésolution et de microscopie de superrésolution pour décrire l 'acquisition de données optiques, en imagerie, en microscopie ou en Vision artificielle, à une résolution supérieure à la limite de diffraction optique. Les définitions usuelles sont utilisées pour la fluorescence et pour les fluorophores.
On se réfère maintenant à la Figure. 1 , qui représente une illustration du paradigme de la Microscopie, 100.
La Microscopie optique consiste en l' illumination, par une source lumineuse, non représentée, à l'aide d' un Microscope, 1 0, d'un échantillon biologique ou non- biologique, 1 1 , et la mesure en fonction du temps, à l'aide d'une observation visuelle ou d'un module de détection, 12, de la lumière émise, réémise, diffusée ou réfléchie ou transmise par l'échantillon. En Biologie, l 'échantillon consiste en une - ou une pluralité - d 'entités objets biologiques différentes, 13 et 14, positionnées à différentes positions. Des exemples de tels objets, sont, entre autres, une cellule, un virus, une protéine et un fragment d'ADN. En vision industriel le artificielle l 'échantillon peut être, par exemple, un élément semi-conducteur
La Microscopie est segmentée en différentes modalités ayant des caractéristiques et des finalités différentes. De nombreuses descriptions des différentes modalités, de leurs caractéristiques et de leurs avantages existent extensivement dans la littérature et se trouvent par exemple sur les web des sociétés Zeiss, Leica, Nikon, ou Olympus.
On peut structurer les applications de Microscopie de nombreuses
manières différentes: l'une d'entre elles est de distinguer les modalités de Microscopie dévolues à visualiser des minuscules sources ponctuelles de celles dévolues à mesurer des objets continus.
Le cas des minuscules sources ponctuelles est a priori beaucoup plus simple. L'objet consiste en un petit nombre de points lumineux ; ceux-ci peuvent être décrits par un petit nombre de paramètres - les descripteurs définis par la suite - simplifiant de beaucoup le problème physique et la complexité algorithmique. Le cas d'un objet continu, décrit par une distribution spatiale - ou spatio-temporelle, si on prend en compte la dynamique continue, est différent et est décrit aussi dans cette demande de brevet.
La microscopie de fl uorescence est une des modalités de la microscopie; elle a remplacé, dans de nombreuses applications, les autres techniques de microscopie. Un microscope à fluorescence est un microscope optique utilisé pour étudier les propriétés d'objets, ou de substances organiques ou inorganiques en utilisant les phénomènes de fluorescence au lieu de, ou en plus d'autres modalités telle que la réflexion et l'absorption.
On se réfère de nouveau à la Figure. 1 , décrivant, cette fois, un microscope de fluorescence utilisé soit en Biologie soit en Vision artificielle pour caractériser, par exemple, des matériaux; en microscopie de fluorescence on fixe des minuscules sources ponctuelles, 1 5 à 18, par exemple des fluorophores basées sur le phénomène physique de la fluorescence à un photon, à des positions spécifiques et prédéterminées des objets, 13 et 14; on observe la lumière émise par les sources ponctuelles en lieu et place d'observer la lumière émise par les objets, 1 3 et 14, eux-mêmes.
L'échantillon est éclairé par une lumière de longueur d'onde, ou de longueurs d'onde spécifiques, qui est absorbée par les sources ponctuelles, induisant ainsi l 'émission de lumière à des longueurs d'onde différentes et plus élevées. Lors de la collection de la lumière émise, en fluorescence, la lumière d'illumination est séparée de la fluorescence émise, qui est plus faible, par l'utilisation d'un filtre spectral d'émission.
La microscopie de fluorescence étudie la lumière émise par de petites sources ponctuelles, les fluorophores. Toutefois, lorsque la densité des fluorophores est élevée, les fluorophores ne sont plus analysés individuellement mais traités comme un objet continu. Il est important de noter, dès ce stade, que le même système permet l 'observation d'objets continus, et n'est pas limité à l'observation de sources ponctuelles.
Les fluorophores sont devenus un outil important de la visualisation d'objets biologiques. L'activité et l'information biologique comprenant des détails au-dessus de la limite de résol ution de 200 nm sont systématiquement visualisés et mesurées en utilisant la microscopie de fluorescence. Cette limite de résolution est dérivée du critère de Rayleigh, qui, dans le meilleur des cas, atteint 200nm dans des systèmes conçus spécialement.
Pendant longtemps, jusqu'à l'émergence des techniques de superrésolution décrites ci- dessous, il était reconnu que les techniques optiques, y compris la microscopie de fluorescence, sont incapables de visualiser des détails plus petits que le critère de Rayleigh, de l'ordre de 200 nm.
Cependant, d'autres activités biologiques fondamentales se produisent également à des échelles de taille inférieure à 200 nm dans des échantillons biologiques. A ce niveau de résolution spatiale, des phénomènes importants peuvent être observés : les processus biologiques à l'échelle intracellulaire, le transfert d'information cellulaire, le repliement et le dépl iement des protéines et les modifications de l'ADN et l'ARN. Ainsi, par exemple, la mesure de ces informations intracellulaires ouvrira de nouvelles voies à la compréhension de l'activité biologique, et conduira à des progrès dans la connaissance et le suivi de la recherche et du diagnostic médical.
Les principales implémentations de la microscopie de fluorescence, décrites en détails dans la littérature, sont le microscope confocal, souvent utilisé dans une configuration à balayage ou à disque rotatif et le microscope d'imagerie à grand champ.
On se réfère maintenant à la figure 2, qui est une représentation simplifiée d'un microscope confocal à fluorescence de l'art antérieur 200.
Un microscope confocal de fluorescence, Fig. 2, est un instrument optique. Ses principaux composants matériels sont représentés dans la figure. 2. Ils comprennent:
Une source de lumière, 20,
un cadre optomécanique non représenté,
un cube de filtres, 21 ,
un objectif de microscope 22, et,
un ensemble détecteur, 23,
une unité de traitement, non représentée.
La source de lumière, 20, qui peut être une lampe à arc ou d'un laser, crée de l'énergie lumineuse nécessaire pour la fluorescence.
Le cadre optomécanique, non représenté, est le support de tous les éléments optiques et comprend des optiques auxiliaires et les capacités d'alignement. Il comprend également, des éléments optiques, non représentés, capables de façonner le faisceau, pour permettre sa focalisation d' un point de taille minimale, au moyen de l'objectif du microscope.
11 peut comprendre également, dans un microscope confocal de fluorescence à balayage, un mécanisme de balayage, spatial ou angulaire, non représenté pour modifier la position de la source ponctuelle par rapport à l'objet à mesurer.
Le mécanisme de balayage peut alternativement:
translater mécaniquement l'objet, en utilisant par exemple une platine de translation,
scanner optiquement le faisceau sur l 'objet, en utilisant par exemple un ensemble de miroirs galvanométriques ou translateurs acousto-optiques, ou utiliser une combinaison quelconque de ces moyens de translation, mécaniques ou optiques.
Dans un microscope confocal de fluorescence à balayage, l'information est recueill ie point à point, en utilisant le mécanisme de balayage.
II peut comprendre également, dans un microscope confocal de fl uorescence à disque rotatif, un disque rotatif, comportant une pluralité de trous microscopiques, permettant la projection simultanée d'une pluralité de points. Dans un microscope confocal de" fluorescence à disque rotatif, un ensemble de points, correspondant aux trous
microscopiques est acquis à chaque instant et la rotation du disque permet de balayer l'ensemble de la surface de l'échantillon pour une position longitudinale donnée.
Le cube de filtres, 21 , canalise les différents signaux optiques et évite la contamination du signal de fluorescence parla lumière d'excitation. Le cube de filtres se décompose en: fi ltre d'excitation, 210, miroir dichroïque, 21 1 , et filtre d'émission, 212. Les filtres et le miroir dichroïque sont choisis en fonction de la longueur d'onde d'excitation et des caractéristiques spectrales d'émission du fluorophore.
L'objectif de microscope, 22, focalise la lumière créée par la source dans le plan focal de l'objectif, 24, en une distribution lumineuse de taille réduite, la distribution lumineuse optimale consistant en un disque d'Airy. L'objectif de microscope, 22, permet également de recueillir en retour la l umière fluorescente émise par les fluorophores.
Pour un microscope confocal de fluorescence à balayage le système peut être déscanné, c'est-à-dire que la lumière en retour peut passer par le mécanisme de balayage pour compenser la translation due au balayage.
Une lentille de détecteur, 25, crée, au plan image du détecteur 26, une image magnifiée du plan focal de l'objectif, 24. Un trou confocal, 27, est théoriquement placé dans le plan image du détecteur, 26. Dans la plupart des systèmes pratiques, le trou confocal, 27, est placé dans un plan d'imagerie intermédiaire non représenté et réimagé sur le plan image du détecteur, 26.
L'assemblage du détecteur, 23, détecte l ' intensité fluorescente globale dans le volume éclairé, et la transforme en signal numérique. Pour un microscope confocal à balayage, l'assemblage du détecteur est constitué d'un détecteur d'un seul élément, comme un PMT ou SPAD. Pour un microscope confocal à disque rotatif, l'assemblage du détecteur est constitué d'une matrice d'éléments de détection, telle qu'un CCD, un EMCCD, un CMOS ou une matrice de SPAD.
L'ensemble des composants montés à partir de la source lumineuse jusqu'au filtre dichroïque est la voie d'éclairage, 201 . L'ensemble des composants montés à partir du filtre dichroïque jusqu'à l'assemblage du détecteur est la voie de détection, 202.
Le processus optique élémentaire d'un microscope confocal peut être segmenté en six étapes:
· Projection de la lumière sur le volume d'analyse
• émission de lumière fluorescente par les fluorophores
• Imagerie des fluorophores sur le plan focal
• Limitation dans le plan focal de la lumière analysée par le trou confocal
• Intégration de la lumière analysée par un détecteur photoélectrique
· Visualisation de l'intensité mesurée sous forme d'une valeur de pixel dans une image
Des microscopes à fluorescence sont disponibles auprès de plusieurs fabricants, comme par exemple, Nikon, Zeiss, Leica ou Olympus. Les microscopes à fluorescence peuvent être soit des microscopes standards adaptés à la fluorescence soit des microscopes spécifiques optimisés pour la fluorescence. Les microscopes modernes sont des instruments polyvalents capables de fonctionner dans de nombreuses modalités différentes, y compris, mais sans s'y limiter, les modalités de fluorescence, en utilisant la même plateforme optomécanique et la plupart des composants. La plupart des microscopes à fluorescence sont développés en tant que plate-forme ouverte, capable d'effectuer plusieurs fonctionnalités additionnelles avec des modifications minimes. D'autres microscopes à fluorescence sont des instruments dédiés, personnalisés à une tâche spécifique, comme le diagnostic médical ou pharmaceutique.
Superrésolution
De nouvelles méthodes optiques, les méthodes de superrésolution, sont capables de discriminer des sources ponctuel les, en dessous du critère de Rayleigh. Ces méthodes sont développées par plusieurs entreprises, laboratoires et chercheurs et certains des instruments utilisant ces méthodes, les microscopes de superrésolution, sont disponibles
commercialement. Plusieurs analyses comparatives des méthodes de superrésolution ont été publiées récemment dans la littérature, comme les articles de Schermelleh et al. [ 1 ].
Une bibliographie mise à jour sur la superrésolution se trouve sur le site web de la société Zeiss, et sur le site web de la société Nikon.
Les différentes méthodes de microscopie existantes et les microscopes existants, n'incorporant pas la superrésolution, permettent l 'observation microscopique dans la limite de la diffraction optique. Ceci réduit leur champ d'utilisation à un ensemble d'applications limité,
Les nouvelles techniques de superrésolution permettent elles d'obtenir des informations au-delà de la limite de résolution. Le principal problème de l'ensemble des techniques existantes de superrésolution est que l'enveloppe des performances, exprimée en termes de résolution latérale, de résolution longitudinale, de vitesse, d'intensité lumineuse nécessaire, de photo-toxicité dans l'objet biologique, d'aptitude à mesurer des objets différents, est très l imitée.
De plus, la plupart des méthodes et instruments existants de superrésolution peuvent fournir soit une bonne résolution latérale, soit une bonne résolution longitudinale, mais rarement les deux.
De plus, tous ces instruments sont complexes et nécessitent une haute technicité de l' opérateur.
De plus, ces instruments ne peuvent observer généralement qu'une faible partie des spécimens biologiques, en raison de fortes l imitations opérationnelles, telles que pour certains d'entre eux une faible profondeur de champ ou de très fortes intensités nocives pour les cellules.
Un autre problème avec les méthodes et instruments existants de super résolution, est que la plupart d'entre eux sont en mesure de récupérer, dans le volume il luminé, les attributs d'un fluorophore unique, mais ne parviennent pas à reconnaître simultanément la présence de plusieurs fluorophores et de mesurer leurs attributs.
Un problème supplémentaire avec les méthodes et instruments existants de superrésolution est que ces méthodes et instruments existants sont présentés aux utilisateurs et perçus par eux comme un outil général, apte à remplacer les microscopes standard ou confocal. Cependant, les méthodes et instruments existants de superrésolution manquent de la simplicité, de la robustesse, de la faci lité d'utilisation et des prix compétitifs des microscopes standards ce qui freine leur utilisation comme outils de recherche générale ou comme outils de diagnostic. Un autre problème avec les méthodes et instruments existants de superresolution est que la plupart de ces méthodes et instruments sont construits comme des instruments autonomes conçus pour remplacer les microscopes standards. Une telle approche nécessite le remplacement des instruments existants ainsi que le renouvellement de tous les systèmes périphériques et toutes les connaissances et savoir-faire, liés aux plateformes de microscopie et développées depuis de nombreuses années.
Un autre problème avec la plupart des méthodes et instruments existants de microscopie de fluorescence et de superrésolution est que ces méthodes et instruments sont COnÇUS sur un paradigme d'acquisition d'image, pour lequel l'entité de base de l ' information est une - ou plusieurs images, ou une - ou plusieurs - régions ROI - Région Of Interest bi ou tridimensionnelles. Les méthodes algorithmiques, systémiques et de superrésolution décrites ultérieurement dans le contexte de l' invention permettront, par leur inhérente flexibilité, le développement de stratégies nouvelles d'acquisition. Ces procédures d'acquisition, dynamiques et sélectives, seront définies par une gestion optimisée de la séquence d'acquisition et de traitement interactif et différé. Elles permettront une optimisation plus évoluée de l 'information utile, définie par des critères basés sur la forme, la géométrie et la dynamique d'un ou plusieurs objets fluorescents, séparément ou l 'un par rapport à l 'autre.
11 y a donc toujours un besoin urgent de fournir des méthodes et instruments de superrésolution et des méthodes algorithmiques capable de mesurer avec une grande précision les attributs d'un fluorophore. Il est en outre nécessaire de fournir des méthodes et des instruments pour détecter et quantifier la présence de plusieurs fluorophores placés dans le même volume illuminé.
Un autre problème avec la plupart des méthodes et instruments existants de microscopie de fluorescence et de superrésolution est que ces méthodes et instruments sont conçus pour étudier des échantillons sur des lamelles de microscopes. Cependant, le microscope confocal est aujourd'hui utilisé dans de nombreux domaines médicaux comme instrument de diagnostics in-vivo pour des examens internes et externes au corps humain par le biais de fibres optiques utilisées pour illuminer et pour visualiser la fluorescence émise par les tissus à diagnostiquer. La superrésolution ne permet pas actuellement de pratiquer des tels diagnostics in-vivo. Les méthodes algorithmiques, systémiques et de superrésolution décrites ultérieurement dans le contexte de l ' invention permettront le développement de nouvelles méthodes de diagnostics in-vivo qui réduiront les besoins de pratiquer des biopsies et raccourciront le temps d'attente du patient. RESUME DE L'INVENTION :
Un premier aspect de cette invention concerne un procédé optique de mesure pour déterminer la distribution spatiale ou la localisation de sources réémettrices sur un échantil lon, l'échantillon comportant au moins une source réémettrice ledit au moins une source réémettrice réémettant de la lumière en fonction de la lumière projetée sur l 'échantillon, suivant une loi déterminée, par une première source lumineuse comprenant un premier laser, et la source réémettrice pouvant être déplétée ou activée par l'action d'une seconde source lumineuse, comprenant un second laser, le procédé comportant :
l 'utilisation des deux lasers, la longueur d'onde d'un des lasers étant accordée sur la longueur d'onde d'excitation dudit au moins une source réémettrice et la longueur d'onde du second laser étant accordée sur la longueur d'onde de déplétion ou d'activation dudit au moins une source réémettrice
la réalisation, à l'aide d' un sous module de polarisation, pour chaque laser, un état de polarisation contrôlé,
la projection sur l'échantillon, au moyen d'un appareil optique de projection achromatique, pour chaque laser une distribution lumineuse compacte, se propageant suivant le même chemin optique pour l 'ensemble des lasers,
la détection de la lumière réémise par ledit au moins une source réémettrice de l'échantillon ;
la génération, d'au moins une image, à partir de la lumière détectée.
Dans un mode de réalisation le procédé comporte en outre l 'analyse algorithmique des images pour obtenir une information de distribution spatiale ou localisation dudit au moins une source réémettrice.
Un deuxième aspect de l 'invention concerne Pachromatisation du procédé optique de mesure selon le premier aspect de l'invention de façon à permettre l'utilisation du procédé optique de mesure à différentes longueurs d'onde d'excitation et de déplétion, de façon à exciter sélectivement les sources réémettrices en fonction d'un marquage sélectif en longueur d'onde.
Un autre aspect de l 'invention concerne la réalisation d' un système de superrésolution de type STED ou RELSOFT à l 'aide d'un procédé optique de mesure à chemin optique commun achromatique et capable de beamshaping différent sur différents faisceaux en fonction de leur polarisation.
Un autre aspect de l 'invention concerne la colocalisation de tous les lasers à l 'aide d'un banc optique préférablement utilisant un système de fibre optique pour colocaliser les faisceaux avant leur mise en forme par le procédé optique décrit dans les précédents aspects. Un autre aspect de 1 ' invention concerne ia réalisation du procédé selon le premier aspect à l'aide de la diffraction conique.
Dans un mode de réalisation du procédé décrit précédemment, la distribution lumineuse compacte du premier laser d'excitation est de famil le topologique différente de celle du second laser de déplétion ou d'activation
Dans un mode de réalisation du procédé décrit précédemment,
lesdites au moins deux distributions lumineuses compactes de famil les topoiog.'ques différentes sont créées par une interférence entre une onde régulière et une onde singulière, ou entre deux ondes singulières, et une différenciation spatiale entre lesdites au moins deux distributions est créée en faisant varier au moins un des paramètres suivants:
a) au moins un des paramètres de l 'onde régulière;
b) au moins un paramètre d'au moins une onde singulière et
c) une différence de phase entre l 'onde régulière et l 'onde singulière ou entre les deux ondes singul ières.
Dans un mode de réalisation du procédé décrit précédemment, la projection de distributions lumineuses de familles topologiques différentes est effectuée par une diffraction conique ou un assemblage de cristaux uniaxes.
Dans un mode de réalisation du procédé décrit précédemment, la projection de distributions lumineuses de topologies différentes est effectuée par une diffraction conique dans un cristal mince.
Un mode de réalisation du procédé décrit précédemment, comportant le couplage de la lumière issue des lasers par un sous-module optique, à travers une fibre unique ou une voie optique unique
Dans un mode de réalisation du procédé décrit précédemment, la fibre optique comporte une fibre photonique.
Dans un mode de réalisation du procédé décrit précédemment, la fibre optique comporte une fibre à faible nombre de modes, « fe modes fiber» en anglais.
Un mode de réalisation du procédé décrit précédemment, comportant le contrôle des lasers pour créer conjointement une séquence de distributions d'excitation et une séquence de distributions de déplétion ou d'activation, les deux séquences étant synchronisées
Un mode de réalisation du procédé décrit précédemment, comportant le contrôle des lasers pour créer conjointement une séquence de distributions d'excitation et une séquence de distributions de déplétion ou d'activation, les deux séquences étant synchronisées, et une distribution singulière d'excitation étant simultanée à une distribution singulière de déplétion
Un mode de réalisation du procédé décrit précédemment, comportant le contrôle des lasers pour créer conjointement une séquence de distributions d'excitation et une séquence de distributions de déplétion ou d'activation, une des distributions d'excitation étant une superoscillation.
Un mode de réalisation du procédé décrit précédemment, comportant le contrôle des lasers pour créer simultanément ou suivant une séquence de distributions d'excitation et une séquence de distributions de déplétion ou d'activation, l'ensemble des distributions de déplétion ou d'activation étant équivalente ou similaire à un vortex.
Un autre aspect de cette invention concerne un dispositif de mesure pour déterminer la distribution spatiale ou la localisation de sources réémettrices sur un échantillon, l'échantillon comportant au moins une source réémettrice, ledit au moins une source réémettrice réémettant de la lumière en fonction de la lumière projetée sur l 'échantil lon par un premier laser, suivant une loi déterminée, et la source réémettrice pouvant être déplétée ou activée par l 'action d'un second laser le dispositif comportant:
deux lasers de longueurs d'ondes différentes, la longueur d'onde du premier laser étant accordée sur la longueur d'onde d'excitation de ladite au moins une source réémettrice et la longueur d'onde du second laser étant accordée sur la longueur d'onde de déplétion ou d'activation de ladite au moins une source réémettrice
un sous module de polarisation, pour chaque laser, d'un état de polarisation différent,
un module de projection achromatique permettant de créer pour chaque laser une distribution lumineuse compacte, se propageant suivant le même chemin optique pour l 'ensemble des lasers,
un module de détection apte à détecter de la lumière réémise par ledit au moins une source réémettrice de l'échantillon ;
un module de génération, apte à générer au moins une image optique, à partir de la lumière détectée; et
un module d'analyse algorithmique apte à analyser des images pour obtenir une information de localisation dudit au moins une source réémettrice.
Dans un mode de réalisation du procédé décrit précédemment, la distribution lumineuse compacte du laser d'excitation est de famille topologique différente de celle du laser de déplétion ou d'activation Dans un mode de réalisation du procédé décrit précédemment le module de projection est apte à créer lesdites au moins deux distributions lumineuses compactes de familles topologiques différentes par une interférence entre une onde régulière et une onde singulière, ou entre deux ondes singulières, et une différenciation spatiale entre lesdites au moins deux distributions est créée en faisant varier au moins un des paramètres suivants:
a) au moins un des paramètres de l 'onde régulière;
- b) au moins un paramètre d'au moins une onde singulière et
- c) une différence de phase entre l'onde régulière et l'onde singulière ou entre les deux ondes singulières.
Dans un mode de réalisation du procédé décrit précédemment, le module de projection comporte au moins un cristal conique pour effectuer la projection de distributions lumineuses de familles topologies différentes par une diffraction conique ou un assemblage de cristaux uniaxes.
Dans un mode de réalisation du procédé décrit précédemment, la fibre optique comporte une fibre photonique.
Dans un mode de réalisation du procédé décrit précédemment, le couplage de la lumière issue des lasers est accompli par un sous-module optique, à travers une fibre unique ou une voie optique unique
Dans un mode de réalisation du procédé décrit précédemment, la fibre optique comporte une fibre à nombre de modes limité, « few modes fiber» en anglais.
Dans un mode de réalisation du procédé décrit précédemment, ledit au moins un cristal conique, défini ultérieurement, est un cristal mince.
Dans un mode de réalisation du procédé décrit précédemment, les lasers sont configurés pour créer conjointement une séquence de distributions d'excitation et une séquence de distributions de déplétion ou d'activation, les deux séquences étant synchronisées
Dans un mode de réalisation du procédé décrit précédemment, les lasers sont configurés pour créer conjointement une séquence de distributions d'excitation et une séquence de distributions de déplétion ou d'activation, les deux séquences étant synchronisées, et une distribution singulière d'excitation étant simultanée à une distribution singulière de déplétion
Dans un mode de réalisation du procédé décrit précédemment, les lasers sont configurés pour créer conjointement une séquence de distributions d'excitation et une séquence de distributions de déplétion ou d'activation, une des distributions d'excitation étant une superoscillation.
Dans un mode de réalisation du procédé décrit précédemment, les lasers sont configurés pour créer conjointement simultanément ou suivant une séquence de distributions d'excitation et une séquence de distributions de déplétion ou d'activation, l'ensemble des distributions de déplétion ou d'activation étant équivalente ou similaire à un vortex.
La description des modes de réalisation de l 'invention basée sur la microscopie confocale de fluorescence, peut être étendue mutatis mutandis, aux autres modalités de microscopie, confocales ou non. et à la Vision artificielle, qu'elles observent des objets biologiques, de vision artificielle ou autres, et que l 'objet consiste de sources ponctuelles, d'objets structurés ou d'objets continus.
Un autre aspect de l'invention concerne un procédé optique de mesure pour déterminer la distribution spatiale ou la localisation de sources réémettrices sur un échantillon, l'échantillon comportant au moins une source réémettrice ledit au moins une source réémettrice réémettant de la lumière en fonction de la lumière projetée sur l 'échantillon, suivant une loi déterminée, par une première source lumineuse comprenant un premier laser, et ladite au moins une source réémettrice pouvant être déplétée ou activée par l 'action d'une seconde source lumineuse, comprenant un second laser, le procédé comportant :
l 'utilisation de deux lasers, la longueur d 'onde du premier laser étant accordée sur la longueur d'onde d'excitation dudit au moins une source réémettrice et la longueur d'onde du second laser étant accordée(s) sur la longueur d'onde de déplétion ou d'activation dudit au moins une source réémettrice
la projection sur l 'échantillon, au moyen d' un appareil optique de projection achromatique pour le premier laser et le deuxième laser des distributions lumineuses, la détection de la lumière réémise par ledit au moins une source réémettrice de l'échantillon ; et
la génération, d'au moins une image, à partir de la lumière détectée.
Dans un mode de réalisation du procédé décrit précédemment, la projection comprend pour le premier laser une distribution lumineuse compacte, et pour le second laser de deux distributions compactes l'une d'entre elles ayant un zéro d' intensité se propageant axialement suivant un mouvement de spirale. Dans un mode de réalisation des procédés décrit précédemment, les deux distributions créant une déplétion sont issues de deux lasers indépendants à la même longueur d'onde ou à une longueur d'onde proche. Dans un mode de réalisation du procédé décrit précédemment, la projection sur l 'échantillon est effectuée au moyen d'un appareil optique de projection
achromatique, comportant un élément optique ayant la fonctionnalité de segmenter un faisceau optique en une pluralité de faisceaux indépendants, la projection comportant pour les deux lasers une matrice de distributions lumineuses compactes et collocalisées,
Dans un mode de réalisation du procédé décrit précédemment, l 'élément optique comporte une matrice de microlentilles.
Dans un mode de réalisation du procédé décrit précédemment, l 'appareil optique de projection achromatique, comporte un élément de duplication permettant de dupliquer les distributions lumineuses latéralement pour les deux lasers d'une matrice de distributions lumineuses compactes et collocalisées.
Dans un mode de réalisation du procédé décrit précédemment, l 'élément de duplication comporte un réseau de transmission à séparateur de faisceaux ou un cri:
uni axe.
Dans un mode de réalisation du procédé décrit précédemment, l 'appareil optique de projection achromatique, inclut au moins un élément optique supplémentaire, ayant la fonctionnalité de créer à partir d'un faisceau incident deux ou plus faisceaux décalés latéralement ou axialement, pour les deux lasers d' une matrice de distributions l umineuses compactes et collocalisées.
Dans un autre mode de réalisation des dispositifs décrits précédemment, un faisceau supplémentaire dérivé du laser de déplétion ou un dispositif comportant un second laser de déplétion, contient une des distributions lumineuses à forte dépendance axiale telles que les Stokes ou une autre distribution décrite dans cette invention, pour réduire la taille axiale du volume émetteur. Dans un autre mode de réalisation des dispositifs décrits précédemment, on utilise un élément dynamique de polarisation avant ou après le cristal biaxe pour corriger le mouvement dynamique de la pupille, qui dans certains cas peut être créée au cours du balayage optique du microscope confocal. Cet effet de mouvement de la pupille étant dans certaines implémentations des technologues STED une des limites des performances, sans nécessiter d'un système de balayage supplémentaire.
Dans un autre mode de réalisation des dispositifs décrits précédemment, on projette à l 'aide d'un module LatSRCS original ou modifié, deux ou plusieurs distributions lumineuses localisées à différentes longueurs d'onde. La première distribution lumineuse permet de rendre la scène parcimonieuse, c'est-à-dire isoler des émetteurs à l'aide d'un effet physique, de façon à créer des régions dans lesquelles on peut émettre l'hypothèse de parcimonie c'est-à-dire la présence d'un émetteur isolé ou d'un petit nombre d'émetteurs. Les effets physiques qui permettront de réaliser cette parcimonie seront les mêmes ou seront des effets dérivés, des effets utilisés pour créer la parcimonie pour les techniques de microscopie de localisation d'émetteurs uniques.
Dans un autre mode de réal isation, la plateforme de microscope qui a été décrite est couplée à un système de microscopie électronique (CLEM- Corrélative Light Electron Microscopy), ou tout autre système similaire tel que le TEM (Transmission Electron icroscopy), ou ΓΕΒΜ (Electron Beam Microscopy), ou la SEM ( Scannmg Electron M icroscopy).
Dans un autre mode de réalisation de l'invention, on utilise des distributions ayant une forte dépendance axiale telles que les stokes. et les distributions dites « demi-lunes décalées » pour caractériser la dépendance axiale d'un point dans le cas d' un système de microscopie de localisation.
Dans un autre mode de réa l isation de l 'invention, on uti l ise des distributions ayant une forte dépendance axiale telles que les stokes. et les distributions dites « demi-lunes décalées » pour caractériser la dépendance axiale d'un point dans le cas d'un système de microscopie de localisation dans lequel on a uti l isé un module LatSRC original ou modi fié pour rendre ta scène parcimonieuse de façon locale et mesurer la position des sources réémettrices parcimonieuses à l 'aide d 'une des techniques de type PS1T.
Dans un autre mode de réalisation de l'invention, on réalisera une technique de dark tracking dans laquel le le suivi d ' un poi nt est réalisé par la projection d' un vortex ou d' une autre distribution contenant un ou pl usieurs zéro d'intensité optique et la compensation dynamique du mou vement d 'un émetteur détecté lorsque l'émetteur se retrouve en dehors du zéro d 'intensité optique susdit.
Dans un autre mode de réalisation, on utilise une cascade de prismes de Wollaston de différentes séparations de faisceaux pour séparer un faisceau incident en un grand nombre de faisceaux émergents. On peut obtenir le même effet en modifiant le prisme de Wollaston, pour créer le prisme de Wollaston composé, en lui ajoutant des pièces de cristal uniaxe dont l 'indice et l 'orientation de la biréfringence sont choisis. On peut ainsi construire un prisme d'un seul bloc de cristal uniaxe qui peut séparer un faisceau incident en 2"faisceaux émergents (par exemple huit ou seize), qui sont contenus dans un plan, et séparé par des angles égaux. Une fois focalisés sur l'échantillon, on obtient 2" points alignés et également séparés.
Dans un mode de réalisation des procédés décrits précédemment, le procédé comporte en outre l'analyse algorithmique des images pour obtenir une information de distribution spatiale ou localisation dudit au moins une source réémettrice.
Un autre aspect de l 'invention concerne un dispositif optique de mesure pour déterminer la distribution spatiale ou la localisation de sources réémettrices sur un échantillon, l'échantillon comportant au moins une source réémettrice ledit au moins une source réémettrice réémettant de la l umière en fonction de la lumière projetée sur l 'échantillon, suivant une loi déterminée, par une première source lumineuse comprenant un premier laser, et ladite au moins une source réémettrice pouvant être dépiétée ou activée par l 'action d'une seconde source lumineuse, comprenant un second laser, le dispositif comportant :
un premier laser et un second laser, la longueur d'onde du premier laser étant accordée sur la longueur d'onde d'excitation dudit au moins une source réémettrice et la longueur d'onde du second laser étant accordée(s) sur la longueur d'onde de déplétion ou d'activation dudit au moins une source réémettrice
un module de projection achromatique pour créer pour le premier laser et le deuxième laser des distributions lumineuses,
un module de détection pour détecter la lumière réémise par ledit au moins une source réémettrice de l 'échantillon ;
un module de génération pour générer au moins une image, à partir de la lumière détectée. Dans un mode de réalisation du dispositif décrit précédemment le module de projection est apte à créer pour le premier laser une distribution lumineuse compacte, et pour le second laser de deux distributions compactes l 'une d'entre elles ayant un zéro d'intensité se propageant axialement suivant un mouvement de spirale.
Dans un mode de réalisation du dispositif décrit précédemment, les deux distributions créant une déplétion sont issues de deux lasers indépendants à la même longueur d'onde ou à une longueur d'onde proche. Dans un mode de réalisation des dispositifs décrits précédemment, le module de projection achromatique, comporte un élément optique ayant la fonctionnalité de segmenter un faisceau optique en une pluralité de faisceaux indépendants, la projection comportant pour les deux lasers une matrice de distributions lumineuses compactes et coi localisées.
Dans un mode de réalisation des dispositifs décrits précédemment, l 'élément optique comporte une matrice de microlentilles.
Dans un mode de réalisation des dispositifs décrits précédemment, le module de projection achromatique, comporte un élément de duplication permettant de dupliquer les distributions lumineuses latéralement pour les deux lasers d'une matrice de distributions lumineuses compactes et collocalisées.
Dans un mode de réalisation des dispositifs décrits précédemment, l'élément de duplication comporte un réseau de transmission à séparateur de faisceaux ou un cristal uniaxe.
Dans un mode de réalisation des dispositifs décrits précédemment, le module de projection achromatique, comporte au moins un élément optique supplémentaire, ayant la fonctionnalité de créer à partir d'un faisceau incident deux ou plus faisceaux décalés latéralement ou axialement, pour les deux lasers d'une matrice de distributions lumineuses compactes et collocalisées,
Dans un mode de réalisation des dispositifs décrits précédemment, le dispositif comporte en outre un module d'analyse algorithmique apte à analyser les images pour obtenir une information de distribution spatiale ou localisation dudit au moins une source réémettrice.
Un autre aspect de l' invention concerne un système optique et/ou optoélectronique, comportant
un module d'acquisition d' image pour acquérir un ensemble d' images différentes et différenciées, issues de la même région spatiale d'un objet, bidimensionnelie ou tridimensionnelle,
un algorithme dans lequel la formulation de la reconstruction la reconstruction de l 'objet et de ses propriétés spatiales et/ou temporel les et/ou spectrales est considérée comme un problème inverse bayésien et conduit à la définition d'une distribution a posteriori.
une loi a posteriori combinant, grâce à la loi de Bayes, la formulation probabiliste d' un modèle de bruit, ainsi que d'éventuels aprioris sur une distribution de lumière crée dans l'échantillon par projection;
l'estimation de la distribution de lumière dans l'échantillon par l'utilisation de nuées d'émetteurs ponctuels qui permet de favoriser les solutions parcimonieuses;
l'estimation de la moyenne a posteriori au moyen d'un algorithme de type Monte-Carlo Markov Chain (MCMC),
la représentation des résultats soit sous forme d'une image soit sous forme de données numériques ou graphiques
BREVE DESCRIPTION DES DESSINS
L'invention va maintenant être décrite en relation avec certains modes de réalisation en référence aux figures illustratives suivantes de sorte qu'elle puisse être mieux comprise.
Avec une référence spécifique aux figures, il est souligné que les indications figurantes sont présentées à titre d'exemple, et à des fins d'illustration de la discussion des modes de réalisation de l'invention et ne sont présentés que dans le but de fournir ce qui puisse être considéré la description la plus utile et facile à comprendre des principes et des aspects conceptuels de l'invention. A cet égard, aucune tentative n'est faite pour montrer des détails de structure de l'invention plus en détail que ce qui est nécessaire pour une compréhension fondamentale de l'invention, la description prise avec les dessins faisant apparaître à l'homme de l'art comment les différentes formes de l'invention peuvent être réalisées dans la pratique.
Dans les dessins: Fig. 1 est une représentation simplifiée en perspective d'un microscope à fluorescence confocal de l'art antérieur, utilisé aussi comme support de l'invention;
Fig. 2 est une représentation picturale simplifiée d'un système de superrésolution en microscopie de fluorescence, conformément à un mode de réalisation de la présente invention;
Fig. 3 est une illustration schématique simplifiée d'un setup d'un module de diffraction conique, conformément à un mode de réalisation de la présente invention;
Fig. 4 est une représentation picturale simplifiée des deux paradigmes de mesure selon des modes de réalisation de l 'invention et de la microscopie confocale;
Fig. 5 est une représentation picturale simplifiée d'un mode de réalisation particulier de la plateforme de microscopie SRCDP ;
Fig. 6a est une illustration schématique simplifiée d'un module latéral de
superrésoiution, conformément à un mode de réalisation de la présente invention;
Fig. 6b est une illustration schématique simplifiée d'une autre réalisation d'un module latéral de superrésolution, conformément à un mode de réalisation de la présente invention;
Fig. 7 présente des tables de distributions lumineuses d'un module de diffraction conique en fonction de la polarisation des polariseurs d'entrée et de sortie pour plusieurs valeurs du paramètre de diffraction conique, po. Ces distributions lumineuses ont été calculées par simulation des équations développées par Berry, [2] ;
Fig.8 est une illustration schématique si mplifiée d' un des modes de réalisation du dark tracking ;
Fig. 9 est une illustration schématique simpl ifiée d'une méthode d'algorithme de superrésolution de données de fluorophores, conformément à un mode de réalisation de la présente invention.
Fig. 10 est une illustration schématique simplifiée du calcul desdescripteurs ;
Fig. 1 1 est une illustration schématique simplifiée du module de contrôle de la plateforme SRCDP.
Dans toutes les figures, des chiffres de référence similaires identifient des pièces similaires.
Définitions et compléments techniques
Les définitions usuelles sont utilisées dans la description pour: phase et polarisation, poiarimétrie, vecteurs et matrices de Jones, paramètres de Stokes et techniques de mesure des paramètres de Jones et de Stokes. Les définitions usuelles sont util isées dans la description pour le mode TEMoo d'une fibre et les termes anglais, « Photonic Crystal Fiber » - PCF -,« few modes fiber » - FMF , vortex Fiber et « dual core Photonic Crystal Fiber ».
Nous nous référerons à un dispositif permettant de coupler plusieurs lasers à différentes longueurs d'onde ou à une même longueur d'onde, avec la même polarisation ou avec différentes polarisations, dans une ou plusieurs fibres optiques, en utilisant le terme de banc laser.
La définition des superoscillations est celle de Yakir Aaronov et Sir ichael Berry. Une superoscillation est un phénomène dans lequel un signal qui est globalement limité en bande peut contenir des segments locaux qui oscillent plus rapidement que ses composantes de Fourier les plus rapides. [26]
Le centre ou centroïde d'une distribution de lumière est le centre de gravité de l'intensité. Le diamètre d'une distribution de lumière est le diamètre du premier zéro d'intensité, pour des ondes régulières et singulières, sans prendre en compte le zéro central de l'onde singulière.
Deux distributions de lumière sont collocalisées si leurs centres coïncident ou sont séparés par une valeur spatiale faible par rapport à la dimension de la distribution de lumière.
Dans cette demande de brevet, nous utiliserons la longueur d'onde d'émission, comme métrique de base du système.
Dans cette demande de brevet, les définitions usuelles sont utilisées pour les composants optiques suivants : lentille dont la définition est élargie, pour inclure l'ensemble des moyens optiques qui transmettent, réfractent ou réfléchissent la lumière, optique auxiliaire - sous-module optique visant à interfacer et à ajuster soit les paramètres géométriques soit les paramètres de phase et/ou de polarisation entre deux autres sous- modules ou modules optiques -, polariseur, analyseur, lame de retard, séparateur de faisceau beamspl itter en anglais, polarisant et non-polarisant, combineur de faisceau beam combiner en anglais, polarisant et non-polarisant.
Dans cette demande de brevet, les définitions usuelles sont utilisées pour les polariseurs azimutal et radial. Nous étendrons, implicitement ou explicitement, certains développements décrits ultérieurement pour les polariseurs azimutal et radial, à l'ensemble des éléments polarisants variables dans l'espace.
Dans cette demande de brevet, les définitions usuelles, [3], sont utilisées pour les différentes techniques de superrésolution; ces techniques peuvent être regroupées en familles: REversible Saturable OpticaL Fluorescence Transitions(RESOLFT), regroupant les techniques : Stimulated Emission Depletion microscopy (STED), Ground state depletion (GSD), Saturated Structured Illumination Microscopy (SSIM) et SPE (Saturated Pattern Excitation Microscopy), Localisation Microscopy, (microscopie de localisation, en anglais) regroupant les techniques Photoactivated localization microscopy (PALM), FPALM (3D Localization in Fluorescence Photoactivation Localization Microscopy), Stochastic optical reconstruction microscopy (STORM), dSTORM (direct STORM), SPDM (Spectral Précision Distance Microscopy), « stochastic blinking », Ground state depletion (GSD), et techniques similaires (quel que soit l 'acronyme utilisé)
Structured Image Microscopy (SIM)
FRAP (fluorescence recovery after photobleaching),
TIRF (Total Interna! Reflection Fluorescence Microscopy).
Dans cette demande de brevet, les définitions usuelles sont utilisées pour différentes techniques de Microscopie, de résolution standard ou de superrésolution, fluorescentes ou non, telles que les termes anglais« Computational Microscopy », « Corrélative
Microscopy », « Cross-platform-microscopy », FCS - Fluorescence Corrélation
Spectroscopy », FCCS -« Fluorescence Cross-Correlation Spectroscopy », ou PCH -
Photon Counting Histogram, RICS « Raster Imaging Corrélation Spectroscopy » ou FRAP - « Fluorescence Recovery after Photobleaching) analysis ».
Dans cette demande de brevet, les définitions usuelles sont utilisées pour la
Transformée de Hough.
Nous nous référons à un polariseur partiel pour décrire un élément ou un module dont l'absorption est différente pour les deux polarisations linéaires - dichroïsme linéaire - ou pour les deux polarisations circulaires - dichroïsme circulaire.
Nous nous référons à des éléments dynamiques de polarisation ou de phase, pour décrire les moyens optiques dont les propriétés de polarisation ou de phase varient en fonction du temps de façon contrôlée, de façon discrète ou continue.
Ces éléments dynamiques de polarisation ou de phase comprennent, mais ne sont pas limités à: lames d'onde tournante sur leur axe, valves de lumière basées sur des technologies à cristaux liquides, dispositifs électro-optiques, connus aussi comme cellules de Pockels, cellules de Kerr, dispositifs électro-optiques résonnants, dispositifs magnéto- optiques, connus également en tant que cellules de Faraday, dispositifs acousto- ou élasto- optiques ou toute combinaison de ces moyens. Nous nous référons à des éléments dispersifs de polarisation ou de phase pour décrire des éléments dont l 'état de polarisation dépend de la longueur d'onde. Le plus simple des sous-modules dispersifs de polarisation est la lame d'onde multimode ou épaisse.
Nous nous referons a P « algorithme du centroïde » pour décrire la procédure usuelle de mesure du centroïde et éventuellement de la largeur (FWHM - acronyme en anglais pour « Full width Half Maximum ») d'une distribution lumineuse.
Cet algorithme a sa source dans l 'Astronomie et l'Astrométrie, et a permis la mesure de la position des étoiles avec une très grande précision. Cet algorithme est utilisé aujourd'hui dans l 'ensemble de l 'instrumentation optique, y compris en Biologie de superrésolution.
Dans ce document, les définitions usuelles sont utilisées pour les composants optoélectroniques suivants : détecteur photoélectrique, CCD, EMCCD, CMOS, SPAD Single Photon Avalanche Diode et matrice de SPAD.
Nous util iserons les termes:
o image optique, pour la distribution spatiale d'intensité lumineuse,
o image électronique, pour décrire la distribution spatiale de charges pour un CCD, de courant pour un CMOS ou d'événements pour un SPAD, créées par l ' image optique, à un instant donné, dans un plan de détection,
o image numérique, pour décrire une matrice de nombres créée par la
numérisation de l'image électronique.
Pour simplifier la lecture et la compréhension du texte nous utiliserons aussi le terme d'image pour !a sortie d'un détecteur à pixel unique tel qu'un PMT ou SPAD, en la considérant comme une image consistant en un unique pixel.
Lorsqu'aucune ambiguïté n 'existe, ou que la distinction entre les trois types d'images n'est pas nécessaire, nous utiliserons le terme simplifié générique d'image.
Pour les images, nous utilisons la terminologie utilisée pour les détecteurs matriciels, tels que les CCD, les EMCCD et les CMOS. Pour les SPAD et les matrices de SPAD, le résultat d'une mesure est une liste ordonnée dans le temps, d' impacts de photons détaillant, pour chaque photon, le temps d'impact et la position de Timpact. Pour simplifier la présentation de ce document, nous inclurons ce cas dans notre définition des images.
Les images détaillées dans ce document, dans de nombreux cas, peuvent être qualifiées des microimages, des images de taille sensiblement égale à un petit nombre de diamètres du disque d'Airy, typiquement inférieur à 5 diamètres, et/ou à faible nombre de pixels, typiquement 4*4 à 32*32. Dans une image numérique Aj, les indices m et n représentent les indices des pixels : l 'origine des pixels sera choisie comme la projection du centre du volume d'analyse défini dans un paragraphe ultérieur.
Polarimétrie et vecteurs de Stokes
La polarimétrie se réfère à la mesure de l'état de polarisation de la lumière incidente. L'état de polarisation de la lumière incidente peut être décrit par les paramètres de Stokes, un ensemble de valeurs, introduit par George Gabriel Stokes en 1852, et utilisé en Optique.
Copropagation de deux faisceaux optiques
De nombreux systèmes et dispositifs optiques utilisent deux faisceaux - ou plus - ayant des propriétés différentes. Les faisceaux peuvent interagir entre eux ou non, être projetés séquentiellement ou simultanément. Dans la majorité de ces systèmes et dispositifs, les deux chemins optiques sont séparés physiquement l 'un de l 'autre. Cette séparation physique créée, au niveau de l 'ingénierie du système un ensemble de contraintes, qui bien que résolvables, alourdissent de façon importante la complexité du système et son coût. "Nous nous référons à des systèmes à chemin commun « common path » en anglais, pour référencer un ensemble de dispositifs dans lesquels les deux faisceaux différenciés se propagent suivant le même chemin physique, à des variations mineures près.
Champ électrique en coordonnées polaires et modes angulaires
Ε(ρ, θ) = Α(ρ, θ) . εχρ [ΐ φ(ρ, θ)) υ(ρ, θ) (EQ. 1 )
II est usuel en Optique de décomposer les composantes du champ, soit son ampl itude, sa phase et sa polarisation, en modes orthogonaux, cartésiens ou polaires.
De nombreuses décompositions en modes orthogonaux polaires, tels que les modes
Gaussiens, Hermite-Gaussiens, et Laguerre-Gaussiens sont connus de l'Homme de l 'Art.
Nous utiliserons principalement dans ce document, la décomposition de l'amplitude du champ électrique en modes Hypergéométriques-Gaussiens HyGG de forme :
Α(ρ, θ) oc HH exp (-/>2 + ϋθ) (EQ. 2)
Dans cette décomposition, p est le mode radial et C l'ordre azimutal. Ondes singulières
Une onde singulière comprend une intensité nulle en son centre et une variation de phase azimutale d'un multiple de 2%. Ce thème de recherche en Optique, initié par l 'article majeur de J.F Nye et M. Berry. en 1 74, [4], est maintenant connu comme l'« optique singulière ». Des exemples d'ondes régulières et singulières sont présentés dans la suite.
Nous utilisons le terme anglais beam shaping pour décrire la transformation d'une onde de forme et de topologie donnée en une onde d'une autre forme ou topologie, et en particulier la transformation d'une onde régulière en singulière et vice versa.
Topologie et distributions lumineuses compactes
Une distribution lumineuse, ponctuel le, sera réputée compacte si elle remplit une des conditions de compacité définies ci-dessous, par deux conditions alternatives et non exclusives :
soit, plus de 75% de l 'énergie est contenue dans un cercle de rayon inférieur à 1.75 fois le rayon d'Airy,
soit un domaine lumineux, contenant plus de 65% de l 'énergie est délimité par une ligne d' intensité nulle comprise dans un cercle de rayon inférieur à deux fois le rayon d'Airy,
Nous distinguons différentes familles de distributions lumineuses ponctuelles, de topologies différentes :
Les distributions régulières, dans leur définition usuelle en Optique,
Les distributions singulières, dénommées aussi vortices optiques, de charge topologique (ordre azimutal) l, dans lesquelles la phase varie de 0 à 2π £,autour de la direction de propagation, C étant un entier.
Les distributions d'amplitude à variation azimutale d'ordre t, dénommées aussi distribution de Laguerre-Gauss,
Les distributions de polarisation et optionnel lement de phase à variation azimutale d'ordre Edénommées aussi modes de Laguerre-Gausspolarisés radialement.
Deux distributions lumineuses compactes, seront réputées de fami lles topologiques différentes si elles remplissent au moins une, et n' importe laquelle, des conditions suivantes :
L' une est régulière et l 'autre est singulière,
L'une est ponctuel le et l 'autre est annulaire,
Les ordres azimutaux C de l'amplitude des deux distributions lumineuses différent, Les ordres azimutaux £ de la polarisation ou de la phase des deux distributions lumineuses différent. Alternativement, deux distributions lumineuses projetées sur un volume donné seront réputées de topologies différentes si dans une partie conséquente de la surface i lluminée conjointement, les gradients sont de direction inversées.
Nanoémetteurs lumineux
Un nanoémetteur lumineux est un petit émetteur secondaire, attaché à un objet; il est de taille sensiblement inférieure à une fraction de longueur d'onde, typiquement mais non limité à une taille inférieure à un cinquième de la longueur d'onde ; un nanoémetteur lumineux absorbe l'énergie incidente et réémet de la lumière à la même longueur d'onde que la lumière incidente ou à des longueurs d'onde différentes ; la lumière émise par le nanoémetteur peut être cohérente, partiellement cohérente ou incohérente avec la lumière absorbée. Les principaux exemples de nanoémetteurs lumineux sont les fluorophores et les nanoparticules, mais ils incluent aussi un grand nombre d'autres éléments.
La définition, dans le contexte de l 'invention, des nanoémetteurs lumineux est, déterminée par les deux conditions suivantes:
création d'un émetteur lumineux secondaire ponctuel,
et
positionnement prédéterminé de cet émetteur relativement à une entité artificielle, biologique ou organique.
Les mécanismes physiques qui peuvent créer un nanoémetteur sont nombreux ; ils incluent mais ne sont pas limités à l 'absorption, la diffusion ou la réflexion, la
fluorescence, «émission-déplétion», [5], par exemple en utilisant les techniques
RESOLFT, les phénomènes de photo activation et de photo déplétion, la fluorescence à deux ou plusieurs photons, la diffusion élastique ou non, la diffusion Raman, ou à d'autres mécanismes physiques connues de l'Homme de l'Art. Nous utiliserons le terme émission de lumière pour décrire l'émission d'ondes électromagnétiques par le nanoémetteur lumineux, que la lumière soit cohérente, incohérente ou partiellement cohérente.
Nous étendrons notre définition des nanoémetteurs, en y incluant les particules diffusantes, absorbantes et réfléchissantes, attachées à une entité biologique ou organique ; l'action d'une particule diffusante, réfléchissante ou absorbante sur le champ
électromagnétique peut en effet être décrite comme la création avec une phase inverse, suivant le principe de Babinet, pour une particule absorbante d'un champ secondaire auxiliaire, émergeant de la particule, superposé au champ électromagnétique incident.
Nous nous référerons dans cette demande de brevet aux descripteurs d'un nanoémetteur pour dénoter l'ensemble d'information décrivant un nanoémetteur en tant que source ponctuelle, à un instant déterminé. Etant donné que le nanoémetteur est considéré comme une source ponctuelle, l'ensemble de l 'information le représentant contient un nombre limité de paramètres, soit : sa position dans l 'espace, son intensité, les caractéristiques spectrales, d' intensité, de cohérence, de phase et de polarisation de la lumière émise par le fluorophore, en fonction de la lumière incidente.
"Nous nous référerons dans cette demande de brevet aux descripteurs d'un objet structuré. Par exemple, pour une ligne uniforme, l'ensemble de l 'information le représentant contient un nombre limité de paramètres, soit : son orientation dans l 'espace, son intensité, les caractéristiques spectrales, d'intensité, de cohérence, de phase et de polarisation de la lumière émise par le l 'objet, en fonction de la lumière incidente.
Pour une distribution continue, l 'objet est représenté, comme habituel en traitement d'image, par une matrice d'intensités.
Toutefois, dans la majorité des cas, et dans la description de l ' invention, nous nous référons, sous la désignation de descripteurs, à un sous-ensemble des descripteurs d'un nanoémetteur comprenant sa position géométrique, son intensité, et le type du fluorophore. lorsque plusieurs populations de nanoémetteurs lumineux, différenciées par exemple par leur spectre d'émission, sont présentes dans un même échantillon. Cette simplification utilisée dans la description n'altère pas le domaine de l ' invention qui inclura dans son champ d'application l 'intégralité des descripteurs des nanoémetteurs lumineux.
Pour simplifier la compréhension du contexte de l'invention, la suite de la description référence seulement le cas le plus simple, celui dans lequel le nanoémetteur est un fluorophore et l 'interaction physique est la fluorescence à un photon. Pourtant, cette description doit être comprise comme une illustration simplifiée d'une description générale des méthodes et concepts applicables à l 'ensemble des nanoémetteurs lumineux cités préalablement ou connus de l ' Homme de l 'Art, quel que soit le phénomène physique sous- jacent.
II est marquant que le nanoémetteur échantil lonne le champ ou l 'intensité incidente à une position tridimensionnelle précise, sans influence de l'ensemble de la distribution spatiale de l 'intensité incidente. Nous référencerons cette propriété remarquable dans cette demande de brevet comme la capacité d'échantillonnage du nanoémetteur lumineux.
Toutefois, le mode de réalisation de l ' invention décrit permet aussi de mesurer des objets structurés et des distributions continues ne possédant pas la capacité
d 'échantillonnage du nanoémetteur lumineux.
On se réfère de nouveau à la Figure. 1 ; qui représente un ensemble de nanoémetteurs ou d'objets structurés, positionnés sur un objet biologique donné, 1 5 et 16 d 'une part et 1 7 et 1 8 d'autre part. Alternativement, la lumière émise peut consister en une distribution continue, non représentée sur la Figure 1 , ou en toute combinaison de nanoémetteurs, d'objets structurés ou de distribution continues. L'ensemble de nanoémetteurs, d'objets structurés ou de distribution continues est référencé comme un ensemble «d'objets biologiques lumineux»; i ls représentent une carte de l'objet biologique, dans le sens défini par Alfred Korzybski en sémantique générale. Il est toutefois de pratique courante pour simplifier la description, de référencer l'objet biologique lumineux comme l 'objet biologique lui-même, lorsqu'aucune ambiguïté ne peut apparaître. L'objet biologique lumineux contient de nombreuses informations pertinentes liées à l 'objet biologique, principalement l' information spatiotemporelle, la position de l 'objet et son orientation en fonction du temps, et l 'information morphologique, par exemple dans le cas de la scission d'une cellule en deux.
Le système de mesure selon au moins un mode de réalisation de l 'invention permettra de calculer la carte mesurée, et effectuer une évaluation des descripteurs de toute combinaison de nanoémetteurs, d'objets structurés ou une évaluation de la distribution spatiale de distributions continues. Cette carte mesurée diffère de la carte originale, en raison du bruit, des conditions de mesure, des limites du système ou de l 'incertitude de mesure. Cette information de la carte mesurée peut être élaborée ultérieurement en différents niveaux d'abstraction. Ce premier niveau d'abstraction, qui décrit les résultats directs de la mesure, ne contient, à priori, aucune information biologique mais les résultats d' une mesure physique décrite par des nanoémetteurs, d'objets structurés ou de distributions continues, qui pourrait d'ai lleurs représenter n'importe quelle entité marquée.
Le second niveau, le niveau d'abstraction géométrique structure les nanoémetteurs, d'objets structurés ou de distributions continues sous forme d'objets géométriques. Il consiste en une description d'objets lumineux et de leurs caractéristiques dynamiques, telles que leur position ou orientation, ou leur morphologie. A ce niveau, l 'information est encore une information physique et géométrique décrivant un ensemble d'objets.
L' information géométrique utilise la carte mesurée et une information auxiliaire, potentiel lement extérieure au système, sur la relation entre les points lumineux et des objets.
Le niveau d'abstraction biologique permet une certaine appréhension de la réalité biologique grâce à une relation constitutive entre les objets mesurés et des entités biologiques correspondantes. Il contient un ensemble d ' informations sur l 'objet biologique, principalement la position et sa dynamique, sa forme et sa morphologie.
L' information biologique utilise la carte mesurée et l 'information géométrique, et une information auxiliaire, potentiellement extérieure au système, sur la relation des points lumineux et des objets aux entités biologiques. Un certain nombre de conclusions sur la fonctionnalité biologique de l'échantillon peuvent être obtenues à ce niveau.
Le niveau d'abstraction fonctionnel permet une appréhension de la réalité biologique.
Il consiste en une information fonctionnelle, décorrélée des informations géométriques, et répondant à des interrogations en termes et jargon biologique, tel que : « le virus a-t-il pénétré la cellule '? ».
Un niveau additionnel d' information peut être défini incluant le processus de contrôle et d'instrumentation ; en effet, un processus de contrôle et d' instrumentation plus évolué peut être défini, permettant de remonter à une information biologique plus structurée, à travers une automatisation du processus d'acquisition de données. Un exemple de tels processus est décrit par Steven Finkbeiner, sous la dénomination de « Robotic Microscopy Systems ».
Cette description des niveaux d'abstraction, définis dans cette demande, a été rédigée, pour simplicité, pour la Biologie. Elle est applicable, mutatis mutandis, à tous les domaines de la Vision, biologique et médicale, artificielle et industrielle.
Diffraction conique
La diffraction ou réfraction conique, est un phénomène optique prédit par Hamilton, [6], en 1832, et confirmé expérimentalement deux mois après par Lloyd, [7]. La diffraction conique décrit la propagation d' un faisceau de lumière dans la direction de l'axe optique d'un cristal biaxe.
En effet, dans un cristal biaxe, l'axe optique est positionne dans le plan créé par le axes cristal lographiques x et z; l 'angle par rapport à l'axe z est θο, dépendant des trois indices de réfraction suivant la loi, tan <¾ =
Figure imgf000029_0001
Hamilton a prédit que la lumière émerge sous la forme d'un cône creux de rayons. La réfraction conique est une étape importante de l'histoire des sciences et a joué un rôle dans la démonstration de la théorie des ondes électromagnétiques.
Un regain d'intérêt pour la diffraction conique eu lieu dans les dernières années du XXe siècle; elle a abouti à une théorie complète par Berry et al. [2], validée
expérimentalement en 2009, [8]. Nous suivons ici la théorie, la terminologie et les définitions de Berry, y compris le changement de dénomination de l'effet physique, à partir de ce point, utilisant le terme plus rigoureux de diffraction conique.
Toutefois, il est important de noter, que le terme « diffraction conique » est aussi utilisé pour deux autres techniques n'ayant aucune relation avec la technique que nous décrivons :
• la diffraction en incidence oblique est aussi appelée diffraction conique
• Le terme anglais, « conical diffraction mounting » référence un montage de réseau de diffraction dans lequel le réseau est monté sur une surface courbe.
La diffraction conique a suscité un intérêt considérable au niveau théorique et expérimental, mais, « aucune application pratique semble avoir été trouvée », [9]. Historiquement, la diffraction conique a été observée dans les cristaux biaxes. Nous nous référons à un cristal conique pour décrire un cristal biaxe inorganique ou organique, présentant le phénomène de diffraction conique. Quelques exemples non limitatifs de cristaux biaxés comprennent, l'Aragonite, K P, TA, BiW, LBO, Nb03, MDT, YCOB, BIBO, DAST, POM, NPP, LAP, LiInS2 et LiInSe2.
D'autres effets existent, créant une diffraction conique intrinsèquement plus faible soit en créant une diffraction conique plus faible le long d'un trajet optique plus court.
Toutefois, ces effets peuvent être utilisés dans le cadre des dispositifs décrits. Ces effets comprennent les polymères, les cristaux l iquides et les effets de biréfringence induite par voie externe. Les polymères comprennent mais ne sont pas limités à: les feuilles de polymère étirées et à la polymérisation en cascade, [ 10]; les cristaux liquides comprennent mais ne sont pas limités à: la phase nématique biaxe thermotrope, [ 1 1 ]; les effets externes de biréfringence induite comprennent, mais ne sont pas limités à: l'application d'un champ électrique créant un effet électro-optique, sur un cristal cubique non-centrosymétrique, et le modulateur photo-élastique.
La phase dans le vortex créé par diffraction conique est une phase géométrique et est donc intrinsèquement achromatique.
Les effets chromatiques additionnels sont la dispersion de l'axe optique et la dépendance des différents paramètres présents dans les équations de la diffraction conique en fonction de la longueur d'onde.
La dispersion chromatique de l'axe optique crée un angle de l'axe optique du cristal, dépendant de la longueur d'onde, par rapport à l'axe optique du système. Elle est due, dans la majorité des cas, à la dispersion des indices de réfraction.
Les indices de réfraction dépendent de la longueur d'onde, suivant les équations de Sellmeier. L'angle de l'axe optique varie donc en fonction de longueur d'onde, il crée un angle d'inclinaison chromatique de l'axe optique dans le plan créé par le axes x et z cristallographiques.
Il dépend fortement du type de cristal. Dans un cristal de MDT, le cristal achromatique le moins dispersif dans le visible, la direction de l'axe optique varie de moins de 0, 1 degrés entre 540 nm et 700 nm. Dans un cristal de KTP, le cristal plus achromatique dans l'IR de télécommunication, l'angle varie de 0,05 degrés, entre 1 ,350 nm et 2, 100 nm, et moins de 0,02 degrés sur la fenêtre de télécommunication - 1450 nm à 1650 nm. D'autre part, θ0 peut varier fortement en fonction de la longueur d'onde dans certains cristaux organiques comme le DAST.
La compensation de la dispersion chromatique de l'axe optique peut être effectuée en utilisant l'optique géométrique. La dispersion chromatique de la direction de l'axe optique peut être compensée en utilisant la dispersion naturelle de verre ou d'autres matériaux optiques, ou en utilisant des réseaux ou de prismes. La procédure d'achromatisation ne diffère pas, dans ce cas, de la procédure standard de correction de toute aberration chromatique en optique géométrique, Cette procédure peut être conçue et optimisée en utilisant l'un des logiciels optiques commerciaux disponibles en définissant des fonctions cibles adéquates.
Un concept différent d'achromatisation, est basé sur l'utilisation de deux matériaux différents, ayant des effets de diffraction coniques inverses, à haute et basse dispersions chromatiques.
La dépendance des différents paramètres présents dans les équations de la diffraction conique en fonction de la longueur d'onde, modifie les paramètres d 'efficacité des effets de diffraction conique.
Pour des cristaux coniques linéaires, définis ultérieurement, la fonction de transfert fondamentale est identique à l 'unité et ainsi trivialement indépendante de longueur d'onde. Par contre, la fonction de transfert du vortex dépend de la longueur d'onde et peut être représentée par un facteur chromatique égal à τ (λ).
Pour des cristaux coniques sinusoïdaux, définis ultérieurement, le comportement est différent de celui de cristaux linéaires coniques: l'onde fondamentale dépend de la longueur d'onde et l'onde vortex est presque indépendante de celle-ci. Effet, les simulations montrent que la forme de l'onde vortex n'est que légèrement modifiée par une variation du paramètre, θο de 0,5 à 0.75. Par contre, la forme de l'onde fondamentale dépend de longueur d'onde et cet effet doit être pris en compte dans la conception de systèmes utilisant les deux ondes, fondamentale et vortex.
On se réfère maintenant à la figure 3, qui est une illustration schématique simplifiée d 'une configuration d'un module de diffraction conique, 300, conformément à un mode de réalisation de la présente invention.
La lumière incidente, 30, est supposée être collimatée, même si d'autres conditions peuvent être adaptées en util isant des moyens optiques simples.
Le setup lui-même comprend une première lentille, 31 , un cristal conique, 32 et une lentil le optionnelle 33. Les deux premières lentilles, 31 et 33, sont configurées de préférence sous forme d'un télescope Kepler 1 : 1. L'ouverture numérique de la première lentille, 31 , dans l'espace image, représentée ci-dessous par Uo, détermine les paramètres de l'effet conique à travers le rayon conique, défini ci-dessous. Un plan d'imagerie conique, 35, est placé au plan focal de la première lentille 31 ; un polariseur, ou un polariseur partiel, 29, décrit ci-dessus, peut également être ajouté. Toutefois, dans certains systèmes optiques ou la lumière incidente est déjà polarisée, cet élément n'est pas nécessaire. Une lentille de focalisation, 36, détermine la taille finale de la tache lumineuse. Elle peut être un objectif de microscope externe, ou peut être fusionnée avec la seconde lentille 33. telle qu'implémentée dans un autre mode de réalisation de cette invention. La répartition de la lumière projetée sur l'échantillon est, en première approximation, en négligeant les effets vectoriels, une image réduite de la distribution de la lumière dans te plan image.
L'influence des effets vectoriels sera discutée ci-dessous. Le rapport d'échelle ou le grossissement est déterminé par un objectif de microscope.
Soit la variable spatiale, R, au plan d'imagerie conique, et le vecteur d'onde, U, représentées en coordonnées cylindriques par R, 9R et U, Ou. Soit λ, la longueur d'onde de la lumière.
Le comportement du champ électrique émergeant du cristal conique 32 est entièrement caractérisé par un seul paramètre, le rayon conique, Ro; le rayon conique dépend du matériau et l'épaisseur du cristal.
Nous introduisons des paramètres normalisés permettant à la description ci-dessous de la répartition de la lumière, d'être valide à la fois au plan d'imagerie conique et au foyer de l'objectif du microscope, dans les limites de la théorie scalaire de diffraction. Un exemple d'introduction des paramètres normalisés est décrit dans la référence [2]
La position radiale normalisée, p, le vecteur d'onde normalisée, u, représentés en coordonnées cylindriques par p, 6 et u, Ou, et le rayon normalisé conique, po, sont donnés par:
Figure imgf000032_0001
λ uo À (EQ. 4)
Uo étant l'ouverture numérique du système. Pour po<0,5, nous faisons référence ici à un cristal conique mince; pour po« 1 , nous nous référons ici à la forme d'un cristal conique mince linéaire, pour po< 0.5 et >1 , à un cristal conique mince sinusoïdal et pour 1 <po<6, à un cristal conique moyen.
L'onde émergeante du cristal conique mince, E(p, OR), exprimée en coordonnées normalisées pour une onde polarisée circulairement, est constituée par la superposition de deux ondes, référencées ici comme l'onde fondamentale, Ep (p), une onde régulière, et l'onde vortex , Ev (P,0R), une onde singulière; ces deux ondes sont cohérentes l'une avec l'autre, collocalisées, polarisées circulairement et de chiral ité inverse :
E( ¾)
Figure imgf000032_0002
Dans cette équation, EF (p) est l'amplitude fondamentale scalaire, Fy (p) est l'amplitude scalaire de vortex réduite; elles sont donnés par: Er(p) = 2π j du u cos(p0u)J0(pu); Fv {p) - 2π j du u sin^w) J, (pw). (EQ. 6)
Pour un cristal conique mince linéaire, l'onde fondamentale peut être approximée par une tache d'Airy et l'onde de vortex peut être approximée à un vortex linéaire, représenté par:
Fr {p) = 2πρα j du u Jt (pu). (EQ. 7)
En supposant que l'action du polariseur partiel, 29, est la mise à l'échelle de l'onde vortex par a, les paramètres de Stokes peuvent être déduits des équations précédentes, β étant l 'angle de la polarisation linéaire:
S0 = (EF (p))2 + (a1 Fv (p))2
S{ = 2aEr {p
Figure imgf000033_0001
S, = (Ε, (Ρ)Ϊ ~ (a2Fv (pjf Nous utiliserons les termes d'un objet parcimonieux « sparse object » en anglais, pour décrire un ensemble d'émetteurs lumineux ponctuels, d'un nombre inférieur à douze, positionné dans un volume dont la taille, dans chacune des dimensions, est inférieure à 3 longueur d'ondes, à la longueur d'onde d'émission ou de réflexion des émetteurs. Le volume de tail le inférieure à 3 longueurs d'ondes, qui contient l 'objet clairsemé, sera référencé comme un volume d'analyse de taille réduite.
Nous utiliserons le terme d'objet continu pour décrire un ensemble d'émetteurs lumineux ponctuels ou continus, ne rempl issant pas les conditions décrites précédemment dans la définition de l'objet clairsemé.
On se réfère maintenant aux figures 4a à 4c qui sont une représentation simplifiée du concept de confinement volumique du microscope confocal .
La fonctionnalité du confinement volumique est de limiter, dans les trois dimensions spatiales, la région observée de l 'échantillon à un volume de taille la plus petite possible, le volume d'analyse. La fonctionnalité du confinement volumique limite le volume d'analyse par la combinaison de deux effets : le confinement de la lumière projetée sur une petite surface, idéalement de la tai lle de la tâche d'Airy, 50, et l'élimination de la lumière défocalisée par le trou confocal, 28 de la Figure 2. La superposition de ces deux effets crée un petit volume, le volume d'analyse, 60. Ce volume détermine la taille de la région élémentaire détectée par le système.
Considérons un objet parcimonieux ou continu, 51 , consistant en un ensemble de nanoémetteurs, 53 à 59. Les nanoémetteurs 53 à 55 positionnés dans le volume d'analyse 60, et seulement eux, sont à la fois excités par la source lumineuse et les photons émis par eux arrivent au module du détecteur. Les nanoémetteurs ne se trouvant pas dans le cône d'éclairage, 56 et 57, ne sont pas illuminés par la lumière incidente. La lumière émise par les nanoémetteurs 58 et 59 ne se trouvant au plan conjugué du trou confocal, 28 de la Figure 2, est bloquée, presque intégralement, par le trou confocal, 28 de la Figure 2.
Deux repères cartésiens différents sont définis dans le système, Figure 4c:
Le référentiel « i » : Les axes référencés « i » représentent un repère cartésien centré sur le centre du volume d'analyse, 61.
Le référentiel « a » : Les axes référencés « a » représentent un repère cartésien centré, pour chaque nanoémetteur lumineux, sur le nanoémetteur lumineux considéré comme un point discret, 62,
Lorsque, en utilisant un mode de réalisation de l'invention qui sera décrite ultérieurement, on projette un vortex sur l 'échantillon sous analyse, le centre du vortex sera en général défini comme le centre du volume d'analyse.
Au moins un mode de réalisation de l'invention utilise la diffraction conique pour réaliser les modules optiques fondamentaux de la technique. Toutefois, des
implémentations alternatives, remplaçant les modules basés sur la diffraction conique, par des modules basés sur d'autres concepts optiques, sont en mesure de fournir les mêmes fonctionnalités. Elles font partie intrinsèquement du champ de cette invention. Les concepts optiques alternatifs comprennent mais ne sont pas limités aux cristaux uniaxes, aux réseaux à pas inférieur à la longueur d'onde, « subwavelength gratings », aux modes de laser structurés, aux composants holographiques et à d'autres techniques connues de l ' Homme de l 'Art,
Les concepts, techniques et dispositifs optiques et optoélectroniques, qui peuvent être util isé dans des modes de réalisation de l 'invention sont décrits dans par exemple le livre écrit par D. Goldstein, «Polarized light», [ 12], le « Handbook of Confocal Microscopy », [ 1 ], le « Handbook of Optics », [ 14].
Sémaphore optique
Nous utilisons dans ce mode de réalisation de l'invention le terme de sémaphore optique pour décrire un élément optique, passif ou actif, capable de canaliser la lumière incidente vers différents canaux ou détecteurs en fonction d'une propriété de la lumière. Le cas le plus simple est une lame dichroïque qui sépare la lumière en deux canaux en fonction de la longueur d'onde.
Nous utilisons dans ce mode de réalisation de l 'invention le terme, en anglais, de « Position dépendent Optical Sémaphore » - acronyme PDOS - ou sémaphore optique dépendant de la position - pour décrire un sémaphore optique qui canalise la lumière en fonction de la position du point émetteur. Le PDOS sera déterminé par une série de fonctions de transfert, Ti(x,y,z) dépendant, pour chaque canal ou détecteur i, de la position de l 'émetteur (x,y,z), dans un volume de référence. L'ordre du PDOS sera le nombre de canaux ou détecteurs. Le PDOS sera « sans perte », lossless en anglais, dans un volume d'analyse, si la somme des fonction de transfert, Ti(x,y,z) est égale à l 'unité dans le volume d'analyse.
Le trou confocal, décrit par Minsky, [ 1 5], est considéré dans ce mode de réalisation de l' invention comme un PDOS dégénéré d'ordre 1 .
Dans la majorité des cas la dépendance du PDOS est une fonction complexe des positionslatérales et longitudinale. Toutefois, nous utilisons dans des modes de réalisation de l ' invention le terme, en anglais, de « Longitudinal Position dépendent Optical Sémaphore » - acronyme LPDOS - ou sémaphore optique dépendant de la position longitudinale - pour décrire un sémaphore optique qui canalise la lumière en fonction de la position longitudinale du point émetteur. Le LPDOS sera déterminé par une série de fonctions de transfert, Ti(z) dépendant, pour chaque canal ou détecteur i, de la position longitudinale de l 'émetteur (z), dans un volume de référence. L'ordre du PDOS sera le nombre de canaux ou détecteurs. Le LPDOS sera « sans perte », lossless en anglais, dans un volume d'analyse, si la somme des fonction de transfert, Ti(z) est égale à l'unité dans le volume d'analyse. Le LPDOS sera souvent couplé à un stop, limitant le champ latéral du système.
Transmission par des fibres optiques
Une utilisation principale des fibres optiques est la transmission exclusive du mode
TEMoo- Toutefois, certaines configurations de fibres optiques, tel les que les FMF ou les vortex Fibers. principalement mais non exclusivement basées sur des fibres dites
« Photonic Crystal Fiber » (en anglais) - acronyme PCF - permettent la transmission simultanée ou non, de modes plus complexes, y compris des modes de vortex, ayant une vorticité égale ou inférieure à 2. Il serait donc possible de déporter les distributions optiques créées par la diffractionconique à l'aide de fibres optiques, permettant une simplification majeure du système optique.
La possibil ité de déporter les distributions optiques créées par la réfraction conique à l 'aide de fibres optiques permet l'application des modes de réalisation de l'invention à de nombreuses applications supplémentaires, par exemple mais non limité à l'observation gastrique ou gastroentérologique, et à l 'observation du colon et des voies urinaires.
De plus, certaines fibres les « dual-core photonic crystal fibers », en anglais, [ 16], permettent une interaction entre deux modes, l 'un d'entre eux pouvant être un vortex, et fournissent un mécanisme physique supplémentaire pour créer des fonctions de transfert diversifiées.
Mesures à plusieurs longueurs d'onde Dans des modes de réalisation de l 'invention l'objet peut être éclairé en lumière monochromatique et en util isant par exemple un laser classique ou une lampe
monochromatique. Cette configuration est simple, car un des paramètres principaux du système est fixe et bien déterminé. Toutefois, dans d'autres modes de réalisation de l ' invention l 'objet peut aussi être éclairé à plusieurs longueurs d'onde, soit de façon discrète, en utilisant par exemple plusieurs lasers, soit de façon continue, en utilisant par exemple une lampe ou un laser ayant un spectre plus large.
De nombreux systèmes de superrésolution existants mesurent simultanément ou séquentiellement à plusieurs longueurs d'ondes. En effet, il est possible de marquer des éléments similaires ou différents avec des fluorophores ayant des réponses spectrales différentes, permettant de les reconnaître et de les séparer. Il est important de présenter deux cas différents :
• L'utilisation de marqueurs fluorescents, émettant à deux longueurs d'ondes différentes, excités par la même longueur d'onde
· L' utilisation de marqueurs fluorescents émettant à deux longueurs d'ondes différentes ou similaires, excités par deux longueurs d'ondes différentes
Il faut noter que dans le cas de l 'utilisation de marqueurs fluorescents, émettant à deux longueurs d'ondes différentes, excités par la même longueur d'onde, le problème du recalage entre les mesures d' une longueur d'onde par rapport à la seconde, sont intrinsèquement inexistants car l ' information de position de superrésolution est dérivée de la projection de la lumière, qui est parfaitement identique pour les différentes longueurs d'onde.
Ceci permet une calibration relative de la position de fluorophores à deux longueur d'onde différentes, avec une précision limitée seulement par le système expérimental de calibration, enlevant le problème majeur du recalage entre deux images de longueur d'onde différentes.
La possibi l ité d'achromatiser les systèmes optiques basés sur la diffraction conique en font un outil de choix pour l'implémentation de systèmes optiques, a chemin commun, pour de nombreuses applications, et plus particulièrement pour des modes de réalisation de l ' invention décrits.
L'achromatisation est aussi possible pour les systèmes optiques basés sur les cristaux uniaxes, et pour presque toutes les implémentations alternatives de cette invention, avec, pour chacun d'entre eux, une complexité pratique plus ou. moins grande.
D'autres systèmes de fluorescence existants utilisent une lumière ayant un contenu spectral plus large, pour réduire des artefacts, et principalement les effets de speckle. Corollairement, les propriétés spectrales des protéines fluorescentes permettent de mesurer le potentiel des interactions moléculaires intracellulaires en utilisant la technique de transfert d'énergie de Fôrster - Fôrster (Fluorescence) Résonance Energy Transfer (FRET).
Dans certaines implémentations des systèmes PSIT, la lumière d'un ou des faisceaux laser incidents est séparée à l 'aide d'un séparateur de lumière en deux faisceaux, le faisceau principal qui accomplira la fonctionnalité du système PSIT, et un faisceau supplémentaire de faible intensité utilisé pour mesurer la position du faisceau laser à l'aide d'une caméra ou d'un détecteur de position. Ce dispositif permet de mesurer en temps réel la position du laser indépendamment de toute erreur de wobble ou autre erreur mécanique avec une très haute précision.
Utilisation des interactions non-linéaires dans la superrésolution et famille de techniques RESOLFT et STED
L'utilisation des interactions non linéaires dans un milieu matériel, entre deux faisceaux de lumière, a été proposée en 1994 par Hell, [5] et [ 17], comme base d'un système de super résolution. De nombreuses techniques différentes ont découlées des travaux de Hell créant pl usieurs familles de techniques, telle que le RESOLFT et la « localization microscopy». Plusieurs revues de ces techniques ont été publiées telle que celle de Schermelleh et al. [ 1 ].
Ces interactions non linéaires incluent mais ne sont pas limitées aux phénomènes d' interaction à deux photons, aux effets d'émission-déplétion, de clignotement (blinking en anglais) et de photoactivation sur lesquels sont basées la famille de technologie RESOLFT et la famille de technologies de « localization microscopy».
La fami lle de technologies RESOLFT est bien connue et est décrite dans plusieurs références, tel les que l'article initial de Hell [5] et du brevet initial [ 1 7], ou par
Schermel leh et al. [ 1 ], ou dans des publications récentes, Vicidomini et al. [ 18], ou de Willig et al. [ 1 9].
Dans la technique STED décrite dans l 'article initial de Hell [5], deux faisceaux sont projetés, séquentiellement sur I "objet: un faisceau d'excitation standard, modélisé dans la majorité des cas par une distribution de lumière décrite par une fonction d'Airy, et un faisceau de déplétion - ayant une forme de doughnut ou vortex ; l 'effet de la déplétion est d'empêcher la fluorescence des fluorophores se trouvant dans la surface de la distribution de l umière de déplétion, tout en ne modifiant pas l 'émission des fluorophores positionnés au centre de la distribution de lumière en dehors de la distribution de lumière de déplétion; ceci permet de créer une distribution de l umière d'émission équivalente plus petite que la distribution de lumière d'excitation initiale. Cette technique a permis de réaliser des distributions de lumière d'émission équivalentes de très petite taille, tout en nécessitant toutefois des énergies de déplétion lumineuses très importantes.
Plusieurs variantes du STED ont été développées : le « CW STED », [20], le « gated STED », [21 ], et le « modulated STED » [22]. Dans le CW STED le laser puisé utilisé dans la première version du STED est remplacé par un laser continu - plus simple. Dans le « gated STED » les photons émis sont discriminés en fonction de leur temps d'émission pour écarter les photons émis depuis des fluorophores n'ayant pas reçu suffisamment de temps le faisceau de déplétion ; le « modulated STED » util ise un faisceau d'excitation modulé en intensité, en combinaison avec une détection synchrone dépendant de la fréquence de modulation. Ceci permet de discriminer le signal de fluorescence créé par le faisceau d'excitation de la fluorescence résiduelle provoquée par le faisceau de déplétion.
Le doughnut - ou vortex - était créé, dans la première version du STED, à l 'aide d'une lame de phase variant spatialement, « phase plate» en anglais. Cette implémentation nécessite l'utilisation de deux chemins optiques séparés pour les deux faisceaux, le faisceau d'excitation et le faisceau de déplétion. Ce montage optique est complexe, fortement dépendant de toute dérive mécanique, et crée des alignements optiques complexes. Le système mis au point nécessite une forte technicité et le cout du système est important. De plus, cette implémentation est chromatique, car la lame de phase adaptée à une longueur d'onde ne le sera plus à une autre longueur d'onde. Le système optique n'étant pas achromatique, l 'uti lisation d'un STED à deux longueurs d'onde de déplétion nécessite un système optique encore plus complexe.
Pour simplifier la mise en œuvre du STED, plusieurs auteurs ont proposé des solutions permettant de réaliser un STED dans lequel les deux faisceaux, le faisceau d'excitation et le faisceau de déplétion, se propageraient suivant le même chemin optique :
- Wildanger et al. ont proposé un Microscope STED à chemin optique commun, insensible à la dérive mécanique, basé sur les propriétés de dispersion des différents matériaux optiques, [23],
Bokhor et al. [24], propose l' utilisation d' une séparation annulaire chromatique des faisceaux préalignés ; toutefois cette solution bloque une partie de la lumière de déplétion,
Hoeffman [25], propose l 'utilisation d'un module contenant les éléments optiques préalignés créant le vortex, dans le chemin optique du laser de déplétion, pour simplifier l 'alignement,
Menon et al ; [26], propose des lentilles diffractives permettant de créer des zéros d'amplitude sans singularités de phase,
Reuss et al. [27] introduit un dispositif de formation de faisceau placé directement eh face de la lentille d'objectif. Ce dispositif se base sur l'utilisation de cristaux biréfringents, montés sous forme d'une iame d'onde segmentée, consistant en quatre segments. Par un choix du paramètre d'épaisseur de la lame, il est possible de réaliser un élément consistant en une lame de phase pour la déplétion et une lame neutre pour l 'excitation. Cette technologie est commercialisée sous le nom d'EasyDONUT par la société Abberior [28].
Toutefois, les solutions proposées décrites antérieurement sont toutes fortement chromatiques et sont conçues pour une seule longueur d'onde d'excitation et de déplétion. Toutefois, les applications biologiques nécessitent dans de nombreux cas un système à deux ou plus, longueurs d'onde d'excitation. En effet, i! est de pratique courante de marquer des éléments biologiques différents avec des marqueurs fluorescent différenciés par leur longueur d'onde d'excitation ou d'émission. Les systèmes de fluorescence les plus évolués peuvent utiliser quatre à six marqueurs différenciés. La présence d'une seule voie de super résolution limite fortement l'utilisation des systèmes. Des systèmes STED à deux longueurs d'onde sont d'ailleurs disponibles commercialement. 11 est clair que pour un microscope STED achromatique l 'utilisation du même chemin optique pour deux faisceaux de déplétion à deux longueurs d'onde différentes simpl ifiera la super résolution sur des fluorophores différents.
Dans l 'Art Antérieur, pour l'ensemble des solutions proposées pour le STED, les faisceaux laser initiaux, sont sous forme d'une distribution régulière et dans la majorité des cas d' une distribution gaussienne. Ces faisceaux laser initiaux seront ultérieurement transformés en faisceau d'excitation, une onde régulière, et en faisceau de déplétion, une onde singulière, par un système optique adéquat, décrit par les différents inventeurs. Colocaliser ces faisceaux en amont lorsqu'ils sont encore sous forme de distribution gaussienne est relativement simple. Colocaliser ces faisceaux en aval lorsqu'ils ont été transformés en onde régulière et singulière est beaucoup plus complexe. Colocaliser ces faisceaux en amont peut être réalisé de façon commerciale par des systèmes de banc laser en utilisant des techniques basées sur les fibres optiques. Il est donc relativement aisé comme il est d'ailleurs fait dans l 'ensemble des microscopes confocaux, de créer un ensemble de sorties laser à différentes longueurs d'ondes d' une même fibre optique et donc colocalisées de façon très précise.
La solution proposée dans des modes de réalisation de la présente invention permet de se baser sur cette colocalisation en amont, simplifiant de beaucoup le système et permettant la réalisation d'un STED à plusieurs longueurs d'onde, de façon intrinsèque. Pour ceci, i! est préférable d'utiliser un système optique qui combine les propriétés de chemin optique commun, d'achromaticité et de « beam shaping ». Il est préférable de réaliser un beam shaping différent pour les différents faisceaux, soit une onde régulière pour le faisceau d'excitation et une onde singulière pour le faisceau de déplétion, et ceci à n' importe quelle longueur d'onde dans le spectre visible ou infrarouge. La capacité de réaliser un beam shaping achromatique, permettant d'obtenir pour une polarisation une onde régulière et pour une autre polarisation, une onde singulière, sur l'ensemble de la lumière visible ou infrarouge, diffèrent pour les différentes polarisations, est nouvelle. Le module PSIT permet la réalisation d'un tel système optique qui combine les propriétés de chemin optique commun, d'achromaticité et de « beam shaping ».A notre connaissance, il n'existe pas en effet un système à chemin commun, achromatique et permettant un beam shaping différent pour les différents faisceaux, dans la littérature. Un tel système améliorerait certainement la simplicité de conception et d'utilisation du STED.
Information a priori et information complémentaire
Des modes de réalisation de l 'invention décrite permettent l 'intégration et la fusion d'information supplémentaire externe à la plateforme décrite, optique ou contextuelle, pour obtenir une amélioration de la précision de l 'information recueillie de l 'échantillon pour l' un quelconque des niveaux d'abstraction cités : la carte, le niveau d'abstraction géométrique, le niveau d'abstraction biologique et le niveau d'abstraction fonctionnel.
Plus généralement, la diversité spectrale, l 'information obtenue à plusieurs longueurs d'onde, la diversité de polarisation, et l 'information obtenue en projetant différents états de polarisation, étend l 'étendue de l 'information disponible.
Le fait que l 'absence d'énergie, par exemple dans le cas du zéro du vortex, est une information pertinente, ouvre des possibilités supplémentaires à l'acquisition
d' information sans « coût » en nombre de photons. Cette situation a une grande importance pour la détection de phénomènes de fluorescence faible, comme par exemple
Pautofluorescence.
Une des modalités décrites pour certains modes de réalisation de l 'invention sera référencée sous le nom du dark tracking.
Nous introduisons le concept d'information intégrale optique, l 'information qui pourrait être récupérée à partir de mesures optiques ou par ondes électromagnétiques, sur une cible, par un observateur, à partir d'un point de vue donné. Cette information contient de très nombreux paramètres de l 'objet, liés à sa position, les matériaux qui la composent, sa température, ou son orientation.
L'information intégrale optique ne contient pas, par contre, des informations sur des régions de l'objet n'ayant pas de chemin optique vers l'observateur, par exemple un élément positionné dans une boite opaque, ou une information physique qui n'a pas de transcription optique.
Mesures superrésolues et limite de diffraction
11 a été considéré longtemps que l 'optique limitait intrinsèquement la résolution de tout système optique, à travers la limite de diffraction. L'apparition de techniques de superrésolution - dans différents domaines et sous différentes dénominations - a montré qu' il est possible de dépasser cette limite de diffraction, par différents moyens.
Des modes de réalisation décrits dans cette invention, tels que la détection de la présence de deux points de même intensité, par projection d' un vortex au centre de gravité de la distribution lumineuse créée par l 'onde fondamentale, ne sont pas limités en résolution a priori et pourrait idéalement -avec un nombre de photons infini - obtenir n' importe quelle résolution, comme nous le décrirons ultérieurement pour un cas spécifique.
Acronymes
Nous util iserons dans cette demande de brevet l 'acronyme, SRCD, « Super Resolution using Conical Diffraction » pour nommer la plateforme, les modules et systèmes spécifiques à l ' implémentation de cette invention.
Nous util iserons dans cette demande de brevet l 'acronyme, PSIT, méthode de projection d' une séquence d' intensités lumineuses différant topologiquement, soit en anglais : « Projected Sequence(s) of Intensities with various Topoiogies » ; la méthode PSIT peut aussi être utilisée pour projeter des séquences d'intensités lumineuses différant topologiquement, à deux Ou plusieurs longueur d'onde, séquentiellement ou
simultanément.
Nous utiliserons dans cette demande de brevet l 'acronyme, PDOS, sémaphore optique à dépendance spatiale, soit en anglais : «Position Dépendent Optical Sémaphore».
La plateforme SRCDP, « Super Resol ution using Conical Diffraction Platform», est une plateforme de Microscopie utilisant des modules optiques basés sur la diffraction conique.
Nous util iserons dans cette demande de brevet l 'acronyme, LatSRCS pour nommer le module optique implémentant la méthode PSIT à l'implémentation de cette invention.
Nous utiliserons dans cette demande de brevet l 'acronyme, LongSRCS pour nommer le module optique implémentant la méthode PDOS.
La plateforme SRCDP, décrite en détails par la suite, consiste principalement en deux modules matériels, deux modules optiques nouveaux et complémentaires, les modules optiques LatSRCS et LongSRCS, montés sur un microscope, et un module algorithmique, SRCDA, permettant de reconstruire l 'information superrésolue de l 'échantillon. De plus la plateforme SRCDP, inclut un module de détection amélioré, un module de contrôle du système, et un support informatique et logiciel.
De plus, certains modes de réalisation de l 'invention concernent un nombre important de variantes d' implémentations des méthodes PSIT et PDOS, de la plateforme SRCD, des modules optiques LatSRCS et LongSRCS et de l 'algorithmique, SRCDA. La fonctionnalité du microscope confocal est de limiter, dans les trois dimensions spatiales, la région observée de l'échantillon à un volume de taille la plus petite possible, le volume d'analyse.
En corollaire, dans un microscope de fluorescence confocal, l'information acquise est une valeur unique d'intensité pour l'ensemble du volume d'analyse, conçu comme une entité unique. Plus clairement, l 'information détaillée de la position des nanoémetteurs à l ' intérieur du volume d'analyse n'est pas accessible, a priori, dans un microscope confocal. Il était généralement admis qu'aucune information optique additionnelle ne pouvait être créée qui aurait permis une discrimination supplémentaire à l'intérieur du volume éclairé.
On se réfère maintenant à la Figure 4d, qui est une représentation conceptuelle simplifiée du paradigme de mesure selon au moins un mode de réalisation de l 'invention. Le paradigme de mesure est beaucoup plus ambitieux que celui du microscope confocal de fluorescence, représenté schématiquement dans la Figure 4a.
Dans la figure4d, un volume d'analyse, 60, est créé au plan focal de l'objectif du microscope, 22 ; il contient un objet clairsemé, 51 , consistant en plusieurs nanoémetteurs, 53 à 59; le résultat du système est un objet parcimonieux reconstruit, 63, et une liste des nanoémetteurs et une liste de leurs attributs, 64. Toutefois, l'utilisation d'un objet parcimonieux dans la figure 4d est à fin d ' illustration et cette figure aurait parfaitement pu représenter un objet continu, mutatis mutandis.
On se réfère maintenant à la Figure 4e, qui est une représentation conceptuelle simplifiée d'un autre paradigme de mesure selon au moins un mode de réalisation de l' invention. Dans la Figure 4e, un volume d'analyse, 60, est créée au plan focal de l 'objectif du microscope, il contient un objet clairsemé, 5 1 , comprenant plusieurs nanoémetteurs, 53 à 59 ; une ou plusieurs ondes de déplétion, 2000, réduisent par un effet de déplétion, le volume d'analyse à un volume plus petit représenté par 2001. Seul un des nanoémetteurs dans le schéma considéré émet, et ceci nous permet d'obtenir une image complète de l 'objet.
Le processus optique composé comprend la réalisation d'une série de processus optiques de mesure, contrôlés par le module de contrôle du système, en variant les séquences d'illumination et/ou les fonctionnalités des canaux et/ou la position de la séquence d'il lumination en fonction de données mesurées ou d' information externes. Un exemple de processus optique composé selon un mode de réalisation de l ' invention sera détaillé ci-dessous.
Méthode de mesure PSIT
Une méthode de mesure PSIT selon un mode de réalisation de l'invention, une séquence de distributions lumineuses de topologies différentes est projetée sur le volume d'analyse. La méthode de mesure PS1T réalise les fonctions suivantes :
o Projection d' une séquence, la séquence d'émission, de distributions lumineuses compactes de familles topologiques différentes sur un échantillon; et
o Pour chaque distribution lumineuse compacte :
· émission de lumière par les nanoémetteurs de l 'échantillon,
• création, à l 'aide de l 'optique du microscope, d'une image optique,
• acquisition de l'image optique par un détecteur photoélectrique et création d'une image numérique.
Plus en détails, il est à noter que :
La séquence d 'émission consiste en, au moins deux, distributions lumineuses ponctuelles, de familles topo!ogiques différentes
La séquence d'émission est projetée sur un échantillon biologique marqué par des nanoémetteurs, L'émission lumineuse émergente de chaque nanoémetteur est dépendante, pour chaque nanoémetteur, de l ' intensité, dans le cas incohérent, ou du champ électromagnétique dans le cas cohérent, incidents à la position spatiale, tridimensionnelle du nanoémetteur lumineux susdit propriété d'échantillonnage du nanoémetteur lumineux discutée préalablement.
Pour chaque distribution lumineuse de la séquence d'émission projetée sur l 'échantillon, une image optique est créée. L'ensemble des images correspondantes à l 'ensemble des distributions l umineuses de la séquence d'émission est référencée comme la séquence d' images.
La méthode PSIT selon ce mode de réalisation permet d'acquérir une information essentiellement latérale, c'est-à-dire la position latérale chacun des nanoémetteurs.
Dans un mode de réalisation, la méthode PSIT est implémentée par la projection de distributions lumineuses de topologies différentes créées par diffraction conique et modifiées par une variation des états de polarisation d'entrée et de sortie.
Dans un mode de réalisation, la méthode PSIT peut aussi être utilisée pour projeter des séquences d' intensités lumineuses différant topologiquement, à deux ou plusieurs longueurs d'onde, séquentiellement ou simultanément.
Méthode PDOS
Une méthode PDOS selon un mode de réalisation de l'invention comprend la distribution par un « sémaphore optique», de la lumière réémise par les nanoémetteurs ou par l 'objet continu entre au moins deux détecteurs.
Idéalement, la fonction du sémaphore optique est de séparer sur des détecteurs différents des régions différentes du vol ume d'analyse. Pratiquement, le sémaphore optique crée, pour chaque détecteur, une fonction de transfert de la lumière émise par un nanoémetteur lumineux, dépendant de la position dans l 'espace du nanoémetteur lumineux et différente pour les différents détecteurs.
Dans un mode de réalisation, la méthode PDOS est implémentée de façon à séparer sur des détecteurs différents la lumière collimatée, émergente de nanoémetteurs positionnés au plan focal de l 'objectif, de la lumière non-collimatée émergente de nanoémetteurs se trouvant en-deçà ou au-delà du plan focal.
La méthode PDOS, permet d'acquérir une information essentiellement longitudinale, c'est-à-dire la position longitudinale de chacun des nanoémetteurs.
Mathématiquement, le procédé selon des modes de réalisation de l'invention réalise une fonction de transfert transformant la distribution spatiale dans l'espace des nanoémetteurs en l 'information brute consistant en un ensemble d' images.
L'algorithmique réalise l 'opération inverse : elle reconstruit la distribution spatiale dans l 'espace des nanoémetteurs à partir de l 'ensemble d'images composant l 'information brute.
L 'information dans des modes de réalisation de l'invention
Le résultat intermédiaire, l 'information brute, est obtenu à l ' issue de l'étape de détection. L' information brute consiste en un ensemble d' images Aop(m,n), représentant pour la distribution lumineuse o, l ' image issue du canal de détection p.
Comme dans un microscope confocal, le processus de mesure analyse un volume de petite taille dans un objet de taille beaucoup plus grande. Il nécessitera donc l'ajout de modules supplémentaires, similaires à ceux d'un microscope confocal incluant un processus de balayage, un module logiciel d'intégration, d'analyse et de visualisation des données ponctuelles en surfaces et/ou en objets tridimensionnel.
En termes mathématiques l 'algorithmique résout un problème inverse ou d'estimation de paramètres. Les équations du modèle sont connues et l'on dispose d'un modèle a priori, paramétrique ou non, sur la configuration des nanoémetteurs. Le modèle le plus naturel consiste à supposer un faible nombre de nanoémetteurs (objet clairsemé), mais on peut également uti liser des modèles continus, supposant la présence de structures
unidimensionnelles (lignes, courbes) ou de motifs spécifiques. On peut alors
parcimonieusement utiliser l 'ensemble des procédures mathématiques connues de l 'Homme du métier pour la résolution de problèmes inverses ou l'estimation de paramètres. Nous décrivons ultérieurement un exemple d'algorithmique adapté spécifiquement à la mesure selon un mode de réalisation de l 'invention.
De plus, nous présentons, pour sa valeur emblématique, une sol ution nouvelle du problème de la discrimination de deux points positionnés à faible distance l'un de l'autre. Ce problème, étudié par Lord Rayleigh, est la base du critère de résolution dans de nombreux domaines de l'Optique. Il a ainsi été décrit, de manière assez large, les caractéristiques des modes de réalisation de l'invention afin que la description détail lée de celle-ci puisse être mieux comprise, et afin que la présente contribution à l'art puisse être mieux appréciée. De nombreuses fonctionnalités supplémentaires de l'invention seront décrites ci-après.
Un mode de réalisation de l ' invention est une plateforme matérielle et algorithmique, référencée comme la plateforme SRCDP, 500, illustré à la Figure 5.
La plateforme SRCDP, 500, implémente la méthode selon un mode de réalisation de Γ invention, en combinant les deux méthodes PSIT et PDOS décrites ci-dessus.
Dans un des modes de réalisation, la plateforme SRCDP observe, Figure 5, un échantillon biologique, 1 1 , intégrant un ensemble de nanoémetteurs. Le résultat de l 'observation de l 'échantillon biologique par la plateforme SRCDP est l'acquisition d' information de superrésolution, représentative de l'échantillon observé.
La plateforme SRCDP, 500, Figure 5, comprend principalement :
Dans sa partie matérielle :
• Un microscope confocal200, adapté ou optimisé, similaire au microscope confocal, décrit antérieurement, et comprenant l 'ensemble des composants adéquats, tel que décrit antérieurement
• Deux modules optiques nouveaux et complémentaires, montés sur un microscope standard. Les deux modules optiques nouveaux sont les modules optiques LatSRCS, 700, et LongSRCS, 800, décrit en détails ultérieurement en se référant aux Figures 6 et 8, respectivement. Le module optique LatSRCS 700, implémente les étapes d'illumination nécessaires à l 'implémentation de la méthode PSIT selon un mode de réalisation de l'invention. Le module optique LongSRCS, 800, implémente les étapes de distribution de l 'intensité lumineuse émergente en une pluralité de images de la méthode PDOS selon un mode de réalisation de l ' invention et,
• le module algorithmique SRCDA, 600, capable, à partir des images créées par la plateforme SRCDP de reconstruire l ' information de superrésolution de l'échantillon biologique.
• D'autres éléments auxi l iaires, tels que l 'ordinateur 66 et le logiciel 67, nécessaires à la réalisation de la plateforme,
Module optique LatSRCS implémentant la méthode PSIT
Nous décrivons, en se référant à la figure 6a, un module optique selon un mode de réalisation de l'invention, le module optique LatSRCS, 700, et sa fonction spécifique en microscopie. Le module optique, LatSRCS, 700 selon ce mode de réalisation, est un module optique, projetant sur une pluralité de nanoémetteurs d' un échantillon, une séquence de distributions lumineuses compactes de topologie différente. Chaque nanoémetteur fluoresce avec une séquence d' intensités fluorescentes lumineuses dépendant de l'intensité incidente sur le nanoémetteur et caractérisant la position latérale du nanoémetteur. Dans la plupart des modes de réalisation, les distributions lumineuses compactes de topologies différentes sont créées par l'interférence, avec des amplitudes et phases variables entre une onde régul ière et une onde singulière. Dans le mode de réalisation préféré, les ondes régulière et singulière sont créées par un cristal conique mince.
Le module optique LatSRCS, 700, est positionné dans la voie d'éclairage du microscope confocal 200 ; il projette une séquence de distributions lumineuses compactes de topologies différentes sur l'échantillon 1 1 en utilisant l'objectif du microscope confocal 200. Dans un mode de réalisation utilisant la diffraction conique, l'intensité incidente à une position spécifique sur l'échantil lon 1 1 sera proportionnel le, pour chaque distribution lumineuse, à une combinaison spécifique des paramètres de Stokes.
Le module optique LatSRCS, 700, utilise une fonctionnalité inhérente, décrite précédemment, spécifique au nanoémetteur, qui échantillonne l'intensité lumineuse incidente à sa position précise (du nanoémetteur) et réémet une lumière fluorescente dépendante de la lumière incidente. Il est remarquable que l'information mesurée soit directement liée à la position du nanoémetteur à l'intérieur de la distribution lumineuse compacte. Cette information est figée par la fonctionnalité du nanoémetteur, sa propriété d'absorber et de réémettre la lumière, qui rompent la chaîne optique. Cette information est portée par la lumière fluorescente, sous forme d'une distribution lumineuse émergente, récupérable par un ensemble de détection 65.
Si la lumière incidente varie dans le temps en fonction d'une séquence de distributions lumineuses compactes de topologies différentes, l'intensité de la lumière fluorescente réémise varie dans les mêmes proportions. La séquence de la lumière fluorescente réémise sera proportionnelle à la séquence des distributions lumineuses compactes de topologies différentes. A partir de cette information, il est possible de récupérer la position du nanoémetteur, comme expliqué ci-dessous.
La méthode PSIT selon des modes de réalisation de l ' invention fait référence à la projection d'une séquence de distributions lumineuses compactes de topologies différentes dans un microscope, l'interaction avec l 'objet parcimonieux ou l 'objet continu, la collecte de la lumière réémise par l'objectif du microscope, 22, la détection de la lumière, fluorescente ou non, par l'ensemble de détection amélioré 65, et l'analyse de l'information par un algorithme approprié. Dans certains modes de réalisation, l'ensemble de détection amélioré, 65, se compose d'un détecteur unique, et ne récupère que l'intensité globale en fonction du temps, tandis que dans d'autres modes de réalisation, l'ensemble de détection amélioré se compose d'une petite zone de pixels et récupère aussi la répartition spatiale de la lumière fluorescente. L'ensemble des informations récupérées, consistant en une pluralité d'images, désigné comme les images latérales de superrésolution.
Dans un des modes de réalisation, la contribution d'un nanoémetteur positionné dans le volume éclairé à une image latérale de superrésolution spécifique est proportionnelle à une combinaison des paramètres de Stokes de la lumière incidente à la position du nanoémetteur.
Les images latérales de superrésolution, l'information créée par les distributions lumineuses compactes de topologies différentes est nouvelle, et n'était pas présente dans l'art antérieur. Cette information nouvelle permet d'affiner la position des nanoémetteurs ou la distribution spatiale de l'objet continu, de quantifier le nombre de nanoémetteurs présents dans le volume éclairé et de différencier plusieurs nanoémetteurs présents dans le même volume.
On se réfère maintenant à la figure 6a, qui est une illustration schématique simplifiée d'un module optique LatSRCS, 700, conformément à un mode de réal isation de la présente invention.
La figure 6a représente un module optique, LatSRCS, 700, i l inclut tous les composants du module de diffraction conique, de la figure 3, qui sont mis en œuvre de la même manière que dans le module de diffraction conique 300. L'optique de la source lumineuse du microscope confocal à balayage est supposée être achromatique et en conjugaison infinie, même si d'autres conditions peuvent être adaptées en utilisant une optique auxiliaire. La lumière incidente, entrant depuis la source lumineuse est parallèle, 30. Le module optique 700 lui-même comprend une première lentille, 31 , un achromatique 32, ou un sous-ensemble réalisant achromatiquement la fonctionnalité d'un cristal conique comme explicité précédemment, et une seconde lentille 33; un polariseur partiel, 29, décrit ci-dessus, peut également être ajouté. Les deux premières lentilles, 31 et 33, sont configurées de préférence sous forme d'un télescope de Kepler de rapport 1 : 1 ; le plan d'imagerie conique, 35, est placé au plan focal commun des lentilles 31 et 33. L'ouverture numérique de la première lentille, 3 1 , détermine les paramètres de l'effet de diffraction conique à travers le rayon normalisé conique, définies ci-dessous. Le second objectif, 33, restaure le parallélisme de la lumière, pour l'injecter au microscope. Il comprend en outre un sous-module de contrôle de polarisation, 71 , comprenant, par exemple, une lame quart d'onde tournante, une paire de valves de lumière à cristaux liquides ou une cellule de Pockels, 72, et un analyseur 73. L' information des paramètres de Stokes peut être transformée en information séquentielle, à travers une séquence de distributions lumineuses spatialement différenciés, et portant des informations séquentielles, comme décrit ci-dessus.
Se référant à la Figure 7a, cette figure représente les distributions lumineuses, créées à travers un cristal conique de paramètre conique normalisé po de 0.388, calculées par une approximation scalaire, pour différents états de polarisation d'entrée et de sortie, incluant en entrée ou en sortie soit un polariseur circulaire ou linéaire soit un poiariseur radial ou azimutal. Ces distributions lumineuses ont été calculées dans un plan intermédiaire d'imagerie et non au foyer de l'objectif pour séparer la réfraction conique des effets vectoriels. Les états de polarisation - d'entrée et de sortie - sont caractérisés par leur angle pour les polarisations linéaires et par leurs chiralités pour les polarisations circulaires.
Se référant à la Figure 7b, cette figure représente les distributions lumineuses, créées à travers un cristal conique de paramètre conique normalisé po de 0.818, calculées par une approximation scalaire, pour différents états de polarisation d'entrée et de sortie, incluant en entrée ou en sortie soit un polariseur circulaire ou linéaire soit un polariseur radial ou azimutal . Ces distributions lumineuses ont été calculées en utilisant le logiciel Diffract de la société research. Ces distributions lumineuses ont été calculées dans un plan intermédiaire d'imagerie et non au foyer de l'objectif pour séparer la réfraction conique des effets vectoriels. Les états de polarisation d'entrée et de sortie sont caractérisés par leur angle pour les polarisations linéaires et par leurs chiralités pour les polarisations circulaires.
Nous présentons dans ces tables un grand nombre de fonctions de transfert différentes, incluant les cas incluant en entrée ou en sortie des polariseurs circulaires, linéaires, azimutaux ou radiaux. Il faut compléter cette description en y incluant en plus des polariseurs circulaires, linéaires, azimutaux ou radiaux décrits dans les figures, les cas de polariseurs elliptiques, dichroïques ou partiellement dichroïques, et polariseurs variant spatialement. De plus, comme i llustré dans les figures 7a et 7b, ces fonctions de transfert varient fortement en fonction du paramètre conique normalisé po. De plus, l'introduction de deux cristaux coniques, ou d'un cristal conique et d'un cristal uniaxe ou biaxe (dans lequel la lumière se propage dans une direction de propagation différente de celle de la diffraction conique) en cascade permet un nombre encore plus grand de fonctions de transfert comme i llustré pour deux cristaux coniques dans la figure 7c.
En résumé nous référencerons, dans cette demande de brevet, sous le terme de fonction de transfert de diffraction conique, l 'ensemble des fonctions de transfert pouvant être obtenues à l 'aide d'un faible (<6) nombre de cristaux en cascade, et des éléments de polarisation, statiques ou dynamiques, uniforme ou variant spatialement
Nous noterons principalement les distributions lumineuses suivantes : • Le fondamental : Figure 7a0o et 7a 1 1, obtenue entre polariseurs circulaires paral lèles, qui est une distribution proche de la distribution d'Airy
• Le vortex : Figure 7aoi et 7aio obtenue entre polariseurs circulaires, croisés
• La distribution que nous avons appelé la distribution en « croissant de lune » ou Stokes, les sous-figures 7a0,2-s, 7ai,2->, 7a2-5,0 et 7a2-s,i, et la figure 7c décrivant la variation axiale des distributions en « croissant de lune » ou Stokes. Ces distributions sont obtenues entre un polariseur circulaire et un polariseur linéaire d'angle variable; cette distribution est antisymétrique et l'axe tourne avec l 'axe du polariseur linéaire,
• La distribution que nous avons appelé la distribution en « demi-lunes», sous- figures 7a42, 7ajs, a24 et 7 sont obtenues entre deux polariseurs croisés ; cette distribution est symétrique.
• La distribution que nous avons appelée la distribution en « demi-lunes décalées », figure 7d, représentant la distribution en « demi-lunes décalées » à différentes positions axiales, est obtenue entre deux polariseurs elliptiques pour certaines valeurs d'éllipticité.
• Les distributions lumineuses plus complexes, Figure 7b, pour un cristal de
paramètre conique normalisé, po, supérieur à 0.5
• la réalisation de distributions lumineuses additionnelles à l 'aide de deux - ou plus - cristaux coniques en cascade, (non représentées) avec ou sans éléments de polarisation statiques ou dynamiques entre les cristaux
La réalisation des différentes distributions lumineuses est réalisée par la modification de la polarisation d'entrée ou de sortie. Les différentes distributions lumineuses suivent le même chemin optique et le système optique créant ces distributions est un système optique à chemin commun, tel que nous l 'avons défini antérieurement. Il existe un nombre d'éléments de polarisation ayant une polarisation différente à différentes longueur d'ondes. L'utilisation d'un de ces éléments permet de créer deux ondes compactes, soit régulières soit singulières à deux longueurs d'ondes soit une onde régulière à une longueur d'onde et une onde singulière à une autre longueur d'onde. Un tel dispositif permet une
implémentation beaucoup plus simple des concepts d'émission-déplétion limités dans certains cas par les tolérances ou par les vibrations du système optique.
Redondance et variations de phase aléatoires
Les distributions lumineuses élémentaires décrites dans la Figure 7 peuvent être obtenues de plusieurs façons différentes. De plus, certaines d'entre elles peuvent être obtenues comme une combinaison linéaire d'autres distributions lumineuses élémentaires; par exemple le vortex peut être obtenu par n'importe quelle somme de deux distributions lumineuses « demi-lunes » orthogonales.
Cette redondance permet de moyenner une partie des erreurs de phases aléatoires présentes inexorablement dans de nombreux processus de mesure d'objets biologiques.
Des distributions l umineuses nouvelles peuvent être aussi obtenues comme des combinaisons mathématiques de distributions lumineuses élémentaires. La distribution lumineuse « pseudo-vortex », calculée à partir de combinaisons arithmétiques des quatre distributions en « croissant de lune »a la particularité d'avoir une très forte courbure à l 'origine.
La Méthode PSIT a été conçue au départ pour permettre une superrésolution latérale ; toutefois la méthode PSIT peut aussi être utilisée pour obtenir la position longitudinale d'un nanoémetteur. En effet, certaines distributions lumineuses élémentaires sont relativement insensibles - dans des limites raisonnables - à une variation de la position longitudinale du nanoémetteur, d'autres y sont au contraire très sensibles. Une séquence de distributions lumineuses compactes, certaines d'entre elles indépendantes et certaines d'entre elles dépendantes de la position longitudinale, permettrait de remonter à la position longitudinale des nanoémetteurs.
De plus, pour les distributions lumineuses dépendant fortement de la position longitudinale du nanoémetteur, une série de distributions lumineuses élémentaires décalées légèrement longitudinalement l 'une par rapport à l 'autre peut être projetée sur
l 'échantillon, permettant un ensemble d' images contenant une information longitudinale.
De plus, certaines distributions lumineuses élémentaires plus complexes, consistant en des superpositions plus complexes d'ondes, existent avec une forte dépendance longitudinale ; par exemple les « spot tridimensionnels obscurs » décrits par Zhang, [29], créent un spot noir entouré en trois dimensions par une sphère lumineuse. Ces « spot tridimensionnels obscurs » consistent en une superposition de fonctions de Laguerre- Gauss, qui peuvent être réalisés à l 'intérieur d'une cavité laser ou à l 'aide d'un hologramme ou d' une plaque de phase, comme suggéré par Zhang ou à l'aide de cristaux coniques ou uniaxes comme le suggère l'inventeur.
On peut uti liser la diffraction conique pour changer et mettre en forme la PSF de sorte qu'el le présente des variations latérales et axiales. Après le cristal, le faisceau incident est transformé en deux faisceaux de Bessel : une partie Bo (mode fondamental) et une partie B i (mode vortex). Tous les faisceaux incidents à polarisation homogène peuvent se décomposer sur la base orthogonale composée des polarisations circulaire droite et circulaire gauche. Le faisceau sortant est la somme des contributions des deux composantes, l'une donnant lieu à une partie Bo et l 'autre à une partie Bi. Différentes combinaisons de Bo et Bi peuvent être réalisées en choisissant les polarisations en entrée et sortie, ce qui permet d'obtenir des PSF de différentes formes. Nous sommes en particulier intéressés au cas où la polarisation d'entrée et la polarisation de sortie sont elliptiques avec une orientation des grands axes de chaque ellipse ayant un angle de 90° entre eux. Parmi les distributions générées dans ces conditions, certaines présentent d'importante variation selon l 'axe Z, et ces variations peuvent être exploitées pour mesurer la position d'un émetteur avec une grande précision axiale. Nous séparons ces distributions en deux groupes, les distributions qui présentent un seul lobe et celles présentant deux lobes. Les distributions avec un seul lobe présentent un effet de rotation selon l'axe Z. Ainsi, les distributions Stokes, réalisées à partir d'une polarisation linéaire (ellipticité =0°) et une polarisation circulaire (ellipticité = 45°) présentent des variations qui apparaissent dans le tableau ci-dessous. En utilisant un algorithme approprié, l'orientation de la distribution peut être détectée et la position de l 'émetteur déduite avec une grande précision axiale, (figure 7d). Les distributions avec deux lobes présentent un effet de décalage des deux lobes selon l 'axe Z. Ainsi, les distributions dites demi-lunes décalées, réalisées à partir de deux polarisation elliptique orientées à 90° mais avec la même ellipticité présentent des variations qui apparaissent dans le tableau ci-dessous. En utilisant un algorithme approprié, la position de l 'émetteur peut être déduite avec une grande précision axiale, (figure 7d)
Toute ces variantes sont réputées faire partie de l 'invention. L' inventeur a pourtant choisi, dans certaines implémentations de séparer en deux modules optiques disjoints mais complémentaires les mesures latérales des mesures longitudinales pour réduire la complexité de chacun des modules complémentaires.
Effets vectoriels
La théorie développée jusqu'à présent décrit la distribution de lumière dans le plan d'i magerie du microscope, 35. La répartition de la lumière projetée sur l'échantillon est, selon la théorie de l'imagerie géométrique, une image réduite de la distribution de la lumière dans le plan image.
Toutefois, comme il est décrit abondamment dans la littérature, pour un objectif à forte ouverture numérique, la théorie de l'imagerie géométrique n'est pas exacte et les effets vectoriels, doivent être pris en compte. Ces effets consistent essentiellement en la présence d'une composante polarisée longitudinalement.
En référence de nouveau à la Figure 6a, pour atténuer les effets vectoriels, il peut être avantageux de maintenir l'analyseur final fixe et d'ajouter un élément supplémentaire, fixe ou variable, le sous-module d'adaptation de polarisation de sortie, 74, pour contrôler la polarisation de sortie. Nous avons constaté que la polarisation de sortie ayant une symétrie circulaire réduit sensiblement les effets vectoriels. Une telle polarisation peut être circulaire, radial ou azimutale. Pour la polarisation circulaire, le sous-module d'adaptation de polarisation de sortie 74, est tout simplement une lame de retard d'un quatre d'onde. Dans ce cas, les éléments de polarisation longitudinale ont une symétrie de vortex et se fondent harmonieusement dans le système avec seulement une petite modification de la forme des paramètres de Stokes, même pour les objectifs de microscope avec une ouverture numérique très élevé.
Alternativement, le sous-module d'adaptation de polarisation de sortie, 74, peut être variable et s'adapter à la topologie et à la symétrie de chacune des distributions lumineuses compactes.
On rappelle qu'on peut utiliser un prisme de Wollaston pour séparer un faisceau incident en deux faisceaux émergeants séparés par un angle. En utilisant plusieurs prismes en cascade, ou peut ainsi séparer un faisceau incident en un grand nombre de faisceaux émergents. On peut obtenir le même effet en modifiant le prisme de Wollaston, pour créer le prisme de Wollaston composé, en lui ajoutant des pièces de cristal uniaxe dont l ' indice et l 'orientation de la biréfringence sont choisis. On peut ainsi construire un prisme d 'un seul bloc de cristal uniaxe qui peut séparer un faisceau incident en 2nfaisceaux émergents (par exemple huit ou seize)qui sont contenus dans un plan, et séparé par des angles égaux. Une fois focalisés sur l 'échantillon, on obtient 2n points alignés et également séparés. Si le faisceau incident a traversé un module LatS C ces 2"points ne sont pas 2" tâches d'Airy, mais les distributions crées par le module et sont toutes identiques.
L'avantage d' utiliser ce beamsplitter est de balayer l'échantillon plus
rapidement puisqu'on a 2" points lumineux à la place d' un seul.
Méthode PDOS et mesures latérales
La Méthode PDOS a été conçue au départ pour permettre une superrésolution longitudinale ; toutefois la méthode PDOS peut aussi être utilisée pour obtenir la position latérale d'un nanoémetteur. En effet, les distributions lumineuses élémentaires sont sensibles aussi à une variation de la position latérale du nanoémetteur. Pour un échantillon plan, dans le cas où la projection de lumière n'est pas réalisable, la méthode PDOS peut remplacer la méthode PSIT pour réaliser des mesures superrésolues.
Toute ces variantes sont réputées faire partie de l 'invention. L' inventeur a pourtant choisi, dans une des implémentations de séparer en deux modules optiques disjoints mais complémentaires les mesures latérales des mesures longitudinales pour réduire la complexité de chacun des modules complémentaires.
Module de détection
En microscopie confocale à balayage le détecteur est un détecteur constitué d'un seul élément comme un PMT ou un SPAD. Le temps d'acquisition du détecteur est déterminé par le mécanisme de balayage. Un module de détection amélioré, 65, peut être mis en œuvre en utilisant des détecteurs de petite taille à faible nombre de pixels. Un tel module n'aurait pas été réalisable il y a dix ou vingt ans, en raison de l'absence de technologies adéquates. Aujourd'hui, les détecteurs de petite taille à faible nombre de pixels, à cadence élevée, avec des caractéristiques de faible bruit, sont disponibles sur la base de plusieurs technologies. Des matrices de SPAD avec un faible nombre de pixels, comme 32 * 32, ont été démontré récemment avec des taux d'acquisition jusqu'à 1 MHz. Le module détecteur amél ioré, 65, peut également être mis en œuvre à l'aide de CCD, EMCCD ou capteurs CMOS. Des capteurs CCD, CMOS ou EMCCD avec un faible nombre de pixels existent ou peuvent être conçus spécifiquement. En outre, les détecteurs CCD, CMOS EMCCD peuvent être utilisés en utilisant des fonctionnalités de région d'intérêt, de sous-fenêtrage ou de «binning», des modes « crop » ou « fast kinetics », disponibles pour certains détecteurs.
Les informations spatio-temporelles référencées ici sont la position et ie temps de l'impact de chaque photon fluorescent. Dans les systèmes réels, l'information spatio- temporelle est corrompue par le bruit du détecteur, ce qui crée des photons erronés, et par l'inefficacité de détection, ce qui crée des photons qui ne sont pas détectés, réduisant les performances. Dans les matrices de SPAD, pour chaque photon, le pixel qui l'a détecté et le temps d'impact sont reçus, à savoir l'information spatio-temporelle complète est disponible. Pour des détecteurs CCD, CMOS ou EMCCD, l'acquisition de plusieurs trames est nécessaire pour approximer l'information spatio-temporelle.
Dans plusieurs implémentations nous ferons référence à des détecteurs séparés; dans de très nombreux cas les détecteurs pourront être soit physiquement séparés soit consistant en des zones différentes sur un même détecteur, soit une combinaison des deux cas précédents.
Algorithmique SRCDA
L'algorithmique de reconstruction que nous avons détaillée s'applique non seulement dans le cas d'un champ donné analysé à l'aide des méthodes PS1T et PDOS, mais également dans le cas d'un champ de plus grande dimension analysé par balayage. Dans le cas d'un balayage, le modèle direct est enrichi par le fait qu'un recouvrement entre les différentes positions des signaux projetés permet de prendre en compte, en un point donné, pl us de mesures. La prise en compte de signaux projetés décalés n'apporte néanmoins aucune complexité supplémentaire, puisque ces signaux décalés ne font que s'ajouter à la liste des signaux projetés.
Système multi-images incluant l'algorithme de reconstruction E-LSE
Nous référencerons sous le nom de système multi-images, l 'ensemble des systèmes optiques et optoélectroniques, dans lequel un ensemble d'images différentes et différenciées, issues de la même région spatiale de l'objet, bidimensionnelle ou tridimensionnelle - sont enregistrées et analysées à travers un algorithme adéquat pour analyser la distribution spatiale - et/ou spectrale - de la région spatiale émettrice. Cette différentiation peut être due à la projection d'illumination spatialement différentes, tel que décrit précédemment ; elle peut aussi être due à une variation du contenu spectral de l' illumination; elle peut aussi être due à un mouvement naturel ou imposé de l'extérieur des objets. Enfin elle peut être due à une variation stochastique du contenu de la région spatiale de l'objet, bidimensionnelle ou tridimensionnelle, à travers un effet stochastique naturel ou imposé, tel que les systèmes utilisés dans la super-résolution basée sur la détection stochastique, incluant les processus PALM et STORM et leurs innombrables variantes, portant chacune un acronyme différent.
D'autres moyens de différentiation des images de la même région spatiale émettrice sont connus de l'Homme de l 'Art et sont réputées partie intégrante de cette invention.
Nous référencerons sous le nom de système multi-images incluant l'algorithme de reconstruction E-LSE, un système multi-images utilisant l 'algorithme E-LSE décrit ci- dessous
Algorithme de reconstruction E-LSE
L'algorithme proposé permet, à partir des images enregistrées par la caméra (ou les caméras) suite à l'excitation de l'échantillon par l'ensemble des illuminations choisies, de reconstruire une image à haute résolution, bidimensionnelle ou tridimensionnelle, de l'échantillon. Cet algorithme repose sur la combinaison de plusieurs principes:
1 ) la formulation de la reconstruction comme un problème inverse bayésien qui conduit à la définition d'une distribution a posteriori. Cette loi a posteriori combine, grâce à la loi de Bayes, la formulation probabiliste du modèle de bruit (bruit de Poisson inhérent à la nature quantique de l'émission de photons, auquel vient éventuel lement se superposer la modélisation des autres sources de bruits, notamment ie bruit de lecture de la caméra), ainsi que d'éventuels aprioris (positivité, régularité, etc.) sur la distribution de lumière dans l'échantillon;
2) l'estimation de la distribution de lumière dans l'échantillon par la moyenne (espérance mathématique) de la distribution a posteriori. Cette approche, envisagée par Besag en 1984 [30], a été récemment mise en oeuvre numériquement dans le cas du débruitage d'image avec un apriori de type variation totale [3 1 ,32];
3) l'utilisation de nuées d'émetteurs ponctuels qui permet de favoriser les solutions parcimonieuses (échantillons à nombre limité d'émetteurs, ou dont les émetteurs sont concentrés sur des structures de petite dimension comme des courbes, ou des surfaces dans le cas tridimensionnel;
4) l'estimation de la moyenne a posteriori au moyen d'un algorithme de type Monte- Carlo Markov Chain (MCMC) [33,34], comme dans les références [31 ,32] mentionnées plus haut. Selon un mode de réalisation de l'algorithme, le principe 3 n'est pas utilisé et la moyenne de la distribution a posteriori est calculée sur l'ensemble des images possibles comme dans [31 ,32].
L'algorithme utilise en entrée les mesures effectuées sur l'échantillon, mais également des données inhérentes au système qui sont obtenues après une étape dite de calibration. Dans cette étape, des mesures sont effectuées sur un échantillon de référence afin de mesurer précisément les fonctions d'illumination et la tache optique {Point Spread Function) de retour du système optique.
Dans le mode de réalisation standard, où seul le bruit de Poisson est modélisé, la densité de la loi de probabilité a posteriori s'écrit sous la forme Z
où Z est une constante de normalisation qui n'intervient pas dans l'algorithme, et Ξ(χ, Λ ) = Ç |Ç' «.<-¾, ·> - >«,(>') l g | # + Ç Ak Ui(xk, y) jj
La nuée d'émetteurs est ici représentée par le vecteurs x=(x/,X2, ...x„) (n positions discrètes dans le domaine de l'image haute résolution à reconstruire) et le vecteur λ=(λι,λ2, - · ·λη) qui code les intensités des émetteurs situés aux points xi,X2,...x„. Chaque quantité de type u,(x,y) est déterminée lors de l'étape de calibration : elle représente l'intensité émise au pixel de la caméra par un émetteur situé au pixel x de l'image haute résolution, en réponse à une illumination d'indice (/' code donc ici à la fois la position du signal d'i llumination, mais aussi sa forme). Le réel positif B correspond à l'intensité du fond continu, qui résulte en général à la fois de l'échantillon (fluorescence diffuse par exemple) mais aussi du capteur. Enfin, les quantités m/y) correspondent simplement aux mesures (images enregistrées par la caméra) : m/y) est l'intensité mesurée au pixel y de l'image d'indice i, c'est-à-dire l'image enregistrée après illumination d'indice ).
L'algorithme proposé consiste à faire évoluer les émetteurs représentés par les vecteurs x et /en accord avec la loi donnée par la densité ρ(χ,λ). L'algorithme est itératif: à chaque itération, l'un des émetteurs est perturbé (en position ou en intensité) et cette perturbation est acceptée ou non selon le principe de l'algorithme de Metropolis-Hastings [3J. L'image reconstruite est obtenue en moyennant, avec un poids égal pour chaque itération, les émetteurs ainsi construits. Si xJ et Xs correspondent respectivement à la position et à l'intensité des émetteurs à l'itération j de l'algorithme, alors l'image / reconstruite après N itérations est donnée par
Figure imgf000056_0001
Plusieurs améliorations peuvent être apportées à cet algorithme: l'instauration d'une étape de burn-in (les premières itérations ne sont pas utilisées dans la reconstruction), l'optimisation de l'initialisation des émetteurs, l'optimisation des perturbations effectuées à chaque itération (loi de proposition), l'utilisation d'une étape de post-filtrage (par exemple un léger flou gaussien), etc.
Les résultats de l 'algorithme peuvent être transmis à l'utilisateur soit sous forme d'une image soit sous forme de données numériques ou graphiques.
Le même algorithme de reconstruction, peut être utilisé dans une seconde version incluant un ensemble de paramètres supplémentaires décrivant des paramètres globaux de région spatiale de l'objet soit connus apriori soit déterminés a postériori.
Cet algorithme, dans ses deux versions, peut être utilisé dans ensemble des systèmes multi-images, dans lesquels un ensemble d ' images différentes et différenciées, issues de la même région spatiale de f objet, bidimensionnelle ou tridimensionnelle - sont enregistrées et analysées.
Algorithme du processus optique composé
Le processus optique composé selon au moins un mode de réalisation de l'invention est un complément logique de l'algorithme SRCDA. En effet, la reconstruction obtenue par l'algorithme SRCDA peut mener à la conclusion qu'une image supplémentaire permettrait d'améliorer les performances de la mesure. La plateforme de microscopie SRCDP permet l'acquisition d'une - ou plusieurs - images complémentaires choisies dans un ensemble de distributions lumineuses des méthodes PS1T ou PDOS.
Un exemple est explicité ultérieurement.
Mesure île position d'un point par la méthode PSIT
La méthode PSIT peut être util isée comme une technique permettant de mesurer la position d'un nanoémetteur avec une haute précision. Considérons un nanoémetteur positionné à la position x,y en coordonnées cartésiennes et p, Θ en coordonnés polaires. Une séquence d'illumination consistant en une onde fondamentale, et un couple de distributions dites « demi-lunes », alignées suivant des axes orthogonaux est projetée sur le nanoémetteur.
La procédure de prétraitement créée deux images :
Une image « top hat » consistant en la somme des trois images de la séquence, Une image vortex consistant en la somme des deux images demi-lunes.
Un premier descripteur est la position cartésienne calculée à l 'aide de l 'algorithme du centroide sur l' image « top-hat ».
En se référant à la Figure 10, la position radiale ρ peut être mesurée univoquement en mesurant un paramètre, pa, égal à l'arc tangente normal isé d' un facteur π, du rapport d'intensité entre l 'intensité normalisée émise par le nanoémetteur illuminé par l'onde vortex, IV. et l 'intensité normalisée émise par le nanoémetteur illuminé par l 'onde fondamentale, IF. En effet :
· l' intensité normalisée émise par le nanoémetteur illuminé par l'onde
fondamentale varie de 1 au centre pour l'onde fondamentale à 0 au rayon d'Airy,
• l 'intensité normalisée émise par le nanoémetteur illuminé par l'onde vortex varie de 0 au centre pour à 1 au maximum du vortex pour arriver à 0 pour une valeur légèrement supérieure au rayon d'Airy. L'arc tangente du rapport est une fonction monotone.
La position azimutale peut être mesurée en mesurant le rapport d'intensité entre l ' intensité totale émise par le nanoémetteur illuminé par la première distribution demi-lune, 1H, et l ' intensité totale émise par le nanoémetteur illuminé par la seconde distribution demi- lune, Ive. Le rapport entre ces deux intensités est une loi géométrique en tangente carrée :
Figure imgf000057_0001
Les deux mesures sont redondantes. Cette redondance est une mesure permettant de qualifier l 'objet observé comme étant un point unique et de séparer ce cas des autres objets potentiellement présents sur l 'échantillon.
Une application directe de l 'uti lisation de la méthode PSIT selon un mode de réalisation de l 'invention pour mesurer la position d' un nanoémetteur avec une haute précision est l' intégration de cette technique de mesure dans une technique nouvelle de reconstruction optique stochastique locale. Une des limites de l'applicativité des techniques stochastiques est le processus de mesure, nécessitant un nombre important d'images et donc un temps de mesure long et une forte phototoxicité. L'utilisation de la technique PSIT selon au moins un mode de réalisation de l' invention, qui permet de mesurer la position d' un émetteur lumineux, à une résolution bien supérieure au disque d'Airy, à des cadences pouvant atteindre les micro ou nanosecondes permet l'extension des techniques stochastiques à de nombreuses applications nouvelles.
Les images résultantes de l'utilisation de la méthode PSIT peuvent aussi être traitées en util isant la méthode de Hough généralisée, permettant de reconnaître des objets structurés, ligne, cercle ou autres, dans une image.
La diffraction conique pourrait permettre de mettre en application toute une famille de techniques de super résolution ou super localisation, la localisation d'une seule molécule. On se réfère maintenant à la figure 8, qui illustre schématiquement une technique originale que nous avons nommée « DarkTracking ».
En nous référant à la figure 8, 80 représente la phase d 'initial isation c'est-à-dire la détection de l'émetteur en utilisant un scanner confocal ou tout autre méthode optique connue. 81 représente la phase de positionnement du faisceau vortex sur l 'émetteur ; 82 représente, ie cas où l 'émetteur bouge par rapport au centre du vortex et est excité par une fraction du faisceau créant une fl uorescence qui peut être détectée ; 83 représente le repositionnement de l'émetteur au centre du faisceau vortex tel qu'aucune fluorescence n'est créée et détectée (position enregistrée Xi,Yi) et 84 correspond à une boucle de rétroaction dans laquelle un système indépendant de localisation repositionne l 'élément suivi à une position corrigée.
Les distributions lumineuses utilisées par cette technique sont des vortex générés par diffraction conique. Toutefois cette technique peut util iser d'autres vortex ou autres distributions généré par la diffraction conique. Nous supposons que la molécule qui nous intéresse a été marquée par un ou plusieurs fluorophores qui peut être excité à λ. La position de la molécule est tout d'abord détectée par une image confocale classique à λ. La position du scanner est ensuite ajustée pour stimuler l'échantillon de telle sorte que le centre du vortex coïncide exactement avec la position de l 'émetteur. Le signal en fluorescence est détecté par une caméra très sensible (ex. EMCCD ou sCMOS), ou PMT, permettant une détection du signal de faible amplitude de l 'émetteur grâce à une efficacité quantique importante. Le processus de localisation repose sur l 'absence de signal fluorescent quand l 'émetteur se situe exactement au centre du vortex. Le fait que le gradient d'intensité soit important à proximité du centre du vortex permet une localisation précise de l 'émetteur. Si l 'émetteur bouge légèrement, l'intensité qu'il absorbe ne sera plus nulle, et il émettra un signal en fluorescence dont la position et l 'intensité sont déduites de l ' image. Une boucle de rétroaction permet alors de recentrer le vortex sur l 'émetteur et de mémoriser la position de l'émetteur. La boucle de rétroaction peut être exécutée à la vitesse d'exécution de la caméra (jusqu'à 1 kHz) ou le détecteur (plusieurs MHz), ce qui permet de faire du suivi d'une molécule en temps réel et sur une période de temps conséquente. Comme nous essayons toujours de minimiser le signal émis en fluorescence en minimisant le signal excitant l'émetteur, la localisation peut être conduite sur une longue durée de temps, le bleaching étant moins susceptible de se produire avec de si petites doses de lumière. La précision de la localisation dépend fortement du rapport signal sur bruit de l ' image, par conséquent le bruit de fond (bruit de la caméra et signal en autofluorescence) doit être pris en compte. Supposons à présent que l'échantillon soit marqué par deux fluorophores différents qui peuvent être excités à deux longueurs d'onde différentes, λι et λ2. Nous faisons se propager ensemble deux faisceaux avec des topologies différentes qui dépendent de leur longueur d'onde. Le premier (λι) a une forme classique de Gaussien et permet d'obtenir une image confocale globale de l'échantillon. La deuxième (λ2) est un faisceau vortex utilisé pour le DarkTracking. En contrôlant le miroir galvo qui scanne l 'échantillon, le dark-tracking peut être réalisé à chaque fois qu'une ligne pour l' image caméra est scannée, de sorte que la position de l 'émetteur est suivie à une fréquence beaucoup plus haute que le nombre d'image par seconde. Les principaux avantages de cette technique, comparée à d'autre technique de suivi de molécule unique, sont l ' utilisation d' un unique système de scan et la puissance envoyée aux molécules suivies est extrêmement faible. En pratique, l 'utilisation, l'alignement et la mise en forme de ces deux faisceaux n'est pas une tâche triviale si l'on utilise les techniques
conventionnelles de mise en forme de faisceau, telles que des hologrammes générés par ordinateurs, modulateurs spatiaux ou des lames d'onde en spirale, principalement à cause de leur chrcmaticité inhérente. La diffraction conique peut être utilisée pour simplifier le montage. En utilisant les optiques adaptées, un cristal peut être adapté pour générer un vortex à une longueur d'onde, et un faisceau gaussien à une autre longueur d'onde suivant le même chemin optique. Cela permet d'utiliser un simple chemin optique partant d'une fibre qui résout de nombreux problèmes pratiques. La technologie dark-tracking peut être facilement utilisée pour étudier nombre de question biologique dans lesquelles les techniques conventionnelles de suivi de la position d'une particule sont pénalisées par le bleaching des particules.
Le Dark tracking a été décrit ci-dessus dans le cas de l' utilisation d' un vortex.
Toutefois, de nombreuses variantes, utilisant une ou plusieurs distributions, par exemple mais non limites aux demi-lunes ou aux vecteurs de Stokes, soit toute distribution possédant un zéro d' intensité et un gradient - si possible le plus fort possible - en fonction d'une des dimensions spatiales peut permettre la réalisation du Dark Tracking et sont réputées partie de cette invention. Les capacités de la diffraction conique de créer de nombreuses distributions lumineuses différentes en font un outil de choix pour la réalisation du Dark Tracking.
Reconnaissance et mesure de deux points : un nouveau critère de résolution
Considérons maintenant deux nanoémetteurs de même intensité positionnés symétriquement autour du centre aux positions p, Θ et , -Θ en coordonnés polaires. Nous utiliserons le système décrit dans les paragraphes précédents. Les trois descripteurs donneront les résultats suivants :
• Le centroïde mesurera le centre de gravité de la distribution lumineuse, qui sera à l 'origine,
« Le descripteur p, mesurera la valeur radiale commune des deux nanoémetteurs,
• le descripteur Θ, qui dans le cas des demi-lunes contient une dégénérescence entre Θ et -Θ, mesurera la valeur Θ.
Comme cité précédemment si la valeur du descripteur p n'est pas nulle nous savons que le cas étudié n'est pas un point mais deux ou plus. De plus, les descripteurs p et Θ nous permettent de mesurer les caractéristiques de deux points à une résolution très supérieure à celle définie par le critère de Rayleigh. Qui plus est, en utilisant un processus composé, il est possible de séparer ce cas de la grande majorité des cas de 3 points et plus. Une distribution lumineuse supplémentaire peut être projetée sur l 'échantillon, une demi-lune inclinée d'un angle Θ ; l 'hypothèse de la présence de deux points sera confortée ou infirmée en fonction des résultats de cette image. En effet, l 'énergie mesurée ne sera nulle que pour deux points, pour une ligne ou pour une série de points alignés dans la direction de l 'angle Θ.
Cette mesure n'est pas limitée à priori. Bien sûr, une limite de résolution pratique existe d'abord, liée à la qualité du signal, les fluctuations et imperfections diverses. Si on néglige les limites pratiques, la limite de résolution est liée au nombre de photons détectés.
Modalités STED
On se réfère maintenant à la figure 6b, qui est une illustration schématique simplifiée d'un module optique LatSRCS modifié, achromatique ou non, 700, conformément à un mode de réalisation de la présente invention. Ce module diffère de l ' implémentation d'un module optique LatSRCS, 700, décrit précédemment et représenté dans la Figure 6a, par l 'ajout de plusieurs éléments avant le module :
des lasers, 79a, 79b et 79c, optionnellement à des longueurs d'ondes différentes,
- des fibres optiques, 78a, 78b et 78c, issues des lasers 79a, 79b et 79c, optionnellement, des sous-modules de contrôle de polarisation, 77a, 77b et 77c, pour modifier statiquement ou dynamiquement la polarisation des lasers, 79a, 79b et 79c, les sous-modules de contrôle de polarisation pouvant être positionnés avant ou après la fibre; Toutefois, dans certaines implémentations, par exemple utilisant des fibres PM, « polarization maintaining » en anglais, les sous-modules de contrôle de polarisation 77a, 77b et 77c peuvent ne pas être nécessaires et la polarisation de la lumière issue de la fibre est déterminée par la position relative du laser et de la fibre,
un « laser combiner » (en anglais), 76a, combinant deux ou plusieurs source lasers optionnellement à travers des fibres optiques, 78a, 78b et 78c, en une fibre de sortie commune, 76b,
un élément optique, 75, permettant de transformer la lumière issue de la fibre en lumière collimatée susceptible d'être utilisée par le reste du module LatSRCS, 700, de manière simi laire à celle décrite précédemment.
De nombreuses variations de ce dispositif, connues de l 'Homme de l' Art, peuvent être ajouté à ce schéma et sont revendiquées dans cette invention: par exemple, les deux éléments optiques 3 1 et 75 peuvent être intégrées en un seul élément, ou même enlevées si les paramètres de sortie de la fibre commune sont adéquats. De même, la fibre commune, 76b, peut ne pas être nécessaire pour certaines implémentations. De plus,
L' introduction, à travers une fibre optique commune, ou directement en lumière se propageant dans l 'espace, de deux, ou plus, longueurs d'ondes ayant des polarisations différentes, permet de créer une méthode et/ou un dispositif apte à réaliser les techniques RESOLFT ou STED dans toutes leurs différentes modalités. Dans cette méthode et/ou dispositif les ondes d'excitation et de déplétion se propagent suivant un chemin commun et le module LatSRCS, 700, peut être totalement achromatique, ou non dans une version simplifiée, tel que décrit précédemment.
Dans la variante la plus simple de cette méthode, les ondes d'excitation et de déplétion se propagent suivant deux polarisation linéaires orthogonales et une lame quart d'onde - optionnellement achromatique - est positionnée à l 'entrée du système pour transformer ces polarisations en polarisations circulaires orthogonales pour obtenir, pour l'une une onde fondamentale et pour l'autre un vortex.
On se réfère maintenant de nouveau à la figure 6b. Les sous-modules de contrôle de poiarisation, 77a, 77b et 77c, peuvent être actionnés pour créer, simultanément, des séquences de distributions lumineuses, identiques ou différentes, pour la voie d'excitation et la voie de déplétion. De plus, l' intensité des lasers peut être modulée, créant un chronogramme complexe de l 'intensité de chaque laser, de la séquence de distribution lumineuses d'excitation et de la séquence de distributions lumineuses de déplétion. Dans l ' implémentation préférée, en utilisant un microscope confocal et un module LatSRCS original ou modifié, achromatique ou non, on projette séquentiellement :
En premier lieu, une distribution d'Airy ou un fondamental en excitation simultanément avec un vortex de déplétion. L' image d' émission résultante sera appelée l 'image positive,
En deuxième étape, un vortex d'excitation, simultanément avec un vortex de déplétion. L' image d'émission résultante sera appelée l 'image négative.
Dans une variante du premier lieu on projette uniquement une distribution d'Airy ou un fondamental en excitation
L' image différence, consistant en la soustraction pondérée de ces deux images. Cette image différence, si on choisit les bons paramètres, aura une taille - en termes de PSF - plus fine qu'un STED classique, tout en ne nécessitant qu' une intensité de déplétion relativement faible. En effet, le but de la déplétion du vortex ne sera plus de réduire la tail le d'une tache d'Airy, nécessitant ainsi une énergie importante, comme dans le STED ou RESOLFT classique, mais de réduire l'excès d'énergie présent dans le vortex d'excitation par rapport à la distribution d'Airy ou au fondamental. De plus, la déplétion du Airy ou du fondamental, se couplera avec la soustraction de l'image négative, créée par le vortex d'excitation, ce qui est équivalent à la soustraction mathématique des deux illuminations. La réduction de la taille de la PSF résultante sera la conjugaison de ces deux effets.
De plus, ce mode de réalisation préféré peut, dans certains cas s'affranchir de la nécessité de déclencher l 'excitation comme nécessaire dans le « Gated STED ». En effet, les photons arrivés avant l'application complète de la déplétion, peuvent être pris en compte par un choix adéquat de paramètres, sans nécessiter l 'adjonction d'un système complexe et contraignant. Finalement, la nécessité de moduler le STED, « ModSted » peut aussi être évitée car les photons d'émission émis par le vortex de déplétion ne différent à peu près pas de ceux émis par le vortex d'excitation et peuvent aussi être compensés.
Dans un deuxième mode de réalisation, en utilisant un microscope confocal et un module LatSRCS original ou modifié, on projette simultanément une séquence de faisceaux d'excitation, une séquence de faisceaux de déplétion, les deux séquences de faisceaux pouvant différer par leur polarisation, créant des distributions l umineuses de topologies différentes. Ce dispositif permet, de réal iser une séquence de distributions lumineuses de tailles inférieures à celles qui auraient été obtenues sans le faisceau de
déplétion. L'algorithmique SRCDA, sera utilisé dans cette implémentation pour déterminer la distribution spatiale ou la position d'émetteurs ponctuels.
Dans un autre mode de réalisation, en utilisant un microscope confocal et un module LatSRCS original ou modifié, on projette simultanément un faisceau d'excitation, sous forme d'un Airy et un faisceau de déplétion sous forme d'un vortex, les deux faisceaux différant par leur polarisation. Ce dispositif permet, sans éléments dynamiques, de réaliser un dispositif STED totalement achromatique.
Dans un autre mode de réalisation, en utilisant un microscope confocal, un module LatSRCS original ou modifié, et un module LongSRCS, on projette simultanément une séquence de faisceaux d'excitation, une séquence de faisceaux de déplétion, les deux séquences de faisceaux pouvant différer par leur polarisation, créant des distributions lumineuses de topologies différentes. Le module LatSRCS permet de réaliser une séquence de distributions lumineuses de tailles inférieures à celles qui auraient été obtenues sans le faisceau de déplétion. Le module LongSRCS implémente la méthode PDOS de façon à séparer sur des détecteurs différents la lumière collimatée, émergente de nanoémetteurs positionnés au plan focal de l 'objectif, de la lumière non-col limatée émergente de nanoémetteurs se trouvant en-deçà ou au-delà du plan focal. La méthode PDOS, dans cette implémentation, permet d'acquérir une information essentiellement longitudinale, c'est-à- dire la position longitudinale de chacun des nanoémetteurs, complémentaire de l 'information latérale obtenue à l 'aide du module LatSRCS original ou modifié.
L'algorithmique SRCDA, sera utilisé dans cette implémentation pour déterminer la distribution spatiale ou la position d'émetteurs ponctuels.
Dans un autre mode de réal isation utilisant une des implémentations décrites
antérieurement et utilisant un cristal biaxe pour créer le beam shaping, on utilise un élément dynamique de polarisation avant ou après le cristal biaxe pour corriger le mouvement dynamique de la pupi lle, qui dans certains cas peut être créée au cours du balayage optique du microscope confocal. Cet effet de mouvement de la pupille étant dans certaines implémentations des technologues STED une des limites des performances, sans nécessiter d' un système de balayage supplémentaire. [35]
Dans un autre mode de réalisation utilisant un microscope confocal, on projette à l'aide d'un module LatSRCS original ou modifié, deux ou plusieurs distributions lumineuses localisées à différentes longueurs d' onde. La première distribution lumineuse permet de rendre la scène parcimonieuse, c'est-à-dire d'isoler des émetteurs à l 'aide d'un effet physique, qui dilue la densité des émetteurs capable d'émettre de la fluorescence, de façon à créer des régions dans lesquelles l 'hypothèse de parcimonie est valable c'est-à-dire la présence d'un émetteur isolé ou d'un petit nombre d'émetteurs. Les effets physiques qui permettront de réaliser cette parcimonie seront les mêmes ou seront des effets dérivés, des effets util isés pour créer la parcimonie pour les techniques de microscopie de localisation d 'émetteurs uniques. Ces techniques comprennent par exemple les techniques PALM STORM, DSTORM, FPALM et autres. La deuxième distribution lumineuse à une autre longueur d'onde créera une fluorescence dont l'intensité sera variable dans le temps. Cette deuxième distribution lumineuse utilisera une des techniques PSIT, soit une séquence de distributions discrètes, soit une séquence de distributions continues. Dans le cas de distributions discrètes, la lumière sera détectée soit par un détecteur matriciel, soit par un détecteur unique. Dans le cas de la distribution continue, bien qu' il soit aussi possible d' utiliser un détecteur matriciel, l' implémentation la plus probable sera l 'utilisation d'un détecteur unique ; dans ce cas l ' information latérale de position xy et potentiellement l ' information de distribution longitudinale z pourra être obtenue par des rapports d' intensités. Un des cas les plus intéressants est le cas de distributions harmoniques en temps dans lesquelles les cellules électrooptiques sont actionnées par un voltage sinusoïdal. Dans ce cas, la position xy peut être retrouvée à l'aide d'une mesure des harmoniques temporels du signal mesuré par le détecteur, qui peut être un détecteur unique, qui contiennent indirectement les informations de position latérale.
De nombreuses autres implémentations de cette méthode générale seront claires à l'Homme de l'Art, par exemple:
Certaines des distributions créées par le module LatSRCS, 700, sont des superoscillations, Dans la Figure 7b, les cas sous figures 7boo et 7bi i sont des superoscillations. 11 consiste en un spot naturel lement petit, entouré d'un anneau large et intense. En projetant un anneau de déplétion sur cette superoscillation, il sera possible d'empêcher, à un cout énergétique faible, les fluorophores contenu dans l'anneau d'émettre et la taille du spot sera la taille du spot central de la superoscillation
La création successivement ou simultanément de deux - ou plus - distributions lumineuses en déplétion peut remplacer avantageusement le vortex de déplétion dans toutes les modalités RELSOFT ou STED. Un des effets possible est l 'amélioration de la forme de la distribution lumineuse de déplétion en prenant en compte les effets vectoriels. Il est aussi possible de créer un nombre plus grand que 2 de distributions dites en « demi-lunes», pour explorer différents états de polarisation. Module de contrôle
En référence à la Figure 1 1 et à la Figure 5, dans un mode de réalisation préféré de cette invention, les différents éléments de contrôle intégrés dans la plateforme SRCDP, 500 seront décrits :
Le Module de contrôle, 1 100, à l 'aide de la procédure systémique de contrôle, 1 101 , contrôle et modifie les paramètres optiques de la plateforme SRCDP, 500, les paramètres électroniques de l 'ensemble de détection amélioré, 65, et les paramètres mathématiques des procédures algorithmiques SRCDA, 900, pour optimiser l'information émergente, suivant des critères définis par le système ou par l 'utilisateur. Le contrôle est réalisé en faisant varier les systèmes de contrôle 1 102, 1 103 et 1 104, des différents éléments de la plateforme, 600, 800 et 900. Le système de contrôle, 1 100, utilisera aussi, si elles sont disponibles des informations externes, 1 105, relayées par le support informatique.
Remarque : 1 105 n'est pas présent sur la Figure 1 1
Il est entendu que l'invention n'est pas limitée dans son application aux détails énoncés dans la description contenue dans les présentes ou illustrés dans les dessins. L'invention est capable d'autres modes de réalisation et d'être pratiquée et effectuée de diverses manières. L'homme de l'art comprendra aisément que diverses modifications et changements peuvent être appliquées aux modes de réalisation de l'invention tel que décrit précédemment sans sortir du champ de cette invention
Implémentations alternatives
Les modes de réalisation de l 'invention décrits peuvent être intégrés sur un microscope confocal de fluorescence. Le système de superrésolution selon des modes de réalisation de l' invention consiste en une nouvelle modalité de mesure, en complément ou en remplacement des modal ités existantes de la microscopie. Toutefois, le système de superrésolution selon des modes de réalisation de l'invention peut tout aussi bien être intégré sur les autres plateformes de microscopie. Ces plateformes de microscopie, décrites par exemple en comprennent mais ne sont pas limité aux: microscopes à champ large, « Wide field microscope », microscopes à champ obscur, « dark field microscope », les microscopes de polarisation, les microscopes à différence de phase, les microscopes à interférence différentiel de contraste, les microscopes stéréoscopiques, les microscopes Raman, les m icroscopes dédiés à une tache spécifique, comme le « live cell imaging », le « cell sorting », « cell moti lity » ou tout autre instrument de microscopie optique.
Dans un autre mode de réalisation, la plateforme de microscope qui a été décrite est couplée à un système de microscopie électronique (CLEM- Corrélative Light Electron M icroscopy), ou tout autre système similaire tel que le TEM (Transmission Electron Microscopy), ou l ' EBM (Electron Beam Microscopy), ou la SEM (Scanning Electron Microscopy)
Dans un autre mode de réalisation de l 'invention, la plateforme de microscope est une plateforme SRCDP complète, et comporte un module LongSRCS, implémentant la méthode PDOS et utilisant l 'algorithmique SRCDA.
Dans un autre mode de réalisation de l 'invention, la plateforme de microscope est une plateforme SRCDP partielle, et uti lise l 'algorithmique SRCDA. Dans un autre mode de réalisation de l 'invention, la plateforme de microscope est une plateforme SRCDP partielle, et utilise le module de contrôle.
Dans un autre mode de réalisation de l 'invention, la plateforme de microscope comporte en outre un module LongSRCS, implémentant la méthode PDOS
Quant à une discussion plus approfondie de la manière de l'utilisation et l'exploitation de l'invention, elle devrait ressortir de la description ci-dessus. Par conséquent, aucune discussion relative à la forme de l'utilisation et du fonctionnement ne sera décrite.
À cet égard, avant d'expliquer au moins un mode de réalisation de l'invention dans le détail, il est entendu que l'invention n'est pas limitée dans son application aux détails de la construction et au régime des composantes énoncées dans la description suivante ou illustrées dans le dessin. L'invention est capable d'autres modes de réalisation et peut être pratiquée et effectuée de diverses manières. En outre, il est entendu que la phraséologie et la terminologie employée dans ce document sont dans le but de la description et ne devrait pas être considérée comme limitative.
Les références citées ici enseignent de nombreux principes qui sont applicables à la présente invention. Par conséquent, la totalité du contenu de ces publications sont incorporés ici par référence, le cas échéant pour les enseignements de détails
supplémentaires ou de remplacement, les caractéristiques et / ou d'information technique.
L 'uti lisation avantageuse des fibres optiques est la transmission du mode fondamental, le mode TEMyo et seulement lui . Toutefois, certaines configurations de fibres optiques, principalement mais non exclusivement basées sur des fibres dites « Photonic Crystal Fiber » (en anglais) permet la transmission simultanée ou non, de modes plus complexes, y compris des modes de vortex. 11 serait donc possible de déporter les distributions optiques créées par la réfraction conique à l 'aide de fibres optiques, permettant une simplification majeure du système optique.
De plus, certaines fibres les « dual-core photonic crystal fibers », [ 16], permettent une interaction entre deux modes, l 'un d'entre eux pouvant être un vortex, et fournissent un mécanisme physique supplémentaire pour créer des fonctions de transfert diversifiées.
De nombreuses techniques de superrésolution sont basées sur la mesure de sources ponctuelles, de taille inférieure à une fraction de longueur d'onde. Les techniques de superrésolution selon des modes de réalisation décrits permettent la mesure de sources ponctuelles, mais aussi d'objets structurés, par exemple et principalement des segments de lignes, des cercles ou même d'objets continus. En Biologie, cette extension permettra la mesure d'entités biologiques importantes, telles que des filaments, des neurones et certains microtubules.
Bien que les descriptions des modes de réalisation, pour simplifier la compréhension de l 'invention, présentent les applications en Microscopie, plus spécifiquement en Biologie, et encore plus spécifiquement en Biologie de Fluorescence, les applications peuvent être étendues aux applications générales de la Microscopie et à l'ensemble du domaine de la Vision, incluant la Vision artificielle.
Des modes de réalisation de l'invention peuvent être appliqués, en choisissant un système optique différent, à de nombreuses applications médicales, par exemple mais sans se limiter, à l 'observation ophtalmologique. Ce champ d'application correspond à la mesure d'objets biologiques ou médicaux de résolution micronique, la résolution étant comprise entre 1 et 10 μηι.
De plus, des modes de réalisation de l' invention peuvent être appliqués, comme expliquée ultérieurement, à travers une fibre optique. Ceci permet de nombreuses applications supplémentaires, par exemple mais sans se limiter, à l'observation gastrique ou gastroentérologique, et à l 'observation du colon et des voies urinaires.
Il est entendu que l'invention n'est pas limitée dans son application aux détails énoncés dans la description contenue dans les présentes ou illustrés dans les dessins. L'invention est capable d'autres modes de réalisation et d'être pratiquée et effectuée de diverses manières. L'homme de l'art comprendra aisément que diverses modifications et changements peuvent être appliquées aux modes de réalisation de l'invention tel que décrit précédemment sans sortir de son champ d'application, définie dans et par les revendications annexées.
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Claims

REVENDICATIONS
1 . Un procédé optique de mesure pour déterminer la distribution spatiale ou la localisation de sources réémettrices sur un échantillon, l 'échantillon comportant au moins une source réémettrice ladite au moins une source réémettrice réémettant de la lumière en fonction de la lumière projetée sur l 'échantillon, suivant une loi déterminée, par une première source lumineuse comprenant un premier laser, et la source réémettrice pouvant être déplétée ou activée par l 'action d'une seconde source lumineuse, comprenant un second laser, le procédé comportant :
l 'utilisation des deux lasers, la longueur d'onde d'un des lasers étant accordée sur la longueur d'onde d'excitation dudit au moins une source réémettrice et la longueur d'onde du second laser étant accordée sur la longueur d'onde de déplétion ou d'activation dudit au moins une source réémettrice
la réalisation, à l'aide d'un sous module de polarisation, pour chaque laser, d'un état de polarisation contrôlé,
la projection sur l 'échantillon, au moyen d'un apparei l optique de projection achromatique, pour chaque laser d'une distribution lumineuse compacte, se propageant suivant le même chemin optique pour l'ensemble des lasers,
la détection de la lumière réémise par ledit au moins une source réémettrice de l'échantillon ;
la génération, d'au moins une image, à partir de la lumière détectée ; et l 'analyse algorithmique des images pour obtenir une information de distribution spatiale ou local isation dudit au moins une source réémettrice.
2 Un procédé selon la revendication précédente dans lequel la distribution lumineuse compacte du premier laser d'excitation est de famille topologique différente de celle du second laser de déplétion ou d'activation
3 Un procédé selon la revendication 2, dans lequel
lesdites au moins deux distributions lumineuses compactes de familles topologiques différentes sont créées par une interférence entre une onde régulière et une onde singulière, ou entre deux ondes singulières, et une différenciation spatiale entre lesdites au moins deux distributions est créée en faisant varier au moins un des paramètres suivants:
a) au moins un des paramètres de l 'onde régulière;
b) au moins un paramètre d'au moins une onde singulière et
c) une différence de phase entre l 'onde régul ière et l 'onde singulière ou entre les deux ondes singulières.
4. Un procédé selon la revendication 2 ou 3 dans lequel la projection de distributions lumineuses de familles topologiques différentes est effectuée par une diffraction conique ou un assemblage de cristaux uniaxes.
5. Un procédé selon la revendication 4 dans lequel la projection de distributions lumineuses de topologies différentes est effectuée par une diffraction conique dans un cristal mince.
6 Un procédé selon l 'une quelconque des revendications 1 à 5, comportant le couplage de la lumière issue des lasers par un sous-module optique, à travers une fibre unique ou une voie optique unique
7. Un procédé selon la revendication 6 dans lequel la fibre optique comporte une fibre photonique.
8. Un procédé selon la revendication 6 dans lequel la fibre optique comporte une fibre « few modes fiber».
9. une procédé selon l 'une quelconque des revendications précédentes, comportant le contrôle des lasers pour créer conjointement une séquence de distributions d'excitation et une séquence de distributions de déplétion ou d'activation, les deux séquences étant synchronisées
10 Un procédé selon l 'une quelconque des revendications précédentes, comportant le contrôle des lasers pour créer conjointement une séquence de distributions d'excitation et une séquence de distributions de déplétion ou d'activation, les deux séquences étant synchronisées, et une distribution singulière d'excitation étant simultanée à une distribution singulière de déplétion
1 1 Un procédé selon l 'une quelconque des revendications 1 à 9, comportant le contrôle des lasers pour créer conjointement une séquence de distributions d'excitation et une séquence de distributions de déplétion ou d'activation, une des distributions d'excitation étant une superoscillation.
1 2 Un procédé selon l 'une quelconque des revendications l à 9 comportant le contrôle des lasers pour créer simultanément ou suivant une séquence de distributions d'excitation et une séquence de distributions de déplétion ou d'activation, l'ensemble des distributions de déplétion ou d'activation étant équivalente ou similaire à un vortex.
13. Un dispositif de mesure pour déterminer la distribution spatiale ou la localisation de sources réémettrices sur un échanti llon, l'échantillon comportant au moins une source réémettrice, ladite au moins une source réémettrice réémettant de la lumière en fonction de la lumière projetée sur l 'échantillon par un premier laser, suivant une loi déterminée, et la source reemettrice pouvant être déplétée ou activée par l 'action d'un second laser le dispositif comportant:
deux lasers de longueurs d'ondes, la longueur d'onde du premier laser étant accordée sur la longueur d'onde d'excitation de ladite au moins une source réémettrice et la longueur d'onde du second laser étant accordée sur la longueur d'onde de déplétion ou d'activation de ladite au moins une source réémettrice
un sous module de polarisation, pour réaliser pour chaque laser, d'un état de polarisation différent,
un module de projection achromatique permettant de créer pour chaque laser une distribution lumineuse compacte, se propageant suivant le même chemin optique pour l'ensemble des lasers,
un module de détection apte à détecter de la lumière réémise par ledit au moins une source réémettrice de l 'échantillon ;
un module de génération, apte à générer au moins une image optique, à partir de la lumière détectée; et
un module d'analyse algorithmique apte à analyser des images pour obtenir une information de localisation dudit au moins une source réémettrice.
14. Un dispositif selon la revendication précédente dans lequel la distribution lumineuse compacte du laser d'excitation est de famille topologique différente de celle du laser de déplétion ou d'activation
1 5. Un dispositif selon la revendication 1 dans lequel
le module de projection est apte à créer lesdites au moins deux distributions lumineuses compactes de fami lles topologiques différentes par une interférence entre une onde régulière et une onde singulière, ou entre deux ondes singulières, et une différenciation spatiale entre lesdites au moins deux distributions est créée en faisant varier au moins un des paramètres suivants:
a) au moins un des paramètres de l'onde régulière;
b) au moins un paramètre d'au moins une onde singulière et
- c) une différence de phase entre l 'onde régulière et l'onde singulière ou entre les deux ondes singulières.
16. Un dispositif selon l 'une quelconque des revendications 14 à 15 dans lequel le module de projection comporte au moins un cristal conique pour effectuer la projection de distributions lumineuses de famil les topologies différentes par une diffraction conique ou un assemblage de cristaux uniaxes.
17. Un dispositif selon la revendication 13 comportant une fibre photonique.
18 Un dispositif selon l 'une quelconque des revendications 13 à 17, dans lesquels, le couplage de la lumière issue des lasers est accomplie par un sous-module optique, à travers une fibre unique ou une voie optique unique
19. Un dispositif selon la revendication 1 8 dans lequel la fibre optique comporte une fibre « few modes fiber».
20. Un dispositif selon la revendication 16 dans lequel ledit au moins un cristal conique est un cristal mince.
21 Un dispositif selon l 'une quelconque des revendications ! 3 à 20, dans lequel les lasers sont configurés pour créer conjointement une séquence de distributions d'excitation et une séquence de distributions de déplétion ou d'activation, les deux séquences étant synchronisées
22 Un dispositif selon l 'une quelconque des revendications 13 à 21 , dans lequel les lasers sont configurés pourcréer conjointement une séquence de distributions d'excitation et une séquence de distributions de déplétion ou d'activation, les deux séquences étant synchronisées, et une distribution singulière d'excitation étant simultanée à une distribution singulière de déplétion
23 Un dispositif selon l ' une quelconque des revendications 13 à 21 , dans lequel les lasers sont configurés pourcréer conjointement une séquence de distributions d'excitation et une séquence de distributions de déplétion ou d'activation, une des distributions d'excitation étant une superoscillation.
24 Un dispositif selon l 'une quelconque des revendications 1 à 21 , dans lequel les lasers sont configurés pourcréer conjointement simultanément ou suivant une séquence de distributions d'excitation et une séquence de distributions de déplétion ou d'activation, l'ensemble des distributions de déplétion ou d'activation étant équivalente ou similaire à un vortex.
25 Un procédé optique de mesure pour déterminer la distribution spatiale ou la localisation de sources réémettrices sur un échantillon, l 'échantillon comportant au moins une source réémettrice ladite au moins une source réémettrice réémettant de la lumière en fonction de la lumière projetée sur l 'échantillon, suivant une loi déterminée, par une première source lumineuse comprenant un premier laser, et ladite au moins une source réémettrice pouvant être déplétée ou activée par l 'action d' une seconde source lumineuse, comprenant un second laser, le procédé comportant : l 'utilisation de deux lasers, la longueur d'onde du premier laser étant accordée sur la longueur d'onde d'excitation dudit au moins une source réémettrice et la longueur d'onde du second laser étant accordée(s) sur la longueur d'onde de déplétion ou d'activation dudit au moins une source réémettrice
la projection sur l 'échantillon, au moyen d'un appareil optique de projection achromatique pour le premier laser et le deuxième laser des distributions lumineuses, la détection de la lumière réémise par ledit au moins une source réémettrice de l 'échantillon ; et
la génération, d'au moins une image, à partir de la lumière détectée.
26. Un procédé selon la revendication 25, dans lequel la projection comprend pour le premier laser une distribution lumineuse compacte, et pour le second laser de deux distributions compactes l'une d'entre elles ayant un zéro d'intensité se propageant axialement suivant un mouvement de spirale.
27. Un procédé optique de mesure selon la revendication 25 ou 26 dans lequel les deux distributions créant une déplétion sont issues de deux lasers indépendants à la même longueur d'onde ou à une longueur d'onde proche.
28. Un procédé optique de mesure selon la revendication 25 dans lequel la projection sur l'échantillon est effectuée au moyen d'un appareil optique de projection
achromatique, comportant un élément optique ayant la fonctionnalité de segmenter un faisceau optique en une pluralité de faisceaux indépendants, la projection comportant pour les deux lasers une matrice de distributions lumineuses compactes et collocalisées,
29. Un procédé optique selon la revendication 28 dans lequel l 'élément optique comporte une matrice de microlentilles.
30. Un procédé optique de mesure selon la revendication 25 dans lequel l 'appareil optique de projection achromatique, comporte un élément de duplication permettant de dupliquer les distributions lumineuses latéralement pour les deux lasers d'une matrice de distributions lumineuses compactes et collocalisées.
3 1 . Un procédé selon la revendication 30 dans lequel l'élément de duplication comporte un réseau de transmission à séparateur de faisceaux ou un cristal uniaxe.
32. Un procédé optique de mesure selon la revendication 25 dans lequel l'appareil optique de projection achromatique, inclut au moins un élément optique supplémentaire, ayant la fonctionnalité de créer à partir d'un faisceau incident deux ou plus faisceaux décalés latéralement ou axialement, pour les deux lasers d'une matrice de distributions lumineuses compactes et collocalisées,
33. Un procédé optique de mesure selon l 'une quelconque des revendications 25 à 32 en outre l'analyse algorithmique des images pour obtenir une information de distribution spatiale ou localisation dudit au moins une source réémettrice.
34. Un dispositif optique de mesure pour déterminer la distribution spatiale ou la localisation de sources réémettrices sur un échantillon, l 'échantillon comportant au moins une source réémettrice ladite au moins une source réémettrice réémettant de la lumière en fonction de la lumière projetée sur l 'échantillon, suivant une loi déterminée, par une première source lumineuse comprenant un premier laser, et ladite au moins une source réémettrice pouvant être déplétée ou activée par l 'action d'une seconde source lumineuse, comprenant un second laser, le dispositif comportant :
un premier laser et un second laser, la longueur d'onde du premier laser étant accordée sur la longueur d'onde d'excitation dudit au moins une source réémettrice et la longueur d'onde du second laser étant accordée(s) sur la longueur d'onde de déplétion ou d'activation dudit au moins une source réémettrice
un module de projection achromatique pour créer pour le premier laser et le deuxième laser des distributions lumineuses,
un module de détection pour détecter la lumière réémise par ledit au moins une source réémettrice de l 'échantil lon ;
un module de génération pour générer au moins une image, à partir de la lumière détectée.
35. Un dispositif selon la revendication 34, dans lequel le module de projection est apte à créer pour le premier laser une distribution lumineuse compacte, et pour le second laser deux distributions compactes l 'une d'entre elles ayant un zéro d' intensité se propageant axialement suivant un mouvement de spirale.
36. Un dispositif selon la revendication 34 ou 35 dans lequel les deux distributions créant une déplétion sont issues de deux lasers indépendants à la même longueur d'onde ou à une longueur d'onde proche.
37. Un dispositif selon la revendication 36 dans lequel
le module de projection achromatique, comporte un élément optique ayant la fonctionnalité de segmenter un faisceau optique en une pluralité de faisceaux
indépendants, la projection comportant pour les deux lasers une matrice de distributions lumineuses compactes et collocalisées.
38. Un dispositif selon la revendication 37 dans lequel l 'élément optique comporte une matrice de microlentilles.
39. Un dispositif selon la revendication 35 dans lequel le module de projection achromatique, comporte un élément de duplication permettant de dupliquer les distributions lumineuses latéralement pour les deux lasers d' une matrice de distributions lumineuses compactes et collocalisées.
40. Un dispositif selon la revendication 39 dans lequel l 'élément de duplication comporte un réseau de transmission à séparateur de faisceaux ou un cristal uniaxe.
41 . Un dispositif selon la revendication 35 dans lequel le module de projection achromatique, comporte au moins un élément optique supplémentaire, ayant la fonctionnalité de créer à partir d' un faisceau incident deux ou plus faisceaux décalés latéralement ou axialement, pour les deux lasers d'une matrice de distributions lumineuses compactes et col localisées,
42. Un dispositif selon l 'une quelconque des revendications 34 à 41 comportant en outre un module d'analyse algorithmique apte à analyser les images pour obtenir une information de distribution spatiale ou localisation dudit au moins une source réémettrice.
43. Un système optique et/ou optoélectronique, comportant
un module d'acquisition d' image pour acquérir un ensemble d'images différentes et différenciées, issues de la même région spatiale d'un objet, bidimensionnelle ou tridimensionnelle, un algorithme dans lequel la formulation de la reconstruction de l'objet et de ses propriétés spatiales et/ou temporelles et/ou spectrales est considérée comme un problème inverse bayésien et conduit à la définition d'une distribution a posteriori.
une loi a posteriori combinant, grâce à la loi de Bayes, la formulation probabiliste d'un modèle de bruit, ainsi que d'éventuels aprioris sur une distribution de lumière crée dans l'échantillon par projection;
l'estimation de la distribution de lumière dans l'échantillon par l'utilisation de nuées d'émetteurs ponctuels qui permet de favoriser les solutions parcimonieuses;
l'estimation de la moyenne a posteriori au moyen d'un algorithme de type Monte-Carlo Markov Chain (MCMC),
la représentation des résultats soit sous forme d'une image soit sous forme de données numériques ou graphiques.
44. Un procédé optique de mesure pour déterminer la distribution spatiale ou la localisation de sources réémettrices sur un échantillon, l'échantillon comportant au moins une source réémettrice ladite au moins une source réémettrice réémettant de la lumière en fonction de la lumière projetée sur l 'échantillon, suivant une loi déterminée, par une première source lumineuse, et la source réémettrice pouvant être déplétée ou activée par l 'action d'une seconde source lumineuse, , le procédé comportant :
l 'utilisation des deux sources lumineuses, la longueur d'onde d'un des sources lumineuses étant choisie en fonction de la longueur d'onde d'excitation dudit au moins une source réémettrice et la longueur d'onde du second source lumineuse étant choisie en fonction de la longueur d'onde de déplétion ou d'activation dudit au moins une source réémettrice
la projection sur l'échantillon, au moyen d'un appareil optique de projection achromatique, d'une distribution lumineuse compacte pour chaque source lumineuse, se propageant suivant le même chemin optique pour les deux sources lumineuses,
la détection de la lumière réémise par ledit au moins une source réémettrice de l 'échantillon ;
la génération, d'au moins une image, à partir de la lumière détectée pour obtenir une information de distribution spatiale ou localisation dudit au moins une source réémettrice.
45. Un dispositif de mesure pour déterminer la distribution spatiale ou la localisation de sources réémettrices sur un échanti llon, l 'échantillon comportant au moins une source réémettrice, ladite au moins une source réémettrice réémettant de la lumière en fonction de la lumière projetée sur l'échantillon par une premier source lumineuse, suivant une loi déterminée, et la source réémettrice pouvant être déplétée ou activée par l'action d'un deuxième source lumineuse le dispositif comportant:
deux sources lumineuses, la longueur d'onde du première source lumineuse étant choisie en fonction de la longueur d'onde d'excitation de ladite au moins une source réémettrice et la longueur d'onde de la deuxième source lumineuse étant choisie en fonction la longueur d'onde de déplétion ou d'activation de ladite au moins une source réémettrice
un module de projection achromatique permettant de créer pour chaque source lumineuse une distribution lumineuse compacte, se propageant suivant le même chemin optique pour les deux sources lumineuses,
un module de détection apte à détecter de la lumière réémise par ledit au moins une source réémettrice de l'échantillon ;
un module de génération, apte à générer au moins une image optique, à partir de la lumière détectée pour obtenir une information de localisation dudit au moins une source réémettrice.
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