ES2895983T3 - Método y dispositivo de medición óptica - Google Patents

Abstract

Método de medición óptica para determinar la distribución espacial o la localización de fuentes reemisoras en una muestra, comprendiendo la muestra al menos una fuente reemisora, dicha al menos una fuente reemisora reemite luz de acuerdo con la luz proyectada sobre la muestra, según una ley determinada, por una primera fuente de luz que comprende un primer láser, y siendo la fuente reemisora deplacable o activable por la acción de una segunda fuente de luz, que comprende un segundo láser, comprendiendo el método utilizando los dos láseres (79a), (79b), estando la longitud de onda de uno de los láseres sintonizada con la longitud de onda de excitación de la al menos una fuente reemisora y la longitud de onda del segundo láser sintonizada con la longitud de onda de agotamiento o activación de la al menos una fuente reemisora; producir un estado de polarización controlado para cada láser mediante un submódulo de polarización, combinando los dos láseres mediante un banco de láseres en una salida de fibra común (76b); proyectar sobre la muestra, mediante un aparato óptico de proyección acromática (32) realizado por difracción cónica o ensamblaje de cristales uniaxiales, para cada láser una distribución de luz compacta , propagándose a lo largo de la misma trayectoria óptica para todos los láseres; detectar la luz reemitida por la al menos una fuente reemisora de la muestra; generar al menos una imagen a partir de la luz detectada; y detectar directamente o analizar algorítmicamente las imágenes para obtener información sobre la distribución espacial o la localización de la al menos una fuente reemisora, incluyendo el control de los láseres para crear conjuntamente una secuencia de distribuciones de excitación de diferentes topologías y una secuencia de distribuciones de agotamiento o activación de diferentes topologías, estando las dos secuencias sincronizadas y ajustadas entre sí

Description

DESCRIPCIÓN

Método y dispositivo de medición óptica

[0001] La presente invención se refiere a un método y un dispositivo de medición óptica. Tiene aplicaciones en todos los campos de la imagen, en particular, pero sin limitarse al campo de la Microscopía, incluyendo pero sin limitarse a los campos de la Biología, Medicina, Farmacia, Semiconductores, Ciencia de los Materiales, Metrología, Control, Medición y Observación y a todos los procesos de adquisición de información a partir de observaciones ópticas, en el campo macroscópico o microscópico.

[0002] Un microscopio óptico es un instrumento óptico utilizado generalmente para ver, analizar o medir objetos demasiado pequeños para ser vistos a simple vista.

[0003] Utilizaremos el término biológico para describir cualquier entidad de las Ciencias de la Vida, sea cual sea su origen, humano, animal o vegetal, y el propósito de su observación, investigación, diagnóstico o terapia. Este término incluye los usos médicos de la técnica descrita. La microscopía se utiliza en el campo de la biología, por ejemplo, para observar, estudiar y medir entidades biológicas (objetos) y su dinámica.

[0004] Utilizaremos, por extensión, el término Visión Artificial para describir todas las aplicaciones de medición, metrología u observación de objetos o elementos producidos o construidos por un ser humano o una máquina, por ejemplo, para observar, estudiar y medir semiconductores o para caracterizar materiales.

[0005] Se utilizan las definiciones habituales para: límite de difracción óptica, criterio de Rayleigh, disco de Airy y su radio y diámetro. En el contexto de la invención utilizamos los términos superresolución, superresolution, superresolution imaging y superresolution microscopy para describir la adquisición de datos ópticos, en imagen, microscopía o Machine Vision, a una resolución superior al límite de difracción óptica. Se utilizan las definiciones habituales para la fluorescencia y para los fluoróforos.

[0006] Se hace referencia ahora a la Fig. 1, que representa una ilustración del paradigma de la Microscopía, 100.

[0007] La microscopía óptica consiste en iluminar una muestra biológica o no biológica,11 con una fuente de luz, no mostrada, utilizando un microscopio, y medir la luz emitida, reemitida, dispersada o reflejada o transmitida por la muestra en función del tiempo, utilizando un módulo de observación o detección visual,12. En Biología, la muestra consiste en una -o una pluralidad- de diferentes entidades de objetos biológicos, 13 y 14, colocadas en diferentes posiciones. Ejemplos de tales objetos son, entre otros, una célula, un virus, una proteína y un fragmento de ADN. En visión artificial la muestra puede ser, por ejemplo, un elemento semiconductor

[0008] La microscopía se segmenta en diferentes modalidades con diferentes características y propósitos. Existen numerosas descripciones de las diferentes modalidades, sus características y ventajas en la literatura y pueden encontrarse, por ejemplo, en las páginas web de Zeiss, Leica, Nikon u Olympus.

[0009] Las aplicaciones de microscopía pueden estructurarse de muchas maneras diferentes, una de las cuales consiste en distinguir entre las modalidades de microscopía dedicadas a la visualización de fuentes puntuales diminutas y las dedicadas a la medición de objetos continuos.

[0010] El caso de las fuentes puntuales diminutas es a priori mucho más sencillo. El objeto consiste en un pequeño número de puntos de luz; éstos pueden describirse mediante un pequeño número de parámetros -los descriptores definidos a continuación-, lo que simplifica enormemente el problema físico y la complejidad algorítmica. El caso de un objeto continuo, descrito por una distribución espacial -o espacio-temporal, si se tiene en cuenta la dinámica continua- es diferente y también se describe en esta solicitud de patente.

[0011] La microscopía de fluorescencia es una de las modalidades de microscopía y ha sustituido a otras técnicas de microscopía en muchas aplicaciones. Un microscopio de fluorescencia es un microscopio óptico que se utiliza para estudiar las propiedades de los objetos o de las sustancias orgánicas o inorgánicas utilizando los fenómenos de fluorescencia en lugar de, o además de, otras modalidades como la reflexión y la absorción.

[0012] Se hace referencia de nuevo a la Figura. 1, esta vez describiendo un microscopio de fluorescencia utilizado en Biología o en Visión Artificial para caracterizar, por ejemplo, materiales; en la microscopía de fluorescencia se fijan diminutas fuentes puntuales, 15 a 18, por ejemplo fluoróforos basados en el fenómeno físico de la fluorescencia de un fotón, en posiciones específicas y predeterminadas de los objetos, 13 y 14; la luz emitida por las fuentes puntuales se observa en lugar de la luz emitida por los propios objetos, 13 y 14.

[0013] La muestra se ilumina con luz de una o varias longitudes de onda específicas que son absorbidas por las fuentes puntuales, induciendo así la emisión de luz a longitudes de onda diferentes y superiores. Al recoger la luz emitida, en fluorescencia, la luz de iluminación se separa de la fluorescencia emitida, que es más débil, mediante el uso de un filtro espectral de emisión.

[0014] La microscopía de fluorescencia estudia la luz emitida por pequeñas fuentes puntuales, los fluoróforos. Sin embargo, cuando la densidad de fluoróforos es alta, los fluoróforos ya no se analizan individualmente sino que se tratan como un objeto continuo. Es importante señalar en este punto que el mismo sistema permite la observación de objetos continuos, y no se limita a la observación de fuentes puntuales.

[0015] Los fluoróforos se han convertido en una herramienta importante para la visualización de objetos biológicos. La actividad biológica y la información que incluye detalles por encima del límite de resolución de 200 nm se visualizan y miden de forma rutinaria mediante microscopía de fluorescencia. Este límite de resolución se deriva del criterio de Rayleigh, que en el mejor de los casos alcanza los 200nm en sistemas especialmente diseñados. Durante mucho tiempo, hasta la aparición de las técnicas de superresolución que se describen a continuación, se reconocía que las técnicas ópticas, incluida la microscopía de fluorescencia, son incapaces de visualizar detalles más pequeños que el criterio de Rayleigh, del orden de 200 nm.

[0016] Sin embargo, otras actividades biológicas fundamentales también se producen a escalas de tamaño inferiores a 200 nm en las muestras biológicas. A este nivel de resolución espacial pueden observarse importantes fenómenos: procesos biológicos a escala intracelular, transferencia de información celular, plegado y desdoblamiento de proteínas y modificaciones del ADN y el ARN. Así, por ejemplo, la medición de esta información intracelular abrirá nuevas vías de comprensión de la actividad biológica y permitirá avanzar en el conocimiento y seguimiento de la investigación y el diagnóstico médicos.

[0017] Las principales implementaciones de la microscopía de fluorescencia, descritas en detalle en la literatura, son el microscopio confocal, a menudo utilizado en una configuración de barrido o de disco giratorio, y el microscopio de imagen de campo amplio.

[0018] Se hace referencia ahora a la Figura 2, que es una representación simplificada de un microscopio de fluorescencia confocal del arte previo 200.

[0019] Un microscopio de fluorescencia confocal, Fig. 2, es un instrumento óptico. Sus principales componentes de hardware se muestran en la Fig. 2. Entre ellos se encuentran:

Una fuente de luz, 20,

Un marco optomecánico no mostrado,

Un cubo con filtro, 21,

Un objetivo de microscopio 22, y,

Un conjunto de detectores, 23,

Una unidad de procesamiento, no mostrada.

[0020] La fuente de luz, 20, que puede ser una lámpara de arco o un láser, crea la energía luminosa necesaria para la fluorescencia.

[0021] El marco optomecánico, no mostrado, soporta todos los elementos ópticos e incluye ópticas auxiliares y capacidades de alineación. También incluye elementos ópticos, no mostrados, capaces de conformar el haz, para permitir su enfoque desde un punto de tamaño mínimo, mediante el objetivo del microscopio.

[0022] También puede comprender, en un microscopio de fluorescencia confocal de barrido, un mecanismo de barrido, espacial o angular, no mostrado, para cambiar la posición de la fuente puntual en relación con el objeto a medir.

[0023] El mecanismo de exploración puede, alternativamente, :

• Traslade el objeto mecánicamente, por ejemplo, utilizando una traducción ,

• Explorar ópticamente el haz sobre el objeto, utilizando, por ejemplo, un conjunto de espejos galvanométricos o traductores acústicos-ópticos, o

• Utilice cualquier combinación de estos medios de traducción, mecánicos u ópticos.

[0024] En un microscopio de fluorescencia de barrido confocal, la información se recoge punto a punto, utilizando el mecanismo de barrido.

[0025] También puede comprender, en un microscopio de fluorescencia confocal de disco giratorio, un disco giratorio, que comprende una pluralidad de agujeros microscópicos, que permite la proyección simultánea de una pluralidad de puntos. En un microscopio de fluorescencia confocal de disco giratorio, se adquiere en cada instante un conjunto de puntos, correspondientes a los agujeros microscópicos, y la rotación del disco permite escanear toda la superficie de la muestra para una posición longitudinal determinada.

[0026] El cubo de filtros, 21, canaliza las diferentes señales ópticas y evita la contaminación de la señal de fluorescencia por la luz de excitación. El cubo de filtros está formado por el filtro de excitación, 210, el espejo dicroico, 211, y el filtro de emisión, 212. Los filtros y el espejo dicroico se eligen en función de la longitud de onda de excitación y de las características espectrales de emisión del fluoróforo.

[0027] El objetivo del microscopio, 22, enfoca la luz creada por la fuente en el plano focal del objetivo, 24, en una distribución de luz de tamaño reducido, siendo la distribución de luz óptima un disco de Airy. El objetivo del microscopio, 22, también recoge la luz fluorescente emitida por los fluoróforos en retorno.

[0028] En el caso de un microscopio de fluorescencia confocal de barrido, el sistema puede ser desescaneado, es decir, la luz de retorno puede pasar a través del mecanismo de barrido para compensar la traslación debida al barrido.

[0029] Una lente detectora, 25, crea una imagen ampliada del plano focal del objetivo, 24, en el plano de la imagen del detector, 26.

[0030] Un orificio confocal, 27, se coloca teóricamente en el plano de imagen del detector, 26. En la mayoría de los sistemas prácticos, el orificio confocal, 27, se coloca en un plano de imagen intermedio no mostrado y se reimagina en el plano de imagen del detector, 26.

[0031] El conjunto detector, 23, detecta la intensidad fluorescente global en el volumen iluminado, y la convierte en una señal digital. En el caso de un microscopio confocal de barrido, el conjunto de detectores es un detector de elemento único, como un PMT o un SPAD. En el caso de un microscopio confocal de disco giratorio, el conjunto de detectores está formado por un conjunto de elementos detectores, como un conjunto CCD, EMCCD, CMOS o SPAD.

[0032] El conjunto de componentes montados desde la fuente de luz hasta el filtro dicroico es la ruta de iluminación, 201. El conjunto de componentes montados desde el filtro dicroico hasta el conjunto detector es la ruta de detección, 202.

[0033] El proceso óptico básico de un microscopio confocal puede segmentarse en seis pasos:

Proyección de la luz sobre el volumen de análisis

Emisión de luz fluorescente de los fluoróforos

Imágenes de planos focales de fluoróforos

Limitación en el plano focal de la luz analizada por el agujero confocal

Integración de la luz analizada por un detector fotoeléctrico

Visualización de la intensidad medida como un valor de píxel en una imagen

[0034] Los microscopios de fluorescencia están disponibles en varios fabricantes, como Nikon, Zeiss, Leica u Olympus. Los microscopios de fluorescencia pueden ser microscopios estándar adaptados a la fluorescencia o microscopios específicos optimizados para la fluorescencia. Los microscopios modernos son instrumentos versátiles capaces de operar en muchas modalidades diferentes, incluyendo pero no limitándose a las modalidades de fluorescencia, utilizando la misma plataforma optomecánica y la mayoría de los componentes. La mayoría de los microscopios de fluorescencia se desarrollan como una plataforma abierta, capaz de realizar muchas funciones adicionales con mínimas modificaciones. Otros microscopios de fluorescencia son instrumentos dedicados, adaptados a una tarea específica, como el diagnóstico médico o farmacéutico.

Superresolución

[0035] Los nuevos métodos ópticos, los métodos de superresolución, son capaces de discriminar fuentes puntuales por debajo del criterio de Rayleigh. Estos métodos están siendo desarrollados por varias empresas, laboratorios e investigadores y algunos de los instrumentos que utilizan estos métodos, los microscopios de superresolución, están disponibles comercialmente. Recientemente se han publicado en la literatura varias revisiones comparativas de los métodos de superresolución, como los trabajos de Schermelleh et al [1].

[0036] Se puede encontrar una bibliografía actualizada sobre la superresolución en la página web de la empresa Zeiss, y en la página web de la empresa Nikon.

[0037] Los diversos métodos de microscopía existentes y los microscopios existentes, que no incorporan la superresolución, permiten la observación microscópica en el límite de la difracción óptica. Esto limita su campo de uso a un conjunto limitado de aplicaciones.

[0038] Las nuevas técnicas de superresolución permiten obtener información más allá del límite de resolución. El principal problema de todas las técnicas de superresolución existentes es que la envolvente de rendimiento, expresada en términos de resolución lateral, resolución longitudinal, velocidad, intensidad de luz requerida, fototoxicidad en el objeto biológico, capacidad de medir diferentes objetos, es muy limitada.

[0039] Además, la mayoría de los métodos e instrumentos de superresolución existentes pueden proporcionar una buena resolución lateral o longitudinal, pero raramente ambas.

[0040] Además, todos estos instrumentos son complejos y requieren un alto nivel de habilidad del operador.

[0041] Además, estos instrumentos generalmente sólo pueden observar una pequeña porción de especímenes biológicos, debido a severas limitaciones operacionales, como por ejemplo, para algunos de ellos, una poca profundidad de campo o intensidades muy altas de daño celular.

[0042] Otro problema con los métodos e instrumentos de superresolución existentes es que la mayoría son capaces de recuperar los atributos de un solo fluoróforo del volumen iluminado, pero fallan en reconocer la presencia de múltiples fluoróforos y medir sus atributos simultáneamente.

[0043] Un problema adicional con los métodos e instrumentos de superresolución existentes es que estos métodos e instrumentos existentes se presentan y son percibidos por los usuarios como una herramienta general, adecuada para reemplazar los microscopios estándar o confocales. Sin embargo, los métodos e instrumentos de superresolución existentes carecen de la simplicidad, la solidez, la facilidad de uso y el precio competitivo de los microscopios estándar, lo que dificulta su uso como herramientas generales de investigación o diagnóstico.

[0044] Otro problema con los métodos e instrumentos de súper-resolución existentes es que la mayoría de estos métodos e instrumentos están construidos como instrumentos autónomos diseñados para reemplazar los microscopios estándar. Este enfoque requiere la sustitución de los instrumentos existentes, así como la renovación de todos los sistemas periféricos y de todos los conocimientos y la experiencia, relacionados con las plataformas de microscopía y desarrollados durante muchos años.

[0045] Otro problema con la mayoría de los métodos e instrumentos de microscopía de fluorescencia y superresolución existentes es que estos métodos e instrumentos están construidos sobre un paradigma de adquisición de imágenes, para el cual la entidad de información básica es una - o más imágenes, o una - o más - ROI - Región de Interés bidimensional. Los métodos algorítmicos, sistémicos y de superresolución descritos más adelante en el contexto de la invención permitirán, por su flexibilidad inherente, el desarrollo de nuevas estrategias de adquisición. Estos procedimientos de adquisición dinámicos y selectivos se definirán mediante una gestión optimizada de la secuencia de adquisición y un procesamiento interactivo y diferido. Permitirán una optimización más avanzada de la información útil, definida por criterios basados en la forma, la geometría y la dinámica de uno o varios objetos fluorescentes, por separado o en relación con los demás.

[0046] Por lo tanto, sigue habiendo una necesidad urgente de proporcionar métodos e instrumentos de superresolución y métodos algorítmicos capaces de medir los atributos de un fluoróforo con gran precisión. También es necesario proporcionar métodos e instrumentos para detectar y cuantificar la presencia de múltiples fluoróforos colocados en el mismo volumen iluminado.

[0047] Otro problema con la mayoría de los métodos e instrumentos de microscopía de fluorescencia y super­ resolución existentes es que estos métodos e instrumentos están diseñados para estudiar muestras en portaobjetos de microscopio. Sin embargo, el microscopio confocal se utiliza hoy en día en muchos campos de la medicina como instrumento de diagnóstico in vivo para realizar exámenes internos y externos del cuerpo humano mediante fibras ópticas utilizadas para iluminar y visualizar la fluorescencia emitida por los tejidos a diagnosticar. La superresolución no permite actualmente este tipo de diagnóstico in vivo. Los métodos algorítmicos, sistémicos y de superresolución descritos más adelante en el contexto de la invención permitirán el desarrollo de nuevos métodos de diagnóstico in vivo que reducirán la necesidad de realizar biopsias y acortarán el tiempo de espera de los pacientes. La publicación "STED super-resolution microscopy intissue and in mammalian cell" (LAU LANA ET AL) divulga un método STED óptico. La publicación "Difracción cónica y formación del haz de Bessel con un cristal biaxial de alta calidad óptica" (C. F. PHELAN ET AL) revela el principio de la difracción cónica. El documento WO 2012/049381 A2 divulga un método de microscopía de superresolución que utiliza la proyección de distribuciones de luz de diferentes topologías a través de un cristal cónico.

RESUMEN DE LA INVENCIÓN :

[0048] Un primer aspecto de esta invención se refiere a un método óptico según la reivindicación 1.

[0049] Otro aspecto de la invención se refiere a la realización de un sistema de superresolución de tipo STED o RELSOFT que utiliza un método de medición óptica de trayecto común acromático y que es capaz de dar forma a diferentes haces en función de su polarización, según la reivindicación 5. Otras realizaciones se definen en las reivindicaciones dependientes.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

[0050] La invención se describirá ahora en relación con ciertas realizaciones con referencia a las siguientes figuras ilustrativas para que pueda entenderse mejor.

[0051] Con referencia específica a las figuras, se enfatiza que las indicaciones ilustrativas se presentan a modo de ejemplo, y con el propósito de ilustrar la discusión de las realizaciones de la invención y se presentan sólo con el propósito de proporcionar lo que puede considerarse como la descripción más útil y fácil de entender de los principios y aspectos conceptuales de la invención. A este respecto, no se intenta mostrar los detalles estructurales de la invención con más detalle del necesario para una comprensión fundamental de la invención, ya que la descripción, junto con los dibujos, hace evidente para el experto en la materia cómo pueden realizarse en la práctica las diversas formas de la invención.

[0052] En los dibujos :

• La Fig. 1 es una representación en perspectiva simplificada de un microscopio de fluorescencia confocal de la técnica anterior, utilizado también como soporte de la invención;

• La Fig. 2 es una representación pictórica simplificada de un microscopio confocal del arte previo

• La Fig. 3 es una ilustración esquemática simplificada de una configuración de un módulo de difracción cónica, según una realización de la presente invención;

• La Fig. 4 es una representación pictórica simplificada de los dos paradigmas de medición según las realizaciones de la invención y la microscopía confocal;

• La Fig. 5 es una representación pictórica simplificada de una realización particular de la plataforma de microscopía SRCDP;

• La Fig. 6a es una ilustración esquemática simplificada de un módulo lateral de superresolución, según una realización de la presente invención;

• La Fig. 6b es una ilustración esquemática simplificada de otra realización de un módulo lateral de superresolución, según una realización de la presente invención;

• La Fig. 7 muestra las tablas de distribuciones de luz de un módulo de difracción de cono en función de la polarización de los polarizadores de entrada y salida para varios valores del parámetro de difracción de cono, p0. Estas distribuciones de luz se calcularon mediante la simulación de las ecuaciones desarrolladas por Berry, [2] ; • La Fig.8 es una ilustración esquemática simplificada de uno de los modos de implementación del seguimiento oscuro;

• La Fig. 9 es una ilustración esquemática simplificada de un método de algoritmo de superresolución de datos de fluoróforos según una realización de la presente invención.

• La Fig. 10 es una ilustración esquemática simplificada del cálculo del descriptor;

• La Fig. 11 es una ilustración esquemática simplificada del módulo de control de la plataforma SRCDP.

[0053] En todas las figuras, los números de referencia similares identifican partes similares.

Definiciones y detalles técnicos

[0054] En la descripción se utilizan las definiciones habituales para: fase y polarización, polarimetría, vectores y matrices de Jones, parámetros de Stokes y técnicas para medir los parámetros de Joncs y Stokes.

[0055] En la descripción se utilizan las definiciones habituales para el modo TEM00 de una fibra y los términos "fibra de cristal fotónico" - PCF -, "fibra de pocos modos" - FMF -, fibra de vórtice y "fibra de cristal fotónico de doble núcleo".

[0056] Nos referiremos a un dispositivo para el acoplamiento de varios láseres a diferentes longitudes de onda o a la misma longitud de onda, con la misma polarización o con diferentes polarizaciones, en una o más fibras ópticas, utilizando el término banco láser.

[0057] Las superoscilaciones son definidas por Yakir Aaronov y Sir Michael Berry. La superoscilación es un fenómeno en el que una señal globalmente limitada en banda puede contener segmentos locales que oscilan más rápido que sus componentes de Fourier más rápidos. [26]

[0058] El centro o centroide de una distribución de luz es el centro de gravedad de la intensidad. El diámetro de una distribución de luz es el diámetro del primer cero de intensidad, para ondas regulares y singulares, sin tener en cuenta el cero central de la onda singular.

[0059] Dos distribuciones de luz están colocadas si sus centros coinciden o están separados por un valor espacial pequeño en relación con la dimensión de la distribución de luz.

[0060] En esta solicitud de patente, utilizaremos la longitud de onda de emisión como métrica base del sistema.

[0061] En esta solicitud de patente, se utilizan las definiciones habituales para los siguientes componentes ópticos: lente, cuya definición se amplía para incluir todos los medios ópticos que transmiten, refractan o reflejan la luz, óptica auxiliar -submódulo óptico para interconectar y ajustar los parámetros geométricos o los parámetros de fase y/o polarización entre otros dos submódulos o módulos ópticos-, polarizador, analizador, placa de retardo, divisor de haz polarizante y no polarizante, combinador de haz polarizante y no polarizante.

[0062] En esta solicitud de patente, se utilizan las definiciones habituales para los polarizadores acimutales y radiales. Ampliaremos, implícita o explícitamente, algunos de los desarrollos descritos más adelante para los polarizadores azimutales y radiales a todos los elementos polarizadores espacialmente variables.

[0063] En esta solicitud de patente, se utilizan las definiciones habituales, [3], para las diferentes técnicas de superresolución; estas técnicas pueden agruparse en familias:

• Transiciones de fluorescencia saturable reversible (RESOLFT), que incluye : Microscopía de agotamiento de la emisión estimulada (STED), agotamiento del estado de tierra (GSD), microscopía de iluminación estructurada saturada (SSIM) y SPEM (microscopía de excitación de patrón saturado), microscopía de localización, que agrupa las técnicas de microscopía de localización fotoactivada (PALM), FPALM (Localización 3D en Microscopía de Localización por Fotoactivación de Fluorescencia), Microscopía de Reconstrucción Óptica Estocástica (STORM), dSTORM (STORM directo), SPDM (Microscopía de Distancia de Precisión Espectral), Parpadeo Estocástico, Agotamiento del Estado de Tierra (GSD), y técnicas similares (sea cual sea el acrónimo)

• Microscopía de Imagen Estructurada (SIM)

• FRAP (recuperación de la fluorescencia tras el fotoblanqueo),

• TIRF (microscopía de fluorescencia de reflexión interna total).

[0064] En esta solicitud de patente, se utilizan las definiciones habituales para las diferentes técnicas de microscopía, de estándar o de superresolución, fluorescentes o no, como los términos ingleses "Computational Microscopy", "Correlative Microscopy", "Cross-platform-microscopy", FCS - Fluorescence Correlation Spectroscopy", FCCS -"Fluorescence Cross-Correlation Spectroscopy", o PCH - Photon Counting, "FCS" - Espectroscopia de correlación de fluorescencia, "FCCS" - Espectroscopia de correlación cruzada de fluorescencia, o "PCH" - Histograma de recuento de fotones, "RICS" - Espectroscopia de correlación de imágenes de trama o "FRAP" - Recuperación de la fluorescencia tras el fotoblanqueo) análisis.

[0065] En esta solicitud de patente, se utilizan las definiciones habituales para la transformada de Hough.

[0066] Nos referimos a un polarizador parcial para describir un elemento o módulo cuya absorción es diferente para las dos polarizaciones lineales - dicroísmo lineal - o para las dos polarizaciones circulares - dicroísmo circular.

[0067] Nos referimos a elementos de polarización o fase dinámicos para describir medios ópticos cuyas propiedades de polarización o fase varían con el tiempo de forma controlada, discreta o continua.

[0068] Dichos elementos de polarización dinámica o de fase incluyen, pero no se limitan a: palas de ondas giratorias en el eje, válvulas de luz basadas en tecnologías de cristal líquido, dispositivos electro-ópticos, también conocidos como células Pockels, células Kerr, dispositivos electro-ópticos resonantes, dispositivos magneto-ópticos, también conocidos como células Faraday, dispositivos acústicos o elasto-ópticos, o cualquier combinación de los mismos.

[0069] Nos referimos a elementos de polarización o de dispersión de fase para describir elementos cuyo estado de polarización depende de la longitud de onda. El más sencillo de los submódulos de dispersión de la polarización es el multimodo o placa de onda gruesa,

[0070] Nos referimos al "algoritmo del centroide" para describir el procedimiento habitual para medir el centroide y, posiblemente, la anchura media máxima (FWHM) de una distribución de luz.

[0071] Este algoritmo tiene sus raíces en la Astronomía y la Astrometría, y ha permitido la medición de la posición de las estrellas con una precisión muy alta. Este algoritmo se utiliza hoy en día en toda la instrumentación óptica, incluida la biología de superresolución.

[0072] En este documento, se utilizan definiciones comunes para los siguientes componentes optoelectrónicos: detector fotoeléctrico, CCD, EMCCD, CMOS, SPAD Single Photon Avalanche Diode y SPAD array.

[0073] Utilizaremos los términos:

• imagen óptica, para la distribución espacial de la intensidad luminosa,

• imagen electrónica, para describir la distribución espacial de cargas para un CCD, de corriente para un CMOS o de eventos para un SPAD, creada por la imagen óptica, en un momento dado, en un plano de detección,

• imagen digital, para describir una matriz de números creada al escanear la imagen electrónica.

[0074] Para simplificar la lectura y la comprensión del texto, utilizaremos también el término imagen para la salida de un detector de un solo píxel, como un PMT o un SPAD, considerándola como una imagen formada por un solo píxel.

[0075] Cuando no exista ambigüedad, o cuando la distinción entre los tres tipos de imágenes no sea necesaria, utilizaremos el término genérico simplificado de imagen.

[0076] Para las imágenes, utilizamos la terminología utilizada para los detectores de matriz, como los CCD, EMCCD y CMOS. En el caso de los SPAD y los conjuntos de SPAD, el resultado de una medición es una lista ordenada en el tiempo de los impactos de los fotones que detalla, para cada fotón, el tiempo y la posición del impacto. Para simplificar la presentación de este documento, incluiremos este caso en nuestra definición de imágenes.

[0077] Las imágenes detalladas en este documento, en muchos casos, pueden describirse como microimágenes, imágenes de tamaño sustancialmente igual a un pequeño número de diámetros de disco de Airy, típicamente menos de 5 diámetros, y/o bajo número de píxeles, típicamente 4 x 4 a 32 x 32.

[0078] En una imagen digital Aj, los índices m y n representan los índices de los píxeles; el origen de los píxeles se elegirá como la proyección del centro del volumen de análisis definido en un párrafo posterior.

Polarimetría y vectores de Stokes

[0079] La polarimetría se refiere a la medición del estado de polarización de la luz incidente. El estado de polarización de la luz incidente puede describirse mediante los parámetros de Stokes, un conjunto de valores, introducidos por George Gabriel Stokes en 1852, y utilizados en Óptica.

Copropagación de dos haces ópticos

[0080] Muchos sistemas y dispositivos ópticos utilizan dos o más haces con propiedades diferentes. Los haces pueden o no interactuar entre sí, proyectarse de forma secuencial o simultánea. En la mayoría de estos sistemas y dispositivos, las dos vías ópticas están separadas físicamente entre sí. Esta separación física crea un conjunto de restricciones de ingeniería que, aunque pueden resolverse, aumentan considerablemente la complejidad y el coste del sistema. Nos referimos a los sistemas de trayectoria común como un conjunto de dispositivos en los que los dos haces diferenciados se propagan por la misma trayectoria física, con pequeñas variaciones.

Campo eléctrico en coordenadas polares y modos angulares

[0081]

E(p,9) = A(p,9) • exp[í qi(p,9)]u(p,9) (EQ.1) Es habitual en óptica descomponer las componentes del campo, es decir, su amplitud, su fase y su polarización, en modos ortogonales, cartesianos o polares.

El hombre de la técnica conoce numerosas descomposiciones en modos ortogonales polares, como los modos gaussianos, Hermite-Gaussianos y Laguerre-Gaussianos.

En este trabajo utilizaremos principalmente la descomposición de la amplitud del campo eléctrico en modos HyGG hipergeométricos-gaussianos de la forma :

A(p, 9) x pP+WA(p, 9) • exp(-p2 ilff) (EQ.2) En esta descomposición, p es el modo radial y l el orden azimutal.

Ondas singulares

[0082] Una onda singular tiene intensidad cero en su centro y una variación de fase azimutal de un múltiplo de 2n. Este tema de investigación en Óptica, iniciado por el importante trabajo de J.F Nye y M. Berry, en 1974, [4], se conoce ahora como "óptica singular". A continuación se presentan ejemplos de ondas regulares y singulares.

[0083] Utilizamos el término conformación del haz para describir la transformación de una onda de una forma y topología determinada en una onda de otra forma o topología, y en particular la transformación de una onda regular en una singular y viceversa.

Topología y distribuciones luminosas compactas

[0084] Una distribución luminosa puntual se considerará compacta si cumple una de las condiciones de compacidad definidas a continuación, mediante dos condiciones alternativas y no excluyentes:

o bien, más del 75% de la energía está contenida en un círculo con un radio inferior a 1,75 veces el radio de Airy,

o un dominio de luz, que contiene más del 65% de la energía, está delimitado por una línea de intensidad cero dentro de un círculo de radio inferior al doble del radio de Airy,

[0085] Distinguimos diferentes familias de distribuciones luminosas puntuales, con diferentes topologías:

Distribuciones regulares, en su definición habitual en Óptica,

Distribuciones singulares, también llamadas vórtices ópticos, de carga topológica (orden azimutal) 1, en las que la fase varía de 0 a 2n l,alrededor de la dirección de propagación, siendo l un número entero.

Las distribuciones de amplitud que varían azimutalmente de orden l, también conocidas como la distribución de Laguerre-Gauss,

Distribuciones de polarización y, opcionalmente, de fase con variación azimutal de orden Il, también conocidas como modos Laguerre-Gaussianos polarizados radialmente.

[0086] Se considerará que dos distribuciones luminosas compactas son de familias topológicas diferentes si satisfacen al menos una, y cualquiera, de las siguientes condiciones:

Una es regular y la otra es singular,

Uno es de punta y el otro de anillo,

Los órdenes azimutales l de la amplitud de las dos distribuciones de luz difieren,

Los órdenes azimutales l de la polarización o la fase de las dos distribuciones de luz difieren.

[0087] Alternativamente, se considerará que dos distribuciones de luz proyectadas sobre un volumen dado tienen topologías diferentes si en una parte sustancial del área iluminada conjuntamente los gradientes son de dirección opuesta.

Emisores de nanoluz

[0088] Un nanoemisor emisor de luz es un pequeño emisor secundario, adherido a un objeto; es sustancialmente más pequeño que una fracción de una longitud de onda, típicamente pero no limitado a un tamaño inferior a un quinto de la longitud de onda; un nanoemisor emisor de luz absorbe energía incidente y reemite luz a la misma longitud de onda que la luz incidente o a diferentes longitudes de onda; la luz emitida por el nanoemisor puede ser coherente, parcialmente coherente o incoherente con la luz absorbida. Los principales ejemplos de nanoemisores emisores de luz son los fluoróforos y las nanopartículas, pero también incluyen un gran número de otros elementos.

[0089] La definición, en el contexto de la invención, de los nanoemisores de luz viene determinada por las dos condiciones siguientes:

Creación de un emisor de luz puntual secundario,

y

El posicionamiento predeterminado de este transmisor en relación con una entidad artificial, biológica u orgánica.

[0090] Los mecanismos físicos que pueden crear un nanoemisor son numerosos; incluyen, pero no se limitan, a la absorción, la dispersión o la reflexión, la fluorescencia, la "emisión-agotamiento", [5] por ejemplo, mediante técnicas RESOLFT, los fenómenos de fotoactivación y fotoagotamiento, la fluorescencia de dos o múltiples fotones, la dispersión elástica o inelástica, la dispersión Raman u otros mecanismos físicos conocidos en la técnica. Utilizaremos el término emisión de luz para describir la emisión de ondas electromagnéticas del emisor de luz, ya sea coherente, incoherente o parcialmente coherente.

[0091] Ampliaremos nuestra definición de nanoemisores para incluir las partículas dispersantes, absorbentes y reflectantes unidas a una entidad biológica u orgánica; la acción de una partícula dispersante, reflectante o absorbente sobre el campo electromagnético puede, en efecto, describirse como la creación con fase inversa, según el principio de Babinet, para una partícula absorbente de un campo secundario auxiliar, que emerge de la partícula, superpuesto al campo electromagnético incidente.

[0092] En esta solicitud de patente, nos referiremos a los descriptores de un nanoemisor para denotar el conjunto de información que describe un nanoemisor como fuente puntual, en un momento dado. Dado que el nanoemisor se considera una fuente puntual, el conjunto de información que lo representa contiene un número limitado de parámetros, a saber: su posición en el espacio, su intensidad, las características espectrales, de intensidad, coherencia, fase y polarización de la luz emitida por el fluoróforo, en función de la luz incidente.

[0093] En esta solicitud de patente nos referiremos a los descriptores de un objeto estructurado. Por ejemplo, para una línea uniforme, el conjunto de información que la representa contiene un número limitado de parámetros, a saber: su orientación en el espacio, su intensidad, las características espectrales, de intensidad, de coherencia, de fase y de polarización de la luz emitida por el objeto, en función de la luz incidente.

[0094] Para una distribución continua, el objeto se representa, como es habitual en el procesamiento de imágenes, mediante una matriz de intensidades.

[0095] Sin embargo, en la mayoría de los casos, y en la descripción de la invención, nos referimos, bajo la denominación de descriptores, a un subconjunto de los descriptores de un nanoemisor que comprende su posición geométrica, su intensidad y el tipo de fluoróforo, cuando varias poblaciones de nanoemisores luminosos, diferenciados por ejemplo por su espectro de emisión, están presentes en la misma muestra. Esta simplificación utilizada en la descripción no altera el alcance de la invención, que incluirá en su campo de aplicación la totalidad de los descriptores de los emisores de luz.

[0096] Para simplificar la comprensión del contexto de la invención, la siguiente descripción se refiere únicamente al caso más sencillo, aquel en el que el nanoemisor es un fluoróforo y la interacción física es la fluorescencia de un fotón. Sin embargo, esta descripción debe entenderse como una ilustración simplificada de una descripción general de los métodos y conceptos aplicables a todos los nanoemisores de luz anteriormente mencionados o conocidos por el Hombre de la Técnica, sea cual sea el fenómeno físico subyacente.

[0097] Es notable que el nanotransmisor muestre el campo o la intensidad incidente en una posición tridimensional específica, sin influir en toda la distribución espacial de la intensidad incidente. En esta solicitud de patente nos referiremos a esta notable propiedad como la capacidad de muestreo del nanoemisor de luz.

[0098] Sin embargo, la realización descrita de la invención también permite la medición de objetos estructurados y distribuciones continuas que no tienen la capacidad de muestreo del nanoemisor de luz.

[0099] Se hace referencia de nuevo a la Figura. 1; que representa un conjunto de nanoemisores u objetos estructurados, posicionados sobre un objeto biológico determinado, 15 y 16 por un lado y 17 y 18 por otro. Alternativamente, la luz emitida puede consistir en una distribución continua, no mostrada en la figura 1, o cualquier combinación de nanoemisores, objetos estructurados o distribución continua. El conjunto de nanoemisores, objetos estructurados o distribuciones continuas se denomina conjunto de "objetos luminosos biológicos"; representan un mapa del objeto biológico, en el sentido definido por Alfred Korzybski en la semántica general. Sin embargo, es práctica habitual, para simplificar la descripción, referirse al objeto biológico luminoso como el propio objeto biológico, cuando no puede surgir ninguna ambigüedad. El objeto luminoso biológico contiene mucha información relevante relacionada con el objeto biológico, principalmente información espacio-temporal, la posición del objeto y su orientación en el tiempo, e información morfológica, por ejemplo en el caso de la división de una célula en dos.

[0100] El sistema de medición según al menos una realización de la invención calculará el mapa medido, y realizará una evaluación de los descriptores de cualquier combinación de nanoemisores, objetos estructurados o una evaluación de la distribución espacial de distribuciones continuas. Este mapa medido difiere del mapa original, debido al ruido, las condiciones de medición, las limitaciones del sistema o la incertidumbre de la medición. Esta información del mapa medido puede elaborarse en diferentes niveles de abstracción. Este primer nivel de abstracción, que describe los resultados directos de la medición, no contiene, a priori, ninguna información biológica, sino los resultados de una medición física descrita por nanoemisores, objetos estructurados o distribuciones continuas, que podrían, en efecto, representar cualquier entidad marcada.

[0101] El segundo nivel, el nivel de abstracción geométrica, estructura los nanoemisores de objetos estructurados o distribuciones continuas como objetos geométricos. Consiste en una descripción de los objetos luminosos y sus características dinámicas, como su posición u orientación, o su morfología. En este nivel, la información sigue siendo física y geométrica y describe un conjunto de objetos. La información geométrica utiliza el mapa medido e información auxiliar, potencialmente externa al sistema, sobre la relación entre los puntos de luz y los objetos.

[0102] El nivel de abstracción biológica permite una cierta aprehensión de la realidad biológica gracias a una relación constitutiva entre los objetos medidos y las entidades biológicas correspondientes. Contiene un conjunto de información sobre el objeto biológico, principalmente la posición y su dinámica, forma y morfología. La información biológica utiliza el mapa medido y la información geométrica, así como información auxiliar, potencialmente externa al sistema, sobre la relación de los puntos de luz y los objetos con las entidades biológicas. A este nivel se pueden obtener una serie de conclusiones sobre la funcionalidad biológica de la muestra.

[0103] El nivel de abstracción funcional permite la aprehensión de la realidad biológica. Consiste en información funcional, desvinculada de la información geométrica, y responde a preguntas en términos y jerga biológicos, como: "¿Ha penetrado el virus en la célula?

[0104] Se puede definir un nivel adicional de información que incluya el proceso de control e instrumentación; de hecho, se puede definir un proceso de control e instrumentación más avanzado que permita llegar a una información biológica más estructurada, a través de una automatización del proceso de adquisición de datos. Un ejemplo de este tipo de procesos es el descrito por Steven Finkbeiner, bajo el nombre de "Sistemas de microscopía robótica".

[0105] Esta descripción de los niveles de abstracción, definidos en esta aplicación, ha sido escrita, para simplificar, para la Biología. Es aplicable, mutatis mutandis, a todos los campos de la Visión, biológica y médica, artificial e industrial.

Difracción cónica

[0106] La difracción, o refracción cónica, es un fenómeno óptico predicho por Hamilton, [6], en 1832, y confirmado experimentalmente dos meses después por Lloyd, [7]. La difracción cónica describe la propagación de un haz de luz en la dirección del eje óptico de un cristal biaxial.

[0107] En efecto, en un cristal biaxial, el eje óptico se sitúa en el plano creado por los ejes cristalográficos x y z; el

ángulo con respecto al eje z es 00 , en función de los tres índices de refracción según la ley tan0o

[0108] Hamilton predijo que la luz emerge como un cono hueco de rayos. La refracción cónica es un paso importante en la historia de la ciencia y desempeñó un papel en la demostración de la teoría de las ondas electromagnéticas.

[0109] En los últimos años del siglo XX se produjo un renacimiento del interés por la difracción de conos, que culminó con una teoría completa de Berry et al.[2], validada experimentalmente en 2009, [8]. Aquí seguimos la teoría, la terminología y las definiciones de Berry, incluido el cambio de nombre del efecto físico a partir de este punto, utilizando el término más riguroso de difracción de conos.

[0110] Sin embargo, es importante señalar que el término "difracción cónica" se utiliza también para otras dos técnicas no relacionadas con la técnica que estamos describiendo:

• La difracción en incidencia oblicua también se denomina difracción en cono

• El término "montaje de difracción cónico" se refiere a un conjunto de rejillas de difracción en el que la rejilla está montada en una superficie curva.

[0111] La difracción cónica ha suscitado un considerable interés teórico y experimental, pero "no parece haberse encontrado ninguna aplicación práctica" [9].

[0112] Históricamente, la difracción cónica se ha observado en cristales biaxiales. Nos referimos a un cristal cónico para describir un cristal biaxial inorgánico u orgánico que presenta el fenómeno de difracción cónica. Algunos ejemplos no limitantes de cristales biaxiales incluyen, Aragonita, KTP, KTA, KBiW, LBO, KNbO³, MDT, YCOB, BIBO, DAST, POM, NPP, LAP, LiInS² y LiInSe².

[0113] Existen otros efectos, creando una difracción de cono intrínsecamente más débil o creando una difracción de cono más débil a lo largo de un camino óptico más corto. Sin embargo, estos efectos pueden utilizarse en los dispositivos descritos. Estos efectos incluyen polímeros, cristales líquidos y efectos de birrefringencia inducidos externamente. Los polímeros incluyen, pero no se limitan a: láminas de polímero estiradas y polimerización en cascada, [10]; los cristales líquidos incluyen, pero no se limitan a: fase nemática biaxial termotrópica, [11]; los efectos de birrefringencia inducidos externamente incluyen, pero no se limitan a: aplicación de un campo eléctrico que crea un efecto electro-óptico, en un cristal cúbico no centrosimétrico, y modulador fotoelástico.

[0114] La fase en el vórtice creado por la difracción cónica es una fase geométrica y por lo tanto es intrínsecamente acromática.

[0115] Los efectos cromáticos adicionales son la dispersión del eje óptico y la dependencia de la longitud de onda de los diversos parámetros en las ecuaciones de difracción del cono.

[0116] La dispersión cromática del eje óptico crea un ángulo dependiente de la longitud de onda del eje óptico del cristal con respecto al eje óptico del sistema. Se debe, en la mayoría de los casos, a la dispersión de los índices de refracción.

[0117] Los índices de refracción dependen de la longitud de onda, según las ecuaciones de Sellmeier. Por lo tanto, el ángulo del eje óptico varía con la longitud de onda, creando un ángulo de inclinación cromática del eje óptico en el plano creado por los ejes cristalográficos x y z.

[0118] Depende en gran medida del tipo de cristal. En un cristal MDT, el menos acromático en el visible, la dirección del eje óptico varía en menos de 0,1 grados entre 540 nm y 700 nm. En un cristal KTP, el más acromático en el Ir de telecomunicaciones, el ángulo varía en 0,05 grados, entre 1.350 nm y 2.100 nm, y menos de 0,02 grados en la ventana de telecomunicaciones - 1450 nm a 1650 nm. Por otro lado, 00 puede variar fuertemente con la longitud de onda en algunos cristales orgánicos como el DAST.

[0119] La compensación de la dispersión cromática del eje óptico puede realizarse mediante óptica geométrica. La dispersión cromática en la dirección del eje óptico puede compensarse utilizando la dispersión natural del vidrio u otros materiales ópticos, o utilizando rejillas o prismas. El procedimiento de acromatización en este caso no difiere del procedimiento estándar para corregir cualquier aberración cromática en la óptica geométrica. Este procedimiento puede diseñarse y optimizarse mediante uno de los paquetes de software óptico disponibles en el mercado, definiendo las funciones objetivo adecuadas.

[0120] Un concepto diferente de acromatización se basa en el uso de dos materiales diferentes, con efectos de difracción cónica inversa, a alta y baja dispersión cromática.

[0121] La dependencia de la longitud de onda de los diversos parámetros en las ecuaciones de difracción de cono cambia los parámetros de eficiencia de los efectos de difracción de cono.

[0122] Para los cristales cónicos lineales, definidos más adelante, la función de transferencia fundamental es idéntica a la unidad y, por tanto, trivialmente independiente de la longitud de onda. En cambio, la función de transferencia del vórtice depende de la longitud de onda y puede representarse mediante un factor cromático igual a t (A).

[0123] Para los cristales cónicos sinusoidales, definidos más adelante, el comportamiento es diferente al de los cristales cónicos lineales: la onda fundamental depende de la longitud de onda y la onda de vórtice es casi independiente de ella. De hecho, las simulaciones muestran que la forma de la onda de vórtice sólo se modifica ligeramente por una variación del parámetro 0n de 0,5 a 0,75. Por otra parte, la forma de la onda fundamental depende de la longitud de onda y este efecto debe tenerse en cuenta en el diseño de los sistemas que utilizan tanto las ondas fundamentales como las de vórtice.

[0124] Se hace referencia ahora a la Figura 3, que es una ilustración esquemática simplificada de una configuración de un módulo de difracción cónico, 300, de acuerdo con una realización de la presente invención.

[0125] Se supone que la luz incidente, 30, está colimada, aunque pueden adaptarse otras condiciones utilizando medios ópticos sencillos.

[0126] El montaje propiamente dicho comprende una primera lente, 31, un cristal cónico acromático, 32 y una lente opcional 33. Las dos primeras lentes, 31 y 33, se configuran preferentemente como un telescopio Kepler 1:1. La apertura numérica de la primera lente, 31, en el espacio de la imagen, representada a continuación como U⁰ , determina los parámetros del efecto cono a través del rayo cónico, definido a continuación. En el plano focal de la primera lente, 31, se coloca un plano de imagen cónico, 35; también se puede añadir un polarizador, o polarizador parcial, 29, descrito anteriormente. Sin embargo, en algunos sistemas ópticos en los que la luz incidente ya está polarizada, este elemento no es necesario. Una lente de enfoque, 36, determina el tamaño final del punto luminoso. Puede ser un objetivo de microscopio externo, o puede estar fusionado con la segunda lente 33. La distribución de la luz proyectada sobre la muestra es, en una primera aproximación, despreciando los efectos vectoriales, una imagen reducida de la distribución de la luz en el plano de la imagen. La influencia de los efectos vectoriales se analizará más adelante. La relación de escala o el aumento se determina mediante el objetivo de un microscopio.

[0127] Dejemos que la variable espacial, R, en el plano de imagen cónico, y el vector de onda, U, se representen en coordenadas cilíndricas por R, 0r y U, 0u . Sea A la longitud de onda de la luz.

[0128] El comportamiento del campo eléctrico que emerge del cristal cónico 32 está totalmente caracterizado por un único parámetro, el radio cónico, R⁰; el radio cónico depende del material y del espesor del cristal.

[0129] Introducimos parámetros normalizados que permiten que la siguiente descripción de la distribución de la luz sea válida tanto en el plano cónico de la imagen como en el foco del objetivo del microscopio, dentro de los límites de la teoría escalar de la difracción. En la referencia [2] se describe un ejemplo de introducción de parámetros estándar.

[0130] La posición radial normalizada, p, el vector de onda normalizado, u, representado en coordenadas cilindricas por p, 0^r y u, 0^u , y el radio cónico normalizado, po, vienen dados por:

p = 2 JÜ0, u = ^ ; Po = 2 y ü „ . (EQ. 3)

P = 2 j U 0, u = ¿ ; Po = 2 ^ fü 0. (EQ. 4)

[0131] Siendo Uo la apertura numérica del sistema. Para po <0,5, nos referimos aquí a un cristal cónico fino; para po << 1, nos referimos aquí a la forma de un cristal cónico fino lineal, para po < 0,5 y >1, a un cristal cónico fino sinusoidal y para 1<po <6, a un cristal cónico medio.

[0132] La onda emergente del cristal cónico delgado, E(p, 0r ), expresada en coordenadas normalizadas para una onda polarizada circularmente, consiste en la superposición de dos ondas, denominadas aquí como la onda fundamental, Ef (p), una onda regular, y la onda de vórtice, Ev(p ,0r ), una onda singular; estas dos ondas son coherentes entre sí, colocadas, polarizadas circularmente y de quiralidad inversa :

E(p,tffi) = E F(p) ( ^ . ) Fv(p) exp(-WR) ( j ) (EQ. 5)

[0133] En esta ecuación, Ef(p) es la amplitud escalar fundamental, Fv(p) es la amplitud escalar reducida del vórtice; están dadas por:

Ep(p) = 2nf duucos(p„u)J„(pu); Fv (p) = 2nf duusin(p„u) j F(pu) (EQ. 6)

[0134] Para un cristal cónico delgado lineal, la onda fundamental puede ser aproximada por un punto de Airy y la onda de vórtice puede ser aproximada a un vórtice lineal, representado por:

Fv (p) = 2np„f duu2JP(pu) (EQ. 7)

[0135] Suponiendo que la acción del polarizador parcial, 29, reduce la intensidad de la onda de vórtice en un factor a, los parámetros de Stokes pueden derivarse de las ecuaciones anteriores, siendo p el ángulo de polarización lineal:

S0 = (EF(p))2 (a2Fv(p))2

■Sj = 2aEF(p)Fv(p) sin(0R) ; S2 = 2aEF(p)Fv(p)cos8F! (EQ. 8)

S3 = (EF(p))2 - { a 2Fv(p))2

p = eR

[0136] Utilizaremos el término "objeto disperso" para describir un conjunto de emisores de luz puntuales, en número inferior a doce, situados en un volumen cuyo tamaño en cada dimensión es inferior a 3 longitudes de onda en la longitud de onda emisora o reflectante de los emisores. El volumen de tamaño inferior a 3 longitudes de onda, que contiene el objeto disperso, se denominará volumen de análisis de tamaño reducido.

[0137] Utilizaremos el término objeto continuo para describir un conjunto de emisores de luz puntuales o continuos, que no cumplen las condiciones descritas anteriormente en la definición de objeto disperso.

[0138] Se hace referencia ahora a las Figuras 4a a 4c que son una representación simplificada del concepto de confinamiento de volumen del microscopio confocal.

[0139] La funcionalidad del confinamiento de volumen es limitar, en las tres dimensiones espaciales, la región observada de la muestra a un volumen del menor tamaño posible, el volumen de análisis. La funcionalidad del confinamiento del volumen limita el volumen de análisis mediante la combinación de dos efectos: el confinamiento de la luz proyectada a un área pequeña, idealmente el tamaño del punto de Airy, 5o, y la eliminación de la luz desenfocada por el agujero confocal, 28 en la Figura 2 . La superposición de estos dos efectos crea un pequeño volumen, el volumen de análisis, 6o. Este volumen determina el tamaño de la región elemental detectada por el sistema.

[0140] Considérese un objeto parsimonioso o continuo, 51, formado por un conjunto de nanoemisores, 53 a 59. Los nanoemisores 53 a 55 colocados en el volumen de análisis 6o, y sólo ellos, son excitados por la fuente de luz y los fotones emitidos por ellos llegan al módulo detector. Los nanoemisores que no están en el cono de iluminación, 56 y 57, no son iluminados por la luz incidente. La luz emitida por los nanoemisores 58 y 59 que no se encuentran en el plano conjugado del agujero confocal, 28 en la figura 2 , es bloqueada casi por completo por el agujero confocal, 28 en la figura 2 .

[0141] En el sistema se definen dos puntos de referencia cartesianos diferentes, Figura 4c:

El marco de referencia "i": Los ejes referenciados "i" representan un marco de referencia cartesiano centrado en el centro del volumen de análisis, 61.

El marco de referencia "a": Los ejes referenciados "a" representan un marco de referencia cartesiano centrado, para cada emisor de luz, en el emisor de luz considerado como un punto discreto, 62,

[0142] Cuando, utilizando una realización de la invención que se describirá más adelante, se proyecta un vórtice sobre la muestra que se está analizando, el centro del vórtice se definirá generalmente como el centro del volumen de análisis.

[0143] La principal realización de la invención utiliza la difracción cónica para implementar los módulos ópticos fundamentales de la técnica. Sin embargo, las implementaciones alternativas, sustituyendo los módulos basados en la difracción cónica, por módulos basados en otros conceptos ópticos, son capaces de proporcionar la misma funcionalidad. Están intrínsecamente dentro del ámbito de esta invención. Los conceptos ópticos alternativos incluyen, entre otros, los cristales uniaxiales, las rejillas de sub-longitud de onda, los modos láser estructurados, los componentes holográficos y otras técnicas conocidas por el experto,

[0144] Los conceptos, técnicas y dispositivos ópticos y optoelectrónicos se describen, por ejemplo, en el libro escrito por D. Goldstein, "Polarized light", [12], el "Handbook of Confocal Microscopy", [13], el "Handbook of Optics", [14].

Semáforo óptico

[0145] Utilizamos el término semáforo óptico para describir un elemento óptico, pasivo o activo, capaz de canalizar la luz incidente hacia diferentes canales o detectores en función de una propiedad de la luz. El caso más sencillo es una placa dicroica que separa la luz en dos canales en función de la longitud de onda.

[0146] Utilizamos el término "semáforo óptico dependiente de la posición" (PDOS) para describir un semáforo óptico que canaliza la luz en función de la posición del punto emisor. La PDOS estará determinada por una serie de funciones de transferencia, Ti(x,y,z) que dependen, para cada canal o detector i, de la posición del emisor (x,y,z), en un volumen de referencia. El orden de la PDOS será el número de canales o detectores. La PDOS será sin pérdidas en un volumen de análisis si la suma de las funciones de transferencia, Ti(x,y,z) es igual a la unidad en el volumen de análisis.

[0147] El agujero confocal, descrito por Minsky, [15], se considera una PDOS degenerada de orden 1.

[0148] En la mayoría de los casos, la dependencia de la PDOS es una función compleja de posiciones laterales y longitudinales. Sin embargo, utilizamos el término Semáforo óptico dependiente de la posición longitudinal (LPDOS) para describir un semáforo óptico que canaliza la luz en función de la posición longitudinal del punto emisor. El LPDOS estará determinado por una serie de funciones de transferencia, Ti(z) que dependen, para cada canal o detector i, de la posición longitudinal del emisor (z), en un volumen de referencia. El orden de la PDOS será el número de canales o detectores. El LPDOS será sin pérdidas en un volumen de análisis si la suma de las funciones de transferencia, Ti(z) es igual a la unidad en el volumen de análisis. El LPDOS suele estar acoplado a un tope, lo que limita el campo lateral del sistema.

Transmisión por fibras ópticas

[0149] Un uso principal de las fibras ópticas es la transmisión exclusiva del modo TEMoo. Sin embargo, algunas configuraciones de fibras ópticas, como las FMF o las fibras de vórtice, basadas principalmente, pero no exclusivamente, en las denominadas fibras de cristal fotónico (PCF), permiten la transmisión simultánea o no de modos más complejos, incluidos los modos de vórtice, con una vorticidad igual o inferior a 2. Por lo tanto, sería posible desplazar las distribuciones ópticas creadas por la difraccióncónica utilizando fibras ópticas, lo que permitiría una importante simplificación del sistema óptico.

[0150] La posibilidad de desplazar las distribuciones ópticas creadas por la refracción cónica por medio de fibras ópticas permite la aplicación de las realizaciones de la invención a muchas aplicaciones adicionales, por ejemplo, pero no limitado a la observación gástrica o gastroenterológica, y la observación del colon y del tracto urinario.

[0151] Además, algunas fibras, las llamadas fibras de cristal fotónico de doble núcleo [16], permiten la interacción entre dos modos, uno de los cuales puede ser un vórtice, y proporcionan un mecanismo físico adicional para crear diversas funciones de transferencia.

Mediciones de varias longitudes de onda

[0152] El objeto puede ser iluminado con luz monocromática utilizando, por ejemplo, un láser convencional o una lámpara monocromática. Esta configuración es sencilla, ya que uno de los principales parámetros del sistema es fijo y está bien determinado. Sin embargo, el objeto también puede ser iluminado a varias longitudes de onda, ya sea de forma discreta, por ejemplo, utilizando varios láseres, o de forma continua, por ejemplo, utilizando una lámpara o un láser con un espectro más amplio.

[0153] Muchos de los sistemas de super-resolución existentes miden simultánea o secuencialmente en múltiples longitudes de onda. En efecto, es posible etiquetar elementos similares o diferentes con fluoróforos que tienen respuestas espectrales diferentes, lo que permite reconocerlos y separarlos. Es importante presentar dos casos diferentes:

• El uso de marcadores fluorescentes, que emiten a dos longitudes de onda diferentes, excitados por la misma longitud de onda

• El uso de marcadores fluorescentes que emiten a dos longitudes de onda diferentes o similares, excitados por dos longitudes de onda diferentes

[0154] Cabe señalar que en el caso de utilizar marcadores fluorescentes, que emiten a dos longitudes de onda diferentes, excitados por la misma longitud de onda, el problema de registro entre las mediciones de una longitud de onda con respecto a la segunda, son intrínsecamente inexistentes porque la información de posición de súper resolución se deriva de la proyección de la luz, que es perfectamente idéntica para las diferentes longitudes de onda.

[0155] Esto permite la calibración relativa de la posición de los fluoróforos a dos longitudes de onda diferentes, con una precisión limitada únicamente por el sistema de calibración experimental, eliminando el principal problema de registro entre dos imágenes de diferentes longitudes de onda.

[0156] La posibilidad de acromatizar los sistemas ópticos basados en la difracción cónica los convierte en una herramienta de elección para la implementación de sistemas ópticos, un camino común, para muchas aplicaciones, y más particularmente para las realizaciones descritas de la invención.

[0157] La acromatización también es posible para los sistemas ópticos basados en cristales uniaxiales, y para casi todas las implementaciones alternativas de esta invención, cada una con diversos grados de complejidad práctica.

[0158] Otros sistemas de fluorescencia existentes utilizan luz con un contenido espectral más amplio para reducir los artefactos, principalmente los efectos de moteado.

[0159] Como corolario, las propiedades espectrales de las proteínas fluorescentes permiten medir el potencial de las interacciones moleculares intracelulares mediante la técnica de transferencia de energía de resonancia de Forster (fluorescencia) (FRET).

[0160] En algunas implementaciones de sistemas PSIT, la luz de un haz o haces de láser incidentes se divide utilizando un divisor de luz en dos haces, el haz principal que realizará la funcionalidad del sistema PSIT, y un haz adicional de baja intensidad utilizado para medir la posición del haz de láser utilizando una cámara o detector de posición. Este dispositivo permite medir la posición del láser en tiempo real, independientemente de cualquier bamboleo u otro error mecánico, con una precisión muy elevada.

Utilización de interacciones no lineales en la superresolución y la familia de técnicas RESOLFT y STED

[0161] El uso de interacciones no lineales en un medio material entre dos haces de luz fue propuesto en 1994 por Hell, [5] y [17], como base para un sistema de súper resolución. De los trabajos de Hell han surgido muchas técnicas diferentes que han creado varias familias de técnicas, como el RESOLFT y la microscopía de localización. Se han publicado varias revisiones de estas técnicas, como la de Schermelleh et al [1].

[0162] Estas interacciones no lineales incluyen, pero no se limitan, a los fenómenos de interacción de dos fotones, efectos de emisión-desaparición, parpadeo y fotoactivación en los que se basa la familia de tecnologías RESOLFT y la familia de tecnologías de microscopía de localización.

[0163] La familia de tecnologías RESOLFT es bien conocida y se describe en varias referencias, como el artículo original de Hell [5] y la patente original [17], o por Schermelleh et al [1], o en publicaciones recientes, Vicidomini et al [18], o por Willig et al [19].

[0164] En la técnica STED descrita en el artículo original de Hell [5], se proyectan dos haces, secuencialmente sobre el objeto: un haz de excitación estándar, modelado en la mayoría de los casos por una distribución de luz descrita por una función de Airy, y un haz de agotamiento, con forma de donut o vórtice; el efecto del agotamiento es impedir la fluorescencia de los fluoróforos en la superficie de la distribución de luz de agotamiento, mientras que se deja intacta la emisión de los fluoróforos situados en el centro de la distribución de luz fuera de la distribución de luz de agotamiento; esto crea una distribución de luz de emisión equivalente más pequeña que la distribución de luz de excitación original Esta técnica ha permitido realizar distribuciones de luz de emisión equivalente muy pequeñas, pero sigue requiriendo energías de luz de agotamiento muy elevadas.

[0165] Se han desarrollado diversas variantes de STED: STED de onda continua, [20] STED con puerta, [21] y STED modulada [22]. En la STED CW, el láser pulsado utilizado en la primera versión de la STED se sustituye por un láser continuo, más sencillo. En el STED gated los fotones emitidos se discriminan en función de su tiempo de emisión para descartar los fotones emitidos por los fluoróforos que no han recibido el haz de agotamiento durante un periodo de tiempo suficiente; el STED modulado utiliza un haz de excitación de intensidad modulada en combinación con una detección sincrónica en función de la frecuencia de modulación. Esto permite discriminar la señal de fluorescencia creada por el haz de excitación de la fluorescencia residual causada por el haz de agotamiento.

[0166] El donut -o vórtice- se creó, en la primera versión de STED, utilizando una placa de fase. Esta implementación requiere el uso de dos caminos ópticos separados para los dos haces, el de excitación y el de agotamiento. Esta disposición óptica es compleja, depende en gran medida de cualquier deriva mecánica y crea alineaciones ópticas complejas. El sistema desarrollado requiere un alto nivel de conocimientos técnicos y su coste es considerable. Además, esta implementación es cromática, ya que la placa de fase adaptada a una longitud de onda no se adaptará a otra. Como el sistema óptico no es acromático, el uso de una STED con dos longitudes de onda de agotamiento requiere un sistema óptico aún más complejo.

[0167] Para simplificar la implementación de la STED, varios autores han propuesto soluciones que permiten realizar una STED en la que los dos haces, el de excitación y el de agotamiento, se propagan a lo largo del mismo camino óptico:

• Wildanger et al. propusieron un microscopio STED de trayectoria común, insensible a la deriva mecánica, basado en las propiedades de dispersión de diferentes materiales ópticos, [23],

• Bokhor et al [24] proponen el uso de un anillo cromático de separación de haces; sin embargo, esta solución bloquea parte de la luz de agotamiento,

• Hoeffman [25], propone el uso de un módulo que contiene los elementos ópticos prealineados que crean el vórtice, en la trayectoria óptica del láser de agotamiento, para simplificar la alineación,

• Menon et al; [26], propone lentes difractivas para crear ceros de amplitud sin singularidades de fase,

• Reuss et al [27] introdujeron un formador de haz colocado directamente delante de la lente del objetivo. Este dispositivo se basa en el uso de cristales birrefringentes, montados como una placa de ondas segmentada, que consta de cuatro segmentos. Eligiendo el parámetro de grosor de la placa, es posible realizar un elemento compuesto por una placa de fase para el agotamiento y una placa neutra para la excitación. Esta tecnología es comercializada bajo el nombre de EasyDONUT por la empresa Abberior [28].

[0168] Sin embargo, las soluciones propuestas anteriormente descritas son todas altamente cromáticas y están diseñadas para una única longitud de onda de excitación y agotamiento. Sin embargo, las aplicaciones biológicas requieren en muchos casos un sistema con dos o más longitudes de onda de excitación. De hecho, es una práctica habitual marcar diferentes elementos biológicos con etiquetas fluorescentes diferenciadas por su longitud de onda de excitación o emisión. Los sistemas de fluorescencia más avanzados pueden utilizar de cuatro a seis marcadores diferenciados. La presencia de un único canal de superresolución limita mucho el uso de los sistemas. Los sistemas STED de doble longitud de onda están disponibles en el mercado. Está claro que para un microscopio STED acromático el uso de la misma trayectoria óptica para dos haces de agotamiento a dos longitudes de onda diferentes simplificará la superresolución en diferentes fluoróforos.

[0169] En el arte previo, para todas las soluciones STED propuestas, los rayos láser iniciales tienen la forma de una distribución regular y en la mayoría de los casos una distribución gaussiana. Estos haces láser iniciales se transformarán posteriormente en un haz de excitación, una onda regular, y en un haz de agotamiento, una onda singular, mediante un sistema óptico adecuado descrito por los distintos inventores. Colocar estos haces aguas arriba cuando todavía están en forma de distribución gaussiana es relativamente sencillo. Localizar estos haces aguas abajo cuando se han transformado en una onda regular y singular es mucho más complejo. La colocación de estos haces ascendentes puede realizarse comercialmente mediante sistemas de bancos láser que utilizan técnicas basadas en la fibra óptica. Por lo tanto, es relativamente fácil, como se hace en todos los microscopios confocales, crear un conjunto de salidas de láser a diferentes longitudes de onda desde la misma fibra óptica y, por lo tanto, colocarlos de forma muy precisa.

[0170] La solución propuesta en las realizaciones de la presente invención permite basarse en esta co-ubicación aguas arriba, simplificando en gran medida el sistema y permitiendo la realización de una STED multi-longitud de onda, intrínsecamente. Para ello, es preferible utilizar un sistema óptico que combine las propiedades de trayectoria óptica común, acromaticidad y conformación del haz. Es preferible conseguir una conformación diferente del haz para los distintos haces, es decir, una onda regular para el haz de excitación y una onda singular para el haz de agotamiento, en cualquier longitud de onda del espectro visible o infrarrojo. La capacidad de realizar una conformación acromática del haz, que permite obtener una onda regular para una polarización y una onda singular para otra polarización, en todo el espectro de luz visible o infrarroja, es nueva. El módulo PSIT permite la realización de un sistema óptico de este tipo que combina las propiedades de trayectoria óptica común, acromaticidad y conformación del haz, ya que, hasta donde sabemos, no existe en la literatura ningún sistema de trayectoria común, acromaticidad y conformación del haz. Este sistema mejoraría sin duda la simplicidad de diseño y uso de STED.

Información previa y complementaria

[0171] Las realizaciones de la invención descrita permiten la integración y fusión de información adicional externa a la plataforma descrita, óptica o contextual, para lograr una mejora en la precisión de la información recogida de la muestra para cualquiera de los niveles de abstracción citados: el mapa, el nivel de abstracción geométrico, el nivel de abstracción biológico y el nivel de abstracción funcional.

[0172] De forma más general, la diversidad espectral, la información obtenida en múltiples longitudes de onda, la diversidad de polarización y la información obtenida mediante la proyección de diferentes estados de polarización, amplían la gama de información disponible.

[0173] El hecho de que la ausencia de energía, por ejemplo en el caso del vórtice cero, sea una información relevante, abre posibilidades adicionales para adquirir información sin "coste" de número de fotones. Esto es de gran importancia para la detección de fenómenos de fluorescencia débil, como la autofluorescencia.

[0174] Una de las modalidades descritas se denominará seguimiento oscuro.

[0175] Introducimos el concepto de información integral óptica, la información que podría ser recuperada a partir de mediciones de ondas ópticas o electromagnéticas, sobre un objetivo, por un observador, desde un punto de vista determinado. Esta información contiene muchos parámetros del objeto, relacionados con su posición, materiales, temperatura u orientación.

[0176] Sin embargo, la información integral óptica no contiene información sobre las regiones del objeto que no tienen un camino óptico hacia el observador, por ejemplo un elemento posicionado en una caja opaca, o información física que no tiene una transcripción óptica.

Medidas de superresolución y límites de difracción

[0177] Hace tiempo que se considera que la óptica limita intrínsecamente la resolución de cualquier sistema óptico, a través del límite de difracción. La aparición de las técnicas de superresolución -en diferentes campos y con diferentes nombres- ha demostrado que es posible superar este límite de difracción, por diferentes medios.

[0178] Las realizaciones descritas en la presente invención, como la detección de la presencia de dos puntos de igual intensidad, mediante la proyección de un vórtice en el centro de gravedad de la distribución de luz creada por la onda fundamental, no están limitadas en cuanto a la resolución a priori y podrían, idealmente -con un número infinito de fotones-, obtener cualquier resolución, como se describirá más adelante para un caso concreto.

Acrónimos

[0179] Utilizaremos el acrónimo, SRCD, "Super Resolution using Conical Diffraction" en esta solicitud de patente para nombrar la plataforma, los módulos y los sistemas específicos para la implementación de esta invención.

[0180] En esta solicitud de patente, utilizaremos el acrónimo, PSIT, "Projected Sequence(s) of Intensifies with various Topologies" (Secuencia(s) Proyectada(s) de Intensidades con varias Topologías); el método PSIT también puede ser utilizado para proyectar secuencias de intensidades de luz topológicamente diferentes, en dos o más longitudes de onda, secuencialmente o simultáneamente.

[0181] En esta solicitud de patente utilizaremos el acrónimo, PDOS, para "Position Dependent Optical Semaphore".

[0182] La Plataforma de Super Resolución mediante Difracción Cónica (SRCDP) es una plataforma de microscopía que utiliza módulos ópticos basados en la difracción cónica.

[0183] En esta solicitud de patente, utilizaremos el acrónimo, LatSRCS, para nombrar el módulo óptico que implementa el método PSIT de la presente invención.

[0184] En esta solicitud de patente utilizaremos el acrónimo, LongSRCS, para nombrar el módulo óptico que implementa el método PDOS.

[0185] La plataforma SRCDP, descrita en detalle más adelante, consiste principalmente en dos módulos de hardware, dos módulos ópticos nuevos y complementarios, LatSRCS y LongSRCS, montados en un microscopio, y un módulo algorítmico, SRCDA, para reconstruir la información superresuelta de la muestra. Además, la plataforma SRCDP incluye un módulo de detección mejorado, un módulo de control del sistema y soporte de software y hardware.

[0186] Además, existen diversas variantes de los métodos PSIT y PDOS, la plataforma SRCD, los módulos ópticos LatSRCS y LongSRCS y el algoritmo SRCDA.

[0187] La funcionalidad del microscopio confocal es limitar, en las tres dimensiones espaciales, la región observada de la muestra a un volumen del menor tamaño posible, el volumen de análisis.

[0188] Como corolario, en un microscopio de fluorescencia confocal, la información adquirida es un único valor de intensidad para todo el volumen de análisis, concebido como una entidad única. Más claramente, la información detallada sobre la posición de los nanoemisores dentro del volumen de análisis no es accesible, a priori, en un microscopio confocal. En general, se aceptaba que no se podía crear ninguna información óptica adicional que permitiera una mayor discriminación dentro del volumen iluminado.

[0189] Se hace referencia ahora a la Figura 4d, que es una representación conceptual simplificada del paradigma de medición según al menos una realización de la invención. El paradigma de medición es mucho más ambicioso que el del microscopio de fluorescencia confocal, representado esquemáticamente en la Figura 4a .

[0190] En la Figura 4d, se crea un volumen de análisis, 60, en el plano focal del objetivo del microscopio, 22; contiene un objeto disperso, 51, que consiste en varios nanoemisores, 53-59; la salida del sistema es un objeto disperso reconstruido, 63, y una lista de los nanoemisores y una lista de sus atributos, 64. Sin embargo, el uso de un objeto parsimonioso en la figura 4d es a efectos ilustrativos y esta figura podría haber representado perfectamente un objeto continuo, mutatis mutandis.

[0191] Se hace referencia ahora a la Figura 4e, que es una representación conceptual simplificada de otro paradigma de medición según al menos una realización de la invención. En la figura 4e, se crea un volumen de análisis, 60, en el plano focal del objetivo del microscopio, que contiene un objeto disperso, 51, que comprende una pluralidad de nanoemisores, 53-59; una o más ondas de agotamiento, 2000, reducen por un efecto de agotamiento el volumen de análisis a un volumen más pequeño representado por 2001. En este esquema, sólo uno de los nanoemisores transmite, lo que permite obtener una imagen completa del objeto.

[0192] El proceso óptico compuesto comprende la realización de una serie de procesos de medición óptica, controlados por el módulo de control del sistema, variando las secuencias de iluminación y/o las funcionalidades del canal y/o la posición de la secuencia de iluminación según los datos medidos o la información externa. A continuación se detallará un ejemplo de proceso óptico compuesto según una realización de la invención.

Método de medición del PSIT

[0193] Un método de medición PSIT según una realización no reivindicada de la invención una secuencia de distribuciones de luz de diferentes topologías se proyecta sobre el volumen de análisis.

[0194] El método de medición PSIT realiza las siguientes funciones:

° Proyección de una secuencia, la secuencia de emisión, de distribuciones luminosas compactas de diferentes familias topológicas sobre una muestra; y

o Para cada distribución de luz compacta :

• Emisión de luz de los nanoemisores en la muestra,

• Creación de una imagen óptica utilizando la óptica del microscopio,

• Adquisición de la imagen óptica mediante un detector fotoeléctrico y creación de una imagen digital.

[0195] Más detalladamente, cabe señalar que :

La secuencia de emisión está formada por al menos dos distribuciones de luz puntuales de diferentes familias topológicas

La secuencia de emisión se proyecta sobre una muestra biológica etiquetada con nanoemisores, La emisión de luz emergente de cada nanoemisor depende, para cada nanoemisor, de la intensidad, en el caso incoherente, o del campo electromagnético en el caso coherente, que incide en la posición espacial y tridimensional del nanoemisor emisor de luz, dicha propiedad de muestreo del nanoemisor emisor de luz comentada anteriormente.

[0196] Para cada distribución de luz de la secuencia de emisión proyectada sobre la muestra, se crea una imagen óptica. El conjunto de imágenes correspondientes al conjunto de distribuciones de luz de la secuencia de emisión se denomina secuencia de imágenes.

[0197] El método PSIT según esta realización adquiere esencialmente información lateral, es decir, la posición lateral de cada uno de los nanoemisores.

[0198] En una realización, el método PSIT se implementa proyectando distribuciones de luz de diferentes topologías creadas por difracción de cono y modificadas variando los estados de polarización de entrada y salida.

[0199] En una realización, el método PSIT también puede utilizarse para proyectar secuencias de intensidades de luz topológicamente diferentes en dos o más longitudes de onda de forma secuencial o simultánea.

Método PDOS

[0200] Un método PDOS según una realización no reivindicada de la invención comprende la distribución de la luz reemitida por los nanoemisores o por el objeto continuo entre al menos dos detectores mediante un "semáforo óptico".

[0201] Idealmente, la función del semáforo óptico es separar diferentes regiones del volumen de análisis en diferentes detectores. En la práctica, el semáforo óptico crea, para cada detector, una función de transferencia de la luz emitida por un nanoemisor de luz, dependiendo de la posición en el espacio del nanoemisor de luz y diferente para los diferentes detectores.

[0202] En una realización, el método PDOS se implementa para separar la luz colimada que emerge de los nanoemisores situados en el plano focal de la lente de la luz no colimada que emerge de los nanoemisores situados por debajo o más allá del plano focal en diferentes detectores.

[0203] El método PDOS permite la adquisición de información esencialmente longitudinal, es decir, la posición longitudinal de cada uno de los nanoemisores.

[0204] Matemáticamente, el método según las realizaciones de la invención realiza una función de transferencia que transforma la distribución espacial en el espacio de los nanoemisores en la información bruta que consiste en un conjunto de imágenes. El algoritmo realiza la operación inversa: reconstruye la distribución espacial de los nanoemisores a partir del conjunto de imágenes que componen la información bruta.

Información en las realizaciones de la invención

[0205] El resultado intermedio, la información bruta, se obtiene al final de la etapa de detección. La información bruta consiste en un conjunto de imágenes Aop(m,n), que representan para la distribución de luz o, la imagen del canal de detección p.

[0206] Como en un microscopio confocal, el proceso de medición analiza un pequeño volumen en un objeto mucho más grande. Por lo tanto, necesitará módulos adicionales, similares a los de un microscopio confocal, que incluyan un proceso de escaneo, un módulo de software para la integración, el análisis y la visualización de datos puntuales en superficies y/u objetos tridimensionales.

[0207] En términos matemáticos, el algoritmo resuelve un problema inverso o de estimación de parámetros. Las ecuaciones del modelo son conocidas y se tiene un modelo a priori, paramétrico o no, sobre la configuración de los nanoemisores. El modelo más natural es suponer un número bajo de nanoemisores (objeto disperso), pero también se pueden utilizar modelos continuos, asumiendo la presencia de estructuras unidimensionales (líneas, curvas) o patrones específicos. Todos los procedimientos matemáticos conocidos por el experto pueden utilizarse entonces con moderación para resolver problemas inversos o estimar parámetros. Más adelante se describirá un ejemplo de un algoritmo específicamente adaptado a la medición según una realización de la invención.

[0208] Además, presentamos, por su valor emblemático, una nueva solución del problema de la discriminación de dos puntos situados a corta distancia el uno del otro. Este problema, estudiado por Lord Rayleigh, es la base del criterio de resolución en muchos campos de la Óptica.

[0209] Las características de las realizaciones de la invención se han descrito de manera bastante amplia para que la descripción detallada de la invención pueda entenderse mejor, y para que la presente contribución a la técnica pueda apreciarse mejor. A continuación se describirán muchas otras características de la invención.

[0210] Una realización de la invención es una plataforma de hardware y algoritmos, denominada plataforma SRCDP, 500, mostrada en la Figura 5.

[0211] La plataforma SRCDP, 500, implementa el método según una realización de la invención, combinando los dos métodos PSIT y PDOS descritos anteriormente.

[0212] En una realización, la plataforma SRCDP observa, Figura 5, una muestra biológica, 11 que incorpora una matriz de nanoemisores. El resultado de la observación de la muestra biológica por la plataforma SRCDP es la adquisición de información de superresolución, representativa de la muestra observada.

[0213] La plataforma SRCDP, 500, Figura 5, comprende principalmente :

En su parte hardware :

• Un microscopio confocal200, adaptado u optimizado, similar al microscopio confocal, descrito anteriormente, y que comprende todos los componentes pertinentes, como se ha descrito anteriormente

• Dos módulos ópticos nuevos y complementarios, montados en un microscopio estándar. Los dos nuevos módulos ópticos son el LatSRCS, 700, y el LongSRCS, 800, descritos en detalle más adelante con referencia a las figuras 6 y 8, respectivamente. El módulo óptico LatSRCS 700 implementa los pasos de iluminación necesarios para implementar el método PSIT según una realización de la invención. El módulo óptico LongSRCS, 800, implementa los pasos de distribución de la intensidad de luz emergente en una pluralidad de imágenes del método PDOS según una realización de la invención y,

• el módulo algorítmico SRCDA, 600, capaz de reconstruir la información de superresolución de la muestra biológica a partir de las imágenes creadas por la plataforma SRCDP.

• Otros elementos auxiliares, como el ordenador 66 y el software 67, necesarios para la realización de la plataforma,

Módulo óptico LatSRCS que aplica el método PSIT

[0214] Refiriéndose a la Figura 6a, se describe un módulo óptico según una realización no reivindicada de la invención, LatSRCS, 700, y su función específica en microscopía.

[0215] El módulo óptico, LatSRCS, 700 según esta realización, es un módulo óptico que proyecta sobre una pluralidad de nanoemisores de una muestra, una secuencia de distribuciones de luz compactas de diferente topología. Cada nanoemisor emite una fluorescencia con una secuencia de intensidades de luz fluorescente que depende de la intensidad que incide sobre el nanoemisor y que caracteriza la posición lateral del nanoemisor. En la mayoría de las realizaciones, se crean distribuciones de luz compactas de diferentes topologías por la interferencia, con amplitudes y fases variables entre una onda regular y una onda singular. En la realización preferida, las ondas regulares y singulares son creadas por un fino cristal cónico.

[0216] El módulo óptico LatSRCS, 700, se posiciona en la trayectoria de iluminación del microscopio confocal 200; proyecta una secuencia de distribuciones de luz compacta de diferentes topologías sobre la muestra 11 utilizando el objetivo del microscopio confocal 200. En una realización que utiliza la difracción de cono, la intensidad incidente en una posición específica de la muestra 11 será proporcional, para cada distribución de luz, a una combinación específica de parámetros de Stokes.

[0217] El módulo óptico LatSRCS, 700, utiliza una funcionalidad inherente, descrita anteriormente, específica del nanoemisor, que muestrea la intensidad de la luz incidente en su posición precisa (del nanoemisor) y reemite luz fluorescente en función de la luz incidente. Sorprendentemente, la información medida está directamente relacionada con la posición del nanoemisor dentro de la distribución de luz compacta. Esta información queda fijada por la funcionalidad del nanoemisor, su propiedad de absorber y reemitir luz, que rompe la cadena óptica. Esta información es transportada por la luz fluorescente, en forma de una distribución de luz emergente, recuperable por un conjunto detector 65.

[0218] Si la luz incidente varía en el tiempo según una secuencia de distribuciones de luz compacta de diferentes topologías, la intensidad de la luz fluorescente reemitida variará en la misma proporción. La secuencia de luz fluorescente reemitida será proporcional a la secuencia de distribuciones de luz compacta de diferentes topologías. A partir de esta información, es posible recuperar la posición del nanoemisor, como se explica a continuación.

[0219] El método PSIT según las realizaciones de la invención se refiere a la proyección de una secuencia de distribuciones de luz compactas de diferentes topologías en un microscopio, la interacción con el objeto disperso o el objeto continuo, la recogida de la luz reemitida por el objetivo del microscopio, 22, la detección de la luz, fluorescente o no, por el conjunto detector mejorado, 65, y el análisis de la información por un algoritmo apropiado. En algunas realizaciones, el conjunto detector mejorado, 65, consiste en un solo detector, y recupera sólo la intensidad global en función del tiempo, mientras que en otras realizaciones, el conjunto detector mejorado consiste en una pequeña área de píxeles y también recupera la distribución espacial de la luz fluorescente. El conjunto de información recuperado, formado por una pluralidad de imágenes, se denomina imágenes laterales de superresolución.

[0220] En una realización, la contribución de un nanoemisor posicionado en el volumen iluminado a una imagen lateral de superresolución específica es proporcional a una combinación de los parámetros de Stokes de la luz incidente en la posición del nanoemisor.

[0221] En las imágenes laterales de super-resolución, la información creada por las distribuciones de luz compactas de diferentes topologías es nueva, y no estaba presente en el arte previo. Esta nueva información permite afinar la posición de los nanoemisores o la distribución espacial del objeto continuo, cuantificar el número de nanoemisores presentes en el volumen iluminado y diferenciar entre varios nanoemisores presentes en el mismo volumen.

[0222] Se hace referencia ahora a la Figura 6a, que es una ilustración esquemática simplificada de un módulo óptico LatSRCS, 700, según una realización de la presente invención.

[0223] La figura 6a muestra un módulo óptico, LatSRCS, 700, que incluye todos los componentes del módulo de difracción de conos, figura 3, que se implementan de la misma manera que en el módulo de difracción de conos 300. Se supone que la óptica de la fuente de luz del microscopio confocal de barrido es acromática e infinitamente conjugada, aunque se pueden acomodar otras condiciones utilizando ópticas auxiliares. La luz incidente, que entra desde la fuente de luz es paralela, 30. El módulo óptico 700 comprende una primera lente, 31, un cristal cónico acromático 32, o un subconjunto que realiza acromáticamente la funcionalidad de un cristal cónico como se ha explicado anteriormente, y una segunda lente 33; también puede añadirse un polarizador parcial, 29, descrito anteriormente. Las dos primeras lentes, 31 y 33, se configuran preferentemente como un telescopio Kepler 1:1; el plano cónico de formación de imágenes, 35, se sitúa en el plano focal común de las lentes 31 y 33. La apertura numérica de la primera lente, 31, determina los parámetros del efecto de difracción cónica a través del haz cónico normalizado, definido a continuación. La segunda lente, 33, restablece el paralelismo de la luz, para inyectarla en el microscopio. Comprende además un submódulo de control de polarización, 71, que comprende, por ejemplo, una placa giratoria de cuarto de onda, un par de válvulas de luz de cristal líquido o una célula Pockels, 72, y un analizador 73. La información del parámetro de Stokes puede transformarse en información secuencial a través de una secuencia de distribuciones de luz espacialmente diferenciadas que lleven información secuencial como se ha descrito anteriormente.

[0224] Refiriéndose a la Figura 7a, esta figura muestra las distribuciones de luz, creadas a través de un cristal cónico con un parámetro cónico normalizado po de 0,388, calculado por una aproximación escalar, para diferentes estados de polarización de entrada y salida, incluyendo un polarizador circular o lineal o un polarizador radial o azimutal como entrada o salida. Estas distribuciones de luz se calcularon en un plano de imagen intermedio y no en el foco de la lente para separar la refracción del cono de los efectos vectoriales. Los estados de polarización -de entrada y de salida- se caracterizan por su ángulo para las polarizaciones lineales y por sus quiralidades para las polarizaciones circulares.

[0225] Refiriéndose a la Figura 7b, esta figura muestra las distribuciones de luz, creadas a través de un cristal cónico con un parámetro cónico normalizado po de 0,818, calculado por una aproximación escalar, para diferentes estados de polarización de entrada y salida, incluyendo un polarizador circular o lineal o un polarizador radial o azimutal como entrada o salida. Estas distribuciones de luz se calcularon con el software Diffract de MMresearch. Estas distribuciones de luz se calcularon en un plano de imagen intermedio y no en el foco de la lente para separar la refracción del cono de los efectos vectoriales. Los estados de polarización de entrada y salida se caracterizan por su ángulo para las polarizaciones lineales y por sus quiralidades para las polarizaciones circulares.

[0226] En estas tablas se presenta un gran número de funciones de transferencia diferentes, incluyendo casos con polarizadores circulares, lineales, azimutales o radiales como entradas o salidas. Además de los polarizadores circulares, lineales, azimutales o radiales descritos en las figuras, hay que añadir a esta descripción los casos de los polarizadores elípticos, dicroicos o parcialmente dicroicos, y los polarizadores espacialmente variables. Además, como se ilustra en las figuras 7a y 7b, estas funciones de transferencia varían mucho en función del parámetro normalizado del cono po. Además, la introducción de dos cristales cónicos, o un cristal cónico y un cristal uniaxial o biaxial (en el que la luz se propaga en una dirección de propagación diferente a la de la difracción cónica) en cascada permite un número aún mayor de funciones de transferencia, como se ilustra para dos cristales cónicos en la figura 7c.

[0227] En resumen, en esta solicitud de patente nos referiremos al conjunto de funciones de transferencia que pueden obtenerse utilizando un número pequeño (<6) de cristales en cascada, y elementos de polarización uniformes o espacialmente variables, como función de transferencia de difracción cónica

[0228] Observaremos principalmente las siguientes distribuciones de luz:

• La fundamental: Figura 7a00 y 7a-n, obtenida entre polarizadores circulares paralelos, que es una distribución cercana a la de Airy

• El vórtice: Figura 7a01 y 7a-i0 obtenidas entre polarizadores circulares y cruzados

• La distribución que hemos denominado "luna creciente" o distribución de Stokes, con las subfiguras 7a0.2-5, 7a-i.2-5, 7a2-5.0 y 7a2-5.1, y la figura 7c que describe la variación axial de las distribuciones "luna creciente" o Stokes. Estas distribuciones se obtienen entre un polarizador circular y un polarizador lineal de ángulo variable; esta distribución es antisimétrica y el eje gira con el eje del polarizador lineal,

• La distribución que hemos llamado de "media luna", las subfiguras 7a42, 7a35, 7a24 y 7a53 se obtienen entre dos polarizadores cruzados; esta distribución es simétrica.

• La distribución que hemos llamado de "media luna desplazada", Figura 7d, que representa la distribución de "media luna desplazada" en diferentes posiciones axiales, se obtiene entre dos polarizadores elípticos para ciertos valores de elipticidad.

• Las distribuciones de luz más complejas, Figura 7b, para un cristal con un parámetro de cono normalizado, p0 superior a 0,5

• La realización de distribuciones de luz adicionales utilizando dos -o más- cristales cónicos en cascada, (no mostrados) con o sin elementos de polarización estática o dinámica entre los cristales

[0229] La realización de las diferentes distribuciones de luz se consigue cambiando la polarización de entrada o de salida. Las diferentes distribuciones de luz siguen la misma trayectoria óptica y el sistema óptico que crea estas distribuciones es un sistema óptico de trayectoria común, como se ha definido anteriormente. Hay una serie de elementos de polarización con diferente polarización en diferentes longitudes de onda. Utilizando uno de estos elementos, se pueden crear dos ondas compactas, regulares o singulares en dos longitudes de onda o una onda regular en una longitud de onda y una singular en otra. Este dispositivo permite una aplicación mucho más sencilla de los conceptos de emisión-desaparición limitados en algunos casos por las tolerancias o por las vibraciones del sistema óptico.

Redundancia y variaciones aleatorias de fase

[0230] Las distribuciones elementales de luz descritas en la Figura 7 pueden obtenerse de muchas maneras diferentes. Además, algunas de ellas pueden obtenerse como combinación lineal de otras distribuciones luminosas elementales; por ejemplo, el vórtice puede obtenerse mediante cualquier suma de dos distribuciones luminosas ortogonales de "media luna".

[0231] Esta redundancia permite promediar algunos de los errores aleatorios de fase que están inexorablemente presentes en muchos procesos de medición de objetos biológicos.

[0232] También se pueden obtener nuevas distribuciones de luz como combinaciones matemáticas de distribuciones de luz elementales. La distribución luminosa del "pseudovórtice", calculada a partir de combinaciones aritméticas de las cuatro distribuciones de la "luna creciente", tiene la particularidad de tener una curvatura muy fuerte en el origen.

[0233] El método PSIT fue originalmente diseñado para permitir la super-resolución lateral; sin embargo, el método PSIT también puede ser utilizado para obtener la posición longitudinal de un nanoemisor. En efecto, algunas distribuciones luminosas elementales son relativamente insensibles -dentro de unos límites razonables- a una variación de la posición longitudinal del nanoemisor, mientras que otras son muy sensibles. Una secuencia de distribuciones luminosas compactas, algunas de ellas independientes y otras dependientes de la posición longitudinal, permitiría trazar la posición longitudinal de los nanoemisores.

[0234] Además, para las distribuciones de luz que dependen en gran medida de la posición longitudinal del nanoemisor, se puede proyectar sobre la muestra una serie de distribuciones de luz elementales ligeramente desplazadas longitudinalmente entre sí, lo que permite obtener un conjunto de imágenes que contienen información longitudinal.

[0235] Además, existen algunas distribuciones de luz elementales más complejas, que consisten en superposiciones de ondas más complejas, con una fuerte dependencia longitudinal; por ejemplo, las "manchas oscuras tridimensionales" descritas por Zhang, [29] crean una mancha negra rodeada en tres dimensiones por una esfera luminosa. Estos "puntos oscuros tridimensionales" consisten en una superposición de funciones de Laguerre-Gauss, que pueden realizarse dentro de una cavidad láser o con la ayuda de un holograma o una placa de fase, como sugiere Zhang, o con la ayuda de cristales cónicos o uniaxiales, como sugiere el inventor.

[0236] La difracción de cono se puede utilizar para cambiar y dar forma a la PSF de manera que tenga variaciones laterales y axiales. Tras el cristal, el haz incidente se transforma en dos haces de Bessel: una parte B⁰ (modo fundamental) y una parte B¹ (modo vórtice). Todos los haces incidentes homogéneamente polarizados pueden descomponerse en la base ortogonal de la polarización circular derecha e izquierda. El haz saliente es la suma de las contribuciones de las dos componentes, una que da lugar a una parte B⁰ y la otra a una parte B¹. Se pueden conseguir diferentes combinaciones de B⁰ y B¹ eligiendo las polarizaciones de entrada y salida, lo que da lugar a PSF de diferentes formas. En particular, nos interesa el caso en el que las polarizaciones de entrada y salida son elípticas con la orientación de los ejes mayores de cada elipse con un ángulo de 90° entre ellas. Entre las distribuciones generadas bajo estas condiciones, algunas muestran una variación significativa a lo largo del eje Z, y estas variaciones pueden ser explotadas para medir la posición de un emisor con alta precisión axial. Separamos estas distribuciones en dos grupos, los que tienen un solo lóbulo y los que tienen dos lóbulos. Las distribuciones de un solo lóbulo tienen un efecto de rotación a lo largo del eje Z. Así, las distribuciones de Stokes, realizadas a partir de la polarización lineal (elipticidad =0°) y de la polarización circular (elipticidad = 45°) presentan variaciones que aparecen en la tabla siguiente. Utilizando un algoritmo adecuado, se puede detectar la orientación de la distribución y deducir la posición del emisor con gran precisión axial. (Figura 7d). Las distribuciones con dos lóbulos muestran un efecto de desplazamiento del eje Z de los dos lóbulos. Así, las llamadas distribuciones de medias lunas desplazadas, realizadas a partir de dos polarizaciones elípticas orientadas a 90° pero con la misma elipticidad, presentan variaciones que aparecen en la tabla siguiente. Utilizando un algoritmo adecuado, la posición del transmisor puede deducirse con gran precisión axial. (Figura 7d)

[0237] Todas estas variantes se consideran parte de la invención. Sin embargo, en algunas implementaciones, el inventor ha optado por separar las mediciones laterales de las longitudinales en dos módulos ópticos disjuntos pero complementarios para reducir la complejidad de cada uno de los módulos complementarios.

Efectos vectoriales

[0238] La teoría desarrollada hasta ahora describe la distribución de la luz en el plano de la imagen del microscopio, 35 La distribución de la luz proyectada sobre la muestra es, según la teoría de la imagen geométrica, una imagen reducida de la distribución de la luz en el plano de la imagen.

[0239] Sin embargo, como se describe ampliamente en la literatura, para una lente con una alta apertura numérica, la teoría geométrica de la imagen no es exacta y hay que tener en cuenta los efectos vectoriales. Estos efectos consisten esencialmente en la presencia de una componente polarizada longitudinalmente.

[0240] Refiriéndose de nuevo a la Figura 6a, para mitigar los efectos vectoriales, puede ser ventajoso mantener el analizador final fijo y añadir un elemento adicional fijo o variable, el submódulo de adaptación del sesgo de salida, 74, para controlar el sesgo de salida. Hemos comprobado que la polarización de salida con simetría circular reduce significativamente los efectos vectoriales. Esta polarización puede ser circular, radial o azimutal. Para la polarización circular, el submódulo de adaptación de polarización de salida 74 es simplemente una placa de retardo de cuatro ondas. En este caso, los elementos de polarización longitudinal tienen simetría de vórtice y se mezclan suavemente en el sistema con sólo un pequeño cambio en la forma de los parámetros de Stokes, incluso para objetivos de microscopio con una apertura numérica muy alta.

[0241] Alternativamente, el submódulo de adaptación de polarización de salida, 74, puede ser variable y adaptarse a la topología y simetría de cada una de las distribuciones de luz compactas.

[0242] Se recuerda que un prisma de Wollaston puede utilizarse para dividir un haz incidente en dos haces emergentes separados por un ángulo. Utilizando varios prismas en cascada, es posible separar un haz incidente en un gran número de haces emergentes. El mismo efecto se puede conseguir modificando el prisma de Wollaston, para crear el prisma de Wollaston compuesto, añadiendo piezas de cristal uniaxial de índice y orientación de birrefringencia elegidos. De este modo, se puede construir un prisma a partir de un único bloque de cristal uniaxial que puede separar un haz incidente en 2n haces emergentes (por ejemplo, ocho o dieciséis) que están contenidos en un plano, y separados por ángulos iguales. Una vez enfocada la muestra, se obtiene 2n puntos alineados e igualmente separados. Si el rayo incidente ha pasado por un módulo LatSRC estos 2n los puntos no son 2n Si el rayo incidente ha pasado por un módulo LatSRC estos puntos no son puntos Airy, sino distribuciones creadas por el módulo y son todos idénticos. La ventaja de utilizar este divisor de rayos es que escanea la muestra más rápidamente ya que tenemos 2n puntos de luz en lugar de uno.

Método PDOS y mediciones latérales

[0243] El método PDOS fue originalmente diseñado para proporcionar una super-resolución longitudinal; sin embargo, el método PDOS también puede ser utilizado para obtener la posición lateral de un nanoemisor. De hecho, las distribuciones de luz elementales también son sensibles a una variación en la posición lateral del nanoemisor. En el caso de una muestra plana, en la que la proyección de luz no es factible, el método PDOS puede sustituir al método PSIT para realizar mediciones superresueltas.

[0244] Todas estas variantes se consideran parte de la invención. Sin embargo, en una realización el inventor ha optado por separar las mediciones laterales de las longitudinales en dos módulos ópticos disjuntos pero complementarios para reducir la complejidad de cada uno de los módulos complementarios.

Módulo de detección

[0245] En la microscopía confocal de barrido el detector es un detector de elemento único como un PMT o SPAD. El tiempo de adquisición del detector viene determinado por el mecanismo de barrido.

[0246] Un módulo de detección mejorado, 65, puede ser implementado usando detectores pequeños con un bajo número de píxeles. Un módulo de este tipo no habría sido viable hace diez o veinte años, debido a la falta de tecnología adecuada. En la actualidad, existen detectores pequeños, de bajo número de píxeles y alta velocidad, con características de bajo ruido, basados en varias tecnologías. Las matrices SPAD con un bajo número de píxeles, como 32 x 32se han demostrado recientemente con velocidades de adquisición de hasta 1 MHz. El módulo detector mejorado, 65, también puede implementarse utilizando sensores CCD, EMCCD o CMOS. Existen sensores CCD, CMOS o EMCCD con un bajo número de píxeles o se pueden diseñar específicamente. Además, los detectores CCD, CMOS EMCCD se pueden utilizar utilizando las características de región de interés, subpunto o binning, modos de recorte o cinética rápida, disponibles para algunos detectores.

[0247] La información espacio-temporal a la que se hace referencia aquí es la posición y el tiempo de impacto de cada fotón fluorescente. En los sistemas reales, la información espacio-temporal se ve corrompida por el ruido del detector, que crea fotones erróneos, y por la ineficacia de la detección, que crea fotones que no se detectan, lo que reduce el rendimiento. En las matrices SPAD, para cada fotón se recibe el píxel que lo ha detectado y el momento del impacto, es decir, se dispone de la información espacio-temporal completa. En el caso de los detectores CCD, CMOS o EMCCD, es necesaria la adquisición de varios fotogramas para aproximar la información espacio-temporal.

[0248] En muchas implementaciones nos referiremos a detectores separados; en muchos casos los detectores pueden estar físicamente separados o consistir en diferentes zonas en el mismo detector, o una combinación de ambos.

A lgoritm os ADRIS

[0249] El algoritmo de reconstrucción que hemos detallado se aplica no sólo al caso de un campo determinado analizado mediante los métodos PSIT y PDOS, sino también al caso de un campo más grande analizado mediante escaneo. En el caso de una exploración, el modelo directo se ve enriquecido por el hecho de que un solapamiento entre las diferentes posiciones de las señales proyectadas permite tener en cuenta más mediciones en un punto determinado. Sin embargo, la inclusión de señales proyectadas desplazadas no aporta ninguna complejidad adicional, ya que estas señales desplazadas simplemente se añaden a la lista de señales proyectadas.

Sistema multiimagen que incluye el algoritmo de reconstrucción E-LES

[0250] Nos referiremos al conjunto de sistemas ópticos y optoelectrónicos bajo la denominación de sistema multiimagen, en el que un conjunto de imágenes diferentes y diferenciadas, procedentes de una misma región espacial bidimensional o tridimensional del objeto, son registradas y analizadas mediante un algoritmo adecuado para analizar la distribución espacial - y/o espectral - de la región espacial emisora. Esta diferenciación puede deberse a la proyección de una iluminación espacialmente diferente, como se ha descrito anteriormente; también puede deberse a una variación del contenido espectral de la iluminación; también puede deberse al movimiento natural o impuesto de los objetos exteriores. Por último, puede deberse a una variación estocástica del contenido de la región espacial del objeto, bidimensional o tridimensional, a través de un efecto estocástico natural o impuesto, como los sistemas utilizados en la superresolución basados en la detección estocástica, incluidos los procesos PALM y STORM y sus innumerables variantes, cada una de las cuales lleva un acrónimo diferente.

[0251] Otros medios para diferenciar las imágenes de la misma región espacial de transmisión son conocidos en la técnica y se consideran parte de esta invención.

[0252] Nos referiremos a un sistema multi-imagen que incluye el algoritmo de reconstrucción E-LSE como un sistema multi-imagen que utiliza el algoritmo E-LSE descrito a continuación

Algoritm o de reconstrucción E-LES

[0253] El algoritmo propuesto permite, a partir de las imágenes grabadas por la(s) cámara(s) tras la excitación de la muestra por el conjunto de iluminaciones seleccionadas, reconstruir una imagen bidimensional o tridimensional de alta resolución de la muestra. Este algoritmo se basa en la combinación de varios principios: 123

1) la formulación de la reconstrucción como un problema bayesiano inverso que conduce a la definición de una distribución a posteriori. Esta distribución a posteriori combina, gracias a la ley de Bayes, la formulación probabilística del modelo de ruido (ruido de Poisson inherente a la naturaleza cuántica de la emisión de fotones, eventualmente superpuesto por la modelización de otras fuentes de ruido, especialmente el ruido de lectura de la cámara), así como posibles aprioris (positividad, regularidad, etc.) sobre la distribución de la luz en la muestra;

2) la estimación de la distribución de la luz en la muestra mediante la media (expectativa matemática) de la distribución a posteriori. Este enfoque, previsto por Besag en 1984 [30], se ha implementado recientemente de forma numérica en el caso del de-noising de imágenes con un apriori de tipo variación total [31,32]; 3) el uso de grupos de emisores puntuales, que favorece las soluciones parsimoniosas (muestras con un número limitado de emisores, o en las que los emisores se concentran en pequeñas estructuras como curvas, o superficies en el caso tridimensional;

4) estimación a posteriori de la media mediante un algoritmo de cadena de Markov Monte Cario (MCMC) [33,34], como en las referencias [31,32] mencionadas anteriormente.

[0254] Según una realización del algoritmo, el principio 3 no se utiliza y la distribución a posteriori se promedia sobre todas las imágenes posibles como en [31,32].

[0255] El algoritmo utiliza como entrada las mediciones realizadas en la muestra, pero también datos inherentes al sistema que se obtienen después de una etapa denominada de calibración. En este paso, se realizan mediciones en una muestra de referencia para medir con precisión las funciones de iluminación y dispersión de puntos del sistema óptico.

[0256] En la realización estándar, donde sólo se modela el ruido de Poisson, la densidad de la distribución de probabilidad a posteriori se escribe como

p(x,A) = íe~E(x,A)

donde Z es una constante de normalización que no interviene en el algoritmo, y

log (B £ k Akut(xk,y ) )}

[0257] La nube de emisores está representada aquí por el vector x = (xi ,X² ,...,Xn) (n posiciones discretas en el dominio de la imagen de alta resolución a reconstruir) y el vector A =(Ai > ² ,... An) que codifica las intensidades de los emisores situados en los puntos xi ,X² ,... Xn . Cada cantidad del tipo ui (x,y) se determina durante la etapa de calibración: representa la intensidad emitida en el píxel y de la cámara por un emisor situado en el píxel x de la imagen de alta resolución, en respuesta a una iluminación de índice i (i codifica aquí tanto la posición de la señal de iluminación como su forma). El real positivo B corresponde a la intensidad del fondo continuo, que generalmente es el resultado tanto de la muestra (fluorescencia difusa, por ejemplo) como del sensor. Por último, las cantidades mi(y) corresponden simplemente a las mediciones (imágenes registradas por la cámara): mi(y) es la intensidad medida en el píxel y de la imagen del índice i, es decir, la imagen registrada tras la iluminación del índice i).

[0258] El algoritmo propuesto consiste en hacer que los emisores representados por los vectores x y A evolucionen de acuerdo con la ley dada por la densidad p (x,A). El algoritmo es iterativo: en cada iteración, uno de los emisores es perturbado (en posición o en intensidad) y esta perturbación es aceptada o no según el principio del algoritmo Metropolis-Hastings [3]. La imagen reconstruida se obtiene promediando, con igual peso para cada iteración, los emisores así construidos. Si x¡ y A¡ corresponden respectivamente a la posición e intensidad de los emisores en la iteración j del algoritmo, entonces la imagen I reconstruida tras N iteraciones viene dada por

I( ^v x) ^' = - £ . , , ¡ ^{N ¿- i j k \x lk= x k}

[0259] Este algoritmo puede mejorarse en varios aspectos: la introducción de una etapa de burn-in (las primeras iteraciones no se utilizan en la reconstrucción), la optimización de la inicialización de los transmisores, la optimización de las perturbaciones realizadas en cada iteración (ley de propuesta), el uso de una etapa de post-filtrado (por ejemplo, un ligero desenfoque gaussiano), etc.

[0260] Los resultados del algoritmo pueden ser transmitidos al usuario como una imagen o como datos numéricos o gráficos.

[0261] El mismo algoritmo de reconstrucción puede utilizarse en una segunda versión que incluya un conjunto de parámetros adicionales que describan los parámetros globales de la región espacial del objeto, conocidos a priori o determinados a posteriori.

[0262] Este algoritmo, en sus dos versiones, puede utilizarse en todos los sistemas de imágenes múltiples, en los que se registran y analizan un conjunto de imágenes diferentes y diferenciadas, procedentes de la misma región espacial bidimensional o tridimensional del objeto.

Algoritmo del proceso óptico compuesto

[0263] El proceso óptico compuesto según al menos una realización de la invención es un complemento lógico del algoritmo SRCDA. De hecho, la reconstrucción obtenida por el algoritmo SRCDA puede llevar a la conclusión de que una imagen adicional mejoraría el rendimiento de la medición. La plataforma de microscopía SRCDP permite la adquisición de una -o varias- imágenes complementarias elegidas entre un conjunto de distribuciones de luz de los métodos PSIT o PDOS.

[0264] Más adelante se explica un ejemplo.

Medición de la posición de un punto mediante el método PSIT

[0265] El método PSIT puede utilizarse como técnica para medir la posición de un nanotransmisor con gran precisión.

[0266] Consideremos un nanoemisor posicionado en x,y en coordenadas cartesianas y pe en coordenadas polares. Se proyecta sobre el nanoemisor una secuencia de iluminación compuesta por una onda fundamental y un par de distribuciones llamadas "medias lunas", alineadas a lo largo de ejes ortogonales.

[0267] El procedimiento de preprocesamiento crea dos imágenes:

Una imagen de "sombrero de copa" que consiste en la suma de las tres imágenes de la secuencia, Una imagen de vórtice formada por la suma de las dos imágenes de media luna.

[0268] Un primer descriptor es la posición cartesiana calculada mediante el algoritmo del centroide en la imagen del sombrero.

[0269] Refiriéndose a la figura 10, la posición radial p puede medirse unívocamente midiendo un parámetro, pa , igual a la tangente de arco normalizada por un factor n, de la relación de intensidad entre la intensidad normalizada emitida por el nanoemisor iluminado por la onda de vórtice, Iv, y la intensidad normalizada emitida por el nanoemisor iluminado por la onda fundamental, If. En efecto:

• La intensidad normalizada emitida por el nanoemisor iluminado por la onda fundamental varía de 1 en el centro para la onda fundamental a 0 en el radio de Airy,

• La intensidad normalizada emitida por el nanoemisor iluminado por la onda del vórtice varía de 0 en el centro a 1 en el máximo del vórtice para llegar a 0 para un valor ligeramente superior al radio de Airy. El arco tangente de la relación es una función monótona.

[0270] La posición azimutal puede medirse midiendo la relación de intensidad entre la intensidad total emitida por el nanoemisor iluminado por la primera distribución de media luna, Ih , y la intensidad total emitida por el nanoemisor iluminado por la segunda distribución de media luna, Ive. La relación entre estas dos intensidades es una ley geométrica de tangente cuadrada:

[0271] Las dos medidas son redundantes. Esta redundancia es una medida para calificar el objeto observado como un único punto y separar este caso de otros objetos potencialmente presentes en la muestra.

[0272] Una aplicación directa del uso del método PSIT según una realización de la invención para medir la posición de un nanoemisor con alta precisión es la integración de esta técnica de medición en una novedosa técnica de reconstrucción óptica local estocástica. Una de las limitaciones de la aplicabilidad de las técnicas estocásticas es el proceso de medición, que requiere un gran número de imágenes y, por tanto, un largo tiempo de medición y una alta fototoxicidad. El uso de la técnica PSIT según al menos una realización de la invención, que permite medir la posición de un emisor de luz, con una resolución muy superior a la del disco de Airy, a velocidades que pueden alcanzar los micro o nanosegundos, permite la extensión de las técnicas estocásticas a muchas aplicaciones nuevas.

[0273] Las imágenes resultantes del uso del método PSIT también pueden ser procesadas utilizando el método de Hough generalizado, permitiendo el reconocimiento de objetos estructurados, línea, círculo u otros, en una imagen.

[0274] La difracción cónica podría permitir la aplicación de toda una familia de técnicas de súper resolución o súper localización, la localización de una sola molécula. Ahora nos referimos a la figura 8 , que ilustra de forma esquemática una técnica original que hemos denominado "DarkTracking".

[0275] Refiriéndose a la figura 8, 80 representa la fase de inicialización, es decir, la detección del emisor utilizando un escáner confocal o cualquier otro método óptico conocido. 81 representa la fase de posicionamiento del haz de vórtices sobre el emisor; 82 representa el caso en el que el emisor se desplaza con respecto al centro del vórtice y es excitado por una fracción del haz creando una fluorescencia que puede ser detectada; 83 representa el reposicionamiento del emisor en el centro del haz de vórtices de forma que no se crea ni se detecta fluorescencia (posición registrada Xi,Yi) y 84 corresponde a un bucle de retroalimentación en el que un sistema de localización independiente reposiciona el elemento rastreado a una posición corregida.

[0276] Las distribuciones de luz utilizadas por esta técnica son vórtices generados por difracción de cono. Sin embargo, esta técnica puede utilizar otros vórtices u otras distribuciones generadas por difracción de conos. Suponemos que la molécula de interés ha sido marcada con uno o más fluoróforos que pueden ser excitados a A. La posición de la molécula se detecta primero mediante una imagen confocal convencional en A. A continuación, se ajusta la posición del escáner para estimular la muestra de manera que el centro del vórtice coincida exactamente con la posición del emisor. La señal de fluorescencia es detectada por una cámara de alta sensibilidad (por ejemplo, EMCCD o sCMOS), o por un PMT, lo que permite detectar la señal de baja amplitud del emisor debido a la alta eficiencia cuántica. El proceso de localización se basa en la ausencia de señal fluorescente cuando el emisor se encuentra exactamente en el centro del vórtice. El hecho de que el gradiente de intensidad sea grande cerca del centro del vórtice permite una localización precisa del emisor. Si el emisor se mueve ligeramente, la intensidad que absorbe ya no será cero, y emitirá una señal de fluorescencia cuya posición e intensidad se deducen de la imagen. A continuación, un bucle de retroalimentación vuelve a centrar el vórtice en el emisor y almacena la posición de éste. El bucle de retroalimentación puede funcionar a la velocidad de la cámara (hasta 1kHz) o del detector (varios MHz), lo que permite el seguimiento de una molécula en tiempo real y durante un periodo de tiempo considerable. Como siempre intentamos minimizar la señal emitida en fluorescencia minimizando la señal que excita el emisor, la localización puede realizarse durante un largo periodo de tiempo, ya que es menos probable que se produzca un blanqueo con dosis de luz tan pequeñas. La precisión de la localización depende en gran medida de la relación señal-ruido de la imagen, por lo que hay que tener en cuenta el ruido de fondo (ruido de la cámara y señal de autofluorescencia). Supongamos ahora que la muestra está marcada con dos fluoróforos diferentes que pueden ser excitados a dos longitudes de onda diferentes, Ai y A² . Propagamos juntos dos haces con diferentes topologías que dependen de su longitud de onda. La primera (Ai ) tiene una forma gaussiana clásica y proporciona una imagen confocal global de la muestra. El segundo (A² ) es un haz de vórtices utilizado para el DarkTracking. Mediante el control del espejo galvo que escanea la muestra, se puede realizar el seguimiento de la oscuridad cada vez que se escanea una línea de la imagen de la cámara, de modo que la posición del emisor se rastrea con una frecuencia mucho mayor que el número de fotogramas por segundo. Las principales ventajas de esta técnica, en comparación con otras técnicas de seguimiento de moléculas individuales, son el uso de un único sistema de escaneo y que la potencia enviada a las moléculas rastreadas es extremadamente baja. En la práctica, el uso, la alineación y la conformación de estos dos haces no es una tarea trivial cuando se utilizan técnicas convencionales de conformación de haces, como los hologramas generados por ordenador, los moduladores espaciales o las palas de ondas espirales, principalmente debido a su cromaticidad inherente. La difracción cónica puede utilizarse para simplificar el montaje. Utilizando una óptica adecuada, se puede adaptar un cristal para generar un vórtice en una longitud de onda, y un haz gaussiano en otra longitud de onda a lo largo de la misma trayectoria óptica. Esto permite utilizar una vía óptica sencilla a partir de una fibra que resuelve muchos problemas prácticos. La tecnología de seguimiento en la oscuridad puede utilizarse fácilmente para estudiar muchas cuestiones biológicas en las que las técnicas convencionales de seguimiento de la posición de una partícula se ven penalizadas por el blanqueo de la misma.

[0277] El seguimiento oscuro se ha descrito anteriormente para el uso de un vórtice. Sin embargo, muchas variantes, utilizando una o más distribuciones, por ejemplo pero no limitadas a las medias lunas o a los vectores de Stokes, es decir, cualquier distribución que tenga una intensidad nula y un gradiente - a ser posible lo más fuerte posible - en función de una de las dimensiones espaciales puede permitir la realización del Dark Tracking y se consideran parte de esta invención. La capacidad de la difracción cónica para crear muchas distribuciones de luz diferentes la convierte en una herramienta de elección para el seguimiento de la oscuridad.

Reconocimiento y medición de dos puntos: un nuevo criterio de resolución

[0278] Consideremos ahora dos nanoemisores de la misma intensidad colocados simétricamente alrededor del centro en las posiciones pQ y p, -0 en coordenadas polares. Utilizaremos el sistema descrito en los párrafos anteriores. Los tres descriptores darán los siguientes resultados:

• El centroide medirá el centro de gravedad de la distribución de la luz, que estará en el origen,

• El descriptor p, medirá el valor radial común de los dos nanoemisores,

• el descriptor 0, que en el caso de las medias lunas contiene una degeneración entre 0 y -0, medirá el valor 0.

[0279] Como ya se ha dicho, si el valor del descriptor p es distinto de cero, sabemos que el caso estudiado no es un punto sino dos o más. Además, los descriptores p y 0 permiten medir las características de dos puntos con una resolución mucho mayor que la definida por el criterio de Rayleigh. Además, utilizando un proceso compuesto, es posible separar este caso de la gran mayoría de los casos de 3 o más puntos. Se puede proyectar una distribución de luz adicional sobre la muestra, una media luna inclinada por un ángulo 0; la hipótesis de la presencia de dos puntos se confirmará o refutará según los resultados de esta imagen. En efecto, la energía medida sólo será cero para dos puntos, para una línea o para una serie de puntos alineados en la dirección del ángulo 0.

[0280] Esta medida no está limitada a priori. Por supuesto, primero existe un límite de resolución práctico, relacionado con la calidad de la señal, las fluctuaciones y diversas imperfecciones. Si no tenemos en cuenta los límites prácticos, el límite de resolución está relacionado con el número de fotones detectados.

Modalidades de STED

[0281] Se hace referencia ahora a la Figura 6b, que es una ilustración esquemática simplificada de un módulo óptico LatSRCS acromático o no acromático modificado 700. Este módulo difiere de la implementación previamente descrita de un módulo óptico LatSRCS, 700, mostrado en la Figura 6a , por la adición de varios elementos antes del módulo :

• láseres, 79a, 79b y 79c, opcionalmente a diferentes longitudes de onda,

• fibras ópticas, 78a, 78b y 78c, de los láseres 79a, 79b y 79c,

• opcionalmente, submódulos de control de polarización, 77a, 77b y 77c, para modificar estática o dinámicamente la polarización de los láseres, 79a, 79b y 79c, siendo los submódulos de control de polarización posicionables antes o después de la fibra; Sin embargo, en algunas realizaciones, por ejemplo utilizando fibras PM, los submódulos de control de polarización 77a, 77b y 77c pueden no ser necesarios y la polarización de la luz de la fibra se determina por la posición relativa del láser y la fibra,

• un combinador láser, 76a, que combina dos o más fuentes láser opcionalmente a través de fibras ópticas, 78a, 78b y 78c, en una fibra de salida común, 76b,

• un elemento óptico, 75, para transformar la luz de la fibra en luz colimada para ser utilizada por el resto del módulo LatSRCS, 700, de forma similar a la descrita anteriormente.

[0282] Muchas variaciones de esta disposición, conocidas en la técnica, pueden añadirse a este esquema y se reivindican en esta invención: por ejemplo, los dos elementos ópticos 31 y 75 pueden integrarse en un solo elemento, o incluso eliminarse si los parámetros de salida de la fibra común son adecuados. Del mismo modo, la fibra común, 76b, puede no ser necesaria para algunas implementaciones. Además,

[0283] La introducción, a través de una fibra óptica común, o directamente en la luz que se propaga en el espacio, de dos o más longitudes de onda que tienen polarizaciones diferentes, permite crear un método y/o un dispositivo adecuado para realizar las técnicas RESOLFT o STED en todas sus diferentes modalidades. En este método y/o dispositivo las ondas de excitación y de agotamiento se propagan a lo largo de una trayectoria común y el módulo LatSRCS, 700, puede ser totalmente acromático, o no en una versión simplificada, como se ha descrito anteriormente.

[0284] En la variante más simple de este método, las ondas de excitación y de agotamiento se propagan a lo largo de dos polarizaciones lineales ortogonales y una placa de cuarto de onda - opcionalmente acromática - se coloca a la entrada del sistema para transformar estas polarizaciones en polarizaciones circulares ortogonales para obtener, para una, una onda fundamental y para la otra un vórtice.

[0285] Ahora se hace referencia de nuevo a la Figura 6b. Los submódulos de control de polarización, 77a, 77b y 77c, pueden ser operados para crear, simultáneamente, secuencias idénticas o diferentes de distribuciones de luz para las vías de excitación y agotamiento. Además, la intensidad de los láseres puede ser modulada, creando una sincronización compleja de la intensidad de cada láser, la secuencia de distribución de la luz de excitación y la secuencia de distribución de la luz de agotamiento.

[0286] En la realización preferida, utilizando un microscopio confocal y un módulo LatSRCS original o modificado, acromático o no, se proyecta secuencialmente :

En primer lugar, se excita una distribución Airy o una fundamental simultáneamente con un vórtice de agotamiento. La imagen de emisión resultante se llamará imagen positiva,

En el segundo paso, un vórtice de excitación, simultáneamente con un vórtice de agotamiento. La imagen de emisión resultante se llamará imagen negativa.

[0287] En una variante del primer lugar, sólo se proyecta una distribución de Airy o una fundamental en excitación

[0288] La imagen de diferencia, que consiste en la sustracción ponderada de estas dos imágenes. Esta imagen diferencial, si se eligen los parámetros adecuados, tendrá un tamaño más fino -en términos de PSF- que una STED convencional, al tiempo que sólo requiere una intensidad de agotamiento relativamente baja. De hecho, el objetivo del agotamiento de vórtices ya no será reducir el tamaño de un punto de Airy, lo que requiere una gran energía, como en el STED clásico o el RESOLFT, sino reducir el exceso de energía presente en el vórtice de excitación en comparación con la distribución de Airy o la fundamental. Además, el agotamiento de la Airy o fundamental se acoplará a la sustracción de la imagen negativa, creada por el vórtice de excitación, lo que equivale a la sustracción matemática de las dos iluminaciones. La reducción del tamaño de la PSF resultante será la combinación de estos dos efectos.

[0289] Además, esta realización preferida puede, en algunos casos, obviar la necesidad de disparar la excitación como se requiere en Gated STED. En efecto, los fotones que llegan antes de que se aplique completamente el agotamiento pueden tenerse en cuenta mediante una elección adecuada de los parámetros, sin necesidad de un sistema complejo y restrictivo. Por último, también puede evitarse la necesidad de modular la STED, "ModSted", ya que los fotones de emisión emitidos por el vórtice de agotamiento no son esencialmente diferentes de los emitidos por el vórtice de excitación y también pueden compensarse. En una segunda realización, utilizando un microscopio confocal y un módulo LatSRCS original o modificado, se proyectan simultáneamente una secuencia de haces de excitación y una secuencia de haces de agotamiento, y las dos secuencias de haces pueden diferir en la polarización, creando distribuciones de luz de diferentes topologías. Este dispositivo permite producir una secuencia de distribuciones de luz de menor tamaño que las que se habrían obtenido sin el haz de agotamiento. En esta aplicación se utilizará el algoritmo SRCDA para determinar la distribución espacial o la posición de los emisores puntuales. En otra realización, utilizando un microscopio confocal y un módulo LatSRCS original o modificado, se proyectan simultáneamente un haz de excitación, en forma de Airy, y un haz de agotamiento, en forma de vórtice, siendo los dos haces diferentes en su polarización. Este dispositivo permite, sin elementos dinámicos, realizar un dispositivo STED totalmente acromático.

[0290] En otra realización no reclamada, utilizando un microscopio confocal, un módulo LatSRCS original o modificado y un módulo LongSRCS, se proyectan simultáneamente una secuencia de haces de excitación y una secuencia de haces de agotamiento, pudiendo las dos secuencias de haces diferir en su polarización, creando distribuciones de luz de diferentes topologías. El módulo LatSRCS permite una secuencia de distribuciones de luz de menor tamaño que la que se habría obtenido sin el haz de agotamiento. El módulo LongSRCS implementa el método PDOS de tal manera que separa la luz colimada, que emerge de los nanoemisores situados en el plano focal de la lente, de la luz no colimada que emerge de los nanoemisores situados por debajo o más allá del plano focal, en diferentes detectores. El método PDOS, en esta implementación, permite la adquisición de información esencialmente longitudinal, es decir, la posición longitudinal de cada uno de los nanoemisores, complementaria a la información lateral obtenida mediante el módulo LatSRCS original o modificado. En esta aplicación se utilizará el algoritmo SRCDA para determinar la distribución espacial o la posición de los emisores puntuales.

[0291] En otra realización no reivindicada que utiliza una de las implementaciones descritas anteriormente y que utiliza un cristal biaxial para crear la conformación del haz, se utiliza un elemento de polarización dinámica antes o después del cristal biaxial para corregir el movimiento dinámico de la pupila, que en algunos casos puede crearse durante el barrido óptico del microscopio confocal. Este efecto del movimiento de la pupila es en algunas implementaciones de los tecnólogos de STED una de las limitaciones de rendimiento, sin necesidad de un sistema de exploración adicional.

[35]

[0292] En otra realización no reivindicada que utiliza un microscopio confocal, se proyectan dos o más distribuciones de luz localizadas a diferentes longitudes de onda utilizando un módulo LatSRCS original o modificado. La primera distribución de la luz se utiliza para hacer que la escena sea dispersa, es decir, para aislar los emisores mediante un efecto físico, que diluye la densidad de los emisores capaces de emitir fluorescencia, con el fin de crear regiones en las que sea válida la hipótesis de la dispersidad, es decir, la presencia de un emisor aislado o de un número reducido de emisores. Los efectos físicos que logran esta dispersión serán los mismos o se derivarán de los efectos utilizados para crear la dispersión para las técnicas de microscopía de localización de un solo emisor. Estas técnicas incluyen, por ejemplo, PALM STORM, DSTORM, FPALM y otras. La segunda distribución de luz a una longitud de onda diferente creará una fluorescencia cuya intensidad será variable en el tiempo. Esta segunda distribución de luz utilizará una de las técnicas PSIT, ya sea una secuencia de distribuciones discretas o una secuencia de distribuciones continuas. En el caso de las distribuciones discretas, la luz será detectada por un detector matricial o por un solo detector. En el caso de la distribución continua, aunque también es posible utilizar un detector matricial, la implementación más probable será el uso de un solo detector; en este caso, la información de la posición lateral xy y potencialmente la información de la distribución longitudinal z se puede obtener mediante relaciones de intensidad. Uno de los casos más interesantes es el de las distribuciones armónicas en el tiempo, en el que las células electro-ópticas son impulsadas por una tensión sinusoidal. En este caso, la posición xy puede recuperarse midiendo los armónicos de tiempo de la señal medida por el detector, que puede ser un único detector, que contiene indirectamente la información de posición lateral.

[0293] Muchas otras implementaciones de este método general serán claras para e1Hombre del Arte, por ejemplo:

• Algunas de las distribuciones creadas por el módulo LatSRCS, 700, son superoscilaciones, En la figura 7b , los casos de las figuras 7b00 y 7bn son superoscilaciones. Consiste en una mancha naturalmente pequeña rodeada por un anillo grande e intenso. Proyectando un anillo de agotamiento sobre esta superoscilación, será posible impedir, con un bajo coste energético, que los fluoróforos contenidos en el anillo emitan y el tamaño de la mancha será del tamaño de la mancha central de la superoscilación

• La creación de dos -o más- distribuciones de luz de agotamiento sucesiva o simultáneamente puede sustituir ventajosamente al vórtice de agotamiento en todas las modalidades RELSOFT o STED. Un posible efecto es la mejora de la forma de la distribución de la luz de agotamiento al tener en cuenta los efectos vectoriales. También es posible crear más de 2 distribuciones llamadas "de media luna", para explorar diferentes estados de polarización.

Módulo de control

[0294] Con referencia a la Figura 11 y a la Figura 5, en una realización preferida de esta invención, se describirán los diversos elementos de control integrados en la plataforma SRCDP, 500 :

El Módulo de Control, 1100, utilizando el procedimiento de control sistémico, 1101, controla y modifica los parámetros ópticos de la plataforma SRCDP, 500, los parámetros electrónicos del conjunto de detección mejorado, 65, y los parámetros matemáticos de los procedimientos algorítmicos SRCDA, 900, para optimizar la información emergente, según criterios definidos por el sistema o por el usuario. El control se consigue variando los sistemas de control 1102, 1103 y 1104, de los distintos elementos de la plataforma, 600, 800 y 900. El sistema de control, 1100, también utilizará, si está disponible, información externa, 1105, transmitida por el medio informático. Nota : 1105 no se muestra en la figura 11

[0295] Se entiende que la invención no está limitada en su aplicación a los detalles expuestos en la descripción del presente documento o ilustrados en los dibujos. La invención es capaz de otras realizaciones y de ser practicada y llevada a cabo de varias maneras. El experto en la materia comprenderá fácilmente que pueden aplicarse diversas modificaciones y cambios a las realizaciones de la invención descritas anteriormente sin salirse del ámbito de esta invención

Aplicaciones alternativas

[0296] Las realizaciones descritas de la invención pueden integrarse en un microscopio de fluorescencia confocal. El sistema de superresolución según las realizaciones de la invención consiste en una nueva modalidad de medición, además o en sustitución de las modalidades de microscopía existentes. Sin embargo, el sistema de superresolución según las realizaciones de la invención puede integrarse igualmente en otras plataformas de microscopía. Tales plataformas de microscopía, descritas por ejemplo en incluyen pero no se limitan a: Microscopios de campo amplio, microscopios de campo oscuro, microscopios de polarización, microscopios de diferencia de fase, microscopios de interferencia de contraste diferencial, microscopios estereoscópicos, microscopios Raman, microscopios dedicados a una tarea específica, como la obtención de imágenes de células vivas, la clasificación de células, la motilidad celular o cualquier otro instrumento de microscopía óptica.

[0297] En otra realización no reivindicada, la plataforma de microscopía descrita se acopla a un sistema de microscopía electrónica (CLEM- Correlative Light Electron Microscopy), o cualquier otro sistema similar como TEM (Transmission Electron Microscopy), o EBM (Electron Beam Microscopy), o SEM (Scanning Electron Microscopy)

[0298] En otra realización no reivindicada de la invención, la plataforma de microscopio es una plataforma SRCDP completa, e incluye un módulo LongSRCS, que implementa el método PDOS y utiliza el algoritmo SRCDA.

[0299] En otra realización no reclamada, la plataforma de microscopio es una plataforma SRCDP parcial, y utiliza el algoritmo SRCDA.

[0300] En otra realización no reclamada, la plataforma del microscopio es una plataforma parcial SRCDP, y utiliza el módulo de control.

[0301] En otra realización no reivindicada, la plataforma del microscopio comprende además un módulo LongSRCS, que implementa el PDOS

[0302] En cuanto a la forma de uso y funcionamiento de la invención, debería desprenderse de la descripción anterior. Por lo tanto, no se describirá la forma de uso y funcionamiento.

[0303] A este respecto, antes de explicar al menos una realización de la invención en detalle, se entiende que la invención no está limitada en su aplicación a los detalles de la construcción y disposición de los componentes expuestos en la siguiente descripción o ilustrados en el dibujo. La invención es capaz de otras realizaciones y puede ser practicada y llevada a cabo de varias maneras. Además, se entiende que la fraseología y la terminología utilizadas en el presente documento son a efectos de la descripción y no deben considerarse limitativas.

[0304] Las referencias citadas en este documento enseñan muchos principios que son aplicables a la presente invención. En consecuencia, todo el contenido de esas publicaciones se incorpora aquí por referencia, cuando sea apropiado para las enseñanzas de detalles adicionales o sustitutivos, características y/o información técnica.

[0305] El uso ventajoso de las fibras ópticas es la transmisión del modo fundamental, el modo TEM00, y sólo él. Sin embargo, algunas configuraciones de fibras ópticas, principalmente pero no exclusivamente basadas en las denominadas fibras de cristal fotónico, permiten la transmisión de modos más complejos, incluidos los modos de vórtice, ya sea simultáneamente o no. Por lo tanto, sería posible desplazar las distribuciones ópticas creadas por la refracción cónica utilizando fibras ópticas, lo que permitiría una importante simplificación del sistema óptico.

[0306] Además, algunas fibras, las llamadas fibras de cristal fotónico de doble núcleo, [16] permiten una interacción entre dos modos, uno de los cuales puede ser un vórtice, y proporcionan un mecanismo físico adicional para crear funciones de transferencia diversificadas.

[0307] Muchas técnicas de superresolución se basan en la medición de fuentes puntuales, más pequeñas que una fracción de longitud de onda. Las técnicas de superresolución según las realizaciones descritas permiten la medición de fuentes puntuales, pero también de objetos estructurados, por ejemplo y principalmente segmentos de líneas, círculos o incluso objetos continuos. En biología, esta ampliación permitirá medir importantes entidades biológicas, como los filamentos, las neuronas y algunos microtúbulos.

[0308] Aunque las descripciones de las realizaciones, para simplificar la comprensión de la invención, presentan aplicaciones en Microscopía, más específicamente en Biología, y aún más específicamente en Biología de Fluorescencia, las aplicaciones pueden extenderse a aplicaciones generales de Microscopía y a todo el campo de la Visión, incluyendo la Visión Artificial.

[0309] Las realizaciones de la invención pueden aplicarse, eligiendo un sistema óptico diferente, a muchas aplicaciones médicas, por ejemplo, pero sin limitarse a la observación oftalmológica. Este campo de aplicación corresponde a la medición de objetos biológicos o médicos de resolución micrométrica, siendo la resolución entre 1 y 10 |jm.

[0310] Además, las realizaciones de la invención pueden aplicarse, como se explica más adelante, a través de una fibra óptica. Esto permite muchas aplicaciones adicionales, por ejemplo, pero sin limitarse a la observación gástrica o gastroenterológica, y la observación del colon y del tracto urinario.

[0311] Se entiende que la invención no está limitada en su aplicación a los detalles expuestos en la descripción del presente documento o ilustrados en los dibujos. La invención es capaz de otras realizaciones y de ser practicada y llevada a cabo de varias maneras. El experto en la materia comprenderá fácilmente que pueden aplicarse diversas modificaciones y cambios a las realizaciones de la invención descritas anteriormente sin apartarse de su alcance, tal como se define en las reivindicaciones adjuntas.

Referencias

[0312]

1. L. Schermelleh, R. Heintzmann y H. Leonhardt, "A guide to super-resolution fluorescence microscopy", The Journal of cell biology 190, 165-175 (2010).

2. M. V. Berry, "Conical diffraction asymptotics: fine structure of Poggendorff rings and axial spike", Journal Of Optics A-Pure And Applied Optics 6, 289-300 (2004).

3. http://en.wikipedia.org/wiki/Superresolution

4. J. F. Nye y M. V. Berry, "Dislocations in Wave Trains", Proceedings of the Royal Society of London. Serie A, Ciencias Matemáticas y Físicas (1934-1990) 336, 165-190(1974).

5. S. W. Hell y J. Wichmann, "Breaking the diffraction resolution limit by stimulated emission: stimulatedemission-depletion fluorescence microscopy", Optics letters 19, 780-782 (1994 ).

6. W. R. Hamilton, "Tercer suplemento a un ensayo sobre la teoría de los sistemas de rayos". Trans. Royal Irish. Acad. pp 1-144 (1833).

7. H. Llyold, "On the Phenomena presented by Light in its Passage along the Axes of Biaxial Crystals", The London and Edinburgh Philosophical Magazine and Journal of Science ii, 112-120 (1833).

8. C. Phelan, D. O'Dwyer, Y. Rakovich, J. Donegan y J. Lunney, "Conical diffraction and Bessel beam formation with a high optical quality biaxial crystal", J. Opt. A, Pure Appl. Opt 7, 685-690 (2009).

9. M. Berry y M. Jeffrey, "Conical diffraction: Hamilton's diabolical point at the heart of crystal optics", Progress in Optics 50, 13 (2007).

10. A. Geivandov, I. Kasianova, E. Kharatiyan, A. Lazarev, P. Lazarev y S. Palto, "Retardadores de película fina imprimible para LCD".

11. B. Acharya, A. Primak, T. Dingemans, E. Samulski y S. Kumar, "The elusive thermotropic biaxial nematic phase in rigid bent-core molecules", Pramana 61,231-237 (2003).

12. D. H. Goldstein y E. Collett, Polarized light (CRC, 2003), Vol. 83.

13. J. B. Pawley, Handbook of biological confocal microscopy (Springer Verlag, 2006).

14. M. Bass, Handbook of optics (McGraw-Hill, 2001).

15. M. Minsky, "Microscopy Apparatus", 3.013.467 (1961).

16. P. Li, J. Zhao, S. Liu, X. Gan, T. Peng y X. Jiao, "Comportamientos dinámicos de vórtices ópticos en fibras de cristal fotónico de doble núcleo", Optics Communications (2012).

17. Stefan Hell y Jan Wichmann "Process and device for optically measuring a point on a sample with high local resolution", US patent 5731588 A,

18. Vicidomini G, Schonle A, Ta H, Han KY, Moneron G, et al. (2013) STED Nanoscopy with Time-Gated Detection: Theoretical and Experimental Aspects. PLoS ONE 8(1)

19. Katrin I. Willig, Lars Kastrup, U. Valentin Nagerl, Stefan W. Hell: "STED Microscopy: Different Approaches and Applications

20. Angus John BAIN y Richard John MARSH " Mejoras relativas a la microscopía de fluorescencia", WO 2013008033 A1, Número de solicitud PCT/GB2012/051680, Fecha de presentación 13 de julio de 2012 21. Christian Eggeling et al. "Sted microscopy with pulsed excitation, continuous stimulation, and gated registration of spontaneously emitted fluorescence light", application WO 2012069076 A1, Application PCT/EP2010/067956, Filing date, Nov 22, 2010

22. Emiliano Ronzitti et al: "Frequency dependence detection in a STED microscope using modulated excitation light", Optics Express, Vol. 21, Issue 1, pp. 210-219 (2013)

23. D. Wildanger et. al. Un microscopio STED alineado por diseño", Opt. Exp. 17, 16100-16110 (2009). 24. N. Bokor et al. "Compact fluorescence depletion microscope system using an integrated optical element", Opt. Comm. 281, 1850 (2008).

25. Juergen Hoeffman, "Apparatus for illuminating a specimen and confocal fluorescence scanning microscope", patente US6555826 y "Scanning microscope with a detcctor and light source for exciting an energy state in a specimen and module fora scanning microscope", patente US6958470

26. R. Menon, P. Rogge y H.-Y. Tsai, "Design of diffractive lenses that generate optical nulls without phase singularities", J. Opt. Soc. Am. A 26(2), 297-304 (2009).

27. M. Reuss et. al. Un dispositivo birrefringente convierte un microscopio de barrido estándar en un microscopio STED que también mapea la orientación molecular", Opt. Exp. 18, 1049-1058 (2010)

28. http://www.abberior.com/products/productlist/cat/optical-components/prod/easydonut-phaseplate/ 29. Y. Zhang, "Generation of three-dimensional dark spots with a perfect light shell with a radially polarized Laguerre-Gaussian beam", Applied optics 49, 6217-6223 (2010).

30. J. Besag, "Towards Bayesian Image Analysis". Journal of Applied Statistics, vol. 16, pp. 395-407, 1989.

31. C. Louchet, L. Moisan, "Total Variation denoising using posterior expectation". Actas de la Conferencia Europea de Procesamiento de Señales (Eusipco), 2008.

32. C. Louchet, L. Moisan, "Posterior Expectation of the Total Variation model: Properties and Experiments". SIAM Journal on Imaging Sciences, vol. 6, n. 4, pp. 2640-2684, 2013.

33. L. Tiemey, "Markov Chains for exploring posterior distributions". Los Anales de Estadística, vol. 22, n. 4, pp. 1701-1728, 1994.

34. W.K. Hastings, "Monte Carlo Sampling Methods Using Markov Chains and Their Applications". Biometrika, vol. 57, n. 1, pp. 97-109, 1970.

35. Johann Engelhardt, "Método y dispositivo para desplazar dinámicamente un haz de luz en relación con un sistema óptico que enfoca el haz de luz", solicitud p Ct WO2010069987 A1

Claims (7)

REIVINDICACIONES

1. Método de medición óptica para determinar la distribución espacial o la localización de fuentes reemisoras en una muestra, comprendiendo la muestra al menos una fuente reemisora, dicha al menos una fuente reemisora reemite luz de acuerdo con la luz proyectada sobre la muestra, según una ley determinada, por una primera fuente de luz que comprende un primer láser, y siendo la fuente reemisora deplacable o activable por la acción de una segunda fuente de luz, que comprende un segundo láser, comprendiendo el método

utilizando los dos láseres (79a), (79b), estando la longitud de onda de uno de los láseres sintonizada con la longitud de onda de excitación de la al menos una fuente reemisora y la longitud de onda del segundo láser sintonizada con la longitud de onda de agotamiento o activación de la al menos una fuente reemisora; producir un estado de polarización controlado para cada láser mediante un submódulo de polarización, combinando los dos láseres mediante un banco de láseres en una salida de fibra común (76b); proyectar sobre la muestra, mediante un aparato óptico de proyección acromática (32) realizado por difracción cónica o ensamblaje de cristales uniaxiales, para cada láser una distribución de luz compacta

, propagándose a lo largo de la misma trayectoria óptica para todos los láseres;

detectar la luz reemitida por la al menos una fuente reemisora de la muestra;

generar al menos una imagen a partir de la luz detectada;

y detectar directamente o analizar algorítmicamente las imágenes para obtener información sobre la distribución espacial o la localización de la al menos una fuente reemisora, incluyendo el control de los láseres para crear conjuntamente una secuencia de distribuciones de excitación de diferentes topologías y una secuencia de distribuciones de agotamiento o activación de diferentes topologías, estando las dos secuencias sincronizadas y ajustadas entre sí

2. Un método de medición óptica, según la reivindicación anterior, siendo al menos una distribución de excitación singular simultánea con una distribución de agotamiento singular

3. Un método según las reivindicaciones anteriores, que comprende controlar los láseres para crear conjuntamente una secuencia de distribuciones de excitación y una secuencia de distribuciones de agotamiento o activación, siendo una de las distribuciones de excitación una superoscilación.

4. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que comprende controlar los láseres para crear simultáneamente o en una secuencia de distribuciones de excitación y una secuencia de distribuciones de agotamiento O activación, siendo el conjunto de distribuciones de agotamiento o activación equivalente o similar a un vórtice.

5. Dispositivo de medición para determinar la distribución espacial o la localización de fuentes reemisoras en una muestra, comprendiendo la muestra al menos una fuente reemisora, dicha al menos una fuente reemisora reemite luz en función de la luz proyectada sobre la muestra por un primer láser, según una ley determinada, pudiendo la fuente reemisora ser agotada o activada por la acción de un segundo láser, comprendiendo el dispositivo :

dos láseres de diferentes longitudes de onda (79a), (79b), estando la longitud de onda del primer láser sintonizada con la longitud de onda de excitación de dicha al menos una fuente reemisora y la longitud de onda del segundo láser sintonizada con la longitud de onda de agotamiento o activación de dicha al menos una fuente reemisora, un submódulo de polarización para realizar para cada láser, de un estado de polarización diferente, la combinación de los dos láseres mediante un banco de láseres en una salida de fibra común (76b), un módulo de proyección acromática (32) que comprende al menos un cristal cónico para realizar la proyección de distribuciones de luz de diferentes familias de topología por una difracción cónica o un conjunto de cristales uniaxiales, que permita crear para cada láser una distribución de luz compacta, que se propague a lo largo de la misma trayectoria óptica para todos los láseres, un módulo de detección capaz de detectar la luz reemitida por dicha al menos una fuente reemisora de la muestra, un módulo de generación, capaz de generar al menos una imagen óptica, a partir de la luz detectada, y un módulo de análisis algorítmico o de detección directa capaz de analizar las imágenes para obtener información de localización de dicha al menos una fuente reemisora

donde los láseres están configurados para crear conjuntamente una secuencia de distribuciones de excitación de diferentes topologías y una secuencia de distribuciones de agotamiento o activación de diferentes topologías, estando las dos secuencias sincronizadas para crear conjuntamente una secuencia de distribuciones de excitación y una secuencia de distribuciones de agotamiento o activación, estando las dos secuencias sincronizadas, y siendo una única distribución de excitación simultánea con una única distribución de agotamiento

6. Un dispositivo según la reivindicación 5 en el que los láseres están configurados para crear conjuntamente una secuencia de distribuciones de excitación y una secuencia de distribuciones de agotamiento o activación, siendo una de las distribuciones de excitación una superoscilación.

7. Un dispositivo según una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 6, en el que los láseres están configurados para crear simultáneamente o en una secuencia de distribuciones de excitación y una secuencia de distribuciones de agotamiento o activación, siendo el conjunto de distribuciones de agotamiento o activación equivalente o similar a un vórtice.