WO2015044037A1 - Vorrichtung und verfahren zur aufbereitung und/oder prozessierung von biologischen proben - Google Patents

Vorrichtung und verfahren zur aufbereitung und/oder prozessierung von biologischen proben Download PDF

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WO2015044037A1
WO2015044037A1 PCT/EP2014/069957 EP2014069957W WO2015044037A1 WO 2015044037 A1 WO2015044037 A1 WO 2015044037A1 EP 2014069957 W EP2014069957 W EP 2014069957W WO 2015044037 A1 WO2015044037 A1 WO 2015044037A1
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WO
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beads
cavity
cells
bodies
sample
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PCT/EP2014/069957
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English (en)
French (fr)
Inventor
Melanie HOEHL
Original Assignee
Robert Bosch Gmbh
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Robert Bosch Gmbh filed Critical Robert Bosch Gmbh
Publication of WO2015044037A1 publication Critical patent/WO2015044037A1/de

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M47/00—Means for after-treatment of the produced biomass or of the fermentation or metabolic products, e.g. storage of biomass
    • C12M47/06—Hydrolysis; Cell lysis; Extraction of intracellular or cell wall material

Definitions

  • the present invention relates to a device for processing and / or processing of biological samples, wherein the device has at least two axially superimposed body, each having at least one cavity and wherein the bodies are displaced or rotated against each other in response to a centrifugal force or equivalent force. Furthermore, the invention relates to a method for the preparation and / or processing of biological samples using such a device.
  • the processing and processing of biological samples is based essentially on the handling of liquids.
  • various aids in particular pipettes and various reaction vessels, are used in order to be able to carry out the various processes during manual handling with the aid of various laboratory equipment.
  • an analysis of biological cell material is carried out. For example, proteins and other components of a biological cell are examined and characterized.
  • nucleic acids or other material contained in a sample it is often necessary to break up the biological cells contained in the sample.
  • breaking up the cells which is also commonly referred to as lysis, various methods are known.
  • cell membranes must be destroyed and in the case of plant cells and the cell walls.
  • an enzymatic lysis of cells is very widespread, in which the cell membranes are enzymatically degraded.
  • the enzymes proteinase K or lysozyme can be used.
  • organic solvents for example sodium hydroxide solution, can be used in order to disrupt the cells in a chemical manner. Lysis can continue by using EDTA
  • biological cells can also be disrupted mechanically, for example by homogenization under high pressure (French-Press), by the use of ultrasound, by repeated freezing and thawing, or by electromagnetic radiation.
  • French-Press homogenization under high pressure
  • ultrasound ultrasound
  • freezing and thawing or by electromagnetic radiation.
  • ball mills Another possibility for the mechanical disruption of biological cells is the use of so-called ball mills, in which a destruction of the cells is achieved by shearing forces that arise when "milling" the cells between small beads.
  • cell disruption should be fast and efficient.
  • the chosen method should be designed so that cell membranes and cell walls on one side are reliably destroyed.
  • the cellular constituents that constitute the respective "target product" of the process to be performed should not be destroyed, so for example, no further denaturation, proteolysis or oxidation of molecules should take place.
  • German Offenlegungsschrift DE 10 2010 003 223 A1 describes a system with a device which is provided for insertion into a centrifuging rotor.
  • two or more revolver-like bodies are arranged axially one above the other.
  • the revolvers contain one or more cavities, in particular reaction chambers and channels, and optionally further structures for carrying out processes, in particular fluidic unit operations.
  • An acceleration change of the centrifuge activates an integrated mechanism, which works in the manner of a ballpoint pen mechanism.
  • the bodies move radially outwards, the bodies being displaced or rotated relative to one another by means of a tooth system and an integrated restoring means. Individual cavities can thereby be interconnected.
  • orientation-dependent opening of individual cavities or vessels in the bodies is possible, one side of the cavity or of the vessel being provided, for example, with a pierceable foil. With the help of a thorn on another body, the film is pierced by the movement of the body against each other.
  • a controlled fluid management in the device can be achieved.
  • fluid guidance can be realized from pre-storage chambers via intermediary processing chambers to collecting cavities for the processed liquids.
  • Such a system can be used, for example, for the purification of biological or biochemical molecules.
  • the sample and all reagents required for purification are used in the top turret.
  • the underlying revolvers serve as reaction stages for the various solid or liquid phase reactions.
  • the transport of sample and reagents from the top to the bottom turret is accomplished by the centrifugal force of a standard laboratory centrifuge by transporting the liquids along the force vector of centrifugal force from radially inward points to radially outward points.
  • the device according to the invention serves for the preparation and / or
  • cells as used herein is meant primarily biological cells and in particular prokaryotic cells and eukaryotic cells of plant or animal origin, as well as fungal cells, and also includes cellular material in the form of, for example, tissues and / or organs "includes in a broader sense but also other material, such as Viruses or spores or other types of survival or forms of life.
  • the device according to the invention comprises at least two axially superimposed bodies, each having at least one cavity.
  • the bodies are displaceable or rotatable relative to each other as a function of a centrifugal force or a force having the same effect, wherein the cavities of the superimposed bodies can be fluidly coupled to one another.
  • the bodies are designed, for example, as so-called revolvers.
  • the device according to the invention comprises in addition to the at least two axially stacked or stacked bodies, a housing which receives the stacked body.
  • the housing is in particular designed such that it fits into the holder of a
  • Rotor of a centrifuge can be used.
  • the housing may for example have the shape of a conventional centrifuge tube.
  • the transport of liquids through the superimposed body takes place in a predeterminable manner by utilizing the centrifugal force or an equivalent force. In particular, it is a microfluidic arrangement.
  • beads are contained in at least one of the cavities of this device. With the help of these beads, a mechanical digestion of the cells contained in the sample takes place.
  • the biological cells between the beads are ground to some extent, with Scheher forces acting, which lead to destruction of cell membranes and / or cell walls.
  • the beads included in the device according to the invention are therefore designed to be suitable for this purpose.
  • the cells are usually digested enzymatically.
  • the enzymatic lysis usually has to be carried out at a certain temperature, usually at an elevated temperature, since the particular enzyme generally has a specific temperature optimum for its maximum activity.
  • the device according to the invention uses mechanical lysis or mechanical cell disruption using beads. There are no expensive reagents, especially no expensive enzymes required.
  • the storage of the beads is in contrast to the storage of enzymes quite straightforward, since for example no storage at low temperatures or under certain buffer conditions must take place. Even the cell disruption itself is largely independent of the temperature, so that no particular temperature must be set for the cell disruption. In addition, the mechanical cell disruption can be carried out very quickly, for example in less than 5 minutes. Overall, the device according to the invention with the mechanical cell disruption using beads in comparison with an enzymatic cell disruption allows a much faster, easier and more cost-effective implementation of cell disruption.
  • the device according to the invention with the mechanical disruption of cells using beads is particularly advantageously suitable for generally difficult to open cells, such as, for example, yeasts, spores, algae and others. These cells are often very resistant and hardly accessible to enzymatic cell disruption. By the use according to the invention of beads for the mechanical digestion, these cells can readily be disrupted.
  • the device according to the invention is also suitable for the digestion of cells of any other form, for example, for Gram-positive or Gram-negative bacteria, and generally for cells of plant or animal origin.
  • the device can also be set up for the digestion of very difficult to access cells, for example, plant cells with very solid cell walls.
  • the beads themselves can be made of different materials, provided they have sufficient strength. Suitable examples are plastics, ceramics, metals, glass and / or silica.
  • the average The diameter of the beads may be selected, for example, between about 0.01 mm to about 2 mm, depending on the particular cells to be disrupted. It is also possible to use mixtures with beads which have different diameters and / or different materials.
  • the beads may be provided in different positions within the device.
  • the beads may be contained in a cavity of the upper body (revolver). This can e.g. a cavity, which is intended to order the sample.
  • the sample with the cells is thus introduced into the cavity containing the beads.
  • the process is started, the cells are digested in a first step with the help of the beads, so that then further processing of the sample can take place.
  • One or more of the axially superposed body (s) may be configured in several parts and include, for example, a lid and a mixing trough, wherein the lid and the mixing trough may be movable relative to each other.
  • the lid engages in the volume of the mixing trough and by an up and down movement of the lid and mixing trough against each other, which is controlled by the centrifugal forces acting, can take place an increased mixing in the mixing chamber.
  • the beads are contained in a cavity of the lid. Through acceleration and deceleration during centrifugation, the sample can be repeatedly pumped through the lid and into the mixing chamber, whereby the beads are moved in the cavity of the lid. As a result of the shearing forces, which are exacerbated, cell disruption takes place in a particularly effective manner.
  • the beads can be contained in a cavity of a body of the device, which as
  • the mixing chamber itself can be set up such that it can be moved by the acting centrifugal forces or equivalent forces so as to achieve thorough mixing.
  • the beads are particularly strongly moved, so that cell disruption can be carried out very efficiently.
  • provision may be made for globules to be contained at different positions within the device according to the invention.
  • beads may be provided both in the sample application chamber and in the mixing chamber.
  • the means for opening a cavity may e.g. be designed as a film which is pierced by an underlying mandrel depending on the position of the body to each other.
  • the means for opening the cavity (s) containing the beads are preferably arranged so that the beads do not leave the cavity even after opening the cavity and that only the sample, ie the cell lysate, leaves the cavity and is passed into the subsequent cavity.
  • the regions to be ruptured are preferably smaller than the pellets themselves, so that the pellets can not escape from the respective cavity and thus do not disturb the further processing of the sample.
  • an engagement of guide springs of one body in a row of teeth of the other body and a counter to the centrifugal force or against the same force acting restoring force of the body is provided for the rotation or displacement of the body.
  • the invention further encompasses a method for processing and / or processing biological samples, wherein a device is used which has at least two bodies arranged axially one above the other with at least at least one cavity. These bodies are rotatable or displaceable relative to one another in dependence on a centrifugal force or an equivalent force and the different cavities of the bodies can be fluidly coupled to one another. This is in particular a stacked microfluidic system already described at the outset.
  • a device which has at least two bodies arranged axially one above the other with at least at least one cavity.
  • These bodies are rotatable or displaceable relative to one another in dependence on a centrifugal force or an equivalent force and the different cavities of the bodies can be fluidly coupled to one another.
  • This is in particular a stacked microfluidic system already described at the outset.
  • the cells are mechanically disrupted by containing in at least one of the cavities of the device used beads.
  • the device can be inserted into the rotor of a centrifuge.
  • the cell disruption itself takes place by means of acceleration and deceleration of the centrifuge.
  • Preferably, several cycles of acceleration and deceleration are carried out for cell disruption.
  • the acceleration and deceleration of the centrifuge causes movement of the beads within the device, so that cell disruption occurs due to the shear forces acting between the beads and the cells.
  • the cells are sort of ground between the beads. Equivalent forces may be exerted as an alternative to the centrifugal forces, for example, a similar effect may be produced by repeated application of a negative pressure or an overpressure.
  • the low speed can be, for example, in an acceleration range between 20 g and 600 g.
  • the high speed can be, for example, in an acceleration range between 1000 g and 12,000 g.
  • FIG. 1 shows a sectional view of a centrifugable device with several mutually rotatable bodies (turrets) from the prior art;
  • Fig. 2 isometric view of an upper body (revolver) as part of a device according to the invention
  • Fig. 3A B isometric view of a second body (revolver) as part of the device according to the invention in a view obliquely from the side (Fig. 3A) and in plan view (Fig. 3B) and
  • Fig. 4A B isometric view of components of the second body
  • Fig. 1 shows schematically a system for automatic
  • the body 10, 20, 30 comprise various cavities 11, 12, 21, 22, 31, 32, 33 which serve as containers and reaction spaces.
  • the device can, for example, for a
  • Protein purification can be used.
  • the cavities 1 1 reagents are kept.
  • the sample is introduced.
  • the cavity 21 represents a mixing chamber.
  • the cavity 22 contains a matrix-based column, with which the actual protein purification takes place.
  • the cavity 31 is provided for waste from washing steps on the column.
  • the eluate of the column is collected.
  • the purified protein can be detected with a biochemical reaction, wherein a detector 40, which is located outside the device can be used.
  • the bodies 10, 20, 30 are in a stacked manner within a housing in the form of a centrifuge tube 50, which is closable with a lid 51.
  • the centrifuge tube 50 is placed in the rotor of a laboratory Centrifuge used.
  • the bodies 10, 20, 30 rotate in a predetermined manner against each other, in particular via an integrated ballpoint pen mechanism.
  • the transport of sample and reagents from the top turret 10 to the bottom turret 30 is by the centrifugal force.
  • the fluid flow takes place in a predetermined manner, so that the sample from the cavity 12 passes through the various processing steps in a predetermined manner.
  • the cells expressing this protein must first be disrupted.
  • this can be done in advance, for example, by treating the cells outside the device enzymatically or chemically, so that the resulting cell lysate can then be introduced into the cavity 12 for further processing.
  • Another conventional possibility is that an enzyme suitable for lysing the cells is kept in such a device. A corresponding enzyme may be contained in the cavity 12, for example. If then the sample containing the cells is introduced into the cavity 12, cell lysis, ie cell disruption, takes place under certain conditions.
  • the temperature optimum of the respective enzyme must be taken into account. As a rule, a higher temperature is required for the enzymatic activity. Furthermore, it should be noted that the stability of the enzyme must be taken into account in the storage of such a device, wherein usually a stability of the enzyme only at sufficiently low
  • the device according to the invention provides such a device with beads or beads to be able to carry out a mechanical cell disruption.
  • This mechanical cell disruption is based on "crunching" the cells between the beads, wherein
  • the beads may have an average diameter of, for example, 0.01 mm to 2 mm.
  • the beads may be provided in various regions and positions within the device of the invention.
  • FIG. 2 shows an example of the device according to the invention, in which the beads 1000 are contained in a cavity 101 of the upper turret 100.
  • the revolver 100 has a total of eight cavities 101 to 108.
  • the cavity 101 is the so-called sample chamber, into which the biological sample, that is to say in particular the cells contained in a liquid, is introduced.
  • the biological sample that is to say in particular the cells contained in a liquid
  • Chamber 101 are the beads 1000, here indicated by an arrow and several filled circles.
  • the sample containing cell material or, for example, spore material is introduced into the chamber 101 before starting the processing.
  • the beads mix with the cells of the sample, so that the acting Scheerrräfte cause the digestion of the cells.
  • This step is controlled by the acceleration and deceleration of the centrifuge, for example by a change between 40 g and 6000 g.
  • the sample chamber 101 can be opened, in particular in the lower region, in order to be able to further process the digested or lysed sample.
  • a film for. As an aluminum foil, be provided, which closes the cavity 101 down. This film is pierced or torn open by a mandrel of a revolver placed below it, so that the
  • a suitable for this Centrifuge protocol can be carried out, for example, according to the following scheme.
  • the sample and beads are mixed by cycling the speeds using accelerations between 20 g and 600 g and between 1000 g and 12,000 g.
  • the hold times at the respective target speed may be 1 second or longer, not taking hold at a certain speed, but cycling between the two speeds for mixing and the acting shearing forces.
  • the lower speed can be set, for example, to achieve an acceleration of 200 g and the upper speed to achieve an acceleration of 2000 g. It can be carried out between 1 and 500 cycles, for example, are suitable in particular 20 to 200 cycles. For example, good results are already achieved with 100 cycles.
  • the centrifuge In order to puncture the film of the cavity 101 in the revolver 100 for releasing the lysed sample, the centrifuge is first accelerated to 6000 g and kept there for a short time, for example 1 second to 1 minute, then accelerated again down to 40 g. In general, it is sufficient to accelerate below 200 g. As a result, the ballpoint pen mechanism is activated so that the aluminum foil of the cavity 101 in the revolver 100 is pierced and the cell lysate can leave the sample chamber 101.
  • the various exemplary process steps for the lysis or the cell disruption and for a subsequent protocol for protein purification by means of a column chromatography are listed below:
  • the cell disruption may also take place in a subsequent revolver, where "below” means that the following revolver is arranged below the first revolver, as seen in the flow direction is arranged below the revolver 100.
  • the revolver 200 in this example has four upwardly projecting guide springs 21 1, which can engage in the row of teeth 1 1 1 of the revolver 100, so that by means of the ballpoint pen mechanism a predetermined rotation, depending on the
  • the revolver 200 is designed in several parts, with the upper part of the revolver 200 forming a cover 210 (mandrel cover) for an underlying mixing trough 230 (mixing chamber), which is described in greater detail with reference to FIG On the mandrel lid 210 are located
  • An opening of the cavities of the overlying revolver 100 for example, an opening of the sample chamber 101, can be done by the mandrels 212, 213 and 214, these mandrels can pierce, for example, a film that the cavities in Close the upper turre
  • Opening takes place with corresponding rotation of the bodies (turrets) relative to each other, so that a predetermined fluid flow is achieved from a cvity of the upper turret into a cavity of the turret underneath.
  • This mechanical coupling of the cavities is controlled by the respective set centrifugal force, wherein the corresponding rotation of the body to each other by the aforementioned ballpoint pen mechanism and a restoring spring force can be triggered.
  • 3B shows a top view of the mandrel cover 210.
  • the cover 210 has a depression 220 (cavity), which engages in the volume of the underlying mixing trough.
  • An opening 221 in the cavity 220 allows fluid flow between the cavity 220 and the underlying mixing trough.
  • the beads 2000 which are used according to the invention for cell disruption are located.
  • the sample passes from a cavity of an overlying revolver into the recess 220.
  • the cavity of the above-mentioned lying turret can be pierced, for example, with the mandrel 214.
  • the ballpoint pen mechanism of the turrets 100 and 200 is configured such that by means of the centrifugal force the turret 200 moves up and down in dependence on the acting acceleration. This up and down movement is effected by a spring force acting against the centrifugal force.
  • a spring can be arranged in the lower region of the revolver 200.
  • the liquid is pumped through the lid 210 again and again, wherein the liquid passes through the opening 221 respectively.
  • the globules 2000 also move through the acceleration and deceleration, so that the cell disruption by the crushing of the cells and the acting
  • This embodiment has the advantage that in this case an up and down movement of the lid 210 of the revolver 200 and an underlying mixing chamber is used to achieve a further mixing of the beads and the cells to be connected so as to make the cell disruption even more efficient.
  • the mixing can take place, for example, by cycling between speeds in the acceleration range from 40 g to 500 g and in the acceleration range from 4000 g to 6000 g, for example with 100 g and 5500 g or with 500 g and 5000 g. It may preferably be changed several times between the speeds.
  • 1 to 500 cycles may be performed, preferably 20 to 200 cycles, with, for example, 100 cycles giving very good results.
  • the following is an exemplary protocol for the purification of DNA from bacterial cells, wherein the cells are digested in the mixing chamber containing the beads according to the invention.
  • a cell material for example, Escherichia coli or other Gram-negative bacteria can be used.
  • the protocol is also applicable to other cells and in particular to other bacteria. Speed or cycle speed process step (g)
  • Fig. 4 shows another example of the positioning of the beads.
  • revolver 200 is again shown, which is subdivided into an upper part, the mandrel cover 210, and into a lower part, the so-called mixing trough 230.
  • the lid 210 is configured to engage the interior volume of the mixing trough 230.
  • cover 210 and mixing trough 230 move against each other. This up and down movement is triggered by the acting centrifugal acceleration.
  • the beads 3000 are located in the mixing trough 230.
  • the up and down movement of the lid 210 and mixing trough 230 results in a particularly good mixing of the beads with the sample or with the sample reached cells.
  • the arrow 1 indicates the direction of the centrifugal acceleration.
  • 4B shows the mixing trough 230 in a view obliquely from below.
  • the capped opening 231 which is provided for eluting or for the passage of the cell lysate after cell disruption.
  • the hole 231 may be closed by a foil that can be opened by being pierced or torn open by an underlying mandrel cap.
  • the opening is or the openings provided for the passage of the cell lysate are smaller in diameter than the beads, so that the beads 3000, which are located in the mixing trough 230, can not pass through and do not interfere with the subsequent treatment steps.
  • a plurality of openings 231 may be provided at the bottom of the mixing trough 230.
  • one or more predetermined breaking points may be provided, which allow the cell lysate to pass in a comparable manner.
  • the beads are provided at different positions within the device according to the invention, for example in the sample chamber or application chamber in an upper turret and additionally in a mixing chamber in a subsequent turret.

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Abstract

Bei einer Vorrichtung zur Aufbereitung und/oder Prozessierung von biologischen Proben weist die Vorrichtung wenigstens zwei axial übereinander angeordnete Körper (100, 200) mit jeweils wenigstens einer Kavität (101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108; 220; 230) auf. Die Körper (100, 200) sind in Abhängigkeit von einer Zentrifugalkraft oder einer gleichwirkenden Kraft gegeneinander verschiebbar oder verdrehbar, wobei die Kavitäten miteinander fluidisch koppelbar sind. Die Vorrichtung ist dadurch gekennzeichnet, dass in wenigstens einer der Kavitäten (101, 220, 230) Kügelchen (1000, 2000, 3000) enthalten sind, die zum mechanischen Aufschluss von Zellen in der biologischen Probe geeignet sind.

Description

Beschreibung
Titel
Vorrichtung und Verfahren zur Aufbereitung und/oder Prozessierung von biologischen Proben
Die vorliegende Erfindung betrifft eine Vorrichtung zur Aufbereitung und/oder Prozessierung von biologischen Proben, wobei die Vorrichtung wenigstens zwei axial übereinander angeordnete Körper mit jeweils wenigstens einer Kavität aufweist und wobei die Körper in Abhängigkeit von einer Zentrifugalkraft oder einer gleichwirkenden Kraft gegeneinander verschiebbar oder verdrehbar sind. Weiterhin betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Aufbereitung und/oder Prozessierung von biologischen Proben unter Verwendung einer derartigen Vorrichtung.
Stand der Technik
Die Aufbereitung und Prozessierung von biologischen Proben, beispielsweise im Zusammenhang mit der Aufreinigung und/oder Anreicherung bestimmter Moleküle oder mit der Analyse und Charakterisierung bestimmter Moleküle, basiert im Wesentlichen auf der Handhabung von Flüssigkeiten. Herkömmlicherweise werden hierzu verschiedene Hilfsmittel, insbesondere Pipetten und verschiedene Reaktionsgefäße, eingesetzt, um bei einer manuellen Handhabung unter Zuhilfenahme verschiedener Laborgeräte die verschiedenen Prozesse durchführen zu können. In vielen Bereichen der Biologie und Biochemie und insbesondere auch in der medizinischen Forschung und Diagnostik wird eine Analyse von biologischem Zellmaterial durchgeführt. Beispielsweise werden Proteine und andere Bestandteile einer biologischen Zelle untersucht und charakterisiert.
Um die in einer Probe enthaltenen Proteine, Nukleinsäuren oder anderes Material untersuchen zu können, ist es oftmals erforderlich, die in der Probe enthaltenen biologischen Zellen aufzubrechen. Für das Aufbrechen der Zellen, das auch allgemein als Lyse bezeichnet wird, sind verschiedene Methoden bekannt. Hier- bei müssen die Zellmembranen und im Fall von pflanzlichen Zellen auch die Zellwände zerstört werden. Beispielsweise ist eine enzymatische Lyse von Zellen sehr verbreitet, bei der die Zellmembranen enzymatisch abgebaut werden. Hierfür können beispielsweise die Enzyme Proteinase K oder Lysozym verwendet werden. Weiterhin können organische Lösungsmittel, beispielsweise Natronlauge, eingesetzt werden, um auf chemische Weise die Zellen aufzuschließen. Eine Lyse kann weiterhin durch Verwendung von EDTA
(Ethylendiamintetraessigsäure) bewirkt werden, wobei EDTA als Komplexbildner wirkt. Weiterhin können biologische Zellen auch mechanisch aufgeschlossen werden, beispielsweise durch eine Homogenisierung unter großem Druck (French-Press), durch Einsatz von Ultraschall, durch wiederholtes Einfrieren und Auftauen oder durch elektromagnetische Strahlen. Eine weitere Möglichkeit zum mechanischen Aufschluss von biologischen Zellen ist die Verwendung von sogenannten Kugelmühlen, bei denen eine Zerstörung der Zellen durch Scheerkräfte erreicht wird, die bei dem„Mahlen" der Zellen zwischen kleinen Kügelchen (Beads) entstehen.
Insgesamt sollte ein Zellaufschluss schnell und effizient erfolgen. Das gewählte Verfahren sollte so ausgelegt sein, dass Zellmembranen und Zellwände auf der einen Seite zuverlässig zerstört werden. Auf der anderen Seite sollten die zellulären Bestandteile, die das jeweilige„Zielprodukt" des durchzuführenden Prozesses darstellen, nicht zerstört werden. Es sollte also beispielsweise keine weitergehende Denaturierung, Proteolyse oder Oxidation von Molekülen stattfinden.
Für viele biochemische Prozessierungen sind bereits Automatisierungen verfügbar, wobei beispielsweise Pipettierroboter oder andere Spezialgeräte zum Einsatz kommen. Weiterhin können mit sogenannten Lab-on-a-Chip-Systemen viele biochemische Prozesse in voll automatisierter Weise durchgeführt werden. Lab- on-a-Chip-Systeme sind mikrofluidische Systeme, die die gesamte Funktionalität eines makroskopischen Labors auf einem nur etwa plastikkartengroßen Kunststoffsubstrat vereinigen. Neben dem Kunststoffsubstrat mit verschiedenen Kanälen, Reaktionskammern usw. sind vorgelagerten Reagenzien und verschiedene aktive Komponenten, wie beispielsweise Ventile oder Pumpen, sowie weitere Aktuations-, Detektions- und Steuereinheiten erforderlich. Weiterhin sind kartuschenbasierte Systeme bekannt, wobei die Flüssigkeiten typischerweise in einem Spezialgerät in einer Kartusche prozessiert werden. Beispielsweise beschreibt die deutsche Offenlegungsschrift DE 10 2010 003 223 A1 ein System mit einer Vorrichtung, die zum Einsetzen in einen Zentrifugationsrotor vorgesehen ist. Hierbei sind zwei oder mehr revolverartige Körper axial übereinander angeordnet. Die Revolver beinhalten dabei ein oder mehrere Kavitäten, insbesondere Reaktionskammern und Kanäle, und gegebenenfalls weitere Strukturen für die Durchführung von Prozessen, insbesondere von fluidischen Einheitsoperationen. Ein Beschleunigungswechsel der Zentrifuge aktiviert eine integrierte Mechanik, die nach Art einer Kugelschreibermechanik funktioniert. Infolge der Zentrifugalkraft bewegen sich die Körper radial nach außen, wobei die Körper mittels einer Verzahnung und einem integrierten Rückstellmittel gegeneinander verschoben oder verdreht werden. Einzelne Kavitäten können hierdurch miteinander verschaltet werden. Darüber hinaus ist ein orientierungsabhängiges Öffnen von einzelnen Kavitäten oder Gefäßen in den Körpern möglich, wobei eine Seite der Kavität oder des Gefäßes beispielsweise mit einer durchstechbaren Folie versehen ist. Mit Hilfe eines Dorns auf einem anderen Körper wird die Folie durch die Bewegung der Körper gegeneinander durchstoßen. Auf diese Weise kann eine kontrollierte Fluidführung in der Vorrichtung erreicht werden. Beispielsweise kann eine Fluidführung von Vorlagerungskammern über zwischengeschaltete Prozessierungskammern bis hin zu Auffangkavitäten für die prozessierten Flüssigkeiten realisiert werden. Ein derartiges System kann zum Beispiel zur Aufreinigung von biologischen oder biochemischen Molekülen genutzt werden. Hierfür werden im obersten Revolver die Probe und alle zur Aufreinigung benötigten Reagenzien eingesetzt. Die darunterliegenden Revolver dienen als Reaktionsstufen für die verschiedenen Fest- oder Flüssigphasenreaktionen. Der Transport von Probe und Reagenzien vom obersten zum untersten Revolver erfolgt durch die Zentrifugalkraft einer Standard-Laborzentrifuge, indem die Flüssigkeiten entlang des Kraftvektors der Zentrifugalkraft von radial innenliegenden Punkten zu radial außenliegenden Punkten transportiert werden.
Offenbarung der Erfindung
Vorteile der Erfindung Die erfindungsgemäße Vorrichtung dient zur Aufbereitung und/oder
Prozessierung von biologischen Proben, wobei innerhalb der Vorrichtung ein mechanischer Aufschluss von Zellen in der biologischen Probe erfolgen kann. Mit dem hier verwendeten Begriff„Zellen" sind in erster Linie biologische Zellen und insbesondere prokaryontische Zellen und eukaryontische Zellen pflanzlichen oder tierischen Ursprungs sowie auch Pilzzellen gemeint. Weiterhin ist hiermit auch Zellmaterial in Form von beispielsweise Geweben und/oder Organen umfasst. Der Begriff„Zellen" umfasst im weiteren Sinne aber auch anderes Material, wie z.B. Viren oder Sporen oder andere Überdauerungsformen oder Erschei- nungsformen von Lebewesen.
Die erfindungsgemäße Vorrichtung umfasst wenigstens zwei axial übereinander angeordnete Körper mit jeweils wenigstens einer Kavität. Die Körper sind in Abhängigkeit von einer Zentrifugalkraft oder einer gleichwirkenden Kraft gegenei- nander verschiebbar oder verdrehbar, wobei die Kavitäten der übereinander angeordneten Körper miteinander fluidisch koppelbar sind. Die Körper sind beispielsweise als sogenannte Revolver ausgestaltet. Die erfindungsgemäße Vorrichtung umfasst neben den wenigstens zwei axial übereinander angeordneten bzw. gestapelten Körpern ein Gehäuse, das die gestapelten Körper aufnimmt. Das Gehäuse ist insbesondere so ausgestaltet, dass es in die Halterung eines
Rotors einer Zentrifuge eingesetzt werden kann. Das Gehäuse kann beispielsweise die Form eines üblichen Zentrifugenröhrchens aufweisen. Der Transport von Flüssigkeiten durch die übereinander angeordneten Körper erfolgt in vorgebbarer Weise durch Ausnutzung der Zentrifugalkraft oder einer gleichwirkenden Kraft. Insbesondere handelt es sich um eine mikrofluidische Anordnung. Erfindungsgemäß sind in wenigstens einer der Kavitäten dieser Vorrichtung Kügel- chen (Beads) enthalten. Mit Hilfe dieser Beads erfolgt ein mechanischer Aufschluss der Zellen, die in der Probe enthalten sind. Hierbei werden die biologischen Zellen zwischen den Kügelchen gewissermaßen zermahlen, wobei Scheerkräfte wirken, die zu einer Zerstörung der Zellmembranen und/oder Zellwände führen. Die Kügelchen, die erfindungsgemäß in der Vorrichtung enthalten sind, sind daher so ausgestaltet, dass sie für diesen Zweck geeignet sind. Insbesondere weisen sie eine ausreichende Festigkeit auf, damit die erforderlichen Scheerkräfte entstehen können. In bisherigen vergleichbaren Systemen werden die Zellen üblicherweise enzymatisch aufgeschlossen. Nachteilig ist hierbei allerdings, dass der enzymatische Zellaufschluss verhältnismäßig lange dauert. Zu- dem sind verhältnismäßig teure Enzyme erforderlich, die in der Regel bei niedrigen Temperaturen gelagert werden müssen. Weiterhin muss die enzymatische Lyse in der Regel bei einer bestimmten Temperatur, üblicherweise bei einer erhöhten Temperatur, durchgeführt werden, da das jeweilige Enzym in der Regel ein bestimmtes Temperaturoptimum für seine maximale Aktivität aufweist. Demgegenüber nutzt die erfindungsgemäße Vorrichtung eine mechanische Lyse bzw. einen mechanischen Zellaufschluss unter Verwendung von Kügelchen. Es sind hierbei keine teuren Reagenzien, insbesondere keine teuren Enzyme erforderlich. Auch die Lagerung der Kügelchen ist im Gegensatz zur Lagerung von Enzymen ganz unproblematisch, da beispielsweise keine Lagerung bei niedrigen Temperaturen oder bei bestimmten Pufferbedingungen stattfinden muss. Auch der Zellaufschluss selbst ist weitestgehend unabhängig von der Temperatur, sodass für den Zellaufschluss keine bestimmte Temperatur eingestellt werden muss. Zudem ist der mechanische Zellaufschluss sehr schnell durchführbar, beispielsweise in weniger als 5 Minuten. Insgesamt erlaubt die erfindungsgemäße Vorrichtung mit dem mechanischen Zellaufschluss unter Verwendung von Kügelchen im Vergleich mit einem enzymatischen Zellaufschluss eine wesentlich schnellere, einfachere und kostengünstigere Durchführung des Zellaufschlusses.
Die erfindungsgemäße Vorrichtung mit dem mechanischen Aufschluss von Zellen unter Verwendung von Kügelchen eignet sich in besonders vorteilhafter Weise für im Allgemeinen schwer aufschließbare Zellen, wie beispielsweise Hefen, Sporen, Algen und andere. Diese Zellen sind oftmals sehr widerstandsfähig und einem enzymatischen Zellaufschluss kaum zugänglich. Durch die erfindungsgemäß vorgesehene Verwendung von Kügelchen für den mechanischen Aufschluss können diese Zellen ohne Weiteres aufgeschlossen werden. Darüber hinaus eignet sich die erfindungsgemäße Vorrichtung auch für den Aufschluss von Zellen jeder anderen Form, beispielsweise auch für gram-positive oder gramnegative Bakterien, sowie allgemein für Zellen pflanzlichen oder tierischen Ursprungs. Durch entsprechende Auslegung der Kügelchen kann die Vorrichtung auch für den Aufschluss von sehr schwer zugänglichen Zellen, beispielsweise pflanzlichen Zellen mit sehr festen Zellwänden eingerichtet werden.
Die Kügelchen selbst können aus verschiedenen Materialen gefertigt sein, sofern sie eine ausreichende Festigkeit aufweisen. Geeignet sind beispielsweise Kunststoffe, Keramiken, Metalle, Glas und/oder Silika. Der durchschnittliche Durch- messer der Kügelchen kann beispielsweise zwischen etwa 0,01 mm bis etwa 2 mm gewählt werden, abhängig von den jeweils aufzuschließenden Zellen. Es können auch Gemische mit Kügelchen eingesetzt werden, die unterschiedliche Durchmesser und/oder unterschiedliche Materialen aufweisen.
Die Kügelchen können in unterschiedlichen Positionen innerhalb der Vorrichtung vorgesehen sein. Beispielsweise können die Kügelchen in einer Kavität des oberen Körpers (Revolvers) enthalten sein. Dies kann z.B. eine Kavität sein, die zum Auftrag der Probe vorgesehen ist. Die Probe mit den Zellen wird hierbei also in die Kavität eingebracht, die die Kügelchen enthält. Wenn der Prozess gestartet wird, werden die Zellen in einen ersten Schritt mit Hilfe der Kügelchen aufgeschlossen, sodass anschließend die weitere Prozessierung der Probe stattfinden kann.
Einer oder mehrere der axial übereinander angeordneten Körper kann/können mehrteilig ausgestaltet sein und beispielsweise einen Deckel und eine Mischwanne umfassen, wobei der Deckel und die Mischwanne gegeneinander beweglich sein können. Der Deckel greift hierbei in das Volumen der Mischwanne ein und durch eine Auf- und Abbewegung von Deckel und Mischwanne gegeneinander, die durch die wirkenden Zentrifugalkräfte gesteuert wird, kann eine verstärkte Durchmischung in der Mischkammer stattfinden. In einer Ausgestaltung der erfindungsgemäßen Vorrichtung sind die Kügelchen in einer Kavität des Deckels enthalten. Durch eine Be- und Entschleunigung bei der Zentrifugation kann die Probe immer wieder durch den Deckel und in die Mischkammer gepumpt werden, wobei auch die Kügelchen in der Kavität des Deckels bewegt werden. Durch die hierbei verstärkt wirkenden Scheerkräfte erfolgt der Zellaufschluss in besonders effektiver Weise.
In einer weiteren Ausgestaltung der erfindungsgemäßen Vorrichtung können die Kügelchen in einer Kavität eines Körpers der Vorrichtung enthalten sein, die als
Mischkammer vorgesehen ist. Die Mischkammer selbst kann beispielsweise so eingerichtet sein, dass sie durch die wirkenden Zentrifugalkräfte oder gleichwirkenden Kräfte beweglich ist, um so eine Durchmischung zu erreichen. Durch die Anordnung der Kügelchen in der beweglichen Mischkammer werden daher die Kügelchen besonders stark bewegt, sodass der Zellaufschluss sehr effizient durchgeführt werden kann. Um den Zellaufschluss weiter zu optimieren, kann es vorgesehen sein, dass an verschiedenen Positionen innerhalb der erfindungsgemäßen Vorrichtung Kügel- chen enthalten sind. Beispielsweise können Kügelchen sowohl in der Probenauftragskammer als auch in der Mischkammer vorgesehen sein.
Bei einer herkömmlichen Vorrichtung der gattungsgemäßen Art ist es im Allgemeinen vorgesehen, dass Einrichtungen zum Öffnen der Kavitäten vorgesehen sind, um den Flüssigkeitsfluss zu bewerkstelligen. Die Einrichtungen zum Öffnen einer Kavität können z.B. als Folie ausgestaltet sein, die von einem darunterliegenden Dorn in Abhängigkeit von der Position der Körper zueinander durchstoßen wird. Erfindungsgemäß sind die Einrichtungen zum Öffnen der Kavität(en), die die Kügelchen enthält/enthalten, vorzugsweise so eingerichtet, dass die Kügelchen selbst nach dem Öffnen der Kavität die Kavität nicht verlassen und dass nur die Probe, also das Zelllysat, die Kavität verlässt und in die nachfolgende Kavität geleitet wird. Wenn beispielsweise ein Durchstoßen oder Aufreißen einer Folie zum Öffnen der Kavität vorgesehen ist, sind die aufzureißenden Bereiche vorzugsweise kleiner als die Kügelchen selbst, sodass die Kügelchen aus der jeweiligen Kavität nicht entweichen können und damit die weitere Prozessierung der Probe nicht stören.
In einer bevorzugten Ausgestaltung der erfindungsgemäßen Vorrichtung ist für die Verdrehung oder Verschiebung der Körper gegeneinander ein Eingriff von Führungsfedern des einen Körpers in eine Profilzahnreihe des anderen Körpers und eine entgegen der Zentrifugalkraft oder entgegen der gleichwirkenden Kraft wirkende Rückstellkraft der Körper vorgesehen. Durch eine Kombination dieses an sich bekannten Mechanismus (Kugelschreibermechanik) mit den erfindungsgemäß vorgesehenen Kügelchen in der Vorrichtung kann in besonders vorteilhafter Weise ein Zellaufschluss und eine nachfolgende Prozessierung der Probe in automatisierter Weise erfolgen, wobei der Zellaufschluss selbst sehr schnell, mit geringen Kosten und mit sehr einfacher und unkomplizierter Handhabung vonstatten gehen kann.
Die Erfindung umfasst weiterhin ein Verfahren zur Aufbereitung und/oder Prozessierung von biologischen Proben, wobei eine Vorrichtung verwendet wird, die wenigstens zwei axial übereinander angeordnete Körper mit jeweils wenigs- tens einer Kavität umfasst. Diese Körper sind in Abhängigkeit von einer Zentrifugalkraft oder einer gleichwirkenden Kraft gegeneinander verdrehbar oder verschiebbar und die verschiedenen Kavitäten der Körper sind miteinander fluidisch koppelbar. Es handelt sich hierbei insbesondere um ein bereits eingangs be- schriebenes gestapeltes mikrofluidisches System. Bei dem erfindungsgemäßen
Verfahren werden die Zellen mechanisch aufgeschlossen, indem in wenigstens einer der Kavitäten der verwendeten Vorrichtung Kügelchen enthalten sind. Bezüglich weiterer Merkmale der verwendeten Vorrichtung wird auf die obige Beschreibung verwiesen. Im Zuge des erfindungsgemäßen Verfahrens kann die Vorrichtung in den Rotor einer Zentrifuge eingesetzt werden. Der Zellaufschluss selbst erfolgt durch eine Be- und Entschleunigung der Zentrifuge. Vorzugsweise werden für den Zellaufschluss mehrere Zyklen der Be- und Entschleunigung durchgeführt. Die Be- und Entschleunigung der Zentrifuge bewirkt eine Bewegung der Kügelchen innerhalb der Vorrichtung, sodass durch die zwischen den Kügelchen und den Zellen wirkenden Scheerkräften der Zellaufschluss erfolgt.
Die Zellen werden gewissermaßen zwischen den Kügelchen zermahlen. Als Alternative zu den Zentrifugalkräften können gleichwirkende Kräfte ausgeübt werden, beispielsweise kann ein ähnlicher Effekt durch wiederholtes Anlegen eines Unterdrucks oder eines Überdrucks erzeugt werden.
Für das Be- und Entschleunigen wird vorzugsweise zwischen einer niedrigen Drehzahl und einer hohen Drehzahl der Zentrifuge gewechselt. Die niedrige Drehzahl kann beispielsweise in einem Beschleunigungsbereich zwischen 20 g und 600 g liegen. Die hohe Drehzahl kann beispielsweise in einem Beschleuni- gungsbereich zwischen 1000 g und 12.000 g liegen.
Weitere Merkmale und Vorteile der erfindungsgemäßen Vorrichtung und des erfindungsgemäßen Verfahrens ergeben sich aus der nachfolgenden Beschreibung von Ausführungsbeispielen im Zusammenhang mit den Zeichnungen. Hierbei können die einzelnen Merkmale jeweils für sich oder in Kombination miteinander verwirklicht sein.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
In den Zeichnungen zeigen: Fig. 1 Schnittdarstellung einer zentrifugierbaren Vorrichtung mit mehreren zueinander verdrehbaren Körpern (Revolver) aus dem Stand der Technik;
Fig. 2 isometrische Darstellung eines oberen Körpers (Revolver) als Bestandteil einer erfindungsgemäßen Vorrichtung;
Fig. 3A B isometrische Darstellung eines zweiten Körpers (Revolver) als Bestandteil der erfindungsgemäßen Vorrichtung in einer Ansicht schräg von der Seite (Fig. 3A) und in Aufsicht (Fig. 3B) und
Fig. 4A B isometrische Darstellung von Komponenten des zweiten Körpers
(Revolver) als Bestandteil einer erfindungsgemäßen Vorrichtung, bestehend aus Deckel und Mischwanne in einer Ansicht schräg von der Seite (Fig. 4A) und als Ansicht der Mischwanne von unten (Fig. 4B).
Beschreibung von Ausführungsbeispielen
Fig. 1 zeigt in schematischer Weise ein System zur automatischen
Prozessierung von biochemischen Prozessen aus dem Stand der Technik, das auf mehreren axial übereinander angeordneten Körpern (Revolvern) 10, 20, 30 beruht, die gegeneinander verdrehbar sind. Die Körper 10, 20, 30 umfassen verschiedene Kavitäten 1 1 , 12, 21 , 22, 31 , 32, 33, die als Behältnisse und Reaktionsräume dienen. Die Vorrichtung kann beispielsweise für eine
Proteinaufreinigung eingesetzt werden. In den Kavitäten 1 1 werden Reagenzien vorgehalten. In die Kavität 12 wird die Probe eingebracht. Die Kavität 21 stellt eine Mischkammer dar. Die Kavität 22 enthält eine Matrix-basierte Säule, mit der die eigentliche Proteinaufreinigung erfolgt. Die Kavität 31 ist für den Abfall aus Waschschritten an der Säule vorgesehen. In der Kavität 32 wird das Eluat der Säule aufgefangen. In einer anschließenden Reaktionskammer 33 kann das aufgereinigte Protein mit einer biochemischen Reaktion nachgewiesen werden, wobei ein Detektor 40, der sich außerhalb der Vorrichtung befindet, eingesetzt werden kann. Die Körper 10, 20, 30 befinden sich in gestapelter Weise innerhalb eines Gehäuses in Form eines Zentrifugenröhrchens 50, das mit einem Deckel 51 verschließbar ist. Das Zentrifugenröhrchen 50 wird in den Rotor einer Labor- Zentrifuge eingesetzt. Durch die wirkenden Zentrifugalkräfte verdrehen sich die Körper 10, 20, 30 in vorgegebener Weise gegeneinander, insbesondere über eine integrierte Kugelschreibermechanik. Der Transport von Probe und Reagenzien vom obersten Revolver 10 bis zum untersten Revolver 30 erfolgt durch die Zentrifugalkraft. Hierbei kann es vorgesehen sein, dass durch Dorne oder ähnliches an den Körpern 20, 30 die darüberliegenden Kavitäten geöffnet werden. Der Fluidfluss erfolgt in vorgegebener Weise, sodass die Probe aus der Kavität 12 in vorbestimmter Weise die verschiedenen Prozessierungsschritte durchläuft. Um mit einer solchen Vorrichtung beispielsweise ein intrazelluläres Protein aufreinigen zu können, müssen die Zellen, die dieses Protein exprimieren, zunächst aufgeschlossen werden. Herkömmlicherweise kann dies beispielsweise vorab erfolgen, indem die Zellen außerhalb der Vorrichtung beispielsweise en- zymatisch oder chemisch behandelt werden, sodass das resultierende Zelllysat dann in die Kavität 12 eingebracht werden kann, um weiter prozessiert zu werden. Eine andere herkömmliche Möglichkeit ist, dass in einer solchen Vorrichtung ein Enzym, das zum Lysieren der Zellen geeignet ist, vorgehalten wird. Ein entsprechendes Enzym kann beispielsweise in der Kavität 12 enthalten sein. Wenn dann die Probe, die die Zellen enthält, in die Kavität 12 eingebracht wird, findet unter bestimmten Bedingungen eine Zelllyse, d.h. also ein Zellaufschluss, statt.
Hierbei ist allerdings zu beachten, dass das Temperaturoptimum des jeweiligen Enzyms zu berücksichtigen ist. In der Regel ist eine höhere Temperatur für die enzymatische Aktivität erforderlich. Weiterhin ist zu beachten, dass die Stabilität des Enzyms bei der Lagerung einer derartigen Vorrichtung zu berücksichtigen ist, wobei in der Regel eine Stabilität des Enzyms nur bei ausreichend tiefen
Temperaturen gewährleistet ist. Um diese verschiedenen Probleme und Nachteile zu vermeiden, sieht die erfindungsgemäße Vorrichtung vor, eine derartige Vorrichtung mit Beads bzw. Kügelchen auszustatten, um einen mechanischen Zellaufschluss durchführen zu können. Dieser mechanische Zellaufschluss basiert darauf, dass die Zellen zwischen den Kügelchen„zermahlen" werden, wobei
Scheerkräfte wirken, die zu einer Zerstörung der Zellmembranen und/oder Zellwände führen. Auf diese Weise kann der Zellaufschluss sehr einfach, unkompliziert und schnell sowie in automatisierter Weise durchgeführt werden. Es sind keine kostenintensiven Enzyme erforderlich. Weiterhin müssen keine bestimmten Temperaturen zum einen für die Lagerung der Enzyme und zum anderen für deren optimale enzymatische Aktivität berücksichtigt werden. Das Zellmaterial kann damit in sehr vorteilhafter Weise durch die Kügelchen im Zuge der Prozessierung innerhalb der erfindungsgemäßen Vorrichtung, die durch die Zentrifugalkraft oder eine gleichwirkende Kraft gesteuert wird, aufgeschlossen werden. Geeignete Kügelchen können beispielsweise aus Kunststoffen, Keramiken,
Metallen und/oder Silika bestehen. Die Kügelchen können je nach Anwendung einen durchschnittlichen Durchmesser von beispielsweise 0,01 mm bis 2 mm aufweisen. Die Kügelchen können in verschiedenen Bereichen und Positionen innerhalb der erfindungsgemäßen Vorrichtung vorgesehen sein.
Fig. 2 zeigt ein Beispiel der erfindungsgemäßen Vorrichtung, bei dem die Kügelchen 1000 in einer Kavität 101 des oberen Revolvers 100 enthalten sind. Der Revolver 100 weist insgesamt acht Kavitäten 101 bis 108 auf. Die Kavität 101 ist hierbei die sogenannte Probenkammer, in die die biologische Probe, also insbe- sondere die in einer Flüssigkeit enthaltenen Zellen, eingebracht wird. In der
Kammer 101 befinden sich die Kügelchen 1000, hier angedeutet durch einen Pfeil und mehrere ausgefüllte Kreise.
Am äußeren Umfang des Revolvers 100 befinden sich verschiedene Profile 1 10, 1 1 1 , die Bestandteil der Kugelschreibermechanik sind, mittels derer der Revolver
100 und weitere, in einer Vorrichtung nachfolgend angeordnete Körper bzw. Revolver gegeneinander verdrehbar sind.
Zur Durchführung des Zellaufschlusses in der Probenkammer 101 wird vor dem Starten der Prozessierung die Probe, die Zellmaterial oder beispielsweise Sporenmaterial enthält, in die Kammer 101 eingebracht. Im Zuge der Prozessierung vermischen sich die Kügelchen mit den Zellen der Probe, sodass die wirkenden Scheerkräfte den Aufschluss der Zellen bewirken. Dieser Schritt wird durch das Be- und Entschleunigen der Zentrifuge, beispielsweise durch einen Wechsel zwi- sehen 40 g und 6000 g, gesteuert. Wenn die Zellen ausreichend aufgeschlossen sind, kann die Probenkammer 101 insbesondere im unteren Bereich geöffnet werden, um die aufgeschlossene bzw. lysierte Probe weiter verarbeiten zu können. Beispielsweise kann eine Folie, z. B. eine Alufolie, vorgesehen sein, die die Kavität 101 nach unten abschließt. Diese Folie wird durch einen Dorn eines da- runter angeordneten Revolvers aufgestochen oder aufgerissen, sodass das
Zelllysat zur weiteren Verarbeitung freigesetzt wird. Ein hierfür geeignetes Zentrifugenprotokoll kann beispielsweise gemäß dem folgenden Schema durchgeführt werden. Die Probe und die Kügelchen werden durch Zyklieren der Drehzahlen vermischt, wobei Beschleunigungen zwischen 20 g und 600 g und zwischen 1000 g und 12.000 g eingesetzt werden. Die Haltezeiten bei der jeweiligen Zieldrehzahl können 1 s oder länger betragen, wobei nicht das Halten bei einer bestimmten Drehzahl, sondern das Zyklieren zwischen den beiden Drehzahlen für das Mischen und die wirkenden Scheerkräfte wichtig sind. Die untere Drehzahl kann beispielsweise zur Erreichung einer Beschleunigung von 200 g und die obere Drehzahl zur Erreichung einer Beschleunigung von 2000 g eingestellt werden. Es können zwischen 1 und beispielsweise 500 Zyklen durchgeführt werden, geeignet sind insbesondere 20 bis 200 Zyklen. Gute Ergebnisse werden beispielsweise bereits mit 100 Zyklen erreicht. Um nun die Folie der Kavität 101 im Revolver 100 zur Freisetzung der lysierten Probe anzustechen, wird die Zentrifuge zunächst auf 6000 g beschleunigt und dort kurz gehalten, beispielsweise 1 s bis 1 min, um dann wieder auf 40 g herunterzubeschleunigen. Im Allgemeinen ist es ausreichend, wenn unter 200 g herunterbeschleunigt wird. Hierdurch wird die Kugelschreibermechanik aktiviert, sodass die Alufolie der Kavität 101 im Revolver 100 angestochen wird und das Zelllysat die Probenkammer 101 verlassen kann. Die verschiedenen beispielhaften Prozessschritte für die Lyse bzw. den Zellaufschluss und für ein nachfolgendes Protokoll zur Proteinreinigung mittels einer Säulenchromatographie sind nachfolgend aufgeführt:
Prozessschritt Drehzahl bzw. BeZyklus-Zahl schleunigung (g)
z.B. 200 g für 10 s; 2000 g für 10
Lyse 100
s
Anstechen Revolver 1 6000 g für 30 s 1
Freilassen des Lysats zu 1
40 g für 30 s
Revolver 2 und Kugelschreibermechanik
Anstechen des Revolvers 600 g für 30 s; 40 g für 30 s 1
1 um das lysierte Probenmaterial mit z.B. Bindepuffer zu mischen
Mischen 500 g für 5 s; 5000 g für 5 s 20
600 g für 30 s; 40 g für 30 s
Binden auf die Säule 1
Freisetzen Wasch puffer 1 600 g für 30 s; 40 g für 30 s 2
und 2
Trockenschleudern der 6000 g 5 min
Säule Freisetzen 600 g für 30 s; 40 g für 30 s 1
Elutionsflüssigkeit aus
Revolver 1
Elution 6000 g 3 min
In einer anderen Ausgestaltung kann der Zellaufschluss auch in einem nachfolgenden Revolver erfolgen, wobei unter„nachfolgend" zu verstehen ist, dass der nachfolgende Revolver in Flussrichtung gesehen unterhalb des ersten Revolvers angeordnet ist. Fig. 3A illustriert einen Revolver 200, der in einer erfindungsgemäßen Vorrichtung unterhalb des Revolvers 100 angeordnet ist. Am äußeren Umfang weist der Revolver 200 in diesem Beispiel vier nach oben ragende Führungsfedern 21 1 auf, die in die Profilzahnreihe 1 1 1 des Revolvers 100 eingreifen können, sodass mittels der Kugelschreibermechanik ein vorgebbares Verdrehen, abhängig von der wirkenden Zentrifugalkraft, der Revolver 100 und 200 zueinander realisiert werden kann. Der Revolver 200 ist mehrteilig ausgestaltet, wobei der obere Teil des Revolvers 200 einen Deckel 210 (Dorndeckel) für eine darunterliegende Mischwanne 230 (Mischkammer) bildet, die anhand von Fig. 4 näher erläutert werden wird. Auf dem Dorndeckel 210 befinden sich mehrere vorstehende Dorne 212, 213 und 214. Ein Öffnen der Kavitäten des darüberliegenden Revolvers 100, beispielsweise ein Öffnen der Probenkammer 101 , kann durch die Dorne 212, 213 und 214 erfolgen, wobei diese Dorne beispielsweise eine Folie durchstoßen können, die die Kavitäten in dem oberen Revolver 100 nach unten abschließen. Das Öffnen erfolgt bei entsprechender Drehung der Körper (Revolver) zueinander, sodass ein vorgegebener Flüssigkeitsfluss aus einer Ka- vität des oberen Revolvers in eine Kavität des darunterliegenden Revolvers erreicht wird. Diese mechanische Kopplung der Kavitäten wird durch die jeweils eingestellte Zentrifugalkraft gesteuert, wobei die entsprechende Drehung der Körper zueinander durch die bereits erwähnte Kugelschreibermechanik und eine rückstellende Federkraft ausgelöst werden kann. Fig. 3B zeigt eine Aufsicht auf den Dorndeckel 210. Der Deckel 210 weist eine Vertiefung 220 (Kavität) auf, die in das Volumen der darunterliegenden Mischwanne eingreift. Eine Öffnung 221 in der Kavität 220 erlaubt einen Flüssigkeitsfluss zwischen der Kavität 220 und der darunterliegenden Mischwanne. Innerhalb der Vertiefung 220 befinden sich in dieser Ausführungsform der erfindungsgemäßen Vorrichtung die Kügelchen 2000, die erfindungsgemäß zum Zellaufschluss verwendet werden. Während der Prozessierung der biologischen Probe gelangt die Probe aus einer Kavität aus einem darüberliegenden Revolver in die Vertiefung 220. Die Kavität des darüber- liegenden Revolvers kann beispielsweise mit dem Dorn 214 angestochen werden. Die Kugelschreibermechanik der Revolver 100 und 200 ist so ausgestaltet, dass sich mittels der Zentrifugalkraft der Revolver 200 in Abhängigkeit von der wirkenden Beschleunigung auf- und abbewegt. Diese Auf- und Abbewegung wird durch eine Federkraft bewirkt, die entgegen der Zentrifugalkraft wirkt. Hierfür kann im unteren Bereich des Revolvers 200 eine Feder angeordnet sein. Durch die Auf- und Abbewegung wird die Flüssigkeit immer wieder durch den Deckel 210 gepumpt, wobei die Flüssigkeit die Öffnung 221 jeweils passiert. Die Kügel- chen 2000 bewegen sich durch die Be- und Entschleunigung ebenfalls, sodass der Zellaufschluss durch das Zermahlen der Zellen und die wirkenden
Scheerkräfte bewerkstelligt wird.
Diese Ausgestaltung hat den Vorteil, dass hierbei eine Auf- und Abbewegung des Deckels 210 des Revolvers 200 und einer darunterliegenden Mischkammer genutzt wird, um eine weitere Durchmischung der Kügelchen und der aufzuschließenden Zellen zu erreichen, um so den Zellaufschluss noch effizienter gestalten zu können. Durch das federbetriebene System entstehen durch das Gegeneinanderschieben des Dorndeckels 210 und der darunterliegenden Mischwanne turbulente Strömungen und damit vermehrte Scheerkräfte, die den Zellaufschluss unterstützen. Das Mischen kann hierbei z.B. durch Zyklieren zwischen Drehzahlen im Beschleunigungsbereich von 40 g bis 500 g und im Beschleunigungsbereich von 4000 g bis 6000 g, beispielsweise mit 100 g und 5500 g oder mit 500 g und 5000 g, stattfinden. Es kann vorzugsweise mehrfach zwischen den Drehzahlen gewechselt werden. Beispielsweise können 1 bis 500 Zyklen durchgeführt werden, bevorzugt sind 20 bis 200 Zyklen, wobei beispielsweise 100 Zyklen sehr gute Ergebnisse liefern. Nachfolgend ist ein beispielhaftes Protokoll für die Aufreinigung von DNA aus bakteriellen Zellen aufgeführt, wobei die Zellen in der Mischkammer, die erfindungsgemäß die Kügelchen enthält, aufgeschlossen werden. Als Zellmaterial können beispielsweise Escherichia coli oder andere gramnegative Bakterien eingesetzt werden. Das Protokoll ist jedoch auch auf andere Zellen und insbesondere auf andere Bakterien übertragbar. Prozessschritt Drehzahl bzw. BeZyklus-Zahl schleunigung (g)
Anstechen Revolver 1 600 g für 30 s; 40 g für 30 s 1
(Probe wird in die Mischkammer in Revolver 2
gebracht)
Mischen in Mischkammer in 500 g für 5 s; 5000 g für 5 s 100
Revolver 2
Anstechen des Revolvers 600 g für 30 s; 40 g für 30 s 1
1 um das lysierte Probenmaterial mit z.B. Bindepuffer zu mischen
Mischen 500 g für 5 s; 5000 g für 5 s 20
Binden auf die Säule 600 g für 30 s; 40 g für 30 s 1
Freisetzen Wasch puffer 1 600 g für 30 s; 40 g für 30 s 2
und 2
Trockenschleudern der 6000 g 5 min
Säule
Freisetzen 600 g für 30 s; 40 g für 30 s 1
Elutionsflüssigkeit aus
Revolver 1
Elution 6000 g 3 min
Fig. 4 zeigt ein weiteres Beispiel für die Positionierung der Kügelchen. In diesem Beispiel ist wieder der Revolver 200 gezeigt, der sich in einen oberen Teil, den Dorndeckel 210, und in einen unteren Teil, die sogenannte Mischwanne 230, untergliedert. Der Deckel 210 ist so ausgestaltet, dass er in das innere Volumen der Mischwanne 230 eingreift. Durch eine federbasierte Mechanik bewegen sich Deckel 210 und Mischwanne 230 gegeneinander. Diese Auf- und Abbewegung wird durch die wirkende Zentrifugalbeschleunigung ausgelöst. Die Kügelchen 3000 befinden sich in der Mischwanne 230. Wenn die Probe mit den aufzuschließenden Zellen in die Mischwanne 230 gelangt, wird durch die Auf- und Abbewegung von Deckel 210 und Mischwanne 230 eine besonders gute Durchmischung der Kügelchen mit der Probe bzw. mit den darin enthaltenen Zellen erreicht. Durch die wirkenden Scheerkräfte wird der Zellaufschluss bewirkt. Der Pfeil 1 deutet die Richtung der Zentrifugalbeschleunigung an. Fig. 4B zeigt die Mischwanne 230 in einer Ansicht schräg von unten. Zu erkennen ist die gedeckelte Öffnung 231 , die zum Eluieren bzw. zum Durchtritt des Zelllysats nach dem Zellaufschluss vorgesehen ist. Das Loch 231 kann beispielsweise mittels einer Folie verschlossen sein, die geöffnet werden kann, indem sie von einem darunterliegenden Dorndeckel durchstoßen oder aufgerissen wird. Vorzugsweise ist die Öffnung oder sind die Öffnungen, die zum Durchtritt des Zelllysats vorgesehen sind, im Durchmesser kleiner als die Kügelchen, sodass die Kügelchen 3000, die sich in der Mischwanne 230 befinden, nicht mit durchtreten können und nicht die nachfolgende Aufbereitungsschritte stören. Alternativ können auch mehrere Öffnungen 231 am Boden der Mischwanne 230 vorgesehen sein. Weiterhin können alternativ oder zusätzlich eine oder mehrere Sollbruchstellen vorgesehen sein, die in vergleichbarer Weise einen Durchtritt des Zelllysats ermöglichen.
In weiteren Ausgestaltungen der erfindungsgemäßen Vorrichtung kann es vorge- sehen sein, dass die Kügelchen an verschiedenen Positionen innerhalb der erfindungsgemäßen Vorrichtung vorgesehen sind, beispielsweise in der Probenkammer oder Auftragskammer in einem oberen Revolver und zusätzlich in einer Mischkammer in einem nachfolgenden Revolver.

Claims

Ansprüche
1 . Vorrichtung zur Aufbereitung und/oder Prozessierung von biologischen Proben, wobei die Vorrichtung wenigstens zwei axial übereinander angeordnete Körper (100, 200) mit jeweils wenigstens einer Kavität (101 , 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 220, 230) aufweist und wobei die Körper in Abhängigkeit von einer Zentrifugalkraft oder einer gleichwirkenden Kraft gegeneinander verschiebbar oder verdrehbar sind und wobei die Kavitäten miteinander fluidisch koppelbar sind, dadurch gekennzeichnet, dass in wenigstens einer der Kavitäten (101 , 220, 230) Kügelchen (1000, 2000, 3000) enthalten sind.
2. Vorrichtung nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass die Kügelchen (1000, 2000, 3000) zum mechanischen Aufschluss von Zellen in der biologischen Probe vorgesehen sind.
3. Vorrichtung nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Kügelchen (1000, 2000, 3000) aus Kunststoffen und/oder Keramiken und/oder Metallen und/oder Glas und/oder Silika bestehen.
4. Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Kügelchen (1000, 2000, 3000) einen Durchmesser zwischen etwa 0,01 mm bis etwa 2 mm aufweisen.
5. Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, das die Kügelchen (1000) in einer Kavität (101 ) enthalten sind, die zum Auftragen der Probe vorgesehen ist.
6. Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass wenigstens ein Körper (200) mehrteilig mit einem Deckel (210) und einer Mischkammer (230) ausgebildet ist, wobei Deckel (210) und Mischkammer (230) gegeneinander beweglich sind und wobei die Kügelchen (2000) in einer Kavität (220) enthalten sind, die in dem Deckel (210) angeordnet ist.
Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Kügelchen (3000) in einer Kavität (230) enthalten sind, die als Mischkammer vorgesehen ist.
Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Vorrichtung Einrichtungen (212, 213, 214, 231 ) zum Öffnen der Kavität (101 , 220, 230) mit den Kügelchen (1000, 2000, 3000) aufweist, wobei die Einrichtungen zum Öffnen der Kavität vorzugsweise so eingerichtet sind, dass die Kügelchen nach dem Öffnen der Kavität die Kavität nicht verlassen.
Vorrichtung nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Einrichtungen (231 ) zum Öffnen der Kavität eine durchstoßbare Folie umfassen.
0. Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass für die Verschiebung oder Verdrehung der Körper (200, 300) gegeneinander ein Eingriff von Führungsfedern (21 1 ) des einen Körpers (200) in eine Profilzahnreihe (1 1 1 ) des anderen Körpers (100) und eine entgegen der Zentrifugalkraft oder entgegen der gleichwirkenden Kraft wirkende Rückstellkraft der Körper vorgesehen ist.
1 . Verfahren zur Aufbereitung und/oder Prozessierung von biologischen Proben unter Verwendung einer Vorrichtung mit wenigstens zwei axial übereinander angeordnete Körpern (100, 200), die jeweils wenigstens eine Kavität (101 , 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 220, 230) aufweisen und wobei die Körper in Abhängigkeit von einer Zentrifugalkraft oder einer gleichwirkenden Kraft gegeneinander verschiebbar oder verdrehbar sind und wobei die Kavi- täten miteinander fluidisch koppelbar sind, dadurch gekennzeichnet, dass zum Aufschluss von Zellen in der biologischen Probe Kügelchen (1000, 2000, 3000) eingesetzt werden, die in wenigstens einer der Kavitäten (101 , 220, 230) enthalten sind.
12. Verfahren nach Anspruch 1 1 , dadurch gekennzeichnet, dass die verwendete Vorrichtung wenigstens eines der Merkmale gemäß einem der Ansprüche 2 bis 10 aufweist.
13. Verfahren nach Anspruch 1 1 oder Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass die Vorrichtung in den Rotor einer Zentrifuge eingesetzt wird und dass die Zentrifuge für den Zellaufschluss be- und entschleunigt wird, wobei vorzugsweise mehrere Zyklen der Be- und Entschleunigung durchgeführt werden.
14. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass zum Be- und Entschleunigen zwischen einer niedrigen Drehzahl und einer hohen Drehzahl gewechselt wird, wobei vorzugsweise die niedrige Drehzahl in einem Beschleunigungsbereich zwischen 20 g und 600 g und die hohe Drehzahl in einem Beschleunigungsbereich zwischen 1000 g und 12.000 g liegt.
15. Verfahren nach Anspruch 1 1 oder Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass die Vorrichtung durch wiederholtes Anlegen eines Unterdrucks und/oder eines Überdrucks betätigt wird.
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