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Die vorliegende Erfindung betrifft eine Vorrichtung zur Aufbereitung und/oder Prozessierung von biologischen Proben, wobei die Vorrichtung wenigstens zwei axial übereinander angeordnete Körper mit jeweils wenigstens einer Kavität aufweist und wobei die Körper in Abhängigkeit von einer Zentrifugalkraft oder einer gleichwirkenden Kraft gegeneinander verschiebbar oder verdrehbar sind. Weiterhin betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Aufbereitung und/oder Prozessierung von biologischen Proben unter Verwendung einer derartigen Vorrichtung.
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Stand der Technik
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Die Aufbereitung und Prozessierung von biologischen Proben, beispielsweise im Zusammenhang mit der Aufreinigung und/oder Anreicherung bestimmter Moleküle oder mit der Analyse und Charakterisierung bestimmter Moleküle, basiert im Wesentlichen auf der Handhabung von Flüssigkeiten. Herkömmlicherweise werden hierzu verschiedene Hilfsmittel, insbesondere Pipetten und verschiedene Reaktionsgefäße, eingesetzt, um bei einer manuellen Handhabung unter Zuhilfenahme verschiedener Laborgeräte die verschiedenen Prozesse durchführen zu können. In vielen Bereichen der Biologie und Biochemie und insbesondere auch in der medizinischen Forschung und Diagnostik wird eine Analyse von biologischem Zellmaterial durchgeführt. Beispielsweise werden Proteine und andere Bestandteile einer biologischen Zelle untersucht und charakterisiert.
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Um die in einer Probe enthaltenen Proteine, Nukleinsäuren oder anderes Material untersuchen zu können, ist es oftmals erforderlich, die in der Probe enthaltenen biologischen Zellen aufzubrechen. Für das Aufbrechen der Zellen, das auch allgemein als Lyse bezeichnet wird, sind verschiedene Methoden bekannt. Hierbei müssen die Zellmembranen und im Fall von pflanzlichen Zellen auch die Zellwände zerstört werden. Beispielsweise ist eine enzymatische Lyse von Zellen sehr verbreitet, bei der die Zellmembranen enzymatisch abgebaut werden. Hierfür können beispielsweise die Enzyme Proteinase K oder Lysozym verwendet werden. Weiterhin können organische Lösungsmittel, beispielsweise Natronlauge, eingesetzt werden, um auf chemische Weise die Zellen aufzuschließen. Eine Lyse kann weiterhin durch Verwendung von EDTA (Ethylendiamintetraessigsäure) bewirkt werden, wobei EDTA als Komplexbildner wirkt. Weiterhin können biologische Zellen auch mechanisch aufgeschlossen werden, beispielsweise durch eine Homogenisierung unter großem Druck (French-Press), durch Einsatz von Ultraschall, durch wiederholtes Einfrieren und Auftauen oder durch elektromagnetische Strahlen. Eine weitere Möglichkeit zum mechanischen Aufschluss von biologischen Zellen ist die Verwendung von sogenannten Kugelmühlen, bei denen eine Zerstörung der Zellen durch Scheerkräfte erreicht wird, die bei dem „Mahlen“ der Zellen zwischen kleinen Kügelchen (Beads) entstehen.
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Insgesamt sollte ein Zellaufschluss schnell und effizient erfolgen. Das gewählte Verfahren sollte so ausgelegt sein, dass Zellmembranen und Zellwände auf der einen Seite zuverlässig zerstört werden. Auf der anderen Seite sollten die zellulären Bestandteile, die das jeweilige „Zielprodukt“ des durchzuführenden Prozesses darstellen, nicht zerstört werden. Es sollte also beispielsweise keine weitergehende Denaturierung, Proteolyse oder Oxidation von Molekülen stattfinden.
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Für viele biochemische Prozessierungen sind bereits Automatisierungen verfügbar, wobei beispielsweise Pipettierroboter oder andere Spezialgeräte zum Einsatz kommen. Weiterhin können mit sogenannten Lab-on-a-Chip-Systemen viele biochemische Prozesse in voll automatisierter Weise durchgeführt werden. Labon-a-Chip-Systeme sind mikrofluidische Systeme, die die gesamte Funktionalität eines makroskopischen Labors auf einem nur etwa plastikkartengroßen Kunststoffsubstrat vereinigen. Neben dem Kunststoffsubstrat mit verschiedenen Kanälen, Reaktionskammern usw. sind vorgelagerten Reagenzien und verschiedene aktive Komponenten, wie beispielsweise Ventile oder Pumpen, sowie weitere Aktuations-, Detektions- und Steuereinheiten erforderlich.
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Weiterhin sind kartuschenbasierte Systeme bekannt, wobei die Flüssigkeiten typischerweise in einem Spezialgerät in einer Kartusche prozessiert werden. Beispielsweise beschreibt die deutsche Offenlegungsschrift
DE 10 2010 003 223 A1 ein System mit einer Vorrichtung, die zum Einsetzen in einen Zentrifugationsrotor vorgesehen ist. Hierbei sind zwei oder mehr revolverartige Körper axial übereinander angeordnet. Die Revolver beinhalten dabei ein oder mehrere Kavitäten, insbesondere Reaktionskammern und Kanäle, und gegebenenfalls weitere Strukturen für die Durchführung von Prozessen, insbesondere von fluidischen Einheitsoperationen. Ein Beschleunigungswechsel der Zentrifuge aktiviert eine integrierte Mechanik, die nach Art einer Kugelschreibermechanik funktioniert. Infolge der Zentrifugalkraft bewegen sich die Körper radial nach außen, wobei die Körper mittels einer Verzahnung und einem integrierten Rückstellmittel gegeneinander verschoben oder verdreht werden. Einzelne Kavitäten können hierdurch miteinander verschaltet werden. Darüber hinaus ist ein orientierungsabhängiges Öffnen von einzelnen Kavitäten oder Gefäßen in den Körpern möglich, wobei eine Seite der Kavität oder des Gefäßes beispielsweise mit einer durchstechbaren Folie versehen ist. Mit Hilfe eines Dorns auf einem anderen Körper wird die Folie durch die Bewegung der Körper gegeneinander durchstoßen. Auf diese Weise kann eine kontrollierte Fluidführung in der Vorrichtung erreicht werden. Beispielsweise kann eine Fluidführung von Vorlagerungskammern über zwischengeschaltete Prozessierungskammern bis hin zu Auffangkavitäten für die prozessierten Flüssigkeiten realisiert werden. Ein derartiges System kann zum Beispiel zur Aufreinigung von biologischen oder biochemischen Molekülen genutzt werden. Hierfür werden im obersten Revolver die Probe und alle zur Aufreinigung benötigten Reagenzien eingesetzt. Die darunterliegenden Revolver dienen als Reaktionsstufen für die verschiedenen Fest- oder Flüssigphasenreaktionen. Der Transport von Probe und Reagenzien vom obersten zum untersten Revolver erfolgt durch die Zentrifugalkraft einer Standard-Laborzentrifuge, indem die Flüssigkeiten entlang des Kraftvektors der Zentrifugalkraft von radial innenliegenden Punkten zu radial außenliegenden Punkten transportiert werden.
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Offenbarung der Erfindung
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Vorteile der Erfindung
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Die erfindungsgemäße Vorrichtung dient zur Aufbereitung und/oder Prozessierung von biologischen Proben, wobei innerhalb der Vorrichtung ein mechanischer Aufschluss von Zellen in der biologischen Probe erfolgen kann. Mit dem hier verwendeten Begriff „Zellen“ sind in erster Linie biologische Zellen und insbesondere prokaryontische Zellen und eukaryontische Zellen pflanzlichen oder tierischen Ursprungs sowie auch Pilzzellen gemeint. Weiterhin ist hiermit auch Zellmaterial in Form von beispielsweise Geweben und/oder Organen umfasst. Der Begriff „Zellen“ umfasst im weiteren Sinne aber auch anderes Material, wie z.B. Viren oder Sporen oder andere Überdauerungsformen oder Erscheinungsformen von Lebewesen.
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Die erfindungsgemäße Vorrichtung umfasst wenigstens zwei axial übereinander angeordnete Körper mit jeweils wenigstens einer Kavität. Die Körper sind in Abhängigkeit von einer Zentrifugalkraft oder einer gleichwirkenden Kraft gegeneinander verschiebbar oder verdrehbar, wobei die Kavitäten der übereinander angeordneten Körper miteinander fluidisch koppelbar sind. Die Körper sind beispielsweise als sogenannte Revolver ausgestaltet. Die erfindungsgemäße Vorrichtung umfasst neben den wenigstens zwei axial übereinander angeordneten bzw. gestapelten Körpern ein Gehäuse, das die gestapelten Körper aufnimmt. Das Gehäuse ist insbesondere so ausgestaltet, dass es in die Halterung eines Rotors einer Zentrifuge eingesetzt werden kann. Das Gehäuse kann beispielsweise die Form eines üblichen Zentrifugenröhrchens aufweisen. Der Transport von Flüssigkeiten durch die übereinander angeordneten Körper erfolgt in vorgebbarer Weise durch Ausnutzung der Zentrifugalkraft oder einer gleichwirkenden Kraft. Insbesondere handelt es sich um eine mikrofluidische Anordnung. Erfindungsgemäß sind in wenigstens einer der Kavitäten dieser Vorrichtung Kügelchen (Beads) enthalten. Mit Hilfe dieser Beads erfolgt ein mechanischer Aufschluss der Zellen, die in der Probe enthalten sind. Hierbei werden die biologischen Zellen zwischen den Kügelchen gewissermaßen zermahlen, wobei Scheerkräfte wirken, die zu einer Zerstörung der Zellmembranen und/oder Zellwände führen. Die Kügelchen, die erfindungsgemäß in der Vorrichtung enthalten sind, sind daher so ausgestaltet, dass sie für diesen Zweck geeignet sind. Insbesondere weisen sie eine ausreichende Festigkeit auf, damit die erforderlichen Scheerkräfte entstehen können. In bisherigen vergleichbaren Systemen werden die Zellen üblicherweise enzymatisch aufgeschlossen. Nachteilig ist hierbei allerdings, dass der enzymatische Zellaufschluss verhältnismäßig lange dauert. Zudem sind verhältnismäßig teure Enzyme erforderlich, die in der Regel bei niedrigen Temperaturen gelagert werden müssen. Weiterhin muss die enzymatische Lyse in der Regel bei einer bestimmten Temperatur, üblicherweise bei einer erhöhten Temperatur, durchgeführt werden, da das jeweilige Enzym in der Regel ein bestimmtes Temperaturoptimum für seine maximale Aktivität aufweist. Demgegenüber nutzt die erfindungsgemäße Vorrichtung eine mechanische Lyse bzw. einen mechanischen Zellaufschluss unter Verwendung von Kügelchen. Es sind hierbei keine teuren Reagenzien, insbesondere keine teuren Enzyme erforderlich. Auch die Lagerung der Kügelchen ist im Gegensatz zur Lagerung von Enzymen ganz unproblematisch, da beispielsweise keine Lagerung bei niedrigen Temperaturen oder bei bestimmten Pufferbedingungen stattfinden muss. Auch der Zellaufschluss selbst ist weitestgehend unabhängig von der Temperatur, sodass für den Zellaufschluss keine bestimmte Temperatur eingestellt werden muss. Zudem ist der mechanische Zellaufschluss sehr schnell durchführbar, beispielsweise in weniger als 5 Minuten. Insgesamt erlaubt die erfindungsgemäße Vorrichtung mit dem mechanischen Zellaufschluss unter Verwendung von Kügelchen im Vergleich mit einem enzymatischen Zellaufschluss eine wesentlich schnellere, einfachere und kostengünstigere Durchführung des Zellaufschlusses.
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Die erfindungsgemäße Vorrichtung mit dem mechanischen Aufschluss von Zellen unter Verwendung von Kügelchen eignet sich in besonders vorteilhafter Weise für im Allgemeinen schwer aufschließbare Zellen, wie beispielsweise Hefen, Sporen, Algen und andere. Diese Zellen sind oftmals sehr widerstandsfähig und einem enzymatischen Zellaufschluss kaum zugänglich. Durch die erfindungsgemäß vorgesehene Verwendung von Kügelchen für den mechanischen Aufschluss können diese Zellen ohne Weiteres aufgeschlossen werden. Darüber hinaus eignet sich die erfindungsgemäße Vorrichtung auch für den Aufschluss von Zellen jeder anderen Form, beispielsweise auch für gram-positive oder gram-negative Bakterien, sowie allgemein für Zellen pflanzlichen oder tierischen Ursprungs. Durch entsprechende Auslegung der Kügelchen kann die Vorrichtung auch für den Aufschluss von sehr schwer zugänglichen Zellen, beispielsweise pflanzlichen Zellen mit sehr festen Zellwänden eingerichtet werden.
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Die Kügelchen selbst können aus verschiedenen Materialen gefertigt sein, sofern sie eine ausreichende Festigkeit aufweisen. Geeignet sind beispielsweise Kunststoffe, Keramiken, Metalle, Glas und/oder Silika. Der durchschnittliche Durchmesser der Kügelchen kann beispielsweise zwischen etwa 0,01 mm bis etwa 2 mm gewählt werden, abhängig von den jeweils aufzuschließenden Zellen. Es können auch Gemische mit Kügelchen eingesetzt werden, die unterschiedliche Durchmesser und/oder unterschiedliche Materialen aufweisen.
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Die Kügelchen können in unterschiedlichen Positionen innerhalb der Vorrichtung vorgesehen sein. Beispielsweise können die Kügelchen in einer Kavität des oberen Körpers (Revolvers) enthalten sein. Dies kann z.B. eine Kavität sein, die zum Auftrag der Probe vorgesehen ist. Die Probe mit den Zellen wird hierbei also in die Kavität eingebracht, die die Kügelchen enthält. Wenn der Prozess gestartet wird, werden die Zellen in einen ersten Schritt mit Hilfe der Kügelchen aufgeschlossen, sodass anschließend die weitere Prozessierung der Probe stattfinden kann.
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Einer oder mehrere der axial übereinander angeordneten Körper kann/können mehrteilig ausgestaltet sein und beispielsweise einen Deckel und eine Mischwanne umfassen, wobei der Deckel und die Mischwanne gegeneinander beweglich sein können. Der Deckel greift hierbei in das Volumen der Mischwanne ein und durch eine Auf- und Abbewegung von Deckel und Mischwanne gegeneinander, die durch die wirkenden Zentrifugalkräfte gesteuert wird, kann eine verstärkte Durchmischung in der Mischkammer stattfinden. In einer Ausgestaltung der erfindungsgemäßen Vorrichtung sind die Kügelchen in einer Kavität des Deckels enthalten. Durch eine Be- und Entschleunigung bei der Zentrifugation kann die Probe immer wieder durch den Deckel und in die Mischkammer gepumpt werden, wobei auch die Kügelchen in der Kavität des Deckels bewegt werden. Durch die hierbei verstärkt wirkenden Scheerkräfte erfolgt der Zellaufschluss in besonders effektiver Weise.
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In einer weiteren Ausgestaltung der erfindungsgemäßen Vorrichtung können die Kügelchen in einer Kavität eines Körpers der Vorrichtung enthalten sein, die als Mischkammer vorgesehen ist. Die Mischkammer selbst kann beispielsweise so eingerichtet sein, dass sie durch die wirkenden Zentrifugalkräfte oder gleichwirkenden Kräfte beweglich ist, um so eine Durchmischung zu erreichen. Durch die Anordnung der Kügelchen in der beweglichen Mischkammer werden daher die Kügelchen besonders stark bewegt, sodass der Zellaufschluss sehr effizient durchgeführt werden kann.
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Um den Zellaufschluss weiter zu optimieren, kann es vorgesehen sein, dass an verschiedenen Positionen innerhalb der erfindungsgemäßen Vorrichtung Kügelchen enthalten sind. Beispielsweise können Kügelchen sowohl in der Probenauftragskammer als auch in der Mischkammer vorgesehen sein.
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Bei einer herkömmlichen Vorrichtung der gattungsgemäßen Art ist es im Allgemeinen vorgesehen, dass Einrichtungen zum Öffnen der Kavitäten vorgesehen sind, um den Flüssigkeitsfluss zu bewerkstelligen. Die Einrichtungen zum Öffnen einer Kavität können z.B. als Folie ausgestaltet sein, die von einem darunterliegenden Dorn in Abhängigkeit von der Position der Körper zueinander durchstoßen wird. Erfindungsgemäß sind die Einrichtungen zum Öffnen der Kavität(en), die die Kügelchen enthält/enthalten, vorzugsweise so eingerichtet, dass die Kügelchen selbst nach dem Öffnen der Kavität die Kavität nicht verlassen und dass nur die Probe, also das Zelllysat, die Kavität verlässt und in die nachfolgende Kavität geleitet wird. Wenn beispielsweise ein Durchstoßen oder Aufreißen einer Folie zum Öffnen der Kavität vorgesehen ist, sind die aufzureißenden Bereiche vorzugsweise kleiner als die Kügelchen selbst, sodass die Kügelchen aus der jeweiligen Kavität nicht entweichen können und damit die weitere Prozessierung der Probe nicht stören.
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In einer bevorzugten Ausgestaltung der erfindungsgemäßen Vorrichtung ist für die Verdrehung oder Verschiebung der Körper gegeneinander ein Eingriff von Führungsfedern des einen Körpers in eine Profilzahnreihe des anderen Körpers und eine entgegen der Zentrifugalkraft oder entgegen der gleichwirkenden Kraft wirkende Rückstellkraft der Körper vorgesehen. Durch eine Kombination dieses an sich bekannten Mechanismus (Kugelschreibermechanik) mit den erfindungsgemäß vorgesehenen Kügelchen in der Vorrichtung kann in besonders vorteilhafter Weise ein Zellaufschluss und eine nachfolgende Prozessierung der Probe in automatisierter Weise erfolgen, wobei der Zellaufschluss selbst sehr schnell, mit geringen Kosten und mit sehr einfacher und unkomplizierter Handhabung vonstatten gehen kann.
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Die Erfindung umfasst weiterhin ein Verfahren zur Aufbereitung und/oder Prozessierung von biologischen Proben, wobei eine Vorrichtung verwendet wird, die wenigstens zwei axial übereinander angeordnete Körper mit jeweils wenigstens einer Kavität umfasst. Diese Körper sind in Abhängigkeit von einer Zentrifugalkraft oder einer gleichwirkenden Kraft gegeneinander verdrehbar oder verschiebbar und die verschiedenen Kavitäten der Körper sind miteinander fluidisch koppelbar. Es handelt sich hierbei insbesondere um ein bereits eingangs beschriebenes gestapeltes mikrofluidisches System. Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren werden die Zellen mechanisch aufgeschlossen, indem in wenigstens einer der Kavitäten der verwendeten Vorrichtung Kügelchen enthalten sind. Bezüglich weiterer Merkmale der verwendeten Vorrichtung wird auf die obige Beschreibung verwiesen. Im Zuge des erfindungsgemäßen Verfahrens kann die Vorrichtung in den Rotor einer Zentrifuge eingesetzt werden. Der Zellaufschluss selbst erfolgt durch eine Be- und Entschleunigung der Zentrifuge. Vorzugsweise werden für den Zellaufschluss mehrere Zyklen der Be- und Entschleunigung durchgeführt. Die Be- und Entschleunigung der Zentrifuge bewirkt eine Bewegung der Kügelchen innerhalb der Vorrichtung, sodass durch die zwischen den Kügelchen und den Zellen wirkenden Scheerkräften der Zellaufschluss erfolgt. Die Zellen werden gewissermaßen zwischen den Kügelchen zermahlen. Als Alternative zu den Zentrifugalkräften können gleichwirkende Kräfte ausgeübt werden, beispielsweise kann ein ähnlicher Effekt durch wiederholtes Anlegen eines Unterdrucks oder eines Überdrucks erzeugt werden.
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Für das Be- und Entschleunigen wird vorzugsweise zwischen einer niedrigen Drehzahl und einer hohen Drehzahl der Zentrifuge gewechselt. Die niedrige Drehzahl kann beispielsweise in einem Beschleunigungsbereich zwischen 20 g und 600 g liegen. Die hohe Drehzahl kann beispielsweise in einem Beschleunigungsbereich zwischen 1000 g und 12.000 g liegen.
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Weitere Merkmale und Vorteile der erfindungsgemäßen Vorrichtung und des erfindungsgemäßen Verfahrens ergeben sich aus der nachfolgenden Beschreibung von Ausführungsbeispielen im Zusammenhang mit den Zeichnungen. Hierbei können die einzelnen Merkmale jeweils für sich oder in Kombination miteinander verwirklicht sein.
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Kurze Beschreibung der Zeichnungen
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In den Zeichnungen zeigen:
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1 Schnittdarstellung einer zentrifugierbaren Vorrichtung mit mehreren zueinander verdrehbaren Körpern (Revolver) aus dem Stand der Technik;
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2 isometrische Darstellung eines oberen Körpers (Revolver) als Bestandteil einer erfindungsgemäßen Vorrichtung;
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3A/B isometrische Darstellung eines zweiten Körpers (Revolver) als Bestandteil der erfindungsgemäßen Vorrichtung in einer Ansicht schräg von der Seite (3A) und in Aufsicht (3B) und
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4A/B isometrische Darstellung von Komponenten des zweiten Körpers (Revolver) als Bestandteil einer erfindungsgemäßen Vorrichtung, bestehend aus Deckel und Mischwanne in einer Ansicht schräg von der Seite (4A) und als Ansicht der Mischwanne von unten (4B).
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Beschreibung von Ausführungsbeispielen
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1 zeigt in schematischer Weise ein System zur automatischen Prozessierung von biochemischen Prozessen aus dem Stand der Technik, das auf mehreren axial übereinander angeordneten Körpern (Revolvern) 10, 20, 30 beruht, die gegeneinander verdrehbar sind. Die Körper 10, 20, 30 umfassen verschiedene Kavitäten 11, 12, 21, 22, 31, 32, 33, die als Behältnisse und Reaktionsräume dienen. Die Vorrichtung kann beispielsweise für eine Proteinaufreinigung eingesetzt werden. In den Kavitäten 11 werden Reagenzien vorgehalten. In die Kavität 12 wird die Probe eingebracht. Die Kavität 21 stellt eine Mischkammer dar. Die Kavität 22 enthält eine Matrix-basierte Säule, mit der die eigentliche Proteinaufreinigung erfolgt. Die Kavität 31 ist für den Abfall aus Waschschritten an der Säule vorgesehen. In der Kavität 32 wird das Eluat der Säule aufgefangen. In einer anschließenden Reaktionskammer 33 kann das aufgereinigte Protein mit einer biochemischen Reaktion nachgewiesen werden, wobei ein Detektor 40, der sich außerhalb der Vorrichtung befindet, eingesetzt werden kann. Die Körper 10, 20, 30 befinden sich in gestapelter Weise innerhalb eines Gehäuses in Form eines Zentrifugenröhrchens 50, das mit einem Deckel 51 verschließbar ist. Das Zentrifugenröhrchen 50 wird in den Rotor einer Laborzentrifuge eingesetzt. Durch die wirkenden Zentrifugalkräfte verdrehen sich die Körper 10, 20, 30 in vorgegebener Weise gegeneinander, insbesondere über eine integrierte Kugelschreibermechanik. Der Transport von Probe und Reagenzien vom obersten Revolver 10 bis zum untersten Revolver 30 erfolgt durch die Zentrifugalkraft. Hierbei kann es vorgesehen sein, dass durch Dorne oder ähnliches an den Körpern 20, 30 die darüberliegenden Kavitäten geöffnet werden. Der Fluidfluss erfolgt in vorgegebener Weise, sodass die Probe aus der Kavität 12 in vorbestimmter Weise die verschiedenen Prozessierungsschritte durchläuft.
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Um mit einer solchen Vorrichtung beispielsweise ein intrazelluläres Protein aufreinigen zu können, müssen die Zellen, die dieses Protein exprimieren, zunächst aufgeschlossen werden. Herkömmlicherweise kann dies beispielsweise vorab erfolgen, indem die Zellen außerhalb der Vorrichtung beispielsweise enzymatisch oder chemisch behandelt werden, sodass das resultierende Zelllysat dann in die Kavität 12 eingebracht werden kann, um weiter prozessiert zu werden. Eine andere herkömmliche Möglichkeit ist, dass in einer solchen Vorrichtung ein Enzym, das zum Lysieren der Zellen geeignet ist, vorgehalten wird. Ein entsprechendes Enzym kann beispielsweise in der Kavität 12 enthalten sein. Wenn dann die Probe, die die Zellen enthält, in die Kavität 12 eingebracht wird, findet unter bestimmten Bedingungen eine Zelllyse, d.h. also ein Zellaufschluss, statt. Hierbei ist allerdings zu beachten, dass das Temperaturoptimum des jeweiligen Enzyms zu berücksichtigen ist. In der Regel ist eine höhere Temperatur für die enzymatische Aktivität erforderlich. Weiterhin ist zu beachten, dass die Stabilität des Enzyms bei der Lagerung einer derartigen Vorrichtung zu berücksichtigen ist, wobei in der Regel eine Stabilität des Enzyms nur bei ausreichend tiefen Temperaturen gewährleistet ist. Um diese verschiedenen Probleme und Nachteile zu vermeiden, sieht die erfindungsgemäße Vorrichtung vor, eine derartige Vorrichtung mit Beads bzw. Kügelchen auszustatten, um einen mechanischen Zellaufschluss durchführen zu können. Dieser mechanische Zellaufschluss basiert darauf, dass die Zellen zwischen den Kügelchen „zermahlen“ werden, wobei Scheerkräfte wirken, die zu einer Zerstörung der Zellmembranen und/oder Zellwände führen. Auf diese Weise kann der Zellaufschluss sehr einfach, unkompliziert und schnell sowie in automatisierter Weise durchgeführt werden. Es sind keine kostenintensiven Enzyme erforderlich. Weiterhin müssen keine bestimmten Temperaturen zum einen für die Lagerung der Enzyme und zum anderen für deren optimale enzymatische Aktivität berücksichtigt werden. Das Zellmaterial kann damit in sehr vorteilhafter Weise durch die Kügelchen im Zuge der Prozessierung innerhalb der erfindungsgemäßen Vorrichtung, die durch die Zentrifugalkraft oder eine gleichwirkende Kraft gesteuert wird, aufgeschlossen werden.
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Geeignete Kügelchen können beispielsweise aus Kunststoffen, Keramiken, MetalIen und/oder Silika bestehen. Die Kügelchen können je nach Anwendung einen durchschnittlichen Durchmesser von beispielsweise 0,01 mm bis 2 mm aufweisen. Die Kügelchen können in verschiedenen Bereichen und Positionen innerhalb der erfindungsgemäßen Vorrichtung vorgesehen sein.
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2 zeigt ein Beispiel der erfindungsgemäßen Vorrichtung, bei dem die Kügelchen 1000 in einer Kavität 101 des oberen Revolvers 100 enthalten sind. Der Revolver 100 weist insgesamt acht Kavitäten 101 bis 108 auf. Die Kavität 101 ist hierbei die sogenannte Probenkammer, in die die biologische Probe, also insbesondere die in einer Flüssigkeit enthaltenen Zellen, eingebracht wird. In der Kammer 101 befinden sich die Kügelchen 1000, hier angedeutet durch einen Pfeil und mehrere ausgefüllte Kreise.
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Am äußeren Umfang des Revolvers 100 befinden sich verschiedene Profile 110, 111, die Bestandteil der Kugelschreibermechanik sind, mittels derer der Revolver 100 und weitere, in einer Vorrichtung nachfolgend angeordnete Körper bzw. Revolver gegeneinander verdrehbar sind.
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Zur Durchführung des Zellaufschlusses in der Probenkammer
101 wird vor dem Starten der Prozessierung die Probe, die Zellmaterial oder beispielsweise Sporenmaterial enthält, in die Kammer
101 eingebracht. Im Zuge der Prozessierung vermischen sich die Kügelchen mit den Zellen der Probe, sodass die wirkenden Scheerkräfte den Aufschluss der Zellen bewirken. Dieser Schritt wird durch das Be- und Entschleunigen der Zentrifuge, beispielsweise durch einen Wechsel zwischen 40 g und 6000 g, gesteuert. Wenn die Zellen ausreichend aufgeschlossen sind, kann die Probenkammer
101 insbesondere im unteren Bereich geöffnet werden, um die aufgeschlossene bzw. lysierte Probe weiter verarbeiten zu können. Beispielsweise kann eine Folie, z. B. eine Alufolie, vorgesehen sein, die die Kavität
101 nach unten abschließt. Diese Folie wird durch einen Dorn eines darunter angeordneten Revolvers aufgestochen oder aufgerissen, sodass das Zelllysat zur weiteren Verarbeitung freigesetzt wird. Ein hierfür geeignetes Zentrifugenprotokoll kann beispielsweise gemäß dem folgenden Schema durchgeführt werden. Die Probe und die Kügelchen werden durch Zyklieren der Drehzahlen vermischt, wobei Beschleunigungen zwischen 20 g und 600 g und zwischen 1000 g und 12.000 g eingesetzt werden. Die Haltezeiten bei der jeweiligen Zieldrehzahl können 1 s oder länger betragen, wobei nicht das Halten bei einer bestimmten Drehzahl, sondern das Zyklieren zwischen den beiden Drehzahlen für das Mischen und die wirkenden Scheerkräfte wichtig sind. Die untere Drehzahl kann beispielsweise zur Erreichung einer Beschleunigung von 200 g und die obere Drehzahl zur Erreichung einer Beschleunigung von 2000 g eingestellt werden. Es können zwischen 1 und beispielsweise 500 Zyklen durchgeführt werden, geeignet sind insbesondere 20 bis 200 Zyklen. Gute Ergebnisse werden beispielsweise bereits mit 100 Zyklen erreicht. Um nun die Folie der Kavität
101 im Revolver
100 zur Freisetzung der lysierten Probe anzustechen, wird die Zentrifuge zunächst auf 6000 g beschleunigt und dort kurz gehalten, beispielsweise 1 s bis 1 min, um dann wieder auf 40 g herunterzubeschleunigen. Im Allgemeinen ist es ausreichend, wenn unter 200 g herunterbeschleunigt wird. Hierdurch wird die Kugelschreibermechanik aktiviert, sodass die Alufolie der Kavität
101 im Revolver
100 angestochen wird und das Zelllysat die Probenkammer
101 verlassen kann. Die verschiedenen beispielhaften Prozessschritte für die Lyse bzw. den Zellaufschluss und für ein nachfolgendes Protokoll zur Proteinreinigung mittels einer Säulenchromatographie sind nachfolgend aufgeführt:
| Prozessschritt | Drehzahl bzw. Be- schleunigung (g) | Zyklus-Zahl |
| Lyse | z.B. 200 g für 10 s; 2000 g für 10 s | 100 |
| Anstechen Revolver 1 | 6000 g für 30 s | 1 |
| Freilassen des Lysats zu Revolver 2 und Kugel schreibermechanik | 40 g für 30 s | 1 |
| Anstechen des Revolvers 1 um das lysierte Proben material mit z.B. Bindepuf fer zu mischen | 600 g für 30 s; 40 g für 30 s | 1 |
| Mischen | 500 g für 5 s; 5000 g für 5 s | 20 |
| Binden auf die Säule | 600 g für 30 s; 40 g für 30 s | 1 |
| Freisetzen Waschpuffer 1 und 2 | 600 g für 30 s; 40 g für 30 s | 2 |
| Trockenschleudern der Säule | 6000 g | 5 min |
| Freisetzen Elutionsflüssigkeit aus Revolver 1 | 600 g für 30 s; 40 g für 30 s | 1 |
| Elution | 6000 g | 3 min |
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In einer anderen Ausgestaltung kann der Zellaufschluss auch in einem nachfolgenden Revolver erfolgen, wobei unter „nachfolgend“ zu verstehen ist, dass der nachfolgende Revolver in Flussrichtung gesehen unterhalb des ersten Revolvers angeordnet ist. 3A illustriert einen Revolver 200, der in einer erfindungsgemäßen Vorrichtung unterhalb des Revolvers 100 angeordnet ist. Am äußeren Umfang weist der Revolver 200 in diesem Beispiel vier nach oben ragende Führungsfedern 211 auf, die in die Profilzahnreihe 111 des Revolvers 100 eingreifen können, sodass mittels der Kugelschreibermechanik ein vorgebbares Verdrehen, abhängig von der wirkenden Zentrifugalkraft, der Revolver 100 und 200 zueinander realisiert werden kann. Der Revolver 200 ist mehrteilig ausgestaltet, wobei der obere Teil des Revolvers 200 einen Deckel 210 (Dorndeckel) für eine darunterliegende Mischwanne 230 (Mischkammer) bildet, die anhand von 4 näher erläutert werden wird. Auf dem Dorndeckel 210 befinden sich mehrere vorstehende Dorne 212, 213 und 214. Ein Öffnen der Kavitäten des darüberliegenden Revolvers 100, beispielsweise ein Öffnen der Probenkammer 101, kann durch die Dorne 212, 213 und 214 erfolgen, wobei diese Dorne beispielsweise eine Folie durchstoßen können, die die Kavitäten in dem oberen Revolver 100 nach unten abschließen. Das Öffnen erfolgt bei entsprechender Drehung der Körper (Revolver) zueinander, sodass ein vorgegebener Flüssigkeitsfluss aus einer Kavität des oberen Revolvers in eine Kavität des darunterliegenden Revolvers erreicht wird. Diese mechanische Kopplung der Kavitäten wird durch die jeweils eingestellte Zentrifugalkraft gesteuert, wobei die entsprechende Drehung der Körper zueinander durch die bereits erwähnte Kugelschreibermechanik und eine rückstellende Federkraft ausgelöst werden kann. 3B zeigt eine Aufsicht auf den Dorndeckel 210. Der Deckel 210 weist eine Vertiefung 220 (Kavität) auf, die in das Volumen der darunterliegenden Mischwanne eingreift. Eine Öffnung 221 in der Kavität 220 erlaubt einen Flüssigkeitsfluss zwischen der Kavität 220 und der darunterliegenden Mischwanne. Innerhalb der Vertiefung 220 befinden sich in dieser Ausführungsform der erfindungsgemäßen Vorrichtung die Kügelchen 2000, die erfindungsgemäß zum Zellaufschluss verwendet werden. Während der Prozessierung der biologischen Probe gelangt die Probe aus einer Kavität aus einem darüberliegenden Revolver in die Vertiefung 220. Die Kavität des darüber- liegenden Revolvers kann beispielsweise mit dem Dorn 214 angestochen werden. Die Kugelschreibermechanik der Revolver 100 und 200 ist so ausgestaltet, dass sich mittels der Zentrifugalkraft der Revolver 200 in Abhängigkeit von der wirkenden Beschleunigung auf- und abbewegt. Diese Auf- und Abbewegung wird durch eine Federkraft bewirkt, die entgegen der Zentrifugalkraft wirkt. Hierfür kann im unteren Bereich des Revolvers 200 eine Feder angeordnet sein. Durch die Auf- und Abbewegung wird die Flüssigkeit immer wieder durch den Deckel 210 gepumpt, wobei die Flüssigkeit die Öffnung 221 jeweils passiert. Die Kügelchen 2000 bewegen sich durch die Be- und Entschleunigung ebenfalls, sodass der Zellaufschluss durch das Zermahlen der Zellen und die wirkenden Scheerkräfte bewerkstelligt wird.
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Diese Ausgestaltung hat den Vorteil, dass hierbei eine Auf- und Abbewegung des Deckels
210 des Revolvers
200 und einer darunterliegenden Mischkammer genutzt wird, um eine weitere Durchmischung der Kügelchen und der aufzuschließenden Zellen zu erreichen, um so den Zellaufschluss noch effizienter gestalten zu können. Durch das federbetriebene System entstehen durch das Gegeneinanderschieben des Dorndeckels
210 und der darunterliegenden Mischwanne turbulente Strömungen und damit vermehrte Scheerkräfte, die den Zellaufschluss unterstützen. Das Mischen kann hierbei z.B. durch Zyklieren zwischen Drehzahlen im Beschleunigungsbereich von 40 g bis 500 g und im Beschleunigungsbereich von 4000 g bis 6000 g, beispielsweise mit 100 g und 5500 g oder mit 500 g und 5000 g, stattfinden. Es kann vorzugsweise mehrfach zwischen den Drehzahlen gewechselt werden. Beispielsweise können 1 bis 500 Zyklen durchgeführt werden, bevorzugt sind 20 bis 200 Zyklen, wobei beispielsweise 100 Zyklen sehr gute Ergebnisse liefern. Nachfolgend ist ein beispielhaftes Protokoll für die Aufreinigung von DNA aus bakteriellen Zellen aufgeführt, wobei die Zellen in der Mischkammer, die erfindungsgemäß die Kügelchen enthält, aufgeschlossen werden. Als Zellmaterial können beispielsweise Escherichia coli oder andere gramnegative Bakterien eingesetzt werden. Das Protokoll ist jedoch auch auf andere Zellen und insbesondere auf andere Bakterien übertragbar.
| Prozessschritt | Drehzahl bzw. Be- schleunigung (g) | Zyklus-Zahl |
| Anstechen Revolver 1 (Probe wird in die Misch kammer in Revolver 2 gebracht) | 600 g für 30 s; 40 g für 30 s | 1 |
| Mischen in Mischkammer in Revolver 2 | 500 g für 5 s; 5000 g für 5 s | 100 |
| Anstechen des Revolvers 1 um das lysierte Proben material mit z.B. Bindepuf fer zu mischen | 600 g für 30 s; 40 g für 30 s | 1 |
| Mischen | 500 g für 5 s; 5000 g für 5 s | 20 |
| Binden auf die Säule | 600 g für 30 s; 40 g für 30 s | 1 |
| Freisetzen Waschpuffer 1 und 2 | 600 g für 30 s; 40 g für 30 s | 2 |
| Trockenschleudern der Säule | 6000 g | 5 min |
| Freisetzen Elutionsflüssigkeit aus Revolver 1 | 600 g für 30 s; 40 g für 30 s | 1 |
| Elution | 6000 g | 3 min |
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4 zeigt ein weiteres Beispiel für die Positionierung der Kügelchen. In diesem Beispiel ist wieder der Revolver 200 gezeigt, der sich in einen oberen Teil, den Dorndeckel 210, und in einen unteren Teil, die sogenannte Mischwanne 230, untergliedert. Der Deckel 210 ist so ausgestaltet, dass er in das innere Volumen der Mischwanne 230 eingreift. Durch eine federbasierte Mechanik bewegen sich Deckel 210 und Mischwanne 230 gegeneinander. Diese Auf- und Abbewegung wird durch die wirkende Zentrifugalbeschleunigung ausgelöst. Die Kügelchen 3000 befinden sich in der Mischwanne 230. Wenn die Probe mit den aufzuschließenden Zellen in die Mischwanne 230 gelangt, wird durch die Auf- und Abbewegung von Deckel 210 und Mischwanne 230 eine besonders gute Durchmischung der Kügelchen mit der Probe bzw. mit den darin enthaltenen Zellen erreicht. Durch die wirkenden Scheerkräfte wird der Zellaufschluss bewirkt. Der Pfeil 1 deutet die Richtung der Zentrifugalbeschleunigung an. 4B zeigt die Mischwanne 230 in einer Ansicht schräg von unten. Zu erkennen ist die gedeckelte Öffnung 231, die zum Eluieren bzw. zum Durchtritt des Zelllysats nach dem Zellaufschluss vorgesehen ist. Das Loch 231 kann beispielsweise mittels einer Folie verschlossen sein, die geöffnet werden kann, indem sie von einem darunterliegenden Dorndeckel durchstoßen oder aufgerissen wird. Vorzugsweise ist die Öffnung oder sind die Öffnungen, die zum Durchtritt des Zelllysats vorgesehen sind, im Durchmesser kleiner als die Kügelchen, sodass die Kügelchen 3000, die sich in der Mischwanne 230 befinden, nicht mit durchtreten können und nicht die nachfolgende Aufbereitungsschritte stören. Alternativ können auch mehrere Öffnungen 231 am Boden der Mischwanne 230 vorgesehen sein. Weiterhin können alternativ oder zusätzlich eine oder mehrere Sollbruchstellen vorgesehen sein, die in vergleichbarer Weise einen Durchtritt des Zelllysats ermöglichen.
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In weiteren Ausgestaltungen der erfindungsgemäßen Vorrichtung kann es vorgesehen sein, dass die Kügelchen an verschiedenen Positionen innerhalb der erfindungsgemäßen Vorrichtung vorgesehen sind, beispielsweise in der Probenkammer oder Auftragskammer in einem oberen Revolver und zusätzlich in einer Mischkammer in einem nachfolgenden Revolver.
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ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Patentliteratur
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- DE 102010003223 A1 [0006]
