WO2015034178A1 - 파라핀블록 제조용 혈중 세포 응집제 및 이를 이용한 파라핀블록 제조방법 - Google Patents

파라핀블록 제조용 혈중 세포 응집제 및 이를 이용한 파라핀블록 제조방법 Download PDF

Info

Publication number
WO2015034178A1
WO2015034178A1 PCT/KR2014/006952 KR2014006952W WO2015034178A1 WO 2015034178 A1 WO2015034178 A1 WO 2015034178A1 KR 2014006952 W KR2014006952 W KR 2014006952W WO 2015034178 A1 WO2015034178 A1 WO 2015034178A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
blood
blood cell
cells
paraffin block
gelatin
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/KR2014/006952
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
장희진
김선영
백지연
여현양
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
National Cancer Center Japan
National Cancer Center Korea
Original Assignee
National Cancer Center Japan
National Cancer Center Korea
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from KR1020140095898A external-priority patent/KR101643403B1/ko
Application filed by National Cancer Center Japan, National Cancer Center Korea filed Critical National Cancer Center Japan
Priority to US14/917,687 priority Critical patent/US10656058B2/en
Publication of WO2015034178A1 publication Critical patent/WO2015034178A1/ko
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/575—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/5758—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumours, cancers or neoplasias, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides or metabolites
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
    • G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
    • G01N1/36—Embedding or analogous mounting of samples
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/54—Determining the risk of relapse

Definitions

  • the present invention relates to a blood cell coagulant for preparing paraffin block and a method for preparing paraffin block using the same, and more particularly, to preparing a paraffin block including blood cells present in blood from which red blood cells are removed from a small amount of blood.
  • Blood cell coagulant for the production of paraffin block and paraffin block using the same which can implement paraffin block for diagnosing blood cancer cells with high reproducibility and excellent sensitivity and specificity as it can improve the cohesiveness and prevent damage and loss of blood cells at the same time It is to provide a manufacturing method.
  • Circulating tumor cells are rare tumor cells that exist in the blood and circulate in the body, and there is one known one million cells in the blood of cancer patients. In spite of the very small amount present in the blood, the presence of blood cancer cells in the patients with metastatic breast cancer, colorectal cancer and prostate cancer has been found to be an important prognostic factor related to the survival rate. There are reports that monitoring can easily predict treatment response.
  • Diagnosing cancer through blood has conventionally predicted cancer occurrence through increased expression of a specific enzyme
  • Korean Patent Laid-Open No. 2003-0036010 discloses a cancer diagnosis method by measuring enzyme activity of protein kinase in blood. .
  • detection of cancer cells in the blood is mainly limited to quantitative analysis of the amount of tumor cells in blood, that is, the degree of tumor burden. If the detected blood cancer cells can be collected and analyzed pathologically, it can be a diagnostic alternative to biopsy for end-stage cancer patients who have difficulty in biopsy, reducing unnecessary examination costs and appropriate for histological type of cancer. The treatment continues to indirectly reduce the cost of treatment.
  • Representative methods for detecting blood cancer cells known to date through these studies include immunological analysis using monoclonal antibodies and separation by cell size. Most of them are in the early stages of development and are commercially available in some parts. However, the method currently used is a one-time test, which allows only a simple count of blood cancer cells or immunocytochemical staining of blood cancer cells once or twice.
  • the surface marker used is EpCAM, and in the case of hematopoietic cancer cells showing epithelial-mesenchymal transition, hepatocellular carcinoma or malignant melanoma, etc., the marker does not respond to the cancer cells and thus may have false negatives.
  • a conventional method for diagnosing blood cancer cells uses a method of removing red blood cells through chemical treatment and then removing only white blood cells by removing leukocytes by a microfiltration membrane or surface marker, and extracting the final blood cancer cells.
  • a problem of poor reproducibility because it has to go through many steps.
  • paraffin blocks are used for the purpose of diagnosing, treating and researching diseases such as special staining and immunohistochemical staining based on the identification of tissues and cells.
  • the application of the diagnosis using paraffin block is generally through biopsy tissue, and the biopsy tissue is fixed, and the fixed tissue is paraffin block through washing, dehydration, transparent, and paraffin infiltration process for the production of paraffin sections. It is cut to thickness and dried.
  • the sediment fixation method when using the sediment fixation method to precipitate the sample through centrifugation in the blood cells for the blood cells, the amount of the cell population sample is reduced or the tissue or cells are interspersed due to the destruction and loss of the blood cells, the cell population after paraffin infiltration It is difficult to distinguish between the sample and paraffin, and there is a problem in that embedding with tweezers is impossible.
  • the target of the diagnostic method using paraffin block is conventional biopsy tissue or somatic cells, and these biopsy tissue or somatic cells have good intercellular adhesion and contain extracellular matrix components that aggregate cells. It was very easy to manufacture. However, since blood cells have no intercellular junction and do not contain a substance that functions as an extracellular matrix that can aggregate cells, the cells are separated from each other without aggregation. In the blood cell sample in this state, since the blood cells are not aggregated even when the above-described method for preparing the various cell population samples is made, when the paraffin block is manufactured for blood cells, blood cells are frequently lost or lost during the manufacturing process. To make it happen, there is a problem that is very difficult to produce the desired paraffin block.
  • the blood cells are not aggregated properly and processed in formalin fixation or paraffin block production, the blood cells themselves are exposed to the outside and are not protected by the blood during the various intermediate processes of manufacturing the paraffin block. More frequent destruction and loss or loss of cells can occur.
  • blood cancer cells are included in the blood in very small numbers, there is a fatal problem in that the cancer cells cannot be diagnosed through paraffin blocks prepared when the blood cells destroyed, lost or lost are blood cancer cells.
  • the present invention has been made to solve the above problems, the first problem to be solved of the present invention is to facilitate the production of paraffin block, and the destruction, damage, loss, loss of specific blood cells of interest in the manufacturing process
  • the present invention provides a blood cell aggregate that can significantly improve diagnostic reliability of blood cells of interest.
  • the second problem to be solved of the present invention is to provide a kit for diagnosing blood cancer cells with remarkably excellent reproducibility, sensitivity and specificity in the diagnosis of blood cancer cells.
  • the third problem to be solved of the present invention is to provide a method for producing a paraffin block using a blood cell aggregate, which has high reproducibility, and excellent sensitivity and specificity.
  • the present invention provides a paraffin block for agglomerating blood cells against blood cells and performing a function of an extracellular matrix for preventing the damage and loss of blood cells.
  • the blood cell aggregate may include gelatin.
  • the concentration of gelatin may be 5 to 35 mg / ml.
  • the blood cell aggregate is pectin (pectin), chondroitin sulfate (chondroitin sulfate), fibronectin (fibronectin), starch (starch) and laminin (laminin) group It may further include any one or more selected materials.
  • the substance further included in addition to gelatin as a blood cell aggregate may be a weight within 5% of the gelatin weight.
  • the blood cell coagulant further comprises a colorant for developing the blood cell aggregate, the colorant is included in 5 to 10 parts by volume with respect to 100 parts by volume of the blood cell aggregates Can be.
  • the concentration of gelatin may be 10 to 30 mg / ml.
  • the blood cancer cell flocculant for preparing paraffin block may be used for the diagnosis of blood cancer cells.
  • the present invention provides a kit for diagnosing cancer cells in the blood, including a blood cell aggregate for preparing paraffin block according to the present invention, in order to achieve the second object described above.
  • the present invention to achieve the above-mentioned third object, (1) removing the red blood cells from the blood of the subject and extracting blood cells; (2) mixing the blood cells with blood cell aggregates according to the present invention to produce blood cell aggregates; (3) curing the blood cell aggregates; And (4) treating the cured product according to step (3) with a paraffin block forming material.
  • the tube (tube) from which the blood cells used in step (1) are extracted may be coated with gelatin solution.
  • the red blood cell removal in step (1) may use ficoll.
  • the step (2) may mix the blood cells and blood cell aggregates in a 1: 1 to 1.5 volume ratio.
  • the blood cell coagulant of step (2) comprises gelatin, and the gelatin concentration in the blood cell coagulant according to the temperature at which step (2) is performed may be performed under the conditions (a) Any one of (c) may be satisfied.
  • step performance temperature of step (2) When the step performance temperature of step (2) is 5 ° C. or more and less than 15 ° C., the concentration of gelatin in the blood cell coagulant is 5-15 mg / ml.
  • step performance temperature of step (2) When the step performance temperature of step (2) is 15 ° C. or more and less than 25 ° C. The concentration of gelatin in the blood cell coagulant is 15 to 25 mg / ml,
  • step performance temperature of step (2) is 15 ° C. or more and less than 25 ° C.
  • the concentration of gelatin in the blood cell coagulant is 15 to 25 mg / ml
  • the concentration of gelatin in the blood cell coagulant is 25 to 35 mg / ml when the temperature in step (2) is greater than 25 ° C. and less than 35 ° C.
  • the paraffin block forming material of step (4) includes alcohol, xylene and paraffin
  • step (4) is paraffin block in the order of alcohol, xylene and paraffin It can be carried out through the automatic infiltration process by treating the forming material.
  • the paraffin block may be used for histological, immunohistochemical or molecular biological detection methods of circulating tumor cells.
  • step (3) may further comprise the step of fixing the cured body according to the step (3).
  • the fixing of the cured body may be performed by one or more selected from the group consisting of formalin, methanol or ethanol.
  • blood cell refers to a cell contained in blood, preferably peripheral blood, wherein the blood cell includes all of nucleated or nucleated cells, and the blood cells are conventional blood cells (blood In addition to normal cells and / or cancer cells, the term includes all of the blood cells, such as macrophages, lymphocytes (lymphocytes), monocytes (peripheral blood mononuclear cells (PBMC), red blood cells, white blood cells and platelets) It is meant to include all of the cells usually classified as blood cells, such as.
  • PBMC peripheral blood mononuclear cells
  • paraffin block in preparing a paraffin block containing blood cells, it is difficult to immobilize blood cells by a conventional method for preparing a conventional cell population sample, and the blood cell population sample immobilized by a conventional method is a paraffin block.
  • Critical problems that can be damaged, lost and / or lost in the manufacturing process can be solved.
  • paraffin blocks may be used for the purpose of histological, immunohistochemical and molecular biology of certain cells of interest, such as blood cancer cells. It can detect through various methods.
  • the manufacturing process of the paraffin block can be simplified, and the manufacturing time and manufacturing cost can be reduced.
  • paraffin blocks containing blood cells prepared by the present invention can reduce background staining and obtain thin sections, thereby providing excellent resolution.
  • the morphological confirmation of the cancer cells in the blood enables to distinguish from contaminated epithelial cells, thereby reducing errors in false-positive determinations, thereby providing excellent sensitivity and specificity.
  • the count of blood cancer cells per unit volume of blood can be counted by the count of leukocytes and blood cancer cells contained per unit area.
  • specimens are made of paraffin blocks for permanent storage and over 30 different immunohistochemical tests.
  • a paraffin block can be manufactured even with a small amount of blood collection, it is possible to diagnose and diagnose a cancer recurrence and metastatic cancer by measuring and preparing blood sample collected from a sample with a time difference.
  • Figure 1 shows a schematic experimental process for the paraffin block manufacturing method according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 2 is a photograph observed at 200-fold magnification using a microscope after performing CK immunohistochemical staining for paraffin sections prepared from colorectal cancer cell line (SW620) -derived blood cancer cells according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 3 shows H & E staining and CK immunity for paraffin fragments prepared after spiking cancer cells: leukocyte derived from colorectal cancer cell line (SW620) in normal blood according to a preferred embodiment of the present invention. After histochemical staining, the image was observed at 200 times magnification using a microscope.
  • SW620 colorectal cancer cell line
  • Figure 4 is carried out CK immunohistochemical staining for paraffin sections prepared from colorectal cancer cell line (SW620) -derived blood cancer cells in accordance with a preferred embodiment of the present invention, 400 times using a microscope to detect false positives due to contamination It is a photograph observed at magnification.
  • SW620 colorectal cancer cell line
  • Figure 5 is a micrograph observing the cytological pattern of blood cancer cells through the paraffin block prepared differently according to the blood standing time after blood collection of blood cancer cells (SKBR3) -derived specimens before red blood cell separation treatment according to an embodiment of the present invention.
  • SKBR3 blood cancer cells
  • FIG. 6 shows H & E staining, c-erbB2 immunohistochemical staining and fluorescence in situ hybridization reaction against Her2 / neu genes for paraffin fragments prepared from breast cancer cell lines (SKBR3) -derived blood cancer cells according to one preferred embodiment of the present invention. ), And then observed at 1000 times magnification using a microscope.
  • SKBR3 breast cancer cell lines
  • FIG. 7 illustrates H & E staining and CK immunohistochemical staining for paraffin fragments prepared from hepatic cancer cell lines (HepG2) -derived blood cancer cells according to an exemplary embodiment of the present invention, followed by cancer specific markers EpCAM and liver cancer specific markers.
  • Gene expressions for Glypican-3 and alpha-fetoprotein (AFP) are photographed at 400-fold magnification using a microscope.
  • FIG. 8 shows CK immunohistochemical staining for paraffin fragments prepared from colorectal cancer cell line (SW620) -derived blood cancer cells according to an embodiment of the present invention, and then CDX2, a cancer-specific marker EpCAM and a colon cancer-specific marker. And gene expression for p53 at 400-fold magnification using a microscope.
  • SW620 colorectal cancer cell line
  • FIG. 9 shows H & E staining and CK immunohistochemical staining of paraffin sections prepared from blood of stage 4 colon cancer patients with liver metastases according to a preferred embodiment of the present invention.
  • FIG. 10 is a photograph taken by H & E staining and CK immunohistochemical staining for blood cancer cells observed in the blood of the patient, and then observed at 400 times magnification using a microscope.
  • paraffin block is used for the purpose of diagnosing, treating and researching diseases such as special staining and immunohistochemical staining based on the identification of tissues and cells.
  • diseases such as special staining and immunohistochemical staining based on the identification of tissues and cells.
  • the paraffin block is prepared by making the cells in the cell population by using conventional methods, when the paraffin block fragments are stained, the background staining is excessive, so that the sensitivity and specificity for the detection of the specific blood cells that are targeted are significantly decreased. There was this.
  • blood cells do not contain substances that perform functions of extracellular matrix, such as intercellular aggregation, on the surface of cell membranes.
  • paraffin block When the paraffin block is prepared for the cells, there is a problem in that it is very difficult to prepare the desired paraffin block due to frequent loss or loss of blood cells. Furthermore, when blood cells undergo formalin fixation or paraffin block production, blood cells are destroyed, lost, and / or lost during various intermediate processes of manufacturing paraffin block as the blood cells themselves are not exposed and protected outside. This occurred frequently. In particular, since blood cancer cells are included in the blood in a very small number, there is a fatal problem in that the cancer cells cannot be diagnosed through paraffin blocks prepared when the blood cells that are destroyed, lost and / or lost are blood cancer cells.
  • the conventional methods for diagnosing blood cancer cells are less reproducible because they have to go through many steps until blood cancer cells are extracted by removing red blood cells through chemical treatment and then extracting only blood cancer cells through a white blood cell removal method using a microfiltration membrane or a surface marker. There was a problem.
  • a blood cell aggregation material which aggregates blood cells with respect to blood cells and performs an extracellular matrix function to prevent damage and loss of blood cells.
  • a blood cell sample as a cell population sample and a method of sampling a conventional biological tissue in a conventional method for preparing a cell population sample for a conventional biological tissue.
  • Blood cell population prepared in the present invention can solve the fatal problem that is damaged, lost and / or lost during the preparation of paraffin block. This enables the inclusion of paraffin blocks in the blood cells without damage, loss and / or loss of the specific cells of interest.
  • paraffin blocks may be used for the purpose of histological, immunohistochemical and molecular biology of certain cells of interest, such as blood cancer cells. It can detect through various methods. In addition, by not undergoing multiple centrifugation processes for blood cells, the manufacturing process of the paraffin block can be simplified, and the manufacturing time and manufacturing cost can be reduced. Furthermore, as in the conventional methods for detecting blood cancer cells, physical or chemical treatments for removing blood cells in multiple stages can be omitted, thereby reducing loss of target blood cancer cells and increasing cell retention.
  • the blood cell aggregation material which aggregates blood cells with respect to blood cells and performs the function of the extracellular matrix which prevents the damage and loss of blood cells is demonstrated.
  • the blood cells refer to cells contained in blood, preferably peripheral blood, and the blood cells may include both nucleated or nucleated cells, and the blood cells may include conventional blood cells and blood cells. It may include both normal cells and / or cancer cells, and the blood cells are typically peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) such as macrophages, lymphocytes, monocytes, red blood cells, leukocytes, and platelets. It may include all cells classified as blood cells.
  • PBMCs peripheral blood mononuclear cells
  • the blood cell aggregate can function as an extracellular matrix for blood cells from which red blood cells have been removed.
  • the degree of effect expression may not vary depending on the specific type of blood cells.
  • the blood cell aggregates according to the present invention may be used for cells in which red blood cells are removed from blood cells. Can serve as extra substrate.
  • red blood cells in the blood cells contained in the blood occupy a high proportion in the number of cells, and when prepared with paraffin blocks including red blood cells, the specific cells of the blood cells contained per unit area of the paraffin block fragments are included.
  • the probability can be very low.
  • various enzymes that may affect the cell membrane, DNA, RNA and cytoplasm of a specific type of blood cells may be released. Diagnosis of blood cells can be very disadvantageous or impossible. Accordingly, in order to prepare a paraffin block for diagnosing blood cancer cells in the blood, the blood cell aggregates preferably perform an extracellular matrix function on blood cells except red blood cells.
  • the blood cell aggregate according to the present invention aggregates the blood cells, and performs the function of the extracellular matrix to prevent damage and loss of blood cells, the function of the blood cell aggregates will be described in detail below.
  • an extracellular matrix refers to a collection of biopolymers that fill an intracellular or extracellular space, and is present in all tissues, but especially in connective tissues.
  • the extracellular matrix in addition to the physical functions such as support and binding of tissues, physical boundaries, absorption of force, elasticity, and the like in recent years, cell proliferation, cell migration, intracellular metabolism, cell differentiation, cell morphology, etc. It has been known to play a role in regulating physicochemical roles outside of.
  • Blood cell aggregates included in blood cell aggregates according to the present invention also perform the functions of the extracellular matrix as described above for blood cells, but are commonly known as the function of extracellular matrix, cell proliferation, cell migration, intracellular metabolism, etc. It is not a physiochemical role involved, but it is responsible for physical functions such as agglutination of blood cells, defense of physical elements applied to the outside of blood cells, absorption, and elastic elements, through which blood cell aggregates prevent damage and loss of blood cells. To perform the function.
  • the aggregation of the blood cells means that the blood cells in the state of being separated individually through the medium of blood cell aggregates (or blood cell flocculents including the same) form a physically aggregated form.
  • the substance may be a ligand and may not mean that the blood cells are aggregated due to the aggregation of the blood cells by the binding of the receptors on the cell membrane surface or the chemical change of the blood cell aggregates.
  • blood cell aggregates may not include plasma components, more preferably plasma proteins, such as fibrinogen, prothrombin, or thrombin or fibrin in their activated state.
  • the aggregation of blood cells by the blood cell aggregates may not be the aggregation by a conventional coagulation mechanism.
  • blood cells are aggregated by the coagulation mechanism, excessive red blood cells in the aggregates are included so that the amount of blood cells other than the red blood cells contained per unit area is too low, and the diagnostic efficacy is very low.
  • the diagnostic value of blood cell aggregates produced by damaging DNA and RNA of blood cells due to the release of intracellular enzymes is very low, and plasma proteins have problems that cannot achieve the object of the invention.
  • the blood cell aggregate contained in the blood cell aggregate according to the present invention may be very advantageous in preparing the blood cells with paraffin blocks according to the above-described functions.
  • the paraffin block object is prepared as a cell population sample and then treated with paraffin.
  • the conventional paraffin block is manufactured as a biological tissue, and a conventional biological tissue is formed by clustering cells with intercellular junctions. Each of the clustered cells includes an extracellular matrix outside the cell so that the cells can be more aggregated and the cells themselves are physically protected.
  • blood cells unlike biological tissues, each cell independently suspended in the blood, there is no intercellular adhesion, and does not contain substances that perform extracellular matrix outside the cell membrane.
  • the blood cell aggregates included in the blood cell flocculant according to the present invention aggregate the blood cells according to the function of the extracellular matrix to the blood cells so as to solve the above problems. Damage or loss can be prevented.
  • the above-described blood cell aggregate may include gelatin.
  • gelatin is used for various purposes for food and industrial purposes, and it swells in cold water but melts in hot water to become a sol, and when cooled to below room temperature at a concentration of 2 to 3% or more, it becomes a gel. Because it is a heat stable molecule, it may be suitable as the blood cell aggregate of the present invention. In addition, when the aggregated blood cells alone than the material capable of performing other types of extracellular matrix, it is more effective in preventing damage and loss of blood cells to prepare a paraffin block excellent in the physical properties of the present invention. It is more advantageous to do.
  • Gelatin as a blood cell aggregate in accordance with the present invention may mean containing collagen.
  • the gelatin may be included in the form of a gelatin solution, preferably mixed with a solvent.
  • the solvent may include a phosphate buffer solution, distilled water, physiological saline, and the like, and may be distilled water according to a preferred embodiment of the present invention.
  • gelatin included as a blood cell aggregate may be included in the blood cell aggregate for preparing paraffin block according to the present invention preferably at a concentration of 5 to 35 mg / ml, more preferably at a concentration of 5 to 30 mg / ml. More preferably, it may be included at a concentration of 5 to 20 mg / ml. If the concentration of gelatin is less than 5 mg / ml, paraffin block preparation may take time when the paraffin block is prepared for blood cells, resulting in damage to the cells due to gelatin coagulation, or the gelatin may be melted to significantly reduce the sensitivity and specificity of the diagnosis of blood cells. have.
  • the concentration of gelatin exceeds 35 mg / ml, the hardness of paraffin block increases, causing paraffin fragments to bounce off or collapse during the cutting process of paraffin block, causing loss of blood cells and thus sensitivity and specificity of blood cell diagnosis.
  • the degree can be significantly reduced. Specifically, as shown in Table 5 below, which compares the blood cancer cell collection rate according to the gelatin concentration change, when the gelatin concentration is 10 mg / ml, the blood cancer cell collection rate is 93%, whereas the gelatin concentration is 3 mg / ml. It can be seen that the cancer cell collection rate is significantly low as 68%, the gelatin concentration of 50 mg / ml may be confirmed that the cancer cell collection rate is only 6%.
  • the blood cell aggregate may further include any one or more substances selected from the group consisting of pectin, chondroitin sulfate, fibronectin, starch, and laminin. have.
  • the paraffin block is prepared by further including such a substance, the sensitivity and specificity for blood cells can be improved.
  • gelatin when gelatin is included as a blood cell aggregate, gelatin may vary in temperature depending on its concentration. If the concentration of gelatin is increased in order to have a solid or semi-solid in a specific temperature range, the desired properties are realized. There is a problem that the sensitivity and specificity of paraffin blocks for blood cells may be significantly reduced.
  • the gelatin concentration is 20mg / ml If the room temperature is subjected to more than 10 minutes in a room temperature of 28 °C (see Table 6 below) to change the liquid phase Increasing the concentration of gelatin higher than 20 mg / ml to maintain the solid phase or semi-solid phase at 28 ° C. can maintain the solid phase or semi-solid phase as desired. Sensitivity and specificity may not be achieved.
  • the blood cancer cell collection rate of paraffin block is 80%, but when the gelatin concentration is 50 mg / ml, the blood cancer cell collection rate of paraffin block is significantly reduced to 6%, which is higher than a certain concentration. As the concentration of gelatin increases in the blood cancer cell collection rate decreases the sensitivity and specificity of the paraffin block to the cancer cells in the blood can be seen to significantly decrease.
  • pectin, chondroitin sulfate, and fibronectin may be used to preserve the sensitivity and specificity of blood cells, which are reduced with increased gelatin concentrations to maintain the desired properties at specific room temperatures.
  • Any one or more substances selected from the group consisting of starch and laminin may be further included in the blood cell aggregate, and in this case, while maintaining the desired properties at a specific temperature, It may be more advantageous in expressing sensitivity and specificity.
  • the substance further included in addition to gelatin as a blood cell aggregate may be included within 5% of the weight of gelatin. If more than 5% of the weight of gelatin is contained in addition to gelatin, more than 5% of the weight of gelatin increases the hardness of the paraffin block, which causes the loss of blood cells due to the breakdown or fragmentation of the paraffin block. Etc. There may be a problem that the sensitivity and specificity of the blood cell diagnosis is inferior.
  • the blood cell aggregates do not contain gelatin and include only the substances added as blood cell aggregates in addition to the gelatin, it may be difficult to achieve the desired physical properties.
  • the starch is easy to use, but easy to separate, and after adjusting the concentration, there is a disadvantage in that the viscosity or quality does not come out even when the heat is applied again, and also does not melt in cold water, but swells in hot water and luxury.
  • pectin is a polymer of carbohydrate is used as a coagulant, thickener, stabilizer, anti-solidifying agent, emulsifier, etc. in food
  • the thickening power and gelling power of the pectin depends on the balance of acid and ester, acid is not more than 50%
  • acid is not more than 50%
  • non-esterified pectin there is a strong tendency to form gels with calcium ions, which may limit its use alone as a blood cell aggregate.
  • fibronectin fibronectin
  • laminin laminin
  • the gelatin is included as the blood cell aggregate of the present invention, since the gelatin is colorless and transparent, it is difficult to confirm whether or not it is jelled in a container, and thus, the extracellular matrix is developed in the blood cell aggregate of the present invention.
  • Coloring agent for further may be included.
  • the colorant may be bromophenol blue, carbon black, N, N-dimethyl laminoethanol, copper phthaloc yanine, pennsperse orange ),
  • a coloring agent for coloring blood cell aggregates is preferably a loading buffer containing bromophenol blue (Takara Bio Inc.).
  • the colorant may be included in the blood cell aggregate for paraffin block production in 5 to 10 parts by volume with respect to 100 parts by volume of blood cell aggregate. If more than 10 parts by volume of the coloring agent is added to 100 parts by volume of blood cell aggregates, there is a problem that the sample cohesion is weakened or the sample aggregation is delayed, and when the coloring agent is added below 5 parts by volume, the formalin is fixed. There is a problem in that the effect of the disappearance of color is difficult to embed the specimen.
  • kits for diagnosing blood cancer cells including a blood cell aggregate for preparing paraffin block according to the present invention described above.
  • CTCs Circulating tumor cells
  • Blood cancer cell diagnostic kit of the present invention may further comprise a coloring agent for coloring the blood cell aggregates in 5 to 10 parts by volume with respect to 100 parts by volume of the blood cell aggregates contained in the blood cell aggregates for preparing paraffin block.
  • a coloring agent for coloring the blood cell aggregates in 5 to 10 parts by volume with respect to 100 parts by volume of the blood cell aggregates contained in the blood cell aggregates for preparing paraffin block.
  • the blood cells are 40 ⁇ l, 40 ⁇ l of gelatin solution and 2 ⁇ l of colorant are added to the blood cells to confirm that the blood cells and the gelatin solution are aggregated in the form of jelly.
  • Critical significance for the color developer content is the same as described above and will not be described.
  • the method for producing a paraffin block according to the present invention through the above-described paraffin block for blood cell aggregation agent (1) removing red blood cells from the blood of the subject and extracting blood cells; (2) mixing the blood cells with a blood cell aggregate for preparing paraffin block according to the present invention to produce blood cell aggregates; (3) curing the blood cell aggregates; And (4) treating the cured product according to step (3) with a paraffin block forming material.
  • cell pellets obtained from a small amount of blood can be prepared with paraffin block without damaging or losing the cells.
  • the prepared paraffin block can be obtained by only one blood sample of about 5 to 6 ml from the subject.
  • Assays can be performed on specific types of blood cells up to 50 to 60 times, which can be used for pathological as well as clinically very useful and useful assays. Specifically, by securing new new technologies for screening, retrieval and biological analysis of blood cancer cells, it is possible to simplify, reduce the cost and achieve high reliability through the development of comprehensive cancer diagnostic tools and methods.
  • the step (1) includes the step of removing red blood cells from the blood of the subject and extracting blood cells.
  • the red blood cells occupy the largest number of blood cells, and when manufactured with paraffin blocks including red blood cells, the probability of containing a specific type of blood cells among the blood cells contained per unit area of the paraffin block fragment may be very low. Can be.
  • various enzymes that may affect the cell membrane, DNA, RNA and cytoplasm of a specific type of blood cells may be released. Diagnosis of blood cells can be very disadvantageous or impossible. Accordingly, in order to prepare paraffin blocks for the diagnosis of blood cancer cells, only blood cells from which red blood cells are removed from blood collected from a subject should be extracted.
  • the conventional method for diagnosing blood cancer cells in blood removes white blood cells and extracts the final blood cancer cells through various chemical and physical processes as well as red blood cells in the blood of a subject.
  • the centrifugation there is a problem that can cause the loss of cancer cells in the blood, and can lower the collection rate of cancer cells in the blood.
  • the present invention samples blood cells from which blood is removed from blood, only red blood cells are sampled, which greatly simplifies the manufacturing process, shortens the manufacturing time, and reduces cell loss due to no physical or chemical treatment of the cancer cells. It is a very efficient method with high cell retention.
  • the red blood cell removal method that can be used in step (1) according to the present invention may include, but is not limited to, a conventional centrifugal method, inverted centrifugal method, filter method, destran method, and cell lysis method, but is not limited thereto. May be performed by Piccol treatment. Specifically, as shown in Experimental Example 3 below, after spiking 4000 colorectal cancer cell lines SW620 in normal blood (spicoll) and treated with ficoll (cell) and cell lysis (lysis buffer), respectively, red blood cells were removed. In the paraffin block prepared for blood cells, the blood cancer cell collection rate (the total number of blood cancer cells contained in the paraffin block was counted after cytokeratin staining and counted), and red blood cells were removed by picol treatment. The production of paraffin block is 1.7 times higher on average than the cell lysis method.
  • the tube (tube) from which the blood cells used in the step (1) are extracted may be coated with blood cell aggregates.
  • the coating means applying a blood cell aggregate of the same composition as the blood cell aggregate to be mixed with the blood cells in the following step (2) to the bottom surface of the container from which the blood cells are to be extracted.
  • the coating thickness is important to apply a constant so as not to be too thin or thick so that the collection of blood cells, the preferred coating thickness may be 1 ⁇ 2mm.
  • the reason for coating the tube for extracting blood cells with blood cell agglomerate in advance is that when the cell pellet jelly obtained through step (2) is separated from the cell, In order to prevent damage, loss and / or loss of the blood cell aggregates in advance in the container to be used in step (1) can be facilitated collection of blood cell aggregates.
  • step (2) the step of preparing a blood cell aggregate by mixing the blood cells extracted in step (1) with a blood cell aggregate for preparing paraffin block according to the present invention.
  • Paraffin block preparation for the production of paraffin blocks according to the present invention performs an extracellular matrix function on blood cells from which red blood cells have been removed from the blood, thereby maintaining loss of blood cells and damage to cytoplasm. Can maintain the antigenicity of cancer cells.
  • the blood cell flocculant for preparing paraffin block is preferably mixed in an amount of 80 to 150 parts by volume with respect to 100 parts by volume of blood pellets (cell pellet), and through this, the physical properties of the desired paraffin block. It may be more advantageous to the implementation.
  • the properties of the blood cell aggregate at a specific temperature may vary depending on the concentration of gelatin contained in the blood cell aggregate.
  • the concentration of gelatin may be changed in consideration of the performing temperature of step (2), and preferably any one of the following conditions (a) to (c) may be satisfied.
  • the concentration of gelatin in the nucleated cell aggregates in the blood is 5-15 mg / ml when the temperature in step (2) is 5 ° C. or more and less than 15 ° C.
  • Gelatin concentration in the nucleated cell coagulant in the blood is 15 ⁇ 25 mg / ml when the (2) step temperature is more than 15 °C less than 25 °C
  • the concentration of gelatin in the nucleated cell coagulant in the blood is 25-35 mg / ml when the performing temperature of step (2) is greater than 25 ° C but less than 35 ° C
  • gelatin is included as a blood cell aggregate, if the above conditions (a) to (c) are not satisfied, the gelatin melts in the blood cell aggregate prepared in step (2) and the blood cell aggregate cannot be separated from the container. It is difficult to produce the desired blood cell aggregates, and the following (3) step may be difficult to proceed the following process.
  • the concentration at which coagulated gelatin begins to melt differs depending on the temperature at which step (2) is performed, it is preferable to change the concentration of the solution in consideration of the temperature at which step (2) is performed.
  • the step (2) may further include a coloring agent for coloring the blood cell aggregates, and may further include a colorant in 5 to 10 parts by volume with respect to 100 parts by volume of the blood cell aggregates contained in the blood cell aggregates.
  • a coloring agent for coloring the blood cell aggregates may further include a colorant in 5 to 10 parts by volume with respect to 100 parts by volume of the blood cell aggregates contained in the blood cell aggregates.
  • red blood cells are separated from the blood of the subject, and blood cells are aggregated by administering the blood cell coagulant for preparing paraffin block such as gelatin (gelatin) in step (2).
  • the blood cell coagulant for preparing paraffin block such as gelatin (gelatin)
  • the process of manufacturing the blood is preferably finished within 2 hours after collecting the blood of the subject. This is because the blood cancer cells contained in the collected peripheral blood are more likely to undergo cell death than white blood cells.
  • the results of the cell spiking test sprinkled on normal blood using breast cancer cell lines were measured for blood which was left in time-dependent manner immediately after blood collection, 1 hour after blood collection, and 2 hours after blood collection.
  • the results of the cell spiking test sprinkled on normal blood using breast cancer cell lines were measured for blood which was left in time-dependent manner immediately after blood collection, 1 hour after blood collection, and 2 hours after blood collection.
  • step (3) the step of curing the cell aggregates prepared in step (2) is carried out.
  • the blood cell aggregate prepared in step (2) undergoes a curing step, whereby the cells can be separated from the blood cell aggregates in the container of, and the processing time of the general biological tissue that is the target of the paraffin block before the conventional paraffin block preparation ( Typically 12 hours or more) can be shortened to within 6 hours, it becomes easier to process the paraffin block forming material through step (4) described later, it may be more advantageous to implement as a paraffin block expressing the desired physical properties have.
  • the curing of step (3) may leave the blood cell aggregate prepared in step (2) at 2 ° C. to 5 ° C. for 15 to 30 minutes to cure the blood cell aggregate into a jelly form. Cured blood cell aggregates may be immobilized in formalin, methanol and the like for preservation of cells.
  • step (4) the step of treating the paraffin block forming material to the cured product prepared in step (3).
  • the paraffin block forming material may include alcohol, xylene, and paraffin, and the paraffin block forming material is treated in the order of alcohol, xylene and paraffin in the order of the cured product prepared in step (3). Blocks can be produced.
  • the automatic osmosis process may be performed by wrapping a cured product in paper and then treating alcohol, xylene and paraffin in this order.
  • the reason for the automatic infiltration process is as follows. First, in order to thinly thin a sample sample to be observed under the microscope, water may be removed from the sample sample fixed through the fixing solution to enable paraffin penetration (alcohol treatment step). Next, even though the water in the sample is removed by the treated alcohol, alcohol and paraffin are not mixed with each other, so that the alcohol may be removed using xylene (the xylene treatment step). Finally, in order to perform microscopic observation of the specimen, a thin specimen is required to be cut, and thus, a paraffin penetration process may be performed on the specimen in order to perform the cutting procedure (paraffin treatment step).
  • the alcohol treatment step may be performed by dividing into several steps, for example, by first treating a low concentration of alcohol (multiple times) and then processing a high concentration of alcohol (multiple times). May be performed. Such multiple treatments may be equally applied to the xylene treatment step and the paraffin treatment step.
  • the present invention provides a method for observing a specimen sample through a microscope using a paraffin block produced by the above-described method, which is cut into pieces of the paraffin block produced by the above-described method to a suitable size, Staining and observing the chopped paraffin block.
  • the cutting step may be carried out using a conventional cutting device such as a microtome (microtome), and the dyeing process may be performed using a dyeing reagent commonly used in the art.
  • a conventional cutting device such as a microtome (microtome)
  • the dyeing process may be performed using a dyeing reagent commonly used in the art.
  • Paraffin blocks according to the present invention prepared by performing the auto-infiltration process can be sliced by cutting to 3 to 10 ⁇ m thickness, and can be observed through the immunohistochemical staining of the cut block.
  • the paraffin block is thinned to a thickness of 4 to 5 ⁇ m, but the paraffin block of the present invention has a thickness of 3 to 10 ⁇ m, preferably 5 to 8 ⁇ m, more preferably in consideration of the size of blood cancer cells. Can be cut to a thickness of 7 to 8 ⁇ m to count the number of cancer cells in the blood.
  • the paraffin block according to the present invention When the paraffin block according to the present invention is cut to a thickness of 7 to 8 ⁇ m, 30 tests are possible at the time of blood collection of 6 ml blood, and when the thickness is cut to a thickness of 3 to 4 ⁇ m, 60 tests are possible. Dozens of tests are possible with just one small sample of blood, allowing different markers to be applied each time, and multiple tests at different time intervals. This can be
  • the immunohistochemical staining may be performed using staining reagents commonly used in the art, but the dyeing process is not limited thereto, but according to a preferred embodiment of the present invention, H & E staining or cytokeratin (CK) immunity Histochemical staining.
  • staining reagents commonly used in the art, but the dyeing process is not limited thereto, but according to a preferred embodiment of the present invention, H & E staining or cytokeratin (CK) immunity Histochemical staining.
  • Table 1 ⁇ Tissue specific diagnostic marker by primary site currently used in pathology diagnosis> Primary part Diagnostic marker Breast GCDFP-15, ER Colon CK 20, CDX2 Lung TTF1 Ovary ER, mesothelin Prostate PSA Stomach or pancreas CK7, CK20, MUC5AC
  • FISH fluorescence in situ hybridization
  • EDTA tube Three 15 ml tubes were prepared for each 6 ml of collected peripheral blood, and 5 ml of Ficoll was dispensed into each 15 ml container. Next, all the blood collected in the EDTA tube (tube) was put in a 50 ml container, and then phosphate buffer (PBS) was added to a volume of 2 times the blood and mixed.
  • PBS phosphate buffer
  • the cells were centrifuged at 2000 rpm for 20 minutes, and the serum, picol and three layers separated in the centrifuged container. The white buffy coat layer between serum and picol was identified, and only the white cell layer concentrated in the buffy coat layer was carefully collected. Thereafter, the collected cells were transferred to a new 50 ml container, phosphate buffer solution was added to adjust the final volume to 50 ml, and centrifuged at 1500 rpm for 10 minutes.
  • the gelatin solution was dissolved in a concentration of 10 mg / ml in hot water at 90 to 100 ° C. to form a gelatin solution, and then cooled to room temperature (22 ° C.).
  • the cured product was separated from the container. The cured product was put in a ml container, and 10 ml of neutral formalin was administered, and then stored at room temperature for 18 hours.
  • a paraffin block was prepared using a cured product of blood cell aggregates prepared in Examples 1-3.
  • the manufacturing method of the paraffin block of the present invention can reduce the manufacturing time by shortening the tissue processing process to 6 hours, it can be simplified.
  • alcohol was used as ethanol (Ethanol, Fisher Scientic), xylene as Xylene (DUKSAN), and paraffin as Histosec Pastillen (MERCK).
  • Example 2 Prepared in the same manner as in Example 1, in order to separate red blood cells in 1-2 of Example 1 to prepare a paraffin block using a cell lysate instead of picol.
  • Example 2 Prepared in the same manner as in Example 1, except that the concentration of gelatin solution in Examples 1 to 3 was 3 mg / ml, 20 mg / ml, 30 mg / ml, and 40 mg / ml instead of 10 mg / ml. Paraffin block was prepared at 50 mg / ml.
  • Example 1 Prepared in the same manner as in Example 1, except that the cancer cells spiked in 1-1 of Example 1 was used instead of colon cancer cell line SW620 breast cancer cell line SKBR3, after performing Example 1-1 Example 1- Instead of immediately performing 2, blood was left for 1 hour after performing Example 1-1, followed by Example 1-2 to prepare a paraffin block.
  • Example 1 Prepared in the same manner as in Example 10, but instead of leaving blood for 1 hour after performing Example 1-1, the paraffin block was prepared in the same manner as in Example 1 after 2 hours.
  • Paraffin block was prepared by changing blood aggregates in 1-3 as shown in Table 7 below.
  • the paraffin block prepared in Example 1 was subjected to cytokeratin (CK) staining for sections sliced to a thickness of 8 ⁇ m, and the photographs observed through the microscope are shown in FIG. 2.
  • CK cytokeratin
  • the CK immunohistochemical staining of the paraffin block thin sections shows that the brown cells are blood cancer cells.
  • paraffin blocks were made into continuous sections of 8 ⁇ m thick blocks, and cytokeratin staining was then performed on each section to count the number of blood cancer cells contained in the entire block.
  • Example 1 and Comparative Example The average value of the results for the paraffin block prepared by performing three times each 1 is shown in Table 3 below.
  • Example 1 TABLE 3 Number of sections Number of cancer cells per section Total cancer cell harvest rate Comparative Example 1 56 22 ⁇ 1.3 1017 (25%) Example 1 30 122 ⁇ 4.8 3732 (93%)
  • the collection rate of blood cancer cells through paraffin blocks prepared by Example 1 was 93% on average 3.7 than the 25% collection rate of blood cancer cells through paraffin blocks prepared by Comparative Example 1 It can be seen that the ship is high.
  • the number of sections cut from the paraffin block prepared according to Example 1 was 30, which is less than that of Comparative Example 1, but the number of blood cancer cells contained in each section was significantly higher than that of Comparative Example. have.
  • the paraffin block prepared in Example 1 can be inspected 30 times when cut to 8 ⁇ m thickness, 60 times can be carried out when cut to 4 ⁇ m thickness, it is possible to apply a different marker every time. can confirm.
  • Cancer cell collection rate (calculated after cytokeratin immunocytochemical staining the total number of cancer cells contained in the paraffin block in the paraffin block prepared in Example 1 and Example 2) Indicated.
  • Ficol treatment can confirm that the cancer cell collection rate is 1.7 times higher than that of the cell lysis method, thereby removing red blood cells from the blood in order to prepare paraffin blocks of better physical properties. It can be seen that processing picol is better.
  • Cancer cell harvesting rate (the total number of cancer cells included in the paraffin block was counted after cytokeratin immunocytochemical staining at room temperature 20 ° C. for paraffin blocks prepared in Examples 1 and 3 to 7) The calculation is shown in Table 5 below.
  • Example 5 As a result of comparing the cancer cell collection rate according to the gelatin solution concentration change, as shown in Table 5, in the case of Examples 1, 4, and 5 at room temperature, the cancer cell collection rate is high, whereas Examples 3, 6, and 7 are the cancer cell collection rates It can be seen that the remarkably decreased. In particular, in Example 5, when the concentration of gelatin solution was 30 mg / ml, the blood cancer cell collection rate was 80%, whereas in Example 6, when the concentration of gelatin solution was 40 mg / ml, the blood cancer cell collection rate was 23%. It can be seen that the decrease is 57% (reduction rate is 71.2%).
  • the concentration of the gelatin solution should be different according to the room temperature or the season, and in the winter season when the room temperature is 15 ° C. or less, even if the concentration of the gelatin is 10 mg / ml, it is possible to prepare a gel-type blood cell aggregate. If the gelatin concentration is 10mg / ml in the summer when the temperature is 25 °C or more, it can be confirmed that the gelatin concentration should be changed to a concentration exceeding 20mg / ml in order to prepare a gel-type blood cell aggregate according to the gelatin recording. have.
  • the cancer cell collection rate of the paraffin block is significantly changed according to the concentration of gelatin, and the cancer cell collection rate is better when the concentration of gelatin solution is 10 mg / ml than when the concentration of gelatin solution is 30 mg / ml
  • the room temperature is 5 ⁇ 15 °C to prepare the best blood cell aggregates in the concentration of gelatin solution to prepare a paraffin block 5 ⁇ 15mg / ml and at the same time to prepare a paraffin block having significantly superior physical properties It can be seen that.
  • the concentration of gelatin solution to 20 ⁇ 30mg / ml can be prepared the best blood cell aggregates and at the same time can be produced a paraffin block having significantly superior physical properties Able to know.
  • the concentration of gelatin solution was found to be the best conditions for making the aggregate when the concentration of 30mg / ml, the coagulated gelatin solution is As time goes by, the problem easily melts, and as it can be seen in Table 5 to solve this problem, when using too high concentration of gelatin solution, another problem occurs that the collection rate of blood cancer cells decreases.
  • the results of Table 6 show that at room temperature 25-35 ° C., paraffin blocks with remarkably excellent physical properties can be produced at the same time when the concentration of gelatin solution is 25-35 mg / ml. It can be seen that it can be produced.
  • Examples 12 to calculate the cancer cell collection rate (calculated after the cytokeratin (cytokeratin) immunohistochemical staining at 20 °C the total number of cancer cells contained in the paraffin block for the paraffin block prepared in Table 7) Shown in
  • Example 12 and Example 17 containing the gelatine solution alone as a blood coagulant can be confirmed that the blood cancer cell collection rate is generally excellent compared to the case of further containing other types of blood aggregates. .
  • the cancer cell collection rate may be further improved, which can be confirmed through Examples 17, 19 and 21.
  • Cancer cells and normal cells can be distinguished cytopathologically regardless of staining.
  • contaminated normal epithelial cells could be read as false-positive because the presence or absence of blood cancer cells is determined according to the surface markers positive or negative.
  • CK-positive squamous epithelial cells were removed from the skin during treatment of skin keratinocytes or erythrocytes and paraffin block during blood collection. It was confirmed that there could be contamination.
  • FIG. 6 the result of performing normal H & E staining, c-erbB2 immunohistochemistry and fluorescence in situ hybridization reaction test (FISH) on the breast cancer cell line (SKBR3) -derived blood cancer cells, Expression of the gene was observed.
  • EpCAM hepatic cancer cell lines
  • the naked eye and tissue findings of the primary colorectal cancer of the primary colorectal cancer and liver cancer recurrence of the patient can be confirmed, and the paraffin according to the manufacturing process of the present invention with blood collected in July 2012. Blood cancer cells could be identified from the section of the block.
  • tissue-specific markers already used for pathological diagnosis of metastatic carcinoma whose primary site is unclear can detect blood cancer cells more sensitively.
  • the method for preparing paraffin block according to the present invention is a non-invasive and simple method of detecting blood cancer cells present in blood through the collection of blood samples, which is very useful for the diagnosis and prognosis of cancer recurrence and metastatic cancer. Analysis of cancer onset, metastasis, and relapse mechanisms can provide a breakthrough in cancer treatment.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)

Abstract

본 발명은 혈중암세포 진단을 위한 파라핀 블록을 제작함에 있어서 사용되는 혈중 세포 응집용 물질 및 이를 이용한 파라핀 블록의 제작방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 혈액 내에 미량으로 존재하는 혈중암세포(CTC)를 파라핀 블록으로 제작함에 있어서 혈액 시료의 채취를 통해 혈액 내 존재하는 혈중암세포를 검출하는 방법이며, 비침습적이고 간단하기 때문에 암의 재발 및 전이암의 진단 및 예후 예측에 매우 유용하며, 암 발병, 전이 및 재발 기전의 분석을 통해 암 치료의 획기적인 전기를 마련할 수 있다.

Description

파라핀블록 제조용 혈중 세포 응집제 및 이를 이용한 파라핀블록 제조방법
본 발명은 파라핀블록 제조용 혈중 세포 응집제 및 이를 이용한 파라핀블록 제조방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 소량의 혈액으로부터 적혈구가 제거된 혈 내 존재하는 혈중 세포를 포함하는 파라핀블록을 제조함에 있어서 혈중 세포의 응집성을 향상시키고 동시에 혈중 세포의 손상 및 소실을 현저하게 방지할 수 있어 재현성이 높고, 민감도 및 특이도가 우수한 혈중암세포 진단을 위한 파라핀 블록을 구현할 수 있는 파라핀블록 제조용 혈중 세포 응집제 및 이를 이용한 파라핀블록 제조방법을 제공하는 것이다.
혈중암세포(Circulating tumor cell; 이하 CTC)는 혈액 중에 존재하여 체내를 순환하는 희소의 종양 세포들로, 암환자의 혈액 내 100만 개의 혈중 세포당 한 개가 존재한다고 알려져 있다. 극히 미량만 혈액 내 존재함에도 불구하고 전이성 유방암, 대장암 및 전립선암 환자에서 혈액 내 혈중암세포의 유무가 생존율과 연관된 중요한 예후 인자임이 밝혀지고 있으며, 최근에는 혈액 내 혈중암세포의 종양 특이적 표지자에 대한 모니터링에 의해 치료반응을 쉽게 예측할 수 있다는 보고들이 있다.
혈액을 통해 암을 진단하는 것을 종래에는 특정한 효소의 발현 증가 등을 통해 암발생 여부를 예측하였고, 대한민국 공개특허 특2003-0036010호는 혈액내 프로테인키나제의 효소활성 측정을 통한 암진단법을 개시하고 있다.
그러나, 아직까지 혈중에서 특정한 효소가 아닌 혈중암세포의 탐지는 혈중 종양 세포의 양, 즉 종양크기(tumor burden) 정도를 가늠하는 정량적 분석에 주로 국한되어 있는 실정이다. 만일 탐지된 혈중암세포를 수거하여 병리학적으로 분석할 수 있다면 이는 조직 검사가 어려운 말기 암환자들에게 조직 검사를 대체할 수 있는 진단법이 될 수 있으며, 불필요한 검사비를 줄이고 암의 조직학적 유형에 맞는 적절한 치료를 시행함으로써 치료 비용을 간접적으로 절감할 수 있어 이에 대한 연구가 계속되고 있다.
이러한 연구를 통해 현재까지 알려진 혈중암세포를 검출하기 위한 대표적인 방법으로는 단클론항체를 이용한 면역학적 분석법과 세포 크기에 의한 분리법이 있으며, 현재 대부분 개발 초기 단계로 일부에서 상용화가 된 상태이다. 그러나, 현재 사용되고 있는 방법은 일회성 검사법으로 혈중암세포의 단순 계수 혹은 혈중암세포에 대한 면역세포화학적 염색만 1 ~ 2회 정도 가능할 뿐이다. 또한 면역학적 분석법의 경우 사용하는 표면표지자가 EpCAM으로, 상피-간엽 이행을 보이는 혈중암세포 혹은 간세포암종이나 악성흑색종 등에서는 표지자가 암세포에 반응을 하지 않아 위음성을 보일 수 있는 단점이 있다. 나아가 세포 크기에 의한 분리법의 경우, 미세공(pore)이 있는 미세여과막을 이용하여 혈중암세포를 수거하는 것으로 아직까지 미세공의 크기가 다양하지 못하기 때문에 미세여과막내 미세공의 크기보다 작은 암세포는 걸러내지 못하며, 반대로 미세공의 크기가 백혈구 응집에 의하여 막힐 수 있다는 단점이 있어, 두 방법 모두 결정적인 문제점이 있다.
또한, 종래의 혈중암세포의 진단 방법은 화학적 처리를 통해 적혈구를 제거한 후, 또다시 미세여과막 또는 표면표지자에 의한 제거법으로 백혈구를 제거하여 혈중암세포만을 추출하는 방법을 사용하는데, 최종 혈중암세포를 추출하기까지 많은 단계를 거쳐야 하기 때문에 재현성이 떨어지는 문제점이 있다.
상기와 같은 문제점을 해결하기 위한 방법으로 혈중암세포를 포함하는 파라핀블록의 제조를 통해 혈중 암세포의 검출을 고려해 볼 수 있다.
통상적으로 파라핀블록은 조직이나 세포의 형태를 파악하고 이를 기초로 특수염색, 면역조직화학 염색 등 질병의 진단, 치료 및 연구목적에 이용되고 있다. 파라핀 블록을 이용한 진단의 적용은 일반적으로 생검조직을 통한 것이며, 생검조직을 고정하고, 고정이 끝난 조직은 파라핀 절편의 제작을 위하여 수세, 탈수, 투명, 파라핀 침투 과정을 거쳐 파라핀 블록을 만들게 되고 일정한 두께로 박절하여 건조 시키는 과정을 거친다.
상기와 같은 파라핀블록을 혈중 세포에 적용하기 위해서는 혈중 세포를 고정액에 고정하여 세포 군집 표본(cell block)을 만든 다음, 파라핀 절편으로 제작하는 과정을 거쳐야 한다. 이때, 통상적으로 생검조직에 대하여 세포 군집 표본을 제조하는 방법으로써 종래에는, a) 원심분리 및 포르말린을 이용한 침전 방법을 사용하는 침전물 고정법; b) 에탄올 속에서 에그 알부민이 응고되는 원리를 이용하는 에그 알부민 사용법; c) 아가(agar) 사용법; d) 혈장-트롬빈 응고법; e) 콜로디온 백 (collodion bag) 사용법; 및 f) 밀포어 필터 (Millpore filter) 방법 등이 사용되어 왔다.
그러나, 상기 세포 군집 표본을 제조하기 위한 종래의 방법 중 아가젤을 이용할 경우 검체를 지지시키는 아가젤이 수축하는 문제가 있고, 이를 통해 파라핀블록 제작 소요시간 및 소요비용이 현저히 증가하여 만족할 만한 성과를 얻지 못하는 단점이 있다.
또한, 상기 방법 중 원심분리를 통해 검체를 침전시키는 침전물 고정법을 혈중 세포에 대해 사용할 경우 혈중 세포의 파괴 및 소실로 인해 세포 군집 표본의 양이 적어지거나 조직이나 세포가 산재되고, 파라핀 침투 후에 세포 군집 표본과 파라핀과의 구분이 어려우며, 포매 시 핀셋으로 포매(embeding) 하기가 불가능하다는 문제점이 있다.
또한, 상기 방법들을 통해 혈중 세포를 세포 군집표본으로 만들어 제조된 파라핀블록의 절편에 염색을 시행할 경우, 배경 염색으로 인한 슬라이드 판독의 어려움이 있을 뿐 아니라, 세포의 파괴 및 소실로 인해 타겟팅한 특정 혈중 세포의 검출을 위한 민감도 및 특이도가 현저히 떨어지는 문제점이 있다.
나아가, 파라핀블록을 이용한 진단방법의 대상은 통상의 생검 조직 또는 체세포들로써, 이러한 생검 조직이나 체세포들은 세포간 접합성이 좋고, 세포들을 응집시키는 세포외 기질성 성분을 포함하고 있음에 따라 세포 군집 표본을 제조하기에 매우 용이하였다. 그러나 혈중 세포는 세포간 접합성이 없고, 세포들을 응집시킬 수 있는 세포외 기질의 기능을 수행하는 물질을 포함하고 있지 않음에 따라 각각의 세포가 응집되지 않고 분리되어 있는 상태이다. 이러한 상태의 혈중세포 시료는 상술한 여러 가지 세포군집 표본을 제조하는 방법을 수행해도 혈중 세포들이 응집되지 않기 때문에 혈중 세포를 대상으로 파라핀블록을 제조시, 제조 과정 중 혈중 세포의 유실이나 분실이 빈번하게 일어나, 목적하는 파라핀블록을 제조하기 매우 어려운 문제점이 있다.
더 나아가, 혈중 세포가 제대로 응집이 되지 않은 채, 포르말린 고정이나 파라핀블록 제조 과정에 처리될 경우, 혈중 세포 그 자체가 외부로 노출되어 보호되지 않음에 따라 파라핀블록을 제조하는 여러 중간 처리 과정 중 혈중 세포가 파괴 및 소실 또는 분실이 더 빈번하게 일어날 수 있다. 특히, 혈중 암세포는 혈액내 포함된다고 하더라도 극히 적은 개수로 포함되기 때문에 파괴 및 소실 또는 분실되는 혈중 세포가 혈중 암세포일 경우 제조된 파라핀블록을 통해 혈중 암세포를 진단할 수 없는 치명적인 문제점이 있다.
본 발명은 상술한 문제를 해결하기 위해 안출된 것으로, 본 발명의 첫 번째 해결하려는 과제는 파라핀 블록의 제조를 보다 용이하게 하고, 제조과정에서 목적한 특정의 혈중 세포의 파괴, 손상, 소실, 분실 등을 방지하여 목적한 혈중 세포의 진단 신뢰성을 현저히 향상시킬 수 있는 혈중 세포 응집제를 제공하는 것이다.
본 발명의 두 번째 해결하려는 과제는 혈중암세포 진단에 있어 재현성, 민감도 및 특이도가 현저히 우수한 혈중암세포 진단용 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 세 번째 해결하려는 과제는 재현성이 높고, 민감도 및 특이도가 현저히 우수한 혈중 세포 응집제를 이용한 파라핀 블록의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명은 상술한 첫 번째 과제를 달성하기 위하여, 혈중 세포에 대하여 혈중 세포들을 응집시키고, 혈중 세포의 손상 및 소실을 방지하는 세포외기질의 기능을 수행하는 혈중 세포 응집 물질;을 포함하는 파라핀블록 제조용 혈중 세포 응집제를 제공한다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 혈중 세포 응집물질은 젤라틴을 포함할 수 있다.
본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 따르면, 상기 젤라틴의 농도는 5 내지 35㎎/㎖일 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 상기 혈중 세포 응집물질은 펙틴(pectin), 콘드로이틴설페이트(chondroitin sulfate), 파이브로넥틴(fibronectin), 전분(starch) 및 라미닌(laminin)으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 물질을 더 포함할 수 있다.
본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 따르면, 혈중 세포 응집물질로 젤라틴 이외에 더 포함되는 물질은 젤라틴 중량의 5%이내의 중량일 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 상기 혈중 세포 응집제는 혈중 세포 응집물질을 발색시키기 위한 발색제를 더 포함하며, 상기 발색제는 혈중 세포 응집물질 100 부피부에 대하여 5 내지 10 부피부로 포함될 수 있다.
본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 따르면, 상기 젤라틴의 농도는 10 내지 30㎎/㎖일 수 있다.
본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 따르면, 상기 파라핀블록 제조용 혈중 암세포 응집제는 혈중 암세포 진단을 위한 용도일 수 있다.
또한, 본 발명은 상술한 두 번째 과제를 달성하기 위하여, 본 발명에 따른 파라핀블록 제조용 혈중 세포 응집제를 포함하는 혈중암세포 진단용 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 상술한 세 번째 과제를 달성하기 위하여, (1) 피검체의 혈액에서 적혈구를 제거하고 혈중 세포를 추출하는 단계; (2) 상기 혈중 세포를 본 발명에 따른 혈중 세포 응집제와 혼합하여 혈중 세포 응집체를 제조하는 단계; (3) 상기 혈중 세포 응집체를 경화시켜 단계; 및 (4) 상기 (3) 단계에 따른 경화체에 파라핀블록 형성물질을 처리하는 단계;를 포함하는 혈중 세포 응집제를 이용한 파라핀블록 제조방법을 제공한다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 (1) 단계에 사용되는 혈액세포가 추출되는 용기(tube)는 젤라틴용액이 코팅될 수 있다.
본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 따르면, 상기 (1) 단계의 적혈구 제거는 피콜(ficoll)을 이용할 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 상기 (2) 단계는 혈중 세포와 혈중 세포 응집제를 1: 1 ~ 1.5 부피비로 혼합시킬 수 있다.
본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 따르면, 상기 (2) 단계의 혈중 세포 응집제는 젤라틴을 포함하고, 상기 (2) 단계가 수행되는 온도에 따라 혈중 세포 응집제에서의 젤라틴 농도는 하기 조건 (a) 내지 (c) 중 어느 하나를 만족할 수 있다.
(a) (2) 단계 수행온도가 5℃ 이상 15℃ 미만일 때 혈중 세포 응집제에서 젤라틴의 농도는 5 ~ 15 ㎎/㎖임, (b) (2) 단계 수행온도가 15℃ 이상 25℃ 미만일 때 혈중 세포 응집제에서 젤라틴의 농도는 15 ~ 25 ㎎/㎖임, (c) (2) 단계 수행온도가 25℃ 초과 35℃ 미만일 때 혈중 세포 응집제에서 젤라틴의 농도는 25 ~ 35㎎/㎖임.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 상기 (4) 단계의 파라핀블록 형성물질은 알코올, 자일렌 및 파라핀을 포함하고, 상기 (4) 단계는 알코올, 자일렌 및 파라핀의 순으로 파라핀블록 형성물질을 처리하여 자동침투과정을 통해 수행될 수 있다.
본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 따르면, 상기 파라핀블록은 혈중암세포(circulating tumor cell)의 조직학적, 면역조직화학적 또는 분자생물학적 검출방법에 이용될 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 상기 (3) 단계 이후에 (3) 단계에 따른 경화체를 고정(fixation)하는 단계를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 따르면, 상기 경화체의 고정(fixation)은 포르말린, 메탄올 또는 에탄올로 구성된 군으로부터 선택되는 1종 이상의 것으로 수행될 수 있다.
이하, 본 발명에서 사용된 용어에 대해 정의한다.
본 발명에서 사용한 용어인 “혈중 세포”는 혈액, 바람직하게는 말초혈액에 포함된 세포를 의미하며, 상기 혈중 세포는 유핵 또는 무핵의 세포를 모두 포함하고, 상기 혈중 세포에는 통상적인 혈액세포(blood cell)외에 정상세포 및/또는 암세포를 모두 포함하는 의미이며, 상기 혈액세포는 매크로파지, 림프구(lymphocyte), 단구(monocyte) 등의 말초혈단핵구(peripheral blood mononuclear cell, PBMC), 적혈구, 백혈구 및 혈소판 등의 통상적으로 혈액세포로 분류되는 세포를 모두 포함하는 의미이다.
본 발명은 혈중 세포가 포함된 파라핀 블록을 제작함에 있어서, 종래의 통상적인 세포군집 표본을 제조하는 방법으로는 혈중 세포를 고정화시키기 어려운 난점 및 종래의 방법으로 고정화된 혈중 세포 군집 표본이 파라핀블록의 제조과정에서 손상, 분실 및/또는 소실되는 치명적인 문제점을 해결할 수 있다. 이를 통해 혈중 세포 중에 목적하는 특정 세포의 손상, 분실 및/또는 소실 없이 파라핀블록에 포함시킬 수 있어 이러한 파라핀블록을 통해 목적하는 특정 세포, 예를 들어 혈중 암세포를 조직학적, 면역조직화학적, 분자생물학적 등 다양한 방법을 통해 검출할 수 있다.
또한, 혈중 세포에 대한 여러 번의 원심분리 과정을 거치지 않음으로써 파라핀블록의 제조공정을 단순화할 수 있고, 제조시간 단축 및 제조비용을 절감할 수 있다.
또한, 종래의 혈중 암세포의 검출방법과 같이 혈액에서 적혈구 제거 후, 또다시 미세여과막 또는 표면표지자에 의한 백혈구 제거법과 같은 물리적 또는 화학적 처리 과정을 생략할 수 있어 목적한 혈중 암세포의 손실을 줄이고 세포 보존율을 높일 수 있다.
나아가, 본 발명을 통해 제조된 혈중 세포를 포함하는 파라핀블록은 배경염색을 감소시키고, 얇은 절편을 얻을 수 있어서 해상도가 뛰어나다. 또한, 혈중 암세포의 형태학적 확인이 가능해 오염된 상피세포와의 구별을 가능하게 하게 하고 이를 통해 위양성 판정의 오류를 줄일 수 있어 민감도 및 특이도가 매우 우수하다. 나아가, 단위면적당 포함된 백혈구와 혈중암세포의 계수로 혈액 단위부피당 혈중암세포의 계수가 가능하다. 더 나아가 검체시료가 파라핀블록으로 제조됨으로써 영구 보관이 가능하며, 30회 이상의 다양한 면역조직화학적 검사가 가능하다. 더 나아가 소량의 혈액 채취로도 파라핀블록의 제조가 가능하기 때문에 시간차를 두고 검체로부터 채취된 혈액을 파라핀 블록으로 제조 및 검사함으로써 암의 재발 및 전이암 진단 및 예후 측정이 가능하다.
도 1은 본 발명의 바람직한 일실시예에 따른 파라핀블록 제조방법에 대한 개략적인 실험과정을 나타내는 것이다.
도 2는 본 발명의 바람직한 일실시예 따라 대장암세포주(SW620)유래 혈중암세포로부터 제작된 파라핀 절편에 대해서 CK 면역조직화학염색을 수행 후 현미경을 사용하여 200배 배율로 관찰한 사진이다.
도 3은 본 발명의 바람직한 일실시예에 따라 정상 혈액에 대장암세포주(SW620)유래 혈중암세포를 암세포:백혈구 비율을 달리하여 스파이킹(spiking)한 후 제작된 파라핀 절편에 대해서 H&E 염색 및 CK 면역조직화학염색을 수행한 후 현미경을 사용하여 200배 배율로 관찰한 사진이다.
도 4는 본 발명의 바람직한 일실시예에 따라 대장암세포주(SW620)유래 혈중암세포로부터 제작된 파라핀 절편에 대해서 CK 면역조직화학염색을 수행한 다음, 오염에 의한 위양성 검출을 현미경을 사용하여 400배 배율로 관찰한 사진이다.
도 5는 본 발명의 바람직한 일실시예에 따라 유방암세포주(SKBR3)유래 검체의 채혈 후 적혈구 분리 처리 전까지 혈액 방치 시간별로 달리 제조된 파라핀블록을 통한 혈중암세포의 세포학적 양상을 관찰한 현미경 사진이다.
도 6은 본 발명의 바람직한 일실시예에 따라 유방암세포주(SKBR3) 유래 혈중암세포로부터 제작된 파라핀 절편에 대해서 H&E 염색, c-erbB2 면역조직화학염색 및 Her2/neu 유전자에 대한 형광동소교잡반응(FISH)을 수행한 다음, 현미경을 사용하여 1000배 배율로 관찰한 사진이다.
도 7은 본 발명의 바람직한 일실시예에 따라 간암세포주(HepG2) 유래 혈중암세포로부터 제작된 파라핀 절편에 대해서 H&E 염색 및 CK 면역조직화학염색을 수행한 다음, 암 특이표지자인 EpCAM 및 간암 특이표지자인 글리피칸-3(Glypican-3) 및 알파-펙토단백질(alpha-fetoprotein, AFP)에 대한 유전자 발현을 현미경을 사용하여 400배 배율로 관찰한 사진이다.
도 8은 본 발명의 바람직한 일실시예에 따른 대장암세포주(SW620)유래 혈중암세포로부터 제작된 파라핀 절편에 대해서 CK 면역조직화학염색을 수행한 다음, 암 특이표지자인 EpCAM 및 대장암 특이표지자인 CDX2 및 p53에 대한 유전자 발현을 현미경을 사용하여 400배 배율로 관찰한 사진이다.
도 9는 본 발명의 바람직한 일실시예에 따른 간 전이가 일어난 4기 대장암 환자의 혈액으로부터 제작된 파라핀 절편에 대해서 H&E 염색 및 CK 면역조직화학염색을 수행한 다음, 원발 종양의 암세포 및 혈중암세포의 세포학적 특성을 비교한 현미경 사진이다.
도 10은 상기 환자의 혈액에서 관찰된 혈중암세포에 대한 H&E 염색 및 CK 면역조직화학염색을 수행한 다음, 현미경을 사용하여 400배 배율로 관찰한 사진이다.
이하, 본 발명을 보다 상세히 설명한다.
상술한 바와 같이 파라핀블록은 조직이나 세포의 형태를 파악하고 이를 기초로 특수염색, 면역조직화학 염색 등 질병의 진단, 치료 및 연구목적에 이용되고 있지만, 종래의 방법으로는 혈중 세포를 대상으로 하여 파라핀블록을 제조하기 매우 어려운 문제점이 있었다. 또한, 종래의 방법들을 통해 혈중 세포를 세포 군집표본으로 만들어 파라핀블록을 제조했다고 하더라도 파라핀블록 절편을 염색시킬 경우 배경 염색이 과도하여 타겟팅한 특정 혈중 세포의 검출을 위한 민감도 및 특이도가 현저히 떨어지는 문제점이 있었다. 나아가 혈중 세포는 통상의 파라핀블록 대상이 되는 생검조직과 다르게 세포막 표면에 세포간 응집 등의 세포외 기질의 기능을 수행하는 물질을 포함하고 있지 않음에 따라 각각의 세포가 응집되지 않고 분리됨에 따라 혈중 세포를 대상으로 파라핀블록을 제조시 혈중 세포의 유실이나 분실이 빈번하여 목적하는 파라핀블록을 제조하기가 매우 어려운 문제점이 있었다. 더 나아가, 혈중 세포가 포르말린 고정이나 파라핀블록 제조 과정을 거칠 경우 혈중 세포 그 자체가 외부로 노출되어 보호되지 않음에 따라 파라핀블록을 제조하는 여러 중간 처리 과정에서 혈중 세포가 파괴, 소실 및/또는 분실이 빈번하게 발생하였다. 특히, 혈중 암세포는 혈액내 포함된다고 하더라도 극히 적은 개수로 포함되기 때문에 파괴, 소실 및/또는 분실되는 혈중 세포가 혈중 암세포일 경우 제조된 파라핀블록을 통해 혈중 암세포를 진단할 수 없는 치명적인 문제점이 있었다. 더 나아가 종래의 혈중암세포의 진단 방법은 화학적 처리를 통해 적혈구를 제거한 후, 다시 미세여과막 또는 표면표지자에 의한 백혈구 제거법을 거쳐 혈중암세포만을 추출함에 따라 혈중암세포 추출까지 많은 단계를 거쳐야 하기 때문에 재현성이 떨어지는 문제점이 있었다.
이에 본 발명에서는 혈중 세포에 대하여 혈중 세포들을 응집시키고, 혈중 세포의 손상 및 소실을 방지하는 세포외기질의 기능을 수행하는 혈중 세포 응집 물질;을 포함하는 파라핀블록 제조용 혈중 세포 응집제를 통해 상술한 문제의 해결을 도모하였다. 이를 통해 혈중 세포가 포함된 파라핀 블록을 제작함에 있어서, 종래의 통상적인 생체조직을 대상으로한 세포군집 표본 제조방법으로는 혈중 세포를 세포군집 표본으로 제조하기 어려운 난점 및 종래의 생체조직의 표본화 방법으로 제조된 혈중 세포 군집 표본이 파라핀블록의 제조과정에서 손상, 분실 및/또는 소실되는 치명적인 문제점을 해결할 수 있다. 이를 통해 혈중 세포 중에 목적하는 특정 세포의 손상, 분실 및/또는 소실 없이 파라핀블록에 포함시킬 수 있어 이러한 파라핀블록을 통해 목적하는 특정 세포, 예를 들어 혈중 암세포를 조직학적, 면역조직화학적, 분자생물학적 등 다양한 방법을 통해 검출할 수 있다. 또한, 혈중 세포에 대한 여러 번의 원심분리 과정을 거치지 않음으로써 파라핀블록의 제조공정을 단순화할 수 있고, 제조시간 단축 및 제조비용을 절감할 수 있다. 나아가, 종래의 혈중 암세포의 검출방법과 같이 다단계의 혈구세포 제거를 위한 물리적 또는 화학적 처리 과정을 생략할 수 있어 목적한 혈중 암세포의 손실을 줄이고 세포 보존율을 높일 수 있다.
먼저, 혈중 세포에 대하여 혈중 세포들을 응집시키고, 혈중 세포의 손상 및 소실을 방지하는 세포외기질의 기능을 수행하는 혈중 세포 응집 물질에 대해 설명한다.
구체적으로 상기 혈중 세포는 혈액, 바람직하게는 말초혈액에 포함된 세포를 의미하며, 상기 혈중 세포는 유핵 또는 무핵의 세포를 모두 포함할 수 있고, 상기 혈중 세포에는 통상적인 혈액세포(blood cell)와 정상세포 및/또는 암세포를 모두 포함할 수 있으며, 상기 혈액세포는 매크로파지, 림프구(lymphocyte), 단구(monocyte) 등의 말초혈단핵구(peripheral blood mononuclear cell, PBMC), 적혈구, 백혈구 및 혈소판 등 통상적으로 혈액세포로 분류되는 세포를 모두 포함할 수 있다.
바람직하게는 상기 혈중 세포 응집물질은 적혈구를 제거한 혈중 세포들에 대해서 세포외 기질의 기능을 수행할 수 있다. 본 발명에 따른 혈중 세포 응집물질은 혈중 세포의 구체적 종류에 따라 효과발현의 정도가 달라지지 않을 수 있다. 다만, 혈중 세포 중에서 적혈구가 아닌 다른 특정 혈중 세포, 예를 들어 혈중 암세포를 진단하기 위한 파라핀블록 제조를 목적으로 할 경우 본 발명에 따른 혈중 세포 응집물질은 혈중 세포 중에서 적혈구를 제거한 세포들에 대해서 세포외 기질의 기능을 수행할 수 있다. 통상적으로 혈액내에 포함된 혈중세포 중에서 적혈구는 세포수에 있어 높은 비율을 차지하기 때문에 적혈구를 포함하여 파라핀블록으로 제조시 파라핀블록 절편의 단위면적당 포함되는 혈중세포 중 목적한 특정 종류의 혈중 세포가 포함될 확률은 매우 낮아질 수 있다. 또한, 파라핀블록의 제조과정에서 적혈구가 손상, 파괴 등이 될 경우 목적한 특정 종류 혈중 세포의 세포막, DNA, RNA 및 세포질 등에 영향을 줄 수 있는 각종 효소(enzyme)들이 방출될 수 있어 목적한 특정 혈중 세포의 진단이 매우 불리하거나 불가능할 수 있다. 이에 따라 혈중 암세포 진단을 위한 파라핀블록을 제조하기 위해서 상기 혈중 세포 응집물질은 적혈구를 제외한 혈중 세포들에 대해 세포외기질의 기능을 수행함이 바람직하다.
한편, 본 발명에 따른 혈중 세포 응집물질은 혈중 세포들을 응집시키고, 혈중 세포의 손상 및 소실을 방지하는 세포외기질의 기능을 수행하는데, 이하 혈중 세포 응집물질의 기능에 대해 구체적으로 살펴본다.
통상적으로 세포외기질(extracellular matrix)은 조직내 또는 세포외의 공간을 채우고 있는 생체고분자의 집합체를 의미하며, 모든 조직에 존재하나 결합조직에 특히 다량으로 존재한다. 상기 세포외기질은 그 기능에 있어 조직의 지지와 결합, 물리적 경계, 힘의 흡수, 탄성 등의 물리적 기능에 나아가 최근에는 세포증식, 세포이동, 세포내 대사, 세포분화, 세포의 형태 등을 세포의 외부에서 조절하는 생리화학적 역할까지 담당하는 것으로 연구를 통해 알려져 있다.
본 발명에 따른 혈중세포 응집제에 포함되는 혈중 세포 응집물질 역시 혈중세포에 대하여 상기와 같은 세포외기질의 기능을 수행하는데 다만, 통상적으로 세포외 기질의 기능으로 알려진 세포증식, 세포이동, 세포내 대사 등에 관여하는 생리화학적 역할이 아닌 혈중 세포의 응집, 혈중세포 외부에서 가해지는 물리적 요소의 방어, 흡수, 탄성요소 등의 물리적 기능을 담당하고, 이를 통해 혈중 세포 응집물질은 혈중세포의 손상 및 소실을 방지하는 기능을 수행할 수 있다.
보다 구체적으로 상기 혈중 세포의 응집이란 혈중 세포 응집물질(또는 이를 포함하는 혈중 세포 응집제)를 매개로 하여 개개로 분리된 상태의 혈중 세포가 물리적으로 응집된 형태를 구현하는 것을 의미하며, 혈중세포 응집물질이 리간드가 되어 혈중세포의 세포막 표면의 수용체와 결합에 따른 응집이나 혈중 세포 응집물질의 화학적 변화에 따라 혈중세포가 응집되는 것을 의미하지 않을 수 있다. 이에 따라 본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 혈중 세포 응집물질은 혈장성분, 보다 바람직하게는 혈장단백질, 예를 들어 피브리노겐, 프로트롬빈 또는 이들의 활성화된 상태의 트롬빈이나 피브린 등을 포함하지 않을 수 있고, 이에 따라 혈중 세포 응집물질이 혈중세포를 응집시키는 것은 통상적인 혈액응고 기작에 의한 응집이 아닐 수 있다. 혈액응고 기작에 의해 혈중 세포가 응집될 경우 응집체내 적혈구가 과다하게 포함되어 파라핀블록으로 제작해도 단위 면적당 포함된 적혈구 외의 혈중 세포의 양이 너무 적어 진단적 효용성이 매우 낮으며, 적혈구 용혈 현상에 따른 세포내 효소 방출로 인하여 혈중세포의 DNA및 RNA에 손상을 주어 제조된 혈중세포 응집체의 진단적 가치가 매우 떨어지고 혈장단백질로는 발명의 목적을 달성할 수 없는 문제점들 있다.
본 발명에 따른 혈중 세포 응집제에 포함되는 혈중 세포 응집물질은 상술한 기능을 발현할 수 있음에 따라 혈중세포를 파라핀블록으로 제조함에 있어 매우 유리할 수 있다. 이는 파라핀블록의 대상은 세포군집 표본으로 제조된 후 상기 표본에 파라핀이 처리되는데, 통상적인 파라핀블록의 제조 대상은 생체조직으로서, 통상적인 생체조직은 세포간 접합성이 있는 세포들이 모여 군집을 이루고, 상기 군집을 이룬 각각의 세포들은 세포 외부에 세포외기질을 포함하여 세포들이 보다 더 응집되고 세포들 자체가 물리적으로 보호될 수 있다. 그러나, 혈중 세포는 생체조직과 다르게 각각의 세포가 독립적으로 혈액내를 부유하며, 세포간 접합성이 없을 뿐 아니라, 세포막 바깥에 세포외기질을 수행하는 물질들을 포함하고 있지 않다. 이러한 특성을 갖는 혈중세포들을 대상으로 세포군집 표본을 제조할 경우 혈중 세포가 응집되지 않아 세포군집 표본 자체를 제조하기 어렵고, 세포들이 응집되지 않은 상태로 파라핀블록을 제조하기 위한 여러 단계를 거칠 경우 목적한 특정 종류의 혈중 세포가 분실될 수 있다. 또한, 혈중 세포가 보호되지 않아 파라핀블록을 제조하기 위한 여러 단계를 거치면서 목적한 특정종류의 혈중 세포가 손상될 수 있고, 60℃ 이상으로 가온 시켜 녹인 파라핀을 처리하는 과정에서 목적한 특정 종류의 혈중 세포가 소실될 수 있는 문제점이 있다. 본 발명에 따른 혈중 세포 응집제에 포함되는 혈중 세포 응집물질은 상기 문제점을 해결할 수 있도록 혈중세포에 대해 세포외기질의 기능을 수행할 수 있음에 따라 혈중세포를 응집시키고, 파라핀블록 제조과정에서 혈중세포의 손상이나 소실을 방지할 수 있다.
본 발명의 바람직한 일실시예 따르면, 상술한 혈중 세포 응집물질은 젤라틴을 포함할 수 있다.
구체적으로 젤라틴은 식품이나 공업용으로 다양한 용도로 사용되며, 냉수에는 팽윤할 뿐이지만 온수에는 녹아 졸(sol)로 되고, 2 ~ 3% 이상의 농도에서는 실온 이하로 식히면 겔(gel)이 되는 성질을 가지고 있어 열에 안정적인 분자이므로, 본 발명의 혈중 세포 응집물질로서 적합할 수 있다. 또한, 다른 종류의 세포외 기질을 수행할 수 있는 물질보다 단독으로 혈중 세포를 응집시킬 때, 혈중 세포의 손상 및 소실을 방지하는 효과가 더 우수하여 본 발명이 목적하는 물성이 우수한 파라핀블럭을 제조하는데 있어 보다 유리하다. 본 발명에 따른 혈중 세포 응집물질로 젤라틴은 콜라겐을 포함하는 의미일 수 있다. 상기 젤라틴은 바람직하게는 용매와 혼합된 젤라틴 용액의 상태로 포함될 수 있다. 상기 용매는 인산완충 용액, 증류수, 생리식염수 등을 포함할 수 있으며, 본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면 증류수일 수 있다.
또한, 혈중 세포 응집물질로 포함되는 젤라틴은 본 발명에 따른 파라핀블록 제조용 혈중 세포 응집제에 바람직하게는 5 내지 35㎎/㎖ 의 농도로 포함될 수 있고, 보다 바람직하게는 5 ~ 30㎎/㎖ 의 농도로, 보다 더 바람직하게는 5 내지 20㎎/㎖ 의 농도로 포함될 수 있다. 만일 젤라틴의 농도가 5㎎/㎖ 미만일 경우 혈중 세포를 대상으로 파라핀블록을 제조했을 때 젤라틴 응고에 시간이 걸려 세포에 손상을 주거나, 젤라틴이 녹아 혈중세포 진단의 민감도 및 특이도가 현저히 저하될 수 있다. 또한, 만일 젤라틴의 농도가 35㎎/㎖를 초과할 경우 파라핀블록의 경도가 증가하여 파라핀블록의 박절 과정에서 파라핀 절편이 튕겨나가거나 부스러져 혈중세포의 손실을 유발하여 혈중 세포 진단의 민감도 및 특이도가 현저히 저하될 수 있다. 구체적으로 젤라틴 농도 변화에 따른 혈중암세포 수거율을 비교한 하기 표 5를 통해 확인할 수 있듯이, 젤라틴의 농도가 10㎎/㎖일 때 혈중 암세포 수거율이 93%인데 반하여 젤라틴의 농도가 3㎎/㎖인 경우 혈중암세포 수거율이 68%로 현저히 낮은 것을 확인할 수 있으며, 젤라틴의 농도가 50㎎/㎖인 경우 혈중암세포 수거율이 6%에 불과함을 확인할 수 있다.
한편, 상기 혈중 세포 응집물질은 펙틴(pectin), 콘드로이틴설페이트(chondroitin sulfate), 파이브로넥틴(fibronectin), 전분(starch) 및 라미닌(laminin)으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 물질을 더 포함할 수 있다. 상기와 같은 물질을 더 포함함을 통해 파라핀블록으로 제조했을 때 혈중세포에 대한 민감도 및 특이도를 향상시킬 수 있다. 특히 젤라틴이 혈중 세포 응집물질로 포함되는 경우 젤라틴은 그 농도에 따라 온도별 성상이 달라질 수 있는데, 특정 온도범위에서 고상 또는 반고상을 갖게 하기 위해 젤라틴의 농도를 높일 경우 목적한 성상은 구현되나 반대로 파라핀블록의 혈중세포에 대한 민감도 및 특이도는 현저히 저하될 수 있는 문제점이 있다. 예를 들어 본 발명에 따른 바람직한 일실시예에 따르면, 젤라틴의 농도가 20㎎/㎖인 경우 실내온도가 28℃인 실내에 10분 이상 거치하면 성상이 액상으로 변하는데(하기 표 6 참조) 실내온도가 28℃에서 성상을 고상 또는 반고상으로 유지시키기 위해 젤라틴의 농도를 20㎎/㎖ 보다 높게 증가시킬 경우 목적하는 대로 고상 또는 반고상의 성상을 유지할 수 있지만, 반대로 목적하는 파라핀블록의 혈중 암세포에 대한 민감도 및 특이도를 구현할 수 없을 수 있다. 구체적으로 하기 표 5에서 젤라틴 농도가 30㎎/㎖일 경우 파라핀블록의 혈중 암세포 수거율은 80%이나 젤라틴 농도가 50㎎/㎖일 경우 파라핀블록의 혈중 암세포 수거율은 6%까지 현저히 저하되어 일정 농도 이상에서 젤라틴의 농도가 증가할수록 혈중 암세포 수거율이 감소하여 혈중 암세포에 대한 파라핀블록의 민감도 및 특이도가 현저히 저하되는 것을 확인할 수 있다.
따라서, 특정 실내온도에서 목적하는 성상을 유지하기 위해 증가시킨 젤라틴 농도에 따라 감소된 혈중세포에 대한 민감도 및 특이도를 보전하기 위해 펙틴(pectin), 콘드로이틴설페이트(chondroitin sulfate), 파이브로넥틴(fibronectin), 전분(starch) 및 라미닌(laminin)으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 물질을 혈중 세포 응집물질에 더 포함할 수 있고, 이 경우 특정온도에서 목적한 성상을 유지하는 동시에 목적하는 혈중세포에 대한 민감도 및 특이도를 발현시킴에 있어 보다 유리할 수 있다.
바람직하게는 혈중 세포 응집물질로 젤라틴 이외에 더 포함되는 상기 물질은 젤라틴 중량의 5%이내로 포함될 수 있다. 만일 젤라틴 이외에 혈중 세포 응집물질로 더 포함되는 물질이 젤라틴 중량의 5%를 초과하여 포함될 경우 파라핀블록의 경도가 증가하여 파라핀블록의 박절 과정에서 파라핀블록이 깨지거나 부스러져 혈중세포의 손실을 유발하는 등 혈중 세포 진단의 민감도 및 특이도가 떨어지는 문제점이 있을 수 있다.
한편, 혈중 세포 응집물질에 젤라틴을 포함하지 않고, 상기 젤라틴 이외에 혈중세포 응집물질로 추가되는 물질만을 포함할 경우 목적하는 물성을 구현하기 어려울 수 있다. 구체적으로 상기 전분(starch)은 사용이 간편하지만 분리되기 쉽고 농도조절을 한 후 식으면 다시 열을 가해도 처음과 같은 점성 또는 품질이 나오지 않는 단점이 있으며, 또한 찬물에는 녹지 않으나, 더운물에는 부풀어 호화(糊化)하는 물적 특성이 있어 파라핀 블록의 제조에 사용하는데 있어서 문제점이 있고, 혈중 세포의 응집을 향상시키기 위해 전분의 농도를 고농도로 높일 경우 응집력은 향상되지만 경도가 지나치게 높게 되어 파라핀블록의 박절 과정에서 파라핀블록이 깨지거나 으스러질 수 있고, 이때 혈중 세포의 손상, 소실이 있을 수 있어 혈중세포 응집물질로 단독 사용이 제한적일 수 있다.
또한, 상기 펙틴(pectin)은 탄수화물의 중합체로 식품에 응고제, 증점제, 안정제, 고화방지제, 유화제 등으로 사용되는데, 펙틴의 증점력과 겔화력은 산과 에스터의 균형에 따라 다르며, 산이 50%를 넘지 않거나 또는 비에스터화된 펙틴의 경우 칼슘이온으로 겔을 형성하려는 경향이 강하여, 혈중세포 응집물질로 단독 사용이 제한적일 수 있다.
또한, 상기 파이브로넥틴(fibronectin) 및 라미닌(laminin) 또한 열에 안정적이지 않아 혈중세포 응집물질로 단독 사용이 제한적일 수 있다.
본 발명의 혈중 세포 응집물질로 젤라틴이 포함될 경우 젤라틴은 무색 투명하므로, 용기 내에서 응집화(jelly) 여부를 유관으로 확인하기 어렵기 때문에, 본 발명의 혈중 세포 응집용 물질에는 세포외기질을 발색하기 위한 발색제가 더 포함될 수 있다.
상기 발색제는 브로모페놀 블루(Bromophenol blue), 카본 블랙(carbon black), N,N-디메틸 라미노에탄올(N,N-dimethy laminoethanol), 구리 프탈로시아닌(copper phthaloc yanine), 펜스퍼스 오렌지(pennsperse orange) 등을 포함할 수 있으며, 본 발명의 일실시예에 따른 혈중 세포 응집물질을 발색하기 위한 발색제는 바람직하게는 브로모페놀 블루(Bromophenol blue)가 포함된 로딩 용액(loading buffer)(Takara Bio Inc)일 수 있으며, 상기 발색제는 혈중 세포 응집물질 100 부피부에 대하여 5 내지 10 부피부로 파라핀블록 제조용 혈중세포 응집제에 포함될 수 있다. 만일 혈중 세포 응집물질 100 부피부에 대하여 발색제가 10 부피부를 초과하여 첨가될 경우 검체 응집력이 오히려 약화되거나 검체 응집이 지연된다는 문제점이 있고, 발색제가 5부피부 미만으로 첨가될 경우 포르말린 고정에 따라 발색의 효과가 사라져 검체의 포매가 어려워지는 문제점이 있다.
한편, 본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상술한 본 발명에 따른 파라핀블록 제조용 혈중 세포 응집제를 포함하는 혈중 암세포 진단용 키트를 구현할 수 있다.
본 발명의 혈중 암세포 진단용 키트를 이용하여 진단할 수 있는 암의 종류에 있어서 제한은 없으나, 암환자의 혈액 내 100만개의 혈중 세포당 한 개가 존재한다고 알려져 있고, 혈액 중에 존재하여 체내를 순환하는 희소의 종양 세포인 혈중암세포(Circulating tumor cell: CTC)를 확인함으로써 진단 가능한 암을 포함할 수 있고, 혈액 중에 극히 미량만 존재함에도 불구하고 혈액 내 혈중암세포의 유무가 생존율과 연관된 중요한 예후 인자임이 밝혀진 전이성 유방암, 대장암, 간암 또는 전립선암을 진단하기 위한 키트일 수 있다.
본 발명의 혈중 암세포 진단용 키트는 파라핀블록 제조용 혈중세포 응집제에 포함된 혈중세포 응집물질 100 부피부에 대하여 혈중세포 응집물질을 발색하기 위한 발색제를 5 내지 10의 부피부로 더 포함할 수 있다. 예를 들어, 혈중 세포가 40㎕일 경우, 혈중 세포에 젤라틴 용액 40㎕, 발색제 2㎕을 넣어 혈중 세포와 젤라틴 용액이 젤리형태로의 응집된 것을 확인할 수 있다. 상기 발색제 함량에 대한 임계적의의는 상술한 바와 동일하여 설명을 생략한다.
한편, 상술한 파라핀블록 제조용 혈중 세포 응집제를 통해 본 발명에 따른 파라핀블록을 제조하는 방법은 (1) 피검체의 혈액에서 적혈구를 제거하고 혈중 세포를 추출하는 단계; (2) 상기 혈중 세포를 본 발명에 따른 파라핀블록 제조용 혈중 세포 응집제와 혼합하여 혈중 세포 응집체를 제조하는 단계; (3) 상기 혈중 세포 응집체를 경화시키는 단계; 및 (4) 상기 (3) 단계에 따른 경화체에 파라핀블록 형성물질을 처리하는 단계;를 포함한다. 이를 통해 소량의 혈액으로부터 얻은 혈중 세포들(cell pellet)을 세포의 손상, 소실 등 없이 파라핀블록으로 제조할 수 있고, 이렇게 제조된 파라핀블록은 피검체로부터 오직 5 ~ 6㎖ 정도의 한 번의 채혈만으로 50 ~ 60회까지 목적하는 특정 종류의 혈중 세포에 대한 분석 실험을 진행할 수 있고, 이러한 점은 병리학적으로는 물론 임상적으로도 적용 범위가 매우 넓고, 유용한 검사법에 사용 될 수 있다. 구체적으로, 혈중암세포의 선별, 회수 및 생물학적 분석의 새로운 신기술을 확보함으로써, 종합적인 암 진단 도구와 방법의 개발을 통한 암 진단의 간소화, 저렴화 및 고신뢰도를 획득할 수 있다.
먼저, (1)단계로써 피검체의 혈액에서 적혈구를 제거하고 혈중 세포를 추출하는 단계를 포함한다.
상기 적혈구는 혈액세포 중에서 수적으로 가장 큰 비중을 차지하는 세포로, 적혈구를 포함하여 파라핀블록으로 제조시 파라핀블록 절편의 단위면적당 포함되는 혈중세포 중, 목적한 특정 종류의 혈중 세포가 포함될 확률은 매우 낮아질 수 있다. 또한, 파라핀블록의 제조과정에서 적혈구가 손상, 파괴 등이 될 경우 목적한 특정 종류 혈중 세포의 세포막, DNA, RNA 및 세포질 등에 영향을 줄 수 있는 각종 효소(enzyme)들이 방출될 수 있어 목적한 특정 혈중 세포의 진단이 매우 불리하거나 불가능할 수 있다. 이에 따라 혈중 암세포 진단을 위한 파라핀블록을 제조하기 위해서 피검체에서 채혈된 혈액에서 적혈구를 제거한 혈중세포만을 추출해야 한다.
한편, 종래의 혈중 암세포 진단방법은 피검체의 혈액에서 적혈구뿐만 아니라 여러 화학적, 물리적 처리과정을 거쳐 백혈구까지 제거하고 최종 혈중 암세포를 추출하였는데, 이러한 종래의 방법은 최종 혈중 암세포의 추출까지 여러 단계를 거치며, 여러 번의 원심분리는 혈중 암세포의 손실을 유발할 수 있고, 혈중 암세포의 수거율을 저하시킬 수 있는 문제가 있었다. 그러나 본 발명은 피검체에서 채취한 혈액에서 오직 적혈구만을 제거한 혈중 세포를 표본화하기 때문에 제조과정이 매우 간소화되고, 제조시간이 단축되며, 혈중암세포에 대한 물리적 또는 화학적 처리를 하지 않기 때문에 세포 손실이 적고, 세포 보존율이 높은 매우 효율적인 방법이다.
본 발명에 따른 (1) 단계에서 사용될 수 있는 적혈구 제거방법은 통상적인 원심법, 도립(倒立)원심법, 필터법, 데스트란법 및 세포 용해법 등을 포함할 수 있으나 이에 제한되지 않으나, 보다 바람직하게는 피콜 처리법으로 수행될 수 있다. 구체적으로, 하기의 실험예 3을 통해 확인할 수 있듯이, 정상혈액에 대장암 세포주 SW620 4000개를 스파이킹(spiking)한 후 피콜(ficoll)과 세포 용해액(lysis buffer)을 각각 처리하여 적혈구를 제거한 혈중 세포를 대상으로 제조한 파라핀 블록에서 혈중 암세포 수거율(파라핀 블록에 포함된 혈중암세포의 전체 수를 사이토케라틴(Cytokeratin) 염색 후 계수하여 수거율 산정)을 비교 분석한 결과, 피콜 처리법으로 적혈구를 제거하여 파라핀블록을 제조한 경우가 세포용해법을 이용한 경우에 비하여 수거율이 평균 1.7배 높음을 확인할 수 있다.
또한, 본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 (1) 단계에 사용되는 혈액세포가 추출되는 용기(tube)는 혈중 세포 응집제가 코팅된 것을 사용할 수 있다. 상기 코팅은 하기 (2) 단계에서 혈중 세포에 혼합될 혈중 세포 응집제와 동일한 조성의 혈중 세포 응집제를 혈중 세포를 추출할 용기 바닥면에 도포하는 것을 의미한다. 이때 코팅시키는 두께는 혈중 세포의 수거가 용이할 수 있도록 너무 얇거나 두껍지 않도록 일정하게 도포하는 것이 중요하며, 바람직한 코팅 두께는 1 ~ 2mm 일 수 있다.
혈중 세포를 추출할 용기(tube)를 미리 혈중 세포 응집제로 코팅하는 이유는 하기 (2) 단계를 통해 수득되는 혈중 세포 응집체(Cell pellet jelly)를 용기에서 분리할 때, 혈중 세포들(cell pellet)의 손상, 손실 및/또는 분실을 방지하기 위함이며, (1) 단계에 사용될 용기에 미리 혈중 세포 응집제를 코팅해 놓음으로써 혈중 세포 응집체의 수거를 용이하게 할 수 있다.
다음으로 본 발명에 따른 (2) 단계로써, (1) 단계에서 추출된 혈중 세포를 본 발명에 따른 파라핀블록 제조용 혈중 세포 응집제와 혼합하여 혈중 세포 응집체를 제조하는 단계를 포함한다. 본 발명에 따른 파라핀블록 제조용 혈중 세포 응집제는 혈액에서 적혈구가 제거된 혈중 세포에 대하여 세포외기질(extracellular matrix)기능을 수행함에 따라 혈중 암세포의 소실 및 세포질 손상이 되지 않도록 유지시켜 주며, 이를 통해 혈중 암세포의 항원성을 유지시킬 수 있다.
상기 본 발명에 따른 파라핀블록 제조용 혈중 세포 응집제에 대한 설명은 상술한 바와 동일하여 생략한다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 파라핀블록 제조용 혈중 세포 응집제는 혈중 세포(cell pellet) 100 부피부에 대하여 80 내지 150의 부피부로 혼합하는 것이 바람직하며, 이를 통해 목적하는 파라핀블록의 물성 구현에 보다 유리할 수 있다.
한편, 본 발명에 따른 파라핀블록 제조용 혈중 세포 응집제에 포함되는 혈중 세포 응집물질로 젤라틴이 사용되는 경우 상기 혈중 세포 응집제에 포함된 젤라틴의 농도에 따라 특정 온도에서의 혈중 세포 응집체의 성상이 달라질 수 있는바, (2) 단계의 수행 온도를 고려하여 젤라틴의 농도를 달리할 수 있고 바람직하게는 하기 조건 (a) 내지 (c) 중 어느 하나를 만족할 수 있다.
(a) (2) 단계 수행온도가 5℃ 이상 15℃ 미만일 때 혈중내 유핵세포 응집제에서 젤라틴의 농도는 5 ~ 15 ㎎/㎖임
(b) (2) 단계 수행온도가 15℃ 이상 25℃ 미만일 때 혈중내 유핵세포 응집제에서 젤라틴의 농도는 15 ~ 25 ㎎/㎖임
(c) (2) 단계 수행온도가 25℃ 초과 35℃ 미만일 때 혈중내 유핵세포 응집제에서 젤라틴의 농도는 25 ~ 35㎎/㎖임
만일, 혈중 세포 응집물질로 젤라틴이 포함되는 경우 상기의 조건(a) 내지 (c)를 만족하지 못하면 (2) 단계에서 제조된 혈중세포 응집체에서 젤라틴이 녹아 용기에서 혈중세포 응집체를 분리할 수 없고, 목적하는 혈중세포 응집체를 제조하기 어려우며, 하기의 (3) 단계를 이하의 공정을 진행하기 어려운 문제점이 있을 수 있다.
따라서, (2) 단계를 수행하는 온도에 따라 응고된 젤라틴이 녹기 시작하는 농도가 다르기 때문에 (2) 단계를 수행하는 온도를 고려하여 용액의 농도를 달리하는 것이 바람직하다.
또한, 상기 (2) 단계에서는 혈중 세포 응집제를 발색시키기 위한 발색제가 더 포함될 수 있고, 혈중 세포 응집제에 포함된 혈중 세포 응집물질 100 부피부에 대하여 발색제를 5 내지 10의 부피부로 더 포함할 수 있다. 상기 발색제에 대한 구체적인 설명은 상술한 바와 같은바 생략한다.
한편, 본 발명에 따른 (1) 단계에서 피검체의 혈액으로부터 적혈구를 분리하여 혈액세포를 추출하는 과정부터 (2) 단계에서 젤라틴(gelatin) 등의 파라핀블록 제조용 혈중 세포 응집제를 투여하여 혈중 세포 응집체를 제조하는 과정까지는 피검체의 혈액을 채혈한 후 2시간 이내에 종료하는 것이 바람직하다. 채혈된 말초 혈액 내 포함된 혈중암세포는 백혈구에 비하여 세포 고사가 잘 일어나기 때문이다.
구체적으로, 도 5에 나타난 바와 같이 유방암세포주를 이용하여 정상 혈액에 뿌린 세포돌출실험(cell spiking test) 결과는 채혈 직후, 채혈 후 1시간, 채혈 후 2시간까지 시간 의존적으로 방치된 혈액을 대상으로 파라핀 블록을 만들어 세포학적 양상을 비교해 본 결과 채혈 후 2시간이 경과하면 암세포의 세포질이 파괴(degradation) 되고, 항원성이 저하되는 것을 관찰할 수 있다.
다음으로 본 발명에 따른 (3) 단계로써, (2) 단계를 통해 제조된 혈중 세포 응집체를 경화시켜 단계를 수행한다.
(2) 단계를 통해 제조된 혈중세포 응집체는 경화 단계를 거침으로써, 세포를 의 용기에서 혈중 세포 응집체를 분리시킬 수 있으며, 통상적인 파라핀블록 제조 전의 파라핀블록 대상이 되는 일반 생체조직의 처리시간(통상적으로 12시간 이상)을 6시간 이내로 단축시킬 수 있고, 후술하는 (4) 단계를 통한 파라핀블록 형성물질의 처리가 더 용이해지며, 목적하는 물성을 발현하는 파라핀블록으로 구현시키기에 보다 유리할 수 있다. 바람직하게는 상기 (3) 단계의 경화는 (2) 단계에서 제조된 혈중세포 응집체를 2℃ 내지 5℃에서 15 ~ 30분 동안 방치하여 혈중세포 응집체를 젤리 형태로 경화시킬 수 있다. 경화된 혈중세포 응집체는 세포의 보존을 위하여 포르말린, 메탄올 등에 넣어 고정시킬 수 있다.
다음으로, 본 발명에 따른 (4) 단계로써, 상기 (3) 단계에서 제조된 경화체에 파라핀블록 형성물질을 처리하는 단계를 수행한다.
상기 파라핀블록 형성물질은 알코올, 자일렌 및 파라핀을 포함할 수 있으며, (3) 단계에서 제조된 경화체에 대해 알코올, 자일렌 및 파라핀의 순으로 파라핀블록 형성물질을 처리하여 자동침투과정을 통해 파라핀블록을 제조할 수 있다.
구체적으로 상기 자동침투과정은 경화체를 종이에 싸서 알코올, 자일렌 및 파라핀의 순으로 처리함으로써 수행할 수 있다. 상기 자동침투과정을 거치는 이유는 다음과 같다. 먼저, 현미경 관찰 대상이 되는 검체시료를 얇게 박절하기 위해서는 파라핀 침투가 가능하도록 고정액을 통해 고정시킨 검체시료로부터 수분을 제거할 수 있다(알코올 처리단계). 다음으로, 처리된 알코올에 의해서 검체시료 내의 수분은 제거된다 하더라도 알코올과 파라핀이 서로 섞이지 않기 때문에 자일렌을 이용하여 알코올을 제거할 수 있다(자일렌 처리단계). 마지막으로, 검체시료를 현미경 관찰을 위해서는 검체시료를 얇게 박절하는 과정이 요구됨에 따라, 박절 과정의 수행을 위해서 검체시료에 대해 파라핀 침투 과정을 수행할 수 있다(파라핀 처리단계).
이때, 검체의 양이나 크기에 따라서, 알코올 처리단계는 여러 단계로 나누어 수행될 수 있는데, 예를 들어 먼저 저농도 알코올을 처리하고 (복수 회 가능) 이어서 고농도 알코올을 처리하는 (복수 회 가능)방식으로 수행될 수도 있다. 이러한 복수 회에 걸친 처리는 자일렌 처리단계 및 파라핀 처리단계의 경우에도 동일하게 적용될 수 있다.
또한, 본 발명은 상술한 방법에 의해서 제작된 파라핀 블록을 사용하여 검체 시료를 현미경을 통해 관찰하는 방법을 제공하는데, 이는 상기 서술된 방법으로 제작된 파라핀 블록을 적당한 크기로 박절하여 절편화하고, 상기 박절된 파라핀 블록을 염색하고 관찰하는 단계를 포함한다.
상기 박절 단계는 마이크로톰(microtome) 등과 같은 통상적인 박절 기기를 사용하여 수행될 수 있으며, 당업계에서 통상적으로 사용되는 염색시약을 사용하여 염색과정이 수행될 수 있다.
상기 자동침투과정을 수행하여 제조된 본 발명에 따른 파라핀 블록은 3 내지 10㎛ 두께로 박절하여 절편화하고, 상기 박절된 블록을 면역조직화학적 염색을 통하여 관찰할 수 있다.
일반적으로 파라핀 블록은 4 내지 5u㎛의 두께로 박절하는 것이 일반적이나, 본 발명의 파라핀 블록은 혈중암세포의 크기를 고려하여 3 내지 10㎛의 두께로, 바람직하게는 5 내지 8㎛, 더욱 바람직하게는 7 내지 8㎛의 두께로 박절하여 혈중암 세포 수를 계수할 수 있다.
본 발명에 따른 파라핀 블록을 7 ~ 8㎛의 두께로 박절할 경우, 6㎖ 혈액의 채혈시 30회의 검사가 가능하며, 3 ~ 4㎛의 두께로 박절할 경우 60회의 검사가 가능하고, 이에 따라 단 1회 소량 채취된 혈액을 통해 수십 번의 검사가 가능하게 되어 매 회 다른 표지자를 적용할 수 있고, 시간차를 두고 여러 번 검사함으로써 병리학적으로는 물론 임상적으로도 적용 범위가 매우 넓은, 유용한 검사법이 될 수 있다.
상기 면역조직화학적 염색은 당업계에서 통상적으로 사용되는 염색시약을 사용하여 염색과정이 수행될 수 있으며 이에 제한은 없으나, 본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면 H&E 염색 또는 사이토케라틴(cytokeratin,CK) 면역조직화학염색일 수 있다.
본 발명의 전술한 방법에 의해서 제작된 파라핀 블록을 사용하여 검체 시료에 대하여 현미경 관찰을 수행함으로써, 혈중암세포의 조직학적, 면역조직화학적 또는 분자생물학적 검사 방법을 수행할 수 있다.
구체적으로, 하기의 실험예 8에서 알 수 있듯이, 혈중암세포의 형태학적 확인 및 계수를 통한 조직학적 검사를 실시하여 오염된 상피세포와 혈중암세포의 구별이 가능해짐에 따라 위양성 판정의 가능성이 없어 정확한 진단을 가능하게 한다.
또한, 하기의 실험예 3 및 실험예 4에서 알 수 있듯이, 사용하고자 하는 표면 표지자를 제한 없이 선택하여 면역조직화학적 검사가 가능하며, 더 나아가 이미 원발 부위가 불명확한 전이성 암종의 병리학적 진단에 사용되고 있는 하기 표 1에 나타낸 조직특이적 표지자를 조합하면 보다 민감하게 혈중암세포를 검출할 수 있다.
표 1 <현재 병리 진단에서 사용 중인 원발 부위별 조직특이적 진단 표지자 >
원발부위 진단표지자
Breast GCDFP-15, ER
Colon CK 20, CDX2
Lung TTF1
Ovary ER, mesothelin
Prostate PSA
Stomach or pancreas CK7, CK20, MUC5AC
또한, 형광동소교잡반응(FISH: Fluorescence in situ hybridization) 및 유전자 변이 검사(mutation analysis)와 같은 분자생물학적 검사가 가능하다.
결국, 암 진단을 위한 진단검사의학 및 영상의학 기술의 발달에도 불구하고, 이들 검사만으로 암을 진단하기에는 한계가 있으며, 가장 확실한 암 진단은 조직 검사를 통한 병리학적 진단이지만 수술적 치료가 불가능하거나 조직 검사를 위한 접근이 어려운 말기암 환자군에서는 조직 검사를 대체할 수 있는 효과적인 진단방법이 될 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.
<실시예 1>
1-1. 채혈
정상인의 말초혈액 6㎖를 EDTA가 첨가된 용기에 채혈 후 상기 혈액내 포함된 백혈구 수를 4×107으로 계수하고, 대장암세포주 SW620을 백혈구 10,000: 암세포 1의 비율에 맞도록 암세포 4000개를 스파이킹(spking)한 후 상온 보관에서 보관하였다.
1-2. 적혈구의 분리
채혈된 말초혈액 6㎖당 15㎖ 용기(tube)를 각 3개씩 준비하여, 각 15㎖ 용기에 피콜(Ficoll)을 5㎖씩 분주하였다. 다음, EDTA 용기(tube)에 채취된 혈액을 50㎖ 용기에 모두 넣은 후, 인산완충용액(PBS)을 혈액의 2배 부피로 넣고 혼합하였다.
15㎖ 용기에 담겨있는 피콜 위에 인산완충용액이 포함된 말초혈액 7㎖씩을 분주 후, 2000rpm에서 20분 동안 원심 분리하였고, 원심분리를 마친 용기 내에서 세 층으로 분리된 혈청(serum), 피콜 및 혈청과 피콜 사이의 하얀색 버피코트 층(buffy coat layer)를 확인하고, 버피코트층에 밀집되어 있는 하얀 세포층만 조심스럽게 수거하였다. 그 후, 새 50㎖ 용기에 상기 수거한 세포를 옮겨담고, 인산완충용액을 넣어 최종 부피를 50㎖로 맞춘 후, 1500rpm에서 10분 동안 원심 분리하였다. 상기 원심분리를 마친 용기 내에서 상층액을 수거한 후, 남은 세포 (cell pellet)에 PBS 1ml 투여 후 13000rpm에서 3분 동안 원심 분리하여, 상층액 수거 후, 적혈구가 제거된 혈중 세포를 얻었다.
1-3. 파라핀블록 제조용 혈중 세포 응집제의 제조
먼저, 혈중 세포 응집물질로 젤라틴 용액을 90 ~ 100℃ 온수에 10㎎/㎖ 농도로 녹여 젤라틴 용액을 만든 뒤 상온에 거치하여 용액의 온도를 실내온도(22℃)로 식혀 사용하였다.
적혈구가 제거된 혈중 세포를 혈중 세포 응집제와 혼합하기 전에, 빈 용기에 동일 농도의 젤라틴 용액을 코팅 후 두께가 1mm 되도록 투입하여 미리 코팅해 놓은 다음, 미리 코팅해 놓은 용기에 혈중 세포를 넣고, 혈중 세포가 담겨진 용기에 젤라틴(Gelatin) 용액을 혈중세포와 젤라틴 용액이 1:1의 부피비가 되도록 혼합하였다. 추가로, 투명한 젤라틴 용액의 응집 확인을 위해, 발색제인 0.05% 브로모페놀 블루(Bromophenol blue)가 포함된 로딩 용액(loading buffer)(Takara Bio Inc)을 젤라틴 용액에 대하여 1:0.05의 부피비로 더 첨가하였다.
혈중세포/젤라틴 용액/발색제 혼합물을 냉장(4℃)에서 20분간 보관 후, 혈중세포/젤라틴 용액/발색제 혼합물이 젤리(jelly)형태로 굳어 경화된 것을 확인한 후, 경화체를 용기에서 분리하여, 15㎖ 용기에 상기 경화체를 넣고, 중성 포르말린(formalin)을 10㎖ 투여 후, 상온에서 18시간 동안 보관하였다.
1-4. 파라핀 블록의 제조
상기 실시예 1-3을 통해 제조된 혈중 세포 응집체의 경화물을 이용하여 파라핀 블록(Paraffin block)을 제조하였다.
일반적인 파라핀 블록 제조방법을 따르나, 일반조직 처리 과정은 12시간 이상 소요되지만, 본 발명의 파라핀 블록의 제조방법은 조직 처리 과정을 6시간으로 단축함으로써 제조시간을 절감할 수 있으며, 간소화할 수 있다.
파라핀 블록의 제조는 하기 표 2의 조직 처리 과정에 따라 수행하였다.
표 2
수행과정 수행시간(분)
1 포르말린 60
2 증류수 5
3 99.9% 알코올(1) 15
4 99.9% 알코올(2) 15
5 99.9% 알코올(3) 30
6 99.9% 알코올(4) 30
7 99.9% 알코올(5) 30
8 99.9% 알코올(6) 30
9 자일렌(1) 30
10 자일렌(2) 60
11 파라핀(1) 30
12 파라핀(2) 60
상기 표 2의 과정을 마친 후, 파라핀에 포매(embeding)하여 블록으로 만들어 보관하였다.
상기 표 2의 과정에서 알코올은 에탄올(Ethanol, Fisher Scientic), 자일렌은 Xylene (DUKSAN), 파리핀은 Histosec Pastillen(MERCK)을 사용하였다.
<실시예 2>
실시예 1과 동일하게 실시하여 제조하되, 실시예 1의 1-2에서 적혈구를 분리하기 위하여 피콜 대신에 세포용해액을 사용하여 파라핀 블록을 제조하였다.
<실시예 3 ~ 7>
실시예 1과 동일하게 실시하여 제조하되, 실시예 1의 1-3에서 젤라틴용액의 농도를 10㎎/㎖ 대신에 각각 3㎎/㎖, 20㎎/㎖, 30㎎/㎖, 40㎎/㎖, 50㎎/㎖로 하여 파라핀블록을 제조하였다.
<실시예 8 ~ 9>
실시예 1과 동일하게 실시하여 제조하되, 실시예 1의 1-1에서 스파이킹 되는 암세포 수 및 혈액내 백혈구 수의 비율을 1:104 대신에 각각 1:105 및 1:106이 되도록 암세포를 스파이킹하여 파라핀블록을 제조하였다.
<실시예 10>
실시예 1과 동일하게 실시하여 제조하되, 실시예 1의 1-1에서 스파이킹 되는 암세포의 종류를 대장암세포주 SW620 대신에 유방암세포주 SKBR3를 사용하였고, 실시예 1-1 수행 후 실시예 1-2를 즉시 수행하는 대신에 실시예 1-1 수행 후 1시간 혈액을 방치시킨 뒤 실시예 1-2를 수행하여 파라핀블록을 제조하였다.
<실시예 11>
실시예 10과 동일하게 실시하여 제조하되, 실시예 1-1 수행 후 1시간 혈액을 방치시키는 대신에 2시간 방치한 후 실시예 1과 동일하게 실시하여 파라핀블록을 제조하였다.
<실시예 12 ~ 21>
상기 실시예 1과 동일하게 실시하여 제조하되, 실시예 1의 1-1에서 스파이킹 되는 암세포 수 및 혈액내 백혈구 수의 비율을 1:104 대신에 1:105로 하였고, 실시예 1의 1-3에서 혈중세포 응집물질을 하기 표 7과 같이 변경하여 파라핀블록을 제조하였다.
<비교예 1>
정상 혈액 6㎖ 혈액에 암세포 4000개를 spiking 한 후, 피콜을 처리하여 적혈구를 제거한 후 추출된 혈중 세포에 포르말린을 투여하여 18시간 고정 후, 고정된 검체를 다시 원심분리시킨 후 상층액을 제거하고 검체 침전물을 수득하여 폴리비닐알코올 및 증류수를 첨가하였다. 이 혼합물에 아세톤 및 시아노아크릴레이트를 가하여 다시 한번 더 원심분리시킨 후, 상층액을 제거하고 응집 검체 침전물을 수득하였다. 이 침전물에 대해서 자동침투과정을 수행함으로써 파라핀 블록을 제작한 후,
<실험예 1> - 면역조직화학 염색을 통한 혈중 암세포 검출
실시예 1을 통해 제조된 파라핀블록을 8㎛의 두께로 박절한 절편에 대해 사이토케라틴(CK) 염색을 실시한 후 이를 현미경을 통해 관찰한 사진을 촬영하여 도 2에 나타내었다.
구체적으로 도 2에 나타난 바와 같이, 파라핀 블록을 박절한 절편을 CK 면역조직화학 염색을 시행한 결과 갈색으로 관찰되는 세포가 혈중 암세포임을 확인할 수 있다.
<실험예 2> - 암세포주 유래 혈중암세포의 수거율 분석
실시예 1 및 비교예 1을 통해 제조된 혈중암세포 검출용 파라핀 블록에 대한 혈중암세포 분석에 있어서 민감도를 측정하기 위하여 파라핀 블록에 포함된 암세포 수거율을 비교 분석하였다.
혈중암세포의 크기를 고려하여 파라핀블록을 8㎛의 두께로 전체 블록을 연속 절편으로 만든 뒤, 각 절편에 사이토케라틴 염색을 하여 블록 전체에 포함된 혈중암세포 수를 계수하였고, 실시예 1 및 비교예 1을 각각 3회씩 시행하여 제조된 파라핀블록에 대한 결과의 평균값을 하기 표 3에 나타내었다.
표 3
절편(section)의 수 절편 당 암세포의 수 총 암세포의 수거율
비교예 1 56 22±1.3 1017 (25%)
실시예 1 30 122±4.8 3732 (93%)
구체적으로 상기 표 3에 나타난 바와 같이, 실시예 1 에 의해 제조된 파라핀블록을 통한 혈중암세포의 수거율이 평균 93%로 비교예 1 에 의해 제조된 파라핀블록을 통한 혈중암세포의 수거율인 25%보다 3.7배 높음을 알 수 있다.
또한, 실시예 1에 따라 제조된 파라핀 블록으로부터 박절된 절편의 수는 30으로 비교예 1에 의한 방법에 비해 적었으나, 각 절편 당 포함된 혈중암세포의 수는 비교예 보다 현저하게 높음을 알 수 있다.
상기 표 3과 같은 결과는 비교예 1에서는 적혈구 분리 후 추가로 두 번의 원심분리 과정이 더 추가됨에 따른 혈중 암세포 분실 및/또는 손실에 의한 것이며, 이에 따라 실시예 1의 경우가 원심 분리과정 중 혈중암세포의 손상 또는 소실을 현저히 감소시킬 수 있음을 알 수 있다.
또한, 파라핀 블록으로 절편을 만드는 과정에서 파라핀을 녹이기 위하여 60℃로 가온시켜야 하는데 이 과정에서 비교예의 경우 세포의 소실이 있는 것으로 볼 수 있고, 이에 반해 실시예 1에 의해 제조된 파라핀 블록은 혈중 세포 응집제를 이용하기 때문에 파라핀의 가온과정에 의한 혈중 세포의 소실이 감소되고 있음을 확인할 수 있다.
또한, 실시예 1에서 제조된 파라핀 블록은 8㎛ 두께로 박절할 경우에는 30회의 검사가 가능하고, 4㎛ 두께로 박절할 경우 60회의 검사가 시행 가능하며, 매 회 다른 표지자를 적용할 수 있음을 확인할 수 있다.
<실험예 3> - 적혈구 제거 방법에 따른 암세포 수거율 분석
실시예 1 및 실시예 2를 통해 제조된 파리핀 블록에서 암세포 수거율 (파라핀 블록에 포함된 암세포의 전체 수를 사이토케라틴(Cytokeratin) 면역조직화학염색 후 계수하여 수거율 산정)을 계산하여 하기 표 4에 나타내었다.
표 4
적혈구 제거방법 수거된 암세포 수
실시예 1 피콜(Ficoll) 2252±08.3
실시예 2 세포용해액(lysis buffer) 1291±98.4
구체적으로 상기 표 3에 나타난 바와 같이, 암세포 수거율 비교 결과 피콜 처리법이 세포용해법에 비하여 암세포 수거율이 평균 1.7배 높음을 확인할 수 있고, 이를 통해 보다 우수한 물성의 파라핀블록을 제조하기 위해 혈액에서 적혈구를 제거하는데 있어 피콜을 처리함이 더 우수함을 확인할 수 있다.
<실험예 4> - 젤라틴 용액 농도 변화에 따른 혈중암세포 수거율 분석
실시예 1 및 실시예 3 ~ 7을 통해 제조된 파라핀블록에 대해 암세포 수거율 (파라핀 블록에 포함된 암세포의 전체 수를 상온 20℃에서 사이토케라틴(Cytokeratin) 면역조직화학염색 후 계수하여 수거율 산정)을 계산하여 하기 표 5에 나타내었다.
표 5
젤라틴 용액의 농도(㎎/㎖) 혈중암세포 수거율
실시예 3 3 68%
실시예 1 10 93%
실시예 4 20 86%
실시예 5 30 80%
실시예 6 40 23%
실시예 7 50 6%
젤라틴 용액 농도 변화에 따른 암세포 수거율을 비교한 결과, 상기 표 5에 나타난 바와 같이, 상온에서 실시예 1, 4, 5의 경우 암세포의 수거율이 높은데 반하여, 실시예 3, 6, 7은 암세포 수거율이 현저히 저하된 것을 확인할 수 있다. 특히, 실시예 5에서 젤라틴용액의 농도가 30㎎/㎖인 경우 혈중 암세포 수거율이 80%인 반면에 실시예 6에서 젤라틴 용액의 농도가 40㎎/㎖인 경우 혈중 암세포 수거율이 23%로 수거율이 57%나 저하(수거율 감소율은 71.2%에 달함)됨을 확인할 수 있다.
<실험예 5> - 젤라틴 용액 농도 변화에 따른 실내온도별 용해여부 분석
실시예 1, 4, 5에서 사용된 젤라틴 용액 50㎕ 에 대해 실내 온도를 각각 5℃, 17℃, 28℃로 달리했을 때 거치시간별로 용해여부를 평가하여 녹지 않은 경우를 ×, 녹아 용해된 경우를 ○로 표시하여 하기 표 6에 나타내었다.
표 6
10㎎/㎖ 20㎎/㎖ 30㎎/㎖
거치 시간 5℃ 17℃ 28℃ 5℃ 17℃ 28℃ 5℃ 17℃ 28℃
5분 × × ○ × × × × × ×
10분 × ○ ○ × × ○ × × ×
20분 × ○ ○ × × ○ × × ×
30분 × ○ ○ × × ○ × × ×
60분 × ○ ○ × ○ ○ × × ○
구체적으로 상기 표 6에 나타난 바와 같이, 젤라틴 용액의 농도에 따라 실내온도별로 용해여부가 달라지고, 거치시간이 짧을 경우 녹지 않아가 거치시간이 길어지면 용해되는 경우가 있음을 확인할 수 있다.
따라서, 실내온도 혹은 계절에 따라 젤라틴 용액의 농도를 달리해야 함을 알 수 있고, 실내온도가 15℃이하인 동절기에는 젤라틴의 농도가 10㎎/㎖이어도 젤리형태의 혈중세포 응집체를 제조할 수 있으나 실내온도가 25℃ 이상인 하절기에는 젤라틴의 농도가 10㎎/㎖일 경우 젤라틴이 녹음에 따라 젤리형태의 혈중세포 응집체를 제조하기 위해서는 젤라틴의 농도를 20㎎/㎖를 초과하는 농도로 달리해야됨을 확인할 수 있다.
한편, 상술한 실험예 4에서 확인할 수 있듯이, 젤라틴의 농도에 따라 파라핀블록의 암세포 수거율이 현저히 달라지고, 젤라틴 용액의 농도가 30㎎/㎖일 때에 비해 10㎎/㎖일 때 암세포 수거율이 더 우수함에 따라 실내온도가 5 ~ 15℃에서는 파라핀블록을 제조하기 위한 젤라틴 용액의 농도를 5 ~ 15㎎/㎖로 함이 가장 좋은 혈중 세포 응집체를 제조할 수 있는 동시에 현저히 우수한 물성을 갖는 파라핀블록을 제조할 수 있음을 알 수 있다.
또한, 실내온도가 15 ~ 25℃ 일 경우, 젤라틴 용액의 농도를 20 ~ 30㎎/㎖로 함이 가장 좋은 혈중 세포 응집체를 제조할 수 있는 동시에 현저히 우수한 물성을 갖는 파라핀블록을 제조할 수 있음을 알 수 있다.
또한, 실내온도가 상온보다 높은 25 ~ 35℃일 경우, 젤라틴 용액의 농도가 30㎎/㎖일 때 가장 좋은 응집물질을 만들 수 있는 조건임을 확인할 수 있었으며, 실내온도가 높아지면 응고된 젤라틴 용액이 시간이 지남에 따라 쉽게 녹아버리는 문제점이 생기게 되고, 이를 해결하기 위하여 상기 표 5에서 확인할 수 있듯이, 너무 높은 농도의 젤라틴 용액을 사용하게 되면 혈중암세포의 수거율이 떨어지는 또 다른 문제점이 발생하므로 상기 표 5 및 표 6의 결과를 종합해 볼 때, 실내온도 25 ~ 35℃에서는 젤라틴 용액의 농도가 25 ~ 35㎎/㎖일 때 가장 좋은 혈중 세포 응집체를 제조할 수 있는 동시에 현저히 우수한 물성을 갖는 파라핀블록을 제조할 수 있음을 알 수 있다.
<실험예 6> - 혈중 세포 응집물질에 따른 혈중암세포 수거율 분석
실시예 12 ~ 을 통해 제조된 파라핀블록에 대해 암세포 수거율 (파라핀 블록에 포함된 암세포의 전체 수를 상온 20℃에서 사이토케라틴(Cytokeratin) 면역조직화학염색 후 계수하여 수거율 산정)을 계산하여 하기 표 7에 나타내었다.
표 7
혈중 응집물질 Spiked cell수 수거된 세포수 혈중암세포 수거율
젤라틴(㎎/㎖) 전분1)(%)4) CS2)(%) 라미닌3)(%)
실시예 12 20 - - - 400 344 86%
실시예 13 20 1 - - 400 203 50%
실시예 14 20 - - 0.001 400 154 39%
실시예 15 30 - - - 400 320 80%
실시예 16 30 - 0.25 - 400 220 55%
실시예 17 30 - 0.5 - 400 321 80%
실시예 18 30 1 - - 400 203 51%
실시예 19 30 2 - - 400 345 86%
실시예 20 30 5 - - 400 308 77%
실시예 21 30 1 0.125 - 400 352 88%
1) 전분(starch: Sigma-Aldrich)2) CS : 콘드로이틴설페이트(chondroitin sulfate: Sigma-Aldrich)3) 라미닌(laminin: Sigma-Aldrich)4) (%) : 전분, CS, 라미닌의 함량은 젤라틴을 기준으로 농도% 이며, 예를들어 실시예 13에서 전분의 함량은 0.2㎎/㎖임을 의미한다.
구체적으로 상기 표 7에서 확인할 수 있듯이, 젤라틴용액을 단독으로 혈중응집물질로 포함한 실시예 12 및 실시예 17이 다른 종류의 혈중 응집물질을 더 포함한 경우에 비해 대체로 혈중 암세포 수거율이 우수한 것을 확인할 수 있다. 다만, 젤라틴용액이 아닌 다른 종류의 혈중 응집물질의 함량에 따라 혈중암세포 수거율이 더 향상될 수 있으며, 이는 실시예 17, 19 및 21을 통해 확인할 수 있다.
<실험예 7> - 파라핀블록을 통한 혈중 암세포 진단의 민감도 분석
실시예 1, 실시예 8 및 실시예 9를 통해 제조된 파라핀 블록에 대해 CK 면역조직화학적 염색을 수행하여 현미경 관찰을 통해 촬영한 사진을 도 3에 나타내었다.
구체적으로 도 3과 같이, 대장암세포주 SW620와 백혈구가 1:106의 비율(실시예 9)일 때에도 혈중암세포의 검출이 가능함을 확인할 수 있다. 이를 통해 본 발명에 의한 혈중암세포 검출용 파라핀블록의 제조방법은 혈중암세포의 검출에 있어 민감도 및 특이도가 우수함을 확인할 수 있다.
<실험예 8> - 파라핀블록을 통한 혈중암세포에 대한 형태학적 분석
본 발명에 따른 혈중암세포 검출용 파라핀블록에 대한 혈중암세포 분석에 있어서 형태학적 확인을 통해 오염에 의한 위양성 검출을 확인하였다.
암세포와 정상 세포는 염색성과 상관없이 세포병리학적으로 구분이 가능하다. 즉, 기존에 표면표지자에 의한 혈중암세포의 진단법에서는 표면표지자 양성 혹은 음성에 따라 혈중암세포의 존재 여부를 결정하기 때문에 오염된 정상 상피세포가 위양성으로 판독될 수 있었다.
실시예 1을 통해 제조된 파라핀블록에 대한 CK 면역조직화학염색 결과, 도 4에 나타난 바와 같이, 채혈 시 피부 각질 세포 혹은 적혈구 처리 및 파라핀 블록의 제작 과정 등에서 피부에서 떨어진 CK 양성 편평 상피세포의 오염(contamination)이 있을 수 있는 것을 확인하였다.
따라서, 본 방법에 의해 제조된 혈중암세포 검출용 파라핀블록에서는 병리학적 검사가 가능하므로 혈중암세포의 형태학적 확인을 통해 오염된 상피세포와 구별하여 위양성 여부를 판별해낼 수 있어, 보다 정확한 진단이 가능하다.
<실험예 9> - 채혈 후 혈액의 방치시간에 따른 혈중 암세포의 항원성 손실여부 분석
실시예 1, 실시예 10 및 실시예 11을 통해 제조된 파라핀블록에 대해서 CK 면역조직화학적 염색을 수행한 후 현미경 관찰을 통해 촬영한 사진을 도 5에 나타내었다.
구체적으로 도 5를 통해 확인할 수 있듯이, 적혈구 제거 처리 과정 수행 전까지 방치시간에 따른 세포학적 양상을 비교해본 결과, 채혈 후 2시간이 지날 경우 암세포의 세포질이 파괴(degradation) 되고 항원성이 떨어지는 것을 관찰할 수 있었다.
<실험예 10> - 혈중암세포 검출용 파라핀블록에 대한 다양한 적용
본 방법의 실시예 1에 의해 제조된 혈중암세포 검출용 파라핀블록을 이용한 다양한 검사의 적용 가능성을 확인하였다.
다양한 세포주유래 혈중암세포를 정상 혈액에 대하여 백혈구 10,000: 암세포 1 의 비율로 스파이킹(spiking)한 후, 상기 실시예 1의 제조방법을 통해 파라핀 블록을 제조하여 각종 암 진단 특이표지자에 대한 면역조직화학염색 및 유전자 검사를 수행하였고, 그 결과를 도 6 내지 도 8에 나타내었다.
구체적으로 도 6에 나타난 바와 같이, 유방암세포주(SKBR3) 유래 혈중암세포에 대한 일반 H&E 염색, c-erbB2 면역조직화학염색 및 Her2/neu 유전자에 대한 형광동소교잡 반응 검사(FISH)를 수행한 결과, 유전자의 발현이 관찰되었다.
또한, 도 7에 나타난 바와 같이 간암세포주(HepG2) 유래 혈중암세포에 대한 면역조직화학염색을 수행한 결과, EpCAM은 음성이나, 간암 특이표지자인 글리피칸-3(Glypican-3) 및 알파-펙토단백질(alpha-fetoprotein, AFP)에 양성 반응을 보임을 확인하였다.
또한, 도 8에 나타난 바와 같이 대장암세포주(SW620) 유래 혈중암세포에 대한 면역조직화학염색을 수행한 결과, 세포질막에서 EpCAM의 발현을 확인하였고, 대장암 진단 표지자인 CDX2의 핵 발현 및 p53 단백질의 발현 또한 확인할 수 있었다.
<실험예 10> - 암 전이 환자에서의 혈중암세포의 세포학적 특성분석
실제 환자에서의 적용 예로써, 병기가 4기인 에스 결장 대장암으로 2008년 결장절제술을 받고 2010년 간에 재발하였던 환자 혈액을 채혈하여 본 발명의 제조과정에 따른 파라핀블록을 제조하여 혈중암세포를 확인하고, 원발 종양의 암세포 및 혈중암세포의 세포학적 특성을 비교하여 그 결과를 도 9 및 도 10에 나타내었다.
구체적으로 도 9에 나타난 바와 같이, 환자의 원발 대장암 및 간암 재발에 대한 육안 사진 및 원발 대장암의 조직 소견을 확인할 수 있으며, 2012년 7월 채혈된 환자 혈액으로 본 발명의 제조과정에 따른 파라핀블록의 절편에서 혈중암세포를 확인할 수 있었다.
또한, 도 10에 나타난 바와 같이 상기 환자의 혈액에서 관찰된 혈중암세포의 H&E 염색 및 CK 면역조직화학염색을 수행한 결과, 일부 세포는 사이토케라틴(CK)에 음성 소견을 보임을 확인할 수 있었다.
이를 통해 이미 원발 부위가 불명확한 전이성 암종의 병리학적 진단에 사용되고 있는 조직특이적 마커를 조합하면 보다 민감하게 혈중암세포를 검출할 수 있는 것이다.
따라서, 본 발명의 파라핀 블록의 제조방법은 혈액 시료의 채취를 통해 혈액내 존재하는 혈중암세포를 검출하는 방법으로 비침습적이고 간단하기 때문에 암의 재발 및 전이암의 진단 및 예후 예측에 매우 유용하며, 암 발병, 전이 및 재발 기전의 분석을 통해 암 치료의 획기적인 전기를 마련할 수 있다.

Claims (15)

  1. 혈중 세포에 대하여 혈중 세포들을 응집시키고, 혈중 세포의 손상 및 소실을 방지하는 세포외기질의 기능을 수행하는 혈중 세포 응집 물질;을 포함하는 파라핀블록 제조용 혈중 세포 응집제.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 혈중 세포 응집물질은 젤라틴을 포함하는 것을 특징으로 하는 파라핀블록 제조용 혈중 세포 응집제.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 응집제에서 젤라틴의 농도는 5 내지 35㎎/㎖ 인 것을 특징으로 하는 파라핀블록 제조용 혈중 세포 응집제.
  4. 제2항에 있어서,
    상기 혈중 세포 응집물질은 펙틴(pectin), 콘드로이틴설페이트(chondroitin sulfate), 파이브로넥틴(fibronectin), 전분(starch) 및 라미닌(laminin)으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 물질을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 파라핀블록 제조용 혈중 세포 응집제.
  5. 제4항에 있어서,
    혈중 세포 응집물질로 젤라틴 이외에 더 포함되는 물질은 젤라틴 중량의 5% 이내로 포함되는 것을 특징으로 하는 파라핀블록 제조용 혈중 세포 응집제.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 혈중 세포 응집제는 혈중 세포 응집물질을 발색시키기 위한 발색제를 더 포함하며, 상기 발색제는 혈중 세포 응집물질 100 부피부에 대하여 5 내지 10 부피부로 포함되는 것을 특징으로 하는 파라핀블록 제조용 혈중 세포 응집제.
  7. 제3항에 있어서,
    상기 젤라틴의 농도는 10 내지 30㎎/㎖ 인 것을 특징으로 하는 파라핀블록 제조용 혈중 세포 응집제.
  8. 제1항에 따른 파라핀블록 제조용 혈중 세포 응집제를 포함하는 혈중암세포 진단용 키트.
  9. (1) 피검체의 혈액에서 적혈구를 제거하고 혈중 세포를 추출하는 단계;
    (2) 상기 혈중 세포를 제1항에 따른 혈중 세포 응집제와 혼합하여 혈중 세포 응집체를 제조하는 단계;
    (3) 상기 혈중 세포 응집체를 경화시켜 단계; 및
    (4) 상기 (3) 단계에 따른 경화체에 파라핀블록 형성물질을 처리하는 단계;를 포함하는 혈중 세포 응집제를 이용한 파라핀블록 제조방법.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 (1) 단계에 사용되는 혈중 세포가 추출되는 용기(tube)는 젤라틴 용액이 코팅된 것을 특징으로 하는 혈중 세포 응집제를 이용한 파라핀블록 제조방법.
  11. 제9항에 있어서,
    상기 (1) 단계의 적혈구 제거는 피콜(ficoll)을 이용하는 것을 특징으로 하는 혈중 세포 응집제를 이용한 파라핀블록 제조방법.
  12. 제9항에 있어서,
    상기 (2) 단계는 혈중 세포와 혈중 세포 응집제를 1: 1 ~ 1.5 부피비로 혼합시키는 것을 특징으로 하는 혈중 세포 응집제를 이용한 파라핀블록 제조방법.
  13. 제9항에 있어서,
    상기 (2) 단계의 혈중 세포 응집제는 젤라틴을 포함하고, 상기 (2) 단계가 수행되는 온도에 따라 혈중 세포 응집제에서의 젤라틴 농도는 하기 조건 (a) 내지 (c) 중 어느 하나를 만족하는 것을 특징으로 하는 혈중 세포 응집제를 이용한 파라핀블록 제조방법.
    (a) (2) 단계 수행온도가 5℃ 이상 15℃ 미만일 때 혈중 세포 응집제에서 젤라틴의 농도는 5 ~ 15 ㎎/㎖임
    (b) (2) 단계 수행온도가 15℃ 이상 25℃ 미만일 때 혈중 세포 응집제에서 젤라틴의 농도는 15 ~ 25 ㎎/㎖임
    (c) (2) 단계 수행온도가 25℃ 초과 35℃ 미만일 때 혈중 세포 응집제에서 젤라틴의 농도는 25 ~ 35㎎/㎖임
  14. 제9항에 있어서,
    상기 (4) 단계의 파라핀블록 형성물질은 알코올, 자일렌 및 파라핀을 포함하고,
    상기 (4) 단계는 알코올, 자일렌 및 파라핀의 순으로 파라핀블록 형성물질을 처리하여 자동침투과정을 통해 수행되는 것을 특징으로 하는 혈중 세포 응집제를 이용한 파라핀블록 제조방법.
  15. 제9항에 있어서,
    상기 파라핀블록은 혈중암세포(circulating tumor cell)의 조직학적, 면역조직화학적 또는 분자생물학적 검출방법에 이용되는 것을 특징으로 하는 혈중 세포 응집제를 이용한 파라핀블록 제조방법.
PCT/KR2014/006952 2013-09-09 2014-07-29 파라핀블록 제조용 혈중 세포 응집제 및 이를 이용한 파라핀블록 제조방법 Ceased WO2015034178A1 (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US14/917,687 US10656058B2 (en) 2013-09-09 2014-07-29 Blood cell aggregating agent for preparing paraffin block and method for preparing paraffin block by using same

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR20130108022 2013-09-09
KR10-2013-0108022 2013-09-09
KR10-2014-0095898 2014-07-28
KR1020140095898A KR101643403B1 (ko) 2013-09-09 2014-07-28 파라핀블록 제조용 혈중 세포 응집제 및 이를 이용한 파라핀블록 제조방법

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2015034178A1 true WO2015034178A1 (ko) 2015-03-12

Family

ID=52628602

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/KR2014/006952 Ceased WO2015034178A1 (ko) 2013-09-09 2014-07-29 파라핀블록 제조용 혈중 세포 응집제 및 이를 이용한 파라핀블록 제조방법

Country Status (1)

Country Link
WO (1) WO2015034178A1 (ko)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105699142A (zh) * 2016-02-18 2016-06-22 石河子大学 用于质地紧密坚硬植物材料的石蜡切片制作方法
CN112082836A (zh) * 2020-09-15 2020-12-15 海南医学院第一附属医院 一种临床血性胸水细胞蜡块及其制备方法
CN113074996A (zh) * 2021-03-15 2021-07-06 陈建华 一种血浆凝固细胞块法及其临床应用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3970427A (en) * 1973-03-22 1976-07-20 American Hospital Supply Corporation Process for reducing sticking of blood cells to glass in blood testing procedures
US6913921B2 (en) * 2002-10-31 2005-07-05 University Of Massachusetts Rapid cell block embedding method and apparatus
JP2005192521A (ja) * 2004-01-09 2005-07-21 Hiroko Sato 部分分解重合性タンパク質からなる造血幹細胞を含む未熟な血液細胞（ｈｓｃ）の増殖促進用支持体およびその支持体を使用したｈｓｃの製造方法。

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3970427A (en) * 1973-03-22 1976-07-20 American Hospital Supply Corporation Process for reducing sticking of blood cells to glass in blood testing procedures
US6913921B2 (en) * 2002-10-31 2005-07-05 University Of Massachusetts Rapid cell block embedding method and apparatus
JP2005192521A (ja) * 2004-01-09 2005-07-21 Hiroko Sato 部分分解重合性タンパク質からなる造血幹細胞を含む未熟な血液細胞（ｈｓｃ）の増殖促進用支持体およびその支持体を使用したｈｓｃの製造方法。

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BROWN DA ET AL.: "Gelatin-embedded cell -polymer constructs for histological cryosectioning", J BIOMED MATER RES PART B: APPL BIOMATER, vol. 72B, 2005, pages 79 - 85 *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105699142A (zh) * 2016-02-18 2016-06-22 石河子大学 用于质地紧密坚硬植物材料的石蜡切片制作方法
CN105699142B (zh) * 2016-02-18 2018-04-03 石河子大学 用于质地紧密坚硬植物材料的石蜡切片制作方法
CN112082836A (zh) * 2020-09-15 2020-12-15 海南医学院第一附属医院 一种临床血性胸水细胞蜡块及其制备方法
CN113074996A (zh) * 2021-03-15 2021-07-06 陈建华 一种血浆凝固细胞块法及其临床应用

Similar Documents

Publication Publication Date Title
RU2743169C2 (ru) Репрезентативная диагностика
Allfrey et al. The isolation of cell nuclei in non-aqueous media
WO2010047448A1 (en) Diagnostic kit of colon cancer using colon cancer related marker,and diagnostic method thereof
CA2341897A1 (en) Method of diagnosis of prostate cancer
WO2009113814A2 (ko) 간암 진단용 단백질성 마커
WO2014206259A1 (zh) 前列腺癌基因标记物在标记前列腺癌复发和转移中的用途及方法
CN106645752B (zh) Galectin‑10及其特异性抗体在制备检测鼻咽癌试剂盒中的应用
Bremmer et al. Comparative evaluation of genetic assays to identify oral pre‐cancerous fields
Ferlicot et al. Measurement of telomere length on tissue sections using quantitative fluorescence in situ hybridization (Q‐FISH)
WO2016144136A1 (ko) Ffpe 조직에서 핵산의 분리 방법
WO2019035565A2 (ko) 안드로겐 수용체의 변이체 기반 전립선암환자 스크리닝 방법
WO2013115476A1 (ko) 검체 시료의 응집용 조성물, 이를 이용한 파라핀 블록의 제작방법 및 상기 파라핀 블록을 이용한 세포 마이크로어레이용 세포군집 표본의 제조방법
CN117470619B (zh) 多重免疫组化染色及数字病理分析双过程质控品
Dikshit et al. Simultaneous visualization of rna and protein expression in tissue using a combined RNAscope™ in situ hybridization and immunofluorescence protocol
WO2019066485A1 (ko) 크기 배제 크로마토그래피를 이용한 세포밖 소포체의 순도 분석 방법
Kinoshita et al. Genomic‐based ancillary assays offer improved diagnostic yield of effusion cytology with potential challenges in malignant pleural mesothelioma
Cheng et al. Molecular characterization of testicular germ cell tumors using tissue microdissection
ik El-Mansi et al. Evaluation of PTEN expression in cervical adenocarcinoma by tissue microarray
Somma et al. Squamous cell carcinoma of the lower lip: FAS/FASL expression, lymphocyte subtypes and outcome
US20160223438A1 (en) Blood cell aggregating agent for preparing paraffin block and method for preparing paraffin block by using same
CN105675868A (zh) 基于idh1-r132h和atrx表达的胶质瘤分型系统
CN105606818A (zh) 基于idh1-r132h和atrx表达的胶质瘤预后系统
Simons et al. Analysis of chromosome 22q as an aid to the diagnosis of rhabdoid tumor: a case report
WO2019050149A2 (ko) 전립선특이 막항원 기반 전립선암환자 스크리닝 방법
Kaneko et al. A cell‐block preparation using glucomannan extracted from Amorphophallus konjac

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 14841921

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 14917687

Country of ref document: US

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 14841921

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1