WO2015027354A2 - Método para el enfriamiento y criopreservación de semen equino y diluyentes utilizados en dicho método - Google Patents
Método para el enfriamiento y criopreservación de semen equino y diluyentes utilizados en dicho método Download PDFInfo
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Abstract
La presente invención se relaciona con el campo de la Biotecnología, y en particular se refiere a un método para el enfriamiento y criopreservación de semen proveniente de equinos, utilizando diluyentes particularmente apropiados para dicho método. Las altas tasas de enfriamiento alcanzadas por el método empleado previo a la congelación, y el diluyente de enfriamiento y criopreservación que contiene compuestos que reducen el metabolismo celular, permiten que se obtengan elevados niveles de fecundidad de los espermatozoides criopreservados.
Description
MÉTODO PARA EL ENFRIAMIENTO Y CRIOPRESERVACIÓN DE SEMEN EQUINO Y DILUYENTES UTILIZADOS EN DICHO MÉTODO
Campo Técnico
La presente invención se relaciona con el campo de la Biotecnología, y en particular se refiere a un método para el enfriamiento y criopreservación de semen proveniente de equinos, utilizando diluyentes particularmente apropiados para dicho método, así como los diluyentes utilizados en el mismo.
Antecedentes de la Invención
En la actualidad, la inseminación artificial se ha convertido en un factor clave para la preservación, reproducción y diseminación de razas de animales de interés económico. Esta técnica consiste en la deposición de semen o esperma en el aparato reproductor de la hembra sin la intervención del macho.
Como se ha demostrado en las especies animales donde se ha empleado extensivamente, la inseminación artificial ayuda a mejorar la fertilidad pues permite el examen previo de la calidad del semen antes de su utilización, reduce el riesgo de trasmisión de enfermedades, facilita los programas de selección y mejora genética, pudiendo inseminar a varias hembras con un eyaculado, así como permite disponer de esperma de calidad en zonas alejadas de donde se localizan los donantes, con lo cual se reduce considerablemente el riesgo de accidente en el transporte de los animales (Manual de Inseminación Artificial de la Hembra Bovina, Cátedra de Zootecnia General, Facultad de Agronomía y Zootecnia, Universidad Nacional de Tucumán, ISBN 987-05-1241-0).
Una vez obtenido, el semen debe utilizarse inmediatamente en la inseminación o conservarse apropiadamente, ya que cualquier exposición de los espermatozoides a un ambiente adverso puede ocasionar efectos deletéreos sobre su capacidad fertilizante.
Por otra parte, el semen diluido puede preservarse por períodos prolongados de tiempo llevando al mínimo los posibles daños a las células espermáticas, siempre y cuando esto se realice bajo condiciones muy particulares y estrictas.
En el caso de la especie equina, aun cuando la inseminación artificial tiene un antiguo historial, esta técnica ha tenido limitaciones cuando se pretende trabajar con semen congelado, no así usando semen fresco, método que no presenta mayores dificultades (Porte E. 1992. Equinos de Tiro. Editorial Universitaria S.A., p. 194).
En los métodos actuales de conservación de semen, se busca reducir el metabolismo de los espermatozoides sometiéndolos al descenso de la temperatura del medio que los contiene (Squires y otros, 1998. Theriogenology 49(4), 743-9; McKinnon A. 1999. "Breeding and Its Technology - Now and The Future". World Trotting Conf. Papers).
En la actualidad existen dos métodos de conservación de los espermatozoides:
1) En estado líquido en refrigeración (0o a 15° C), y
2) Criopreservación (-196° C).
Sin embargo, debido fundamentalmente a que en el proceso de refrigeración, congelación y descongelación, los espermatozoides se someten a un fuerte estrés medioambiental, específicamente al shock térmico y estrés osmótico que alteran dramáticamente las condiciones físicas y químicas a la que se expone la célula, la elección de un inadecuado diluyente o protocolo de congelación puede conducir a un daño irreversible de las estructuras celulares que finalmente afecta la fertilidad de los espermatozoides (Weitze KF, (1977) Gefrierschadigung und Gefrierschutz im Rahmen der Tiefgefrierkonservierung lebenden Materials unter besonderer Berucksichtigung der Saugersamenzelle (Ubersichtsreferat). Dtsch Tierzrztl Wschr 84, 373-412 und 43, 761-768).
Un diluyente de semen es una solución acuosa que permite aumentar el volumen del eyaculado hasta conseguir las dosis necesarias para su utilización en inseminación artificial, y al mismo tiempo preservar las características funcionales de las células espermáticas y mantener el nivel de fertilidad adecuado (http://www.agroinformacion.com, 25/09/2008).
Se espera que un diluyente sea capaz de preservar la capacidad fecundante de los espermatozoides además de su motilidad; también debe tamponar la acidificación del medio consecuencia del metabolismo de los espermatozoides, y eventualmente, aportar nutrientes esenciales de tipo energético (Pickett B. W, y otros. 1987. Preservaron of stallion semen by freezing Procedures for collection, evaluation and utilization of stallion semen for artificial insemination. Animal reproduction laboratory, Colorado State University. Fort Collins 80523. 75-95 pp.).
En consecuencia, un diluyente apropiado de semen, según los antecedentes del estado de la técnica, debe contener 4 principales componentes: un sustrato metabólico apropiado, un agente crioprotector, un agente para el control del pH y la osmolaridad de la composición y uno o más antibióticos, para la inhibición del desarrollo microbiano en la preparación (http://www.agroinformacion.com 25/09/09).
Si bien se han descrito numerosos diluyentes de semen para diferentes especies de mamíferos (por ejemplo en las solicitudes de patentes CN102845413, CN102726372, AU2007258289, RU2436299, US 7,208,265, US 8,251 ,887, entre otras, existen algunos trabajos que han profundizado en la idoneidad de la composición particular que requiere cada diluyente para cada especie en los protocolos de criopreservación de espermatozoides.
La limitante en la criopreservación del semen, conocida como el factor diluyente o "extender"; se debe a que en la actualidad existen varios protocolos de congelación que requieren estudios comparativos para poder identificar el diluyente más eficiente para cada método que se emplea. Los trabajos coinciden en que el principal factor de variación que determina la congelación es propio del individuo, sin embargo el mayor y más preocupante inconveniente es el "shock" térmico al cual están expuestos los espermatozoides durante el proceso de congelación y descongelación, reduciendo así en gran medida la capacidad de fertilización y la calidad (Pineda. D. S., Biotecnología de la Reproducción en Animales Domésticos., Universidad de Nariño, Programa de Medicina Veterinaria. Pasto- Nariño. 2002. p. 88-92). Si bien se han ensayado varias tasas de enfriamiento y descongelación en la criopreservación seminal de diferentes especies, lo cierto es que no se ha logrado determinar con exactitud una curva
estándar para esta técnica (Hochi S., Semple E., Leibo S. P. (1996) Effect of cooling and warming rates during cryopreservation on survival of in vitro produced bovine embryos. Theriogenology. 46:837-47; Yu I., Songsasen N., Godke R. A., Leibo S. P. (2002). Differences among dogs in response of their spermatozoa to cryopreservation using various cooling and warming rates. Cryobiology. 44: 62-78; Peña-Martinez A. I. (2004). Canine fresh and cryopreserved semen evaluation. Anim Reprod Sci. 82: 209-24; Velasco-Santamaría Y.M, Medina-Robles VM, Cruz- Casallas PE, 2006 Cryopreservation of yamú (Brycon amazonius) sperm for large scale fertilization. Aquaculture. 256: 264-71).
Lo planteado anteriormente se debe principalmente a que los resultados dependen de factores tales como el diluyente o el crioprotector usado, el sistema de empaquetamiento; así como también de la calidad seminal, parámetro altamente variable entre los diferentes individuos (Landsverk K. (2000) Packaging and distribution-Their impact on fertility. In Johnston LA and Gutherie HD. (Editors). IV International Conference on Boar semen preservaron. Maryland, USA. 137-139).
Por otra parte, el uso de crioprotectores ha causado polémica en la comunidad científica, pues, aunque se requieren como constituyentes de los diluyentes para proteger las células espermáticas contra los efectos adversos de la congelación, Ammán en 1993 reportó que no se ha logrado encontrar la sustancia más apropiada, así como tampoco la cantidad adecuada para tal fin. Las características fisicoquímicas de los crioprotectores no son suficientes para proveer las condiciones adecuadas ni la protección celular durante el proceso de congelación, en efecto se ha demostrado que el primer factor limitante es la toxicidad que este genera, produciendo lesiones tanto de tipo osmótico como bioquímico (Amann, R. P. and JK Graham, 1993. Spermatozoal function. In: DiRienzi D, ed. Equine reproduction. Philadelphia: Lea and Febiger; 715-745).
Es por esta razón que varios autores y especialistas en el área de reproducción equina coinciden en la necesidad de utilizar un diluyente y un criopreservante que aporte lipoproteínas y sustancias que protejan al espermatozoide del "shock" térmico, sin embargo es el crioprotector el que durante el proceso de congelación lleva la mayor responsabilidad, siendo el glicerol un crioprotector penetrante
clásico que aún con los avances actuales presenta inconvenientes con el semen equino, motivo por el cual las amidas, y especialmente la dimetil-formamida, se proponen como una solución, teniendo en cuenta sus características crioprotectoras y su poder de penetración celular (Braun, W. Determining fertility in stallions. Veterinary Medicine (1989).p. 192-199).
Existen diferentes composiciones propuestas como diluyentes apropiados para ser utilizados en la conservación esperma equino, todas indisolublemente vinculas con el protocolo específico que se utilice en su conservación ("Equine Artificial Insemínation. Davies Morel". CABI Publishing, 1999).
Lo más generalizado en el campo particular de los equinos es que se utilice como sustrato apropiado leche o sus subproductos, a los que se les añade también ingredientes químicos para ajusfar y estabilizar el pH y la osmolaridad, así como antibióticos para inhibir el crecimiento bacteriano.
Por ejemplo, en el caso solicitud de patente con número de publicación CN102578079 se describe un fluido base para diluir semen de equinos y un método de preparación y uso del miso. El fluido base contiene una leche líquida descremada, glucosa, rafinosa, D-glucopiranosa, citrato trisódico, citrato de potasio y ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazinetano sulfónico (HEPES). A dicho fluido base también se le puede añadir penicilina y dihidroestreptomicina, yema de huevo y glicerol. El fluido base es adecuado para la dilución del semen y para su conservación a temperatura normal, así como para su conservación a baja temperatura (15° o 5o C) y para su congelación cuando le son adicionadas otras sustancias, entre ellas los crioprotectores (diluyente secundario).
Por otra parte, la solicitud de patente reciente WO/2013/050643, divulga un diluyente de semen equino compuesto por una solución salina equilibrada de Hank, suplementada con glucosa, lactosa, suero fetal bovino y fosfocaseinato nativo proveniente de leche, yema de huevo entre 0.5 y 4% (v/v) HCON (CH3)2 (1- 4% v/v) y glicerol (0.5-2% v/v).
Otros diluyentes descritos en el estado de la técnica y que actualmente se utilizan ampliamente en el mercado para la criopreservación de semen equino se relacionan a continuación. Si bien en la siguiente relación se mencionan los componentes principales de estos diluyentes, es muy probable que algunos de
ellos importantes no aparezcan divulgados, pues constituyen información propietaria de los fabricantes.
1. Botucrio® (M. Alvarenga: Curso Internacional de Reproducción en Equinos, UACh (2010); Nacimiento y otros., Journal of Equine Veterinary Science; Volume 28, Issue 6, Pages 351-358)
- Agua no pirogénica
- Yema de huevo de gallina (5%)
- Glicerol (1%)
- Metilformamida (4%)
- Taurina y glicina (>14 aminoácidos)
- Trealosa y bajas cantidades de glucosa
- penicilina cristalina y amikacina
2. INRA96® (E. Pillet, G. Duchamp, F. Batellier, V. Beaumal, M. Anton, S.
Desherces, E. Schmitte, M. Magistrini. "Egg yolk plasma can replace egg yolk in stallion freezing. Theriogenology 75 (2011) 105-114).
- caseína de la leche
- yema de huevo (2-4%)
- glicerol (2,5%)
3. Gent (minitube) (http://www.minitube.de/DE eng/Products- Services/Equine/Semen-Extenders/Gent-Equine-Extender-for-Semen- Freezinq-45-ml
- yema de huevo
- glicerol
- antibióticos
4. EZ-freezing LE®: (http://www.arssales.com/EZFreezUserGuide-hr.pdf en http://www.arssales.com/epf-e-z_freezin.html)
- yema de huevo
- lactosa
- glucosa
- equex STM
- citrato de sodio dihidrato
- EDTA disódico
- bicarbonato de sodio
- glicerol
- ticarcilina
5. E-Z Freezin MFR5® (http://www.arssales.com/EZFreezUserGuide-hr.pdf en http://www.arssales.com/epf-e-z_freezin.html)
- glicerol
- yema de huevo
- leche descremada en polvo
- glucosa,
- lactosa
- citrato de sodio dihidrato,
- citrato de potasio monohidrato,
- hepes libre de ácido,
- tricarcillina di sódica
Como se puede observar, la mayoría de los diluyentes anteriores incluyen como parte de su composición sustratos energéticos, utilizados fundamentalmente para preservar la motilidad de las células espermáticas, parámetro tradicionalmente usado como indicador de la viabilidad de los espermatozoides y también como predictor de la fertilidad, que a la luz de la evidencia actual, según la presente invención, requiere ser revisado.
Como se ha explicado anteriormente, debido a que el proceso de criopreservación requiere que el semen eyaculado a la temperatura corporal sufra un proceso de congelación hasta -196° C, que es la temperatura del nitrógeno en estado líquido, y que constituye hasta la fecha el mejor medio de conservación a largo plazo, se
han encontrado dos zonas de la refrigeración o enfriamiento particularmente peligrosas para la viabilidad de los espermatozoides provenientes de equinos. La primera corresponde al descenso de temperatura desde aproximadamente los 20° C (temperatura ambiental) hasta los 5o C (temperatura de refrigeración), fenómeno que se conoce como shock térmico y que presenta cierta tendencia a relajar la membrana del acrosoma del espermatozoide. La segunda zona corresponde al descenso de la temperatura hasta los -20° C (temperatura de congelación). Durante este período, la muestra pasa por la fase de calor latente de cristalización que, si no se enfría con rapidez, provocará un incremento de la temperatura del semen. La siguiente reducción de la temperatura hasta los -196° C parece ser inocua para las células (Valencia I, Loza H, Valencia P, Vega I, Delgado D y Oleas M. (2008) Utilidad clínica del banco de semen. Red Latinoamericana de Reproducción Asistida (http://www.redlara.com/inq/pec dat_livro_ivan 14. asp).
El semen equino refrigerado se ha utilizado en programas de inseminación artificial de manera rutinaria por más de 25 años en esta especie. Esta situación, tanto en Chile como en el resto del mundo, se ha visto potenciada porque la mayoría de los registros de caballos aprueban el uso de la inseminación artificial en cualquiera de sus formas, con ello la reproducción equina ha hecho suyos todos los beneficios de esta tecnología. Sin embargo, aún existen una gran variedad de problemas asociados al uso de semen refrigerado, y el más importante es que no todos los reproductores donantes pueden usarse para producir y enviar semen refrigerado, pues su fertilidad decrece cuando el semen es procesado, enfriado y transportado en dispositivos de refrigeración. En algunos trabajos se ha sugerido que estos problemas pueden estar asociados a la composición del plasma seminal (Brinsko y otros, 2000, Theriogenology 54, 129- 136).
Para el caso específico de los equinos, se han desarrollado una serie de diluyentes o extensores de refrigeración, basados normalmente en el uso de leche, gelatina o yema de huevo junto a antibióticos (Squires y otros, 1981. Equine Veterinary Science 1 , 43-48; Jasko y otros, 1992. Theriogenology 37, 1241 -1252; Ijaz and Ducharme, 1995. Theriogenology, 44(7), 1039-1050; Lawson
and Davies Morel, 1996. New Developments in Equine Studies. Royal Agricultural Society, Kenilworth. UK, pp 26-39).
Dichos componentes aportan ingredientes que posibilitan la supervivencia de los espermatozoides fuera del tracto reproductivo, destacándose las lipoproteínas que contiene la leche o la yema de huevo, las cuales protegen a los espermatozoides en contra del shock térmico, al estabilizar la estructuras de membranas celulares (Blanchard y otros, 2003. Manual of Equine Reproduction, second Edition. Mosby, pp 165-168). Los sustratos metabólicos, principalmente la glucosa, normalmente se incorporan como fuente de energía para los espermatozoides, así como los antibióticos, los cuales retardan o eliminan el crecimiento microbiano.
Se ha definido que el descenso de la temperatura desde los 18° a los 8° C es una fase crítica, en la cual puede ocurrir el shock térmico citado anteriormente (Amann y Pickett, 1987. Journal of Equine Veterinary Science 7, 145-173), y por ello se recomienda el uso de tasas de refrigeración menores a 0,3° C en dicho rango, minimizando la ocurrencia del daño celular que este ocasiona (Ammán y Pickett, 1987. Journal of Equine Veterinary Science 7, 145-173). Para lograr tasas de refrigeración como las mencionadas, el semen equino normalmente tiene que ser almacenado y transportado dentro de dispositivos de enfriamiento pasivo. El más comúnmente usado de estos dispositivos es el Equitainer (Hamilton Thorne Research, Danvers, MA, Patente No. US 4,530,816), el cual enfría la muestra de semen lentamente a una razón inicial de 0,03° C por minuto a 4-8° C (Douglas y otros., 1987. Journal of Reproduction and Fertility 35, 649-650; Squires y otros, 1998. Theriogenology 49(4), 743-9).
Los sistemas de enfriamiento pasivo como el anterior, manifiestan un comportamiento curvilíneo, con una alta tasa de enfriamiento inicial, que progresivamente se estabiliza a una mucho más lenta, próximo a la temperatura final. A pesar de estas variaciones, estos sistemas trabajan bien, y reportan tasas de enfriamiento promedio de 0,08° C por minuto entre los 20°C y los 12°C (Douglas-Hamilton y otros, 1984. Theriogenology 24(3), 291-304), las que se consideran apropiadas para los espermatozoides de equinos (Mckinnon, 1999.
"Breeding and Its Technology - Now and The Future". World Trotting Conf Papers).
Los sistemas de enfriamiento activo como el 548 MOD-X Semen-Cooler (Animal Reproduction Systems, Chino, CA), han permitido investigar el uso de tasas de enfriamiento programadas linealmente, por sobre y bajo los rangos descritos. Dichos experimentos, revelaron que el semen equino inicialmente diluido en leche descremada, puede tolerar un rápido enfriamiento (0,7° C/min) desde los 37° a los 5°C, sin efectos deletéreos sobre el porcentaje de espermatozoides motiles. Entre los 19° y los 8°C, sin embargo, la tasa de enfriamiento tiene que reducirse a 0,05° C/min para prevenir la pérdida de la motilidad espermática, mientras que por debajo de los 8o C se puede aplicar una rápida tasa de enfriamiento (Mckinnon, 1999. "Breeding and Its Technology - Now and The Future". World Trotting Conf. Papers).
Anteriormente, en un estudio realizado por Varner y otros, en el cual el semen diluido se expuso a diferentes tasas de enfriamiento se concluye que los espermatozoides equinos deben refrigerarse a tasas iguales o inferiores 0,3° C, basado en el hecho de que las tasas rápidas y moderadas tenían un efecto negativo sobre los parámetros de motilidad espermática versus tasas lentas (Varner y otros 1988 Theriogenology 29, 043).
Llama la atención que las definiciones y recomendaciones respecto de las tasas de enfriamiento en la especie equina se basan exclusivamente en parámetros de motilidad espermática y no existen reportes basados en la viabilidad o integridad de la membrana plasmática, variable que estaría más directamente asociada con las alteraciones descritas para el daño por shock térmico en la fase crítica de los 18-20° C y los 5°. Por otra parte no se reportan datos en los cuales se haya evaluado la fertilidad de semen expuesto a distintas tasas de enfriamiento.
SUMARIO DE LA INVENCIÓN
Mediante la presente invención se logró demostrar que, de forma sorprendente, la aplicación de tasas de refrigeración superiores a las descritas en el estado de la técnica como peligrosas en el rango de >1 ,8° C/min (Figura 1), permiten que la
viabilidad espermática post refrigeración y post descongelación descienda en menos de un 4 % y en un 37%, respectivamente, con respecto de la viabilidad del semen fresco recién colectado (Figuras 2 y 3).
En consecuencia la presente invención propone un método para el enfriamiento y criopreservación de espermatozoides equinos, el cual incluye un protocolo de refrigeración y congelación no programable, en cuyos pasos se emplean diluyentes específicamente diseñados para los mismos.
El método de la invención comprende los siguientes pasos:
a. proporcionar una muestra de semen equino previamente diluido en un diluyente de centrifugación mantenido bajo condiciones apropiadas;
b. centrifugar dicha muestra y resuspender el pellet que contiene los espermatozoides en un diluyente de refrigeración y congelación con capacidad de inhibir el metabolismo celular;
c. refrigerar la muestra así obtenida a 5 °C desde la temperatura ambiente (20°-37°) durante 30 a 90 minutos; y
d. congelar la muestra previamente refrigerada del paso (c).
En una modalidad preferida de la invención, las condiciones apropiadas para acondicionar y mantener la muestra de semen equino es diluir primeramente el eyaculado fresco en leche descremada utilizada como diluyente de centrifugación, a temperatura ambiente, es decir aproximadamente entre 20 y 37° C. En una modalidad más preferida la dilución el semen en el diluyente de centrifugación es en una relación 1 :1.
En otra modalidad preferida de la invención la centrifugación de la muestra diluida en leche descremada se realiza también a temperatura ambiente (es decir aproximadamente entre 20 y 37° C), durante 15-20 minutos a 1000 x g.
Una vez eliminado el sobrenadante obtenido a partir del paso anterior de centrifugación y que contiene el plasma seminal, el pellet que contiene los espermatozoides se resuspende, como una modalidad preferida, en una composición diluyente con capacidad reductora del metabolismo (diluyente de refrigeración y congelación), en lo adelante denominado HM0, y que se utiliza
como diluyente base en un volumen apropiado para lograr una concentración espermática final de 200 x 106 espermatozoides por mi, concentración a la cual se empaqueta en pajuelas o pajillas de 0,5 mi, antes de la refrigeración.
En una modalidad preferida, la composición HMO comprende adicionalmente un agente inhibidor del metabolismo celular, seleccionado a partir del grupo que consiste de agentes hipoglicemiantes, hormonas tales como la grelina, moléculas sintéticas o naturales que produzcan efecto inhibitorio del metabolismo o hipoglicemiante, biguanidas, tales como la metformina, y la fenformina, adenilatos tales como el AMP, el ADP, y el AICAR, e inhibidores y/o desacoplantes mitocondriales, tales como dinitrofenol, cianuro, rotenona, CCPC, oligomicina A, acido malónico, antinimicina A, azida, entre otros.
Las muestras de semen obtenidas previamente se llevan a un refrigerador calibrado a 5o C, y se mantienen en el mismo durante 30-90 minutos.
Al llevar a cabo este método de enfriamiento de las muestras, se logran tasas de refrigeración rápidas. Es decir, partiendo de una muestra de semen resuspendida en HMO a 20° C y empaquetada en pajuelas de congelación de 0,5 mi, se ejecuta una tasa de enfriamiento de 7,4° C/min entre los 20° y los 10° C; seguida de otra de 1 ,8° C/min entre los 10° y los 7° C y por ultimo de 0,2° C/min entre los 7° y los 5o C. En promedio se logra una tasa de enfriamiento de 1 ,25° C/min, un valor que es considerablemente más alto (4 veces) que la tasa de enfriamiento recomendada como ideal (0,3 °C/min) para mantener la viabilidad de los espermatozoides de equinos entre los 20° y los 5o C, lográndose esto en tan solo 15 minutos.
Las muestras así refrigeradas se someten a vapores de nitrógeno líquido. Para ello se congelan en un rack de congelación a 4-6 cm por sobre el nivel de nitrógeno líquido, durante 20 minutos en una caja térmicamente aislada. Posteriormente se sumergen en el nitrógeno líquido y se almacenan en tanques criogénicos.
Adicionalmente, el método de la invención permite que las muestras refrigeradas se puedan mantener a 5o C por varias, entre 12 y 24 horas, antes de su congelación.
Si las muestras así crioconservadas se desean utilizar en inseminación artificial, las mismas deben previamente descongelarse a 37° C durante al menos 30 segundos, y posteriormente se emplea una dosis de al menos a 400 x 106 de espermatozoides vivos totales, en un procedimiento de inseminación artificial profunda en cuerno ipsilateral al folículo periovulatorio (menos de 6 horas de confirmada la ovulación) o post ovulatorio (no más de 6 horas de confirmada la ovulación).
Adicionalmente es importante señalar que para que este proceso manifieste toda su efectividad se debe trabajar con eyaculados frescos que al ser evaluados contengan idealmente al menos un 70% de viabilidad o integridad de membrana plasmática como único criterio de selección, salvo que la motilidad total sea inferior al 50%.
La presente invención también incluye los diluyentes que se utilizan en el método previamente descrito.
En el caso del diluyente de centrifugación, como ya se describió previamente, este está constituido por leche descremada UHT (pasteurizada a temperatura ultra-alta), la cual se utiliza para diluir y centrifugar el eyaculado y poder eliminar el plasma seminal de la muestra de semen.
Una vez centrifugado el eyaculado, se desecha el sobrenadante y los espermatozoides se resuspenden en el diluyente de refrigeración y congelación que contiene agentes crioprotectores, el cual presenta capacidad reductora del metabolismo celular ya que no contiene sustratos energéticos, y como aspecto novedoso, incluye adicionalmente agentes inhibidores del metabolismo celular entre otros componentes.
El método de la invención es particularmente útil para la preservación de semen derivado de la especia equina, y característicamente muestra su eficiencia para las razas de equinos Ardennes, Brabant, Bretón y Percherón.
El diluyente de refrigeración y congelación HM0 de la presente invención se caracteriza por presentar la siguiente composición básica:
Tris 150 - 450 mM
Ácido cítrico Dihidratado 50 - 150 mM
Yema de huevo 10 - 18%
Glicerol 0,3 - 5%
Estreptomicina 0,1 - 10 mg/ml
Gentamicina 0,01 - 0,1 mg/ml
Agua destilada hasta completar 1000 mi;
osmolaridad: 660-690 mOsm/Kg
pH: 7,0-7,4.
Como se puede observar, en la presente invención el diluyente de refrigeración y congelación se puede considerar que es un diluyente reductor del metabolismo celular ya que carece de sustratos tales como glucosa, fructosa, piruvato, lactato, etc., los cuales normalmente se incluyen en este tipo de composiciones, particularmente glucosa.
De forma adicional y como aspecto novedoso de la presente invención, la composición del diluyente de refrigeración y congelación se puede suplementar adicionalmente con uno o más agentes inhibidores del metabolismo celular, que incluyen pero no se limitan a agentes hipoglicemiantes, hormonas tal como la grelina, moléculas sintéticas o naturales que produzcan efecto inhibitorio del metabolismo o hipoglicemiante, biguanidas, tales como la metformina, y la fenformina, adenilatos tales como AMP, ADP, y AICAR, e inhibidores y/o desacoplantes mitocondriales, tales como dinitrofenol, cianuro, rotenona, CCPC, oligomicina A, ácido malónico, antinimicina A y azida.
Los diluyentes previamente mencionados son útiles para utilizar en protocolos de refrigeración-congelación de esperma equina, y de forma particular, de las razas de caballo Ardennes, Bretón y Percherón.
La invención también involucra, en una modalidad preferida, un kit para la inseminación artificial de hembras de la especie equina, y particularmente de las razas Ardennes, Bretón y Percherón, el cual comprende espermatozoides criopreservados de conformidad con el método de la invención e instrucciones para su uso.
Las altas tasas de enfriamiento alcanzadas por el método empleado previo a la congelación, y los diluyentes utilizados en el mismo, logran elevados niveles de fecundidad de los espermatozoides criopreservados mediante la invención, datos que se muestran en la descripción más detallada que sigue.
Se podrá observar que la viabilidad de los espermatozoides postdescongelación (50% aproximadamente, dependiendo de la viabilidad del eyaculado fresco) y su funcionalidad espermática in vivo (48% aproximado por intento de inseminación artificial), se demuestra mediante pruebas in vitro e in vivo en campo. Tanto el método como los diluyentes aquí propuestos, se validan en razas pesadas de caballos, para las cuales, como se describe en el estado de la técnica, han demostrado menores cualidades de congelabilidad de semen, así como bajas tasas de fertilidad con semen congelado.
Adicionalmente, las tasas de enfriamiento rápido logradas con la invención permiten la utilización de refrigeración simple para esta primera etapa, y la posibilidad de prescindir de equipamiento sofisticado que se requiere actualmente para ello en los procesos análogos del estado de la técnica.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
FIGURA 1 : Muestra gráficamente la rampa de enfriamiento y congelación obtenida utilizando el método y los diluyentes de la invención.
FIGURA 2: Muestra la viabilidad del semen fresco y refrigerado con el diluyente HMO con o sin aditivos en comparación con el diluyente comercial Botucrio®.
FIGURA 3: Muestra la viabilidad postdescongelación del semen criopreservado con el diluyente HMO, con o sin aditivos, en comparación con el comercial Botucrio®.
FIGURA 4: Muestra el porcentaje de acrosomas intactos postdescongelación del semen criopreservado con el diluyente HMO, con o sin aditivos, en comparación con el comercial Botucrio®.
FIGURAS 5 y 6: Muestran el porcentaje de Motilidad Total y Progresiva postdescongelación del semen criopreservado con el diluyente HMO, con o sin aditivos, en comparación con el comercial Botucrio®.
FIGURA 7: Muestra el porcentaje o índice de fragmentación del ADN luego de la descongelación del semen criopreservado con el diluyente HMO, con o sin aditivos, en comparación con el comercial Botucrio®.
FIGURA 8: Muestra el porcentaje de espermatozoides viables con acrosomas intactos postdescongelación del semen criopreservado con el diluyente HMO, con o sin aditivos, en comparación con el comercial Botucrio®, evaluados mediante citometría de flujo.
FIGURA 9: Resultados del análisis de motilidad total (A) y progresiva (B) postdescongelación tras 1 hora de incubación a 37° C y diluido en medio Whittens (glucosa) en ausencia o presencia de fructosa.
FIGURA 10: Muestra el análisis de congelabilidad del semen criopreservado con diluyente HMO y Botucrio®, en el que se comparan dos tiempos de refrigeración (20 y 90 minutos). Los gráficos muestran los resultados de viabilidad, viabilidad normalizada con la viabilidad del eyaculado fresco, análisis de motilidad total y progresiva.
FIGURA 11 : Resultados del análisis de congelabilidad completo de las dosis testigo usadas en las pruebas de campo, donde se evaluaron los parámetros de Viabilidad (A), Integridad Acrosomai (B) Motilidad Total (C), Motilidad Progresiva (D), de espermatozoides criopreservados con el diluyente HMO en comparación con el comercial Botucrio®.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
Utilizando el método de refrigeración y criopreservación de espermatozoides propuesto en la presente invención, se logran óptimos resultados. Las tasa de refrigeración que se alcanza al inicio es alta (7,4° C/min en 2 minutos), luego un poco más lenta desde los 2 a los 10 minutos hasta los 7o C (1 ,8 min) y finalmente, se alcanza una tasa lenta de 0,2° C/min hasta llegar a los 5o C. Con
este método se logra disminuir la temperatura desde los 20° C hasta los 5° C en tan solo 15 minutos, temperatura a la cual es posible mantener por varias horas las muestras enfriadas antes de congelarlas (12-24 hrs), lo que facilita adicionalmente las condiciones de envío de muestras de semen así preparadas y mantenidas a 5° C para su posterior congelación. Finalmente, los diluyentes de centrifugación) y de refrigeración y congelación utilizados en el método de la invención, son simples y de fácil adquisición, en tanto que el protocolo inventivo es económico y eficiente, ya que prescinde del empleo de dispositivos o equipamiento sofisticados para su realización.
A continuación se describirán las diferentes modalidades de la invención como ejemplos de realización de la misma, los cuales se divulgan con fines únicamente de ilustración de la misma, pero en modo alguno deben considerarse para restringir su alcance legal.
EJEMPLOS DE REALIZACIÓN
Ejemplo 1. Estandarización y mejoras del protocolo de criopreservación de espermatozoides equinos a usar en inseminación artificial de razas pesadas, empleando diluyentes especialmente diseñados para el mismo.
Se realizaron pruebas preliminares en las cuales se evaluó el efecto del tiempo en refrigeración (20 minutos vs 90 minutos) sobre la congelabilidad, usando dos diluyentes de congelación (HM0 y Botucrio®). Los análisis revelaron que no existen diferencias significativas en los parámetros de congelabilidad analizados en ninguno de los dos diluyentes usados cuando se compara el tiempo de refrigeración (Figura 10). También se probaron el efecto de la fuerza y tiempo de centrifugación (600-1000 x g por 10 a 20 minutos), así como de la concentración de empaquetamiento (200-400 millones de espermatozoides/ml) (datos no mostrados).
El método que finalmente dio los mejores resultados se detalla a continuación.
En primer lugar, el eyaculado previamente filtrado se diluye en una relación 1 :1 con leche descremada atemperada a la misma temperatura del eyaculado
(diluyente de centrifugación). La mezcla anterior se centrifuga a temperatura ambiente, aproximadamente a 22° C, durante 15 minutos a 1000 x g.
Al sobrenadante obtenido en el paso anterior se mide su temperatura y se elimina. El pellet recuperado se resuspende entonces en el diluyente HM0 (diluyente de refrigeración y congelación) que contiene opcionalmente la adición de AMP (HM0- AMP) o Metformina (HMO-Metformina) a la misma temperatura del sobrenadante eliminado, utilizando 1/5 del volumen del eyaculado) y ajustando la concentración de espermatozoides en la mezcla a 200 x 106 espermatozoides (spz)/ml.
La muestra así acondicionada se empaqueta en pajuelas de 0,5 mi y se sellan con calor. Las pajuelas se disponen en un rack de congelación y luego se trasladan a un refrigerador calibrado a 5o C, manteniéndose a esa temperatura durante 40 minutos.
Con este método se ejecutan las siguientes tasas de refrigeración: -7,4° C/min ente los 20 y los 10° C/min; -1 ,8° C/min entre los 10 y los T C y -0,2° C/min entre los 7 y los 5o C. En promedio es de 1 ,25o C/min entre los 20 y los 5o C (Figura 1).
Luego se coloca el rack de congelación a 4-6 cm (-120° C) del nivel de nitrógeno líquido en una caja térmica por 20 minutos, y finalmente se sumerge en nitrógeno líquido y se lleva a un tanque criogénico.
Para utilizar el semen así conservado, este debe descongelarse a 37° C, durante al menos 30 segundos y usar inmediatamente.
La dosis de semen de estas razas (pesadas) a utilizar en cada inseminación artificial de yeguas de cualquier raza incluidas las pesadas mensionadas anteriormente debe ser equivalente al menos a 400 x 106 de spz totales, en un procedimiento de inseminación artificial profunda en cuerno ipsilateral al folículo en ovulación.
Se debe trabajar con eyaculados evaluados previamente y que presenten cuando se obtienen de forma fresca al menos un 70% (idealmente) de viabilidad o integridad de membrana plasmática.
Vale aclarar que para el uso de semen congelado en razas pesadas , el estado de la técnica recomienda utilizar doble dosificación (800 x 106 de espermatozoides (spz) viables en total) vs 400 x 106 de spz totales típicamente indicados para
todas las razas en general, para garantizar una fecundación exitosa de las hembras inseminadas con semen congelado (Catálogo Harás nacional, Francia).
Los resultados obtenidos utilizando el método estandarizado de la invención se muestran en la Figura 1.
En esta figura se muestran las rampas de congelación obtenidas en los distintos estudios. En ella se detalla lo sucedido entre los 20 y los 5 °C, fase en la cual se identifican 3 componentes (pendientes) o tasas de enfriamiento que se obtienen con la invención, de las cuales dos de ellas (7,4 y 1 ,8° C/min, desde los 20 a los 7o, en menos de 4 minutos) son muy superiores a las descritas y recomendadas para semen equino (0,3 °C/min).
Ejemplo 2. Estudios de funcionalidad y calidad espermática in vitro a partir del uso de diluyentes de congelación de semen equino.
Para el presente estudio de congelabilidad con distintos extensores, se consideraron sementales de las razas Ardennes, Precherón y Bretón de montaña, todos aptos desde el punto de vista sanitario, con una madurez y conducta reproductiva adecuada para la colección seminal mediante vagina artificial
Para cada evaluación se utilizó como control del proceso de criopreservación el extensor de origen brasileño Botu-Crio®, todos los tratamientos farmacológicos fueron probados sobre HM0.
Protocolo de Congelación: Como criterio sólo se congelaron eyaculados que tengan un porcentaje de viabilidad igual o superior al 70%. Para las pruebas farmacológicas el semen fue empaquetado en pajuelas a 50 millones/ml. Para las pruebas de campo el material criopreservado se empaquetó a 200 millones vivos/ml. Como diluyente de centrifugación se usó leche descremada (1 :1). El pellet obtenido fue resuspendió en los diluyentes de congelación previamente atemperados a 20° C y enfriado y equilibrado a 5o C durante 90 minutos. Posteriormente las pajuelas se expusieron a vapores de nitrógeno líquido durante 20 minutos (60°/min), finalmente las pajuelas fueron sumergidas y almacenadas en nitrógeno líquido por al menos 3 semanas antes de su análisis.
Descongelación: Las pajuelas se descongelaron en baño termorregulado a 37° C por 30 segundos, utilizando el descongelador portátil Minitube MT35/42.
a) Evaluación de la Viabilidad:
En condiciones de campo (semen fresco) se usó el test de eosina-nigrosina de Bloom, con modificaciones realizando 3 frotis (15 μΙ en total) a partir de una mezcla (1 :1) de muestra con una solución de eosina (50 g/L)/negrosina (100 g/L) ambas preparadas en NaCI (9 g/L). Los frotis secos se analizaron en microscopio de campo claro a una magnificación de 40 X, contabilizándose al menos 20 espermatozoides por frotis. Para el análisis avanzado de viabilidad en laboratorio se utilizó el módulo de viabilidad de Sperm Class Analizer, a partir de una mezcla (1 :1) de la muestra con una solución de naranja de acridina 20 μΜ y yoduro de propidio 10 μΜ, contándose al menos 200 espermatozoides.
b) Evaluación de la Integridad de Acrosomas mediante fluorescencia y uso de la lectinas conjugada a fluoróforo PSA-FITC:
20 ul de semen (pajuelas) se lavaron mediante centrifugación a 600 g durante 1 minuto en buffer Tris/citrato (300 mM/94.7mM) pH= 7,4 y luego se resuspendieron en el mismo, tras lo cual la muestra se esparció y se secó en 3 portaobjetos. Las muestras se lavaron con h Oci por dos minutos y se fijaron con metanol 100% durante 1 minuto, los esparcidos se tiñeron con solución de PSA- FITC (100 mg/mL) durante 15 minutos. Las preparaciones se lavaron con exceso de hkOci, se secaron y se observaron a una magnificación de 40X en un microscopio de epifluorescencia (Leica DMI3000B).
c) Análisis de Motilidad Espermática: Para cada análisis se tomaron muestras que se diluyeron a una concentración de 25 x106 células/ml. Los estudios contemplaron el uso del sistema CASA (Sperm Class Analyzer Sea, Microptic), basado en el análisis de 24 imágenes digitales fotografiadas consecutivamente y que fueron tomadas en un lapso de 1 segundo, mediante de un microscopio Nikon E200 acoplado a una cámara de alta velocidad y con platina termoestatizada a 37° C. Se contabilizaron al menos 500 espermatozoides. La configuración usada en el análisis fue la siguiente: Área de partícula: > 4μ2 y <75 μ2; Motiles: νΰί>10μ/5; Motiles Progresivos: STR > 75%; Conectividad: 12.
d) Evaluación de la fragmentación de DNA espermático postdescongelación:
Se utilizó el módulo de Fragmentación del CASA, con el uso de un kit comercial
Halomax®, que está basado en el método de Sperm Chromatine Dispersión (SCD). Las muestras (descongeladas) se diluyeron a una concentración de 5-10 millones/ml en tampón de fosfato salino (300 Mm/94,7 Mm). Separadamente se fundió la agarosa de bajo punto de fusión (90 -100° C) durante 5 minutos aproximadamente, posteriormente la agarosa se equilibró a 37° C, para mezclarla con 20 pl del semen diluido y se agitó vigorosamente. Luego se colocó una gota de la suspensión en los portaobjetos previamente tratados del kit comercial y se cubrió con un cubreobjetos, presionando suavemente para evitar las burbujas de aire. La muestra se llevó a refrigerador por 5 minutos a 4° C en posición horizontal, posteriormente se preparó la solución desnaturalizante, la cual se reconstituyó homogeneizando 1 mi de solución de lisis (comercial) con 1 pl de agente reductor (comercial). Una vez extraída la muestra del refrigerador se quitó el cubreobjetos, deslizándolo suavemente de la muestra e inmediatamente fue sumergido el portaobjetos en la solución desnaturalizante antes preparada y se incubó por 5 minutos a temperatura ambiente (22° C). Luego, las muestras se lavaron en una bandeja con agua destilada y se dejó por 5 minutos. Posteriormente, las muestras se deshidrataron en una batería de etanol 75%, 95% y 100%), 2 minutos en cada una, manteniendo siempre la posición horizontal del portaobjetos. Los portaobjetos se secaron y tiñeron con tinción de Wrigth durante 8 minutos y luego se dejaron secar a temperatura ambiente, para su posterior lectura en el microscopio. Para la observación y análisis mediante CASA, se utilizó el objetivo 20 X, con el cual se cuantificó automáticamente el porcentaje de espermatozoides con el ADN fragmentado y no fragmentado, discriminando a los espermatozoides que muestran un pequeño halo periférico de dispersión de la cromatina de los que exhiben un amplio halo de dispersión.
e) Citometría de Flujo: Las pajuelas se descongelaron según lo descrito anteriormente, luego se diluyeron con buffer Tris/citrato, centrifugadas a 600 g por 3 minutos, el pellet se resuspendió en 1 mi buffer Tris/citrato, finalmente 25 μΙ de la resuspensión se incubaron durante 5 minutos a 37° C en una solución de PSA-FITC 10 Mg/ml y yoduro de propidio 12 μΜ con un volumen final de 400 μΙ. El análisis se realizó utilizando FACS Canto II BD. Los resultados corresponden al promedio de fluorescencia relativa del conteo de 5000 registros por muestra.
Los resultados obtenidos con estos experimentos muestran que no se encontraron diferencias significativas en términos de viabilidad (Figura 3), estado acrosomal (Figura 4) e índice de fragmentación de DNA (Figura 7) postdescongelación de los espermatozoides criopreservados, previamente tratados con el diluyente base HMO, con o sin aditivos; encontrándose al nivel de los parámetros obtenidos con el control comercial Botucrio®.
Ejemplo 3. Resultados de la Evaluación de la calidad seminal postdescongelación mediante el sistema de análisis espermático asistido por computadora (CASA):
Se obtuvieron resultados que indican que de los tres parámetros evaluados de manera independiente, a saber la viabilidad, el estado de los acrosomas y la motilidad (total y progresiva) inmediatamente postdescongelación de los espermatozoides criopreservados utilizando HMO como diluyente de refrigeración y congelación en comparación con el diluyente comercial Botucrio®, solo la motilidad presentó diferencias significativas, siendo mayor en Botucrio®.
Las diferencias significativas entre los tratamientos (letras distintas, p<0,05), según one way ANOVA post hoc Tukey's (*p<0,05; **p<0,01). n=24 para viabilidad y motilidad espermática e índice de fragmentación de DNA evaluados por sistema CASA y n=12 para estado acrosomal, evaluado mediante microscopía de epífluorescencia (PSA-FITC) se observan en las Figuras 3, 4, 5. 6 y 7.
Los resultados anteriores tienen cierta lógica, ya que la estrategia que se sigue con la invención es el empleo de agentes reductores del metabolismo celular en el diluyente de refrigeración y congelación, y por lo tanto de bajo aporte energético, mientras que por el contrario el control comercial utilizado contiene fuentes energéticas y/o activadores de la motilidad como amidas y altas concentraciones de glucosa.
Sin embargo, estas diferencias no son significativas cuando las evaluaciones correspondientes se realizan a la hora de descongelación, independientemente de la presencia de sustratos metabólicos como la glucosa y fructosa (presente o adicionada al medio de dilución Whittens, respectivamente) a las muestras luego de su descongelación (Figura 9).
Para poder realizar una evaluación combinada de dos parámetros valiosos en términos de calidad como lo son la viabilidad y el estado acrosomal, se realizó una valoración mediante citometría de flujo, con la cual se cuantifica el porcentaje de espermatozoides de interés postdescongelación, ya que solo los espermatozoides vivos y con membrana acrosomal intacta serán capaces de experimentar la reacción acrosomal en el proceso de fecundación in vivo.
El análisis simultáneo de la viabilidad y el estado acrosomal postdescongelación evaluando el pre-acondicionamiento metabólico, fue determinado por citometría de flujo mediante el uso de yoduro de propidio y/o PSA-FITC (Effects of a- tocopherol and Ascorbic Acid on Equine Semen Quality after Cryopreservation: Joanna Sousa Vasconcelos Franco DVM, MS, Antonio Chaveiro PhD, Ana Góis BSc, Fernando Moreira da Silva PhD. Journal of Equine Veterinary Science xxx (2013) 1-7 http://dx.doi.org/10.1016/jjevs.2012.12.012).
Los resultados evidencian diferencias significativas entre los tratamientos, según one way ANOVA post hoc Tukey's (*p<0,05; **p<0,01 ; ***p<0,001 ; n=12, revelando que la mayor población de espermatozoides vivos con acrosomas intactos se encuentra con el uso de HMO (43,5 +/- 3,2), sin presentar diferencias significativas al adicionar Metformina, AICAR y AMP, pero sí frente al uso de Compuesto C (37,7 +/- 3,6) y el diluyente Botucrio® (35,5 +/- 2,8). (Figura 8). Estos resultados, validan tanto el método de enfriamiento y criopreservación como el uso de los diluyentes utilizados en el mismo, situándolos incluso por encima del estándar comercial Botucrio® utilizado como control, específicamente HMO, HMO+metformina y HMO+AMP (Figura 8).
Es importante destacar, con respecto a la consideración de la motilidad como un parámetro de calidad postdescongelación del semen, que existen autores que consideran que no necesariamente es un buen indicador de la fertilidad (Leopold y otros, Theriogenology, 49:1537, 1998).
Otro ejemplo de lo anterior son los resultados comparativos que se obtuvieron al usar los diluyentes INRA82 v/s INRA96, donde los valores obtenidos para la motilidad fueron significativamente superiores con el primero y la fertilidad fue significativamente superior con el segundo (40% y 71%, respectivamente) (Pillet y otros, Dairy Sci. Technol. 88: 257, 2008).
Adicionalmente se realizó un análisis de la motilidad total (A) y progresiva (B) postdescongelación, incubando los espermatozoides 1 hora a 37° C en presencia de distintos sustratos energéticos en medio Whitten, el cual posee una concentración de 5 mM de glucosa y también suplementado con 5 mM de fructosa. Los resultados muestran que no hay diferencias significativas en términos de motilidad total en presencia de glucosa o fructosa, mientras que en ausencia de estos sólo se mantiene la diferencia entre Botucrio® y los valores obtenidos con el Compuesto C. Aun así, las diferencias en términos de motilidad progresiva con respecto a los valores obtenidos con Botucrio® son mayores que los obtenidos con los diluyentes de la invención cuando se diluyen en medio Whitten, sin embargo no muestran diferencias cuando se evalúan sin dilución, (Figura 9). Las diferencias significativas entre los tratamientos, según one way ANOVA post hoc Bonferroni, n=5, se presentan con letras minúsculas distintas (P<0,05).
Como conclusión de estos estudios, y considerando que el período de residencia de los espermatozoides en el oviducto se encuentra entre las 24 y las 48 horas, la evaluación de la motilidad postdescongelación como parámetro de la calidad funcional del semen pierde fuerza según lo observado con el análisis realizado a 1 hora postdescongelación.
Ejemplo 4. Estudios de funcionalidad y calidad espermática en pruebas de campo, mediante uso del diluyente de congelación HMO.
En la Figura 11 se muestra el análisis de congelabilidad completo de las dosis testigo usadas en las pruebas de campo. En esta figura se muestran los resultados de los parámetros Viabilidad (A), Integridad Acrosomal (B) Motilidad Total (C), Motilidad Progresiva (D), de espermatozoides criopreservados y que se utilizan posteriormente en el protocolo de inseminación artificial. Se muestra Media ± SEM. n=7 eyaculados (3 sementales Ardennes), diferencias significativas se muestran en asteriscos (*p<0,05; **p<0,01 y ***p<0,001).
Es posible observar con estos ensayos, que a diferencia de pruebas anteriores de congelabilidad para razas pesadas con protocolos estandarizados, se encontraron diferencias significativas en la viabilidad espermática, siendo mayor al usar Botucrio® que HMO (52 vs 40 %), lo que podría ser explicado por diferencias en el
comportamiento a la congelación de los sementales particulares incorporados al estudio (Estaño, Castizo y Centurión), explicando al menos pardamente las diferencias (aunque no significativas) entre el número de preñeces logradas con ambos (76% vs 47%, respectivamente).
Por otra parte, no se encontraron diferencias significativas en el índice de fragmentación de DNA postdescongelación obtenido al usar HMO y Botucrio® (< al 10% en ambos).
Con estos resultados se puede concluir que la variable fragmentación de DNA no se ve influenciada por los tratamientos reductores del metabolismo celular.
Ejemplo 5. Resultados de la inseminación artificial (IA) en razas pesadas de equinos, utilizando semen preservado con el método de la invención.
El protocolo de inseminación artificial se basó en la sincronización, mediante el uso de doble administración de prostaglandina (PGF2) intramuscular (10 mg c/aplicación y distanciadas por 15 días) y posterior monitoreo ecográfico del crecimiento folicular superior a 35 mm para inducir ovulación mediante la aplicación de 2500 Ul de hCG. La inseminación artificial se aplicó controlando ecográficamente la ovulación, pre-ovulatoria no mayor que 12 horas o postovulatoria no superior a 6 horas.
En la Tabla 1 se muestran los resultados obtenidos a partir de la inseminación con ovulación confirmada de 36 yeguas.
Tabla 1 : índices de gestación (15 días post IA) obtenidas mediante el uso de semen criopreservado con los diluyentes de congelación HMO y Botucrio®.
*índices de preñez por ciclo (15 días post IA) obtenidas mediante el uso de semen criopreservado con los diluyentes de congelación HMO y Botucrio®, previamente refrigerado con las tasas de refrigeración descritas en la figura 3 (tiempo total de refrigeración: 20 y 90 minutos para Botucrio®
y HMO, respectivamente, en ambos casos se alcanzaron los 5° C en menos de 12 minutos). Rango de referencia descrito en literatura para semen congelado a un intento: 35-50 %.
Los resultados de índices de preñez obtenidos por ciclo (diagnóstico a los 15 días a un intento) fueron de un promedio del 61% (22/36, considerando ambos diluyentes), valor que está por sobre el estándar referencial esperado para semen congelado (35-50%), incluso se aproxima al esperado para el semen refrigerado (60%). (Tabla 1). El análisis comparativo derivado del uso de ambos diluyentes no arrojo diferencias significativas, requiriéndose estudios de mayor escala para poder categorizar ambos diluyentes en función de este parámetro, junto con el uso reciproco de las mismas yeguas y un mayor número de reproductores).
Cabe destacar que las razas de tiro pesado poseen una disminuida fertilidad en comparación a razas medianas o ligeras, siendo la variable semen uno de los factores (no el único) que condiciona dicha característica. (Lisa Hale: Reproductive Problems in the Draft Horse, Reproduction: General- Jun 18th, 2002, http://www.aaep.org/health articles view.php?print friendlv=true&id=150).
Por otra parte, como experiencia total de la aplicación de un protocolo de inseminación artificial con semen congelado y considerando ambos diluyentes en conjunto se logró un 61% de preñeces por ciclo estral usado, lo que valida contundentemente el protocolo de congelación de semen (rampas de enfriamiento y congelación, el uso de la viabilidad como criterio principal de congelabilidad de los eyaculados y preparación de dosis de inseminación), sincronización folicular, inducción de ovulación, criterio de inseminación pre y postovulatorio.
Claims
1. Un método para el enfriamiento y criopreservación de espermatozoides de un mamífero, dicho método que comprende los pasos de:
a. proporcionar una muestra de semen del mamífero previamente acondicionada con un diluyente de centrifugación en condiciones apropiadas;
b. centrifugar dicha muestra y resuspender el pellet que contiene los espermatozoides en un diluyente de refrigeración y congelación reductor del metabolismo celular;
c. refrigerar la muestra así obtenida desde la temperatura ambiente hasta 5o C durante 30 a 90 minutos; y
d. congelar la muestra refrigerada del paso (c) en nitrógeno líquido.
2. El método de la reivindicación 1 , caracterizado porque dicho diluyente de centrifugación es leche descremada a temperatura ambiente.
3. El método de la reivindicación 2, caracterizado porque dicho diluyente de centrifugación se encuentra a una temperatura entre 20 y 30° C.
4. El método de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque el semen se diluye en el diluyente de centrifugación en una relación 1 :1.
5. El método de la reivindicación 1 , caracterizado porque la centrifugación del semen diluido en el diluyente de centrifugación se realiza a temperatura ambiente.
6. El método de la reivindicación 5, caracterizado porque la centrifugación del semen diluido en el diluyente de centrifugación se realiza a una temperatura entre 20 y 30° C.
7. El método de las reivindicaciones 5 y 6, caracterizado porque la centrifugación del semen diluido en el diluyente de centrifugación se realiza durante 15-20 minutos a 1000 x g.
8. El método de la reivindicación 1 , caracterizado porque los espermatozoides obtenidos a partir del paso de centrifugación (b) se resuspenden en un diluyente de refrigeración y congelación reductor del metabolismo celular que comprende un compuesto seleccionado a partir del grupo que consiste
de agentes hipoglicemiantes, hormonas tal como la grelina, biguanidas, tales como la metformina, y la fenformina, adenilatos tales como AMP, ADP, y AICAR, e inhibidores y/o desacoplantes mitocondriales, tales como dinitrofenol, cianuro, rotenona, CCPC, oligomicina A, ácido malónico, antinimicina A y azida.
9. El método de la reivindicación 8, caracterizado porque dicho diluyente comprende un compuesto que se selecciona del grupo que consiste de AMP, metformina y AICAR.
10. El método de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizado porque los espermatozoides diluidos en el diluyente de refrigeración y congelación, se transfieren inmediatamente a 5o C y se mantienen a esta temperatura durante 30-90 minutos antes de su congelación.
11. El método de las reivindicaciones 1 a 10, caracterizado porque dicho mamífero es de la especia equina.
12. El método de la reivindicación 11 , caracterizado porque dicho mamífero de la especie equina se selecciona a partir de las razas Ardennes, Brabant, Bretón y Percherón.
13. Un diluyente de centrifugación para acondicionar una muestra de semen de un mamífero utilizado en el método de las reivindicaciones 1 a 12, caracterizado porque comprende leche descremada a temperatura ambiente.
14. El diluyente de la reivindicación 13, caracterizado porque dicho mamífero es de la especie equina.
15. El diluyente de la reivindicación 14, caracterizado porque dicho mamífero de la especie equina se selecciona a partir de las razas Ardennes, Bretón y Percherón.
16. Un diluyente de refrigeración y congelación de espermatozoides de un mamífero utilizado en el método de las reivindicaciones 1 a 12, caracterizado porque comprende una composición base HM0 compuesta por:
Tris 150 - 450 mM
Ácido cítrico Dihidratado 50 - 150 mM
Yema de huevo 10 - 18%
Glicerol 0,3 - 5 %
Estreptomicina 0,1 - 10 mg/ml
Gentamicina 0,01 - 0,1 mg/ml
Agua destilada hasta completar 1000 mi;
osmolaridad: 660-690 mOsm/Kg
pH: 7,0-7,4.
17. El diluyente de la reivindicación 16, caracterizado porque comprende adicionalmente un compuesto seleccionado a partir del grupo que consiste de agentes hipoglicemiantes, hormonas tal como la grelina, biguanidas, tales como la metformina, y la fenformina, adenilatos tales como AMP, ADP, y AICAR, e inhibidores y/o desacoplantes mitocondriales, tales como dinitrofenol, cianuro, rotenona, CCPC, oligomicina A, ácido malónico, antinimicina A y azida.
18. El diluyente de la reivindicación 17, caracterizado porque comprende un compuesto que se selecciona del grupo que consiste de AMP, metformina y AICAR.
19. El diluyente de las reivindicaciones 16 a la 18, caracterizado porque dicho mamífero es de la especie equina.
20. El diluyente de la reivindicación 19, caracterizado porque dicho mamífero de la especie equina se selecciona a partir de las razas Ardennes, Brabant, Bretón y Percherón.
21. Un kit para la inseminación artificial de hembras de la especie equina, caracterizado porque comprende:
- espermatozoides criopreservados de conformidad con el método de las reivindicaciones 1 a 12; e
- instrucciones para su uso.
22. Un kit según la reivindicación 21 , caracterizado porque dicha hembra de la especie equina se selecciona a partir de las razas Ardennes, Brabant, Bretón y Percherón.
) 23. Un método para la inseminación artificial de hembras de la especie equina, caracterizado porque comprende los pasos de:
a. proporcionar una hembra que se encuentre en período de ovulación; y
b. administrar la dosis apropiada de espermatozoides criopreservados de conformidad con el método de las reivindicaciones 1 a 12, previamente descongelados.
24. El método de la reivindicación 22, caracterizado porque dicha hembra de la especie equina se selecciona a partir de las razas Ardennes, Brabant, Bretón y Percherón.
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