WO2013050643A1 - Diluyente para la congelación de semen equino, método de preparación y aplicaciones - Google Patents
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- A61D19/02—Instruments or methods for reproduction or fertilisation for artificial insemination
Definitions
- This invention belongs, in general, to the field of livestock, specifically that of equine livestock.
- the present invention relates to a new diluent for freezing equine semen, the method for obtaining it and its applications.
- the equine livestock sector is characterized by the production and breeding of specimens of high individual value, in which specific morphological and functional characteristics are sought depending on each breed.
- the productive unit is the group of animals "herd production”
- the productive unit is the individual.
- the option used is the removal of the individual from the production chain and its replacement, in the equine industry this is not an option, due to the high individual value of the stallions, either for their morphology, or for their functionality.
- the seminal quality we find a great individual variability in this quality and in the response to freezing between stallions.
- the strategy of freezing semen of all stallions is essential. It is noteworthy that the semen of certain stallions have a market value from € 3,000 to € 6,000 per insemination dose.
- Lipid peroxidation assessed with BODIPY-C11, increases after cryopreservation of stallion spermatozoa, is stallion-dependent and is related to apoptotic-like changes.
- the authors of the present invention taking these problems into account, have designed a new diluent for the freezing of equine semen, based on an alternative cryoprotectant, and at a specific concentration, which minimizes osmotic damage both during freezing and subsequent defrosting, allowing obtain survival rates of post-defrost equine sperm far superior to the means currently available in the market.
- the diluent object of the invention comprises HCON (CH3) 2 which, at specific concentrations, allows reducing the toxicity of glycerol, while enhancing the cryoprotective effect of both.
- This diluent constitutes a new medium for sperm suspension prior to freezing. With this medium, the results obtained with the means currently available in the market are improved. In addition, the variability between stallions is substantially reduced, thus obtaining mode increase the number of stallions that can benefit from this technology.
- the diluent is based on the use of alternative cryoprotectants that reduce osmotic shock during the freezing process, and antioxidants that protect the sperm during the defrosting process, such as melatonin and Trolox, whose use in stallions is not known so far.
- a main objective of the invention relates to a means for the freezing of equine semen comprising a) A Hank buffer solution supplemented with HEPES, glucose, lactose, BSA and native milk phosphocaseinate, b) 0.5 egg yolk -4% v / v, c) HCON (CH3) 2 at 1 -4% v / vyd) Glycerol at 0.5-2%.
- Another object of the invention is the process for obtaining said medium.
- a third objective of the invention relates to the use of the medium in the freezing of equine semen.
- the present invention relates to a means for freezing equine semen comprising: a. A Hank buffer solution supplemented with HEPES, glucose, lactose, BSA and native milk phosphocaseinate,
- HCON (CH3) 2 allows reducing the toxicity of glycerol, while enhancing the cryoprotective effect of both.
- the medium described in a) allows to achieve maximum effect.
- HCON (CH3) 2 is used in a range of 1.5-2.5% v / v and glycerol in a range of 1 -1.5% v / v.
- the medium further comprises melatonin, in a range of 0.5 to 5 ⁇ , caffeine, in a range of 0.5 to 3 mM and / or TROLOX, in a range of 50 to 200 ⁇ , as antioxidants.
- melatonin in a range of 0.5 to 5 ⁇
- caffeine in a range of 0.5 to 3 mM
- TROLOX in a range of 50 to 200 ⁇
- antioxidants as antioxidants.
- this new diluent allow the long-term freezing of equine semen, so that another aspect of the invention contemplates the use of the means of the invention for the freezing of equine semen.
- sperm are slowly resuspended in the medium of the present invention at 22 e C and, after a period of equilibration at 5 e C, the semen is packaged and proceeded to freezing and stored in liquid nitrogen.
- step ii) add the yolk obtained in step ii) to 0.5 to 4% v: v to the Hank buffer solution supplemented with HEPES, glucose, lactose, BSA and native milk phosphocaseinate,
- step iv) caffeine is added at a concentration between 0.5 and 3 mM, TROLOX at a concentration between 50 and 200 ⁇ and / or melatonin at a concentration between 0.5 and 5 ⁇ .
- the diluent or medium for freezing equine semen of the present invention was prepared from a Hank buffer solution, supplemented with HEPES, medium composed of 0.14 g of CaCI 2 , 0.40g of KCI, 0.06 g of KH 2 P04, 0.2g of MgS0 4 7H20, 8g of NaCl, 0.35g of NaHC0 3 , 4.76g of HEPES, 13.5g of glucose and 3% of BSA, 500ml ultrapure water, and diluted 1: 1 with a medium containing 27g of native milk phosphocaseinate and 11% lactose (v: v) dissolved in 500 ml of water.
- the egg yolk was subsequently prepared by centrifugation during
- the diluent thus prepared was compared with the two commercial diluents available in Europe. For this purpose, ejaculates of 7 stallions were obtained, which were diluted 1: 1 to 1: 3 in the commercial INRA96 diluent and the ejaculate was centrifuged at 600 g for 10 minutes. After centrifugation, most seminal plasma was removed leaving only 5%. The ejaculate had been divided into three parts and after centrifugation each part was resuspended in the two commercial diluents (GHENT and INRA96 supplemented with egg yolk and glycerol) and in the diluent of the present invention. In all of them the final concentration of sperm was 100 million per milliliter. Once resuspended in the corresponding diluents, the ejaculates were equilibrated at 4 e C for one hour, and the semen was packed in 0.5 ml straws.
- Figure 1 compares the results obtained in freezing and defrosting semen from the 7 different stallions, to which the freezing and defrosting process was repeated 6 times (42 ejaculates in total).
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Abstract
La presente invención contempla un medio para congelar semen equino que comprende a) una solución tampón de Hank suplementada con HEPES, glucosa, lactosa, BSA y fosfocaseinato nativo de leche, b) yema de huevo (0,5-4% v/v), c) HCON (CH3)2 (1-4% v/v), y d) glicerol (0,5-2% v/v). Asimismo se refiere al procedimiento para la obtención del medio de la invención que comprende i) abrir un huevo y separar la clara de la yema, ii) centrifugar la yema obtenida en i) a una velocidad entre 2-2500 r.p.m. durante un tiempo de entre 15-20 minutos, iii) añadir la yema obtenida en el paso ii) del 0,5 al 4% v:v a la solución tampón de Hank suplementada con HEPES, glucosa, lactosa, BSA fosfocaseinato nativo de leche, iv) añadir la solución obtenida en iii) HCON(CH3) 2 del 1 al 4% v:v, glicerol del 0,5 al 2% v/v, y v) homogenizar la solución obtenida en iv).
Description
DILUYENTE PARA LA CONGELACIÓN DE SEMEN EQUINO, MÉTODO DE PREPARACIÓN Y APLICACIONES
CAMPO DE LA INVENCIÓN
Esta invención pertenece, de forma general, al campo de la ganadería, en concreto al de la ganadería equina. De forma particular, la presente invención se refiere a un nuevo diluyente para la congelación de semen equino, al método para su obtención y sus aplicaciones.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
El sector de la ganadería equina se caracteriza por la producción y cría de ejemplares de alto valor individual, en la que se buscan características morfológicas y funcionales específicas dependiendo de cada raza.
A diferencia de otros sectores ganaderos, en los que la unidad productiva es el grupo de animales "producción del rebaño", en el sector equino la unidad productiva es el individuo. Así, mientras que en el sector ganadero en general, si un individuo no posee eyaculados de una calidad aceptable, la opción que se emplea es la eliminación del individuo de la cadena productiva y su sustitución, en la industria equina esto no es una opción, debido al alto valor individual de los sementales, bien por su morfología, bien por su funcionalidad. Además como resultado de una selección que no ha tenido en cuenta la calidad seminal, nos encontramos con una gran variabilidad individual en dicha calidad y en la respuesta a la congelación entre sementales. Sin embargo, debido a su alto valor, la estrategia de congelar semen de todos los sementales es esencial. Es de destacar que el semen de determinados sementales tienen un valor en el mercado a partir de los 3.000 a 6.000€ por dosis de inseminación.
La congelación de semen equino en nuestro país, y en toda Europa, se viene realizando con tres tipos básicos de diluyentes, diluyentes basados en una solución de lactosa al 1 1 % con yema de huevo y glicerol a concentraciones que varían entre
el 2 y el 5% (Martin, J.C, Klug, E. and Gunzel, A.fí. (1979) Centrifugation of stallion semen and its storage in large volume straws. J fíeprod Fértil Suppl, 47-51; Tischner, M. (1979) Evaluation of deep-frozen semen in stallions. J Fleprod Fértil Suppl, 53-59), diluyentes comerciales a base de yema de huevo (Ghent™ Minitüb Landshut, Alemania) o leche desnatada (INRAFreeze™, IMV, L'Aigle Francia). En norte y sudamerica se pueden encontrar otros diluyentes comerciales como BotuCrio™, o E-Z Freezing™. Sin embargo, tanto con los diluyentes comerciales, como con los de laboratorio, se observa una alta mortalidad espermática (Samper, J.C. (2001) Management and fertility of mares bred with frozen semen. Anim fíeprod Sci 68, 219-228; Samper, J.C, Hellander, J.C. and Crabo, B.G. (1991) fíelationship between the fertility of fresh and frozen stallion semen and semen quality. J fíeprod Fértil Suppl 44, 107- 114; Samper, J.C. and Morris, CA. (1998) Current methods for stallion semen cryopreservation: a survey. Theriogenology 49, 895-903) y además los espermatozoides supervivientes presentan diverso grado de daño no letal {Ortega Ferrusola, C, González Fernandez, L, Morrell, J.M., Salazar Sandoval, C, Macias García, B., fíodriguez-Martinez, H., Tapia, J.A. and Peña, F.J. (2009) Lipid peroxidation, assessed with BODIPY-C11, increases after cryopreservation of stallion spermatozoa, is stallion-dependent and is related to apoptotic-like changes. fíeproduction 138, 55-63; Ortega-Ferrusola, C, Sotillo- Galan, Y., Várela-Fernandez, E., Gallardo-Bolanos, J.M., Muriel, A., González- Fernandez, L, Tapia, J.A. and Peña, F.J. (2008) Detection of "apoptosis-like" changes during the cryopreservation process in equine sperm. J Androl 29, 213- 221) pero que disminuye su vida media en el tracto genital de la yegua dificultando el manejo reproductivo y disminuyendo aún más la fertilidad (Samper 2001). Es decir, disminuye la fertilidad por la alta mortalidad espermática durante la congelación y además por la menor vida media de los que sobreviven el proceso.
Hoy día con los protocolos actuales de congelación no se ha podido solventar el problema de la variabilidad entre sementales en la respuesta a esta tecnología. Esto determina que sementales de un alto valor genético no puedan ver su semen congelado. En general, la Federación Hípica Internacional determina que los eyaculados han de tener al menos un 35% de motilidad progresiva a la descongelación para poder entrar en un programa comercial.
Se ha demostrado que el principal daño que sufren los espermatozoides durante el proceso de congelación-descongelación es debido al shock osmótico que experimentan durante la congelación debido a la pérdida de agua intracelular, y durante la descongelación debido a la rehidratación brusca {Morris, G.J., Faszer, K., Green, J.E., Draper, D., Grout, B. W. and Fonseca, F. (2007) Rapidly cooled horse spermatozoa: loss of viability is due to osmotic imbalance during thawing, not intracellular ice formation. Theriogenology 68, 804-812).
Los autores de la presente invención, teniendo en cuenta estos problemas, han diseñado un nuevo diluyente para la congelación de semen equino, basado en un crioprotector alternativo, y a una concentración específica, que minimiza el daño osmótico tanto durante la congelación como posterior descongelación, permitiendo obtener unas tasas de supervivencia de los espermatozoides equinos post descongelación muy superiores a los medios actualmente disponibles en el mercado.
En el desarrollo de este diluyente se ha tenido además en cuenta el concepto de reducir la toxicidad del crioprotector (Fahy, G.M. (2010) Cryoprotectant toxicity neutralization. Cryobiology 60, S45-53; Fahy, G.M., Lilley, T.H., Linsdell, H., Douglas, M.S. and Meryman, H. T. (1990) Cryoprotectant toxicity and cryoprotectant toxicity reduction: in search of molecular mechanisms. Cryobiology 27, 247-268). En este sentido los autores de la presente invención han demostrado que concentraciones muy bajas de glicerol son capaces de dañar significativamente el citoesqueleto del espermatozoide, antes de que se produzcan daños importantes en la membrana.
Así, el diluyente objeto de la invención comprende HCON(CH3)2 que, a concentraciones específicas, permite reducir la toxicidad del glicerol, a la vez que se potencia el efecto crioprotector de ambos.
Este diluyente constituye un nuevo medio para la suspensión de los espermatozoides previo a la congelación. Con este medio se mejoran los resultados obtenidos con los medios actualmente disponibles en el mercado. Además se reduce sustancialmente la variabilidad entre sementales, consiguiendo de este
modo aumentar el número de sementales que se pueden beneficiar de esta tecnología. El diluyente está basado en el uso de crioprotectores alternativos que reducen el shock osmótico durante el proceso de congelación, y antioxidantes que protegen al espermatozoide durante el proceso de descongelación, como la melatonina y Trolox, cuyo uso en sementales no es conocido hasta el momento.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
Figura 1. Comparativa de los resultados obtenidos en la congelación y descongelación del semen de 7 sementales distintos empleando como diluyentes a) el diluyente de la presente invención, b) el diluyente comercial INRA96-EY-G y c) el diluyente comercial GHENT.
OBJETIVO DE LA INVENCIÓN
Un objetivo principal de la invención se refiere a un medio para la congelación de semen equino que comprende a) Una solución tampón de Hank suplementada con HEPES, glucosa, lactosa, BSA y fosfocaseinato nativo de leche, b) yema de huevo al 0,5-4% v/v, c) HCON(CH3)2 al 1 -4% v/v y d) Glicerol al 0 ,5-2%.
Otro objetivo de la invención es el procedimiento para la obtención de dicho medio.
Finalmente, un tercer objetivo de la invención se refiere al empleo del medio en la congelación de semen equino.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
La presente invención se refiere a un medio para la congelación de semen equino que comprende: a. Una solución tampón de Hank suplementada con HEPES, glucosa, lactosa, BSA y fosfocaseinato nativo de leche,
b. yema de huevo al 0,5-4% v/v,
c. HCON(CH3)2 al 1 -4% v/v y
d. Glicerol al 0,5-2%.
La combinación de HCON(CH3)2 a esas concentraciones específicas permite reducir la toxicidad del glicerol, a la vez que se potencia el efecto crioprotector de ambos. El medio descrito en a) permite lograr el máximo efecto.
En realizaciones preferidas, el HCON(CH3) 2 se emplea en un rango de 1 ,5-2,5% v/v y el glicerol en un rango de 1 -1 .5% v/v.
En una realización particular, el medio comprende además melatonina, en un rango de 0.5 a 5μΜ, cafeína, en un rango de 0.5 a 3 mM y/o TROLOX, en un rango de 50 a 200 μΜ, como antioxidantes. Estos ingredientes opcionales mejoran la motilidad post descongelación de los espermatozoides y sus velocidades en sementales que muestran un exceso de peroxidación de las membranas de sus espermatozoides.
Las propiedades de este nuevo diluyente permiten la congelación a largo plazo de semen equino, por lo que en otro aspecto principal de la invención se contempla el empleo del medio de la invención para la congelación de semen equino. En realizaciones particulares, tras la eliminación del plasma seminal y evaluación del eyaculado, se resupenden los espermatozoides lentamente en el medio de la presente invención a 22eC y, tras un periodo de equilibrado a 5eC, se envasa el semen y se procede a su congelación y almacenado en nitrógeno líquido.
En otro aspecto principal de la invención se contempla un procedimiento para la obtención del medio de la invención que comprende los siguientes pasos: i. abrir un huevo y separar la clara de la yema,
¡i. centrifugar la yema obtenida en i) a una velocidad comprendida entre 2-
2500 r.p.m durante un tiempo comprendido entre 15-20 minutos, ü¡. añadir la yema obtenida en el paso ii) al 0.5 al 4% v:v a la solución tampón de Hank suplementada con HEPES, glucosa, lactosa, BSA y fosfocaseinato nativo de leche,
iv. añadir a la solución obtenida en iii) HCON(CH3)2 al 1 -4% v:v y glicerol al 0,5-2% v/v, y
v. homogenizar la solución obtenida en iv).
En realizaciones preferidas, en el paso iv) se añade cafeína a una concentración comprendida entre 0.5 y 3 mM, TROLOX a una concentración comprendida entre 50 y 200 μΜ y/o melatonina a una concentración comprendida entre 0.5 y 5μΜ.
EJEMPLO
El diluyente o medio para la congelación de semen equino de la presente invención se preparó a partir de una solución tampón de Hank, suplementada con HEPES, medio compuesto por 0.14 g de CaCI2, 0.40g de KCI, 0.06 g de KH2P04, 0.2g de MgS04 7H20, 8g de NaCI, 0.35g de NaHC03, 4.76 g de HEPES, 13.5 g de glucosa y un 3% de BSA, agua ultrapura 500 mi, y diluido 1 :1 con un medio conteniendo 27 gr de fosfocaseinato nativo de leche y un 1 1 % de lactosa (v:v) disuelto en 500 mi de agua. Posteriormente se preparó la yema de huevo mediante centrifugación durante
15 minutos a 2000 r.p.m. La solución anterior se suplemento con un 4% v/v de la yema de huevo de la fracción superior del tubo. Posteriormente esta solución así obtenida se suplemento con un 2.5% v/v de HCON(CH3)2 en combinación con glicerol al 1 .5% v/v. Se homogenizo bien la solución obteniendo el diluyente de congelación de la presente invención (CACERES-2).
El diluyente así preparado se comparó con los dos diluyentes comerciales disponibles en Europa. Para ello se obtuvieron eyaculados de 7 sementales, que se diluyeron 1 :1 a 1 :3 en el diluyente comercial INRA96 y el eyaculado se centrifugó a 600 g durante 10 minutos. Tras la centrifugación se eliminó la mayoría del plasma seminal dejando sólo un 5%. El eyaculado se había dividido en tres partes y tras la centrifugación se resuspendió cada una de las partes en los dos diluyentes comerciales (GHENT e INRA96 suplementado con yema de huevo y glicerol) y en el diluyente de la presente invención. En todos ellos la concentración final de espermatozoides fue de 100 millones por mililitro. Una vez resuspendidos en los correspondientes diluyentes, los eyaculados se equilibraron a 4 eC durante una hora, y se envasó el semen en pajuelas de 0.5 mi.
En la figura 1 se comparan los resultados obtenidos en la congelación y
descongelación de semen de los 7 sementales distintos, a los que se repitió el proceso de congelación y descongelación en 6 ocasiones (42 eyaculados en total).
Para establecer la calidad del semen se valoraron parámetros de calidad seminal mediante citometría de flujo, como integridad y cambios iniciales de membrana, estado del acrosoma, y motilidad progresiva mediante sistema computerizado de análisis seminal. Todas las diferencias observadas fueron estadísticamente significativas a favor del diluyente de la presente invención. Así la motilidad postdescongelación se incrementó entre un 1 1 a un 17% comparado con los dos diluyentes comerciales actualmente en uso, también las velocidades de los espermatozoides fueron superiores al descongelar. También tras la descongelación el porcentaje de espermatozoides que mantuvieron la integridad de la membrana fue superior en el diluyente aquí descrito, incrementándose en más de 10 puntos porcentuales en comparación con los diluyentes comerciales actualmente en uso en España. Una representación de estas mejoras puede verse en la figura 1 .
Claims
1 . Medio para la congelación de semen equino caracterizado porque comprende: a) Solución tampón de Hank suplementada con HEPES, glucosa, lactosa, BSA y fosfocaseinato nativo de leche,
b) yema de huevo a una concentración comprendida entre 0,5-4% v/v, c) HCON(CH3)2 a una concentración comprendida entre 1 -4% v/v, y d) glicerol a una concentración comprendida entre 0,5-2% v/v.
2. Medio, según la reivindicación 1 , caracterizado porque comprende adicionalmente: e) cafeína a una concentración comprendida entre 0.5 y 3 mM, TROLOX a una concentración comprendida entre 50 y 200 μΜ y/o melatonina a una concentración comprendida entre 0.5 y 5μΜ.
3. Procedimiento para la obtención del medio de la reivindicación 1 , caracterizado porque comprende los siguientes pasos: i. abrir un huevo y separar la clara de la yema,
¡i. centrifugar la yema obtenida en i) a una velocidad comprendida entre 2- 2500 r.p.m durante un tiempo comprendido entre 15-20 minutos,
Ni. añadir la yema obtenida en el paso ii) del 0.5 al 4% v:v a la solución tampón de Hank suplementada con HEPES, glucosa, lactosa, BSA y fosfocaseinato nativo de leche,
iv. añadir a la solución obtenida en iii), HCON(CH3)2 del 1 al 4% v:v, glicerol del 0,5 al 2% v/v, y
v. homogeinizar la solución obtenida en iv).
4. Procedimiento, según la reivindicación 3, caracterizado porque en el paso d) se añade cafeína 0.5 y 3 mM, TROLOX a una concentración comprendida entre 50 y 200 μΜ y/o melatonina a una concentración comprendida entre 0.5 y 5μΜ.
5. Empleo del medio de las reivindicaciones 1 ó 2 para la congelación del semen equino.
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Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103651333A (zh) * | 2013-12-23 | 2014-03-26 | 伊犁德瑞骏发生物科技有限公司 | 一种马属动物冷冻精液稀释液及其配制方法 |
| CN103843758A (zh) * | 2014-02-19 | 2014-06-11 | 新疆维吾尔自治区畜牧科学院畜牧研究所 | 一种马精子低温保存稀释液 |
| WO2015027354A2 (es) | 2013-08-29 | 2015-03-05 | Universidad Austral De Chile | Método para el enfriamiento y criopreservación de semen equino y diluyentes utilizados en dicho método |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| ES2530427B1 (es) * | 2013-09-02 | 2015-12-10 | Universidad De Extremadura | Diluyente para la congelación de semen equino adaptable a cada individuo |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2008117026A1 (en) * | 2007-03-23 | 2008-10-02 | The Royal Veterinary College | Method for enhancing sperm survival |
| CN101418282A (zh) * | 2008-12-15 | 2009-04-29 | 郑州牧业工程高等专科学校 | 猪袋装冷冻精液保存液及其保存方法 |
-
2011
- 2011-10-06 ES ES201131611A patent/ES2402505B1/es active Active
-
2012
- 2012-10-08 WO PCT/ES2012/070696 patent/WO2013050643A1/es active Application Filing
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2008117026A1 (en) * | 2007-03-23 | 2008-10-02 | The Royal Veterinary College | Method for enhancing sperm survival |
| CN101418282A (zh) * | 2008-12-15 | 2009-04-29 | 郑州牧业工程高等专科学校 | 猪袋装冷冻精液保存液及其保存方法 |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| "Dimethyl formamide improves the post-thaw characteristics ofsex-sorted and non-sorted stallion spermatozoa.", ANIMAL REPRODUCTION SCIENCE, vol. 121, no. 1-2, 1 January 2010 (2010-01-01), pages 216 - 217 * |
| MOORE ET AL.: "Effect of cooling rate and cryoprotectant on the cryosurvival ofequine spermatozoa.", JOURNAL OF EQUINE VETERINARY SCIENCE, vol. 26, no. 5, 1 May 2006 (2006-05-01), pages 215 - 218 * |
| MOTA FILHO A C ET AL.: "Dimethylformamide as a cryoprotectant for canine semen diluted andfrozen in ACP-106C", THERIOGENOLOGY, vol. 76, no. 7, 5 May 2011 (2011-05-05), pages 1367 - 1372, XP028294795, DOI: doi:10.1016/j.theriogenology.2011.05.010 * |
| VARIOUS: "Abstracts", ANIMAL REPRODUCTION SCIENCE, vol. 89, no. 1-4, 1 October 2005 (2005-10-01), pages 199 - 321, XP005084224 * |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2015027354A2 (es) | 2013-08-29 | 2015-03-05 | Universidad Austral De Chile | Método para el enfriamiento y criopreservación de semen equino y diluyentes utilizados en dicho método |
| CN103651333A (zh) * | 2013-12-23 | 2014-03-26 | 伊犁德瑞骏发生物科技有限公司 | 一种马属动物冷冻精液稀释液及其配制方法 |
| CN103843758A (zh) * | 2014-02-19 | 2014-06-11 | 新疆维吾尔自治区畜牧科学院畜牧研究所 | 一种马精子低温保存稀释液 |
| CN103843758B (zh) * | 2014-02-19 | 2015-09-23 | 新疆维吾尔自治区畜牧科学院畜牧研究所 | 一种马精子低温保存稀释液 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| ES2402505A1 (es) | 2013-05-06 |
| ES2402505B1 (es) | 2014-03-12 |
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