WO2015027308A1 - Complexos metálicos de naringina e naringenina e composições inseticidas para o controle de insetos pragas urbanos, da agricultura e da silvicultura - Google Patents

Complexos metálicos de naringina e naringenina e composições inseticidas para o controle de insetos pragas urbanos, da agricultura e da silvicultura Download PDF

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WO2015027308A1
WO2015027308A1 PCT/BR2014/000313 BR2014000313W WO2015027308A1 WO 2015027308 A1 WO2015027308 A1 WO 2015027308A1 BR 2014000313 W BR2014000313 W BR 2014000313W WO 2015027308 A1 WO2015027308 A1 WO 2015027308A1
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nar
naringin
phen
insecticide
flavanone
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PCT/BR2014/000313
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English (en)
French (fr)
Inventor
Maria Fátima das Graças Fernandes SILVA
João Batista FERNANDES
Rose Marie CARLOS
Moacir Rossi FORIM
Paulo Cesar VIEIRA
Arlene Gonçalves CORREA
Odair Corrêa BUENO
Fernando Carlos PAGNOCCA
André Lúcio Franceschini SARRIA
Regina Maria Mendes de OLIVEIRA
Lialiane NEBO
Andréia Pereira MATOS
Ana Puala TEREZAN
Original Assignee
Fundação Universidade Federal De São Carlos
Universidade Estadual Paulista
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    • A01N59/16—Heavy metals; Compounds thereof
    • A01N59/20—Copper

Definitions

  • the present invention belongs to the field of synthesis, characterization and use of metallic inorganic complexes linked to abundant and commercially available natural products, naringin and naringenin, capable of acting directly in the control and / or combat of the leaf-cutting ants and lizard corn and other insect pests from agriculture and forestry when added to baits, incorporated into diets and by topical actions.
  • the present invention has application in the production of insecticides and or metallo-organic fungicide considering the sustainable development, that is, minimizing the social and environmental impact of the insecticide activity, while obtaining the best cost-benefit ratio.
  • Leaf-cutting ants constitute the main pests in Brazilian reforestation areas and represent more than 75% of the costs and time spent in controlling forest pests.
  • the technology involved in the search for pesticides for pest control represents one of the frontiers of science, which involves different multidisciplinary aspects and can greatly contribute to the advancement of this technology.
  • the toxic agent used in formicide bait or topical or dietary ingestion formulations should be simple to prepare, using cheap and abundant reagents, not harming the environment while minimizing negative social and environmental impacts of its activities, it must be water-soluble and stable in both acidic and basic soils, as well as stable in climatic weather and must comply with the required time of toxic action against target insects (leaf-cutting ants, caterpillars). corn and other insect pests from agriculture and forestry).
  • the baits may be from orange pomace, cassava flour, agar, etc., and the formulations may be in aqueous solution or in the presence of micelle forming agents or in diets.
  • the control / control of insect pests from agriculture and forestry such as leaf-cutting ants in large areas is described by various methods.
  • Methods related to biological control mostly refer to organic products including ingredients such as d-limonene, a citrus oil extract or Spinosad®, a chemical complex produced by a soil microbe.
  • Chemical control uses insecticides in the form of dust, granules, aerosol (cold mist), term mist or bait.
  • the most widely used method for the control of leaf-cutting ants is the use of toxic baits, which are carried into the nest causing the death of the queen and other anthill individuals. Baits for most ant species are the best tactic, as nests are most often completely destroyed, especially when baits contain either an insecticidal substance or a fungicide or one acting on these two symbiotic organisms. This provides a permanent solution to a particular problem.
  • Bait or other forms of application, to be efficient and minimize environmental impact must use low levels of toxic agents to avoid contaminating fish, mammals or birds living in the plantation area.
  • aerosols When aerosols are used in conjunction with baits, ants may die before they can carry the baits into the nest or warn the remaining ants of the potential toxicity of the bait. Thus aerosols should not be used in conjunction with ant baits. It is also important to stress the need for the bait to contain its own amount of toxic agent or delayed action so that no premature death of the carrier ant occurs. The baits should also have no toxic effects until some time after the ant returns to the colony. However the toxic effect should occur within a few hours after the carrier ant reaches the nest. A very delayed toxic action time often allows the remaining part of the colony to move from the area and form new colonies.
  • contact insecticides Most of the toxic agents added to baits and other formulations that are used in chemical control of insect pests, such as leaf-cutting ants, are called contact insecticides, which act directly on the insect's central nervous system.
  • agents include acefate (Orthene®), carbaryl (Sevin®), fipronil (Over'N Out®, granulated), pyrethrins, pyrethroids (bifetrin, cyfluthrin, cypermethrin, deltamethrin, lambda-cyhalothrin, permethrin, sphenvalerate, tefluthrin or tralometrine) , and liquid fipronil, abamectin (Ascend®), indoxacarb (Advion®, Spectracide®.
  • Toxic agents that act on the digestive system are also found in other metabolic pathways than the central nervous system (hydramethylnone or Amdro). ®) and toxic agents that interfere with reproduction or growth These include phenoxycarb (Award®), metoprene (Extinguish®), and pyriproxyfen (Distance® or Esteem®) .
  • phenoxycarb Award®
  • metoprene Extinguish®
  • pyriproxyfen Distance® or Esteem®
  • a relatively new type of bait combines two active ingredients, hydramethylnone. and metoprene (AMDRO FireStrike® or Extinguish Plus®).
  • the efficiency of these toxic agents is related to the action time required for the elimination of insects (ant, for example) and the time spent in the environment.
  • Time Baits Rapid reactions include indoxacarb (effective 3 to 10 days) and hydramethylnone (effective 2 to 3 weeks). These products often require more frequent applications compared to slow-acting products such as abamectin, phenoxycarb, methoprene or pyriproxyfen, which are effective from 1 to 6 months depending on the time of application (spring, fall).
  • Natural pyrethrins and synthetic pyrethroid ingredients eliminate pest insects and ants among them in minutes. Acephate and carbaryl take a day, while granular fipronil takes six weeks to clear the colony. Curbar, spinosad, and acephate need days to weeks. Pyrethroids may remain in the environment for weeks to months while fipronil may persist for years.
  • Hydramethylnone and Metoprene can control ants and other insects better because they act faster and longer.
  • the processes described above are more or less efficient, but all have problems in the degree of control, efficiency action time and toxicity.
  • the formulation of some uses the 25CE terming agent, whose active ingredient is Fipronil, an agent classified as highly toxic to various species of aquatic organisms.
  • Pyrethroid-based insecticides have a quick and lethal effect. However, the use of pyrethroids has increased the risk to birds and / or mammals and is very toxic to fish, bees and aquatic arthropods such as lobsters and shrimps. Diazinone-based insecticides have an action time of 1 to 7 days.
  • Acute organophosphate poisoning affects the autonomic nervous system, the somatic system and the central nervous system (CNS). Chronic exposure to low doses of organophosphates can also cause important effects, including signs and symptoms of Parkinsonism.
  • Chinese publication CN1348694A reveals an insecticide against sulfluramid and tetramethrin-based white ants.
  • one of the areas that has been investigated for the control / combat of insect pests of agriculture and forestry uses inorganic metal ions in the baits and as toxic agents to be used.
  • incorporated into the baits supplied to the leaf-cutting ants see US Patent 5,850,707.
  • the bait uses specific components and sugar in combination with alkaline and alkaline earth salts such as MgCl 2 , as this combination significantly increases the rate of consumption of bait by ants.
  • Agar was also used as a matrix material, which can also increase attractiveness.
  • patent literature is mainly directed to the activities of these metals as salts or in combination with other insecticides without chemical complex formation between them.
  • US 4,438,090 discloses a method of preparing an insecticide which is mixed with magnesium stearate.
  • US 4,461,758 discloses an insecticide including boric acid powder, magnesium stearate and silica gel.
  • Some patent documents cite complex formation. Those where complexes are formed include: (a) Zinc-containing liquid pesticide (CN1158695), (b) Zinc cyclohexyl formate and its germicide series (CN99122178) and (c) Method for the production of a suspension of Ziram (US4533085) using zinc as a complexant and traditional insecticides such as carbamates and Paratioh.
  • MIP integrated pest management
  • IPM has become fundamental for the forest sector, as forest companies have full quality programs that seek to improve their efficiency and competitiveness by imposing the international market, which requires Cerflor, ISO, CFS, among others, forest certification. attest to the technical, ecological and social quality of companies as a prerequisite for the purchase of their products. As a result, there was also a need to restructure forest pest control programs to minimize the negative social and environmental impacts of their activities.
  • IPM Integrated Pest Management
  • the choice of the right system is essential for the control / combat of insect pests from agriculture and forestry, such as leaf-cutting ants, cornstarch caterpillars and Aedes aegypti, to occur efficiently minimizing social and environmental impacts. environmental impacts of its activities so that the company can obtain the necessary forest certification for the commercialization of its products.
  • the toxic agent incorporated into the bait or other forms of application must delay its action so that the insect that comes in contact with the insecticide will die or return to the anthill for ants and contaminate. the largest possible population of the nest before it is eliminated and warn the remaining ants of the presence of toxic agent in the provided bait. If this occurs, the ants leave the nest and seek another region to set up a new colony.
  • the causative agent of dengue is a virus, belonging to the genus Flavivirus and family Flaviridae and transmitted by culicid mosquito vectors.
  • Dengue virus is transmitted to humans through the bite of female Aedes mosquitoes, with Aedes aegypti being the only vector of epidemiological importance in the Americas, where the circulation of the virus has already been established from the southern United States to Argentina. .
  • Aedes aegypti the only vector of epidemiological importance in the Americas, where the circulation of the virus has already been established from the southern United States to Argentina. .
  • There is no effective dengue vaccine yet, so the only method currently available to fight the disease is the control of the Aedes aegypti mosquito.
  • Commercial pesticides are still an important tool in controlling the Dengue vector.
  • Aphids are sucking hemiptera, exclusively phytophagous, causing direct damage due to sap suction and the transmission of pathological agents to the plant.
  • the genus Cinara is composed of species that occur in conifers, being distributed in various regions of the world. They feed on colonies located on shoots, branches, stem and roots. The most intense and most damaging attacks occur on seedlings and new plantings.
  • Trees attacked by aphids may show symptoms of chlorosis, reduced growth in plant diameter and height, bending of the stem, bud dryness and overgrowth due to apical bud destruction; presence of dark-colored fumagina fungus, which covers the branches and foliage reducing the photosynthetic area, hindering the plant's respiration and transpiration processes, interfering with its development; and feeding can cause the branch to dry and the plants to die off progressively.
  • US Published Patent Application US 20090099135 A1 describes various pest control formulations, including Cinara spp., Without overlapping with the subject matter of this application.
  • Naringin is a flavanone glycoside. It is an important flavonoid in oranges and gives it its bitter taste. In humans it is metabolized to naringenin. Both naringenin and hesperitin, which are the naringin and hesperidin aglycones naturally occur in citrus fruits. It is believed that flavonoids may act as an antioxidant.
  • the present invention discloses a novel toxicant and / or fungicidal agent system to be incorporated into the baits and thermosetting, sprays and other forms of application consisting of a polypyridine molecule and a natural product joined in a single formulation to a central metallic inorganic ion.
  • the present invention also relates to a process for the preparation of such compounds and their application in vivo to leaf-cutting ants, corncaterpillar larvae and other insect pests of agriculture and forestry, as well as arthropods considered to be pests of medical and veterinary interest as well. culicid mosquitoes, reduvid bed bugs and mites vectors of etiological agents.
  • M
  • the compounds [M n (L) m (L-L ') k ] 2+ and [M n (L) m ] 2+ may be linked to (PF 6 ) X , (OAc “ ) or Cl " as against -Ions.
  • the invention further comprises the intermediate endowed with insecticide activity of formula (M) n (L'-L ') m, which may be attached to (IX (OAc) or Cl "as counter-ions.
  • the invention further comprises insecticidal compositions containing as active phase such compounds, compositions having thermal stability and solubility at different pH values (2-12), which allows the application of said compositions to regions of acidic and basic soils.
  • Insecticidal compositions containing as active phase 1,1'-phenanthroline and 2,2'-bipyridine and derivatives thereof are also subject of the invention.
  • the 2,2'-bipyridine and 1,1'-phenanthroline derivatives comprise respectively 5-chloro-2,2'-bipyridine, 4,6-diphenyl-2,2'-bipyridine, 4,4'-CH 3 - 2,2'-bipyridine, 5-chloro-phenanthroline, 4,7-diphenyl-phenanthroline and 5,6-dimethyl-phenanthroline.
  • the invention therefore provides for the production of insecticides comprising in the same molecule a flavanone (L) selected from naringin and narihgenin and a polypyridine binder (L'-L ') with antiacetylcholinesterase properties joined by covalent bonds to the same central metal ion ( M), where a metal ion such as Mg (II) for example is a natural mineral fertilizer.
  • L flavanone
  • L'-L ' polypyridine binder
  • antiacetylcholinesterase properties joined by covalent bonds to the same central metal ion ( M), where a metal ion such as Mg (II) for example is a natural mineral fertilizer.
  • the invention also provides for obtaining insecticides comprising in the same molecule a flavonone (L) selected from naringin and naringenin and a metal center with anti-acetylcholinesterase properties where a metal ion such as Cu (11) for example is
  • the invention further provides Metals Insecticides with thermal stability and solubility at different pH values (2-12) allowing agricultural activity for regions of acidic and basic soils.
  • the invention further provides metallo-insecticides of the (M) n (L) m structure bonded to (PF 6 ) X , (OAc “ ) or Cl " as counter ions.
  • the invention further provides M n (L'-L ') k -type metallo-insecticides of structure bonded to (PF 6 ) X , (OAc " ) or Cl " as counterions.
  • the invention further provides Metals Insecticide compositions based on the compounds of the invention with high insecticidal activity and low toxicity.
  • the invention further provides Metallo Insecticide compositions where reversible non-competitive inhibition of acetylcholinesterase enzyme activity slowly and significantly alters the excitatory system of leaf-cutting ants, corncaterpillar larvae and other urban, agricultural and forestry pests, culminating in the disease. death and control / combat of anthill and pest insects.
  • the invention further provides Metall Insecticide compositions with comprehensive insecticidal action in relation to leaf-cutting ants and insect pests of agriculture and forestry and urban.
  • the invention also provides applicable Metall Insecticide compositions for controlling arthropods considered to be pests of medical and veterinary interest including, but not limited to, culicid mosquitoes, reduvid bed bugs and mite vectors of etiological agents.
  • FIGURE 1A illustrates the c / s- [Cu (nar) (phen)] (PF 6 ) complex formula according to the invention.
  • FIGURE 1B illustrates the c / ' s- [Cu (nar) 2 ] (PF 6 ) complex formula according to the invention.
  • FIGURE 2 is the mass spectrum of the [Cu (nar) (phen)] (PF 6 ) complex.
  • FIGURE 3 is the mass spectrum of the cis- [Cu (nar) 2 ] complex (PF 6 ).
  • FIGURE 4A shows the UV-Vis spectrum of the invention Metallo-insecticide [Cu (nar) (phen)] (PF 6 ) and free flavonoid, at concentration 10 "4 mol L " 1 at pH 12.
  • FIGURE 4A 4B shows the attached UV-Vis spectrum of Metal-lnseticida invention is S- [Cu (NAR) 2] (PF 6) in a concentration of 10 "4 mol L" 1.
  • FIGURE 5 is a block diagram showing the values of the mycelial growth areas of the symbiont fungus for the Control (8.74 cm 2 ) and for a compound of the invention, (phen) 2 Cu (0.00 cm 2 ). .
  • FIGURE 6 is a graph data series for the decay kinetics of acetylcholinesterase enzyme activity with increasing absorbance at 412 nm as a function of time for the [Cu (nnina) (bipy)] (PF 6 ) complex
  • FIGURE 7 is a Lineweaver-Burke plot for determining the value of the Michaelis constant, K m .
  • FIGURE 8 is a bar graph of the determination of the inhibitory percentage of AChE (acetylcholinesterase) enzyme.
  • FIGURE 9 is a bar graph of determination of the inhibitory percentage of the symbolic fungus Leucoagaricus gongylophorus.
  • FIGURE 10 is the percentage bioluminescence inhibition plot caused by c / ' s- [Ru (hesp) (phen) 2 ] (PF 6 ) ( ⁇ ), [Mg (hesp) (phen) (CH 3 OH) 2 ] (CH 3 COO) ( ⁇ ) and the ZnS0 4 ( ⁇ ) standard in the Vibrio fischeri toxicity assays.
  • FIGURE 11 is the Percent Bioluminescence Inhibition Graph caused by Cu (nar) (phen) (PF 6 ) ( ⁇ ) measured on EC50 of ZnS0 4 ( ⁇ ) in the Vibrio fischeri toxicity assays.
  • naringin and naringenin compounds are generally flavanones and thus the terms in this report are considered equivalent.
  • Metallol-insecticides comprises, for the particular case of Cu (ll), the steps of:
  • a) add triethylamine to the flavanone selected from naringin and naringenin in molar ratio triethylamine / flavanone 2: 1 in 1: 1 ethanol / water medium to promote deprotonation of the C 5- linked OH group, obtaining deprotonated flavanone; b) adding the polypyridine binder (phenantrolinic or bipyridine) to the deprotonated flavanone of a) in a 1: 1 molar ratio; c) adding the metal salt to the mixture b) in a 1: 1: 1 ratio; d) Keep the system produced in c) at reflux under constant agitation in a nitrogen atmosphere to promote the replacement of the two labile anions by the deprotonated flavanone of b) to obtain the cis-[Cu (phen) (flavanone)] metallo-insecticide or [Cu (bipy) (flavanone)]; e) Depending on the
  • the process of obtaining Metallol-insecticides of the type c / ' s- [M n (L) m ] comprises, for the particular case of Cu (ll), the steps of:
  • a) add triethylamine to the flavanone selected from naringin and naringenin in molar ratio triethylamine / flavanone 2: 1 in 1: 1 ethanol / water medium to promote deprotonation of the C 5- linked OH group, obtaining deprotonated flavanone; b) adding the metal salt to the mixture a) in a 1: 1 ratio;
  • the metal varies as in the listing provided above in this report.
  • the complexes were prepared by adapting the method proposed in the literature, according to Sulivan, B.P .; Salmon, D.J .; Meyer, T.J .. Mixed
  • the preparation of the c / ' s- [Cu (flavanone) 2 ] type compound is as follows: in a 50 ml conical flask was added 0.175 mmol of the flavonoid solubilized in 10 mL of HPLC grade ethanol and then drops of triethylamine (TEA), the system was shaken with magnetic stirrer until complete solubilization, after which a solution of approximately 0.0875 mmol of solubilized copper (II) acetate in 1.5 mL of distilled water was added dropwise. The system was kept under agitation for 3 hours in the absence of light. After this period a green precipitate formed which was filtered under vacuum and washed with ice cold acetone and allowed to dry under reduced pressure.
  • TAA triethylamine
  • the synthesis of metallo-insecticides comprises the steps of:
  • M is a metal selected from Ru (11), Mg (11), Co (11/11), Cu (11/11), Mn (11/11), Fe (11: 11), Zn (11) and Ca (11) to a) deprotonated flavanone in a 2: 1 molar ratio of flavanone / metal precursor;
  • the process of preparing the metallo-insecticides of the invention comprises the steps of:
  • M is a metal selected from Ru (II), Mg (11), Co (11/111), Cu (11/111), Mn (11/111), Fe (11: 11), Zn (11) and Ca (11) to a) deprotonated flavanone in a 2: 1 molar ratio of flavanone / metal precursor;
  • the second embodiment applies equally to naringin and naringenin in any proportion.
  • a third embodiment of the complex preparation process of the invention comprises the steps of reacting one pot metal salt, flavanone and polypyridine binder according to the steps of:
  • the yields are from 40 to 70%.
  • UV-vis absorption spectra were obtained on an Agilent 8453 spectrophotometer using 1 cm optical path quartz cuvettes. Infrared spectra were obtained in solution in the region of 4000 - 300 cm -1 using CaF 2 windows in a Bomem-Michelson 102 equipment. C, H and N microanalyses were obtained in the EA 1110 CHNS-O Carlo Erba Instrument equipment. 1 H and 13 C Nuclear Magnetic Resonance spectra were obtained on a BRUKER DRX 400 MHz and / or ARX 200 MHz spectrometer.
  • the degree of purity of the prepared metallo-insecticides was analyzed by comparing the percentages of elemental analysis of elements C, H, N and S obtained in the experimental samples with the expected theoretical values.
  • Table 2 shows the 25-day cumulative mortality and average survival (S 50 ) of Atta sexdens rubropilosa workers by eating the bait containing (1) the pure diet and the incorporated artificial diet at 0.1 mg / mL. of: (2 and 3) free naringin and naringenin flavanones, respectively; (4 and 5) the free bipyridine compounds, 1,10'-phenanthroline and 2,2'-bipyridine, respectively; (6) the Copper-prepared Metallo-Insecticide system, c / ' s- [Cu (nar) (phen)], (7) the Copper-prepared Metallo-Insecticide system, [Cu (nnina) 2 ] and (8) the sulfluramide commercial insecticide (positive control).
  • Naringin and naringeninin complexes such as compound 7 (Table 2) with these metals and in the absence of 2,2'-bipyridine and 1,10-phenanthroline also exhibit insecticidal activity (end products).
  • 2,2'-Bipyridine and 1,10-phenanthroline exhibit insecticidal activity when incorporated into baits at concentrations of 0.1 mg / mL, see
  • Table 3 thus shows the averages of larval and pupal phase mortality of S. frugiperda fed an artificial diet treated with the variations of naringin, naringin 2 Cu, (naring) (phen) Cu and (hesp) (phen) Cu, at 100 mg kg -1 temperature: 25 ⁇ 1 ° C; RH: 70 ⁇ 5% and photophase: 12h.
  • Sulfluramide is an effective insecticide in the control of leaf-cutting ants and other pest insects, its ban in many countries is due to its high toxicity. Therefore, in the search for a new insecticide it is also necessary to evaluate the ecotoxicological risk of a potential insecticide candidate.
  • the high water solubility of the Metallo-insecticides object of this invention may express concerns about possible hazards in aquatic environments. For this reason, acute toxicity with Vibrio fischeri bacteria was investigated.
  • Figure 10 presents for comparison the percentage inhibition of the bioluminescence of the bacterium Vibrio fischeri versus the concentration of Metallo-lnseticide c / s- [Ru (hesp) (phen) 2 ] (PF 6 ) ( ⁇ ) and Metalo -lnseticide [Mg (hesp) (phen) (CH 3 OH) 2 ] (CH 3 COO) (A) and for comparison the Microtox bioassay was also performed with the standard zinc toxic substance (in ZnS0 4 ) ( ⁇ ).
  • Figure 11 shows the percentage of Cu (nar) (phen) ( ⁇ ) Metallolnseticide inhibition measured in EC50 of ZnS0 4 ( ⁇ ), since the initial concentrations of metallo-insecticide were higher than the EC20 obtained in the model. of hesperidin.
  • the data obtained by comparing Figures 10 and 11 suggest that the metallo-insecticides tested, either with hesperidin or naringin, do not present an apparent risk to aquatic systems, since the higher the concentration of a compound capable of causing less harmful effect. its toxicity.
  • inhibitory activity As with insecticidal activity, there is an increase in inhibitory activity when one has 1,10'-phenanthroline, 1,10'-phenanthroline / metal, naringin and naringenin. All of these substances have inhibitory activity and can be used as constituents of formulations for controlling leaf-cutting ants and other social insects that have symbiotic fungus (examples: wasps and termites).
  • Figure 9 shows as an example the inhibition of symbiont fungus by copper and naringin complexed 1,10'-phenanthroline which has the highest inhibition percentage, 67% (the smaller the mycelium area, the greater the inhibition compared to the control). followed by bipyridine / copper / naringin (52% inhibition) and Cu / Naringin (41% inhibition), with pure Naringin having no inhibitory action.
  • Acetylcholineesterase Enzyme Activity Evaluation One of the mechanisms of action of the main insecticide groups is related to the inhibition of acetylcholinesterase enzyme activity by inactivating it and preventing the breakdown of the acetylcholine neurotransmitter. As a result, postsynaptic receptors become overloaded and will not receive new stimuli. This causes no stimuli to reach the muscles, which will paralyze muscle breathing, causing the insect to die.
  • Figure 8 shows the percent inhibition graphs for the [Cu (nar) 2 ] metal complexes at 73.2%, [Cu) (bipy) (nar)] at 98.3%, [Cu (phen) (nar )] with 98.9%, [Cu (nnina) 2 ] with 86.98% and [Cu (nnina) (bipy)] with 97.3%.
  • the graph obtained for the inhibition of acetylcholinesterase activity shows that there is an intense inhibitory percentage when compared to its free flavonoid.
  • Free flavanones and metallo-insecticides were individually incorporated into the artificial diet at a concentration of 2 mg ml -1 .
  • a solid artificial diet was prepared, prepared with 1.25 g glucose, 0.25 g bacteriological peptone, 0.025 g yeast extract and 0.25 g bacteriological agar dissolved in 25 ml of distilled water.
  • average workers of Atta sexdens rubropilosa were distributed in lots of 50 workers for each concentration tested, divided into groups of ten ants and kept in 5 Petri dishes. 10 cm in diameter lined with filter paper.
  • the plates were placed in a greenhouse with a temperature of 24 ° C ⁇ 1 ° C and relative humidity above 70% and examined daily for removal and recording of the number of dead ants over a period of 25 days.
  • the data obtained were analyzed based on the survival versus time curve, by which the 50% (S 50 ) survival rate was calculated, which were compared by the Graf-Pad TM computer-assisted software using the log test. -rank with a significance level of 95%.
  • An artificial diet containing distilled water (600 mL), agar (10.3 g), yeast extract (25.3 g), wheat germ (39.6 g), sorbic acid (0.8 g), ascorbic acid (2.6 g), 40% formaldehyde (6.3 mL), tetracycline (50 mg), nipagin (1.1 g) and carioquinha beans (82.5 g) were used for biological assays.
  • the complexes were solubilized in a small amount of sample and mixed with the ascorbic acid contained in the artificial diet.
  • Each complex was incorporated into the artificial diet for S. frugiperda in the ratio of 100 mg of extract to 100 g of diet (1000 mg Kg "1 ), being careful to add it at the end, when the diet is at a temperature of 50
  • a control diet without extract was also prepared using the solvent in which the complexes were solubilized
  • the diets were poured into glass tubes (8.5 ⁇ 2, 5 cm), previously sterilized, in an oven at 170 ° C for 1 h and then capped with water-repellent cotton.After placing the diet, the tubes were kept for 24 h in wire grids to eliminate excess moisture (water droplets). Then, the newly hatched S. frugiperda caterpillars were inoculated using a caterpillar per glass tube. after pupation and transferred to 50 mL plastic cups where they remain until the emergence of adults.
  • the trial site and artificial diet were the same as above, the big difference was in the amount of material needed to perform it.
  • 24-well polystyrene plates were filled with the artificial diet, and then left for 20 minutes at room temperature under sterilization conditions.
  • the wells are 3.4 ml in volume and 17 mm deep by 15 mm in diameter with 1.9 cm 2 of culture area. All compounds were dissolved in appropriate solvent using six concentrations (1, 3, 7, 10, 25 and 50 mg kg "1 ) and one control.
  • concentrations (1, 3, 7, 10, 25 and 50 mg kg "1 ) and one control.
  • a single newly hatched S. frugiperda caterpillar was placed in a well for 7 days.Each experiment contained a total of 72 caterpillars (each plate with 24 triplicate wells).
  • Acute toxicity was determined by topical application to S. frugiperda last instar caterpillars, which were cooled to paralyze their movements. Each insect was topically applied to the caterpillar abdomen 1 pL of the acetone extract sofa with the aid of an analytical microapplicator at concentrations of 1, 3, 7, 10, 25 and 50 mg kg " 1. Additional concentrations were used. after 48 hours the number of survivors was observed Thirty caterpillars were used for each concentration, thus the LD 50 (lethal dose producing 50% survival) was calculated, see Matos, AP; Nebo, L; Vieira, PC; Fernandes, JB; Da Silva, MFGF; Chemical constituents and insecticidal activity of fruit extracts of Trichilia elegans and T. catigua (Meliaceae) Quim. Nova, 32: 1553-1556, 2009b.
  • the tests with the symbiotic fungus L. gongylophorus were performed at the Bioassay Laboratory of the Natural Products group of the Federal University of S ⁇ o Carlos (UFSCar).
  • the fungus was isolated from a nest of A. sexdens rubropilosa leaf-cutting ants and kept under laboratory conditions by monthly passage in the culture medium consisting of malt extract (20 g / L), peptone (5 g / L) yeast (2 g / l) and agar (20 g / l).
  • the substances subjected to the symbiotic fungus test were incorporated into the culture medium and solubilized in distilled water. Then, in each test tube, 10 ml of culture medium / substance was added.
  • Assay tubes with culture medium / substance and Petri dishes (80 X 15 mm) were autoclaved at 120 ° C, 1.0 atm for 20 minutes.
  • the culture media was poured into Petri dishes into the laminar flow hood, previously sterilized for 30 minutes by ultraviolet light. After solidification of the culture medium, each petri dish was inoculated in the central position with an 8 mm diameter agar disk previously colonized by the symbiotic L gongylophorus fungus. The samples were prepared in replicates. The incubation time was approximately 30 days at 25 ° C ( ⁇ 2), where calculations of the mycelial growth areas of the symbiotic fungus were performed in each sample (adaptation MIYASHIRA, 2007) (17). Inhibition percentages were calculated by comparing the mycelial growth area of the control symbiotic fungus with the mycelial growth area on the sample plates. Control was considered as 0% inhibition of the symbiote fungus.
  • AChE inhibitory activity was performed aiming to know one of the mechanisms of action of the target compounds of the present application.
  • AChE inhibitory activity was measured spectroscopically, performed at 25 ° C by the Ellman method as described in Ellman, GL; Courtney, KD; Andres Jr., V .; Featherstone, RM. A new and rapid colorimetric determination of acetylcholinesterase activity. Biochem. Pharmacol. 7: 88-95, 1961. Wetwitayaklung, P .; Limmatvapirat, C; Phaechamud, T .; Keokitichai, S. Kinetics of Acetylcholinesterase Inhibition of Quisqualis indica Linn. Flower Extract Silpakorn U Science & Tech. J. 1: 20-28, 2007.
  • Enzyme activity was measured by reaction of thiocoline (the AChE action hydrolysis product on the acetylthiocoline substrate) with DTNB, which produces 5-thio-2-nitro-benzoic acid measured at 412 nm.
  • the reaction mixture has a final volume of 3 mL containing 50 mM Tris / HCl (buffer solution, pH 8.0), 0025 units of E. electricus acetylcholinesterase, 0:10 mM acetylthiocholine iodide and 333 ⁇ of 5,5 'dithiobis (2-nitrobenzoic) (DTNB). Inhibition curves were performed in triplicate with incubation of at least 4 inhibitor concentrations for 15 min.
  • the elements Mg, Ru, Cu, Fe, Zn, Co and Ca were determined in a Varian VISTA model, induced plasma optical emission spectrometer, from the acid digestion of ants in a microwave with closed bottles.
  • the 1000 ppm stock solution of each metal was prepared from the corresponding salt.
  • Vibrio fischeri (Microtox ® System).
  • the bioluminescence emitted by the bacterium V. fischeri is widely used in ecoxicological studies. Bioassays performed with such bacteria are quite efficient in comparison to other test organisms such as fish and other aquatic organisms, including freshwater, due to the rapidity of results and reproducibility, see Kaiser, KLE. Correlations of Vibrio fischeri bacteria test data with bioassay data for other organisms. Environmental Health Perspectives Supplements, 106: 583-591, 1998.
  • the Metallo-insecticide system offers numerous advantages over previously known systems in that it provides a more efficient method for controlling / combating insect pests from agriculture and forestry such as leaf-cutting ants, cornstarch caterpillars. It also presents concrete application possibilities for control of arthropods considered to be pests of medical and veterinary interest such as culicid mosquitoes, reduvid bed bugs and mite vectors of etiological agents, following the requirements proposed by the integrated pest control management program (MIP).
  • MIP integrated pest control management program
  • the Metallolnsecticide system has the property of being absorbed into the plasma bloodstream due to its hydrophilic part and being transported to the stomach, intestine and also reaching the brain of the insect pests by overcoming the brain barrier due to its lipophilic fragment ⁇ (L ' -L ' ) M] n + ⁇ .
  • the Metallolnseticide system containing the central metal ion of ruthenium and other metals that acts on the central nervous system of insects by a reversible inhibition mechanism of acetylcholinesterase enzyme allows the action time to be delayed (tingling elimination after 15 days of tingling). diet).
  • the Metallolinsicide to be added to the baits is capable of eliminating 85% of the anthill using amounts (1.5 mmol L "1 ).
  • the Metallolinsicide system acts on the anthill without the need to add other agents. toxic to achieve the desired insecticidal activity
  • the Metallo-insecticide system can operate with minimal amounts (0.8 mmol L "1 ). Does not exhibit appreciable decomposition and / or undesirable product formation when added to the baits or other formulations provided in the diets of the cutting ants and withstand the weather, with wide performance in both acidic and basic soils.
  • the present invention follows the necessary requirements required by the integrated pest management (IPM) program which enables the company to obtain forest certification (CFS) to market its products.
  • IPM integrated pest management
  • the bodies responsible for issuing the CFS restrict the use of insecticides containing in their formula Alphacipermethrin - Insecticide (BASF), Deltamethrin - Formicide (K-Othrine) and Insecticide (Decis), Epoxiconazole - Fungicide (Opera), Fenitrothione products.
  • the IPM also selects forest pest control / control methods based on economic, ecological and sociological parameters, seeking to keep the population of these pests below the level of economic damage.
  • the value of the bait containing 0.3% commercially sold sulfluramide was R $ 5.10 (factory price; research done 19/07/2013). It should be emphasized that, if the preparations of the Metallo-insecticide systems object of this invention were obtained on an industrial scale, the final costs for their production would be competitive with those observed for sulfluramide.

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Abstract

São descritos complexos metálicos de naringina e naringenina, de fórmula (M)n(L'-L')m, (M)n(L)m, e cis-[Mn(L)m(L'-L')k]2+, [Mn(L)m(L'-L')k] e [Mn(L)m(L'-L')k], ligados ou não a (PF6)X, (OAc-) ou Cl- como contra-íons, onde: é um íon metálico selecionado dentre Ru(ll), Mg(ll), Co(ll/lll), Cu(ll/lll), Mn(ll/lll), Fe(ll/lll), Zn(ll) e Ca(ll) sob forma de haleto ou acetato; L'-L') é um ligante polipiridínico selecionado dentre 2,2'-bipiridina, 1,10'- fenantrolina e derivados das mesmas; (L) é uma flavanona selecionada dentre naringina e naringenina, e "m", "n", "k" e "x" são 1 ou 2. Os complexos encontram aplicação como composições inseticidas para o controle de insetos pragas urbanos, da agricultura e da silvicultura.

Description

COMPLEXOS METÁLICOS DE NARINGINA E NARINGENINA E COMPOSIÇÕES INSETICIDAS PARA O CONTROLE DE INSETOS PRAGAS URBANOS, DA AGRICULTURA E DA SILVICULTURA
CAMPO DA INVENÇÃO
A presente invenção pertence ao campo da síntese, caracterização e utilização de complexos inorgânicos metálicos ligados a produtos naturais abundantes e disponíveis comercialmente, a naringina e naringenina, capazes de atuar diretamente no controle e/ou combate das formigas cortadeiras e lagartas-dos-cartuchos dos milhos e outros insetos pragas da agricultura e silvicultura quando adicionados a iscas, incorporados a dietas e por ações tópicas.
A presente invenção apresenta aplicação na produção de inseticidas e ou fungicida metalo-orgânico considerando o desenvolvimento sustentável, isto é, minimizando o impacto social e ambiental da atividade inseticida, ao mesmo tempo em que obtém a melhor relação custo-benefício.
FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO
A preparação de complexos inorgânicos metálicos ligados a produtos naturais para o controle e/ou combate das formigas cortadeiras e lagartas-dos-cartuchos dos milhos e outros insetos pragas da agricultura e silvicultura são tanto de interesse académico, como tecnológico. Este último é devido principalmente ao fato de os insetos serem os grandes competidores por alimento em relação ao ser humano.
As formigas cortadeiras (saúvas e quenquéns) constituem as principais pragas das áreas de reflorestamento brasileiro e representam mais de 75% dos custos e do tempo gasto no controle de pragas florestais.
Pelo fato de limitarem o pleno desenvolvimento agrícola e florestal as lagartas-dos-cartuchos dos milhos e outros insetos pragas da agricultura levam a perdas acima de 30% na produção de milho e outros alimentos.
Isto tem levado a pesquisas, por novos recursos e/ou tecnologias para o controle e/ou combate dos insetos pragas da agricultura, usando, por exemplo, agrotóxicos para o controle de pragas a fim de aumentar e assegurar a produção agrícola.
As formigas cortadeiras distribuem-se desde o sul dos Estados Unidos até o centro da Argentina. No Brasil estão presentes 10 espécies e 3 subespécies de Atta, Spodoptera frugiperda e outros insetos pragas, o que contribuiu para a classificação do Brasil como o 3o maior consumidor de praguicidas no mundo e o primeiro no âmbito da América Latina. O uso de praguicidas no Brasil alcançou, no ano de 2005, o patamar de produção e comercialização de, aproximadamente, 400 mil toneladas.
A tecnologia envolvida na busca de agrotóxicos visando o controle de pragas representa uma das fronteiras da ciência, a qual envolve diferentes aspectos multidisciplinares e pode contribuir muito para o avanço desta tecnologia.
Para ser eficiente e apresentar baixo custo financeiro, o agente tóxico usado na isca formicida ou em formulações para ação tópica ou por ação por ingestão através de dietas, deve ser de preparo simples, usando reagentes baratos e abundantes, não agredir o meio ambiente minimizando os impactos sociais e ambientais negativos de suas atividades, deve ser hidrossolúvel e estável tanto em solos ácidos como básicos, além de ser estável também às intempéries climáticas e seguir os requisitos necessários quanto ao tempo de ação tóxica frente aos insetos alvos (formigas cortadeiras, lagartas-dos-cartuchòs dos milhos e outros insetos pragas da agricultura e silvicultura).
Para as formigas não deve apresentar toxicidade letal nos primeiros dias de sua ingestão para que todos os indivíduos da colónia sejam contaminados. As iscas podem ser de bagaço de laranja, farinha de mandioca, agar, etc, e as formulações podem ser em solução aquosa ou com a presença de agentes formadores de micelas ou em dietas.
O controle/combate de insetos praga da agricultura e silvicultura como as formigas cortadeiras em grandes áreas é descrito por vários métodos. Os métodos relacionados ao controle biológico se referem em sua maioria a produtos orgânicos incluindo ingredientes tais como d- limoneno, um extrato de óleo de citrus ou Spinosad®, um complexo químico produzido por um micróbio do solo. No controle químico são usados inseticidas na forma de pó, granulados, aerossol (nebulizações a frio), termo nebulizações ou iscas.
O método mais utilizado para o controle das formigas cortadeiras é o que utiliza as iscas tóxicas, as quais são carregadas para dentro do ninho provocando a morte da rainha e dos demais indivíduos do formigueiro. As iscas para a maioria das espécies de formigas é a melhor tática, já que os ninhos são na maioria das vezes completamente destruídos, principalmente quando as iscas contêm uma substância inseticida e outra fungicida ou uma com ação nestes dois organismos que vivem em simbiose. Isto fornece uma solução permanente para um problema particular.
A isca, ou outras formas de aplicação, para ser eficiente e minimizar o impacto ambiental deve usar baixos níveis de agente tóxico para não contaminar os peixes, os mamíferos ou pássaros que vivem na área de plantio.
Quando os aerossóis são usados junto com as iscas, as formigas podem morrer antes de conseguirem levar as iscas para o ninho ou então avisar as formigas remanescentes da potencial toxicidade da isca. Desta maneira os aerossóis não devem ser usados junto com as iscas para formigas. Também é importante salientar a necessidade de a isca conter uma quantidade própria de agente tóxico ou ação retardada da mesma, de maneira que não ocorra a morte prematura da formiga carregadora. As iscas também não devem apresentar efeitos tóxicos até algum tempo após a formiga retornar à colónia. Entretanto o efeito tóxico deve ocorrer dentro de algumas horas após a formiga carregadora chegar ao ninho. Um tempo de ação tóxica muito retardada frequentemente permite que a parte remanescente da colónia se mova da área e forme novas colónias.
A maioria dos agentes tóxicos adicionados às iscas e outras formulações que são usados no controle químico de insetos pragas, tais como as formigas cortadeiras, é de inseticidas denominados de contato, os quais atuam diretamente no sistema nervoso central do inseto. Tais agentes incluem acefato (Orthene®), carbaril (Sevin®), fipronil (Over 'N Out®, granulado), piretrinas, piretróides (bifetrina, ciflutrina, cipermetrina, deltametrina, lambda-cihalotrina, permetrina, esfenvalerato, teflutrina ou tralometrina), e fipronil líquido, abamectina (Ascend®), indoxacarbe(Advion®, Spectracide®. Encontram-se também agentes tóxicos que atuam no sistema digestivo (ácido bórico), em outras vias do metabolismo que não o sistema nervoso central (hidrametilnona ou Amdro®) e os agentes tóxicos que interferem com a reprodução ou crescimento. Estes incluem fenoxicarbe (Award®), metoprene (Extinguish®), e piriproxifena (Distance® or Esteem®). Um tipo relativamente novo de isca combina dois ingredientes ativos, hidrametilnona e metopreno (AMDRO FireStrike® ou Extinguish Plus®).
A eficiência destes agentes tóxicos está relacionada com o tempo de ação necessário para a eliminação dos insetos (formiga, por exemplo) e ao tempo de permanência no meio ambiente.
A escolha do agente tóxico é em geral determinada pelo grau de controle/combate na área de interesse. As iscas com tempo de ação rápido incluem indoxacarbe (efetiva de 3 a 10 dias) e hidrametilnona (efetiva de 2 a 3 semanas). Estes produtos muitas vezes exigem aplicações mais frequentes quando comparados aos produtos com tempo de ação lento como: abamectina, fenoxicarbe, metopreno ou piriproxifeno, os quais são efetivos de 1 a 6 meses dependendo da época em que forem aplicados (primavera, outono).
Os ingredientes naturais piretrinas e sintéticos piretróide eliminam os insetos pragas e dentre eles as formigas em minutos. Acefato e carbaril levam um dia, enquanto fipronil granular leva seis semanas para eliminar a colónia. Carbaril, spinosad, e acefato necessitam dias a semanas. Piretróides podem permanecer no ambiente por semanas a meses enquanto fipronil pode persistir por anos.
Produtos que combinam ingredientes de atuação rápida e lenta simultaneamente também estão presentes no mercado tais como: hidrametilnona e metopreno (Extinguish® Plus, Amdro® Firestrike), podem controlar as formigas e outros insetos melhor porque atuam mais rapidamente e por mais tempo.
Os processos descritos acima são eficientes em maior ou menor grau, mas todos apresentam problemas no grau de controle, tempo de ação de eficiência e toxicidade. A formulação de alguns usa o agente termidor 25CE, cujo princípio ativo é o Fipronil, agente classificado como altamente tóxico para várias espécies de organismos aquáticos.
Os inseticidas à base de piretróide têm um efeito rápido e letal. Entretanto, a utilização de piretróides tem aumentado os riscos a pássaros e/ou mamíferos, sendo muito tóxico para peixes, abelhas e artrópodes aquáticos, tais como lagostas e camarões. Os inseticidas que têm como base a diazinona apresentam um tempo de ação de 1 a 7 dias.
A publicação russa RU2209549 (C2) "Método para o controle de formigas de jardim" descreve um inseticida à base de diazinona. Entretanto, diazinona é um organofosforado com uso bastante restrito como inseticida devido a sua elevada toxicidade para a espécie humana uma vez que a força das ligações P=0 permite uma interação muito forte com a enzima acetilcolinesterase presente no sistema nervoso central. A intoxicação aguda por organofosforados atinge o sistema nervoso autónomo, o sistema somático e o SNC (Sistema Nervoso Central). A exposição crónica a baixas doses de organofosforados também pode provocar efeitos importantes, incluindo sinais e sintomas de Parkinsonismo.
A publicação chinesa CN1348694A revela um inseticida contra formigas brancas à base de sulfluramida e tetrametrina.
Neste contexto, uma das áreas que vem sendo investigada para o controle/combate de insetos pragas da agricultura e silvicultura, tais como a das formigas cortadeiras e lagartas-dos-cartuchos de milhos, utiliza íons inorgânicos metálicos nas iscas e como agentes tóxicos a serem incorporados às iscas fornecidas às formigas cortadeiras, vide a patente U.S. 5.850.707. Conforme este documento, a isca utiliza componentes específicos e açúcar em combinação com sais alcalinos e alcalino- terrosos como MgCI2, visto que essa combinação aumenta significativamente a taxa de consumo das iscas pelas formigas. Também foi utilizado o agar como material matriz, o qual também pode aumentar a atratividade.
Com relação aos metais utilizados nos inseticidas complexados para controle de insetos pragas da agricultura e silvicultura, a literatura de patentes é dirigida principalmente às atividades desses metais como sais ou em combinação com outros inseticidas sem formação de complexo químico entre eles.
Assim, a patente U.S. 4.438.090 revela um método de preparação de um inseticida, o qual é misturado ao estearato de magnésio. A patente U.S. 4.461.758 divulga um inseticida incluindo ácido bórico em pó, estearato de magnésio e sílica gel.
Portanto, o objeto desses documentos não tem relação direta com o objeto da presente invenção.
Alguns documentos de patente citam a formação de complexos. Naqueles em que há formação de complexos podem-se citar: a) Zincion- containing liquid pesticide (CN1158695), b) Zinc cyclohexyl formate and its germicide series (CN99122178) e c) Method for production of a suspension of Ziram (US4533085) que utilizam zinco como complexante e inseticidas tradicionais tais como carbamatos e Paratioh.
Destaca-se ainda que sais de cobre, ferro, zinco, cálcio e magnésio, suas associações com fungicidas e complexos com fungicidas são intensamente usados como fungicidas, sendo que os complexos utilizando cobre ou zinco com 8-hidroxiquinolina são os mais utilizados, vide Publicação da Roménia RO 88253. Portanto, não há relação entre os compostos alvos da invenção e aqueles dos documentos publicados.
Os artigos e patentes que descrevem sistemas semelhantes tratam das várias técnicas e métodos para a obtenção de iscas ou inseticidas contendo íons metálicos inorgânicos, porém diferem muito do sistema Metalo-lnseticida descrito no presente documento e do estado da técnica envolvido em sua preparação.
Apesar de muitos dos sistemas já estudados apresentarem eficiências de conversão relativamente altas, os principais problemas encontrados nestas investigações são a necessidade de incorporar agentes tóxicos conhecidos pelos seus malefícios à população animal local e ao meio ambiente. A maioria dos sistemas estudados até o momento requer a presença de um agente tóxico como sulfluramida, hidrametilnona e abamectina para ser incorporado na isca ou outro sistema de aplicação para produzir o efeito tóxico esperado. Publicações de obtenção de hesperidina (pedido brasileiro BR10704708), o seu uso para aumentar a produção na lavoura agindo como promotora de crescimento de plantas (JP53210776 e JP6279211) e de metais complexados com polímero com ação inseticida que pode também potencializar a formação de quelato (patente U.S. 5.643.971 ) não têm qualquer relação com a presente invenção.
No pedido brasileiro BR102012031380-4, depositado pelas mesmas Requerentes, complexos metálicos com as flavanonas hesperidina e hesperitina mostraram alta ação inseticida em vários modelos (formigas cortadeiras, Spodoptera frugiperda, aedes aegipty), porém não é obvio que outras flavanonas e seus complexos tenham a mesma ação, sendo necessário realizar tanto a síntese dos mesmos, quanto os ensaios requeridos para a comprovação desta ação inseticida. Assim, o estudo com naringina e naringenina e seus complexos foi realizado e mostrou que as atividades para os complexos com cobre apresenta maior efeito para naringina e naringenina e os de magnésio para hesperidina e hesperitina, indicando a necessidade de estudos completos com flavanonas, com diversos metais e ligantes polipiridínicos.
O interesse na pesquisa por novos inseticidas químicos é encontrar um método que apresente a melhor relação custo-benefício, minimizando o impacto ambiental.
Outro ponto fundamental que deve ser considerado no desenvolvimento de um inseticida para o controle e combate de insetos pragas urbanos, da agricultura e silvicultura, bem como de interesse médico e veterinário, como exemplos das formigas cortadeiras e lagartas- dos-cartuchos dos milhos, é que este apresente os requisitos necessários implementados pelo programa de manejo integrado de controle de pragas (MIP), o qual procura preservar ou aumentar os fatores de mortalidade natural, pelo uso integrado de todas as técnicas de combate possíveis, selecionadas com base em parâmetros económicos, ecológicos e sociológicos, buscando manter a população dessas pragas abaixo do nível de dano económico ou significativo à saúde humana ou animal.
O MIP tornou-se fundamental para o setor florestal, pois as companhias florestais possuem programas de qualidade total, que buscam melhorar sua eficiência e competitividade, por imposição do mercado internacional, que exige certificação florestal dos tipos Cerflor, ISO, CFS entre outras, para atestar a qualidade técnica, ecológica e social das empresas como pré-requisito para a aquisição de seus produtos. Com isso, houve a necessidade de reestruturar, também, os programas de controle de pragas florestais, para minimizar os impactos sociais e ambientais negativos de suas atividades.
O MIP surgiu do uso indiscriminado de inseticidas principalmente na década de 1930 com a descoberta e aplicação de inseticidas clorados que impulsionaram o controle de pragas em todo o mundo. Entretanto, o uso em grande escala desses produtos levou ao surgimento de populações resistentes por volta de 1946. Em 1959 foi criado o conceito de nível de controle de dano económico e de controle integrado. Em 1967 foi criado o conceito de Manejo Integrado de Pragas (MIP), na tentativa de reduzir os impactos negativos do uso irracional de inseticidas. Na década de 1970 inicia-se o processo de proibição do uso de clorados no controle de pragas e a partir da década de 1980, expandem-se os programas de MIP em diversas culturas e países.
Neste contexto, a escolha do sistema correto é essencial para que o controle/combate dos insetos pragas da agricultura e silvicultura, tais como as formigas cortadeiras, lagartas-dos-cartuchos de milhos e Aedes aegypti, ocorra de maneira eficiente minimizando os impactos sociais e ambientais negativos de suas atividades para que a empresa consiga a certificação florestal necessária para a comercialização de seus produtos. Para ser eficiente e apresentar baixo custo financeiro o agente tóxico incorporado à isca ou outras formas de aplicações deve retardar seu tempo de ação de maneira que o inseto que entre em contato com o inseticida morra ou retorne ao formigueiro, no caso das formigas, e contamine a maior população possível do ninho antes de ser eliminada e avisar as formigas remanescentes da presença de agente tóxico na isca fornecida. Se isto ocorrer, as formigas abandonam o ninho e procuram outra região para instalar nova colónia.
Adicionalmente, os critérios para minimizar o impacto ambiental e social negativos do inseticida devem estar presentes. Para isso deve-se evitar o uso de agentes tóxicos que danifiquem o meio ambiente (fauna, flora) em que o inseticida será utilizado.
Para que uma empresa consiga a certificação florestal (CFS) deve restringir o uso de inseticidas que contenham em sua fórmula os seguintes princípios ativos: alfa-cipermetrina, deltametrina - epoxiconazola, fenitrotion, fipronil, pendimetalin, sulfluramida, triadimenol. Tal restrição decorre da toxicidade, bioacumulação e persistência destes.
O agente etiológico causador da dengue é um vírus, pertencente ao género Flavivírus e família Flaviridae e transmitido por vetores mosquitos culicídeos. O vírus da dengue é transmitido ao ser humano através da picada de fêmeas dos mosquitos do género Aedes, sendo o Aedes aegypti o único vetor de importância epidemiológica nas Américas, onde a circulação do vírus já se estabeleceu desde o sul dos Estados Unidos até a Argentina. Existem 2,5 bilhões de pessoas vivendo em áreas de risco endémico de dengue em todo o mundo e podem surgir, a cada ano, 50 milhões de novos casos de dengue. Não existe ainda uma vacina eficaz contra a dengue, portanto o único método atualmente disponível ao combate da doença é o controle do mosquito Aedes aegypti. Praguicidas comerciais ainda constituem uma ferramenta importante no controle do vetor da dengue. Entretanto existem inúmeros estudos sobre populações de Aedes aegypti resistentes aos inseticidas em vários estados brasileiros. Várias substâncias alternativas de baixa toxicidade ao ser humano são objeto de pedido de patente como o pedido publicado norte- americano U.S. 20080274076A1 que descreve uma composição para controle de larvas em um recipiente específico.
O pedido brasileiro publicado BR0800792-6A2 apresenta um larvicida caracterizado pela utilização de seis compostos derivados de oxadiazóis.
Afídeos são hemípteros sugadores, exclusivamente fitófagos, causando danos diretos devido à sucção da seiva e a transmissão de agentes patológicos à planta. O género Cinara é composto por espécies que ocorrem em coníferas, encontrando-se distribuídos por várias regiões do mundo. Alimentam-se em colónias localizadas nos brotos, ramos, caule e nas raízes. Os ataques mais intensos e com danos mais significativos ocorrem em mudas e em plantios novos. As espécies Cinara atlântica e Cinara pinivora atacam somente plantas do género Pinus e são nativos da América do Norte. Foram introduzidas no Brasil e registradas pela primeira vez em 1996 e 1998, respectivamente. As árvores atacadas por afídeos podem apresentar sintomas de clorose, redução do crescimento em diâmetro e altura das plantas, entortamento do fuste, seca dos brotos e superbrotação devido à destruição do broto apical; presença do fungo fumagina, de coloração escura, que recobre os ramos e as folhagens reduzindo a área fotossintética, dificultando os processos de respiração e transpiração da planta, interferindo no seu desenvolvimento; e a alimentação pode causar a seca do ramo e progressivamente a morte das plantas. O pedido de patente publicado norte-americano U.S. 20090099135 A1 descreve diversas formulações para controle de pragas, incluindo Cinara spp., sem superposição com o objeto do presente pedido.
A Naringina é uma flavanona glicosídeo. É um flavonóide importante em laranjas e lhe dá o seu sabor amargo. Em seres humanos é metabolizado para naringenina. Ambos naringenina e hesperitina, que são as agliconas de naringina e hesperidina ocorrem naturalmente em frutas cítricas. Acredita-se que os flavonóides podem atuar como antioxidante.
A presente invenção apresenta um novo sistema de agente tóxico e/ ou fungicida a ser incorporado às iscas e termonebulização, sprays e outras formas de aplicação, constituído de uma molécula polipiridinica e um produto natural unidos em uma única formulação a um íon inorgânico metálico central.
A presente invenção também versa sobre um processo para a preparação de tais compostos e sua aplicação in vivo nas formigas cortadeiras, lagartas-dos-cartuchos dos milhos e outros insetos pragas da agricultura e silvicultura, bem como artrópodes considerados pragas de interesse médico e veterinário como mosquitos culicídeos, percevejos reduvídeos e ácaros vetores de agentes etiológicos.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
De um modo amplo, a presente invenção compreende o processo de preparação de compostos do tipo [Mn(L)m(L'-L')k]2+(PF6)x, ou [Mn(L)m(L'-L')k] ou Mn(L)m onde n = 1 ou 2; m = 1 ou 2; k = 1 ou 2 e x = 1 ou 2, e compostos do tipo [Mn(L)m(L'-L')k], onde (L) é uma flavanona selecionada dentre naringina e naringenina e (L'-L') é um ligante polipiridínico selecionado dentre 1 ,10'-fenantrolina e 2,2'-bipiridina e derivados, a flavanona e o ligante estando unidos a um mesmo íon metálico central (M), incluindo Ru(ll), Mg(ll), Co(ll/lll), Cu(ll/lll), Mn(ll/lll), Fe(ll/lll), Zn(ll) e Ca(ll).
Os compostos [Mn(L)m(L'-L')k]2+ e [Mn(L)m]2+ podem estar ligados a (PF6)X, (OAc") ou Cl" como contra-íons.
Assim, a invenção compreende também os compostos do tipo [Mn(L)m(L'-L')k](PF6)X( [Mn(L)m(L'-L')k](OAc ) ou [Mn(L)m(L'-L')k]Cr, [Mn(L)m]2+(OAc )2, [Mn(L)m]2+(Cr)2 ou MnLm onde n = 1 ou 2; m = 1 ou 2 k = 1 ou 2 , x =1 ou 2.
A invenção compreende ainda os intermediários dotados de atividade inseticida de fórmula geral (M)n(L'-L')m, que podem estar ligados a ( ôíx, (OAc ) ou Cl" como contra-íons.
A invenção compreende adicionalmente composições inseticidas contendo como fase ativa tais compostos, as composições apresentando estabilidade térmica e solubilidade para diferentes valores de pH (2-12), o que permite a aplicação das ditas composições para regiões de solos ácidos e básicos.
Composições inseticidas contendo como fase ativa 1 ,10'- fenantrolina e 2.2'-bipiridina e seus derivados são igualmente objeto da invenção.
Os derivados de 2,2'-bipiridina e 1 ,10'-fenantrolina compreendem respectivamente 5-cloro-2,2'-bipiridina, 4,6-difenil-2,2'-bipiridina, 4,4'-CH3- 2,2'-bipiridina, 5-cloro-fenantrolina, 4,7-difenil- fenantrolina e 5,6-dimetil- fenantrolina.
A invenção provê, portanto, a obtenção de inseticidas que compreendem na mesma molécula uma flavanona (L) selecionada dentre naringina e narihgenina e um ligante polipiridínico (L'-L') com propriedades antiacetilcolinesterase unidos por ligações covalentes a um mesmo íon metálico central (M), onde um íon metálico como Mg(ll) por exemplo é um fertilizante mineral natural. A invenção provê também a obtenção de inseticidas que compreendem na mesma molécula uma flavonona (L) selecionada dentre naringina e naringenina e um centro metálico com propriedades antiacetilcolinesterase onde um íon metálico como Cu(ll) por exemplo é um fertilizante mineral natural.
A invenção provê ainda Metalo Inseticidas dotados de estabilidade térmica e solubilidade para diferentes valores de pH (2-12) permitindo a atividade agrícola para regiões de solos ácidos e básicos.
A invenção provê adicionalmente Metalo-lnseticidas de estrutura do tipo (M)n(L)m ligados a (PF6)X, (OAc") ou Cl" como contra-íons.
A invenção provê adicionalmente Metalo-lnseticidas de estrutura do tipo Mn(L'-L')k ligados a (PF6)X, (OAc") ou Cl" como contra-íons.
A invenção provê adicionalmente composições Metalo Inseticidas à base dos compostos da invenção com grande atividade inseticida e baixa toxicidade.
A invenção provê ainda composições Metalo Inseticidas onde a inibição não competitiva reversível da atividade da enzima acetilcolinesterase altera lenta e significativamente o sistema excitatório das formigas cortadeiras, lagartas-dos-cartuchos dos milhos e outros insetos pragas urbanos, da agricultura e silvicultura, culminando com a morte dos mesmos e controle/combate do formigueiro e insetos pragas.
A invenção provê ainda composições Metalo Inseticidas com ação inseticida abrangente em relação às formigas cortadeiras e insetos pragas da agricultura e silvicultura e urbano.
A invenção provê também composições Metalo Inseticidas aplicáveis para controle de artrópodes considerados pragas de interesse médico e veterinário incluindo, entre outros, mosquitos culicídeos, percevejos reduvídeos e ácaros vetores de agentes etiológicos. BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
A FIGURA 1A anexa ilustra a fórmula do complexo c/s- [Cu(nar)(phen)](PF6) conforme a invenção. A FIGURA 1 B anexa ilustra a fórmula do complexo c/'s-[Cu(nar)2](PF6) conforme a invenção.
A FIGURA 2 anexa é o espectro de Massas do complexo [Cu(nar)(phen)](PF6).
A FIGURA 3 anexa é o espectro de Massas do complexo cis- [Cu(nar)2](PF6).
A FIGURA 4A anexa mostra o espectro de UV-Vis do Metalo- inseticida da invenção [Cu(nar)(phen)](PF6) e do flavonóide livre, em concentração 10"4 mol L"1 em pH 12. A FIGURA 4B anexa mostra o espectro de UV-Vis do Metalo-lnseticida da invenção c s-[Cu(nar)2](PF6), em concentração 10"4 mol L"1.
A FIGURA 5 anexa é um diagrama de blocos que mostra os valores das áreas do crescimento micelial do fungo simbionte para o Controle (8,74 cm2) e para um composto da invenção, (phen)2Cu (0,00 cm2).
A FIGURA 6 anexa é uma série dados em gráfico para a cinética de decaimento da atividade da enzima acetilcolinesterase com o aumento da absorbância em 412 nm em função do tempo para o complexo [Cu(nnina)(bipy)](PF6)
A FIGURA 7 anexa é um gráfico de Lineweaver-Burke para determinação do valor da constante de Michaelis, Km.
A FIGURA 8 anexa é um gráfico de barras da determinação da porcentagem inibitória da enzima AChE (acetilcolinesterase).
A FIGURA 9 anexa é um gráfico de barras da determinação da porcentagem inibitória do fungo simbionte Leucoagaricus gongylophorus.
A FIGURA 10 anexa é o gráfico de inibição da bioluminescência em porcentagem ocasionada por c/'s-[Ru(hesp)(phen)2](PF6) (·), [Mg(hesp)(phen)(CH3OH)2](CH3COO) (▲) e o padrão ZnS04 (■) nos ensaios de toxicidade à bactéria Vibrio fischeri.
A FIGURA 11 anexa é o Gráfico de inibição da bioluminescência em porcentagem ocasionada por Cu(nar)(phen)(PF6) (·) medido em EC50 de ZnS04 (■) nos ensaios de toxicidade à bactéria Vibrio fischeri.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
Os compostos naringina e naringenina são genericamente flavanonas e deste modo no presente relatório os termos são considerados equivalentes.
Todas as sínteses relativas a compostos da invenção, tanto dos complexos precursores como dos Metalo-lnseticidas, são realizadas sob refluxo, em atmosfera inerte, sob borbulhamento de nitrogénio, agitação constante e na ausência de luz.
Em uma modalidade, o processo de obtenção dos Metalo- lnseticidas do tipo c/s-[Mn(L)m(L'-L')k] compreende, para o caso particular de Cu(ll), as etapas de:
a) adicionar trietilamina à flavanona selecionada dentre naringina e naringenina em razão molar trietilamina/flavanona 2:1 em meio etanol/água 1 :1 para promover a desprotonação do grupo OH ligado ao C5, obtendo flavanona desprotonada; b) adicionar o ligante polipiridinico (fenantrolínico ou bipiridínico) à flavanona desprotonada de a) em razão molar 1 :1 ; c) adicionar o sal do metal à mistura b) em uma proporção 1 :1 :1 ; d) Manter o sistema produzido em c) em refluxo sob agitação constante em atmosfera de nitrogénio para promover a substituição dos dois ânions lábeis pela flavanona desprotonada de b) para obter o Metalo-lnseticida cis- [Cu(phen)(flavanona)] ou [Cu(bipy)(flavanona)]; e) Em função do metal utilizado, precipitar os compostos produzidos em d) por adição de contra-íons selecionados dentre (PF6"), (AcO") e Cl" em razão molar 2:1 contra- íon/Metalo-Inseticida, separar, lavar com etanol e/ou água, obtendo o Metalo-lnseticida c/s-[M(phen)(flavanona)](contra- íon) ou [M(bip)(flavanona)](contra-íon); e
f) Recuperar e armazenar os Metalo-lnseticidas de e) para uso e comercialização.
Em outra modalidade, o processo de obtenção dos Metalo- lnseticidas do tipo c/'s-[Mn(L)m] compreende, para o caso particular de Cu(ll), as etapas de:
a) adicionar trietilamina à flavanona selecionada dentre naringina e naringenina em razão molar trietilamina/flavanona 2:1 em meio etanol/água 1 :1 para promover a desprotonação do grupo OH ligado ao C5, obtendo flavanona desprotonada; b) adicionar o sal do metal à mistura a) na proporção 1 :1 ;
c) manter o sistema produzido em b) em refluxo sob agitação constante em atmosfera de nitrogénio para promover a substituição dos dois ânions lábeis pela flavanona desprotonada de a) para obter o Metalo-lnseticida cis- [Cu(flavanona)2];
d) em função do metal utilizado, precipitar os compostos produzidos em c) por adição de contra-íons selecionados dentre (PF6"), (AcO ) e Cl" em razão molar 2:1 contra- íon/Metalo-Inseticida, separar e lavar com etanol e/ou água, obtendo o Metalo-lnseticida c/s-[M(flavanona)2]; e
e) recuperar e armazenar os Metalo-lnseticidas de d) para uso e comercialização. Os mesmos procedimentos experimentais usados para preparar os complexos c/s-[M(nar)(phen ou bip)2]2+(contra-íon), c/s-[Ru(narg)(phen ou bip)2]2+(contra-íon) e c/s-[M(flavanona)2]2+(contra-íon) foram utilizados com os metais Mg(ll), Co(ll/lll), Ru(ll/lll), Mn(ll/lll), Fe(ll/lll), Zn(ll) e Ca(ll), com adaptações integralmente compreendidas dentro do escopo da invenção, onde alguns dos compostos são precipitados com NH4PF6, outros com Na(CH3COO) e ainda outros com NaCI.
Desta maneira, serão apenas descritas as preparações dos complexos c/s-[Cu(flavanona)2] e -[Cu(phen)(flavanona)] ou [Cu(bip)(flavanona)]. Complexos c/s-[Cu(Nar)(phen) ou (bip)] são igualmente possíveis.
O metal varia como na listagem fornecida acima no presente relatório.
Os complexos foram preparados adaptando o método proposto na literatura, conforme Sulivan, B.P.; Salmon, D.J.; Meyer, T.J.. Mixed
Phosphine 2,2'-Bipyridine Complexes of. Ruthenium. Inorg. Chem. 17:
3334-3341 , 1978.
O preparo do composto do tipo c/'s-[Cu(flavanona)2] é como segue: em um erlenmeyer de 50 mL adicionou-se 0,175 mmol do flavonoide solubilizados em 10 mL de etanol grau HPLC e em seguida foi adicionado gotas de trietilamina (TEA), o sistema foi agitado com agitador magnético até completa solubilização, após foi adicionado gota a gota uma solução de aproximadamente 0,0875 mmol de acetato de cobre (II) solubilizado em 1 ,5 mL de água destilada. O sistema foi mantido sob agitação por 3 horas em ausência de luz. Após este período houve a formação de um precipitado verde que foi filtrado sob vácuo e lavado com acetona gelada e deixado para secar sob pressão reduzida.
Na formação do complexo do tipo Inseticida cis-
[Cu(phen)(flavanona)] ou [Cu(bip)(flavanona)] em um erlenmeyer de 50 mL foi adicionado 0,175 mmol de flavonóide e 0,175 mmol de phen/bipy solubiiizados em 10 mL de etanol grau HPLC e em seguida foi adicionado gotas de TEA, o sistema foi agitado com agitador magnético até completa solubilização, após foi adicionado gota a gota uma solução de 0,175 mmol de acetato de cobre solubilizado em 1 ,5 mL de água destilada. O sistema foi mantido sob agitação por 6 horas sob escuridão. Após este período houve a formação de um precipitado verde intenso que foi filtrado sob vácuo e lavado com acetona gelada e deixado para secar sob pressão reduzida.
Os rendimentos variam de 65 a 79 %.
De modo geral, em uma primeira modalidade a síntese dos metalo- inseticidas compreende as etapas de:
a) adicionar trietilamina à flavanona selecionada dentre naringina e naringenina em razão molar trietilamina/flavanona 2:1 em meio etanol/água 1 :1 para promover a desprotonação do grupo OH ligado ao C5, obtendo flavanona desprotonada;
b) adicionar haleto ou acetato do precursor metálico M, onde M é um metal selecionado dentre Ru(ll), Mg(ll), Co(ll/lll), Cu(ll/lll), Mn(ll/lll), Fe(ll/lll), Zn(ll) e Ca(ll) à flavanona desprotonada de a) em razão molar 2:1 de flavanona / precursor metálico;
c) Manter o sistema produzido em b) em refluxo sob agitação constante, adicionar 2,2'-bipiridina ou 1 ,10'-fenantrolina na proporção de 1 :1 , em atmosfera de nitrogénio para obter os Metalo-lnseticidas de formulação geral c/'s-[Mn(L)m(L'-L')k]2+, [Mn(L)m(L'-L,)k]x, e [Mn(L)m(L'-L')k] onde n = 1 ou 2; m = 1 ou 2 e k = 1 ou 2;
d) Quando necessário precipitar os compostos produzidos em c) por adição de contra-íon selecionado dentre PF6 ", (AcO") e Cl" em razão molar 2:1 contra-íon/Metalo-Inseticida seguido de separação e lavagem com etanol e/ou água, obtendo o Metalo- Inseticida c/s-[Mn(L)m(L'-L')k]2+, [Mn(L)m(L'-L')k]x, e [Mn(L)m(L'- L')k] (PF6)k, onde k = 1 ou 2; e
e) Recuperar e armazenar os Metalo-lnseticidas de d) para uso e comercialização.
Em uma segunda modalidade, o processo de preparação dos metalo-inseticidas da invenção compreende as etapas de:
a) preparar o complexo c/s-[(M)n(L'-L')m] a partir do haleto ou acetato do precursor metálico M, onde M é um metal selecionado dentre Ru(ll), Mg(ll), Co(ll/lll), Cu(ll/lll), Mn(ll/lll), Fe(ll/lll), Zn(ll) e Ca(ll), U sendo selecionada dentre 1 ,10'- fenantrolina e 2,2'-bipiridina e derivados das mesmas; b) adicionar trietilamina a uma flavanona L selecionada dentre naringina e naringenina em razão molar 2:1 trietilamina/flavanona em meio etanol/água 1 :1 para promover a desprotonação do grupo OH ligado ao C5) obtendo flavanona desprotonada;
c) após 10 min adicionar o complexo c/s- M)^.-'-.-')™] obtido em a) à flavanona L desprotonada de b) em relação molar 1 :1 ;
d) Manter o sistema produzido em c) em refluxo sob agitação constante em atmosfera de nitrogénio para promover a substituição dos ânions lábeis pela flavanona desprotonada de b) para obter os Metalo-lnseticidas c/'s-[Mn(L)m(L'-L')k], [Mn(L)m(L'- L')k]x, e [Mn(L)m(L'-L')k];
e) Quando necessário fazer reagir o metalo-inseticida de d) com um contra íon selecionado dentre PF6 ", (AcO") e Cl" em razão molar 2:1 de contra-íon/ Metalo-inseticida de d) para obter um precipitado de Metalo-inseticida
Figure imgf000022_0001
[Mn(L)m(L'-L')k](AcO-)x, e [Mn(L)m(L'-L')k](Cr)x, o precipitado sendo separado e lavado; e f) Recuperar e armazenar os Metalo-lnseticidas de e) para uso e comercialização.
A preparação do complexo (M)n(L)m segue o procedimento descrito abaixo:
a) adicionar trietilamina à flavanona selecionada dentre naringina e naringenina em razão molar trietilamina/flavanona 2:1 em meio etanol/água 1 :1 para promover a desprotonação do grupo OH ligado ao C5, obtendo flavanona desprotonada;
b) adicionar haleto ou acetato do precursor metálico M, onde M é um metal selecionado dentre Ru (II), Mg(ll), Co(ll/lll), Cu(ll/lll), Mn(ll/lll), Fe(ll/lll), Zn(ll) e Ca(ll) à flavanona desprotonada de a) em razão molar 2:1 de flavanona / precursor metálico;
c) Manter o sistema produzido em b) em refluxo sob agitação constante em atmosfera de nitrogénio para obter os Metalo- lnseticidas de formulação geral (M)n(flavanona)m, onde n = 1 e m = 2 ou 3;
d) Em função do metal utilizado, precipitar os compostos produzidos em c) por adição de contra- íon selecionado dentre PF6 ", AcO" ou Cl" em razão molar 2:1 contra-íon/Metalo-Inseticida, seguido de separação e lavagem com etanol e/ou água, obtendo o Metalo- Inseticida [(M)n(flavanona)m](PF6)k, [(M)n(flavanona)m](AcO") e [(M)n(flavanona)m]CI onde k = 1 ou 2, e
e) Recuperar e armazenar os Metalo-lnseticidas de d) para uso e comercialização.
De modo análogo à primeira modalidade de processo, a segunda modalidade se aplica igualmente à naringina e naringenina em qualquer proporção.
Uma terceira modalidade do processo de preparação dos complexos da invenção compreende as etapas de fazer reagir de modo one pot o sal de metal, a flavanona e o ligante polipiridínico segundo as etapas de:
a) adicionar trietilamina à flavanona selecionada dentre naringina e naringenina em razão molar trietilamina/flavanona 2:1 em meio etanol/água 1 :1 ; o haleto ou acetato do precursor metálico M, onde M é um metal selecionado dentre Ru(ll) Mg(ll), Co(ll/lll), Cu(ll/lll), Mn(ll/lll), Fe(ll/lll), Zn(ll) e Ca(ll) em razão molar 2:1 de flavanona / precursor metálico; mantendo o sistema em refluxo sob agitação constante, adicionar 2,2'-bipiridina, 1 ,10'-fenantrolina ou derivados das mesmas na proporção de 1 :1 , em atmosfera de nitrogénio para obter os Metalo-lnseticidas de formulação geral c/s-[Mn(L)m(L'-L')k]2+, [Mn(L)m(L'-L')k]x, e [Mn(L)m(L'-L')k];
b) Em função do metal utilizado, precipitar os compostos produzidos em a) por adição de contra-íon selecionado dentre NH4PF6, Na(CH3COO") ou NaCI em razão molar 2:1 contra-íon/ /Metalo- Inseticida, separar e lavar com etanol e/ou água, obtendo os Metalo-lnseticidas c/s-[Mn(L)m(L'-L')k]2+, [Mn(L)m(L'-L')k]x, e [Mn(L)m(L'-L')k](PF6)k, onde k = 1 ou 2; e
c) Recuperar e armazenar os Metalo-lnseticidas de b) para uso e comercialização.
Nestas metodologias os rendimentos são de 40 a 70%.
As propriedades dos compostos objeto da invenção serão descritas detalhadamente a seguir no presente relatório.
Deve ficar bem claro para os especialistas que embora os experimentos e comentários a seguir sejam dirigidos principalmente para os complexos a metais obtidos conforme o procedimento da primeira modalidade do presente processo, os mesmos experimentos e propriedades são esperados para os complexos a metais obtidos conforme os processos da segunda e terceira modalidades descritas acima no presente relatório.
A presente invenção é concretizada pelos métodos e exemplos descritos a seguir. Os exemplos a seguir descritos não têm a intenção de limitar a invenção, mas somente de exemplificar algumas das maneiras de concretizá-la.
Para efeitos da invenção, as expressões "complexo" e "Metalo- Inseticida" são equivalentes e são intercambiáveis.
Equipamentos Utilizados na Caracterização dos Metalo-lnseticidas
Técnicas espectroscópicas. Os espectros de absorção uv-vis foram obtidos em um espectrofotômetro Agilent 8453, usando cubetas de quartzo de caminho ótico de 1 cm. Os espectros de infravermelho foram obtidos em solução na região de 4000 - 300 cm"1 usando janelas de CaF2 em um equipamento Bomem-Michelson 102. As microanálises de C, H e N foram obtidas no equipamento EA 1110 CHNS-O Carlo Erba Instrument. Os espectros de Ressonância Magnética Nuclear de 1H e 13C foram obtidos em um espectrometro BRUKER DRX 400 MHz e/ou ARX 200 MHz. A determinação de metais, [Ru(ll), Mg(ll), Mg(ll), Co(ll/lll), Cu(ll/lll), Mn(ll/lll), Fe(ll/lll), Zn(ll) e Ca(ll) em amostras do Metalo- inseticida foi realizado com o auxílio de um espectrometro de absorção atómica com chama (AA240FS; Varian, Mulgrave, Austrália) equipado com uma lâmpada de deutério, para a correção da radiação de fundo e chama de ar-acetileno. As medidas foram realizadas em 202,6 nm, usando uma lâmpada de cátodo oco de magnésio e em comprimentos e lâmpadas específicos para cada metal. Os experimentos fotoquímicos foram realizados utilizando um reator fotoquímico circular, idealizado e construído em nosso laboratório, consistindo de quatro pares de lâmpadas (independentes duas a duas) de comprimento de onda especifico (350 e 420 nm) utilizando lâmpadas Rayonet (RMR 4200 A). Determinação do pKa das Flavanonas e dos Meta lo-lnsetic idas
Para estes experimentos as flavanonas livres e os Metalo- Inseticidas foram pesados e adicionados a uma solução desaerada do tampão Tris-HCI preparado e determinado valor de pH. A estabilidade das flavanonas e dos Metalo-lnseticidas foi acompanhada com medidas de absorção ultravioleta-Visível em solução tampão Tris-HCI nos valores de pH de 2,0 a 12,0 ajustado com hidróxido de sódio e ácido clorídrico. A concentração dos compostos analisados foi de 5 x 10"5 mol L"1 na solução tampão nos diferentes valores de pH.
EXEMPLO 1
Investigação do grau de pureza do sistema Metalo-lnseticida da Invenção
O grau de pureza dos Metalo-lnseticidas preparados foi analisado pela comparação dos valores percentuais de análise elementar dos elementos C, H, N e S obtidos nas amostras experimentais com os valores teóricos esperados.
Como Exemplo, parte destes resultados é mostrada na Tabela 1 a seguir.
TABELA 1
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Observa-se uma boa concordância entre os resultados experimentais e teóricos, sugerindo que as formulações propostas pelos requerentes para os complexos (A) - C^H^CuC^s, (B) - C54H62Cu028, (C) - C37H39CUN2O e (D)- C26H2i 206Cu são coerentes. Em razão de cobre ser paramagnético não é possível obter dados de RMN, sendo os complexos identificados pelos seus dados de análise elementar, IV, UV e EM (para este caso vide Figuras 2 e 3).
EXEMPLO 2
Ensaios in vivo com os Metalo-lnseticidas com as Formigas Cortadeiras
Para avaliar a viabilidade dos sistemas Metalo-lnseticidas em atuar como agente tóxico a ser adicionado às dietas, iscas, emulsões para pulverização ou termonebulização e encapsulamento, para o controle e/ou combate de insetos pragas da agricultura e silvicultura, como modelo, utilizaram-se formigas cortadeiras sendo realizadosensaios in vivo com Atta sexdens rubropilosa.
Como exemplo, a Tabela 2 mostra a mortalidade acumulada por 25 dias e a sobrevivência média (S50) de operárias de Atta sexdens rubropilosa pela ingestão da isca contendo (1) a dieta pura e a dieta artificial incorporada a 0,1 mg/mL de: (2 e 3) flavanonas naringina e naringenina livres, respectivamente; (4 e 5) os compostos bipiridínicos livres, 1 ,10'-fenantrolina e 2,2'-bipiridina, respectivamente; (6) o sistema Metalo-lnseticida preparado a partir de cobre, c/'s-[Cu(nar)(phen)], (7) o sistema Metalo-lnseticida preparado a partir de cobre, [Cu(nnina)2] e (8) o inseticida comercial sulfluramida (controle positivo).
TABELA 2
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* Letras distintas em relação ao controle indicam diferença significativa de acordo com a interpretação do teste "log-rank" (p<0,05).
(a) naringina e naringeninas livres - 2 e 3 (Tabela 2). Os dados mostram pouca atividade para naringenina ou alta atividade inseticida da naringina frente às formigas cortadeiras Atta sexdens rubropilosa quando comparado à dieta pura - 1 (Tabela 2) na concentração testada. O aumento desta concentração leva à apresentação de atividade inseticida para as duas substâncias.
(b) Sulfluramida - 8 (Tabela 2). Os dados mostram uma atividade inseticida altamente eficiente com 100% de eliminação do formigueiro após adição deste inseticida à isca (com um teor de 0,30 %) por um período de ingestão da isca de 9 dias.
(c) c/s-[Cu(nnina)2] -7 (Tabela 2). Os dados obtidos para o sistema Metalo-lnseticida c/s-[Cu(nar)(phen)](PF6) mostram uma atividade inseticida superior à apresentada pelo flavonóide livre 3 (Tabela 2), sugerindo que a interação Cu(ll)-flavonoide favorece este efeito tóxico para as formigas cortadeiras.
(d) O sistema cis-[Cu(nar)(phen)] - 6 (Tabela 2) apresentou baixa atividade comparada com os demais ensaiados.
Os resultados obtidos apontam implicações relevantes para a substituição do inseticida comercial sulfluramida pelos sistemas Metalo- lnseticida objeto desta invenção:
1 O tempo de ação inseticida do Metalo-lnseticida é semelhante ao observado para o inseticida comercial, vide Tabela 2, composto (8). Este resultado seria relevante caso houvesse maior tempo para o início da ação inseticida quando se considera que o objetivo é obter um tempo de ação inseticida retardado, ou seja, eliminar as formigas de forma lenta de maneira a impedir o deslocamento da colónia para outras regiões.
2 Complexos de naringina e naringeninina, como o composto 7 (Tabela 2) com estes metais e na ausência de 2,2'-bipiridina e 1 ,10'- fenantrolina também apresentam atividade inseticida (produtos finais). 3 2,2'-Bipiridina e 1 ,10'-fenantrolina complexadas com os metais Ru(ll), Mg(ll), Mg(ll), Co(ll/lll), Cu(ll/lll), Mn(ll/lll), Fe(ll/lll), Zn(ll) e Ca(ll) (intermediários), e destes complexos com naringina e naringenina (produtos finais) apresentam atividade inseticida crescente, vide composto 7 como exemplo (Tabela 2).
2,2'-Bipiridina e 1 ,10'-fenantrolina apresentam atividade inseticida quando incorporadas a iscas em concentrações de 0,1 mg/mL, vide
Tabela 2, compostos 4 e 5.
EXEMPLO 3
Investigação dos sistemas Metalo-lnseticidas obtidos nos Ensaios in vivo com as lagartas-dos-cartuc os dos milhos
Os ensaios realizados com lagartas-dos-cartuchos dos milhos mostraram atividades inseticidas variáveis, sendo como exemplo, Naringina, Naringina2/Cobre não apresentaram atividade e o metalo- inseticida Naringina/1 ,10'-fenantrolina/Cobre apresentou mortalidade de 63%, porém inferior à Hesperidina/1 ,10'-fenantrolina/Cobre que apresentou mortalidade próxima de 97% ao final do experimento (Tabela 3), indicando que os sistemas metalo-inseticidas e intermediários são novos e dotados de atividade biológica.
A Tabela 3 mostra assim as médias da mortalidade de fase larval e pupal de S. frugiperda alimentada com dieta artificial tratada com as variações das substâncias naringina, naringina2Cu, (naring)(phen)Cu e (hesp)(phen)Cu, a 100 mg kg"1 emperatura: 25 ± 1°C; UR: 70 ± 5% e fotofase: 12h. TABELA 3
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Médias seguidas da mesma letra, na coluna, não diferem entre si pelo Teste de Tukey (P<0,05). *Não testado.
EXEMPLO 4
Avaliação da Ecotoxicidade (testes de toxicidade aguda)
Embora Sulfluramida seja um inseticida eficiente no controle de formigas cortadeiras e outros insetos pragas, a causa de sua proibição em muitos países se dá devido à sua alta toxicidade. Logo, na busca de um novo inseticida faz-se necessário também avaliar o risco ecotoxicológico de um candidato em potencial à inseticida. Contudo, a alta solubilidade em água dos Metalo-lnseticidas objeto desta invenção pode expressar preocupações sobre possíveis riscos em ambientes aquáticos. Por esta razão, investigou-se a toxicidade aguda com a bactéria Vibrio fischeri.
Como exemplo, a Figura 10 apresenta para comparação a porcentagem de inibição da bioluminescência da bactéria Vibrio fischeri versus a concentração do Metalo-lnseticida c/s-[Ru(hesp)(phen)2](PF6) (·) e do Metalo-lnseticida [Mg(hesp)(phen)(CH3OH)2](CH3COO) (A) e, para fins de comparação o bioensaio Microtox também foi realizado com a substância tóxica padrão de zinco (em ZnS04) (■).
A Figura 11 apresenta a porcentagem de inibição do Metalo- lnseticida Cu(nar)(phen) (·) medido em EC50 de ZnS04 (■), uma vez que as concentrações iniciais utilizadas do metalo-inseticida foram superiores à EC20 obtida no modelo de hesperidina. Os dados obtidos comparando as Figuras 10 e 11 sugerem que os Metalo-lnseticidas testados, seja com hesperidina ou com naringina, não apresentam risco aparente a sistemas aquáticos, uma vez que quanto maior é a concentração de um composto capaz de causar efeito deletério menor é sua toxicidade. Comparando-se ao padrão (EC2o = 0,24 mg/L e EC50 = 1 ,3 mg/L) o valor de EC2o (correspondente à inibição de 20% da luminescência da bactéria) foi bem maior para os metalo-inseticidas {(EC20 = 17,34 mg/L) Ru[(hesp)(phen)2](PF6) e (EC50 = 19,00 mg/L, EC20 = 5,0 mg/L por extrapolação) Cu(nar)(phen)}.
EXEMPLO 5
Ensaio da inibição do fungo simbionte de formigas cortadeiras
Realizaram-se experimentos para avaliar o efeito dos sistemas Metalo-lnseticidas em diferentes doses no controle de formigas através da inibição de seu fungo simbionte.
Assim como na atividade inseticida, há um aumento da atividade inibitória quando se tem 1 ,10'-fenantrolina, 1 ,10'-fenantrolina/metal, naringina e naringenina. Todas estas substâncias apresentam atividade inibitória e podem ser utilizadas como constituintes de formulações para controle de formigas cortadeiras e outros insetos sociais que têm fungo simbionte (exemplos: vespas e cupins).
A Figura 9 mostra como exemplo a inibição do fungo simbionte pela 1 ,10'-fenantrolina complexada com cobre e naringina que apresenta a maior porcentagem de inibição, 67% (quanto menor a área do micélio, maior é a inibição em relação ao controle), seguida por bipiridina/cobre/naringina (52% de inibição) e Cu/Naringina (41% de inibição), sendo que Naringina pura não tem ação inibitória.
EXEMPLO 6
Avaliação da Atividade da Enzima Acetilcolinaesterase Um dos mecanismos de ação dos principais grupos de inseticidas está relacionado à inibição da atividade da enzima acetilcolinesterase inativando-a e impedindo que ocorra a quebra do neurotransmissor acetilcolina. Com isso, os receptores pós-sinápticos ficam sobrecarregados e não receberão novos estímulos. Isso faz com que não cheguem estímulos aos músculos, o que paralisará a respiração muscular, causando a morte do inseto.
Os experimentos foram realizados seguindo o método proposto por Ellman. As Figuras 6 e 7 mostram os gráficos obtidos da cinética de decaimento da atividade da enzima acetilcolinesterase obtida pelo aumento da absorbância em 412 nm em função do tempo com o composto [Cu(nnina)(bipy)]. Em todos estes casos, os resultados, obtidos experimentalmente in vitro, para a inibição da atividade da acetilcolinesterase usando os produtos naturais livres mostram alta atividade inibitória da acetilcolinesterase.
A Figura 8 mostra os gráficos de porcentagem de inibição para os complexos metálicos [Cu (nar)2] com 73,2%, [Cu )(bipy)(nar)] com 98,3%, [Cu (phen)(nar)] com 98,9%, [Cu(nnina)2] com 86,98% e [Cu(nnina)(bipy)] com 97,3%. O gráfico obtido para a inibição da atividade da acetilcolinesterase mostra que há uma intensa porcentagem inibitória quando comparado com seu flavonóide livre.
Experimentos in vivo com as formigas cortadeiras, lagartas-dos- cartuchos dos milhos como modelos para insetos pragas urbanos, da agricultura e da silvicultura e experimentos in vivo com o fungo simbionte de formigas cortadeiras (Leucoagaricus gongylophorus) e a bactéria Vibrio fisheri
Formigas cortadeiras
As flavanonas livres e os Metalo-lnseticidas foram incorporados, individualmente, na dieta artificial na concentração 2 mg ml_"1. Para a manutenção das formigas isoladas do formigueiro foi usada uma dieta artificial sólida, preparada com 1 ,25 g de glicose, 0,25 g de peptona bacteriológica, 0,025 g de extrato de levedura e 0,25 g de ágar bacteriológico, dissolvidos em 25 mL de água destilada. Para a realização dos bioensaios modelos, operárias médias de Atta sexdens rubropilosa, com massa corpórea variando de 15 mg a 20 mg, foram distribuídas em lotes de 50 operárias para cada concentração testada, divididas em grupos de dez formigas e mantidas em 5 placas de Petri de 10 cm de diâmetro forradas com papel filtro. As placas foram colocadas em estufa com temperatura de 24 °C ± 1 °C e umidade relativa acima de 70% e examinadas diariamente, para a retirada e anotação do número de formigas mortas, durante um período de 25 dias. Os dados obtidos foram analisados com base na curva de porcentagem de sobrevivência versus tempo, através da qual foi calculada a taxa de sobrevivência de 50 % (S50), as quais foram comparadas pelo software assistido por computador Graf-Pad™ usando o teste log-rank com nível de significância de 95 %.
Ensaios biológicos realizados sobre lagartas-dos-cartuchos dos milhos {Spodoptera frugiperda)
Ensaios por ingestão dos extratos
Os ensaios biológicos com as substâncias foram realizados no Laboratório de Bioensaios do Departamento de Química da UFSCar, mantido a 25 ± 1 °C, UR de 70 ± 5 % e fotofase de 12 h.
Uma dieta artificial contendo água destilada (600 mL), agar (10,3 g), extrato de levedura (25,3 g), germe de trigo (39,6 g), ácido sórbico (0,8 g), ácido ascórbico (2,6 g), formaldeído 40 % (6,3 mL), tetraciclina (50 mg), nipagin (1 ,1 g) e feijão carioquinha (82,5 g) foi utilizada para a realização dos ensaios biológicos. Para a realização dos bioensaios, os complexos foram solubilizados em uma pequena quantidade de amostra e misturados ao ácido ascórbico contido na dieta artificial. Logo após, o solvente foi evaporado e a mistura (ácido ascórbico e complexo) foi incorporada à dieta quando esta estava a uma temperatura de 50°C, conforme já realizado em pesquisas desenvolvidas pelos mesmos autores do presente pedido, vide Matos, A.P.; Batista-Pereira, L.G.; Vieira, P.C.; Fernandes, J.B.; Da Silva, M.F.G.F. & Rodriguez, R.R.. Atividade biológica de extratos orgânicos de Trichilia spp. sobre a lagarta do cartucho-do-milho Spodoptera frugiperda (J. E. Smith) (Lepidoptera: Noctuidae) em dieta artificial. Bioassay, 7; 1-6, 2006; e Matos, A.P.; Leite, A.C.; Batista-Pereira, L.G.; Vieira, P.C.; Fernandes, J.B. & Da Silva, M.F.G.F. Effects of limonoids from Cipadessa fruticosa on survival, growth and development of the fali armyworm, Spodoptera frugiperda. Zeitsch. Naturforsc. C, A J. Biosc. 64c: 441-446, 2009a.
Cada complexo foi incorporado à dieta artificial para S. frugiperda na proporção de 100 mg de extrato para 100 g de dieta (1000 mg Kg"1), com o cuidado de adicioná-lo ao final, quando a dieta esta a uma temperatura de 50 °C. Além das dietas correspondentes a cada tratamento, também foi preparada uma dieta testemunha, sem extrato, utilizando o solvente em que foram solubilizados os complexos. Depois da preparação, as dietas foram vertidas em tubos de vidro (8,5 χ 2,5 cm), previamente esterilizados, em estufa a 170 °C por 1 h e em seguida tampados com algodão hidrófugo. Após a colocação da dieta, os tubos foram mantidos por 24 h em grades de arame para eliminação do excesso de umidade (gotículas de água) de suas paredes. A seguir, foi feita a inoculação das lagartas recém-eclodidas de S. frugiperda, utilizando-se uma lagarta por tubo de vidro. As pupas obtidas foram pesadas um dia após a pupação e transferidas para copos plásticos de 50 mL de capacidade, onde permanecem até a emergência dos adultos.
Os parâmetros avaliados foram durações das fases larval e pupal, peso das pupas e porcentagem de insetos mortos (mortalidade) ao final de cada fase.
Ensaios por ingestão com as frações e substâncias puras
O local do ensaio e a dieta artificial foram as mesmas citadas acima, a grande diferença foi na quantidade de material necessária para a realização do mesmo. Para o ensaio com as substâncias puras, placas de poliestireno com 24 poços foram preenchidas com a dieta artificial, e então foram deixadas por 20 minutos a temperatura ambiente sob condições de esterilização. Os poços possuem 3,4 ml de volume sendo 17 mm de profundidade por 15 mm de diâmetro com 1 ,9 cm2 de área de cultura. Todos os compostos foram dissolvidos em solvente apropriado usando seis concentrações (1 , 3, 7, 10, 25 e 50 mg kg"1) e um controle. Para cada concentração e para o controle, uma única lagarta recém- eclodida de S. frugiperda foi colocada em um poço por 7 dias. Cada experimento conteve 72 lagartas no total (cada placa com 24 poços em triplicata).
Após 7 dias, as lagartas sobreviventes foram medidas e pesadas e então transferidas para tubos de vidro (8,5 x 2,5 cm), previamente esterilizados, em estufa a 170 °C por 1 h e em seguida tampados com algodão hidrófugo contendo dieta fresca. A variação do peso das lagartas e mortalidade foi medida após 15 dias de incubação, já que a pupação ocorre após cerca de 18 ± 1 dias. As pupas obtidas foram pesadas um dia após a pupação e transferidas para copos plásticos de 50 mL de capacidade, onde permaneceram até a emergência dos adultos. Foram avaliados ainda os seguintes parâmetros: duração das fases larval e pupal, mortalidade de lagartas e pupas e deformação de pupas e adultos. Ensaio de toxicidade aguda
Toxicidade aguda foi determinada pela aplicação tópica em lagartas do último instar de S. frugiperda, as quais foram esfriadas para paralisar seus movimentos. Em cada inseto foi aplicado topicamente no abdome da lagarta 1 pL da sofião do extrato em acetona, com o auxílio de um microaplicador analítico, nas concentrações de 1 , 3, 7, 10, 25 e 50 mg kg" 1. Concentrações adicionais foram utilizadas quando se necessário. Após 48 horas o número de sobreviventes foi observado. Trinta lagartas foram utilizadas para cada concentração. Deste modo foi calculado o LD50 (dose letal produzindo 50 % de sobrevivência), vide Matos, A. P.; Nebo, L; Vieira, P.C.; Fernandes, J. B.; Da Silva, M.F.G.F.; Constituintes químicos e atividade inseticida dos extratos de frutos de Trichilia elegans e T. catigua (Meliaceae). Quim. Nova, 32: 1553-1556, 2009b.
Análise Estatística
Para os bioensaios com S. frugiperda, o delineamento experimental foi inteiramente casualizado. Nestes bioensaios foram utilizadas médias de agrupamento de dados no total de 6 repetições/tratamento. A unidade experimental foi constituída por 5 tubos com uma lagarta cada. Os dados foram submetidos à análise de variância (ANOVA). A comparação entre médias dos tratamentos foi feita através do Teste de Tukey, ao nível de 5% de probabilidade.
Ensaios biológicos de inibição do fungo Leucoagaricus gongylophorus simbionte de formigas cortadeiras
Os ensaios com o fungo simbionte L. gongylophorus foram realizados no Laboratório de Bioensaios do grupo de Produtos Naturais da Universidade Federal de São Carlos (UFSCar). O fungo foi isolado de um ninho de formigas cortadeiras A. sexdens rubropilosa e mantido em condições de laboratório por passagens mensais no meio de cultura constituído por extrato de malte (20 g/L), peptona (5 g/L) extrato de levedura (2 g/L) e ágar (20 g/L). As substâncias submetidas ao ensaio com o fungo simbionte foram incorporadas ao meio de cultura e solubilizadas em água destilada. Em seguida, em cada tubo de ensaio foram adicionados 10 mL de meio de cultura/substância. Os tubos de ensaio com o meio de cultura/ substância e placas de Petri (80 X 15 mm) foram autoclavados nas condições 120°C, 1 ,0 atm por 20 minutos.
Após a esterilização do material, os meios de cultura foram vertidos em placas de Petri dentro da capela com fluxo laminar, previamente esterilizada durante 30 minutos por luz ultravioleta. Após a solidificação do meio de cultura, cada placa de Petri foi inoculada na posição central com um disco de ágar de 8 mm de diâmetro, previamente colonizado pelo fungo simbionte L gongylophorus. As amostras foram preparadas em réplicas. O tempo de incubação foi de aproximadamente 30 dias, a 25 °C (± 2), onde foram realizados os cálculos das áreas do crescimento micelial do fungo simbionte em cada amostra (adaptação MIYASHIRA, 2007) (17). As porcentagens de inibição foram calculadas a partir da comparação da área do crescimento micelial do fungo simbionte dos controles com a área do crescimento micelial nas placas com amostra. O controle foi considerado como 0% de inibição do fungo simbionte.
Experimentos de Inibição da Atividade da Enzima Acetilcolinesterase (AChE).
Ensaios com Acetilcolinesterase.
A atividade inibitória da AChE foi realizada visando conhecer um dos mecanismos de ação dos compostos alvos do presente pedido.
A atividade inibitória da AChE foi medida espectroscopicamente, realizada a 25 °C, pelo método de Ellman, tal como descrito em Ellman, G.L.; Courtney, K.D.; Andres Jr., V.; Featherstone, R.M.. A new and rapid colorimetric determination of acetylcholinesterase activity. Biochem. Pharmacol. 7: 88-95, 1961. Wetwitayaklung, P.; Limmatvapirat, C; Phaechamud, T.; Keokitichai, S.. Kinetics of Acetylcholinesterase Inhibition of Quisqualis indica Linn. Flower Extract Silpakorn U Science & Tech. J. 1 : 20-28, 2007.
A atividade da enzima foi medida pela reação da tiocolina (o produto de hidrólise da ação da AChE sobre o substrato acetiltiocolina) com DTNB, a qual produz o ácido 5-tio-2-nitro-benzóico medido em 412 nm. A mistura reacional possui um volume final de 3 ml_ contendo 50 mM Tris/HCI (solução tampão, pH 8.0), 0.025 unidades de acetilcolinesterase de E. electricus, 0.10 mM de iodeto de acetiltiocolina e 333 μΜ de ácido 5,5'-ditiobis(2-nitrobenzóico) (DTNB). Curvas de inibição foram realizadas em triplicata com incubação de pelo menos 4 concentrações de inibidor por 15 min. Triplicatas de amostras sem inibidor também foram realizadas paralelamente aos ensaios para assegurar um rendimento de 100% da atividade da AChE. Devido à baixa solubilidade de algumas amostras em água (em especial as flavanonas livres estudadas neste trabalho), as mesmas foram solubilizadas em metanol em concentrações cerca de 150 μΜ. O teor final de metanol no meio reacional foi 0,83% e as constantes cinéticas da enzima são as mesmas que na água, Vide Ronzani, N.; Lajat, M. Acetylcholinesterase Inhibition bv Alkaloids of the Anfs Venom Monomorium minutum. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, vol. 5, n° 11 , pp. 1131-1132, 1995.
Determinação do tipo de inibição da AChE.
Para determinar o tipo de inibição da enzima pelos complexos cis- [Mn(L)m(L'-L')k](PF6)x, ou [Mn(L)m(L'-L')k](Aço-)x, ou [Mn(L)m(L'-L')k](Cr)x, estudos cinéticos foram realizados da seguinte maneira: a velocidade de hidrólise do substrato pela AChE foi medida à 25 °C por 5 min, usando sete concentrações de substrato (50, 75, 100, 150, 200, 250 e 300 μΜ) na presença ou ausência de três concentrações de inibidor (0,0, 50,0 e 100,0 μΜ de c/s-[Mn(L)m(L'-L')k](PF6)x, ou [Mn(L)m(L'-L')k](Aço-)x, ou [Mn(L)m(U- L')k](C )x. Os dados foram piotados pelo método de Lineweaver-Burk para revelar o mecanismo de inibição. Gráficos de Mv versus a concentração do inibidor fornecem o valor estimado de i, a constante de dissociação da ligação AChE-inibidor, vide Segel, I.H.. Enzyme Kinetics: Behaviour and Analysis of Rapid Equilibrium and Steady-State Enzyme Systems. John Wiley and Sons, New York pp. 107-11 1 , 132-134, 1975. Experimentos para Determinação de Mg, Ru, Cu, Fe, Zn, Co e Ca em amostras de Formigas
Os elementos Mg, Ru, Cu, Fe, Zn, Co e Ca foram determinados em espectrômetro de emissão óptica com plasma induzido, modelo VISTA, da marca Varian, a partir da digestão ácida das formigas em forno de microondas com frascos fechados. A solução estoque de 1000 ppm de cada metal foi preparada a partir do sal correspondente.
Experimentos de Ecotoxicidade (testes de toxicidade aguda)
Vibrio fischeri (Sistema Microtox®). A bioluminescência emitida pela bactéria V. fischeri é muito utilizada em estudos ecoxicológicos. Bioensaios realizados com tal bactéria mostram-se bastante eficientes em comparação a outros organismos testes como peixes e outros organismos aquáticos, inclusive da água doce, devido à rapidez de obtenção de resultados e reprodutibilidade, vide Kaiser, K.L.E.. Correlations of Vibrio fischeri bactéria test data with bioassay data for other organisms. Environmental Health Perspectives Supplements, 106: 583-591 , 1998.
Os testes de toxicidade foram realizados no Laboratório de Biogeoquímica Ambiental, Departamento de Química, da UFSCar.
O sistema Metalo-lnseticida oferece inúmeras vantagens sobre os sistemas previamente conhecidos uma vez que fornece um método mais eficiente para controlar/combater insetos pragas da agricultura e silvicultura, tais como as formigas cortadeiras, lagartas-dos-cartuchos dos milhos. Apresenta também possibilidade concreta de aplicação para controle de artrópodes considerados pragas de interesse médico e veterinário como mosquitos culicídeos, percevejos reduvídeos e ácaros vetores de agentes etiológicos, seguindo os requisitos propostos pelo programa de manejamento integrado de controle de pragas (MIP).
O sistema Metalo-lnseticida apresenta formulação do tipo cis- [Mn(L)m(U-L')k](PF6)X) ou c/s-[Mn(L)m(L'-L')k ou c/s-[Mn(L)m um íon metálico central (M) podendo ser um fertilizante ou micronutrientes das plantas quando M é o íon magnésio, ferro, cobre, cobalto, zinco, manganês, um produto natural (L) e uma molécula polipiridinica (L'-L') com atividade antiacetilcolinesterase e n = 1 ,2; m = 1 ,2 k = 1 ,2 e x = 1 ,2. Sugere-se que o sistema Metalo-lnseticida tem a propriedade de ser absorvido pela corrente sanguínea do plasma devido à sua parte hidrofílica e ser transportado para o estômago, intestino e atingir também o cérebro da dos insetos pragas ultrapassando a barreira cerebral, devido ao seu fragmento lipofílico {(L'-L')M]n+}.
O sistema Metalo-lnseticida contendo o íon metálico central de rutênio e outros metais que atua no sistema nervoso central dos insetos por um mecanismo de inibição reversível da enzima acetilcolinesterase permite que o tempo de ação seja retardado (eliminação do formigueiro após 15 dias de aplicação da dieta).
Como exemplo, na presente invenção o Metalo-lnseticida a ser adicionado às iscas é capaz de eliminar 85% do formigueiro usando quantidades (1 ,5 mmol L"1). O sistema Metalo-lnseticida atua no formigueiro sem a necessidade de adicionar outros agentes tóxicos para alcançar a atividade inseticida desejada. O sistema Metalo-lnseticida pode operar com quantidades mínimas (0,8 mmol L"1). Não apresenta decomposição apreciável e/ou formação de produtos indesejáveis quando adicionado ás iscas ou outras formulações fornecidas nas dietas das formigas cortadeiras e resisti às intempéries do meio ambiente, com ampla atuação em solos tanto ácidos como básicos.
A presente invenção segue os requisitos necessários exigidos pelo programa de manejo integrado de controle de pragas (IPM) o qual habilita a empresa a obter a certificação florestal (CFS) para comercializar seus produtos. Os órgãos responsáveis pela emissão do CFS restringem o uso de inseticidas que contenham em sua fórmula os produtos Alfa- cipermetrina - Inseticida (BASF), Deltametrina - Formicida (K- Othrine) e Inseticida (Decis), Epoxiconazole - Fungicida (Ópera), Fenitrotiona - Formicida para termonebulização, Fipronil - Cupinicida (Tuit), Pendimetalina - Herbicida (BASF), Sulfluramida - Isca Formicida, Triadimenol - Fungicida (Bayfidan) devido a sua toxicidade, bioacumulação e persistência.
O IPM seleciona também os métodos de controle/combate das pragas florestais com base em parâmetros económicos, ecológicos e sociológicos, buscando manter a população dessas pragas abaixo do nível de dano económico.
Obviamente, em um investimento florestal e na agricultura, a aplicação ou não de um método de controle envolve um custo que deve ser minimizado e a uma receita, que deve ser maximizada.
Para se obter 100 g de isca são necessários 0,186 g de Cu(Nar)(phen), onde seu percentual corresponde a 0,19%. Assim, para esta formulação o gasto com o Metalo-lnseticida para cada 100 g de isca será de R$ 3,02. Nesta estimativa deve ser levado em consideração que os reagentes foram adquiridos em pequena escala o que envolve um custo alto quando comparado à compra de grandes quantidades.
O valor da isca contendo 0,3% de sulfluramida comercialmente vendida era de R$ 5,10 (preço fábrica; pesquisa feita em 19/07/2013). Deve-se ressaltar que, seguramente, se as preparações dos sistemas Metalo-lnseticidas objeto desta invenção fossem obtidos em escala industrial os custos finais para suas produções seriam competitivos com os observados para a sulfluramida.
Cabe ainda ressaltar mais uma vez, a alta periculosidade da sulfluramida e as restrições impostas para a obtenção do CFS pelas empresas que pretendem comercializar seus produtos.

Claims

REIVINDICAÇÕES
1. Complexos metálicos de naringina e naringenina, caracterizados por serem de fórmula (M)n(L'-L')m, (M)n(L)m, e c/s-[Mn(L)m(L'-L')k]2+, [Mn(L)m(L'-L')k] e [Mn(L)m(L'-L')kJ, ligados ou não a (PF6)X, (OAc ) ou Cl" como contra-íons, onde:
a. M é um íon metálico selecionado dentre Ru(ll), Mg(ll), Co(ll/lll), Cu(ll/lll), Mn(ll/lll), Fe(ll/lll), Zn(ll) e Ca(ll) sob forma de haleto ou acetato;
b. (L'-U) é um ligante polipiridínico selecionado dentre 2,2'- bipiridina, 1 ,10'-fenantrolina e derivados das mesmas;
c. (L) é uma flavanona selecionada dentre naringina e naringenina, e
d. "m", "n", "k" e "x" são 1 ou 2.
2. Complexos metálicos de acordo com a reivindicação 1 , caracterizados por apresentarem atividade inibitória de fungo simbionte de formigas cortadeiras de 67% para [Cu(phen)(nar)], 52% para [Cu(bipy)(nar)] e 41% para [Cu(nar)2].
3. Complexos metálicos de acordo com a reivindicação 1 , caracterizados por a inibição da atividade da acetiícolinesterase por [Cu(nnina)(bipy)] tal como medida pelo IC50 ser de 67,0721± 5,3001.
4. Complexos metálicos de acordo com a reivindicação 1 , caracterizados por a inibição da atividade da acetiícolinesterase atingir os valores de 73,2% para [Cu (nar)2], 98,3% para [Cu (bipy)(nar)], 98,9% para [Cu (phen)(nar)], 86,98% para [Cu(nnina)2] e 97,3% para [Cu(nnina)(bipy)].
5. Composições inseticidas para o controle de insetos pragas urbanos, da agricultura e da silvicultura, caracterizadas por compreenderem como princípio ativo os complexos metálicos conforme as reivindicações 1 , 2, 3 e 4.
6. Composições de acordo com a reivindicação. 5, caracterizadas por a composição contendo 0,1 mg/mL de c/'s-[Cu(nar)(phen)] atingir 62% de mortalidade após 25 dias de ingestão da isca e S50 de 6.
7. Composições de acordo com a reivindicação 5, caracterizadas por a composição contendo 0,1 mg/mL de [Cu(nnina)2] atingir 82% de mortalidade após 25 dias de ingestão da isca e S50 de 0.
8. Composições de acordo com a reivindicação 5, caracterizadas por a composição [Cu(nar)2] na concentração de 100 mg kg"1 atingir 24±5,3% (±EP) de mortalidade pupal e 9,53+11 ,55% (±EP) de mortalidade larval para populações de S. frugiperda.
9. Composições de acordo com a reivindicação 5, caracterizadas por a composição [Cu(nar)(phen)] na concentração de 100 mg kg"1 atingir 63±5,8% (±EP) de mortalidade pupal para populações de S. frugiperda.
10. Composições de acordo com a reivindicação 5, caracterizadas por a porcentagem de inibição da bioluminescência da bactéria Vibrio fischeri versus a concentração de Metalo-lnseticida Cu(nar)(phen) ser de EC2o = 5,0 mg/L vs EC2o = 0,23 mg/L para o padrão ZnS04.
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