WO2015022470A2 - Vaccins contre la maladie de lyme - Google Patents

Vaccins contre la maladie de lyme Download PDF

Info

Publication number
WO2015022470A2
WO2015022470A2 PCT/FR2014/052085 FR2014052085W WO2015022470A2 WO 2015022470 A2 WO2015022470 A2 WO 2015022470A2 FR 2014052085 W FR2014052085 W FR 2014052085W WO 2015022470 A2 WO2015022470 A2 WO 2015022470A2
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
borrelia
proteins
seq
polypeptide
burgdorferi
Prior art date
Application number
PCT/FR2014/052085
Other languages
English (en)
Other versions
WO2015022470A3 (fr
Inventor
Benoît JAULHAC
Nathalie BOULANGER
Laurence Sabatier
Gilles SCHNELL
Original Assignee
Université De Strasbourg
Centre National De La Recherche Scientifique - Cnrs -
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Université De Strasbourg, Centre National De La Recherche Scientifique - Cnrs - filed Critical Université De Strasbourg
Priority to EP14786957.2A priority Critical patent/EP3033105A2/fr
Priority to US14/912,325 priority patent/US20160220653A1/en
Publication of WO2015022470A2 publication Critical patent/WO2015022470A2/fr
Publication of WO2015022470A3 publication Critical patent/WO2015022470A3/fr

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/02—Bacterial antigens
    • A61K39/0225—Spirochetes, e.g. Treponema, Leptospira, Borrelia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/20—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Spirochaetales (O), e.g. Treponema, Leptospira
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/55—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the host/recipient, e.g. newborn with maternal antibodies
    • A61K2039/552—Veterinary vaccine
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Definitions

  • the present invention relates to vaccines against Lyme disease, in particular vaccines comprising one or more polypeptides isolated from Borrelia bu rdorferi ss, Borrelia afzelii or Borrelia garinii.
  • Lyme borreliosis also known as Lyme disease
  • Lyme disease is a vector-borne disease transmitted by a hard tick of the genus Ixodes. It occurs mainly in the Northern Hemisphere where it is the most common vector-borne disease. Recent data also suggest that its range also extends into the southern hemisphere with human cases in Australia (Mayne et al., 201 1 [1]) and ticks infected with Borrelia identified in South America ( Barbieri et al., 2013 [2]).
  • the bacterium responsible for borreliosis is a spirochete belonging to the group Borrelia burgdorferi sensu lato with about 20 identified species.
  • Lyme borreliosis usually develops in wildlife in a wide range of vertebrate hosts and is manifested accidentally in humans first by skin inflammation, erythema migrans, then by a wide variety of clinical manifestations: articular, cardiac, neurological and cutaneous (Radolf et al., 2012
  • the present invention precisely meets the aforementioned needs of the prior art, by providing vaccine compositions for the prevention of Lyme disease.
  • the inventors have developed a proteomic approach to identify and select effective polypeptides for the prevention of Lyme disease. This approach was carried out on the basis of three species of Borrelia that the inventors have determined to be the most involved in human and animal pathology, in particular in dogs, namely Borrelia burgdorferi ss, Borrelia afzelii and
  • the subject of the present invention is in particular a vaccine composition
  • a vaccine composition comprising at least one Borrelia burgdorferi ss, Borrelia afzelii or Borrelia garinii polypeptide chosen from the sequences described below.
  • sequences SEQ ID NO: 1 to 92 shown in Table 1 below in which the sequence numbers of the appended sequence listing, the names of the corresponding polypeptides and the names of the corresponding loci in the genome of the invention are described.
  • Borrelia burgdorferi ss, Borrelia afzelii or Borrelia garinii are described.
  • Table 1 describes the isolated polypeptides consisting of a sequence chosen from SEQ ID NO: 1 to 92 that may be used in the vaccine composition of the invention.
  • Borrelia burgdorferi means “Borrelia burgdorferi ss” or “Borrelia burgdorferi sensu stricto” as opposed to “Borrelia burgdorferi sensu lato” which covers about 20 different species.
  • sequence-determining letters of the polypeptides described herein correspond to the one-letter abbreviation proposed by Leder (Leder et al., Introduction to Molecular Medicine, Ed Scientific American, 1994 [9]).
  • the subject of the present invention is in particular a vaccine composition
  • a vaccine composition comprising at least one Borrelia burgdorferi ss, Borrelia afzelii or Borrelia garinii polypeptide chosen from the sequences SEQ ID NO: 1 to 92.
  • the at least one polypeptide is chosen. among the sequences SEQ ID NO: 10 to 92, preferably 10 to 18, preferably 10 to 15.
  • Any polypeptide of sequence SEQ ID NO: 1 to 92, or any combination of at least two of the polypeptides of sequence SEQ ID NO: 1 to 92, may be used in the vaccine composition according to the invention.
  • the combination of polypeptides may comprise 2 different polypeptides of sequence SEQ ID NO: 1 to 92, for example 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 or even more than 9 different polypeptides of sequence SEQ ID NO: 1 at 92.
  • a combination of the different polypeptides of sequence SEQ ID NO: 1 to 92 may in fact make it possible to increase the therapeutic and / or prophylactic effect of the vaccine composition according to the invention.
  • the vaccine composition according to the invention may comprise a combination of two polypeptides as shown in Table 2 below. Table 2: Combination of polypeptide in the vaccine composition according to the invention
  • the vaccine composition according to the invention may comprise, in addition to any of the combinations of two polypeptides presented in Table 2 above, at least one third polypeptide different from those of the combination, or a fourth different polypeptide, etc. .
  • the vaccine composition comprises a combination of 2, 3, 4, 5, 6 or 7 different polypeptides.
  • polypeptides that can be used in the vaccine composition according to the invention are not limited to the polypeptides consisting of the sequence SEQ ID NO: 1 to 92.
  • sequences having a homology or an identity with these sequences can also be used. to be used, equivalently, in the vaccine composition according to the invention, since they have the same effect as the polypeptides of sequence SEQ ID NO: 1 to 92, namely an immunogenic effect, useful in the prevention of Lyme disease.
  • Those skilled in the art are able to identify homologous sequences from the sequences of the polypeptides that can be used in the vaccine composition according to the invention.
  • a sequence used may have a homology or identity greater than 80% with a sequence described in Table 1, for example an identity or homology greater than 85%, or 90%, or 95%, or 99% with a sequence described in Table 1.
  • Various methods, well known to those skilled in the art, can be used to determine the homology between several sequences. This may be, for example, the Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) method described in Altschul, SF et al., J. Mol. Biol. 1990 [27].
  • BLAST Basic Local Alignment Search Tool
  • polypeptides on the same line represent the same protein, their amino acid sequences are not strictly identical. This may be due to possible mutations that have occurred distinctly in different species of the genus Borrelia.
  • sequences SEQ ID NO: 10, 11 and 12 isolated from the species Borrelia burgdorferi ss, Borrelia afzelii and Borrelia garinii respectively, represent the same protein.
  • Polypeptides that can be used in the vaccine composition according to the invention may be specific to a given Borrelia species, or common to two or three Borrelia species selected from Borrelia burgdorferi ss, Borrelia afzelii and Borrelia garinii.
  • Borrelia burgdorferi ss Borrelia afzelii
  • Borrelia garinii For example:
  • polypeptides of sequence SEQ ID NO: 1 to 9 are proteins specific to the virulent clone of Borrelia burgdorferi ss;
  • polypeptides of sequence SEQ ID NO: 10 to 18 are proteins common to the virulent clones of Borrelia burgdorferi ss,
  • polypeptides of sequence SEQ ID NO: 19 to 28 are proteins common to the virulent clones of Borrelia burgdorferi ss and Borrelia garinii;
  • polypeptides of sequence SEQ ID NO: 29 to 46 are proteins common to the virulent clones of Borrelia burgdorferi ss and
  • polypeptides of sequence SEQ ID NO: 47 to 72 are proteins common to the two virulent clones of Borrelia afzelii and Borrelia garinii;
  • polypeptides of sequence SEQ ID NO: 73 to 86 are proteins common to Borrelia burgdorferi ss and Borrelia afzelii;
  • polypeptides of sequence SEQ ID NO: 87 to 92 are proteins common to Borrelia afzelii and Borrelia garinii.
  • polypeptides of SEQ ID NO: 1 to 9, 13 to 18, 29 to 32, 37, 38, 51, 52, 57, 58, 71, 72 and 87 to 92 are membrane proteins of Borrelia.
  • the polypeptides are polypeptides of different sequences.
  • the polypeptides represent different proteins.
  • the composition comprises a combination of polypeptides of sequence SEQ ID NO: 1 to 92
  • the polypeptides may be proteins whose combination makes it possible to obtain immunization simultaneously against two species or the three species Borrelia burgdorferi ss, Borrelia afzelii and Borrelia garinii.
  • the composition according to the invention comprises a protein common to the three aforementioned species or a mixture of several proteins, for example, 2, 3 or 4 proteins, even plus, covering these three species. This embodiment makes it possible to provide universal vaccine compositions with regard to Borrelia populations.
  • the vaccine composition according to the invention may comprise at least one polypeptide of Borrelia burgdorferi ss, Borrelia afzelii or Borrelia garinii chosen from SEQ ID NO: 2, 7 to 15, 19, 20, 25, 26, 29, 30, 33 to 36, 41 to 50, 53, 54, 57 to 72 and 85 to 92.
  • the at least one polypeptide is chosen from SEQ ID NO: 10 to 15.
  • the vaccine composition may further comprise at least one other Borrelia burgdorferi ss, Borrelia afzelii or Borrelia garinii polypeptide selected from SEQ ID NO: 1, 3 to 6, 16 to 18, 21 to 24, 27, 28, 31, 32, 37-40, 51, 52, 55, 56 and 73-84.
  • the vaccine composition may further comprise at least one other Borrelia burgdorferi polypeptide, Borrelia afzelii or Borrelia garinii selected from groups (c1), (c2) and (c3),
  • said group (d) comprising SEQ ID NO: 19 to 28,
  • said group (c2) comprising SEQ ID NOS: 29-46 and 73-86
  • said group (c3) comprising SEQ ID NOS: 47-72 and 87-92, provided that said at least one polypeptide selected from SEQ ID NOS: 48-72 and 87-92, provided that said at least one polypeptide selected from SEQ ID NOS: 47-72 and 87-92, provided that said at least one polypeptide selected from SEQ ID NOS: 29-46 and 73-86, said group (c3) comprising SEQ ID NOS: 47-72 and 87-92, provided that said at least one polypeptide selected from SEQ ID
  • - is included in one of groups (c1), (c2) or (c3), said at least one other polypeptide is included in a group (c1), (c2) or (c3) different, or
  • the vaccine composition comprising at least one Borrelia burgdorferi ss polypeptide, chosen from the sequences SEQ ID NO: 10, 2, 8, 9, 13, 19, 25, 29, 33, 35, 43, 45 and 85.
  • the at least one polypeptide is selected from SEQ ID NO: 10.
  • the vaccine composition may further comprise at least one other Borrelia burgdorferi ss, Borrelia afzelii or Borrelia garinii polypeptide selected from SEQ ID NO: 1, 3 to 7, 1 1, 12, 14 to 18, 20 to 24, 26 to 28, 30 to 32, 34, 36 to 42, 44, 46 to 84 and 86 to 92.
  • the vaccine composition may further comprise at least one other Borrelia burgdorferi polypeptide, Borrelia afzelii or Borrelia garinii selected from groups (c1), (c2) and (c3),
  • said group (d) comprising SEQ ID NO: 19 to 28,
  • said group (c2) comprising SEQ ID NOS: 29-46 and 73-86
  • said group (c3) comprising SEQ ID NOS: 47-72 and 87-92, provided that said at least one polypeptide selected from SEQ ID NO : 10, 2, 8, 9, 13, 19, 25, 29, 33, 35, 43, 45 and 85:
  • - is SEQ ID NO: 19 and 25, said at least one other polypeptide is included in group (c2) or (c3), or
  • polypeptide is SEQ ID NO: 29, 33, 35, 43, 45 or 85, said at least one other polypeptide is included in group (c1) or (c3), or
  • composition of the invention may comprise a pharmaceutically acceptable carrier
  • pharmaceutically acceptable carrier is understood herein to mean any substance that makes it possible to dilute or transport at least one polypeptide of the vaccine composition according to the invention.
  • the pharmaceutically acceptable carrier does not affect the effectiveness of the polypeptide.
  • the pharmaceutically acceptable carrier may, for example, be an aqueous solution or an emulsion.
  • the pharmaceutically acceptable carrier is an aqueous solution
  • it may be, for example, any of the solutions presented in Heitz et al., 2009 (Twenty years of cell-penetrating peptides: from molecular mechanisms to therapeutics, Heitz F et al. , Br J Pharmacol 2009 May; 157 (2): 195-206 [10]) or in Wehrle P. (Wehrle P., Galenic Pharmacy, Formulation and Pharmaceutical Technology, 2007 [11]).
  • the pharmaceutically acceptable carrier when it is an emulsion, it can be a water-in-oil, oil-in-water, water-in-oil emulsion (Wehrle P. [11]).
  • the vaccine composition according to the invention may comprise an adjuvant.
  • adjuvant means any substance capable of facilitating and amplifying the immune response to the at least one polypeptide of the vaccine composition according to the invention. It may be for example any adjuvant known to those skilled in the art for the administration of polypeptides.
  • the adjuvant may be an adjuvant inducing a humoral response and / or a cellular response.
  • the adjuvant may be chosen from alumina hydroxide, saponin extracts, immune stimulation complexes (also called "ISCOM"), inulin, receptor agonists of the type Toll
  • TLR Cytosine Phosphate Guanine
  • CPG Cytosine Phosphate Guanine
  • Chitosan Chitosan or still mycolic acids. It may also be saponin (Roatt et al., 2012 [14]) or alumina hydroxide (Livey et al., 201 1
  • the vaccine composition according to the present invention may be used alone or in combination with any known treatment for preventing Lyme disease and / or one or more pathology (s) distinct from Lyme disease.
  • the distinct pathology (s) of Lyme disease can be selected from the group consisting of leptospirosis, rabies, distemper, parvovirus and Bordetella infections.
  • the term "used in combination” means a use of the vaccine composition according to the invention jointly or concomitantly, concomitantly or sequentially, with any known treatment for preventing Lyme disease.
  • the mode of administration may be identical or different depending on the co-administered molecules.
  • “Joint or simultaneous” means the use of the composition according to the invention with any known treatment for preventing Lyme disease in a single composition containing them.
  • composition means the separate use of the vaccine composition according to the invention and any known treatment for preventing Lyme disease, by the same or different administration routes during the same period of administration.
  • “Successive” means the separate use of the vaccine composition according to the invention and any known treatment for preventing Lyme disease, by the same or different administration routes during different periods of administration.
  • administration period refers to the time during which a treatment is administered. It may, for example, be several days, for example two days, three days, four days, etc., for example one or more weeks, for example a week, two weeks, three weeks. weeks, etc., for example one or more months, for example one month, two months, three months, etc., for example one or more years, for example one year, two years, three years, etc.
  • the present invention also relates to a vaccine composition according to the invention for use as a medicament.
  • the present invention also relates to a vaccine composition according to the invention, for use in the prevention of Lyme disease.
  • the vaccine composition according to the invention can therefore be used for the manufacture of a medicament, in particular a medicament intended to prevent Lyme disease.
  • the vaccine composition for use as a medicament or for use in the prevention of Lyme disease may be for any mammal susceptible to contracting or having contracted Lyme disease. In particular, it may be for humans or dogs, horses, cattle or other ruminants. Preferably, the vaccine composition according to the invention is intended for the prevention of Lyme disease in dogs.
  • the vaccine composition according to the invention used as a medicament, may be in any form of appropriate administration. It may be one of the forms known to those skilled in the art to administer an active molecule which is a polypeptide (Peppas NA, Carr DA, Chemical Engineering Science, 64, 4553-4565 (2009) [12]; Morishita M
  • the vaccine composition according to the present invention may, for example, be for administration by injection.
  • the vaccine composition according to the invention can be packaged in any form known to those skilled in the art in order to be administered by injection. It can be for example a bottle or a bulb.
  • the injection may be an intramuscular, intradermal or subcutaneous injection.
  • the injection is performed intradermally.
  • the injection is carried out intramuscularly or subcutaneously.
  • the vaccine composition of the present invention may be administered as a medicament, preferably in an amount sufficient to prevent Lyme disease, particularly to prevent that in dogs.
  • the polypeptides of the vaccine composition according to the invention can be inoculated at doses of between 1 and 500 g, preferably between 10 and 100 g (Wressnigg et al., 2013 [16]).
  • the synthesis of the polypeptides that can be used in the vaccine composition according to the present invention can be carried out by any method known to those skilled in the art. It can be for example a synthesis by genetic engineering.
  • polypeptides of the vaccine composition according to the invention When the synthesis of the polypeptides of the vaccine composition according to the invention is carried out by genetic engineering, it is possible, for example, to construct a large polypeptide comprising the polypeptide of the vaccine composition of the present invention and to digest it with restriction enzymes in order to recovering said polypeptide from the vaccine composition according to the invention.
  • restriction enzymes for example, the protocol described in F. Cordier-Ochsenbein et al. J. Mol. Biol. 279.1 177-1 185 [17].
  • the vaccine composition according to the invention can be produced according to any method well known to those skilled in the art. It may be for example a simple mixture of the various components of the vaccine composition.
  • the document by Ramamoorthi and Smooker (2009) [18] describes a method of manufacturing a vaccine composition that can be used in the context of the present invention.
  • the present invention provides effective solutions for the prevention of Lyme disease.
  • FIG. 1 represents the PCR quantification of B. burgdorferi, native strain 297 and its virulent clone 297c4, in the skin of mice, with respect to the time after inoculation of the strain.
  • N Fia / 10 4 GAPDH means number of flagellin per 10 4 of Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase.
  • FIG. 2 represents an expression profile by RT-PCR of a protein common to the three species of Borrelia: B. burgdorferi ss, B. afzelii and B. garinii, namely BB0566 (SEQ ID NO: 10) in the Mouse skin during the early transmission of the bacteria.
  • Example 1 Strategy for identifying Borrelia vaccine candidates for Lyme disease
  • the inventors have developed a proteomic approach to identify and select effective polypeptides for the prevention of Lyme disease.
  • CSF cerebrospinal fluid
  • Bacterial clones were selected for their virulence in mice. All strains were grown in complete BSK-H (Sigma) at 33 ° C and used at low passage ( ⁇ 7). Borrelia were counted and viability was verified by dark field microscopy.
  • the proteins were extracted with a Laemmli buffer [20]. After sonication and centrifugation, the pellet was removed and the protein concentration of the supernatant was determined. Proteins (75 g) underwent a one-dimensional gel electrophoresis prefractionation step (electrophoresis) SDS-PAGE
  • NanoLC-MS / MS analysis was performed using a nanoLC-Chip / MS system (Agilent Technologies, Palo Alto, CA) coupled to an amaZon ion trap (Bruker, Bremen, Germany).
  • the chromatographic system consisted of a pre-column (40 nL, 5 ⁇ ) and a column (150 mm x 75 ⁇ , 5 ⁇ ) comprising the same Zorbax stationary phase 300SB-C18.
  • the solvent system consisted of 2% ACN, 0.1% HCO 2 H in water (solvent A) and 2% water, 0.1% HCO 2 H in ACN (solvent B).
  • 1 ⁇ l of peptide extract (1/20 of the total volume) was loaded in duplicate on the pre-column (in the enrichment column) at a loading rate of (a flow rate set at) 3.75 ⁇ / min with solvent A (100% solvent A).
  • the elution was carried out at a flow rate of 300 nl / min by application of a linear gradient of 8-40% of solvent B for 30 minutes followed by a step of 4 min at 70% of solvent B before reconditioning. the 8% solvent column B.
  • the acquisition parameters of the MS and MS / MS spectra are as follows: source temperature set at 145 ° C. and gas flow rate at 4 L / min.
  • the voltage applied to the needle of the sprayer was set at -1900 V.
  • the acquisition of the MS spectra was performed in positive (ions) mode over a mass range of 250 to 1500 m / z at a scanning speed of 8100 m / z per sec.
  • the maximum number of ions (ionic charge control) and the maximum accumulation time were respectively set at 200,000 and 200 ms, with an average of two scans.
  • MS / MS spectra were acquired by sequentially selecting the 8 most intense (abundant) precursor ions, with a preference for the dicharged ions.
  • the ion selection threshold for fragmentation was set at 100,000. Fragmentation was performed using argon as the collision gas. The selected ions were excluded for 0.6 min.
  • the MS / MS spectra were carried out over a mass range ranging from 100 to 2000 m / z.
  • the maximum number of ions accumulated in MS / MS (control ionic charge) was set at 400,000, with an average of 5 scans.
  • the complete system was driven by the Hystar 3.2 (Bruker) software.
  • the number of spectra attributed to each protein in each duplicate was used to detect expressed in virulent clones.
  • the beta-binomial assay [25] was performed at R to determine protein overexpression (p ⁇ 0.05) in each virulent clone relative to the wild-type strain. The test was performed independently for each of the search engines because the spectral identifications are dependent on the algorithms.
  • the homologous proteins in the three species were determined using the blastp program [27] with an E-value threshold set at 10-30 . Three proteins are thus common to the three Borrelia species analyzed and 27 proteins are common to at least two of the three species (see Table 1 above).
  • BB0173 SEQ ID NO: 13
  • VWA von Willebrand factor A
  • BB0566 SEQ ID NO: 10
  • STAS "Sulfate Transporter and Anti-sigma factor antagonist” type domain
  • BAPKO0873 (SEQ ID NO: 59) contains a domain ⁇ of an RNA polymerase (RpoZ) subunit.
  • BB0765 (SEQ ID NO: 27) contains a domain III of the DNA polymerase (DNAX).
  • RpoN directly activates the transcription of RpoS which, in turn, controls the expression of membrane-associated lipoproteins associated with virulence (OspA, OspC, decorin-binding proteins).
  • OspA membrane-associated lipoproteins associated with virulence
  • a protein associated with an EBfC nucleotide appears as a global regulator of gene expression in Borrelia. The increase in EBfC levels influences the expression of B. burgdorferi genes by 4.5%, including genes associated with infection.
  • Other proteins involved in DNA replication, recombination and repair DNA helicase and SBCD exonuclease
  • SBCD exonuclease DNA helicase and SBCD exonuclease
  • periplasmic flagella FliE, FliP, FlgE and flagellum-specific ATP synthase (FIN).
  • Mobility is crucial for the infectious cycle of B. burgdorferi and periplasmic flagella is essential to ensure adequate mobility to bacteria. Inactivation of genes coding for flagella proteins has been shown to lead to non-motile bacteria. A Another study showed that flagella loss decreases B. garinii infection.
  • PTS phosphotransferase-related protein
  • ACP acyl-bearing protein
  • the skin is an essential organ in the development of Lyme borreliosis because Borrelia is inoculated and multiplies before spreading in the body to reach the target organs: the joint, the nervous system and the skin at a distance.
  • mice were infected with 10 3 spirochaetes in 0.1 ml of BSK medium intradermally in the dorsolumbar region.
  • the control mice were injected with an equal volume of sterile BSK medium and maintained under the same conditions as the infected animals.
  • Evaluation of arthritis was performed weekly by measuring the thickness of both tibio-tarsal joints with a metric vernier caliper. Joint measures provided an indication of the severity of arthritis. Serology was performed as described in Kern et al. [29].
  • mice were killed by overdose of isoflurane gas. About 1 cm of skin was collected at the site of inoculation and stored in Trizol (registered trademark) (Invitrogen).
  • mice The ear, the base of the heart, the bladder and the tibiotarsal joints of Each mouse was aseptically collected and divided into two parts, for PCR and Borrelia culture. The organs of the uninfected mice were collected under the same conditions as the positive mice.
  • spirochaetes For the detection of spirochaetes by culture, the organs removed were placed in 6 ml of BSK-H medium containing 30 g of rifampicin (BioRad). The tubes were maintained at 33 ° C, and the presence of spirochaetes was examined weekly by darkfield microscopy.
  • DNA was extracted from the organs of each mouse on a MagNA Pure system (Roche Diagnostics, France), using a MagNA Pure LC wide-volume isolation kit after external lysis.
  • the heart, the bladder, the ear and the skin were placed in 500 ⁇ l of lysis buffer containing proteinase K.
  • Other samples were treated with external lysis by collagenase A and then proteinase K.
  • the DNA samples were finally eluted in 100 ⁇ l of elution buffer.
  • Ten ⁇ of Borrelia DNA was used as a positive control for detection.
  • Qualitative amplification was performed as described in Woods et al. [30]., Targeting the flagellin gene.
  • RNA samples were taken from each mouse at the site of inoculation.
  • Total RNA was purified using Trizol reagent according to the manufacturer's instructions. The concentration and purity of the extracted RNAs were determined by measuring the optical density at A260 and A280. The samples were then treated with gDNAse (QIAGEN) to remove the contamination with DNA. Total extracted RNAs were submitted to the Quantiscript Reverse Transcription (QIAGEN) to produce the cDNA.
  • CDNA was used to quantify the ospC and bbk32 genes. For B. burgdorferi C297 / 4, selected genes corresponding to cell envelope proteins were retained for RT-PCR.
  • Relative expression levels were calculated using the AACt method with flagellin as the internal standard.
  • the amplification and detection were performed with an ABI 7500 system with the following thermal profile: 95 ° C for 10 minutes, 50 cycles of 95 ° C for 15 s, at 50 ° C for 30 s and 60 ° C for 1 min.
  • Each amplification condition was compared to day 3 for relative quantization.
  • Correlation factors were calculated by comparing the cDNA amplification of each kinetic point of the native strain to the cDNA amplification of each point of the hypervirulent clone. Then, the curve obtained for the clone, was normalized by these factors to obtain a second curve, representative of the wild-type strain, and quantitatively comparable to the clone.
  • the inflammatory profile in the skin of the mice was compared for these different strains of B. burgdorferi ss.
  • Antimicrobial peptides AMPs
  • the PBre (EM) strain induced a significant amount of cathelicidin with a peak on day 3.
  • the MR726 (MEM) strain strongly induced defensin mBD-3.
  • Wild type strain 297 (CSF) showed a peak of mBD-3 at 24 h while strain 1808/03 (CSF) induced a negligible amount of all three MPAs tested.
  • the induction of additional pro-inflammatory molecules was then measured: TNF- ⁇ , IL-6, IL-22 and the chemokine MCP-1.
  • Borrelia infection could be initiated by a heterogeneous population of Borrelia in the vertebrate host.
  • a clone C297 / 4 from B. burgdorferi ss 297 was selected in the laboratory for its rapid diffusion and its neurological manifestations in mice [31].
  • the virulent clone C297 / 4 caused inflammation of the skin with a greater induction of defensins, MBD-14, and cathelicidin compared to the wild-type strain.
  • the results of the wild strain 297 and the hypervirulent clone were also compared in the C3H / HeN mouse.
  • the hypervirulent clone spread more rapidly to the joint, while diffusion to other organs was similar to that of the wild-type strain.
  • Quantification of the bacterial load in the tissues confirmed the intense multiplication occurring in the skin at day 7 regardless of the strain used, but no significant difference was observed between the hypervirulent clone and the wild strain 297.
  • mice Five proteins were selected for in vivo tests in mice, namely the three "hypothetical protein" proteins only detected in the virulent clones and common to the three species of Borrelia (SEQ ID NO: 10 (BB0566), 13 (BB0173) and 16 (BB0722) of Borrelia burgdorferi ss and corresponding sequences SEQ ID NO: 11 (BAPKO0596), 14 (BAPKO0175) and 17 (BAPKO0766) respectively of B. afzelii) and 12 (BG0576), (BG0172) and 18 (BG0172). BG0744) of B.
  • mice Three to four week old C3H / HeN mice were purchased from Charles River Laboratories (L'ArbresIe, France).
  • the inventors have been particularly interested in the strain B. burgdorferi ss 297, isolated from cerebrospinal fluid in the United States.
  • mice All Borrelia strains were cultured in BSK-H (Sigma) medium at 33 ° C and used at low passage ( ⁇ 7) for mouse infection. Spirochetes were counted and viability was verified using the dark-field microscope. The mice were infected with 10 3 spirochaetes in 0.1 ml BSK by intradermal injection into the thoracic dorsal region.
  • mice were killed by isoflurane.
  • a 1 cm area of mouse skin was collected at the site of inoculation and stored in Trizol (Invitrogen) for RT-PCR analyzes.
  • Trizol Invitrogen
  • the sample is kept dry at -80 ° C.
  • RNA samples were taken from each mouse at the site of inoculation.
  • Total RNA was purified using Trizol reagent according to the manufacturer's instructions. The concentration and purity of the extracted RNA was determined by measuring A260 and A280. The samples were then treated with gDNAse wipeout (QIAGEN).
  • Total RNA extracted was synthesized into cDNA using Quantiscript Reverse Transcription (QIAGEN). CDNA was used to quantify the bbk32 genes (positive control). For B. burgdorferi ss 297 and 297c4, the genes corresponding to the three common proteins and RpoN and Gnd were tested in RT-PCR using the primers described in Table 3 below.
  • Biopsies were selected based on PCR quantification. Fragments of approximately 4 mg were cut out and the proteins were extracted into 200 ⁇ l Laemmli buffer and then assayed. Proteins (50 g) were pre-fractionated on SDS-PAGE electrophoresis gel and the migration tracks were excised and processed as described in Example 1. The tryptic peptides were analyzed by nanoLC-MS / MS using the nanoLC-Chip / MS system coupled to the amaZon ion trap, as described in Example 1. The spectra of MS and MS / MS were acquired with the same parameters and the searches were carried out in the same way except for the databanks. In this case, the searches were carried out in databases, consisting of sequences of B. burgdorferi ss B31 and mice, downloaded from the database NCBInr and UniProtKB-SwissProt, respectively (B. burgdorferi B31: August 16 2012; mouse: April 19, 2013).
  • the RT-PCR expression profile of the protein BB0566 (SEQ ID NO: 10), a protein common to all three Borrelia species: B. burgdorferi ss, B. afzelii and B. garinii, in the skin of mice during the early transmission of the bacteria is shown in Figure 2.
  • mice In cutaneous biopsies of infected mice, an average of 1350 mouse proteins were identified. Among the Borrelia proteins detected, the RpoN and Gnd proteins were identified which confirms the expression of these proteins in the skin seven days after inoculation and their potential role during the early transmission of the bacterium.
  • the dose of recombinant proteins to be administered is determined according to a prior dose-effect study well known to those skilled in the art, generally between 1 and 500 g. Depending on the vaccination protocol in the dog, ideally, two administrations will be performed between 2 to 4 weeks apart and an annual reminder.
  • the adjuvant is chosen according to its ability to stimulate the humoral response and / or the cellular response. The person skilled in the art knows which adjuvant to choose to effectively stimulate the humoral response and / or the cellular response.
  • the administration of the vaccine is carried out intradermally, subcutaneously or intramuscularly, preferably intramuscularly or subcutaneously. List of references

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

La présente invention se rapporte à des vaccins contre la maladie de Lyme, en particulier des vaccins comprenant un ou plusieurs polypeptides isolés de Borrelia burgdorferi ss, Borrelia afzelii ou Borrelia garinii.

Description

VACCINS CONTRE LA MALADIE DE LYME
Domaine technique
La présente invention se rapporte à des vaccins contre la maladie de Lyme, en particulier des vaccins comprenant un ou plusieurs polypeptides isolés de Borrelia bu rgdorferi ss, Borrelia afzelii ou Borrelia garinii.
La présente invention trouve des applications dans les domaines vétérinaire et médical. Dans la description ci-dessous, les références entre crochets ([ ]) renvoient à la liste des références présentées à la fin des exemples.
Etat de la technique
La borréliose de Lyme, également appelée maladie de Lyme, est une maladie à transmission vectorielle transmise par une tique dure du genre Ixodes. Elle sévit principalement dans l'hémisphère Nord où elle constitue la maladie à transmission vectorielle la plus fréquente. Des données récentes laissent également entrevoir que son aire de répartition s'étend également dans l'hémisphère sud avec des cas humains en Australie (Mayne et al., 201 1 [1]) et des tiques infectées avec Borrelia identifiées en Amérique du Sud (Barbieri et al., 2013 [2]).
La bactérie responsable de la borréliose est un spirochète appartenant au groupe Borrelia burgdorferi sensu lato avec environ 20 espèces identifiées.
La borréliose de Lyme se développe habituellement dans la faune sauvage chez une large gamme d'hôtes vertébrés et se manifeste accidentellement chez l'homme d'abord par une inflammation cutanée, l'érythème migrant, puis par des manifestations cliniques très variées : articulaires, cardiaques, neurologiques et cutanées (Radolf et al., 2012
[3] ; Stanek et al., 2012 [4]). La peau constitue donc une interface essentielle dans la transmission lors de la piqûre de tique et le développement de la maladie. Les symptômes cliniques de la borréliose observés chez le chien sont très proches de ceux observés chez l'Homme, mais plus spécifiquement elle induit chez le chien une glomérulonéphrite (Little et al., 2010 [5]).
Bien que des traitements antibiotiques soient efficaces à un stade précoce de l'infection, de nombreux patients développent une borréliose en raison d'une absence ou d'une non-observation d'érythème migrant, ou en raison d'un traitement inapproprié ou trop tardif. Une approche vaccinale apparaît être plus prometteuse pour prévenir ou traiter la maladie de Lyme, notamment chez l'animal chez qui le stade précoce cutané ne peut être observé en raison du pelage.
Il existe actuellement plusieurs vaccins sur le marché pour prévenir la borréliose canine. Aux Etats-Unis, ils ne sont dirigés que contre une seule espèce, Borrelia burgdorferi sensu stricto. Par ailleurs, basé sur le concept du « transmission blocking vaccine », un vaccin a été commercialisé aux Etats-Unis pour l'Homme, le LYMErix (marque de commerce), mais sa commercialisation a été arrêtée en 2002 suite à des effets secondaires chez certains patients (Hanson and Edelman, 2003 [6]). Utilisant un antigène recombinant, OspA (Outer surface protein A), deux vaccins sont actuellement utilisés chez le chien aux Etats-Unis (Nobivac (marque déposée) commercialisé par Intervet et Recombitek (marque déposée) commercialisé par Merial et ont montré une certaine efficacité mais seulement contre l'espèce B. burgdorferi ss (Lafleur et al., 2009 [7]). En effet, la population de Borrelia transmise par les tiques est en Europe très hétérogène, et les vaccins actuellement sur le marché ne sont pas efficaces contre les autres espèces virulentes de Borrelia qui sont majoritaires en Europe. Un troisième vaccin est commercialisé utilisant un lysat bactérien de B. burgdorferi ss (Fort Dodge). En Europe, seules deux compagnies (Merial et Bioveta) commercialisent un vaccin également basé sur des lysats de Borrelia, B. burgdorferi ss pour Merial et B. afzelii et B. garinii pour Bioveta. Pour ces différents vaccins, en général trois injections sont nécessaires pour obtenir une protection suffisante, généralement contrôlée par la mesure des anticorps par ELISA (Topfer et Straubinger, 2007 [8]). Toutefois, l'utilisation de lysat bactérien comme base vaccinale n'est pas satisfaisante pour une production en masse.
Ainsi, les vaccins existants utilisent soit des lysats bactériens dont la production de masse est difficilement réalisable, soit la protéine recombinante OspA, peu immunogène et peu exprimée au début de l'infection chez l'homme, soit OspC dont la preuve de concept sur un plan vaccinal n'est pas avérée.
II existe donc de réels besoins de mettre au point de nouveaux vaccins palliant ces défauts, inconvénients et obstacles de l'art antérieur, en particulier des vaccins qui soient fortement immunogènes et efficaces sur diverses populations de Borrelia, et qui puissent être produits en masse à faible coût.
Exposé de l'invention
La présente invention répond précisément aux besoins précités de l'art antérieur, en fournissant des compositions vaccinales pour la prévention de la maladie de Lyme.
A cet effet, les inventeurs ont développé une approche protéomique afin d'identifier et sélectionner des polypeptides efficaces pour la prévention de la maladie de Lyme. Cette approche a été réalisée sur la base de trois espèces de Borrelia que les inventeurs ont déterminé comme étant les plus impliquées en pathologie humaine et animale, en particulier chez le chien, à savoir Borrelia burgdorferi ss, Borrelia afzelii et
Borrelia garinii.
Ainsi, la présente invention a notamment pour objet une composition vaccinale comprenant au moins un polypeptide de Borrelia burgdorferi ss, Borrelia afzelii ou Borrelia garinii choisi parmi les séquences décrites ci-après. Notamment, on décrit les séquences SEQ ID NO: 1 à 92 présentées dans le tableau 1 ci-dessous, dans lequel figurent les numéros des séquences du listage de séquences annexé, les noms des polypeptides correspondants et les noms des loci correspondants dans le génome de Borrelia burgdorferi ss, Borrelia afzelii ou Borrelia garinii.
En d'autres termes, le Tableau 1 décrit les polypeptides isolés consistant en une séquence choisie parmi SEQ ID NO: 1 à 92 susceptibles d'être utilisés dans la composition vaccinale de l'invention.
Tableau 1 : Séquences des polypeptides utilisables dans une composition vaccinale selon l'invention
Figure imgf000006_0001
Figure imgf000007_0001
Dans la présente invention, sauf indication contraire « Borrelia burgdorferi » signifie « Borrelia burgdorferi ss » ou « Borrelia burgdorferi sensu stricto», en opposition à l'indication « Borrelia burgdorferi sensu lato » qui couvre environ 20 espèces différentes.
En outre, sauf indication contraire, les lettres déterminant les séquences des polypeptides décrites dans la présente correspondent à l'abréviation à une lettre proposée par Leder (Leder et al. Introduction to molecular medicine, Ed Scientific American, 1994 [9]).
Ainsi, la présente invention a notamment pour objet une composition vaccinale comprenant au moins un polypeptide de Borrelia burgdorferi ss, Borrelia afzelii ou Borrelia garinii choisi parmi les séquences SEQ ID NO : 1 à 92. De préférence, l'au moins un polypeptide est choisi parmi les séquences SEQ ID NO: 10 à 92, de préférence, 10 à 18, de préférence, 10 à 15.
Tout polypeptide de séquence SEQ ID NO: 1 à 92, ou toute combinaison d'au moins deux des polypeptides de séquence SEQ ID NO: 1 à 92, peut être utilisé(e) dans la composition vaccinale selon l'invention.
Par exemple, la combinaison de polypeptides peut comprendre 2 polypeptides différents de séquence SEQ ID NO: 1 à 92, par exemple 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 voire plus de 9 polypeptides différents de séquence SEQ ID NO: 1 à 92. Une combinaison des polypeptides différents de séquence SEQ ID NO: 1 à 92 peut en effet permettre d'augmenter l'effet thérapeutique et/ou prophylactique de la composition vaccinale selon l'invention. Par exemple, la composition vaccinale selon l'invention peut comprendre une combinaison de deux polypeptides comme présentée dans le tableau 2 ci-dessous. Tableau 2 : Combinaison de polypeptide dans la composition vaccinale selon l'invention
Polypeptide
de Combinaison possible avec les poiypeptides de séquence SEQ NO: séquence suivants
SEQ ID NO:
Au moins une parmi : 2 à 92,
1
de préférence au moins l'une parmi : 10 à 18, 47 à 72 et 87 à 92
Au moins une parmi : 1 et 3 à 92,
2
de préférence au moins l'une parmi : 10 à 18, 47 à 72 et 87 à 92
Au moins une parmi : 1 , 2 et 4 à 92,
3
de préférence au moins l'une parmi : 10 à 18, 47 à 72 et 87 à 92
Au moins une parmi : 1 à 3 et 5 à 92,
4
de préférence au moins l'une parmi : 10 à 18, 47 à 72 et 87 à 92
Au moins une parmi : 1 à 4 et 6 à 92,
5
de préférence au moins l'une parmi : 10 à 18, 47 à 72 et 87 à 92
Au moins une parmi : 1 à 5 et 7 à 92,
6
de préférence au moins l'une parmi : 10 à 18, 47 à 72 et 87 à 92
Au moins une parmi : 1 à 6 et 8 à 92,
7
de préférence au moins l'une parmi : 10 à 18, 47 à 72 et 87 à 92
Au moins une parmi : 1 à 7 et 9 à 92,
8
de préférence au moins l'une parmi : 10 à 18, 47 à 72 et 87 à 92
Au moins une parmi : 1 à 8 et 10 à 92,
9
de préférence au moins l'une parmi : 10 à 18, 47 à 72 et 87 à 92
Au moins une parmi : 1 à 9 et 1 1 à 92,
10
de préférence au moins l'une parmi : 13 à 18
Au moins une parmi : 1 à 10 et 12 à 92,
1 1
de préférence au moins l'une parmi : 13 à 18
Au moins une parmi : 1 à 1 1 et 13 à 92,
12
de préférence au moins l'une parmi : 13 à 18
Au moins une parmi : 1 à 12 et 14 à 92,
13
de préférence au moins l'une parmi : 10 à 12 et 16 à 18
Au moins une parmi : 1 à 13 et 15 à 92,
14
de préférence au moins l'une parmi : 10 à 12 et 16 à 18
Au moins une parmi : 1 à 14 et 16 à 92,
15
de préférence au moins l'une parmi : 10 à 12 et 16 à 18
Au moins une parmi : 1 à 15 et 17 à 92,
16
de préférence au moins l'une parmi : 10 à 15
Au moins une parmi : 1 à 16 et 18 à 92,
17
de préférence au moins l'une parmi : 10 à 15
Au moins une parmi : 1 à 17 et 19 à 92,
18
de préférence au moins l'une parmi : 10 à 15
Au moins une parmi : 1 à 18 et 20 à 92,
19
de préférence au moins l'une parmi : 10 à 18 et 29 à 92
Au moins une parmi : 1 à 19 et 21 à 92,
20
de préférence au moins l'une parmi : 10 à 18 et 29 à 92
Au moins une parmi : 1 à 20 et 22 à 92,
21
de préférence au moins l'une parmi : 10 à 18 et 29 à 92
Au moins une parmi : 1 à 21 et 23 à 92,
22
de préférence au moins l'une parmi : 10 à 18 et 29 à 92
Au moins une parmi : 1 à 22 et 24 à 92,
23
de préférence au moins l'une parmi : 10 à 18 et 29 à 92
Au moins une parmi : 1 à 23 et 25 à 92,
24
de préférence au moins l'une parmi : 10 à 18 et 29 à 92 Au moins une parmi : 1 à 24 et 26 à 92,
25
de préférence au moins l'une parmi : 10 à 18 et 29 à 92
Au moins une parmi : 1 à 25 et 27 à 92,
26
de préférence au moins l'une parmi : 10 à 18 et 29 à 92
Au moins une parmi : 1 à 26 et 28 à 92,
27
de préférence au moins l'une parmi : 10 à 18 et 29 à 92
Au moins une parmi : 1 à 27 et 29 à 92,
28
de préférence au moins l'une parmi : 10 à 18 et 29 à 92
Au moins une parmi : 1 à 28 et 30 à 92,
29
de préférence au moins l'une parmi : 10 à 28,47 à 72 et 87 à 92
Au moins une parmi : 1 à 29 et 31 à 92,
30
de préférence au moins l'une parmi : 10 à 28,47 à 72 et 87 à 92
Au moins une parmi : 1 à 30 et 32 à 92,
31
de préférence au moins l'une parmi : 10 à 28,47 à 72 et 87 à 92
Au moins une parmi : 1 à 31 et 33 à 92,
32
de préférence au moins l'une parmi : 10 à 28,47 à 72 et 87 à 92
Au moins une parmi : 1 à 32 et 34 à 92,
33
de préférence au moins l'une parmi : 10 à 28,47 à 72 et 87 à 92
Au moins une parmi : 1 à 33 et 35 à 92,
34
de préférence au moins l'une parmi : 10 à 28,47 à 72 et 87 à 92
Au moins une parmi : 1 à 34 et 36 à 92,
35
de préférence au moins l'une parmi : 10 à 28,47 à 72 et 87 à 92
Au moins une parmi : 1 à 35 et 37 à 92,
36
de préférence au moins l'une parmi : 10 à 28,47 à 72 et 87 à 92
Au moins une parmi : 1 à 36 et 38 à 92,
37
de préférence au moins l'une parmi : 10 à 28,47 à 72 et 87 à 92
Au moins une parmi : 1 à 37 et 39 à 92,
38
de préférence au moins l'une parmi : 10 à 28,47 à 72 et 87 à 92
Au moins une parmi : 1 à 38 et 40 à 92,
39
de préférence au moins l'une parmi : 10 à 28,47 à 72 et 87 à 92
Au moins une parmi : 1 à 39 et 41 à 92,
40
de préférence au moins l'une parmi : 10 à 28,47 à 72 et 87 à 92
Au moins une parmi : 1 à 40 et 42 à 92,
41
de préférence au moins l'une parmi : 10 à 28,47 à 72 et 87 à 92
Au moins une parmi : 1 à 41 et 43 à 92,
42
de préférence au moins l'une parmi : 10 à 28,47 à 72 et 87 à 92
Au moins une parmi : 1 à 42 et 44 à 92,
43
de préférence au moins l'une parmi : 10 à 28,47 à 72 et 87 à 92
Au moins une parmi : 1 à 43 et 45 à 92,
44
de préférence au moins l'une parmi : 10 à 28,47 à 72 et 87 à 92
Au moins une parmi : 1 à 44 et 46 à 92,
45
de préférence au moins l'une parmi : 10 à 28,47 à 72 et 87 à 92
Au moins une parmi : 1 à 45 et 47 à 92,
46
de préférence au moins l'une parmi : 10 à 28,47 à 72 et 87 à 92
Au moins une parmi : 1 à 46 et 48 à 92,
47
de préférence au moins l'une parmi : 1 à 46 et 73 à 86
Au moins une parmi : 1 à 47 et 49 à 92,
48
de préférence au moins l'une parmi : 1 à 46 et 73 à 86
Au moins une parmi : 1 à 48 et 50 à 92,
49
de préférence au moins l'une parmi : 1 à 46 et 73 à 86
Au moins une parmi : 1 à 49 et 51 à 92,
50
de préférence au moins l'une parmi : 1 à 46 et 73 à 86
Au moins une parmi : 1 à 50 et 52 à 92,
51
de préférence au moins l'une parmi : 1 à 46 et 73 à 86 Au moins une parmi : 1 à 51 et 53 à 92,
52
de préférence au moins l'une parmi : 1 à 46 et 73 à 86
Au moins une parmi : 1 à 52 et 54 à 92,
53
de préférence au moins l'une parmi : 1 à 46 et 73 à 86
Au moins une parmi : 1 à 53 et 55 à 92,
54
de préférence au moins l'une parmi : 1 à 46 et 73 à 86
Au moins une parmi : 1 à 54 et 56 à 92,
55
de préférence au moins l'une parmi : 1 à 46 et 73 à 86
Au moins une parmi : 1 à 55 et 57 à 92,
56
de préférence au moins l'une parmi : 1 à 46 et 73 à 86
Au moins une parmi : 1 à 56 et 58 à 92,
57
de préférence au moins l'une parmi : 1 à 46 et 73 à 86
Au moins une parmi : 1 à 57 et 59 à 92,
58
de préférence au moins l'une parmi : 1 à 46 et 73 à 86
Au moins une parmi : 1 à 58 et 60 à 92,
59
de préférence au moins l'une parmi : 1 à 46 et 73 à 86
Au moins une parmi : 1 à 59 et 61 à 92,
60
de préférence au moins l'une parmi : 1 à 46 et 73 à 86
Au moins une parmi : 1 à 60 et 62 à 92,
61
de préférence au moins l'une parmi : 1 à 46 et 73 à 86
Au moins une parmi : 1 à 61 et 63 à 92,
62
de préférence au moins l'une parmi : 1 à 46 et 73 à 86
Au moins une parmi : 1 à 62 et 64 à 92,
63
de préférence au moins l'une parmi : 1 à 46 et 73 à 86
Au moins une parmi : 1 à 63 et 65 à 92,
64
de préférence au moins l'une parmi : 1 à 46 et 73 à 86
Au moins une parmi : 1 à 64 et 66 à 92,
65
de préférence au moins l'une parmi : 1 à 46 et 73 à 86
Au moins une parmi : 1 à 65 et 67 à 92,
66
de préférence au moins l'une parmi : 1 à 46 et 73 à 86
Au moins une parmi : 1 à 66 et 68 à 92,
67
de préférence au moins l'une parmi : 1 à 46 et 73 à 86
Au moins une parmi : 1 à 67 et 69 à 92,
68
de préférence au moins l'une parmi : 1 à 46 et 73 à 86
Au moins une parmi : 1 à 68 et 70 à 92,
69
de préférence au moins l'une parmi : 1 à 46 et 73 à 86
Au moins une parmi : 1 à 69 et 71 à 92,
70
de préférence au moins l'une parmi : 1 à 46 et 73 à 86
Au moins une parmi : 1 à 70 et 72 à 92,
71
de préférence au moins l'une parmi : 1 à 46 et 73 à 86
Au moins une parmi : 1 à 71 et 73 à 92,
72
de préférence au moins l'une parmi : 1 à 46 et 73 à 86
Au moins une parmi : 1 à 72 et 74 à 92,
73
de préférence au moins l'une parmi : 10 à 28,47 à 72 et 87 à 92
Au moins une parmi : 1 à 73 et 75 à 92,
74
de préférence au moins l'une parmi : 10 à 28,47 à 72 et 87 à 92
Au moins une parmi : 1 à 74 et 76 à 92,
75
de préférence au moins l'une parmi : 10 à 28,47 à 72 et 87 à 92
Au moins une parmi : 1 à 75 et 77 à 92,
76
de préférence au moins l'une parmi : 10 à 28,47 à 72 et 87 à 92
Au moins une parmi : 1 à 76 et 78 à 92,
77
de préférence au moins l'une parmi : 10 à 28,47 à 72 et 87 à 92
Au moins une parmi : 1 à 77 et 79 à 92,
78
de préférence au moins l'une parmi : 10 à 28,47 à 72 et 87 à 92 Au moins une parmi : 1 à 78 et 80 à 92,
79
de préférence au moins l'une parmi : 10 à 28,47 à 72 et 87 à 92
Au moins une parmi : 1 à 79 et 81 à 92,
80
de préférence au moins l'une parmi : 10 à 28,47 à 72 et 87 à 92
Au moins une parmi : 1 à 80 et 82 à 92,
81
de préférence au moins l'une parmi : 10 à 28,47 à 72 et 87 à 92
Au moins une parmi : 1 à 81 et 83 à 92,
82
de préférence au moins l'une parmi : 10 à 28,47 à 72 et 87 à 92
Au moins une parmi : 1 à 82 et 84 à 92,
83
de préférence au moins l'une parmi : 10 à 28,47 à 72 et 87 à 92
Au moins une parmi : 1 à 83 et 85 à 92,
84
de préférence au moins l'une parmi : 10 à 28,47 à 72 et 87 à 92
Au moins une parmi : 1 à 84 et 86 à 92,
85
de préférence au moins l'une parmi : 10 à 28,47 à 72 et 87 à 92
Au moins une parmi : 1 à 85 et 87 à 92,
86
de préférence au moins l'une parmi : 10 à 28,47 à 72 et 87 à 92
Au moins une parmi : 1 à 86 et 88 à 92,
87
de préférence au moins l'une parmi : 1 à 46 et 73 à 86
Au moins une parmi : 1 à 87 et 89 à 92,
88
de préférence au moins l'une parmi : 1 à 46 et 73 à 86
Au moins une parmi : 1 à 88 et 90 à 92,
89
de préférence au moins l'une parmi : 1 à 46 et 73 à 86
Au moins une parmi : 1 à 89, 91 et 92,
90
de préférence au moins l'une parmi : 1 à 46 et 73 à 86
Au moins une parmi : 1 à 90 et 92,
91
de préférence au moins l'une parmi : 1 à 46 et 73 à 86
Au moins une parmi : 1 à 91 ,
92
de préférence au moins l'une parmi : 1 à 46 et 73 à 86
La composition vaccinale selon l'invention peut comprendre, en plus de n'importe laquelle des combinaisons de deux polypeptides présentées dans le tableau 2 ci-dessus, au moins un troisième polypeptide différent de ceux de la combinaison, voire un quatrième polypeptide différent, etc. De préférence, la composition vaccinale comprend une combinaison de 2, 3, 4, 5, 6 ou 7 polypeptides différents.
Les polypeptides utilisables dans la composition vaccinale selon l'invention ne sont pas limités aux polypeptides consistant en la séquence SEQ ID NO: 1 à 92. L'homme du métier comprend bien que des séquences présentant une homologie ou une identité avec ces séquences peuvent également être utilisées, de manière équivalente, dans la composition vaccinale selon l'invention, dès lors qu'elles présentent le même effet que les polypeptides de séquence SEQ ID NO: 1 à 92, à savoir un effet immunogène, utile dans la prévention de la maladie de Lyme. L'homme du métier est à même d'identifier des séquences homologues à partir des séquences des polypeptides utilisables dans la composition vaccinale selon l'invention. Par exemple, une séquence utilisée peut présenter une homologie ou une identité supérieure à 80% avec une séquence décrite dans le Tableau 1 , par exemple une identité ou une homologie supérieure à 85%, ou à 90%, ou à 95%, ou à 99% avec une séquence décrite dans le Tableau 1 . Différentes méthodes, bien connues de T'homme du métier, peuvent être utilisées pour déterminer l'homologie entre plusieurs séquences. Il peut s'agir par exemple de la méthode BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) décrite dans le document Altschul, S.F. et al., J. Mol. Biol. 1990 [27].
Dans le Tableau 1 ci-dessus, les séquences de polypeptide figurant sur une même ligne représentent une même protéine dont le nom est indiqué dans la colonne de gauche. « n/a » signifie que le nom de la protéine en question n'a pas été identifié ou n'est pas encore connu.
Bien que les polypeptides figurant sur une même ligne représentent une même protéine, leurs séquences d'acides aminés ne sont pas strictement identiques. Cela peut être dû aux mutations possibles qui se sont produites distinctement chez les différentes espèces du genre Borrelia. A titre d'exemples, les séquences SEQ ID NO: 10, 1 1 et 12, isolées des espèces Borrelia burgdorferi ss, Borrelia afzelii et Borrelia garinii respectivement, représentent une même protéine.
Des polypeptides utilisables dans la composition vaccinale selon l'invention peuvent être propres à une espèce de Borrelia donnée, ou communes à deux ou trois espèces de Borrelia choisies parmi Borrelia burgdorferi ss, Borrelia afzelii et Borrelia garinii. Par exemple :
- les polypeptides de séquence SEQ ID NO: 1 à 9 sont des protéines propres au clone virulent de Borrelia burgdorferi ss ;
- les polypeptides de séquence SEQ ID NO: 10 à 18 sont des protéines communes aux clones virulents de Borrelia burgdorferi ss,
Borrelia afzelii et Borrelia garinii ; - les polypeptides de séquence SEQ ID NO: 19 à 28 sont des protéines communes aux clones virulents de Borrelia burgdorferi ss et Borrelia garinii ;
- les polypeptides de séquence SEQ ID NO: 29 à 46 sont des protéines communes aux clones virulents de Borrelia burgdorferi ss et
Borrelia afzelii ;
- les polypeptides de séquence SEQ ID NO: 47 à 72 sont des protéines communes aux deux clones virulents de Borrelia afzelii et Borrelia garinii ;
- les polypeptides de séquence SEQ ID NO: 73 à 86 sont des protéines communes à Borrelia burgdorferi ss et Borrelia afzelii ; et
- les polypeptides de séquence SEQ ID NO: 87 à 92 sont des protéines communes à Borrelia afzelii et Borrelia garinii.
Les polypeptides de séquence SEQ ID NO: 1 à 9, 13 à 18, 29 à 32, 37, 38, 51 , 52, 57, 58, 71 , 72 et 87 à 92 sont des protéines membranaires de Borrelia.
Avantageusement, lorsque la composition comprend une combinaison de polypeptides de séquence SEQ ID NO: 1 à 92, les polypeptides sont des polypeptides de séquences différentes. Avantageusement encore, lorsque la composition comprend une combinaison de polypeptides de séquence SEQ ID NO: 1 à 92, les polypeptides représentent des protéines différentes.
Avantageusement, lorsque la composition comprend une combinaison de polypeptides de séquence SEQ ID NO: 1 à 92, les polypeptides peuvent être des protéines dont l'association permet d'obtenir une immunisation simultanément contre deux espèces ou les trois espèces Borrelia burgdorferi ss, Borrelia afzelii et Borrelia garinii. En d'autres termes, de manière avantageuse, la composition selon l'invention comprend une protéine commune aux trois espèces précitées ou un mélange de plusieurs protéines, par exemple, 2, 3 ou 4 protéines, voire plus, couvrant ces trois espèces. Ce mode de réalisation permet de fournir des compositions vaccinales universelles vis-à-vis des populations de Borrelia. Selon un mode de réalisation particulier, la composition vaccinale selon l'invention peut comprendre au moins un polypeptide de Borrelia burgdorferi ss, Borrelia afzelii ou Borrelia garinii choisi parmi SEQ ID NO: 2, 7 à 15, 19, 20, 25, 26, 29, 30, 33 à 36, 41 à 50, 53, 54, 57 à 72 et 85 à 92. De préférence, l'au moins un polypeptide est choisi parmi SEQ ID NO: 10 à 15.
Dans ce mode de réalisation, la composition vaccinale peut comprendre en outre au moins un autre polypeptide de Borrelia burgdorferi ss, Borrelia afzelii ou Borrelia garinii choisi parmi SEQ ID NO: 1 , 3 à 6, 16 à 18, 21 à 24, 27, 28, 31 , 32, 37 à 40, 51 , 52, 55, 56 et 73 à 84.
En outre, dans ce mode de réalisation, la composition vaccinale peut comprendre en outre, au moins un autre polypeptide de Borrelia burgdorferi, Borrelia afzelii ou Borrelia garinii choisi dans les groupes (c1 ), (c2) et (c3),
ledit groupe (d ) comprenant SEQ ID NO: 19 à 28,
ledit groupe (c2) comprenant SEQ ID NO: 29 à 46 et 73 à 86, ledit groupe (c3) comprenant SEQ ID NO: 47 à 72 et 87 à 92, à condition que si ladite au moins un polypeptide choisi parmi SEQ ID
NO: 2, 7 à 15, 19, 20, 25, 26, 29, 30, 33 à 36, 41 à 50, 53, 54, 57 à 72 et
85 à 92 :
- est compris dans l'un des groupes (c1 ), (c2) ou (c3), ledit au moins un autre polypeptide est compris dans un groupe (c1 ), (c2) ou (c3) différent, ou
- est SEQ ID NO: 2, 7, 8 ou 9, ledit au moins un autre polypeptide est compris dans le groupe (c3), ou est SEQ ID NO: 10, 1 1 , 12, 13, 14, ou 15, ledit au moins un autre polypeptide est compris dans n'importe lequel des groupes (c1 ), (c2) et (c3). Selon un autre mode de réalisation, la composition vaccinale comprenant au moins un polypeptide de Borrelia burgdorferi ss, choisi parmi les séquences SEQ ID NO : 10, 2, 8, 9, 13, 19, 25, 29, 33, 35, 43, 45 et 85. De préférence, l'au moins un polypeptide est choisi parmi SEQ ID NO: 10.
Dans cet autre mode de réalisation, la composition vaccinale peut comprendre en outre au moins un autre polypeptide de Borrelia burgdorferi ss, Borrelia afzelii ou Borrelia garinii choisi parmi SEQ ID NO: 1 , 3 à 7, 1 1 , 12, 14 à 18, 20 à 24, 26 à 28, 30 à 32, 34, 36 à 42, 44, 46 à 84 et 86 à 92.
En outre, dans cet autre mode de réalisation, la composition vaccinale peut comprendre en outre, au moins un autre polypeptide de Borrelia burgdorferi, Borrelia afzelii ou Borrelia garinii choisi dans les groupes (c1 ), (c2) et (c3),
ledit groupe (d ) comprenant SEQ ID NO: 19 à 28,
ledit groupe (c2) comprenant SEQ ID NO: 29 à 46 et 73 à 86, ledit groupe (c3) comprenant SEQ ID NO: 47 à 72 et 87 à 92, à condition que si ladite au moins un polypeptide choisi parmi SEQ ID NO: 10, 2, 8, 9, 13, 19, 25, 29, 33, 35, 43, 45 et 85 :
- est SEQ ID NO: 19 et 25, ledit au moins un autre polypeptide est compris dans le groupe (c2) ou (c3), ou
- est SEQ ID NO: 29, 33, 35, 43, 45 ou 85, ledit au moins un autre polypeptide est compris dans le groupe (c1 ) ou (c3), ou
- est SEQ ID NO: 2, 8 ou 9, ledit au moins un autre polypeptide est compris dans le groupe (c3), ou
- est SEQ ID NO: 10 ou 13 ledit au moins un autre polypeptide est compris dans un n'importe lequel des groupes (c1 ), (c2) et (c3). Avantageusement, la composition de l'invention peut comprendre un véhicule pharmaceutiquement acceptable
On entend dans la présente par « véhicule pharmaceutiquement acceptable » toute substance permettant de diluer ou transporter au moins un polypeptide de la composition vaccinale selon l'invention. De préférence, le véhicule pharmaceutiquement acceptable n'affecte pas l'efficacité du polypeptide. Le véhicule pharmaceutiquement acceptable peut, par exemple, être une solution aqueuse ou une émulsion.
Lorsque le véhicule pharmaceutiquement acceptable est une solution aqueuse, cela peut être, par exemple, une quelconque des solutions présentées dans le document Heitz et al., 2009 (Twenty years of cell-penetrating peptides: from molecular mechanisms to therapeutics. Heitz F et al., Br J Pharmacol. 2009 May;157(2): 195-206 [10]) ou dans le document Wehrlé P. (Wehrlé P., Pharmacie galénique, Formulation et technologie pharmaceutiques, 2007 [11]).
Lorsque le véhicule pharmaceutiquement acceptable est une émulsion, cela peut être une émulsion eau dans l'huile, huile dans l'eau, eau dans l'huile dans l'eau (Wehrlé P. [11]). La composition vaccinale selon l'invention peut comprendre un adjuvant. On entend par « adjuvant » toute substance capable de faciliter et d'amplifier la réponse immunitaire à l'au moins un polypeptide de la composition vaccinale selon l'invention. Il peut s'agir par exemple de tout adjuvant connu de l'homme du métier pour l'administration de polypeptides.
Par exemple, l'adjuvant peut être un adjuvant induisant une réponse humorale et/ou une réponse cellulaire. A titre d'exemples non limitatifs, l'adjuvant peut être choisi parmi l'hydroxyde d'alumine, les extraits de saponine, les complexes de stimulation immunitaire (aussi appelés "ISCOM"), l'inuline, les agonistes des récepteurs de type Toll
(TLR), les complexes Cytosine Phosphate Guanine (CPG), le Chitosan ou encore les acides mycoliques. Il peut s'agir également de la saponine (Roatt et al., 2012 [14]) ou de l'hydroxide d'alumine (Livey et al., 201 1
[15] ; Wressnigg et al. 2013 [16]). La composition vaccinale selon la présente invention peut être utilisée seule ou en combinaison avec tout traitement connu permettant de prévenir la maladie de Lyme et/ou une ou plusieurs pathologie(s) distincte(s) de la maladie de Lyme. A titre d'exemple, la ou les pathologie(s) distincte(s) de la maladie de Lyme peu(ven)t être choisie(s) dans le groupe comprenant la leptospirose, la rage, la maladie de carré, la parvovirose et les infections par Bordetella.
Selon l'invention, on entend par « utilisé en combinaison », une utilisation de la composition vaccinale selon l'invention de façon conjointe ou simultanée, concomitante, ou successive, avec tout traitement connu permettant de prévenir la maladie de Lyme. Le mode d'administration peut être identique ou différent suivant les molécules co-administrées.
On entend par « conjointe ou simultanée », l'utilisation de la composition selon l'invention avec tout traitement connu permettant de prévenir la maladie de Lyme dans une seule composition les contenant.
On entend par « concomitante », l'utilisation séparée de la composition vaccinale selon l'invention et de tout traitement connu permettant de prévenir la maladie de Lyme, par des voies d'administration identiques ou différentes durant la même période d'administration.
On entend par « successive », l'utilisation séparée de la composition vaccinale selon l'invention et de tout traitement connu permettant de prévenir la maladie de Lyme, par des voies d'administration identiques ou différentes durant des périodes d'administration différentes.
On entend par « période d'administration », la durée pendant laquelle un traitement est administré. Il peut, par exemple s'agir de plusieurs jours, par exemple deux jours, trois jours, quatre jours, etc., par exemple une ou plusieurs semaines, par exemple une semaine, deux semaines, trois semaines, etc., par exemple un ou plusieurs mois, par exemple un mois, deux mois, trois mois, etc., par exemple une ou plusieurs années, par exemple un an, deux ans, trois ans, etc.. La présente invention se rapporte également à une composition vaccinale selon l'invention, pour utilisation comme médicament.
La présente invention se rapporte également à une composition vaccinale selon l'invention, pour utilisation dans la prévention de la maladie de Lyme.
La composition vaccinale selon l'invention peut donc être utilisée pour la fabrication d'un médicament, en particulier un médicament destiné à prévenir la maladie de Lyme.
La composition vaccinale pour utilisation comme médicament ou pour utilisation dans la prévention de la maladie de Lyme peut être destiné à tout mammifère susceptible de contracter ou ayant contracté la maladie de Lyme. En particulier, elle peut être destinée à l'Homme ou au chien, au cheval, aux bovins ou à d'autres ruminants. De préférence, la composition vaccinale selon l'invention est destinée à la prévention de la maladie de Lyme chez le chien.
La composition vaccinale selon l'invention, utilisée comme médicament, peut être sous toute forme d'administration appropriée. Il peut s'agir d'une des formes connues par l'homme du métier pour administrer une molécule active qui est un polypeptide (Peppas NA, Carr DA, Chemical engineering Science, 64, 4553-4565 (2009) [12] ; Morishita M,
Peppas NA, Drug Discovery Today, 1 1 , 905-910 (2006) [13]).
La composition vaccinale selon la présente invention peut, par exemple, être destinée à une administration par injection.
Ainsi, la composition vaccinale selon l'invention peut être conditionnée sous toute forme connue de l'homme du métier en vue d'être administrée par injection. Il peut s'agir par exemple d'un flacon ou d'une ampoule.
Par exemple, l'injection peut être une injection intramusculaire, intradermique ou sous-cutanée. Selon un mode de réalisation, l'injection est réalisée par voie intradermique. Selon un autre mode de réalisation avantageux, l'injection est réalisée par voie intramusculaire ou sous- cutanée.
La composition vaccinale de la présente invention peut être administrée comme médicament, de préférence en quantité suffisante pour prévenir la maladie de Lyme, en particulier pour prévenir celle chez le chien. Par exemple, les polypeptides de la composition vaccinale selon l'invention peuvent être inoculés à des doses comprises entre 1 et 500 g, de préférence entre 10 à 100 g (Wressnigg ef a/.,2013 [16]). La synthèse des polypeptides utilisables dans la composition vaccinale selon la présente invention peut être réalisée par tout procédé connu de l'homme du métier. Il peut s'agir par exemple d'une synthèse par génie génétique.
Lorsque la synthèse des polypeptides de la composition vaccinale selon l'invention est réalisée par génie génétique, on peut par exemple construire un polypeptide de grande taille comprenant le polypeptide de la composition vaccinale de la présente invention et le digérer avec des enzymes de restriction afin de recueillir ledit polypeptide de la composition vaccinale selon l'invention. On peut par exemple utiliser le protocole décrit dans F. Cordier-Ochsenbein et al. J. Mol. Biol. 279,1 177-1 185 [17].
La composition vaccinale selon l'invention peut être produite selon toute méthode bien connue de l'homme du métier. Il peut s'agir par exemple d'un simple mélange des différents constituants de la composition vaccinale. Le document de Ramamoorthi et Smooker (2009) [18] décrit un procédé de fabrication de composition vaccinale utilisable dans le cadre de la présente invention. Ainsi, la présente invention fournit des solutions efficaces pour la prévention de la maladie de Lyme.
D'autres avantages pourront encore apparaître à l'homme du métier à la lecture des exemples ci-dessous donnés à titre illustratif et non limitatif.
Brève description des figures
- La figure 1 représente la quantification par PCR de B. burgdorferi, souche native 297 et de son clone virulent 297c4, dans la peau de souris, par rapport au temps après inoculation de la souche. « N Fia / 104 GAPDH » signifie nombre de flagelline par 104 de Glyceraldehyde 3-phosphate déshydrogénase.
- La figure 2 représente un profil d'expression par RT-PCR d'une protéine commune aux trois espèces de Borrelia : B. burgdorferi ss, B. afzelii et B. garinii, à savoir BB0566 (SEQ ID NO: 10) dans la peau de souris au cours de la transmission précoce de la bactérie.
EXEMPLES
Exemple 1 : Stratégie d'identification de candidats vaccins de Borrelia pour la maladie de Lyme
Les inventeurs ont développé une approche protéomique afin d'identifier et sélectionner des polypeptides efficaces pour la prévention de la maladie de Lyme.
Ils ont sélectionné par clonage en milieu solide (De Martino et al., 2006 [19]), des souches de Borrelia burgdorferi ss, Borrelia afzelii et Borrelia garinii virulentes et non virulentes sur la souris. Une stratégie Gel- LC-MS/MS a été utilisée pour comparer les protéines dans chaque culture de Borrelia. 1.1 Matériel et méthodes
1 .1 .1 Souris, souches bactériennes et conditions de culture
Des souris C3H/HeN âgées de trois à quatre semaines ont été utilisées (Charles River Laboratories, L'ArbresIe, France).
Trois souches de Borrelia burgdorferi sensu lato ont été analysées :
- Borrelia burgdorferi ss, souche 297 (A. Steere, USA), isolé du liquide céphalorachidien (LCR) d'un patient,
- B. garinii, souche PBi (B. Wilske, Allemagne) isolé du LCR d'un patient, - B. afzelii, souche 163/98 (E. Ruzic-Sabljic, Slovénie) isolé du LCR d'un patient.
Pour chaque espèce, les bactéries ont été clonées sur BSK-S. Les clones bactériens ont ensuite été cultivés sur milieu BSK-H (Sigma) et testé sur un modèle de souris selon le protocole décrit dans De Martino et al. [19]. Les clones bactériens ont été sélectionnés pour leur virulence chez la souris. Toutes les souches ont été cultivées en milieu BSK-H complet (Sigma) à 33°C et utilisées à passage bas (<7). Les Borrelia ont été comptées et la viabilité a été vérifiée en microscopie à fond noir.
1 .1 .2 Identification de protéines, après digestion à la trypsine et nanoLC- MS/MS
Pour chaque souche et son clone, les protéines ont été extraites par un tampon de Laemmli [20]. Après sonication et centrifugation, le culot a été éliminé et la concentration en protéines du surnageant a été déterminée. Les protéines (75 g) ont subi une étape de préfractionnement sur gel d'électrophorèse monodimensionnel (électrophorèse) SDS-PAGE
(12% acrylamide). Les pistes résultantes ont été colorées avec du bleu de Coomassie [21]. Des bandes de gel de 2 mm ont été excisées manuellement et de manière systématique. La digestion des protéines contenues dans le gel a été effectuée comme décrit dans Villiers et al.
[22], et les peptides (trypsiques) obtenus ont été extraits par l'addition de
35 μΙ de 60% (v/v) d'acétonitrile (ACN) et de 0,1 % (v/v) d'HCO2H. L'analyse nanoLC-MS/MS a été réalisée en utilisant un système de type nanoLC-Chip/MS (Agilent Technologies, Palo Alto, CA) couplé à un piège à ions amaZon (Bruker, Bremen, Allemagne). Le système chromatographique était composé d'une pré-colonne (40 nL, 5 μιτι) et d'une colonne (150 mm x 75 μιτι, 5 μιτι) comportant la même phase stationnaire Zorbax 300SB-C18. Le système de solvant se composait de 2% d'ACN, 0,1 % HCO2H dans l'eau (solvant A) et de 2% d'eau, 0,1 % HCO2H dans de l'ACN (solvant B). 1 μΙ d'extrait peptidique (1/20 du volume total) a été chargé en duplicat sur la pré-colonne (dans la colonne d'enrichissement) à un débit de chargement de (une vitesse d'écoulement fixée à) 3,75 μΙ/min avec le solvant A (à 100% de solvant A). L'élution a été effectuée à un débit de 300 nl/min par application d'un gradient linéaire de 8-40% en solvant B pendant 30 minutes suivi d'une étape de 4 min à 70% de solvant B avant le reconditionnement de la colonne à 8% de solvant B. Les paramètres d'acquisition des spectres MS et MS/MS sont les suivants : température de la source réglée à 145°C et débit de gaz à 4 L/min. La tension appliquée sur l'aiguille du sprayer (de nanoélectronébulisation) a été réglée à -1900 V. L'acquisition des spectres MS a été réalisée en mode (ions) positif sur une gamme de masses de 250 à 1500 m/z à une vitesse de balayage de 8100 m/z par s. Le nombre maximum d'ions (contrôle de la charge ionique) et le temps maximum d'accumulation ont été respectivement fixés à 200 000 et 200 ms, avec une moyenne sur deux scans. L'acquisition des spectres MS/MS a été réalisée en sélectionnant séquentiellement les 8 ions précurseurs les plus intenses (abondantes), avec une préférence pour les ions dichargés. Le seuil de sélection d'un ion pour la fragmentation (seuil absolu) a été fixé à 100 000. La fragmentation a été réalisée en utilisant de l'argon comme gaz de collision. Les ions sélectionnés ont été exclus pendant 0.6 min. Les spectres MS/MS ont été réalisés sur une gamme de masse allant de 100 à 2000 m/z. Le nombre d'ions maximum accumulables en MS/MS (contrôle de la charge ionique) a été fixé à 400 000, avec une moyenne sur 5 scans. Le système complet a été piloté par le logiciel Hystar 3.2 (Bruker).
1 .1 .3 Analyse des données
Les données brutes des spectres MS et MS/MS (données de masse collectées pendant la nanoLC-MS/MS) ont été traitées, transformées en fichiers ".mgf avec le logiciel DataAnalysis 4.0 (Bruker) et interprétées en utilisant les algorithmes MASCOT 2.4.3 (Matrix Science, Londres, Royaume-Uni) [23] et OMSSA 2.1 .7 (Open Mass Spectrometry Search Algorithm, Maryland, USA) [24]. Les recherches ont été effectuées sans aucune restriction de poids moléculaire ou de point isoélectrique dans des banques de données de protéines composées respectivement de séquences (de protéines) de Borrelia burgdorferi ss B31 , Borrelia garinii PBi et Borrelia afzelii PKo téléchargées sur la banque de données non redondante du Centre National de l'Information en Biotechnologies (NCBInr, le 16 août 2012). Les protéines contaminantes connues comme la kératine humaine et la trypsine, ont été ajoutées à chaque banque de données et liées avec des copies inversées de toutes les séquences (B. burgdorferi ss B31 : 1758 entrées; B. garinii PBi : 1720 entrées; B. afzelii PKo : 2157 entrées). Les banques de données B. burgdorferi ss B31 et B. afzelii PKo ont été utilisées car les souches B. burgdorferi ss 297 et B. afzelii 163 respectivement n'ont pas encore été séquencées. La trypsine a été choisie comme enzyme. La tolérance sur la masse des précurseurs et des fragments a été fixée à 0,5 Da. Un maximum de 2 clivages manqués a été accepté et quelques modifications pos-traductionnelles ont été prises en compte : carbamidométhylation (C), acétylation N-terminale, oxydation
(M). Les résultats des algorithmes MASCOT et OMSSA ont été indépendamment chargés dans le logiciel Scaffold (Proteome Software, Portland, OR). Le taux de faux positifs a été fixé à 1 % avec un minimum d'un peptide par protéine.
Le nombre de spectres attribués à chaque protéine au sein de chaque duplicat a été utilisé afin de mettre en évidence des protéines sur- exprimées dans les clones virulents. Le test bêta-binomial [25] a été mis en œuvre en R pour déterminer la sur-expression des protéines (p < 0,05) dans chaque clone virulent par rapport à la souche de type sauvage. Le test a été effectué indépendamment pour chacun des moteurs de recherche car les identifications spectrales sont dépendantes des algorithmes.
1.2 Résultats
1 .2.1 Reproductibilité de l'identification de protéines bactériennes selon l'injection et l'algorithme de recherche utilisé
Chaque échantillon a été analysé en duplicat. L'identification des protéines présentes dans chaque répétition a été réalisée en utilisant une combinaison des deux moteurs de recherche : Mascot et OMSSA. Ainsi, la reproductibilité des identifications a été évaluée pour les deux algorithmes de recherche. Le nombre de protéines communes aux duplicats d'injection (chevauchement) est élevé (> 90% dans la plupart des cas) et quelques protéines ont spécifiquement été identifiées dans un réplicat. Cette proportion est plus élevée chez Mascot par rapport à OMSSA. Ces identifications spécifiques pourraient s'expliquer soit par la faible quantité de ces protéines, soit par la variabilité due au mode d'acquisition dépendant des données (DDA). Afin de comparer les identifications obtenues en utilisant les moteurs de recherche, nous avons fusionné les identifications des duplicats. Pour tous les échantillons, il y a un nombre élevé (>85%) de protéines identifiées (chevauchement) à la fois par Mascot et OMSSA. Quelques protéines sont observées spécifiquement par un seul algorithme. La combinaison des moteurs de recherche mène à plus de 5% d'identifications supplémentaires.
1 .2.2 Protéines(Polvpeptides) impliquées dans la transmission bactérienne
Pour chaque espèce, les identifications obtenues par Mascot ou OMSSA ont été fusionnées et les profils protéiques des clones sauvages et des clones virulents ont été comparés par les inventeurs. Plus de 800 protéines ont été identifiées dans chaque cas et un recouvrement (chevauchement) important entre les clones sauvages et virulents a été observé : près de 90% pour B. burgdorferi ss et B. garinii et 80% pour B. afzelii. Il a ainsi été constaté, pour chaque espèce, une proportion plus importante de protéines détectées dans les clones virulents par rapport à la souche sauvage (jusqu'à 1 10 pour B. burgdorferi ss).
Par ailleurs, des protéines présentes à la fois dans le clone virulent et la souche sauvage de Borrelia mais sur-exprimées chez le clone virulent, ont été détectées. Par conséquent, une stratégie basée sur le nombre de spectres attribués à chaque protéine (de comptage spectrale) couplée à un test statistique adéquat (bêta-binomial) [25] a été utilisée pour mettre en évidence les protéines sur-exprimées dans le clone virulent par rapport à la souche sauvage (p <0,05). Des tests statistiques ont été réalisés indépendamment pour Mascot et OMSSA car le nombre de spectres assignés est généralement variable entre les deux moteurs de recherche [26]. Une protéine avec une valeur p inférieure à 0,05 à la fois pour Mascot et OMSSA a été considérée comme sur-exprimée afin de limiter le nombre de faux positifs. Le nombre de protéines sur-exprimées dépend de l'espèce considérée. 31 protéines sur-exprimées ont été détectées pour B. burgdorferi ss, 43 pour B. garinii et 72 pour B. afzelii.
Les protéines homologues chez les trois espèces ont été déterminées en utilisant le programme blastp [27] avec un seuil de E- valeur fixé à 10"30. Trois protéines sont ainsi communes aux trois espèces de Borrelia analysées et 27 protéines sont communes à au moins deux des trois espèces (voir tableau 1 ci-dessus).
Quarante protéines de Borrelia ont ainsi été retenues (représentées par les 92 séquences de polypeptides de séquence SEQ ID NO: 1 à 92 dans le tableau 1 ci-dessus) parmi plus d'un millier de protéines identifiées pour les espèces appartenant à ce genre.
- Trois protéines sont communes à tous les clones virulents et n'ont pas été détectées dans des souches sauvages : la première, BB0173 (SEQ ID NO: 13) possède un domaine du facteur de von Willebrand de type A (VWA) qui est connu pour être impliqué dans l'adhésion cellulaire. La seconde, BB0566 (SEQ ID NO: 10), possède un domaine de type « Sulfate Transporter and Anti-sigma factor antagonist » (STAS). Les facteurs sigma sont des éléments clés dans l'activation de la transcription de l'ARN polymérase (ARNP) impliquée dans la régulation de Borrelia. La troisième protéine, BB0722 (SEQ ID NO: 16), n'a pas encore été décrite dans la littérature, mais semble être une protéine associée à la membrane de la bactérie.
- D'autres protéines sont liées au noyau catalytique RNAP: l'unité β
(rpoC) et le facteur sigma-54 (RpoN). Par exemple, BAPKO0873 (SEQ ID NO: 59) contient un domaine ω d'une sous-unité d'ARN polymérase (RpoZ). BB0765 (SEQ ID NO: 27) contient un domaine III de l'ADN polymérase (DNAX). Ces protéines sont liées à la voie RpoN-RpoS qui joue un rôle important dans la pathogénicité et la survie microbienne (Radolf et al., 2012 [3]). Chez B. burgdorferi, RpoN active directement la transcription de RpoS qui, à son tour, commande l'expression des lipoprotéines membranaires associées à la virulence (OspA, OspC, protéines se liant à la décorine). Une protéine associée à un nucléotide EBfC apparaît comme un régulateur global de l'expression génique dans Borrelia. L'augmentation des niveaux EBfC influence l'expression des gènes de B. burgdorferi de l'ordre de 4,5%, y compris des gènes associés à l'infection. D'autres protéines impliquées dans la réplication de l'ADN, la recombinaison et la réparation (ADN hélicase et SBCD exonucléase), ou dans le traitement ARNt ont également été identifiées.
- Quatre protéines identifiées sont relatives aux flagelles périplasmiques : FliE, FliP, FlgE et l'ATP synthase spécifique du flagelle (FIN). La mobilité est cruciale pour le cycle infectieux de B. burgdorferi et les flagelles périplasmiques sont indispensables pour assurer une mobilité suffisante aux bactéries. Il a été montré que l'inactivation de gènes codant pour des protéines de flagelles conduit à des bactéries non mobiles. Une autre étude a montré que la perte de flagelles diminue l'infection de B. garinii.
- BB0527 (SEQ ID NO: 43) homologue à Baf (facteur accessoire Bvg) a également été identifiée. Cette protéine a un effet inhibiteur sur l'activité de la phosphatase alcaline et influe donc directement sur l'expression de la protéine de la membrane externe P66. Parmi les protéines surexprimées, la 5-methylthioadenosine/S- adenosylhomocysteine (SEQ ID NO: 87) a également été identifiée. Cette protéine fait partie intégrante du cycle de méthylation. Une étude récente a montré que l'inhibition de cette enzyme peut atténuer la virulence bactérienne.
- Plusieurs protéines identifiées sont impliquées dans le métabolisme des glucides comme les protéines liées au système phosphotransférase (PTS), ou dans la biosynthèse des lipides et du métabolisme, comme la protéine porteuse d'acyle (ACP). D'autres protéines sont hypothétiques et n'ont pas de fonction définie à ce jour.
Exemple 2 : Etude de l'inflammation cutanée chez la souris, après inoculations de différents pathotypes humains de Borrelia burgdorferi sensu stricto
La peau constitue un organe essentiel dans le développement de la borréliose de Lyme puisque Borrelia y est inoculée et s'y multiplie avant de disséminer dans l'organisme pour atteindre les organes cibles : l'articulation, le système nerveux et la peau à distance.
Différents isolais cliniques humains de B. burgdorferi ss
(pathotypes), avec différents facteurs de virulence de type RSTs (16S-23S rRNA intergenic spacer type) ont été sélectionnés. Les réponses inflammatoires au niveau cutané dans un modèle murin ont été comparées selon le protocole décrit ci-après afin de déterminer si l'immunité de la peau jouait un rôle dans l'organotropisme des souches bactériennes. La souris constitue en effet un modèle de choix pour comprendre les mécanismes pathogénicité de B. burgdorferi si [28].
2.1 Matériel et méthodes
2.1 .1 Souris et souches bactériennes
Des souris C3H/HeN âgées de trois à quatre semaines ont été utilisées (Charles River Laboratories, L'ArbresIe, France). Les souches de Borrelia burgdorferi sensu stricto ont été isolées de patients atteints de différentes manifestations cliniques: la souche PBre (RST1 ) d'un érythème migrant (EM) (lésion unique - Allemagne), la souche MR726 (RST3) d'un érythème migrant multiple (Etats-Unis), la souche 1808/03 (RST1 ) de liquide céphalo-rachidien (Slovénie) et la souche 297 (RST2) de liquide céphalo-rachidien également (Etats-Unis). Le clone Borrelia c297/4 a été sélectionné par culture sur milieu BSK solide [19]. Toutes les souches ont été cultivées en BSK-H milieu complet (Sigma) à 33°C et utilisées à passage bas (<7). Les Borrelia ont été comptées et la viabilité a été vérifiée en microscopie à fond noir.
2.1 .2 Suivi de l'infection de la souris
Les souris ont été infectées avec 103 spirochètes dans 0,1 ml de milieu BSK par voie intradermique dans la région dorso-lombaire. Les souris témoins ont été injectées avec un volume égal de milieu BSK stérile et maintenues dans les mêmes conditions que les animaux infectés. Évaluation de l'arthrite a été réalisée toutes les semaines en mesurant l'épaisseur des deux articulations tibio-tarsiennes avec un pied à coulisse métrique. Des mesures conjointes ont fourni une indication de la gravité de l'arthrite. La sérologie a été réalisée comme décrit dans Kern et al. [29].
À différents moments après le début de l'expérience (Oh, 5h, 24h, 3j, 5j, 7j, 15j et 30j après l'infection) les souris ont été tuées par surdose de gaz isoflurane. Environ 1 cm de peau a été recueilli sur le site de l'inoculation et stockées dans du Trizol (marque déposée) (Invitrogen).
L'oreille, la base du cœur, la vessie et les articulations tibio-tarsiennes de chaque souris ont été recueillies de manière aseptique et divisées en deux parties, pour la PCR et la culture de Borrelia. Les organes des souris non infectées ont été collectés dans les mêmes conditions que les souris positives.
2.1 .3 Détection de B. burgdorferi dans les organes de souris
Pour la détection des spirochètes par culture, les organes prélevés ont été placés dans 6 ml de milieu BSK-H contenant 30 g de rifampicine (BioRad). Les tubes ont été maintenus à 33 °C, et la présence de spirochètes a été examinée toutes les semaines en microscopie à fond noir.
Pour la PCR, l'ADN a été extrait des organes de chaque souris sur un système MagNA Pure (Roche Diagnostics, France), en utilisant un kit d'isolation MagNA Pure LC large-volume après lyse externe. Le cœur, la vessie, l'oreille et la peau ont été placés dans 500 μΙ de tampon de lyse contenant de la protéinase K. D'autres échantillons ont été traités avec une lyse externe par la collagénase A, puis la protéinase K. Tous les échantillons d'ADN ont finalement été élués dans 100 μΙ de tampon d'élution. Dix μί d'ADN de Borrelia ont été utilisés comme témoin positif pour la détection. L'amplification qualitative a été effectuée comme décrit dans Woods et al. [30]., en ciblant le gène de la flagelline.
2.1 .4 Quantification de la charge de spirochètes et des gènes inflammatoires de la peau de la souris
Sur le site d'inoculation, la quantification du gène de la flagelline spécifique de B. burgdorferi a été réalisée sur un système LightCycler (Roche Diagnostics, France). Les amorces utilisées pour amplifier le gène fia étaient celles décrites dans Kern et al. [29].
Pour mesurer l'inflammation au site d'inoculation, l'ARN total a été extrait à partir de 10 mg de peau de souris en utilisant le réactif Trizol selon les indications du fabricant (Invitrogen). Les échantillons ont été traités par DNAse (Ambion, USA) puis un premier brin d'ADNc a été synthétisé à partir de 1 g d'ARN total en utilisant la transcriptase inverse SuperScript II (Invitrogen Life Technologies). La quantification de gapdh a été réalisée comme étalon interne. Les niveaux d'expression relatifs ont été calculés en utilisant un animal infecté comme calibrateur. L'amplification et la détection ont été réalisées avec un système ABI 7000 avec le profil thermique ci- après: 95 °C pendant 10 minutes, 50 cycles de 95 °C pendant 15 s, à 60 °C pendant 1 min. Les amorces utilisées pour tous les gènes étudiés sont décrites dans Kern et al. [29].
2.1 .5 Comparaison du profil protéique de la souche B. buradorferi 297 , de la souche de type sauvage et du clone virulent c297/4
Les cultures de B. burgdorferi 297, de la souche sauvage et du clone virulent c297/4, ont été mis en suspension dans du tampon de Laemmli [20]. Le protocole présenté aux exemples 1 .1 .2 et 1 .1 .3 ci-dessus a ensuite été appliqué.
2.1 .6 Dynamique des gènes de B. buradorferi 297. de la souche de type sauvage et du clone virulent c297/4, dans la peau de souris au site d'inoculation
À différents temps (Oh, 5h, 24h, 3j, 5j, 7j, 15j et 30j après l'infection), des échantillons de peau ont été prélevés chez chaque souris au site d'inoculation. L'ARN total a été purifié en utilisant le réactif Trizol selon les instructions du fabricant. La concentration et la pureté des ARN extraits ont été déterminées par mesure de la densité optique à A260 et A280. Les échantillons ont ensuite été traités avec de la gDNAse (QIAGEN) afin d'éliminer la contamination par de l'ADN. Les ARN totaux extraits ont été soumises à la Quantiscript Reverse Transcription (QIAGEN) pour produire l'ADNc. L'ADNc a été utilisé pour quantifier les gènes ospC et bbk32. Pour B. burgdorferi C297/4, les gènes sélectionnés correspondant à des protéines de l'enveloppe cellulaire ont été retenus pour la RT-PCR. Les niveaux d'expression relatifs ont été calculés en utilisant la méthode AACt avec la flagellin comme standard interne. L'amplification et la détection ont été réalisées avec un système ABI 7500 avec le profil thermique ci-après: 95 °C pendant 10 minutes, 50 cycles de 95 °C pendant 15 s, à 50 °C pendant 30 s et 60 °C pendant 1 min. Chaque condition d'amplification a été comparée au jour 3 pour la quantification relative. Les facteurs de corrélation ont été calculés en comparant l'amplification d'ADNc de chaque point de cinétique de la souche native à l'amplification d'ADNc de chaque point du clone hypervirulent. Ensuite, la courbe obtenue pour le clone, a été normalisée par ces facteurs pour obtenir une seconde courbe, représentative de la souche sauvage, et quantitativement comparable au clone.
2.1 .7 Analyse statistique
Chaque expérience a été réalisée au moins trois fois. Pour chacune des RT-PCR, au moins deux extractions ont été réalisées pour chaque souris dans chaque expérience, avec deux à trois souris pour chaque point. 2.2 Résultats
2.2.1 Transmission et diffusion des différents pathotypes de B. buradorferi ss chez la souris
Toutes les souches étudiées ont montré une tendance similaire de diffusion. Borrelia a été détectée au jour 3 par PCR dans la peau, sur le site d'inoculation, pour toutes les souches. Elles ont diffusé rapidement dans l'articulation, où elles ont d'abord été détectées au jour 5 ou 7, puis vers le cœur et la vessie au jour 5, 7 ou 15, et la dissémination la plus lente s'est produite dans l'oreille (peau à distance du site d'inoculation),. Le pathotype PBre, isolé de l'érythème migrant (EM) a diffusé plus lentement vers le cœur et la vessie, par rapport aux autres. En ELISA, toutes les souris se sont positivées aux antigènes de Borrelia 15 jours après l'inoculation bactérienne.
2.2.2 Quantification des pathotypes de Borrelia et mesure de l'inflammation au site d'inoculation La charge bactérienne de la peau a été mesurée. Toutes les souches se sont multipliées de façon intensive au jour 7, mais sans différence significative observée entre les souches testées.
Le profil inflammatoire dans la peau des souris a été comparé pour ces différentes souches de B. burgdorferi ss. Les peptides antimicrobiens (AMPs), marqueurs de l'immunité innée des epithelia, ont été mesurés. La souche PBre (EM) a induit une quantité significative de cathelicidine avec un pic au jour 3. La souche MR726 (MEM) a induit fortement la défensine mBD-3. La souche 297 de type sauvage (CSF) a présenté un pic de mBD- 3 à 24h tandis que la souche 1808/03 (CSF) a induit une quantité négligeable de l'ensemble des trois AMPs testés. L'induction de molécules pro-inflammatoires supplémentaires a ensuite été mesurée: TNF-α, IL-6, IL-22 et la chimiokine MCP-1 . Pour chacune d'eux, un pic d'induction de TNF-α et/ou de MCP-1 a été observé au jour 7. La souche MR726 isolée d'une lésion du MEM, a induit le profil inflammatoire plus fort au niveau de la peau de souris avec un pic de MCP-1 (150 fois) au jour 7.
2.2.3 Analyse spécifique de l'inflammation induite par B. burgdorferi ss 297 souche sauvage et son clone hypervirulent
L'infection à Borrelia pourrait être initiée par une population hétérogène de Borrelia chez l'hôte vertébré. Un clone C297/4 de B. burgdorferi ss 297 a été sélectionné au laboratoire pour sa diffusion rapide et ses manifestations neurologiques chez la souris [31]. Le clone virulent C297/4 a provoqué une inflammation de la peau avec une induction plus importante des défensines, MBD-14, et de cathelicidine par rapport à la souche sauvage. Une très forte induction de MCP-1 et d'IL-6, environ 100 fois plus induction, a été observée pour le clone C297/4 par rapport à la souche sauvage.
Les résultats de la souche 297 sauvage et du clone hypervirulent ont également été comparés chez la souris C3H/HeN. Le clone hypervirulent a diffusé plus rapidement vers l'articulation, alors que la diffusion aux autres organes était semblable à celui de la souche sauvage. La quantification de la charge bactérienne dans les tissus a confirmé la multiplication intense se produisant dans la peau au jour 7 quelle que soit la souche utilisée, mais aucune différence significative n'a été observée entre le clone hypervirulent et la souche sauvage 297.
2.2.4 Caractérisation protéomique des souches B. buradorferi ss, 297 sauvage et du clone hvpervirulent
Le protocole présenté aux exemples 1 .2.1 et 1 .2.2 ci-dessus a été appliqué.
Un total de 887 protéines ont été identifiées avec 848 protéines c297/4 et 777 protéines dans la souche de type sauvage. Nous avons observé un chevauchement de 738 protéines qui représente 83% du nombre total. 1 10 protéines sont spécifiques du clone hypervirulent.
2.2.5 Expression comparative des protéines spécifiques des clones de type sauvage et hvpervirulent de B. buradorferi 297 dans la peau de la souris par RT-PCR.
La cinétique d'expression d'OspC et BBK32, deux protéines importantes dans la transmission de Borrelia a été réalisée pour les souches de type sauvage et c297/4. Les deux souches présentent un premier pic d'expression d'OspC au jour 5, tandis qu'un pic d'expression de BBK32 a été observé au jour 7. Puis, des protéines de surface de Borrelia ont été sélectionnées parmi les 1 10 protéines spécifiques du clone hypervirulent, et leur expression a été suivie au cours de l'inflammation cutanée chez la souris C3H/HeN. Trois gènes sont fortement exprimés dans les deux souches, bb0304, bb0213 et bb0347 avec un pic d'expression au jour 5 pour le clone hypervirulent et au jour 7 pour la souche sauvage.
Exemple 3 : Sélection des candidats vaccinaux et détermination de l'effet immunogène
Les différentes protéines sont testées dans un modèle murin
C3H/HeN afin de voir leur expression au niveau de la peau, lors de la transmission de la bactérie. En effet, l'interface cutanée semble jouer un rôle clef dans la sélection de certaines populations bactériennes (Brisson et al., 201 1 [32]). La peau des souris infectées par voie intradermique est prélevée à 3, 5, 7 et 15 jours. Après design des amorces spécifiques pour chacune des protéines, la technique de RT-PCR est utilisée pour suivre l'expression de ces protéines dans la peau. Les plus exprimées dans la peau sont alors retenues. Elles sont ensuite clonées (Steere et al., 1998
[33]; Ramamoorthi et Smooker, 2009 [18] ; Livey et al., 201 1 [15]) et exprimées chez E. coll. Elles sont inoculées par voie intradermique à la souris et le taux en anticorps est mesuré par Elisa. En effet, la réponse en anticorps apparaît essentielle pour mesurer un effet protecteur lors de la borréliose de Lyme (Embers et Narasimhan, 2013 [34]). Leur effet protecteur est testé par challenge avec des Borrelia inoculées à la seringue, ou mieux avec des tiques infectées par Borrelia. Les souris vaccinées et challengées sont ensuite disséquées et leurs organes cultivés ou testés en PCR afin de mesurer l'absence de Borrelia (Kern et al., 201 1
[29]).
Cinq protéines ont été retenues pour des essais in vivo chez la souris, à savoir les trois protéines « hypothetical protein » uniquement détectées dans les clones virulents et communes aux trois espèces de Borrelia (SEQ ID NO: 10 (BB0566), 13 (BB0173) et 16 (BB0722) de Borrelia burgdorferi ss et les séquences correspondantes respectives SEQ ID NO: 1 1 (BAPKO0596), 14 (BAPKO0175) et 17 (BAPKO0766) de B. afzelii) et 12 (BG0576), 15 (BG0172) et 18 BG0744) de B. garinii)), la protéine RpoN (SEQ ID NO: 41 (BB0450) de Borrelia burgdorferi ss et la séquence correspondante SEQ ID NO: 42 (BAPKO0472) B. afzelii)) et la protéine Gnd (SEQ ID NO: 77 (BB0561 ) de Borrelia burgdorferi ss et la séquence correspondante SEQ ID NO: 42 (BAPKO0590) B. afzelii)). Parallèlement, dans les peaux de souris infectées 7 jours après l'inoculation intradermique, toutes les protéines de Borrelia exprimées dans les peaux de souris infectées ont été analysées par une approche protéomique non ciblée. En effet, 7 jours correspond à un pic de multiplication intense des bactéries après inoculation intradermique et joue donc probablement un rôle clef dans l'initiation de l'infection bactérienne (Kern et al., 201 1 [29]). La stratégie a consisté à extraire les protéines contenues dans les peaux infectées, à les préfractionner par gel d'électrophorèse puis à les identifier par chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse en tandem (stratégie Ge-LC-MS/MS).
3.1 Matériels et méthode
3.1 .1 Inoculation des bactéries et prélèvement des peaux infectées
Des souris de trois à quatre semaines C3H/HeN ont été achetées auprès de Charles River Laboratories (L'ArbresIe, France).
Les inventeurs se sont particulièrement intéressés à la souche B. burgdorferi ss 297, isolée de liquide céphalo-rachidien aux États-Unis
(Sterre et al., 1893 [35])
Différents clones de B. burgdorferi ss ont été obtenus par culture sur un milieu BSK solide ([19]). Le clone 297c4 a été sélectionné pour sa vitesse de dissémination chez la souris et sa localisation cérébrale notamment.
Toutes les souches de Borrelia ont été cultivées en milieu BSK-H (Sigma) à 33°C et utilisés à passage bas (<7) pour l'infection de la souris. Les spirochètes ont été comptés et la viabilité a été vérifiée en utilisant le microscope à fond noir. Les souris ont été infectées avec 103 spirochètes dans 0,1 ml BSK par injection intradermique dans la région thoracique dorsale.
À différents points après l'inoculation (3j, 5j, 7j, 15j), les souris ont été tuées par isoflurane. Une surface de 1 cm de peau de souris a été recueillie au niveau du site d'inoculation et stockée dans Trizol (Invitrogen) pour les analyses RT-PCR. Pour la quantification des Borrelia dans la peau, l'échantillon est conservé à sec -80°C.
3.1 .2 Quantification par PCR des peaux infectées avec Borrelia
Au niveau du site d'inoculation, la détection de la présence de B. burgdorferi ss a été réalisée par PCR en ciblant le gène de la flagelline sur un système LightCycler (Roche Diagnostics, France). Les amorces utilisées pour amplifier le gène fia sont celles décrites précédemment ([29]).
3.1 .3 RT-PCR sur les peaux de souris pour la détection des gènes
Aux différents points de la cinétique, les échantillons de peau ont été prélevés chez chaque souris au niveau du site d'inoculation. L'ARN total a été purifié en utilisant le réactif Trizol selon les instructions du fabricant. La concentration et la pureté de l'ARN extrait ont été déterminées par mesure de la A260 et A280. Les échantillons ont été ensuite traités avec gDNAse wipeout (QIAGEN). L'ARN total extrait a été synthétisé en ADNc en utilisant Quantiscript transcription inverse (QIAGEN). L'ADNc a été utilisé pour quantifier les gènes bbk32 (contrôle positif). Pour B. burgdorferi ss 297 et 297c4, les gènes correspondant aux trois protéines communes et RpoN et Gnd ont été testés en RT-PCR à l'aide des amorces décrites dans le tableau 3 ci-dessous.
Tableau 3 : Amorces utilisées pour la RT-PCR
Protéines SEQ ID NO Séquences
93 F - AGG CCT GAA GGA GAG CTT GT
BB0566
94 R - AAA CCT CAT CGG ATG GAT ACT CAA
95 F - GCT GAT TTT GCC AGC GAG CTT A
BB0722
96 R - TCG GTC CAA ATA CTT CCG TAA CC
97 F - TCG CCT AGT ATG GGG GCT GTT
BB0173
98 R - AGC AGA ACC ATT GCC AAG ATC C
99 F - AAG TGA AAA CCC CCA AAA ACA AAA A
RpoN
100 R - TTG CTC CAC CAA CAG AGC TAA AAA G
101 F - GGA ATG AAG GCG ATC TTT CAG GG
Gnd
102 R - GCT GGC AAA GGA ATC CCA ATT TCAC Les niveaux d'expression relatifs ont été calculés en utilisant la méthode de la flagelline AACt comme étalon interne. L'amplification et la détection ont été effectuées avec un système ABI 7500 avec le profil thermique suivant: 95°C pendant 10 min, 50 cycles de 95°C pendant 15 s, et 60°C pendant 1 min. Chaque condition d'amplification a été comparée au jour 3 pour la quantification relative.
3.1 .4 Analyse protéomique des peaux infectées
Les biopsies ont été sélectionnées en fonction de la quantification par PCR. Des fragments d'environ 4 mg ont été découpés et les protéines ont été extraites dans 200 μί tampon de Laemmli puis dosées. Les protéines (50 g) ont été préfractionnées sur gel d'électrophorèse SDS- PAGE puis les pistes de migration ont été excisées et traitées comme décrit dans l'Exemple 1 . Les peptides tryptiques ont été analysés par nanoLC-MS/MS en utilisant le système nanoLC-Chip/MS couplé au piège à ions amaZon, comme décrit dans l'Exemple 1 . Les spectres de MS et MS/MS ont été acquis avec les mêmes paramètres et les recherches ont été effectuées de la même manière hormis pour les banques de données. Dans le cas présent, les recherches ont été effectuées dans des banques de données, composées de séquences de B. burgdorferi ss B31 et de souris, téléchargées sur la banque de données NCBInr et UniProtKB- SwissProt, respectivement (B. burgdorferi B31 : 16 août 2012 ; souris : 19 avril 2013).
3.2 Résultats
3.2.1 Pic de multiplication des Borrelia au jour 7 ;
La quantification des Borrelia dans la peau à différents points après l'inoculation intradermique révèle une intense multiplication des bactéries au jour 7 et ceci quelle que soit la souche de Borrelia testée
(Figure 1 ). 3.2.2 Cinétique d'expression de certains gènes dans la peau
Le profil d'expression par RT-PCR de la protéine BB0566 (SEQ ID NO: 10), protéine commune aux trois espèces de Borrelia : B. burgdorferi ss, B. afzelii et B. garinii, dans la peau de souris au cours de la transmission précoce de la bactérie est représenté sur la Figure 2.
Ces résultats montrent que la protéine de séquence SEQ ID NO: 10 est fortement surexprimée dans la peau de souris dès le cinquième jour après inoculation pour les deux souches 297 et 297c4.
3.2.3 Analyse protéomique des peaux de souris infectées au jour sept après inoculation intra-dermique
Dans les biopsies cutanées de souris infectées, il a été identifié en moyenne 1350 protéines de souris. Parmi les protéines de Borrelia détectées, les protéines RpoN et Gnd ont été identifiées ce qui confirme l'expression de ces protéines dans la peau sept jours après l'inoculation et leur rôle potentiel lors de la transmission précoce de la bactérie.
Exemple 4 : Essai vaccinal
La dose de protéines recombinantes à administrer est déterminée en fonction d'une étude préalable dose-effet bien connue de l'homme du métier, en général entre 1 et 500 g. Selon le protocole de vaccination chez le chien, idéalement, deux administrations seront effectuées entre 2 à 4 semaines d'intervalle puis un rappel annuel. L'adjuvant est choisi en fonction de sa capacité à stimuler la réponse humorale et/ou la réponse cellulaire. L'homme du métier sait déterminer quel adjuvant choisir pour stimuler efficacement la réponse humorale et/ou la réponse cellulaire. L'administration du vaccin est réalisée par voie intradermique, sous- cutanée ou intramusculaire, de préférence par voie intramusculaire ou sous-cutanée. Listes des références
[1] Mayne PJ. Emerging incidence of Lyme borreliosis, babesiosis, bartonellosis, and granulocytic ehrlichiosis in Australia. Int J Gen Med. 201 1 ;4:845-52.
[2] Barbieri AM et al. Borrelia burgdorfeh sensu lato infecting ticks of the ixodes ricinus complex in Uruguay: first report for the Southern Hémisphère. Vector Borne Zoonotic Dis. 2013 Mar;13(3): 147-53.
[3] Radolf JD et al. Of ticks, mice and men: understanding the dual-host lifestyle of Lyme disease spirochaetes. Nat Rev Microbiol. 2012 Jan 9;10(2):87-99.
[4] Stanek G et al. Lyme borreliosis. Lancet. 2012 Feb 4;379(9814):461 -73. doi: 10.1016/S0140-6736(1 1 )60103-7.
[5] Little SE et al. Lyme borreliosis in dogs and humans in the USA. Trends Parasitol. 2010 ;26 :213-8.
[6] Hanson MS, Edelman R. Progress and controversy surrounding vaccines against Lyme disease. Expert Rev Vaccines. 2003;2 :683-703.
[7] LaFleur RL et al. Bacterin that induces anti-OspA and anti- OspC borreliacidal antibodies provides a high level of protection against canine Lyme disease. Clin Vaccine Immunol. 2009;16 :253-9.
[8] Tôpfer KH, Straubinger RK. Characterization of the humoral immune response in dogs after vaccination against the Lyme borreliosis agent A study with five commercial vaccines using two différent vaccination schedules. Vaccine. 2007;25 :314-26.
[9] Leder et al. "Introduction to molecular medicine", Ed Sientific American, 1994.
[10] Heitz F et al. "Twenty years of cell-penetrating peptides: from molecular mechanisms to therapeutics". Br J Pharmacol. 2009 May; 157(2): 195-206. [11] Wehrlé P., Pharmacie galénique, Formulation et technologie pharmaceutiques, 2007.
[12] Peppas NA et Carr DA, Impact of Absorption and Transport on Intelligent Therapeutics and Nano-scale Delivery of Protein Therapeutic Agents Chemical engineering Science, 64, 4553-4565 (2009).
[13] Morishita M et Peppas NA, Is the oral route possible for peptide and protein drug delivery?Drug Discovery Today, 1 1 , 905-910 (2006).
[14] Roatt BM et al. Performance of LBSap vaccine after intradermal challenge with L. infantum and saliva of Lu. longipalpis: immunogenicity and parasitological évaluation. PLoS One. 2012;7(1 1 ):e49780. doi: 10.1371/journal.pone.0049780. Epub 2012 Nov 26.
[15] Livey I et al. A new approach to a Lyme disease vaccine. Clin Infect Dis. 201 1 Feb;52 Suppl 3:s266-70.
[16] Wressnigg N et al. Safety and immunogenicity of a novel multivalent OspA vaccine against Lyme borreliosis in healthy adults: a double-blind, randomised, dose-escalation phase 1/2 trial. Lancet Infect Dis. 2013 Aug;13(8):680-9.
[17] Cordier-Ochsenbein et al. (1998). "Exploring the folding pathways of annexin I, a multidomain protein. II. Hierarchy in domain folding propensities may govern the folding process." J Mol Biol 279(5): 1 177-85.
[18] Ramamoorthi J, Smooker P. M (2009) So you need a protein- aguide to the productionof recombinant proteins. The open Veterinary
Science Journal, 3, 28-34.
[19] De Martino et al., Enhanced culture of Borrelia garinii and Borrelia afzelii strains on a solid BSK-based médium in anaerobic conditions. Res. Microbiol. 2006, 157, 726-729.
[20] Laemmli, U. K. (1970) "Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4" Nature 227, 680 - 685. [21] Candiano et al. Blue silver: a very sensitive colloïdal Coomassie G-250 staining for proteome analysis. Electrophoresis 2004, 25, 1327-1333.
[22] Villiers, C et al. From secretome analysis to immunology: chitosan induces major altérations in the activation of dendritic cells via a TLR4-dependent mechanism. Mol. Cell. Proteomics MCP 2009, 8, 1252- 1264.
[23] Perkins, D.N et al. Probability-based protein identification by searching séquence databases using mass spectrometry data. Electrophoresis 1999, 20, 3551-3567.
[24] Geer, L.Y. et al., Open mass spectrometry search algorithm. J. Proteome Res. 2004, 3, 958-964.
[25] Pham, T.V. et al. On the beta-binomial model for analysis of spectral count data in label-free tandem mass spectrometry-based proteomics. Bioinforma. Oxf. Engl. 2010, 26, 363-369.
[26] Balgley, B.M., et al. Comparative évaluation of tandem MS search algorithms using a target-decoy search strategy. Mol. Cell. Proteomics MCP 2007, 6, 1599-1608.
[27] Altschul, S. F. et al. Basic local alignment search tool. J. Mol. Biol. 1990, 215, 403-410.
[28] Barthold, S. W. et al. 1993. Chronic Lyme borreliosis in the laboratory mouse. Am. J. Pathol. 143:959-971 .
[29] Kern A, et al. Tick saliva represses innate immunity and cutaneous inflammation in a murine model of Lyme disease. Vector Borne Zoonotic Dis. 201 1 Oct;1 1 (10):1343-50.
[30] Woods, A et al. 2008. MyD88 negatively controls hypergammaglobulinemia with autoantibody production during bacterial infection. Infect. Immun. 76: 1657-1667.
[31] Ouyang Z et al. 2012. Activation of the RpoN-RpoS regulatory pathway during the enzootic life cycle of Borrelia burgdorferi. BMC
Microbiol. 12:44. [32] Brisson D et al. Biodiversity of Borrelia burgdorferi strains in tissues of Lyme disease patients. PLoS One. 201 1 ;6(8):e22926.
[33] Steere AC et al. Vaccination against Lyme disease with recombinant Borrelia burgdorferi outer-surface lipoprotein A with adjuvant. Lyme Disease Vaccine Study Group. N Engl J Med. 1998 Jul 23;339(4):209-15.
[34] Embers ME, Narasimhan S. Vaccination against Lyme disease: past, présent, and future. Front Cell Infect Microbiol. 2013;3:6.
[35] Sterre et al. 1983. The spirochetal etiology of Lyme disease. N. Engl. J. Med. 308:733-740.

Claims

REVENDICATIONS
1 . Composition vaccinale comprenant :
au moins un polypeptide de Borrelia burgdorferi ss choisi parmi SEQ ID NO: SEQ ID NO: 10, 13, 2, 8, 9, 19, 25, 29, 33, 35, 43, 45 et 85.
2. Composition vaccinale selon la revendication 1 , dans laquelle l'au moins un polypeptide de Borrelia burgdorferi ss est choisi parmi SEQ ID NO: 10.
3. Composition vaccinale selon la revendication 1 ou 2, comprenant en plus de l'au moins un polypeptide de la revendication 1 , au moins un polypeptide de Borrelia burgdorferi ss, Borrelia afzelii ou Borrelia garinii choisi parmi SEQ ID NO: 1 , 3 à 7, 1 1 , 12, 14 à 18, 20 à 24, 26 à 28, 30 à 32, 34, 36 à 42, 44, 46 à 84 et 86 à 92.
4. Composition selon l'un quelconque des revendications 1 à 3, comprenant en plus de l'au moins un polypeptide de la revendication 1 , au moins un autre polypeptide de Borrelia burgdorferi ss, Borrelia afzelii ou Borrelia garinii choisi dans les groupes (c1 ), (c2) et (c3),
ledit groupe (d ) comprenant SEQ ID NO: 19 à 28,
ledit groupe (c2) comprenant SEQ ID NO: 29 à 46 et 73 à 86,
ledit groupe (c3) comprenant SEQ ID NO: 47 à 72 et 87 à 92,
à condition que si ladite au moins un polypeptide de la revendication 1 est :
- est SEQ ID NO: 19 et 25, ledit au moins un autre polypeptide est compris dans le groupe (c2) ou (c3), ou
- est SEQ ID NO: 29, 33, 35, 43, 45 ou 85, ledit au moins un autre polypeptide est compris dans le groupe (c1 ) ou (c3), ou
- est SEQ ID NO: 2, 8 ou 9, ledit au moins un autre polypeptide est compris dans le groupe (c3), ou - est SEQ ID NO: 10 ou 13 ledit au moins un autre polypeptide est compris dans un n'importe lequel des groupes (c1 ), (c2) et (c3).
5. Composition selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, comprenant en outre un véhicule pharmaceutiquement acceptable.
6. Composition vaccinale selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, comprenant un adjuvant.
7. Composition vaccinale selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, comprenant au moins un autre principe actif.
8. Composition vaccinale selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, pour utilisation comme médicament.
9. Composition vaccinale selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, pour utilisation dans la prévention de la maladie de Lyme.
PCT/FR2014/052085 2013-08-14 2014-08-12 Vaccins contre la maladie de lyme WO2015022470A2 (fr)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP14786957.2A EP3033105A2 (fr) 2013-08-14 2014-08-12 Vaccins contre la maladie de lyme
US14/912,325 US20160220653A1 (en) 2013-08-14 2014-08-12 Lyme disease vaccines

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FR1358017A FR3009683A1 (fr) 2013-08-14 2013-08-14 Vaccins contre la maladie de lyme
FR1358017 2013-08-14

Publications (2)

Publication Number Publication Date
WO2015022470A2 true WO2015022470A2 (fr) 2015-02-19
WO2015022470A3 WO2015022470A3 (fr) 2015-04-23

Family

ID=49998338

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/FR2014/052085 WO2015022470A2 (fr) 2013-08-14 2014-08-12 Vaccins contre la maladie de lyme

Country Status (4)

Country Link
US (1) US20160220653A1 (fr)
EP (1) EP3033105A2 (fr)
FR (1) FR3009683A1 (fr)
WO (1) WO2015022470A2 (fr)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2016128687A1 (fr) * 2015-02-13 2016-08-18 Université De Strasbourg Vaccins contre la maladie de lyme

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU8153498A (en) * 1997-06-20 1999-01-04 Human Genome Sciences, Inc. (borrelia burgdorferi) polynucleotides and sequences
CN101516905A (zh) * 2006-09-15 2009-08-26 英特塞尔股份公司 疏螺旋体属抗原

Non-Patent Citations (40)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ALTSCHUL, S.F ET AL., J. MOL. BIOL., 1990
ALTSCHUL, S.F. ET AL.: "Basic local alignment search tool", J. MOL. BIOL., vol. 215, 1990, pages 403 - 410
BALGLEY, B.M. ET AL.: "Comparative evaluation of tandem MS search algorithms using a target-decoy search strategy", MOL. CELL. PROTEOMICS MCP, vol. 6, 2007, pages 1599 - 1608
BARBIERI AM ET AL.: "Borrelia burgdorferi sensu lato infecting ticks of the ixodes ricinus complex in Uruguay: first report for the Southern Hemisphere", VECTOR BORNE ZOONOTIC DIS., vol. 13, no. 3, March 2013 (2013-03-01), pages 147 - 53
BARTHOLD, S. W ET AL.: "Chronic Lyme borreliosis in the laboratory mouse", AM. J. PATHOL., vol. 143, 1993, pages 959 - 971
BRISSON D ET AL.: "Biodiversity of Borrelia burgdorferi strains in tissues of Lyme disease patients", PLOS ONE., vol. 6, no. 8, 2011, pages E22926
CANDIANO ET AL.: "Blue silver: a very sensitive colloidal Coomassie G-250 staining for proteome analysis", ELECTROPHORESIS, vol. 25, 2004, pages 1327 - 1333
CORDIER-OCHSENBEIN ET AL.: "Exploring the folding pathways of annexin , a multidomain protein. . Hierarchy in domain folding propensities may govern the folding process", J MOL BIOL, vol. 279, no. 5, 1998, pages 1177 - 85
DE MARTINO ET AL.: "Enhanced culture of Borrelia garinii and Borrelia afzelii strains on a solid BSK-based medium in anaerobic conditions", RES. MICROBIOL., vol. 157, 2006, pages 726 - 729
EMBERS ME; NARASIMHAN S.: "Vaccination against Lyme disease: past, present, and future", FRONT CELL INFECT MICROBIOL., vol. 3, 2013, pages 6
F. CORDIER-OCHSENBEIN ET AL., J. MOL. BIOL., vol. 279, pages 1177 - 1185
GEER, L.Y. ET AL.: "Open mass spectrometry search algorithm", J. PROTEOME RES, vol. 3, 2004, pages 958 - 964
HANSON MS; EDELMAN R: "Progress and controversy surrounding vaccines against Lyme disease", EXPERT REV VACCINES, vol. 2, 2003, pages 683 - 703
HEITZ F ET AL., BR J PHARMACOL., vol. 157, no. 2, May 2009 (2009-05-01), pages 195 - 206
HEITZ F ET AL.: "Twenty years of cell-penetrating peptides: from molecular mechanisms to therapeutics", BR J PHARMACOL., vol. 157, no. 2, May 2009 (2009-05-01), pages 195 - 206
KERN A; 2011 OCT ET AL.: "Tick saliva represses innate immunity and cutaneous inflammation in a murine model of Lyme disease", VECTOR BORNE ZOONOTIC DIS., vol. 11, no. 10, pages 1343 - 50
LAEMMLI, U. K.: "Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4", NATURE, vol. 227, 1970, pages 680 - 685
LAFLEUR RL ET AL.: "Bacterin that induces anti-OspA and anti-OspC borreliacidal antibodies provides a high level of protection against canine Lyme disease", CLIN VACCINE IMMUNOL., vol. 16, 2009, pages 253 - 9
LEDER ET AL.: "Introduction to molecular medicine", 1994
LITTLE SE ET AL.: "Lyme borreliosis in dogs and humans in the USA", TRENDS PARASITOL., vol. 26, 2010, pages 213 - 8
LIVEY 1 ET AL.: "A new approach to a Lyme disease vaccine", CLIN INFECT DIS., vol. 52, no. 3, February 2011 (2011-02-01), pages 266 - 70
MAYNE PJ.: "Emerging incidence of Lyme borreliosis, babesiosis, bartonellosis, and granulocytic ehrlichiosis in Australia", INT J GEN MED., vol. 4, 2011, pages 845 - 52
MORISHITA M; PEPPAS NA, DRUG DISCOVERY TODAY, vol. 11, 2006, pages 905 - 910
MORISHITA M; PEPPAS NA: "Is the oral route possible for peptide and protein drug delivery?", DRUG DISCOVERY TODAY, vol. 11, pages 905 - 910
OUYANG Z ET AL.: "Activation of the RpoN-RpoS regulatory pathway during the enzootic life cycle of Borrelia burgdorferi", BMC MICROBIOL., vol. 12, 2012, pages 44
PEPPAS NA; CARR DA, CHEMICAL ENGINEERING SCIENCE, vol. 64, 2009, pages 4553 - 4565
PEPPAS NA; CARR DA, IMPACT OF ABSORPTION AND TRANSPORT ON INTELLIGENT THERAPEUTICS AND NANO-SCALE DELIVERY OF PROTEIN THERAPEUTIC AGENTS CHEMICAL ENGINEERING SCIENCE, vol. 64, 2009, pages 4553 - 4565
PERKINS, D.N ET AL.: "Probability-based protein identification by searching sequence databases using mass spectrometry data", ELECTROPHORESIS, vol. 20, 1999, pages 3551 - 3567
PHAM, T.V. ET AL.: "On the beta-binomial model for analysis of spectral count data in label-free tandem mass spectrometry-based proteomics", BIOINFORMA. OXF. ENGL., vol. 26, 2010, pages 363 - 369
RADOLF JD ET AL.: "Of ticks, mice and men: understanding the dual-host lifestyle of Lyme disease spirochaetes", NAT REV MICROBIOL., vol. 10, no. 2, 9 January 2012 (2012-01-09), pages 87 - 99
RAMAMOORTHI J; SMOOKER P.M: "So you need a protein-aguide to the productionof recombinant proteins", THE OPEN VETERINARY SCIENCE JOURNAL, vol. 3, 2009, pages 28 - 34
ROATT BM ET AL.: "Performance of LBSap vaccine after intradermal challenge with L. infantum and saliva of Lu. longipalpis: immunogenicity and parasitological evaluation", PLOS ONE., vol. 7, no. 11, 26 November 2012 (2012-11-26), pages E49780
STANEK G ET AL.: "Lyme borreliosis", LANCET, vol. 379, no. 9814, 4 February 2012 (2012-02-04), pages 461 - 73
STEERE AC ET AL.: "Vaccination against Lyme disease with recombinant Borrelia burgdorferi outer-surface lipoprotein A with adjuvant", N ENGL J MED., vol. 339, no. 4, 23 July 1998 (1998-07-23), pages 209 - 15
STERRE ET AL.: "The spirochetal etiology of Lyme disease", N. ENGL. J. MED., vol. 308, 1983, pages 733 - 740
TÔPFER KH; STRAUBINGER RK: "Characterization of the humoral immune response in dogs after vaccination against the Lyme borreliosis agent A study with five commercial vaccines using two different vaccination schedules", VACCINE, vol. 25, 2007, pages 314 - 26
VILLIERS, C ET AL.: "From secretome analysis to immunology: chitosan induces major alterations in the activation of dendritic cells via a TLR4-dependent mechanism", MOL. CELL. PROTEOMICS MCP, vol. 8, 2009, pages 1252 - 1264
WEHRLÉ P.: "Pharmacie galénique", FORMULATION ET TECHNOLOGIE PHARMACEUTIQUES, 2007
WOODS, A ET AL.: "MyD88 negatively controls hypergammaglobulinemia with autoantibody production during bacterial infection", INFECT. IMMUN., vol. 76, 2008, pages 1657 - 1667
WRESSNIGG N ET AL.: "Safety and immunogenicity of a novel multivalent OspA vaccine against Lyme borreliosis in healthy adults: a double-blind, randomised, dose-escalation phase 1/2 trial", LANCET INFECT DIS., vol. 13, no. 8, August 2013 (2013-08-01), pages 680 - 9

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2016128687A1 (fr) * 2015-02-13 2016-08-18 Université De Strasbourg Vaccins contre la maladie de lyme

Also Published As

Publication number Publication date
FR3009683A1 (fr) 2015-02-20
EP3033105A2 (fr) 2016-06-22
WO2015022470A3 (fr) 2015-04-23
US20160220653A1 (en) 2016-08-04

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Kung et al. Borrelia burgdorferi and tick proteins supporting pathogen persistence in the vector
FI107334B (fi) Menetelmä rokotteen valmistamiseksi Lymen taudin estämiseksi
Marcinkiewicz et al. Eliminating factor H-binding activity of Borrelia burgdorferi CspZ combined with virus-like particle conjugation enhances its efficacy as a Lyme disease vaccine
JP2009544279A (ja) 歯周病の予防に有用なポルフィロモナス・ジンジバリスポリペプチド
KR102460165B1 (ko) Ospa의 돌연변이 단편 및 이와 관련된 방법 및 용도
Federizon et al. Immunogenicity of the Lyme disease antigen OspA, particleized by cobalt porphyrin-phospholipid liposomes
Wang Borrelia burgdorferi and other Borrelia species
Shao et al. Evaluation of multicomponent recombinant vaccines against Actinobacillus pleuropneumoniae in mice
Schell et al. Outer membrane proteome of Burkholderia pseudomallei and Burkholderia mallei from diverse growth conditions
LiHua et al. Evaluation of an outer membrane protein as a vaccine against Edwardsiella anguillarum in Japanese eels (Anguilla japonica)
US20230256071A1 (en) Virulent aeromonas vaccines and methods
CN114423448A (zh) 疫苗组合物和选择抗原的方法
Sharma et al. Immune response characterization and vaccine potential of a recombinant chimera comprising B-cell epitope of Aeromonas hydrophila outer membrane protein C and LTB
Yadav et al. Recombinant outer membrane protein OmpC induces protective immunity against Aeromonas hydrophila infection in Labeo rohita
EP1446422A2 (fr) Antigene mycobacterien recombinant de type hemagglutinine de liaison a l&#39;heparine (hbha) methylee
KR20200068756A (ko) 키메라 ospa 분자를 포함하는 조성물 및 이의 사용 방법
CN115698044A (zh) 用于医学用途的包含三种OspA融合蛋白的组合物
Lo et al. Characterization of two lipoproteins in Pasteurella multocida
Hassan et al. Enhanced protective efficacy of Borrelia burgdorferi BB0172 derived-peptide based vaccine to control Lyme disease
KR20120104567A (ko) 기생충 질병에 대한 백신 또는 진단용으로 사용되는 ｌ3 및/또는 ｌ5 공급원의 용도
EP3033105A2 (fr) Vaccins contre la maladie de lyme
Lopes et al. Sm21. 6 a novel EF-hand family protein member located on the surface of Schistosoma mansoni adult worm that failed to induce protection against challenge infection but reduced liver pathology
EP4081534B1 (fr) Vaccin de protection contre les exotoxines staphylococciques
EP3256159A1 (fr) Vaccins contre la maladie de lyme
Jeon et al. Attenuated Salmonella Gallinarum secreting an Escherichia coli heat-labile enterotoxin B subunit protein as an adjuvant for oral vaccination against fowl typhoid

Legal Events

Date Code Title Description
WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2014786957

Country of ref document: EP

121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 14786957

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A2

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 14912325

Country of ref document: US