FR3009683A1 - Vaccins contre la maladie de lyme - Google Patents

Abstract

La présente invention se rapporte à des vaccins contre la maladie de Lyme, en particulier des vaccins comprenant un ou plusieurs polypeptides isolés de Borrelia burgdorferi ss, Borrelia afzelii ou Borrelia garinii.

Description

VACCINS CONTRE LA MALADIE DE LYME Domaine technique La présente invention se rapporte à des vaccins contre la maladie de Lyme, en particulier des vaccins comprenant un ou plusieurs polypeptides isolés de Borrelia burgdorferi ss, Borrelia afzelii ou Borrelia garinii. La présente invention trouve des applications dans les domaines vétérinaire et médical.

Dans la description ci-dessous, les références entre crochets ([ ]) renvoient à la liste des références présentées à la fin des exemples. Etat de la technique La borréliose de Lyme, également appelée maladie de Lyme, est une maladie à transmission vectorielle transmise par une tique dure du genre Ixodes. Elle sévit principalement dans l'hémisphère Nord où elle constitue la maladie à transmission vectorielle la plus fréquente. Des données récentes laissent également entrevoir que son aire de répartition s'étend également dans l'hémisphère sud avec des cas humains en Australie (Mayne et al., 2011 [1]) et des tiques infectées avec Borrelia identifiées en Amérique du Sud (Barbieri et al., 2013 [2]). La bactérie responsable de la borréliose est un spirochète appartenant au groupe Borrelia burgdorferi sensu lato avec environ 20 espèces identifiées.

La borréliose de Lyme se développe habituellement dans la faune sauvage chez une large gamme d'hôtes vertébrés et se manifeste accidentellement chez l'homme d'abord par une inflammation cutanée, l'érythème migrant, puis par des manifestations cliniques très variées : articulaires, cardiaques, neurologiques et cutanées (Radolf et a/.,2012 [3] ; Stanek et a/.,2012 [4]). La peau constitue donc une interface essentielle dans la transmission lors de la piqûre de tique et le développement de la maladie. Les symptômes cliniques de la borréliose observés chez le chien sont très proches de ceux observés chez l'Homme, mais plus spécifiquement elle induit chez le chien une glomérulonéphrite (Little et al., 2010 [5]).

Bien que des traitements antibiotiques soient efficaces à un stade précoce de l'infection, de nombreux patients développent une borréliose en raison d'une absence ou d'une non-observation d'érythèmes migrant, ou en raison d'un traitement inapproprié ou trop tardif. Une approche vaccinale apparait être plus prometteuse pour prévenir ou traiter la maladie de Lyme, notamment chez l'animal chez qui le stade précoce cutané ne peut être observé en raison du pelage. Il existe actuellement plusieurs vaccins sur le marché pour prévenir la borréliose canine. Aux Etats-Unis, ils ne sont dirigés que contre une seule espèce, Borrelia burgdorferi sensu stricto. Par ailleurs, basé sur le concept du « transmission blocking vaccine », un vaccin a été commercialisé aux Etats-Unis pour l'Homme, le LYMErix (marque de commerce), mais sa commercialisation a été arrêtée en 2002 suite à des effets secondaires chez certains patients (Hanson and Edelman, 2003 [6]). Utilisant un antigène recombinant, OspA (Outer Surface protein A), deux vaccins sont actuellement utilisés chez le chien aux Etats-Unis (Nobivac (marque déposée) commercialisés par Intervet et Recombitek (marque déposée) commercialisé par Merial) et ont montré une certaine efficacité mais seulement contre l'espèce B. burgdorferi ss (Lafleur et al., 2009 [7]). En effet, la population de Borrelia transmise par les tiques est en Europe très hétérogène, et les vaccins actuellement sur le marché ne sont pas efficaces contre les autres espèces virulentes de Borrelia qui sont majoritaires en Europe. Un troisième vaccin est commercialisé utilisant un lysat bactérien de B. burgdorferi ss (FortDodge). En Europe, seules deux compagnies (Merial et Bioveta) commercialisent un vaccin également basé sur des lysats de Borrelia, B. burgdorferi ss pour Merial et B. afzelii et B. garinii pour Bioveta. Pour ces différents vaccins, en général trois injections sont nécessaires pour obtenir une protection suffisante, généralement contrôlée par la mesure des anticorps par ELISA (Topfer et Straubinger, 2007 [8]). Toutefois, l'utilisation de lysat bactérien comme base vaccinale n'est pas satisfaisante pour une production en masse.

Ainsi, les vaccins existants utilisent soit des lysats bactériens dont la production de masse est difficilement réalisable, soit la protéine recombinante OspA, peu immunogène et peu exprimée au début de l'infection chez l'homme, soit OspC dont la preuve de concept sur un plan vaccinal n'est pas avérée.

Il existe donc de réels besoins de mettre au point de nouveaux vaccins palliant ces défauts, inconvénients et obstacles de l'art antérieur, en particulier des vaccins qui soient fortement immunogènes et efficaces sur diverses populations de Borrelia, et qui puissent être produits en masse à faible coût.

Exposé de l'invention La présente invention répond précisément aux besoins précités de l'art antérieur, en fournissant des compositions vaccinales pour la prévention de la maladie de Lyme.

A cet effet, les inventeurs ont développé une approche protéomique afin d'identifier et sélectionner des polypeptides efficaces pour la prévention de la maladie de Lyme. Cette approche a été réalisée sur la base de trois espèces de Borrelia que les inventeurs ont déterminé comme étant les plus impliquées en pathologie humaine et animale, en particulier chez le chien, à savoir Borrelia burgdorferi ss, Borrelia afzelii et Borrelia Ainsi, la présente invention a notamment pour objet une composition vaccinale comprenant au moins un polypeptide de Borrelia burgdorferi ss, Borrelia afzelii ou Borrelia garinii choisi parmi les séquences décrites ci-après.

Notamment, on décrit les séquences SEQ ID NO: 1 à 92 présentées dans le tableau 1 ci-dessous, dans lequel figurent les numéros des séquences du listage de séquences annexé, les noms des polypeptides correspondants et les noms des loci correspondants dans le génome de Borrelia burgdorferi ss, Borrelia afzelii ou Borrelia En d'autres termes, le Tableau 1 décrit les polypeptides isolés consistant en une séquence choisie parmi SEQ ID NO: 1 à 92 susceptibles d'être utilisés dans la composition vaccinale de l'invention. 1 0 Tableau 1 : Séquences des polypeptides utilisables dans une composition vaccinale selon l'invention Nom du polypeptide SEQ Nom du SEQ Nom du SEQ Nom du ID locus dans ID locus dans ID locus NO B. NO B. afzelii NO dans B. burgdorferi garinii ss n/a 1 BB0213 - - - - UDP-N- 2 660304 - - - - acetylmuramoylalanyl- D-glutamy1-2,6- diaminopimelate--D- alanyl-D-alanine ligase (murF) fibronectin/fibrinogen- 3 BB0347 - - - - binding protein, putative penicillin-binding 4 660718 - - - - protein (pbp-2) n/a 5 BB0761 - - - - n/a 6 BB0823 - - - - outer membrane 7 660167 - - - - protein (tnp50) alanine racemase (alr) 8 BB0160 - - - - hemolysin Ill (yplQ) 9 BB0117 - - - - n/a 10 BB0566 11 BAPK00596 12 BG0576 n/a 13 BB0173 14 BAPK00175 15 BG0172 n/a 16 BB0722 17 BAPK00766 18 BG0744 50 S ribosomal protein 19 BB0229 - - 20 BG0232 L31 type B flagellar hook-basal 21 BB0292 - - 22 BG0295 body protein FliE Beta glucosidase, 23 BB0620 - - 24 BG0639 putative 30S ribosomal protein 25 BB0491 - - 26 BG0503 S14 type Z n/a 27 BB0765 - - 28 BG0788 n/a 29 BB0748 30 BAPK00794 - - Preprotein translocase 31 BB0395 32 BAPK00410 - - subsunit SecE Holo ACP synthase 33 BB0010 34 BAPK0009 - - n/a 35 BB0029 36 BAPK0028 - - n/a 37 BB0081 38 BAPK00081 - - n/a 39 BB0102 40 BAPK00103 - - RNA polymerase 41 BB0450 42 BAPK00472 - - sigma-54 factor Type III pantothenate 43 BB0527 44 BAPK00553 - - kinase tRNA (guanine-N(1)-)- 45 BB0698 46 BAPK00742 - - methyltransferase n/a - - 47 BAPK00189 48 BG0186 n/a - - 49 BAPK00265 50 BG0258 flagellar biosynthesis - - 51 BAPK00285 52 BG0278 protein FliP Nucleoid associated - - 53 BAPK00491 54 BG0475 protein EbfC Acyl carrier porter - - 55 BAPK00747 56 BG0726 (ACP) n/a - - 57 BAPK00861 58 BG0834 n/a - - 59 BAPK00873 60 BG0845 n/a - - 61 BAPK04502 62 BGP215 n/a - - 63 BAPK00132 64 BG0132 n/a - - 65 BAPK00215 66 BG0210 tRNA - - 67 BAPK00874 68 BG0846 dimethylallyltransferas e exonuclease SbcD - - 69 BAPKOO882 70 BG0854 Hypothetical protein - - 71 BAPK00366 72 BG0366 RNA polymerase 73 BB0388 74 BAPK00029 - - subunit beta replicative DNA 75 BB0111 76 BAPK00112 - - helicase 6-phosphogluconate 77 BB0561 78 BAPK00590 - - dehydrogenase flagellum-specific ATP 79 BB0288 80 BAPK00298 - - synthase Flil putative 81 BB0627 82 BAPK00669 - - aminopeptidase 2 flagellar hook protein 83 BB0283 84 BAPK00293 - - FlgE phosphofructokinase 85 BB0727 86 BAPK00771 - - 5- - - 87 BAPK00619 88 BG0601 methylthioadenosine/S - adenosylhomocysteine nucleosidase, putative n/a - - 89 BAPK00034 90 BG0034 PTS system, maltose - - 91 BAPK00027 92 BGB26 and glucose-specific IIABC component Dans la présente invention, sauf indication contraire « Borrelia burgdorferi » signifie « Borrelia burgdorferi ss » ou « Borrelia burgdorferi sensu stricto», en opposition à l'indication « Borrelia burgdorferi sensu lato » qui couvre environ 20 espèces différentes.

En outre, sauf indication contraire, les lettres déterminant les séquences des polypeptides décrites dans la présente correspondent à l'abréviation à une lettre proposée par Leder (Leder et al. Introduction to molecular medicine, Ed Scientific American, 1994 [9]). Ainsi, la présente invention a notamment pour objet une composition vaccinale comprenant au moins un polypeptide de Borrelia burgdorferi ss, Borrelia afzelii ou Borrelia garinii choisi parmi les séquences SEQ ID NO : 1 à 92. De préférence, l'au moins un polypeptide est choisi parmi les séquences SEQ ID NO: 10 à 92, de préférence, 10 à 18, de préférence, 10 à 15.

Tout polypeptide de séquence SEQ ID NO: 1 à 92, ou toute combinaison d'au moins deux des polypeptides de séquence SEQ ID NO: 1 à 92, peut être utilisé(e) dans la composition vaccinale selon l'invention. Par exemple, la combinaison de polypeptides peut comprendre 2 polypeptides différents de séquence SEQ ID NO: 1 à 92, par exemple 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 voire plus de 9 polypeptides différents de séquence SEQ ID NO: 1 à 92. Une combinaison des polypeptides différents de séquence SEQ ID NO: 1 à 92 peut en effet permettre d'augmenter l'effet thérapeutique et/ou prophylactique de la composition vaccinale selon l'invention. Par exemple, la composition vaccinale selon l'invention peut comprendre une combinaison de deux polypeptides comme présentée dans le tableau 2 ci-dessous.

Tableau 2 : Combinaison de polypeptide dans la composition vaccinale selon l'invention Polypeptide Combinaison possible avec les polypeptides de séquence SEQ NO: de suivants séquence SEQ ID NO: 1 Au moins une parmi : 2 à 92, de préférence au moins l'une parmi : 10 à 18, 47 à 72 et 87 à 92 2 Au moins une parmi : 1 et 3 à 92, de préférence au moins l'une parmi : 10 à 18, 47 à 72 et 87 à 92 3 Au moins une parmi : 1, 2 et 4 à 92, de préférence au moins l'une parmi : 10 à 18, 47 à 72 et 87 à 92 4 Au moins une parmi : 1 à 3 et 5 à 92, de préférence au moins l'une parmi : 10 à 18, 47 à 72 et 87 à 92 Au moins une parmi : 1 à 4 et 6 à 92, de préférence au moins l'une parmi : 10 à 18, 47 à 72 et 87 à 92 6 Au moins une parmi : 1 à 5 et 7 à 92, de préférence au moins l'une parmi : 10 à 18, 47 à 72 et 87 à 92 7 Au moins une parmi : 1 à 6 et 8 à 92, de préférence au moins l'une parmi : 10 à 18, 47 à 72 et 87 à 92 8 Au moins une parmi : 1 à 7 et 9 à 92, de préférence au moins l'une parmi : 10 à 18, 47 à 72 et 87 à 92 9 Au moins une parmi : 1 à 8 et 10 à 92, de préférence au moins l'une parmi : 10 à 18, 47 à 72 et 87 à 92 Au moins une parmi : 1 à 9 et 11 à 92, de préférence au moins l'une parmi : 13 à 18 11 Au moins une parmi : 1 à 10 et 12 à 92, de préférence au moins l'une parmi : 13 à 18 12 Au moins une parmi : 1 à 11 et 13 à 92, de préférence au moins l'une parmi : 13 à 18 13 Au moins une parmi : 1 à 12 et 14 à 92, de préférence au moins l'une parmi : 10 à 12 et 16 à 18 14 Au moins une parmi : 1 à 13 et 15 à 92, de préférence au moins l'une parmi : 10 à 12 et 16 à 18 Au moins une parmi : 1 à 14 et 16 à 92, de préférence au moins l'une parmi : 10 à 12 et 16 à 18 16 Au moins une parmi : 1 à 15 et 17 à 92, de préférence au moins l'une parmi : 10 à 15 17 Au moins une parmi : 1 à 16 et 18 à 92, de préférence au moins l'une parmi : 10 à 15 18 Au moins une parmi : 1 à 17 et 19 à 92, de préférence au moins l'une parmi : 10 à 15 19 Au moins une parmi : 1 à 18 et 20 à 92, de préférence au moins l'une parmi : 10 à 18 et 29 à 92 Au moins une parmi : 1 à 19 et 21 à 92, de préférence au moins l'une parmi : 10 à 18 et 29 à 92 21 Au moins une parmi : 1 à 20 et 22 à 92, de préférence au moins l'une parmi : 10 à 18 et 29 à 92 22 Au moins une parmi : 1 à 21 et 23 à 92, de préférence au moins l'une parmi : 10 à 18 et 29 à 92 23 Au moins une parmi : 1 à 22 et 24 à 92, de préférence au moins l'une parmi : 10 à 18 et 29 à 92 24 Au moins une parmi : 1 à 23 et 25 à 92, de préférence au moins l'une parmi : 10 à 18 et 29 à 92 25 Au moins une parmi : 1 à 24 et 26 à 92, de préférence au moins l'une parmi : 10 à 18 et 29 à 92 26 Au moins une parmi : 1 à 25 et 27 à 92, de préférence au moins l'une parmi : 10 à 18 et 29 à 92 27 Au moins une parmi : 1 à 26 et 28 à 92, de préférence au moins l'une parmi : 10 à 18 et 29 à 92 28 Au moins une parmi : 1 à 27 et 29 à 92, de préférence au moins l'une parmi : 10 à 18 et 29 à 92 29 Au moins une parmi : 1 à 28 et 30 à 92, de préférence au moins l'une parmi : 10 à 28,47 à 72 et 87 à 92 30 Au moins une parmi : 1 à 29 et 31 à 92, de préférence au moins l'une parmi : 10 à 28,47 à 72 et 87 à 92 31 Au moins une parmi : 1 à 30 et 32 à 92, de préférence au moins l'une parmi : 10 à 28,47 à 72 et 87 à 92 32 Au moins une parmi : 1 à 31 et 33 à 92, de préférence au moins l'une parmi : 10 à 28,47 à 72 et 87 à 92 33 Au moins une parmi : 1 à 32 et 34 à 92, de préférence au moins l'une parmi : 10 à 28,47 à 72 et 87 à 92 34 Au moins une parmi : 1 à 33 et 35 à 92, de préférence au moins l'une parmi : 10 à 28,47 à 72 et 87 à 92 35 Au moins une parmi : 1 à 34 et 36 à 92, de préférence au moins l'une parmi : 10 à 28,47 à 72 et 87 à 92 36 Au moins une parmi : 1 à 35 et 37 à 92, de préférence au moins l'une parmi : 10 à 28,47 à 72 et 87 à 92 37 Au moins une parmi : 1 à 36 et 38 à 92, de préférence au moins l'une parmi : 10 à 28,47 à 72 et 87 à 92 38 Au moins une parmi : 1 à 37 et 39 à 92, de préférence au moins l'une parmi : 10 à 28,47 à 72 et 87 à 92 39 Au moins une parmi : 1 à 38 et 40 à 92, de préférence au moins l'une parmi : 10 à 28,47 à 72 et 87 à 92 40 Au moins une parmi : 1 à 39 et 41 à 92, de préférence au moins l'une parmi : 10 à 28,47 à 72 et 87 à 92 41 Au moins une parmi : 1 à 40 et 42 à 92, de préférence au moins l'une parmi : 10 à 28,47 à 72 et 87 à 92 42 Au moins une parmi : 1 à 41 et 43 à 92, de préférence au moins l'une parmi : 10 à 28,47 à 72 et 87 à 92 43 Au moins une parmi : 1 à 42 et 44 à 92, de préférence au moins l'une parmi : 10 à 28,47 à 72 et 87 à 92 44 Au moins une parmi : 1 à 43 et 45 à 92, de préférence au moins l'une parmi : 10 à 28,47 à 72 et 87 à 92 45 Au moins une parmi : 1 à 44 et 46 à 92, de préférence au moins l'une parmi : 10 à 28,47 à 72 et 87 à 92 46 Au moins une parmi : 1 à 45 et 47 à 92, de préférence au moins l'une parmi : 10 à 28,47 à 72 et 87 à 92 47 Au moins une parmi : 1 à 46 et 48 à 92, de préférence au moins l'une parmi : 1 à 46 et 73 à 86 48 Au moins une parmi : 1 à 47 et 49 à 92, de préférence au moins l'une parmi : 1 à 46 et 73 à 86 49 Au moins une parmi : 1 à 48 et 50 à 92, de préférence au moins l'une parmi : 1 à 46 et 73 à 86 50 Au moins une parmi : 1 à 49 et 51 à 92, de préférence au moins l'une parmi : 1 à 46 et 73 à 86 51 Au moins une parmi : 1 à 50 et 52 à 92, de préférence au moins l'une parmi : 1 à 46 et 73 à 86 2 Au moins une parmi : 1 à 51 et 53 à 92, de préférence au moins l'une parmi : 1 à 46 et 73 à 86 53 Au moins une parmi : 1 à 52 et 54 à 92, de préférence au moins l'une parmi : 1 à 46 et 73 à 86 54 Au moins une parmi : 1 à 53 et 55 à 92, de préférence au moins l'une parmi : 1 à 46 et 73 à 86 55 Au moins une parmi : 1 à 54 et 56 à 92, de préférence au moins l'une parmi : 1 à 46 et 73 à 86 56 Au moins une parmi : 1 à 55 et 57 à 92, de préférence au moins l'une parmi : 1 à 46 et 73 à 86 57 Au moins une parmi : 1 à 56 et 58 à 92, de préférence au moins l'une parmi : 1 à 46 et 73 à 86 58 Au moins une parmi : 1 à 57 et 59 à 92, de préférence au moins l'une parmi : 1 à 46 et 73 à 86 59 Au moins une parmi : 1 à 58 et 60 à 92, de préférence au moins l'une parmi : 1 à 46 et 73 à 86 60 Au moins une parmi : 1 à 59 et 61 à 92, de préférence au moins l'une parmi : 1 à 46 et 73 à 86 61 Au moins une parmi : 1 à 60 et 62 à 92, de préférence au moins l'une parmi : 1 à 46 et 73 à 86 62 Au moins une parmi : 1 à 61 et 63 à 92, de préférence au moins l'une parmi : 1 à 46 et 73 à 86 63 Au moins une parmi : 1 à 62 et 64 à 92, de préférence au moins l'une parmi : 1 à 46 et 73 à 86 64 Au moins une parmi : 1 à 63 et 65 à 92, de préférence au moins l'une parmi : 1 à 46 et 73 à 86 65 Au moins une parmi : 1 à 64 et 66 à 92, de préférence au moins l'une parmi : 1 à 46 et 73 à 86 66 Au moins une parmi : 1 à 65 et 67 à 92, de préférence au moins l'une parmi : 1 à 46 et 73 à 86 67 Au moins une parmi : 1 à 66 et 68 à 92, de préférence au moins l'une parmi : 1 à 46 et 73 à 86 68 Au moins une parmi : 1 à 67 et 69 à 92, de préférence au moins l'une parmi : 1 à 46 et 73 à 86 69 Au moins une parmi : 1 à 68 et 70 à 92, de préférence au moins l'une parmi : 1 à 46 et 73 à 86 70 Au moins une parmi : 1 à 69 et 71 à 92, de préférence au moins l'une parmi : 1 à 46 et 73 à 86 71 Au moins une parmi : 1 à 70 et 72 à 92, de préférence au moins l'une parmi : 1 à 46 et 73 à 86 72 Au moins une parmi : 1 à 71 et 73 à 92, de préférence au moins l'une parmi : 1 à 46 et 73 à 86 73 Au moins une parmi : 1 à 72 et 74 à 92, de préférence au moins l'une parmi : 10 à 28,47 à 72 et 87 à 92 74 Au moins une parmi : 1 à 73 et 75 à 92, de préférence au moins l'une parmi : 10 à 28,47 à 72 et 87 à 92 75 Au moins une parmi : 1 à 74 et 76 à 92, de préférence au moins l'une parmi : 10 à 28,47 à 72 et 87 à 92 76 Au moins une parmi : 1 à 75 et 77 à 92, de préférence au moins l'une parmi : 10 à 28,47 à 72 et 87 à 92 77 Au moins une parmi : 1 à 76 et 78 à 92, de préférence au moins l'une parmi : 10 à 28,47 à 72 et 87 à 92 78 Au moins une parmi : 1 à 77 et 79 à 92, de préférence au moins l'une parmi : 10 à 28,47 à 72 et 87 à 92 79 Au moins une parmi : 1 à 78 et 80 à 92, de préférence au moins l'une parmi : 10 à 28,47 à 72 et 87 à 92 80 Au moins une parmi : 1 à 79 et 81 à 92, de préférence au moins l'une parmi : 10 à 28,47 à 72 et 87 à 92 81 Au moins une parmi : 1 à 80 et 82 à 92, de préférence au moins l'une parmi : 10 à 28,47 à 72 et 87 à 92 82 Au moins une parmi : 1 à 81 et 83 à 92, de préférence au moins l'une parmi : 10 à 28,47 à 72 et 87 à 92 83 Au moins une parmi : 1 à 82 et 84 à 92, de préférence au moins l'une parmi : 10 à 28,47 à 72 et 87 à 92 84 Au moins une parmi : 1 à 83 et 85 à 92, de préférence au moins l'une parmi : 10 à 28,47 à 72 et 87 à 92 85 Au moins une parmi : 1 à 84 et 86 à 92, de préférence au moins l'une parmi : 10 à 28,47 à 72 et 87 à 92 86 Au moins une parmi : 1 à 85 et 87 à 92, de préférence au moins l'une parmi : 10 à 28,47 à 72 et 87 à 92 87 Au moins une parmi : 1 à 86 et 88 à 92, de préférence au moins l'une parmi : 1 à 46 et 73 à 86 88 Au moins une parmi : 1 à 87 et 89 à 92, de préférence au moins l'une parmi : 1 à 46 et 73 à 86 89 Au moins une parmi : 1 à 88 et 90 à 92, de préférence au moins l'une parmi : 1 à 46 et 73 à 86 90 Au moins une parmi : 1 à 89, 91 et 92, de préférence au moins l'une parmi : 1 à 46 et 73 à 86 91 Au moins une parmi : 1 à 90 et 92, de préférence au moins l'une parmi : 1 à 46 et 73 à 86 92 Au moins une parmi : 1 à 91, de préférence au moins l'une parmi : 1 à 46 et 73 à 86 La composition vaccinale selon l'invention peut comprendre, en plus de n'importe laquelle des combinaisons de deux polypeptides présentées dans le tableau 2 ci-dessus, au moins un troisième polypeptide différent de ceux de la combinaison, voire un quatrième polypeptide différent, etc. De préférence, la composition vaccinale comprend une combinaison de 2, 3, 4, 5, 6 ou 7 polypeptides différents. Les polypeptides utilisables dans la composition vaccinale selon l'invention ne sont pas limités aux polypeptides consistant en la séquence SEQ ID NO: 1 à 92. L'homme du métier comprend bien que des séquences présentant une homologie ou une identité avec ces séquences peuvent également être utilisées, de manière équivalente, dans la composition vaccinale selon l'invention, dès lors qu'elles présentent le même effet que les polypeptides de séquence SEQ ID NO: 1 à 92, à savoir un effet immunogène, utile dans la prévention de la maladie de Lyme.

L'homme du métier est à même d'identifier des séquences homologues à partir des séquences des polypeptides utilisables dans la composition vaccinale selon l'invention. Par exemple, une séquence utilisée peut présenter une homologie ou une identité supérieure à 80% avec une séquence décrite dans le Tableau 1, par exemple une identité ou une homologie supérieure à 85%, ou à 90%, ou à 95%, ou à 99% avec une séquence décrite dans le Tableau 1. Dans le Tableau 1 ci-dessus, les séquences de polypeptide figurant sur une même ligne représentent une même protéine dont le nom est indiqué dans la colonne de gauche. « n/a » signifie que le nom de la protéine en question n'a pas été identifié ou n'est pas encore connu. Bien que les polypeptides figurant sur une même ligne représentent une même protéine, leurs séquences d'acides aminés ne sont pas strictement identiques. Cela peut être dû aux mutations possibles qui se sont produites distinctement chez les différentes espèces du genre Borrelia. A titre d'exemples, les séquences SEQ ID NO: 10, 11 et 12, isolées des espèces Borrelia burgdorferi ss, Borrelia afzelii et Borrelia garinii respectivement, représentent une même protéine. Des polypeptides utilisables dans la composition vaccinale selon l'invention peuvent être propres à une espèce de Borrelia donnée, ou communes à deux ou trois espèces de Borrelia choisies parmi Borrelia burgdorferi ss, Borrelia afzelii et Borrelia garinii. Par exemple : - les polypeptides de séquence SEQ ID NO: 1 à 9 sont des protéines propres au clone virulent de Borrelia burgdorferi ss ; - les polypeptides de séquence SEQ ID NO: 10 à 18 sont des protéines communes aux clones virulents de Borrelia burgdorferi ss, Borrelia afzelii et Borrelia garinii ; - les polypeptides de séquence SEQ ID NO: 19 à 28 sont des protéines communes aux clones virulents de Borrelia burgdorferi ss et Borrelia garinii ; - les polypeptides de séquence SEQ ID NO: 29 à 46 sont des protéines communes aux clones virulents de Borrelia burgdorferi ss et Borrelia afzelii ; - les polypeptides de séquence SEQ ID NO: 47 à 72 sont des protéines communes aux deux clones virulents de Borrelia afzelii et Borrelia garinii ; - les polypeptides de séquence SEQ ID NO: 73 à 86 sont des protéines communes à Borrelia burgdorferi ss et Borrelia afzelii ; et - les polypeptides de séquence SEQ ID NO: 87 à 92 sont des protéines communes à Borrelia afzelii et Borrelia Les polypeptides de séquence SEQ ID NO: 1 à 9, 13 à 18, 29 à 32, 37, 38, 51, 52, 57, 58, 71, 72 et 87 à 92 sont des protéines membranaires de Borrelia.

Avantageusement, lorsque la composition comprend une combinaison de polypeptides de séquence SEQ ID NO: 1 à 92, les polypeptides sont des polypeptides de séquences différentes. Avantageusement encore, lorsque la composition comprend une combinaison de polypeptides de séquence SEQ ID NO: 1 à 92, les 2 0 polypeptides représentent des protéines différentes. Avantageusement, lorsque la composition comprend une combinaison de polypeptides de séquence SEQ ID NO: 1 à 92, les polypeptides peuvent être des protéines dont l'association permet d'obtenir une immunisation simultanément contre deux espèces ou les trois espèces 25 Borrelia burgdorferi ss, Borrelia afzelii et Borrelia garinii. En d'autres termes, de manière avantageuse, la composition selon l'invention comprend une protéine commune aux trois espèces précitées ou un mélange de plusieurs protéines, par exemple, 2, 3 ou 4 protéines, voire plus, couvrant ces trois espèces. Ce mode de réalisation permet de fournir 30 des compositions vaccinales universelles vis-à-vis des populations de Borrelia.

Selon un mode de réalisation particulier, la composition vaccinale selon l'invention peut comprendre au moins un polypeptide de Borrelia burgdorferi ss, Borrelia afzelii ou Borrelia garinii choisi parmi SEQ ID NO: 2, 7 à 15, 19, 20, 25, 26, 29, 30, 33 à 36, 41 à 50, 53, 54, 57 à 72 et 85 à 92. De préférence, l'au moins un polypeptide est choisi parmi SEQ ID NO: 10 à 15. Dans ce mode de réalisation, la composition vaccinale peut comprendre en outre au moins un autre polypeptide de Borrelia burgdorferi ss, Borrelia afzelii ou Borrelia garinii choisi parmi SEQ ID NO: 1, 3 à 6, 16 à 18, 21 à 24, 27, 28, 31, 32, 37 à 40, 51, 52, 55, 56 et 73 à 84. En outre, dans ce mode de réalisation, la composition vaccinale peut comprendre en outre, au moins un autre polypeptide de Borrelia burgdorferi, Borrelia afzelii ou Borrelia garinii choisi dans les groupes (cl), (c2) et (c3), ledit groupe (cl) ) comprenant SEQ ID NO: 19 à 28, ledit groupe (c2) comprenant SEQ ID NO: 29 à 46 et 73 à 86, ledit groupe (c3) comprenant SEQ ID NO: 47 à 72 et 87 à 92, à condition que si ladite au moins un polypeptide choisi parmi SEQ ID NO: 2, 7 à 15, 19, 20, 25, 26, 29, 30, 33 à 36, 41 à 50, 53, 54, 57 à 72 et 85 à 92: - est compris dans l'un des groupes (cl ), (c2) ou (c3), ledit au moins un autre polypeptide est compris dans un groupe (cl), (c2) ou (c3) différent, ou - est SEQ ID NO: 2, 7, 8 ou 9, ledit au moins un autre polypeptide est compris dans le groupe (c3), ou - est SEQ ID NO: 10, 11, 12, 13, 14, ou 15, ledit au moins un autre polypeptide est compris dans n'importe lequel des groupes (cl), (c2) et (c3).30 Avantageusement, la composition de l'invention peut comprendre un véhicule pharmaceutiquement acceptable On entend dans la présente par « véhicule pharmaceutiquement acceptable » toute substance permettant de diluer ou transporter au moins un polypeptide de la composition vaccinale selon l'invention. De préférence, le véhicule pharmaceutiquement acceptable n'affecte pas l'efficacité du polypeptide. Le véhicule pharmaceutiquement acceptable peut, par exemple, être une solution aqueuse ou une émulsion. Lorsque le véhicule pharmaceutiquement acceptable est une solution aqueuse, cela peut être, par exemple, une quelconque des solutions présentées dans le document Heitz et al., 2009 (Twenty years of cellpenetrating peptides: from molecular mechanisms to therapeutics. Heitz F et al., Br J Pharmacol. 2009 May;157(2):195-206 [10] ) ou dans le document Wehrlé P. (Wehrlé P., Pharmacie galénique, Formulation et technologie pharmaceutiques, 2007 [11] ) . Lorsque le véhicule pharmaceutiquement acceptable est une émulsion, cela peut être une émulsion eau dans l'huile, huile dans l'eau, eau dans l'huile dans l'eau (Wehrlé P. [11] ) .

La composition vaccinale selon l'invention peut comprendre un adjuvant. On entend par « adjuvant » toute substance capable de faciliter et d'amplifier la réponse immunitaire à l'au moins un polypeptide de la composition vaccinale selon l'invention. Il peut s'agir par exemple de tout adjuvant connu de l'homme du métier pour l'administration de polypeptides. Il peut s'agir par exemple de la saponine (Roatt et al., 2012 [14] ) ou de l'hydroxide d'alumine (Livey et al., 2011 [15] ; Wressnigg et al. 2013 [16] ) La composition vaccinale selon la présente invention peut être utilisée seule ou en combinaison avec tout traitement connu permettant de prévenir la maladie de Lyme.

Selon l'invention, on entend par « utilisé en combinaison », une utilisation de la composition vaccinale selon l'invention de façon conjointe ou simultanée, concomitante, ou successive, avec tout traitement connu permettant de prévenir la maladie de Lyme. Le mode d'administration peut être identique ou différent suivant les molécules co-administrées. On entend par « conjointe ou simultanée », l'utilisation de la composition selon l'invention avec tout traitement connu permettant de prévenir la maladie de Lyme dans une seule composition les contenant. On entend par « concomitante », l'utilisation séparée de la composition vaccinale selon l'invention et de tout traitement connu permettant de prévenir la maladie de Lyme, par des voies d'administration identiques ou différentes durant la même période d'administration. On entend par « successive », l'utilisation séparée de la composition vaccinale selon l'invention et de tout traitement connu permettant de prévenir la maladie de Lyme, par des voies d'administration identiques ou différentes durant des périodes d'administration différentes. On entend par « période d'administration », la durée pendant laquelle un traitement est administré. Il peut, par exemple s'agir de plusieurs jours, par exemple deux jours, trois jours, quatre jours, etc., par exemple une ou plusieurs semaines, par exemple une semaine, deux semaines, trois semaines, etc., par exemple un ou plusieurs mois, par exemple un mois, deux mois, trois mois, etc., par exemple une ou plusieurs années, par exemple un an, deux ans, trois ans, etc..

La présente invention se rapporte également à une composition vaccinale selon l'invention, pour utilisation comme médicament. La présente invention se rapporte également à une composition vaccinale selon l'invention, pour utilisation dans la prévention de la maladie de Lyme.

La composition vaccinale selon l'invention peut donc être utilisée pour la fabrication d'un médicament, en particulier un médicament destiné à prévenir la maladie de Lyme. La composition vaccinale pour utilisation comme médicament ou pour utilisation dans la prévention de la maladie de Lyme peut être destiné à tout mammifère susceptible de contracter ou ayant contracté la maladie de Lyme. En particulier, elle peut être destinée à l'Homme ou au chien, au cheval, aux bovins ou à d'autres ruminants. De préférence, la composition vaccinale selon l'invention est destinée à la prévention de la maladie de Lyme chez le chien. La composition vaccinale selon l'invention, utilisée comme médicament, peut être sous toute forme d'administration appropriée. Il peut s'agir d'une des formes connues par l'homme du métier pour administrer une molécule active qui est un polypeptide (Peppas NA, Carr DA, Chemical engineering Science, 64, 4553-4565 (2009) [12] ; Morishita M, Peppas NA, Drug Discovery Today, 11, 905-910 (2006) [13]). La composition vaccinale selon la présente invention peut, par exemple, être destinée à une administration par injection.

Ainsi, la composition vaccinale selon l'invention peut être conditionnée sous toute forme connue de l'homme du métier en vue d'être administrée par injection. Il peut s'agir par exemple d'un flacon ou d'une ampoule. Par exemple, l'injection peut être une injection intramusculaire ou 25 intradermique. De préférence, l'injection est réalisée par voie intradermique. La composition vaccinale de la présente invention peut être administrée comme médicament, de préférence en quantité suffisante pour prévenir la maladie de Lyme, en particulier pour prévenir celle chez le 30 chien. Par exemple, les polypeptides de la composition vaccinale selon l'invention peuvent être inoculés à des doses comprises entre 10 à 100 pg (Wressnigg et al.,2013 [16]). La synthèse des polypeptides utilisables dans la composition vaccinale selon la présente invention peut être réalisée par tout procédé connu de l'homme du métier. Il peut s'agir par exemple d'une synthèse par génie génétique. Lorsque la synthèse des polypeptides de la composition vaccinale selon l'invention est réalisée par génie génétique, on peut par exemple construire un polypeptide de grande taille comprenant le polypeptide de la composition vaccinale de la présente invention et le digérer avec des enzymes de restriction afin de recueillir ledit polypeptide de la composition vaccinale selon l'invention. On peut par exemple utiliser le protocole décrit dans F. Cordier-Ochsenbein et al. J. Mol. Biol. 279,1177-1185 [17].

La composition vaccinale selon l'invention peut être produite selon toute méthode bien connue de l'homme du métier. Il peut s'agir par exemple d'un simple mélange des différents constituants de la composition vaccinale. Le document de Ramamoorthi et Smooker (2009) [18] décrit un procédé de fabrication de composition vaccinale utilisable dans le cadre de la présente invention. Ainsi, la présente invention fournit des solutions efficaces pour la prévention de la maladie de Lyme. D'autres avantages pourront encore apparaître à l'homme du métier à la lecture des exemples ci-dessous donnés à titre illustratif et non limitatif. EXEMPLES Exemple 1 : Stratégie d'identification de candidats vaccins de Borrelia pour la maladie de Lyme Les inventeurs ont développé une approche protéom igue afin d'identifier et sélectionner des polypeptides efficaces pour la prévention de la maladie de Lyme. Ils ont sélectionné par clonage en milieu solide (De Martino et a/.,2006 [19]), des souches de Borrelia burgdorferi, Borrelia afzelii et Borrelia garinii virulentes et non virulentes sur la souris. Une stratégie GelLC-MS/MS a été utilisée pour comparer les protéines dans chaque culture de Borrelia. 1.1 Matériel et méthodes 1.1.1 Souris, souches bactériennes et conditions de culture Des souris C3H/HeN âgées de trois à quatre semaines ont été utilisées (Charles River Laboratories, L'Arbresle, France. Trois souches de Borrelia burgdorferi sensu lato ont été analysées : - Borrelia burgdorferi ss, souche 297 (A. Steere, USA), isolé du liquide céphalorachidien (LCR) d'un patient - B. garinii, souche PBi (B. Wilske, Allemagne) isolé du LCR d'un patient - B. afzelii, souche 163/98 (E. Ruzic-Sabljic, Slovénie) isolé du LCR d'un patient Pour chaque espèce, les bactéries ont été clonées sur BSK-S. Les clones bactériens ont ensuite été cultivés sur milieu BSK-H (Sigma) et testé sur un modèle de souris selon le protocole décrit dans De Martino et al. [19]. Les clones bactériens ont été sélectionnés pour leur virulence chez la souris. Toutes les souches ont été cultivées en BSK-H milieu complet (Sigma) à 33°C et utilisées à passage bas (<7). Les Borrelia ont été comptées et la viabilité a été vérifiée en microscopie à fond noir. 1.1.2 Fractionnement de protéines, après digestion à la trypsine du gel et nanoLC-MS/MS Pour chaque souche et son clone, les protéines ont été extraites par un tampon Laemmli [20]. Après sonication et centrifugation, le culot est éliminé et la teneur en protéines du surnageant a été déterminée. Les protéines obtenues (75 pg) ont subi une électrophorèse sur SDS-PAGE à 12% et colorées avec du bleu de Coomassie [21]. Des bandes de gel de 2 mm ont été excisées manuellement. La digestion dans le gel a été effectuée comme décrit dans Villiers et al. [22], et les peptides trypsiques ont été extraits par l'addition de 35 pl de 60% (v/v) d'acétonitrile (ACN) et de 0,1% (v/v) d'HCO2H. La nanoLC-MS/MS a été réalisée en utilisant un nanoLC-Chip/MS (Agilent Technologies, Palo Alto, CA) couplé à un piège ionique amaZon (Bruker, Bremen, Allemagne). La puce contenait une colonne Zorbax 300SB-C18 (150 mm x 75 pm, taille des particules de 5 pm) et une colonne d'enrichissement 300SB-C18 Zorbax (40 nL, taille de particules de 5 pm). Le système de solvant se composait de 2% d'ACN, 0,1% HCO2H dans l'eau (solvant A) et de 2% d'eau, 0,1% HCO2H dans de I'ACN (solvant B). 1 pl d'extrait peptidique (1/20 du volume total) a été chargé en duplicat dans la colonne d'enrichissement à une vitesse d'écoulement fixée à 3,75 pl/min avec le solvant A. L'élution a été effectuée à un débit de 300 nl/min avec un gradient linéaire de 8-40% de solvant B pendant 30 minutes suivi d'une étape de 4 min à 70% de solvant B avant le reconditionnement de la colonne à 8% de solvant B. Le spectre MS a été opéré avec les paramètres suivants: température de la source réglée à 145°C et débit de gaz à 4 L/min. La tension de nanoélectronébulisation a été réglée à -1900 V. Les spectres MS ont été réalisés dans le mode ions positifs sur la plage de masses de 250 à 1500 m/z à l'aide du mode de résolution améliorée standard à une fréquence de balayage de 8100 m/z/s.

Le contrôle de la charge ionique a été fixé à 200000 avec un temps d'accumulation maximal de 200 ms et le nombre de moyennes a été fixé à 2. Pour les expériences MS en tandem, le système a été opéré avec commutation automatique entre les modes MS et MS/MS. Les 8 polypeptides les plus abondants ont été sélectionnés sur chaque spectre MS pour un plus grand isolement et une fragmentation, avec une préférence pour les ions doublement chargés (seuil absolu de 100000). La fragmentation a été réalisée en utilisant de l'argon comme gaz de collision. Les ions ont été exclus après l'acquisition d'un spectre MS/MS et libérés après 0,60 min. L'option « Smart Parameters Setting » a été utilisée pour les ions précurseurs sélectionnés. Les spectres MS/MS ont été réalisés sur la gamme de masse de 100 à 2000 m/z. Le contrôle de la charge ionique a été fixé à 400000, et la moyenne de 5 scans a été effectuée pour obtenir un spectre MS/MS. Le système complet a été entièrement contrôlé par le logiciel Hystar 3.2 (Bruker). 1.1.3 Analyse des données Les données de masse collectées pendant la nanoLC-MS/MS ont été traitées, transformées en fichiers ".mgr avec le logiciel DataAnalysis 4.0 (Bruker) et interprétées en utilisant les algorithmes MASCOT 2.4.3 (Matrix Science, Londres, Royaume-Uni) [23] et OMSSA 2.1.7 (Open Mass Spectrometry Search Algorrithm, Maryland, USA) [24]. Les recherches ont été effectuées sans aucun poids moléculaire, ou restriction de point isoélectrique contre trois bases de données de protéines composées de séquences de protéines de Borrelia burgdorferi ss B31, Borrelia garinii PBi et Borrelia afzelii PKo téléchargées sur la base de données non redondante du Centre National de l'Information en Biotechnologies (NCBInr, le 16 août 2012). Les protéines contaminantes connues comme la kératine humaine et la trypsine, ont été ajoutées à chaque base de données et liées avec des copies inversées de toutes les séquences (B. burgdorferi ss B31 : 1758 entrées; B. garinii PBi : 1720 entrées; B. afzelii PKo : 2157 entrées). Les bases de données B. burgdorferi ss B31 et B. afzelii PKo ont été utilisées car les souches B. burgdorferi ss 297 et B. afzelii 163 respectivement n'ont pas encore été séquencées. La trypsine a été choisie comme enzyme et une tolérance de masse des fragments de 0,5 Da pour les données MS/MS. Un maximum de 2 clivages manqués a été accepté et quelques modifications ont été prises en compte : carbamidomethyl (C), acétyle N-terminale de la protéine, oxydation (M). Les résultats des algorithmes MASCOT et OMSSA étaient indépendamment chargés dans le logiciel Scaffold (Proteome Software, Portland, OR). La recherche de base de données cible-leurre a permis de contrôler le taux d'identification de faux positifs qui a été fixé à 1% avec un minimum d'un peptide par protéine.

Chaque échantillon a été traité deux fois. Les comptes spectraux pour chaque répétition ont été déterminés à partir du nombre de spectres MS/MS, identifiés à partir des protéines validées par les moteurs de recherche. Le test binomial bêta [25] mis en oeuvre en R a été utilisé pour déterminer la sur-régulation des protéines (p < 0,05) dans chaque clone virulent par rapport à la souche de type sauvage. Le test a été effectué indépendamment pour chacun des moteurs de recherche, car les identifications spectrales sont algorithme-dépendant. Nous nous sommes concentrés sur les protéines régulées à la hausse qui se chevauchent entre les deux algorithmes de recherche. 1.2 Résultats 1.2.1 Reproductibilité de l'identification de protéines bactériennes selon l'injection et l'algorithme de recherche utilisé. Chaque échantillon a été analysé en duplicat. L'identification des protéines présentes dans chaque répétition a été réalisée en utilisant une combinaison des deux moteurs de recherche: Mascot et OMSSA. Ainsi, la reproductibilité des identifications a été évaluée pour les deux algorithmes de recherche. Le chevauchement entre deux répétitions est élevé (> 90% dans la plupart des cas) et quelques protéines ont spécifiquement été identifiées dans une répétition. Cette proportion est plus élevée chez Mascot par rapport à OMSSA. Ces identifications spécifiques pourraient s'expliquer soit par la faible quantité de ces protéines, soit par la variabilité due au mode d'acquisition dépendant des données (DDA). Afin de comparer les identifications obtenues en utilisant les moteurs de recherche, nous avons fusionné les identifications de duplicats. Pour tous les échantillons, il y a un chevauchement entre Mascot et OMSSA (> 85%). Quelques protéines sont observées spécifiquement par un seul algorithme. La combinaison du moteur de recherche mène à plus de 5% d'identification dans le cas présent. 1.2.2 Polypeptides impliqués dans la transmission bactérienne Pour chaque espèce, les identifications obtenues par Mascot ou OMSSA ont été fusionnées et les profils protéiques de type sauvage (WT) et des clones virulents ont été comparés par les inventeurs. Plus de 800 protéines ont été identifiées dans chaque cas et un chevauchement important entre les clones sauvages et virulents ont été observés : près de 90% pour B. burgdorferi ss et B. garinii et 80% pour B. afzelii. La quantité de protéines identifiées augmente jusqu'à 913 protéines pour le clone virulent de B. afzelii. Il a ainsi été constaté, pour chaque espèce, une proportion importante de protéines détectées que dans les clones virulents (jusqu'à 110 pour B. burgdorferi ss).

Par ailleurs, des protéines présentes dans deux souches de Borrelia (tronc commun) mais qui sont sur-régulées dans le clone virulent, ont été détectées. Par conséquent, une stratégie de comptage spectrale couplée à l'essai bêta-binomial [25] a été utilisée pour mettre en évidence de manière significative les protéines sur-régulées dans le clone virulent par rapport à la souche sauvage (p <0,05). Des tests statistiques ont été réalisés indépendamment pour Mascot et OMSSA car le nombre de spectres assignés est généralement variable entre les deux moteurs de recherche [26] . Une protéine avec une valeur p inférieure à 0,05 dans Mascot et OMSSA a été considérée comme sur-régulée afin de limiter le nombre de faux positifs. Le nombre de protéines sur-régulées dépend de l'espèce considérée. 31 protéines sur-régulées ont été détectées pour B. burgdorferi ss, 43 pour B. garinii et 72 pour B. afzelii. Les protéines homologues chez les trois espèces ont été déterminées en utilisant le programme blastp [27] avec un seuil de E- valeur fixé à 10-30. Trois protéines étaient communes aux trois espèces et 27 protéines étaient communes à au moins deux des trois espèces (voir tableau 1 ci-dessus). Quarante protéines de Borrelia ont ainsi été retenues (représentées par les 92 séquences de polypeptides de séquence SEQ ID NO: 1 à 92 dans le tableau 1 ci-dessus) parmi plus d'un millier de protéines identifiées pour les espèces appartenant à ce genre. - Trois protéines sont communes à tous les clones virulents et n'ont pas été détectées dans des souches natives: la première, BB0173 (SEQ ID NO: 13) possède un domaine du facteur de von Willebrand de type A (VWA) qui est connu pour être impliqué dans l'adhésion cellulaire. La seconde, BB0566 (SEQ ID NO: 10), possède un domaine de type « Sulfate Transporter and Anti-sigma factor antagonist » (STAS). Les facteurs sigma sont des éléments clés dans l'activation de la transcription de l'ARN polymérase (ARNP) impliquée dans la régulation de Borrelia. La troisième protéine, BB0722 (SEQ ID NO: 16), n'a pas encore été décrite dans la littérature, mais semble être une protéine associée à la membrane. - D'autres protéines sont liées à noyau catalytique RNAP: l'unité (rpoC) et le facteur sigma-54 (RpoN). Par exemple, BAPK00873 (SEQ ID NO: 59) contient un domaine w d'une sous-unité ARN polymérase (RpoZ). BB0765 (SEQ ID NO: 27) contient un domaine III de l'ADN polymérase (DNAX). Ces protéines sont liées à la voie RpoN-RpoS qui joue un rôle important dans la pathogénicité et la survie microbienne (Radolf et al., 2012 [3] ). Chez B. burgdorferi, RpoN active directement la transcription du RpoS qui, à son tour, commande l'expression des lipoprotéines membranaires associées à la virulence (OspA, OspC, protéines se liant à la décorine). Une protéine associée à un nucléotide EBfC apparaît comme un régulateur global de l'expression génique dans Borrelia. L'augmentation des niveaux EBfC influence l'expression des gènes de B. burgdorferi de l'ordre de 4,5%, y compris des gènes associés à l'infection. D'autres protéines impliquées dans la réplication de l'ADN, la recombinaison et la réparation (ADN hélicase et SBCD exonucléase), ou dans le traitement ARNt ont également été identifiées. - Quatre protéines identifiées sont relatives aux flagelles périplasmiques : FIiE, FliP, FIgE et l'ATP synthase spécifique du flagelle (Flil). La mobilité est cruciale pour le cycle infectieux de Borrelia burgdorferi et les flagelles périplasmiques sont indispensables pour assurer une mobilité suffisante aux bactéries. Il a été montré que l'inactivation de gènes codant pour des protéines de flagelles conduit à des bactéries non mobiles. Une autre étude a montré que la perte de flagelles diminue l'infection de B. garinii. - BB0527 (SEQ ID NO: 43) homologue à Baf (facteur accessoire Bvg) a également été identifié. Cette protéine a un effet inhibiteur sur l'activité de la phosphatase alcaline et influe donc directement sur l'expression de la protéine de la membrane externe P66. Parmi les protéines surexprimées, la 5-m ethylth ioadenosine/S- adenosylhomocysteine (SEQ ID NO: 87) a également été identifiée. Cette protéine fait partie intégrante du cycle de méthylation. Une étude récente a montré que l'inhibition de cette enzyme peut atténuer la virulence bactérienne. - Plusieurs protéines identifiées sont impliquées dans le métabolisme des glucides comme les protéines liées au système phosphotransférase (PTS), ou dans la biosynthèse des lipides et du métabolisme, comme la protéine porteuse d'acyle (ACP). D'autres protéines sont hypothétiques et n'ont pas de fonction définie à ce jour.

Exemple 2 : Etude de l'inflammation cutanée chez la souris, après inoculations différents pathotypes humains de Borrelia burgdorferi sensu stricto La peau constitue un organe essentiel dans le développement de la borréliose de Lyme puisque Borrelia y est inoculée et s'y multiplie avant de disséminer dans l'organisme pour atteindre les organes cibles : l'articulation, le système nerveux et la peau à distance. Différents isolats cliniques humains de B. burgdorferi ss (pathotypes), avec différents facteurs de virulence de type RSTs (16S-23S rRNA intergenic spacer type) ont été sélectionnés. Les réponses inflammatoires au niveau cutané dans un modèle murin ont été comparées selon le protocole décrit ci-après afin de déterminer si l'immunité de la peau jouait un rôle dans l'organotropisme des souches bactériennes.. La souris constitue en effet un modèle de choix pour comprendre les mécanismes pathogénicité de B. burgdorferi sl [28]. 2.1 Matériel et méthodes 2.1.1 Souris et souches bactériennes Des souris C3H/HeN âgées de trois à quatre semaines ont été utilisées (Charles River Laboratories, L'Arbresle, France) Les souches de Borrelia burgdorferi sensu stricto ont été isolées de patients atteints de différentes manifestations cliniques: la souche PBre (RST1) d'un érythème migrant (EM) (lésion unique - Allemagne), la souche MR726 (RST3) d'un érythème migrant multiple (Etats-Unis), la souche 1808/03 (RST1) de liquide céphalo-rachidien (Slovénie) et la souche 297 (RST2) de liquide céphalo-rachidien également (Etats-Unis). Le clone Borrelia c297/4 a été sélectionné par culture sur milieu BSK solide [19]. Toutes les souches ont été cultivées en BSK-H milieu complet (Sigma) à 33°C et utilisées à passage bas (<7). Les Borrelia ont été comptées et la viabilité a été vérifiée en microscopie à fond noir. 2.1.2 Suivi de l'infection de la souris Les souris ont été infectées avec 103 spirochètes dans 0,1 ml de milieu BSK par voie intradermique dans la région dorso-lombaire. Les souris témoins ont été injectées avec un volume égal de milieu BSK stérile et maintenues dans les mêmes conditions que les animaux infectés. Évaluation de l'arthrite a été réalisée toutes les semaines en mesurant l'épaisseur des deux articulations tibio-tarsiennes avec un pied à coulisse métrique. Des mesures conjointes ont fourni une indication de la gravité de l'arthrite. La sérologie a été réalisée comme décrit dans Kern et al. [29]. À différents moments après le début de l'expérience (0h, 5h, 24h, 3j, 5j, 7j, 15j et 30j après l'infection) les souris ont été tuées par surdose de gaz isoflurane. Environ 1 cm de peau a été recueilli sur le site de l'inoculation et stockées dans du Trizol (marque déposée) (Invitrogen). L'oreille, la base du coeur, la vessie et les articulations tibio-tarsiennes de chaque souris ont été recueillies de manière aseptique et divisées en deux parties, pour la PCR et la culture de Borrelia. Les organes des souris non infectées ont été collectés dans les mêmes conditions que les souris positives. 2.1.3 Détection de B. burqdorferi dans les organes de souris Pour la détection des spirochètes par culture, les organes prélevés ont été placés dans 6 ml de milieu BSK-H contenant 30 pg de rifampicine (BioRad). Les tubes ont été maintenus à 33 °C, et la présence de spirochètes a été examinée toutes les semaines en microscopie à fond noir. Pour la PCR, l'ADN a été extrait des organes de chaque souris sur un système MagNA Pure (Roche Diagnostics, France), en utilisant un kit d'isolation MagNA Pure LC large-volume après lyse externe. Le coeur, la vessie, l'oreille et la peau ont été placés dans 500 pl de tampon de lyse contenant de la protéinase K. D'autres échantillons ont été traités avec une lyse externe par la collagénase A, puis la protéinase K. Tous les échantillons d'ADN ont finalement été élues dans 100 pl de tampon d'élution. Dix pL d'ADN de Borrelia ont été utilisés comme témoin positif pour la détection. L'amplification qualitative a été effectuée comme décrit dans Woods et al. [30]. , en ciblant le gène de la flagelline. 2.1.4 Quantification de la charge de spirochètes et des gènes inflammatoires de la peau de la souris Sur le site d'inoculation, la quantification du gène de la flagelline spécifique de B. burgdorferi a été réalisée sur un système LightCycler (Roche Diagnostics, France). Les amorces utilisées pour amplifier le gène fla étaient celles décrites dans Kern et al. [29].

Pour mesurer l'inflammation au site d'inoculation, l'ARN total a été extrait à partir de 10 mg de peau de souris en utilisant le réactif Trizol selon les indications du fabricant (Invitrogen). Les échantillons ont été traités par DNAse (Ambion, USA) puis un premier brin d'ADNc a été synthétisé à partir de 1 pg d'ARN total en utilisant la transcriptase inverse SuperScript II (Invitrogen Life Technologies). La quantification de gapdh a été réalisée comme étalon interne. Les niveaux d'expression relatifs ont été calculés en utilisant un animal infecté comme calibrateur. L'amplification et la détection ont été réalisées avec un système ABI 7000 avec le profil thermique ci-après: 95 °C pendant 10 minutes, 50 cycles de 95 °C pendant 15 s, à 60 °C pendant 1 min. Les amorces utilisées pour tous les gènes étudiés sont décrites dans Kern et al. [29]. 2.1.5 Comparaison du profil protéique de la souche B. burgdorferi 297, de la souche de type sauvage et du clone virulent c297/4 Les cultures de B. burgdorferi 297, de la souche sauvage et du clone virulent c297/4, ont été mis en suspension dans du tampon Laemmli [20]. Le protocole présenté aux exemples 1.1.2 et 1.1.3 ci-dessus a ensuite été appliqué. 2.1.6 Dynamique des gènes de B. burgdorferi 297, de la souche de type sauvage et du clone virulent c297/4, dans la peau de souris au site d'inoculation À différents temps (0h, 5h, 24h, 3j, 5j, 7j, 15j et 30j après l'infection), des échantillons de peau ont été prélevés chez chaque souris au site d'inoculation. L'ARN total a été purifié en utilisant le réactif Trizol selon les instructions du fabricant. La concentration et la pureté des ARN extraits ont été déterminées par mesure de la densité optique à A260 et A280. Les échantillons ont ensuite été traités avec de la gDNAse (QIAGEN) afin d'éliminer la contamination par de l'ADN. Les ARN totaux extraits ont été soumises à la Quantiscript Reverse Transcription (QIAGEN) pour produire l'ADNc. L'ADNc a été utilisé pour quantifier les gènes ospC et bbk32. Pour B. burgdorferi C297/4, les gènes sélectionnés correspondant à des protéines de l'enveloppe cellulaire ont été retenus pour la RT-PCR. Les niveaux d'expression relatifs ont été calculés en utilisant la méthode AACt avec la flagellin comme standard interne. L'amplification et la détection ont été réalisées avec un système ABI 7500 avec le profil thermique ci-après: 95 °C pendant 10 minutes, 50 cycles de 95 °C pendant 15 s, à 50 °C pendant 30 s et 60 °C pendant 1 min. Chaque condition d'amplification a été comparée au jour 3 pour la quantification relative. Les facteurs de corrélation ont été calculés en comparant l'amplification d'ADNc de chaque point de cinétique de la souche native à l'amplification d'ADNc de chaque point du clone hypervirulent. Ensuite, la courbe obtenue pour le clone, a été normalisée par ces facteurs pour obtenir une seconde courbe, représentative de la souche sauvage, et quantitativement comparable au clone. 2.1.7 Analyse statistique Chaque expérience a été réalisée au moins trois fois. Pour chacune des RT-PCR, au moins deux extractions ont été réalisées pour chaque souris dans chaque expérience, avec deux à trois souris pour chaque point. 2.2 Résultats 2.2.1 Transmission et diffusion des différents pathotypes de B. burgdorferi ss chez la souris Toutes les souches étudiées ont montré une tendance similaire de diffusion. Borrelia a été détectée au jour 3 par PCR dans la peau, sur le site d'inoculation, pour toutes les souches. Elles ont diffusé rapidement dans l'articulation, où elles ont d'abord été détectées au jour 5 ou 7, puis vers le coeur et la vessie au jour 5, 7 ou 15, et la dissémination la plus lente s'est produite dans l'oreille (peau à distance du site d'inoculation),. Le pathotype PBre, isolé de l'érythème migrant (EM) a diffusé plus lentement vers le coeur et la vessie, par rapport aux autres. En ELISA, toutes les souris se sont positivées aux antigènes de Borrelia 15 jours après l'inoculation bactérienne. 2.2.2 Quantification des pathotypes de Borrelia et mesure de l'inflammation au site d'inoculation La charge bactérienne de la peau a été mesurée. Toutes les souches se sont multipliées de façon intensive au jour 7, mais sans différence significative observée entre les souches testées. Le profil inflammatoire dans la peau des souris a été comparé pour ces différentes souches de B. burgdorferi ss. Les peptides antimicrobiens (AMPs), marqueurs de l'immunité innée des epithelia, ont été mesurés. La souche PBre (EM) a induit une quantité significative de cathelicidine avec un pic au jour 3. La souche MR726 (MEM) a induit fortement la défensine mBD-3. La souche 297 de type sauvage (CSF) a présenté un pic de mBD3 à 24h tandis que la souche 1808/03 (CSF) a induit une quantité négligeable de l'ensemble des trois AMPs testés. L'induction de molécules pro-inflammatoires supplémentaires a ensuite été mesurée: TNF-a, IL-6, IL-22 et la chimiokine MCP-1. Pour chacune d'eux, un pic d'induction de TNF-a et/ou de MCP-1 a été observé au jour 7. La souche MR726 isolée d'une lésion du MEM, a induit le profil inflammatoire plus fort au niveau de la peau de souris avec un pic de MCP-1 (150 fois) au jour 7. 2.2.3 Analyse spécifique de l'inflammation induite par B. burgdorferi ss 297 souche sauvage et son clone hypervirulent L'infection à Borrelia pourrait être initiée par une population hétérogène de Borrelia chez l'hôte vertébré. Un clone C297/4 de B. burgdorferi ss 297 a été sélectionné au laboratoire pour sa diffusion rapide et ses manifestations neurologiques chez la souris [31]. Le clone virulent C297/4 a provoqué une inflammation de la peau avec une induction plus importante des défensines, MBD-14, et de cathelicidine par rapport à la souche sauvage. Une très forte induction de MCP-1 et d'IL-6, environ 100 fois plus induction, a été observée pour le clone C297/4 par rapport à la souche sauvage. Les résultats de la souche 297 sauvage et du clone hypervirulent ont également été comparés chez la souris C3H/HeN. Le clone hypervirulent a diffusé plus rapidement vers l'articulation, alors que la diffusion aux autres organes était semblable à celui de la souche sauvage. La quantification de la charge bactérienne dans les tissus a confirmé la multiplication intense se produisant dans la peau au jour 7 quelle que soit la souche utilisée, mais aucune différence significative n'a été observée entre le clone hypervirulent et la souche sauvage 297. 2.2.4 Caractérisation protéomique des souches B. burqdorferi ss, 297 sauvage et du clone hypervirulent. Le protocole présenté aux exemples 1.2.1 et 1.2.2 ci-dessus a été appliqué. Un total de 887 protéines ont été identifiées avec 848 protéines c297/4 et 777 protéines dans la souche de type sauvage. Nous avons observé un chevauchement de 738 protéines qui représente 83% du nombre total. 110 protéines sont spécifiques du clone hypervirulent. 2.2.5 Expression comparative des protéines spécifiques des clones de type sauvage et hypervirulent de B. burgdorferi 297 dans la peau de la souris par RT-PCR. La cinétique d'expression d'OspC et BBK32, deux protéines importantes dans la transmission de Borrelia a été réalisée pour les souches de type sauvage et c297/4. Les deux souches présentent un premier pic d'expression d'OspC au jour 5, tandis qu'un pic d'expression de BBK32 a été observé au jour 7. Puis, des protéines de surface de Borrelia ont été sélectionnées parmi les 110 protéines spécifiques du clone hypervirulent, et leur expression a été suivie au cours de l'inflammation cutanée chez la souris C3H/HeN. Trois gènes sont fortement exprimés dans les deux souches, bb0304, bb0213 et bb0347 avec un pic d'expression au jour 5 pour le clone hypervirulent et au jour 7 pour la souche sauvage. Exemple 3 : Sélection des candidats vaccinaux et détermination de l'effet immunogène Les différentes protéines sont testées dans un modèle murin C3H/HeN afin de voir leur expression au niveau de la peau, lors de la transmission de la bactérie. En effet, l'interface cutanée semble jouer un rôle clef dans la sélection de certaines populations bactériennes (Brisson et al., 2011 [32]). La peau des souris infectées par voie intradermique est prélevée à 3, 5, 7 et 15 jours. Après design des amorces spécifiques pour chacune des protéines, la technique de RT-PCR est utilisée pour suivre l'expression de ces protéines dans la peau. Les plus exprimées dans la peau sont alors retenues. Elles sont ensuite clonées (Steere et al., 1998 [33]; Ramamoorthi et Smooker, 2009 [18] ; Livey et al., 2011 [15]) et exprimées chez E. coll. Elles sont inoculées par voie intradermique à la souris et le taux en anticorps est mesuré par Elisa. En effet, la réponse en anticorps apparaît essentielle pour mesurer un effet protecteur lors de la borréliose de Lyme (Embers et Narasimhan, 2013 [34]). Leur effet protecteur est testé par challenge avec des Borrelia inoculées à la seringue, ou mieux avec des tiques infectées par Borrelia. Les souris vaccinées et challengées sont ensuite disséquées et leurs organes cultivés ou testés en PCR afin de mesurer l'absence de Borrelia (Kern et al., 2011 [29]).

Ce protocole peut être réalisé en inoculation intradermique, chez le chien, avec un adjuvant de type saponine ou hydroxide d'alumine.

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Claims (10)

1. REVENDICATIONS1. Composition vaccinale comprenant : au moins un polypeptide de Borrelia burgdorferi ss choisi parmi SEQ ID NO: 10, 13, 2, 7 à 9, 19, 25, 29, 33, 35, 41, 43, 45 et 85.
2. 2. Composition vaccinale selon la revendication 1, dans laquelle l'au moins un polypeptide de Borrelia burgdorferi ss est choisi parmi SEQ ID NO: 10 et 13.
3. 3. Composition vaccinale selon la revendication 1 ou 2, comprenant en plus de l'au moins un polypeptide de la revendication 1, au moins un polypeptide de Borrelia burgdorferi ss, Borrelia afzelii ou Borrelia garinii choisi parmi SEQ ID NO: 1, 3 à 6, 11, 12, 14 à 18, 20 à 24, 26 à 28, 30 à 32, 34, 36 à 40, 42, 44, 46 à 84 et 86 à 92.
4. 4. Composition selon l'un quelconque des revendications 1 à 3, comprenant en plus de l'au moins un polypeptide de la revendication 1, au moins un autre polypeptide de Borrelia burgdorferi ss, Borrelia afzelii ou Borrelia garinii choisi dans les groupes (cl), (c2) et (c3), ledit groupe (cl) comprenant SEQ ID NO: 19 à 28, ledit groupe (c2) comprenant SEQ ID NO: 29 à 46 et 73 à 86, ledit groupe (c3) comprenant SEQ ID NO: 47 à 72 et 87 à 92, à condition que si ladite au moins un polypeptide de la revendication 1 est : - comprise dans l'un des groupes (cl) ou (c2), ledit au moins un autre polypeptide est compris dans un groupe (cl) ou (c2) différent ou dans le groupe (c3), ou - est SEQ ID NO: 2, 7, 8 ou 9, ledit au moins un autre polypeptide est compris dans le groupe (c3), ou - est SEQ ID NO: 10 ou 13, ledit au moins un autre polypeptide est compris dans un n'importe lequel des groupes (cl), (c2) et (c3).
5. 5. Composition selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, comprenant en outre un véhicule pharmaceutiquement acceptable.
6. 6. Composition vaccinale selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, comprenant un adjuvant.
7. 7. Composition vaccinale selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, dans laquelle l'adjuvant est choisi parmi une saponine ou un hydroxide d'alumine.
8. 8. Composition vaccinale selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, comprenant au moins un autre principe actif.
9. 9. Composition vaccinale selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, pour utilisation comme médicament.
10. 10. Composition vaccinale selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, pour utilisation dans la prévention de la maladie de 2 0 Lyme.