WO2014204258A1 - 세포벽 결함 효모 변이주를 이용한 재조합 단백질 분비능이 향상된 효모 균주의 스크리닝 방법 - Google Patents

세포벽 결함 효모 변이주를 이용한 재조합 단백질 분비능이 향상된 효모 균주의 스크리닝 방법 Download PDF

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gas1
yeast
strain
cell wall
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오두병
서훈
황동현
권오석
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Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology KRIBB
Original Assignee
Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology KRIBB
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1048—Glycosyltransferases (2.4)
    • C12N9/1051—Hexosyltransferases (2.4.1)

Definitions

  • the present invention relates to a method for screening a yeast strain secreting the introduced protein, a method for improving the secretion ability of the target protein, a method for producing the target protein, and a method for producing a yeast mutant strain with improved secretion capacity of Gas1 or a fusion protein thereof.
  • Protein drug development began with the universalization of genetic recombination technology.
  • recombinant protein drug production technology which produces useful proteins such as antibodies, hormones, vaccines, and biofunctional proteins, which are limited in production, in mass production in microbial host cells, is used as a representative of microorganisms using microorganisms as cell factories. Emerging as a technology.
  • the development of recombinant drug production technology using microbial expression system capable of mass production at low cost is expected to contribute greatly to the future growth of the pharmaceutical industry.
  • the present inventors endeavored to develop a screening system for efficient selection of yeast strains that secrete and / or enhance expression of foreign recombinant proteins, thereby developing a system in which foreign recombinant proteins are fused to the N-terminus of Gas1 protein. If the gas1 fusion protein is secreted well, the strain grows well, whereas if it is not secreted well, the strain is prevented from growing by screening system that can efficiently select strains that are well secreted and / or expressed. The present invention has been completed.
  • One object of the present invention is to (a) a nucleic acid encoding a fusion protein in which the domains excluding the signal peptide, the target protein and the signal peptide of the Gas1 protein are fused in sequence from the N-terminus to the yeast mutant wherein the gene encoding Gas1 is deleted. Introducing; (b) culturing the yeast mutant strain into which the nucleic acid is introduced under cell wall stress conditions; And (c) comparing the growth of the yeast mutant strain into which the nucleic acid encoding the fusion protein is introduced with the yeast mutant strain in which the gene encoding Gas1 is deleted. It is to provide a method for screening.
  • Another object of the present invention includes the step of introducing a nucleic acid encoding a fusion protein comprising a signal peptide at the N-terminal and the target protein and the Gas1 protein fused to the yeast expressing the Gas1 protein or a variant thereof It is to provide a method for improving secretion ability.
  • Still another object of the present invention is to provide a method for preparing a target protein, comprising introducing a nucleic acid encoding a target protein into a yeast strain screened by the screening method.
  • Still another object of the present invention is to introduce a nucleic acid encoding a fusion protein in which the domains except the signal peptide, the target protein, the linker and the Gas1 protein are fused in sequence to the yeast strain screened by the screening method from the N-terminus. It provides a method for producing a target protein, comprising the step of.
  • Still another object of the present invention is a method for preparing a yeast mutant strain having improved secretion capacity of Gas1 or a fusion protein thereof, comprising: (a) preparing a yeast mutant strain by introducing a mutation into the yeast expressing Gas1 protein; (b) inhibiting the expression of Gas1 protein by causing mutations in the gene of Gas1 or a site involved in its expression in yeast expressing Gas1 protein; And (c) introducing a nucleic acid encoding a Gas1 protein or a fusion protein thereof into the yeast mutant strain obtained by performing the steps (a) and (b); And (d) selecting the yeast mutants which survive the culturing of the yeast mutants obtained from the step (c) under cell wall stress conditions, and the steps (a) and (b) may be performed sequentially or in reverse order. It is to provide a manufacturing method.
  • Still another object of the present invention is to provide a yeast strain having improved secretion capacity of a target protein compared to the wild type screened by the screening method.
  • Still another object of the present invention is to provide a nucleic acid encoding a fusion protein comprising a signal peptide at the N-terminus and a target protein and a Gas1 protein fused to a yeast expressing Gas1 protein or a variant thereof; And (b) culturing the yeast mutant strain into which the nucleic acid has been introduced, under cell wall stress conditions.
  • yeast strain wherein the target protein prepared using the GAS1 deficient strain inhibited growth under the cell wall stress condition of the present invention expresses the fusion protein coupled to the N-terminus of the Gas1 protein. Since yeast strains with increased secretion capacity can be effectively identified by confirming an increase in growth capacity, it can be usefully used to select strains with improved secretion capacity from a series of mutant libraries prepared by random mutations for mass production of recombinant proteins.
  • FIG. 1 is a conceptual diagram of a screening system for selecting a high-secretion yeast strain through the survival screening to recover the cell growth in the cell wall stress conditions by expressing a fusion protein of Gas1 and foreign recombinant protein in a GAS1 deficient strain according to the present invention.
  • (A) to (C) are wild-type strains, yeast mutants lacking the GAS1 gene expressing the low secreting foreign recombinant protein (NS) and Gas1 fusion protein, respectively, and expressing the high secreting foreign recombinant protein (S) and Gas1 fusion protein, respectively.
  • yeast mutant strains lacking the GAS1 gene gas1 action and growth under cell wall stress conditions are shown.
  • Gas1 protein is involved in ⁇ -1,3-glucan cell wall synthesis on the cell surface, and wild type yeast strain expressing Gas1 is capable of growing even under cell wall stress conditions.
  • B shows that yeast mutants lacking the GAS1 gene expressing low secretion foreign recombinant protein (NS) and Gas1 fusion protein inhibit cell wall synthesis, thus weakening the cell wall and thus preventing growth under cell wall stress conditions.
  • C is a diagram showing that Gas1 is secreted out of cells and functions normally at the cell surface by fusion with a highly secreted foreign recombinant protein, thereby allowing growth even under cell wall stress conditions.
  • Figure 2 is a diagram showing the domain structure of (A) various Gas1 fusion proteins according to the invention and (B) a vector expressing it.
  • Saccharomyces cerevisae yeast-derived protein Gas1 (Gas1 1-559) with a signal peptide (signal peptide; SP) to the template the gene expressing the protein (MF ⁇ -Gas1 23-559) has been replaced with the signal peptide of the MF ⁇ (mating factor alpha)
  • YEp352-G1 and YEp352-M-G1 expression vectors were constructed by cloning into a vector YEp352ScGADHpt.
  • glucocerebrosidase (Gcase) genes and ⁇ -galactosidase (GLA) genes of human glucocerebrosidase (Gcase) genes were expressed using YEp352-M to express fusion proteins with foreign recombinant proteins. Cloning into the -G1 vector, YEp352-M-Gcase-G1 and YEp352-M-GLA-G1 expression vectors were constructed, respectively.
  • FIG. 3 shows wild type S. cerevisiae yeast strain; GAS1 deficient strain of the yeast ( ScGAS1 ⁇ ); And a view showing the response to Gas1 or a Gas1 GAS1 and cell wall stress conditions of deficient strain expressing a fusion protein of a foreign recombinant protein.
  • the yeast strains in each lane were as follows:
  • Saccharomyces cerevisiae BY4741 wild type strain S. cerevisiae BY4741
  • FIG. 4 is a schematic diagram of homologous recombination cloning in vivo for screening S. cerevisiae strains secreting and expressing a foreign recombinant protein mutated by error-prone PCR (error-prone PCR).
  • error-prone PCR In real-time PCR, forward and reverse primers were used that additionally contain a sequence of 30 bp or more at the 5′-end, which is homologous to the vector.
  • a foreign recombinant protein site is formed by forming a recombinant vector that is circularly formed by homologous recombination reaction in yeast.
  • the Gas1 fusion protein into which the mutation was introduced is expressed.
  • FIG. 5 is a diagram showing a signal peptide portion of the amino acid sequence of the Gas1 protein (HpGas1) of Hansenula polymorpha predicted by the SignalP-4.1 program. From this, the N-terminal to the 21st amino acid were predicted as a signal peptide.
  • HpGas1 Gas1 protein
  • Figure 6 is a diagram showing the domain structure of (A) H. polymorpha Gas1 (HpGas1) and fusion proteins coupled thereto prepared for introduction into H. polymorpha GAS1 deletion strain ( HpGAS1 ⁇ ) and (B) expression vector of the fusion protein to be.
  • polymorpha and a signal peptide (MF ⁇ -HpGas1 22-546 ) replaced with those of MF ⁇ and a protein (ASS-HpGas1 replaced with signal sequence (ASS) of amylase 22-546 ) genes were cloned into the template vector pDLMOX to prepare pDLMOX-G1, pDLMOX-M-G1 and pDLMOX-A-G1 vectors, respectively.
  • Gcase and GLA genes were cloned into pDLMOX-M-G1 and pDLMOX-A-G1 vectors using EcoRI restriction enzymes for expression of fusion proteins with foreign recombinant proteins, respectively, pDLMOX-M-Gcase-G1 and pDLMOX-.
  • M-GLA-G1, pDLMOX-A-Gcase-G1, and pDLMOX-A-GLA-G1 were constructed.
  • yeast 7 shows wild type H. polymorpha yeast strain; GAS1 deficient strain ( HpGAS1 ⁇ ) of the yeast; And a signal peptide of natural form, MF ⁇ or ASS, and showing the response to cell wall stress conditions of GAS1 deficient strains expressing a fusion protein of HpGas1 or HpGas1 with foreign recombinant protein.
  • the series of yeast strains were cultured using 1% methanol complex medium at (A) 37 ° C., which is a general culture condition, or in a medium containing 100 ⁇ g / ml Congo red, which is a cell wall stress condition, to compare growth rates.
  • Yeasts cultured from the liquid medium to the exponential growth period were diluted 10-fold from the left to compare the growth rate.
  • the yeast strains in each lane were as follows:
  • HpOCH1 gene deletion Hansenula polymorpha DL1-g22 strain H. polymorpha DL1-g22
  • HpGAS1 gene deletion Hansenula polymorpha DL1-g22 mutant H. polymorpha DL1-g22 HpGAS1 ⁇
  • HpGAS1 deletion mutant strain ( HpGAS1 ⁇ / pDLMOX-G1) expressing HpGas1 ,
  • HpGAS1 deficient mutant (HpGAS1 ⁇ / pDLMOX-M-G1 ) were expressing MF ⁇ HpGas1 with a signal peptide
  • HpGAS1 deletion mutant ( HpGAS1 ⁇ / pDLMOX-A-G1) expressing HpGas1 with an ASS signal peptide
  • HpGAS1 deletion mutant ( HpGAS1 ⁇ / pDLMOX-M-Gcase-G1), which expressed a MF ⁇ signal peptide, Gcase and a fusion protein linked to HpGas1 ,
  • HpGAS1 deletion mutant ( HpGAS1 ⁇ / pDLMOX-A-Gcase-G1) expressing ASS signal peptide, Gcase and HpGas1 linked fusion proteins
  • HpGAS1 deficient mutant HpGAS1 ⁇ / pDLMOX-M-GLA -G1 was GLA and expressing the fusion protein associated with HpGas1, and
  • HpGAS1 deletion mutant ( HpGAS1 ⁇ / pDLMOX-A-GLA-G1) expressing ASS signal peptide, GLA and HpGas1 linked fusion proteins.
  • the present invention comprises the steps of: (a) introducing a nucleic acid encoding a fusion protein in which a domain excluding a signal peptide, a target protein, and a signal peptide of Gas1 protein is fused sequentially from the N-terminus to a yeast variant strain in which the gene encoding Gas1 is deleted; (b) culturing the yeast mutant strain into which the nucleic acid is introduced under cell wall stress conditions; And (c) comparing the growth of the yeast mutant strain into which the nucleic acid encoding the fusion protein is introduced with the yeast mutant strain in which the gene encoding Gas1 is deleted. It provides a method of screening.
  • Gas1 is ⁇ -1,3-glucanosyltransglycosylase and is secreted to the cell surface to release ⁇ -1,3-glucan ( ⁇ -1, 3-glucan) is involved in cell wall synthesis.
  • Gas1 is a glycoprotein (glycoprotein) attached to the cell surface through a glycosylphosphatidylinositol anchor (GPI anchor). It is a cross-linking enzyme and plays an important role in the structure and permeability of the yeast cell wall.
  • GAS1 which is a gene encoding Gas1 includes a glycosilphosphatidylinositol (GPI) anchor domain for immobilizing a signal peptide (SP) at the N-terminus and a cell surface at the C-terminus, and an active domain thereof. Located in between.
  • GPI glycosilphosphatidylinositol
  • the present inventors have developed a fusion protein production system in which the target protein is fused to the N-terminus of the Gas1 protein by using the Gas1 protein as a reporter. Since the fusion protein production system includes Gas1 protein, the fusion protein production system exhibits a property of expressing Gas1 to restore growth inhibition under cell wall stress conditions. Thus, the gas1 fusion protein production system improves the expression and secretion of the fusion protein under cell wall stress conditions, and whether or not the secretion of the yeast can be confirmed by analyzing the growth ability of the fusion protein production system under cell wall stress conditions.
  • the secreted fusion protein for screening, not only the secretion of a fusion protein containing Gas1 but also the secreted fusion protein can restore the growth ability by binding to the cell surface and forming a cell wall like the natural Gas1 protein.
  • the GPI anchor domain located at the C-terminus of Gas1 for binding to the cell surface is preferably freely bound. Therefore, the fusion protein is preferably designed to be fused in the order of domains except for the signal peptide, the target protein, and the signal peptide of the Gas1 protein from the N-terminus.
  • the term "secretion” refers to a process of releasing a substance from a cell or gland, and excreted in that it is a substance having a certain function, not a waste product. excretion). Typical cell secretion mechanisms are via the secretory portal in the cell plasma membrane, called the porosome.
  • the secretion in the present invention includes all the phenomena in which the protein produced in the cell is released to the outside of the cell without restriction, the secreted fusion protein may be in the form of a fixed to the cell wall through the Gas1 protein. Therefore, in order to recover the target protein from the secreted fusion protein, the step of separating the target protein from the Gas1 protein may be further performed. Details will be described later.
  • a parent strain a strain lacking the GAS1 gene, a mutant strain prepared to express Gas1 in the strain, and a yeast mutant strain generating a fusion protein with Gcase and GLA proteins having poor secretion ability outside the cell are produced. And the growth ability of the strain under the cell wall stress conditions was confirmed. As a result, the strain lacking the GAS1 gene did not grow under cell wall stress conditions, but it was confirmed that the mutants prepared to express Gas1 recovered the growth ability. On the other hand, yeast mutant strains producing a fusion protein of Gas1 and Gcase or GLA was reduced in growth capacity than the mutants expressing Gas1 alone, it was confirmed that it shows an improved growth capacity compared to the strain lacking the GAS1 gene (Fig. 3 and FIG. 7).
  • the screening method according to the present invention can be applied to a yeast mutant strain library for selection of high secretion strains.
  • the yeast mutant library can be prepared by introduction of a mutation, but is not limited thereto, and can be performed using a library preparation method known in the art.
  • the mutation may be carried out to improve the protein secretion ability of the yeast.
  • the mutation for improving secretion ability may be introduced into the yeast mutant itself, or may be introduced into the target protein.
  • the mutation may be a random mutation.
  • the method of introducing a random mutation in the yeast mutant itself can be used without limitation methods known in the art.
  • Chemical methods using mutagens such as, for example, ethyl methanesulfonate (EMS) or N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine (NTG);
  • EMS ethyl methanesulfonate
  • NGT N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine
  • DNA replication may use a host that lacks a gene related to repair, or a genetic method of introducing a POL3 gene having a corrected function, but is not limited thereto.
  • a method of introducing a mutation into a protein of interest can be used without limitation methods known in the art.
  • the gene fragment encoding the target protein into which the mutation has been introduced and the cleaved vector can be added to the yeast mutant and introduced into the chromosome in the yeast mutant by homologous recombination in the yeast.
  • the mother strain of the yeast mutant strain can use a yeast strain expressing Gas1 known in the art without limitation. Saccharomyces cerevisiae , Hansenula polymorpha , Pichia pastoris or Yarrowia lipolytica , which preferably comprise a gene encoding Gas1 . It may be, but is not limited thereto.
  • signal peptide is a short peptide of 5 to 30 amino acids in length, also called a signal sequence, leader sequence or leader peptide, the majority of newly synthesized proteins destined for the secretory pathway.
  • the signal peptide is a region formed by a specific amino acid sequence of a protein, and includes a nuclear transition signal and a mitochondrial transition signal, which determine a pathway of a protein including the same.
  • the protein is secreted from the cell or inserted into most cell membranes and is included in proteins present in certain organs (eg, endoplasmic reticulum, golgi or endosome).
  • the type 1 membrane-binding protein comprising the signal peptide binds to a lipid membrane having a stop-transfer anchor sequence and is located in the cytoplasmic lumen (maturation of which is located in the plasmaemma) during the synthesis process. If present, the N-terminus targeting the extracellular space).
  • the signal peptide determines the intracellular pathway of the protein including the same, it is an important factor for determining the secretion efficiency of the protein.
  • the signal peptides are extremely heterogeneous and many prokaryotic and eukaryotic signal peptides are functionally interchangeable even in other species.
  • the yeast mutant expressing the fusion protein of the present invention may include without limitation any signal peptide derived from Gas1 or a protein other than Gas1 used in the fusion protein as the signal peptide.
  • the protein other than Gas1 may be a protein other than Gas1 or Gas1 of another yeast strain, preferably, a type 1 membrane-binding protein.
  • a signal peptide capable of improving the secretion efficiency of the protein can be used regardless of the species of the paper or the protein.
  • the cell wall stress conditions are preferably cultured in a medium containing a cell wall synthesis inhibitor, or at a temperature higher than the normal culture temperature. It may be provided, but is not limited thereto, and may be applied to culture conditions that can impart stress to the cell wall known in the art.
  • Non-limiting examples of cell wall synthesis inhibitors include Congo red (CR), Calcofluor white, caffeine, caspofungin, hygromycin, sodium dodecyl sulfate (sodium dodecyl sulfate; SDS) and combinations thereof.
  • Saccharomyces cerevisiae can achieve the cell wall stress conditions by culturing at 37 °C higher than the normal culture temperature.
  • the present invention provides a method for improving the secretion capacity of a target protein, comprising introducing a nucleic acid encoding a fusion protein comprising a signal peptide at the N-terminus and fused with a Gas1 protein to a yeast strain. Provide a method.
  • the signal peptide determines the secretion efficiency of the protein bound thereto, and since the signal peptide is interchangeable regardless of the species or protein expressing it, it is not limited to the signal peptide sequence of Gas1 protein, Regardless of the type, a signal peptide capable of improving the secretory capacity of the protein can be selected and used.
  • the present invention provides a method for preparing a target protein, comprising introducing a nucleic acid encoding a target protein into a yeast strain screened by the screening method.
  • the target protein may be secreted by a mutation, and the mutation may be a random mutation.
  • the target protein may further include a signal peptide, and the signal peptide may be used by selecting a signal peptide capable of improving the secretion capacity of the protein, regardless of the type of paper or protein, as described above. .
  • the preparation method may be to recover a gene encoding Gas1 from which the screened yeast strain is deleted.
  • the present invention provides a nucleic acid encoding a fusion protein in which the domains excluding the signal peptide, the target protein, the linker, and the signal peptide of Gas1 protein are fused from the N-terminus to the yeast strain screened by the screening method. It provides a method of producing a target protein, comprising the step of introducing.
  • the target protein may be improved in secretion capacity by mutation
  • the mutation may be random mutation, and may further include a signal peptide
  • the signal peptide may be a species of paper or protein. Regardless of the signal peptide that can improve the secretion capacity of the protein can be selected and used.
  • the preparation method may further perform the step of separating the target protein from the Gas1 protein to recover the target protein from the secreted fusion protein.
  • Separating the target protein may be performed using any method known in the art without limitation.
  • a nucleic acid encoding a fusion protein may be devised so that the Gas1 protein and the target protein are expressed in the form of a fusion protein linked through a linker that can be easily cleaved.
  • the linker may be, but is not limited to, a peptide composed of a sequence having a specific binding site to be cleaved by a restriction enzyme, but is not limited thereto.
  • the present invention provides a method for preparing a yeast mutant strain that has improved secretion capacity of Gas1 or a fusion protein thereof, comprising: (a) preparing a yeast mutant strain by introducing a mutation into the yeast expressing Gas1 protein; (b) inhibiting the expression of Gas1 protein by causing mutations in the gene of Gas1 or a site involved in its expression in yeast expressing Gas1 protein; And (c) introducing a nucleic acid encoding a Gas1 protein or a fusion protein thereof into the yeast mutant strain obtained by performing the steps (a) and (b); And (d) selecting the yeast mutants which survive the culturing of the yeast mutants obtained from the step (c) under cell wall stress conditions, and the steps (a) and (b) may be performed sequentially or in reverse order. It provides a manufacturing method.
  • the signal peptide may be selected by using a signal peptide that can improve the secretion capacity of the protein, regardless of the type of paper or protein.
  • the present invention provides a yeast strain having improved secretion capacity of a target protein compared to the wild type screened by the screening method.
  • the yeast strain having improved secretion capacity of the target protein may be one that recovers the gene encoding the deleted Gas1 of the screened yeast strain.
  • the present invention provides a method for preparing a fusion protein comprising: (a) introducing a nucleic acid encoding a fusion protein comprising a signal peptide at the N-terminus and fused with a Gas1 protein to a yeast expressing Gas1 protein or a mutant thereof; And (b) culturing the yeast mutant strain into which the nucleic acid is introduced, under cell wall stress conditions.
  • mutants are mutants that cause the parts involved in the Gas1 gene or the expression thereof in the yeast expressing Gas1 protein may be the expression of the Gas1 protein inhibited, and more preferably genes GAS1 encoding a Gas1 protein May be a GAS1 deletion mutant strain.
  • the signal peptide may be selected by using a signal peptide that can improve the secretion capacity of the protein, regardless of the type of paper or protein.
  • the step of separating the target protein from the Gas1 protein may be further performed. Separating the target protein may be performed using any method known in the art without limitation.
  • a nucleic acid encoding a fusion protein may be devised so that the Gas1 protein and the target protein are expressed in the form of a fusion protein linked through a linker that can be easily cleaved.
  • the linker may be, but is not limited to, a peptide composed of a sequence having a specific binding site to be cleaved by a restriction enzyme, but is not limited thereto.
  • Example 1 S. cerevisiae Vector Production for Yeast's GAS1 Screening System
  • the GAS1 (ScGAS1) gene sequence of S. cerevisiae yeast was obtained by searching from the National Center for Biotechnology Information (NCBI) website (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). . From the prior literature, it was confirmed that the N-terminal 1 to 22 of the signal peptide of the 559 amino acid sequence, and there is localization information on the active domain and the cell surface at 23 to 559 (Carotti et al ., Eur. J. Biochem., 2004, 271 (18): 3635-3645).
  • the glycosylphosphatidylinositol-anchor (GPI-anchor) domain which serves to fix proteins on the cell surface, is located at the C-terminus.
  • chromosomal DNA isolated from S. cerevisiae BY4741 strain is used as a template, and PCR is performed using ScGas1-F (SEQ ID NO: 1) and ScGas1-R (SEQ ID NO: 2) as primers.
  • ScGas1-F SEQ ID NO: 1
  • ScGas1-R SEQ ID NO: 2
  • the obtained DNA fragment was cloned into the YEp352ScGAPDHpt vector using BamHI restriction enzyme to produce YEp352-G1 (FIG. 2B left).
  • cloning was performed to replace the signal peptide of ScGAS1 (Nos. 1-22 from the N-terminus) with the signal peptide of MF ⁇ (mating factor ⁇ ).
  • fusion PCR was performed to bind the prepro partial DNA of MF ⁇ obtained earlier.
  • MFa-F SEQ ID NO: 3
  • ScGas1-R SEQ ID NO: 2
  • Amplified DNA was cloned into YEp352ScGAPDHpt vector using BamHI restriction enzyme to produce YEp352-M-G1 (FIG. 2B left).
  • human glucocerebrosidase (Gcase) and ⁇ -galactosidase (GLA) enzyme proteins were selected as foreign recombinant proteins.
  • the protein is an expensive enzyme treatment administered to patients with Gaucher disease and Fabry disease, but is produced using CHO (chinese hamster ovary) cells, which are currently animal cells, but are difficult to express.
  • the present inventors amplified the Gcase gene by PCR using primer pairs of Gcase-F (SEQ ID NO: 6) and Gcase-R (SEQ ID NO: 7) from human cDNA.
  • the YEp352-M-Gcase-G1 vector was constructed by cloning it into the YEp352-M-G1 vector constructed in Example 1.1 using SpeI restriction enzyme (see FIG. 2B right).
  • GLA-F SEQ ID NO: 8
  • GLA-R SEQ ID NO: 9
  • -G1 vector was constructed ( Figure 2B right).
  • the GAS1 deficient strain of S. cerevisiae yeast was used to demonstrate the concept of a high secretion strain screening system using the cell wall stress resistance repair function of Gas1 fusion protein.
  • the ScGAS1 deficient strain S. cerevisiae BY4741 ScGAS1 ⁇ , YSC1021-551615
  • the ScGAS1 deficient strain was purchased from Open BioSystems.
  • YEp352-G1, YEp352-M-G1, YEp352-M-Gcase-G1 and YEp352-M-GLA-G1 vectors prepared in Example 1 were introduced into the ScGAS1 ⁇ strain. Then, these transformed strains were cultured under cell wall stress conditions to check the growth level. Wild type strain and GAS1 deficient strain were used as a control.
  • a 2% glucose complex medium containing 50 ⁇ g / ml and 8 ⁇ g / ml, respectively, of the cell wall synthesis inhibitors Congo red or Chacofluor white was
  • the ScGAS1 deficient mutant strain ( ScGAS1 ⁇ / YEp352-M-GLA-G1) which was expressed in 3 ml of each, was shaken in 2% glucose complex medium at 30 ° C.
  • the cultured strains were obtained in an exponential growth phase, and the initial OD 600 value was adjusted to 1 in 1 ml of sterile water and serially diluted 1/10. 1 ⁇ l of the OD-controlled strain and a series of diluted strains were accumulated at 30 ° C. in a concentration of 2 ⁇ g glucose complex medium, medium containing 50 ⁇ g / ml Congo red, and medium containing 8 ⁇ g / ml chacofluor white. The cells were cultured for 2 days or 3 days, and the results are shown in FIG. 3.
  • the wild-type strain showed excellent growth ability even in the medium containing 50 ⁇ g / ml Congo red or 8 ⁇ g / ml chacofluor white, which is the cell wall stress conditions, whereas the growth of ScGAS1 mutant strain was inhibited .
  • ScGAS1 deficient strains expressing ScGas1 containing ScGas1 or MF ⁇ signal peptide it was confirmed that the growth capacity was restored in the cell wall stress condition.
  • a random mutation was introduced into a foreign recombinant protein using real-induced PCR, and the homologous recombination cloning method was used to select a strain with improved growth ability under cell wall stress conditions by expressing it in a ScGAS1 deficient strain as a fusion protein with ScGas1. .
  • a Gcase gene (cGcase) optimized for codons was used to synthesize human Gcase genes in yeast (DNA2.0).
  • the synthesized cGcase gene was used as a template, and error-cGcase-F (SEQ ID NO: 10) and error-cGcase-R (SEQ ID NO: 11) primers were used, and real-time PCR was performed using Clontech Diversify PCR Random Mutagenesis Kit. Was performed.
  • the primers were constructed to overlap at least 30 bp each with the MF ⁇ signal peptide and the GAS1 gene of the YEp352-M-G1 vector (FIG. 4). The DNA fragment thus amplified was introduced into the ScGAS1 deficient strain ( S.
  • Example 3.1 a strategy for selecting a yeast strain having improved secretion ability by introducing a mutation into a foreign recombinant protein was proposed.
  • a random mutation may be introduced into the yeast strain itself rather than a foreign recombinant protein, and a mutant strain having improved secretion expression ability may be selected using the Gas1 screening system according to the present invention.
  • Random mutations can be introduced into yeast strains by chemical methods using mutagens such as EMS or NTG, or by using hosts that lack genes involved in repairing DNA replication, or have poor calibration capabilities. Genetic methods such as introducing the POL3 gene can be used.
  • the present inventors attempted to confirm whether the survival screening method in which growth is recovered by fusion-expressing Gas1 protein and foreign recombinant protein in a GAS1 deficient strain is not limited to S. cerevisiae yeast, but also applied to other yeasts. To this end, it was tested whether the Gas1-based screening system according to the present invention can be applied to H. polymorpha yeast which is widely used for expression of recombinant protein secretion along with methanolized yeast Pichia pastoris .
  • the present inventors signal by using the amino acid sequence and the SignalP program (www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/) to the gene expression GAS1 (HpGAS1) of the H. polymorpha who identified in the call Republic of Korea Patent Publication No. 2013-0142900 Peptide sites were predicted. As a result, it was predicted that amino acids 1 to 21 of the total 546 amino acids were signal peptides. Thus, it could be inferred that the amino acids 22 to 546 have an active domain and a GPI-anchor domain for fixation on the cell surface.
  • the present inventors used the chromosomal DNA isolated from the H.
  • HpGAS1 gene polymorpha DL1 strain as a template, and obtained HpGAS1 gene by PCR using HpGas1-F (SEQ ID NO: 12) and HpGas1-R (SEQ ID NO: 13) primers.
  • the DNA fragment thus obtained was cloned into pDLMOX vector using HindIII restriction enzyme to prepare pDLMOX-G1 (left side of FIG. 6B).
  • cloning was performed to convert the signal peptide of HpGas1 into the signal peptide of MF ⁇ or ASS.
  • a prepro sequence containing a signal peptide at the MF ⁇ N-terminus was prepared using the pPICZ ⁇ A vector of Invitrogen as a template and using MFa-F (pDLMOX) (SEQ ID NO: 14) and MFa-R (pDLMOX) (SEQ ID NO: 15) primers. Amplified by PCR.
  • the chromosomal DNA isolated from the DL1 strain was used as a template, and HpGas1_w / o_SP-F (SEQ ID NO: 17) and HpGas1-R (SEQ ID NO: 13) primers were used to amplify the HpGAS1 gene sequence behind the signal peptide.
  • the prepro partial DNA of the MF ⁇ obtained above was linked to the result by fusion PCR.
  • MFa-F (pDLMOX) SEQ ID NO: 14
  • HpGas1-R (SEQ ID NO: 13) primers were used for final fusion PCR.
  • the amplified DNA was cloned into pDLMOX vector using HindIII restriction enzyme to prepare pDLMOX-M-G1 (left side of FIG. 6B).
  • the amylase signal peptide, ASS was linked to the HpGas1 protein using a single primer AmylasesSS_HpGas1-F (SEQ ID NO: 16).
  • chromosomal DNA isolated from the DL1 strain was used as a template, and amplified using AmylasesSS_HpGas1-F (SEQ ID NO: 16) and HpGas1-R (SEQ ID NO: 13) primers, and introduced into the pDLMOX vector using HindIII restriction enzyme. PDLMOX-A-G1 was produced (left side of FIG. 6B).
  • the inventors selected human glucocerebrosidase (Gcase) and ⁇ -galactosidase (GLA) enzyme proteins as foreign recombinant proteins as in the S. cerevisiae strain.
  • the present inventors obtained by amplifying the Gcase gene by PCR using Gcase-F (MFa-tag) (SEQ ID NO: 18) and Gcase-R (preHpGas-tag) (SEQ ID NO: 20) primers from human cDNA. Furthermore, the obtained gene was cloned into pDLMOX-M-G1 vector constructed in Example 4.1 using EcoRI restriction enzyme to prepare pDLMOX-M-Gcase-G1 vector.
  • the Gcase gene was amplified using Gcase-F (Amyl-tag) (SEQ ID NO: 19) and Gcase-R (preHpGas-tag) (SEQ ID NO: 20) primers, and constructed in Example 4.1 using EcoRI restriction enzyme.
  • the pDLMOX-A-Gcase-G1 vector was constructed by cloning into one pDLMOX-A-G1 vector.
  • GLA-F (MFa-tag) SEQ ID NO: 21
  • GLA-R preHpGas-tag
  • the pDLMOX-M-GLA-G1 vector was constructed by cloning into the -M-G1 vector.
  • amplification of the GLA gene using GLA-F (Amyl-tag) (SEQ ID NO: 22) and GLA-R (preHpGas-tag) (SEQ ID NO: 23) primers was constructed in Example 4.1 using EcoRI restriction enzyme. Cloning into one pDLMOX-A-G1 vector constructs a pDLMOX-A-GLA-G1 vector.
  • 2013-0142900 was prepared g22- HpGas1 ⁇ strain. And Example 4.1 to g22-HpGas1 ⁇ strain.
  • PDLMOX-G1, pDLMOX-M-G1, pDLMOX-A-G1, pDLMOX-M-Gcase-G1, pDLMOX-A-Gcase-G1, pDLMOX-M-GLA-G1, and pDLMOX-A- produced in 4.2.
  • GLA-G1 vectors were introduced by transformation.
  • the transformed strains and the DL1-g22 strain as a control was cultured in the cell wall stress conditions to compare the growth.
  • a complex medium containing 100 ⁇ g / ml Congo red as a cell wall synthesis inhibitor and 1% methanol (MeOH) as a carbon source was used.
  • HpOCH1 gene deletion Hanshenula polymorpha DL1-g22 strain (DL1-g22), HpGAS1 deletion mutant (g22- HpGAS1 ⁇ ), HpGAS1 deletion mutant ( HpGAS1 ⁇ / pDLMOX-G1), MF ⁇ signal peptide HpGAS1 deletion mutant expressing HpGas1 ( HpGAS1 ⁇ / pDLMOX-M-G1), HpGAS1 deletion mutant expressing HpGas1 with ASS signal peptide ( HpGAS1 ⁇ / pDLMOX-A-G1), MF ⁇ signal peptide, Gcase and HpGas1 HpGAS1 deletion mutant ( HpGAS1 ⁇ / pDLMOX-M-Gcase-G1), ASS signal peptide, Gp and HpGAS1 deletion mutant ( HpGAS1 ⁇ / pDLMOX-A-Gcase-G1), MF ⁇ signal peptide ,
  • the cultured strains were obtained during exponential growth period and the initial OD 600 value was adjusted to 1 in 1 ml of sterile water, and serially diluted 1/10. The OD was adjusted to 1 and a series of diluted strains were accumulated in 1 ⁇ l in a medium containing 1% methanol complex medium (FIG. 7A) and 100 ⁇ g / ml Congo red (FIG. 7B), or at 37 ° C. for 2 days. Incubated for 3 days.
  • the wild type showed excellent growth ability in the medium containing 100 ⁇ g / ml Congo red, which is a cell wall stress condition, it was confirmed that the HpGAS1 deficient strain significantly inhibited the growth.
  • the expression of HpGas1 protein containing HpGas1 or other signal peptide in the HPGAS1 deficient strain regardless of the type of signal peptide, the growth capacity was recovered even under cell wall stress conditions.
  • the growth was slightly recovered compared to the HpGAS1 deficient strain, although weaker than the expression of only HpGas1 protein.
  • Gas1-based screening system of the present invention can screen yeast with excellent secretion ability in various yeast types, suggesting that mass production of various target proteins using the yeast strains screened in this way is possible. will be.

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Abstract

본 발명은 도입된 목적 단백질을 분비하는 효모 균주를 스크리닝하는 방법, 목적 단백질의 분비능을 향상시키는 방법, 목적 단백질의 제조방법 및 Gas1 또는 이의 융합 단백질의 분비능이 향상된 효모 변이주의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명의 세포벽 스트레스 조건에서 성장이 저해되는 GAS1 결손 균주를 이용하여 제조한 목적 단백질이 Gas1 단백질의 N-말단에 결합된 융합 단백질을 발현하는 효모 균주는 상기 융합 단백질의 분비에 따른 세포벽 형성에 의한 성장능 증가를 확인함으로써 분비능이 증가된 효모 균주를 효과적으로 확인할 수 있으므로, 재조합 단백질의 대량생산을 위해 무작위 돌연변이에 의해 제조한 일련의 변이주 라이브러리로부터 분비능이 향상된 균주를 선별하는데 유용하게 이용될 수 있다.

Description

세포벽 결함 효모 변이주를 이용한 재조합 단백질 분비능이 향상된 효모 균주의 스크리닝 방법
본 발명은 도입된 목적 단백질을 분비하는 효모 균주를 스크리닝하는 방법, 목적 단백질의 분비능을 향상시키는 방법, 목적 단백질의 제조방법 및 Gas1 또는 이의 융합 단백질의 분비능이 향상된 효모 변이주의 제조방법에 관한 것이다.
단백질 의약품 개발은 유전자 재조합 기술이 보편화됨으로써 시작되었다. 특히, 생산량이 제한된 항체, 호르몬, 백신 및 생체기능성 단백질과 같은 유용한 단백질을 미생물 숙주세포에서 대량 생산하여 의약품으로 개발하는 재조합 단백질 의약품 생산기술은 미생물을 세포공장(cell factory)으로 활용하는 대표적인 미생물 이용기술로 부상하고 있다. 난치성 질환의 치료를 위한 고순도의 단백질 의약품에 대한 수요가 기하급수적으로 증가하고 있으므로, 저비용으로 대량생산 가능한 미생물 발현 시스템을 이용한 재조합 의약품 생산기술의 개발은 미래의 의약산업 성장에 크게 기여할 것으로 기대된다. 이를 위해 인체에 무해한 다양한 미생물을 이용하여 저비용으로 대량의 재조합 단백질을 생산할 수 있는 기술개발에 대한 연구가 필요하다. 미생물을 이용한 재조합 단백질 생산 연구는 주로 대장균(Escherichia coli; E.coli)을 이용하여 수행되고 있으며, 성공적인 생산이 이루어지기도 하였다. 그러나, 생산된 단백질이 활성을 갖기 위하여 당질화부가(glycosylation)와 같은 번역 후 개질(post-translational modification)이 필요한 당단백질이나 크기가 크고 구조가 복잡한 단백질의 생산에는 적용하기 어렵다는 한계가 있다. 따라서, 이러한 단점을 보완하기 위하여 당질화 능력이 있으며, 당단백질 생산에 효율적이고 생장이 빠른 효모를 이용한 연구가 이루어지고 있다. 당질화가 이루어지기 위해서는 재조합 단백질이 소포체(endoplasmic reticulumn) 및 골지체(golgi apparatus)와 같은 소기관을 거쳐 세포 밖으로 효과적으로 분비 발현되어야 한다. 그러나, 대다수의 단백질들에 있어서 접힘 등의 문제로 인해 세포 밖으로의 분비가 원활하지 못한 경우가 종종 발생한다. 이를 해결하기 위하여 발현된 목적 단백질을 세포 밖으로 분비하는 성능이 우수한 효모 균주를 선별하는 것이 중요하며, 이에 따라 이들 균주를 효율적으로 선별하고 스크리닝할 수 있는 방법에 대한 요구가 증가하고 있다.
본 발명자들은 외래 재조합 단백질을 분비 및/또는 발현능이 향상된 효모 균주의 효율적인 선별을 위한 스크리닝 시스템을 개발하고자 노력한 결과, Gas1 단백질의 N-말단 쪽에 외래 재조합 단백질을 융합시킨 시스템을 개발하여, 외래 재조합 단백질과 Gas1 융합단백질이 분비가 잘되면 균주가 성장을 잘하게 되고, 반면에 분비가 잘 되지 못하면 균주가 성장을 못하게 됨으로서 분비 및/또는 발현이 잘되는 균주를 효율적으로 선별할 수 있는 스크리닝 시스템을 확인하여, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 하나의 목적은 (a) Gas1을 코딩하는 유전자가 결실된 효모 변이주에 N-말단으로부터 차례로 신호 펩타이드, 목적 단백질 및 Gas1 단백질의 신호 펩타이드를 제외한 도메인이 융합된 융합 단백질을 코딩하는 핵산을 도입하는 단계; (b) 상기 핵산을 도입한 효모 변이주를 세포벽 스트레스 조건 하에서 배양하는 단계; 및 (c) 상기 융합 단백질을 코딩하는 핵산을 도입한 효모 변이주의 성장 정도를 Gas1을 코딩하는 유전자가 결실된 효모 변이주와 비교하는 단계를 포함하는, 야생형에 비하여 목적 단백질의 분비능이 향상된 효모 균주를 스크리닝하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 Gas1 단백질을 발현하는 효모 또는 이의 변이주에 N-말단에 신호 펩타이드를 포함하고 목적 단백질과 Gas1 단백질이 융합된 융합 단백질을 코딩하는 핵산을 도입하는 단계를 포함하는, 목적 단백질의 분비능을 향상시키는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 스크리닝하는 방법에 의해 스크리닝된 효모 균주에 목적 단백질을 코딩하는 핵산을 도입하는 단계를 포함하는, 목적 단백질의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 스크리닝하는 방법에 의해 스크리닝된 효모 균주에 N-말단으로부터 차례로 신호 펩타이드, 목적 단백질, 링커 및 Gas1 단백질의 신호 펩타이드를 제외한 도메인이 융합된 융합 단백질을 코딩하는 핵산을 도입하는 단계를 포함하는, 목적 단백질의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 Gas1 또는 이의 융합 단백질의 분비능이 향상된 효모 변이주의 제조방법으로서, (a) Gas1 단백질을 발현하는 효모에 돌연변이를 도입하여 효모 변이주를 준비하는 단계; (b) Gas1 단백질을 발현하는 효모에서 Gas1의 유전자 또는 이의 발현에 관여하는 부위에 돌연변이를 유발시켜 Gas1 단백질의 발현을 저해시키는 단계; 및 (c) 상기 (a) 및 (b) 단계를 수행하여 획득한 효모 변이주에 Gas1 단백질 또는 이의 융합 단백질을 코딩하는 핵산을 도입하는 단계; 및 (d) 상기 (c) 단계로부터 획득한 효모 변이주를 세포벽 스트레스 조건 하에서 배양시 생존하는 효모 변이주를 선별하는 단계를 포함하고, 상기 (a) 및 (b) 단계는 순차적 또는 역순으로 수행될 수 있는 것인 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 스크리닝하는 방법에 의해 스크리닝된 야생형에 비하여 목적 단백질의 분비능이 향상된 효모 균주를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 (a) Gas1 단백질을 발현하는 효모 또는 이의 변이주에 N-말단에 신호 펩타이드를 포함하고 목적 단백질과 Gas1 단백질이 융합된 융합 단백질을 코딩하는 핵산을 도입하는 단계; 및 (b) 상기 핵산을 도입한 효모 변이주를 세포벽 스트레스 조건 하에서 배양하는 단계를 포함하는, 목적 단백질의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 세포벽 스트레스 조건에서 성장이 저해되는 GAS1 결손 균주를 이용하여 제조한 목적 단백질이 Gas1 단백질의 N-말단에 결합된 융합 단백질을 발현하는 효모 균주는 상기 융합 단백질의 분비에 따른 세포벽 형성에 의한 성장능 증가를 확인함으로써 분비능이 증가된 효모 균주를 효과적으로 확인할 수 있으므로, 재조합 단백질의 대량생산을 위해 무작위 돌연변이에 의해 제조한 일련의 변이주 라이브러리로부터 분비능이 향상된 균주를 선별하는데 유용하게 이용될 수 있다.
도 1은 본 발명에 따른 GAS1 결손 균주에 Gas1과 외래 재조합 단백질의 융합단백질을 발현시켜 세포벽 스트레스 조건에서 세포 성장이 회복되는 생존 스크리닝을 통한 고 분비 효모 균주를 선별하는 스크리닝 시스템에 대한 개념도이다. (A) 내지 (C)는 각각 야생형 균주, 저 분비 외래 재조합 단백질(NS)과 Gas1 융합 단백질을 발현하는 GAS1 유전자가 결손된 효모 변이주 및 고 분비 외래 재조합 단백질(S)과 Gas1 융합 단백질을 발현하는 GAS1 유전자가 결손된 효모 변이주에서 Gas1의 작용 및 세포벽 스트레스 조건에서 성장을 나타낸다. (A)에 나타난 바와 같이 Gas1 단백질은 세포 표면에서 β-1,3-글루칸 세포벽 합성에 관여하며, Gas1을 발현하는 야생형 효모 균주는 세포벽 스트레스 조건에서도 성장 가능함을 나타낸 도이다. (B)는 저 분비 외래 재조합 단백질(NS)과 Gas1 융합 단백질을 발현하는 GAS1 유전자가 결손된 효모 변이주는 세포벽 합성이 저해되어 세포벽이 약해지고 이에 따라 세포벽 스트레스 조건에서 성장이 불가능함을 나타낸다. (C)는 고 분비 외래 재조합 단백질과의 융합으로 상기 외래 재조합 단백질과 더불어 Gas1이 세포 밖으로 분비되어 세포 표면에서 정상적으로 기능함으로써 세포벽 스트레스 조건에서도 성장 가능함을 나타낸 도이다.
도 2는 본 발명에 따른 (A) 다양한 Gas1 융합 단백질들의 도메인 구조와 (B)이를 발현하는 벡터를 나타낸 도이다. Saccharomyces cerevisae 효모 유래의 Gas1 단백질(Gas11-559)과 신호 펩타이드(signal peptide; SP)를 MFα(mating factor alpha)의 신호 펩타이드로 교체한 단백질(MFα-Gas123-559)을 발현하는 유전자를 주형벡터(template vector)인 YEp352ScGADHpt에 클로닝하여 YEp352-G1과 YEp352-M-G1 발현벡터들을 각각 제작하였다. 또한, 외래 재조합 단백질과의 융합 단백질 발현을 위하여 인간의 글루코세레브로시다아제(glucocerebrosidase; Gcase) 유전자와 α-갈락토시다아제(α-galactosidase; GLA) 유전자를 SpeI 제한효소를 이용하여 YEp352-M-G1 벡터에 클로닝하여 YEp352-M-Gcase-G1 및 YEp352-M-GLA-G1 발현 벡터를 각각 제작하였다.
도 3은 야생형 S. cerevisiae 효모 균주; 상기 효모의 GAS1 결손 균주(ScGAS1Δ); 및 Gas1 또는 Gas1과 외래 재조합 단백질의 융합 단백질을 발현하는 GAS1 결손 균주들의 세포벽 스트레스 조건에 대한 반응을 나타낸 도이다. 상기 일련의 효모 균주를 일반적인 배양조건인 (A) 2% 포도당 복합 배지를 이용하여 30℃에서, 세포벽 스트레스 조건인 (B) 50 ㎍/㎖ 콩고레드(Congo Red; CR)를 포함하는 배지에서, 및 (C) 8 ㎍/㎖ 칼코플루오르 화이트(Calcofluor White; CFW)를 포함하는 배지에서 배양하여 성장률을 비교하였다. 액체배지에서 지수 성장기까지 배양한 효모들을 좌측으로부터 10배씩 희석하면서 점적하여 성장률을 비교하였으며, 각 레인에 점적한 효모 균주는 아래와 같다:
1; 사카로마이세스 세레비지애 BY4741 야생형 균주(S. cerevisiae BY4741),
2; GAS1 유전자 결손 변이주(S. cerevisiae BY4741 ScGAS1Δ),
3; Gas1을 발현시킨 GAS1 결손 변이주(ScGAS1Δ/YEp352-G1),
4; MFα 신호 펩타이드를 가진 Gas1을 발현시킨 GAS1 결손 변이주(ScGAS1Δ/YEp352-M-G1),
5; MFα 신호 펩타이드, Gcase 및 Gas1로 연결된 융합 단백질을 발현시킨 GAS1 결손 변이주(ScGAS1Δ/YEp352-M-Gcase-G1), 및
6; MFα 신호 펩타이드, GLA 및 Gas1로 연결된 융합 단백질을 발현시킨 GAS1 결손 변이주(ScGAS1Δ/YEp352-M-GLA-G1).
도 4는 실수유발 PCR(error-prone PCR)을 통해서 돌연변이를 유발한 외래 재조합 단백질을 분비 발현하는 S. cerevisiae 균주를 스크리닝하기 위한 생체 내 상동 재조합 클로닝 모식도이다. 실수유발 PCR에는 벡터와 상동성이 있는, 30 bp 이상의 서열을 5'-말단에 추가적으로 포함하는 정방향 및 역방향 프라이머를 사용하였다. 이와 같이 증폭시킨 DNA 절편과 SpeI 제한효소로 절단된 YEp352-M-G1 벡터를 함께 효모에 첨가하면, 효모 내에서 상동 재조합 반응에 의해서 환형(circular)으로 완성된 재조합 벡터가 만들어지면서 외래 재조합 단백질 부위에 돌연변이가 도입된 Gas1 융합 단백질이 발현된다.
도 5는 SignalP-4.1 프로그램에 의해서 예측된 한세눌라 폴리모르파(Hansenula polymorpha)의 Gas1 단백질(HpGas1)의 아미노산 서열의 신호 펩타이드 부분을 나타낸 도이다. 이로부터 N-말단으로부터 21번째 아미노산까지를 신호 펩타이드로 예측하였다.
도 6은 H. polymorpha GAS1 결손 균주(HpGAS1Δ)에 도입하기 위하여 제작한 (A) H. polymorpha Gas1(HpGas1) 및 이와 결합된 융합 단백질들의 도메인 구조와 (B) 상기 융합 단백질의 발현벡터를 나타낸 도이다. H. polymorpha 유래의 Gas1 단백질(HpGas11-559)과 신호 펩타이드를 MFα의 것으로 교체한 단백질(MFα-HpGas122-546) 및 아밀라아제(amylase)의 신호 서열(ASS)로 교체한 단백질(ASS-HpGas122-546)의 유전자를 주형벡터인 pDLMOX에 클로닝하여 pDLMOX-G1, pDLMOX-M-G1 및 pDLMOX-A-G1 벡터들을 각각 제작하였다. 또한, 외래 재조합 단백질과의 융합 단백질 발현을 위하여 Gcase와 GLA 유전자를 EcoRI 제한효소를 이용하여 상기 pDLMOX-M-G1과 pDLMOX-A-G1 벡터에 각각 클로닝하여 pDLMOX-M-Gcase-G1, pDLMOX-M-GLA-G1, pDLMOX-A-Gcase-G1 및 pDLMOX-A-GLA-G1을 제작하였다.
도 7은 야생형 H. polymorpha 효모 균주; 상기 효모의 GAS1 결손 균주(HpGAS1Δ); 및 천연형, MFα 또는 ASS의 신호 펩타이드를 포함하며, HpGas1 또는 HpGas1과 외래 재조합 단백질의 융합 단백질을 발현하는 GAS1 결손 균주들의 세포벽 스트레스 조건에 대한 반응을 나타낸 도이다. 상기 일련의 효모 균주를 일반적인 배양 조건인 (A) 37℃에서 1% 메탄올 복합 배지를 이용하여, 또는 세포벽 스트레스 조건인 (B) 100 ㎍/㎖ 콩고레드를 포함하는 배지에서 배양하여 성장률을 비교하였다. 액체배지에서 지수 성장기까지 배양한 효모들을 좌측으로부터 10배씩 희석하면서 점적하여 성장률을 비교하였으며, 각 레인에 점적한 효모 균주는 아래와 같다:
1; HpOCH1 유전자 결손 한세눌라 폴리모르파 DL1-g22 균주(H. polymorpha DL1-g22),
2; HpGAS1 유전자 결손 한세눌라 폴리모르파 DL1-g22 변이주(H. polymorpha DL1-g22 HpGAS1Δ),
3; HpGas1을 발현시킨 HpGAS1 결손 변이주(HpGAS1Δ/pDLMOX-G1),
4; MFα 신호 펩타이드를 가진 HpGas1을 발현시킨 HpGAS1 결손 변이주(HpGAS1Δ/pDLMOX-M-G1),
5; ASS 신호 펩타이드를 가진 HpGas1을 발현시킨 HpGAS1 결손 변이주(HpGAS1Δ/pDLMOX-A-G1),
6; MFα 신호 펩타이드, Gcase 및 HpGas1로 연결된 융합 단백질을 발현시킨 HpGAS1 결손 변이주(HpGAS1Δ/pDLMOX-M-Gcase-G1),
7; ASS 신호 펩타이드, Gcase 및 HpGas1로 연결된 융합 단백질을 발현시킨 HpGAS1 결손 변이주(HpGAS1Δ/pDLMOX-A-Gcase-G1),
8; MFα 신호 펩타이드, GLA 및 HpGas1로 연결된 융합 단백질을 발현시킨 HpGAS1 결손 변이주(HpGAS1Δ/pDLMOX-M-GLA-G1), 및
9; ASS 신호 펩타이드, GLA 및 HpGas1로 연결된 융합 단백질을 발현시킨 HpGAS1 결손 변이주(HpGAS1Δ/pDLMOX-A-GLA-G1).
본 발명은 (a) Gas1을 코딩하는 유전자가 결실된 효모 변이주에 N-말단으로부터 차례로 신호 펩타이드, 목적 단백질 및 Gas1 단백질의 신호 펩타이드를 제외한 도메인이 융합된 융합 단백질을 코딩하는 핵산을 도입하는 단계; (b) 상기 핵산을 도입한 효모 변이주를 세포벽 스트레스 조건 하에서 배양하는 단계; 및 (c) 상기 융합 단백질을 코딩하는 핵산을 도입한 효모 변이주의 성장 정도를 Gas1을 코딩하는 유전자가 결실된 효모 변이주와 비교하는 단계를 포함하는, 야생형에 비하여 목적 단백질의 분비능이 향상된 효모 균주를 스크리닝하는 방법을 제공한다.
본 발명에서 용어, "Gas1"은 β-1,3-글루카노실트랜스글라이코실레이즈(β-1,3-glucanosyltransglycosylase)로서 세포 표면으로 분비되어 β-1,3-글루칸(β-1,3-glucan) 세포벽 합성에 관여한다. 또한 상기 Gas1은 글리코실포스파티딜이노시톨 앵커(glycosylphosphatidylinositol anchor; GPI anchor)를 통해 세포 표면에 부착되는 당단백질(glycoprotein)이다. 이는 교차결합 효소로 효모 세포벽의 구조 및 투과성에 중요한 역할을 한다. 상기 Gas1을 코딩하는 유전자인 GAS1은 N-말단에는 신호 펩타이드(signal peptide; SP)를, C-말단에는 세포 표면에 고정화하기 위한 글리코실포스파티딜이노시톨(GPI) 앵커 도메인을 포함하며, 활성 도메인이 그 사이에 위치한다.
상기 세포벽 합성에 관여하는 단백질인 Gas1의 부재 즉, GAS1 유전자가 결손된 균주는 세포벽이 약화되어 세포벽 스트레스 조건에서는 성장하기 어렵다. 이에 본 발명자들은 Gas1 단백질을 리포터로 하여 Gas1 단백질의 N-말단에 목적 단백질을 융합시킨 융합 단백질 생산 시스템을 개발하였다. 상기 융합 단백질 생산 시스템은 Gas1 단백질을 포함하므로, 세포벽 스트레스 조건에서 성장이 저해되는 것을 회복하기 위하여 Gas1을 발현 분비하려는 성질을 나타낸다. 따라서, Gas1과의 융합 단백질 생산 시스템은 세포벽 스트레스 조건에서 융합 단백질의 발현 및 분비가 향상되며 해당 효모의 분비 여부 및 정도는 세포벽 스트레스 조건에서 상기 융합 단백질 생산 시스템의 성장능을 분석하여 확인할 수 있다. 본 발명의 목적상, 스크리닝을 위해서는 단순히 Gas1을 포함하는 융합 단백질을 분비하는 것뿐만 아니라 상기 분비된 융합 단백질이 천연형의 Gas1 단백질과 마찬가지로 세포 표면에 결합하여 세포벽을 형성함으로써 성장능을 회복시킬 수 있어야 하므로 세포 표면에 결합하기 위한 Gas1의 C-말단에 위치한 GPI 앵커 도메인은 자유롭게 결합가능한 상태로 유지되는 것이 바람직하다. 따라서, 상기 융합 단백질은 N-말단으로부터 차례로 신호 펩타이드, 목적 단백질 및 Gas1 단백질의 신호 펩타이드를 제외한 도메인의 순서로 융합되도록 고안하는 것이 바람직하다.
본 발명에서 용어, "분비(secretion)"는 세포 또는 샘(gland)으로부터 물질을 방출하는 과정을 의미하는 것으로, 방출되는 물질이 폐기물(waste product)이 아닌 어떠한 기능을 갖는 물질이라는 점에서 배설(excretion)과는 구별된다. 전형적인 세포의 분비 기전은 포로솜(porosome; 세포미세공)이라는 세포 형질막(plasma membrane)에 있는 분비문(secretory portal)을 통한다. 특히 본 발명에서의 분비는 경로에 제한없이 세포 내에서 생성된 단백질이 세포 밖으로 방출되는 현상을 모두 포함하며, 상기 분비된 융합 단백질은 Gas1 단백질을 통해 세포벽에 고정된 형태일 수 있다. 따라서, 상기 분비된 융합 단백질로부터 목적 단백질을 회수하기 위하여 Gas1 단백질로부터 목적 단백질을 분리시키는 단계를 추가로 수행할 수 있다. 구체적인 사항은 후술할 것이다.
본 발명의 구체적인 실시예에서는 모균주로서 GAS1 유전자가 결손된 균주, 상기 균주에 Gas1을 발현하도록 제조된 변이주, 및 세포 밖으로의 분비능이 열악한 Gcase 및 GLA 단백질과의 융합 단백질을 생성하는 효모 변이주를 제작하고, 이들 균주의 세포벽 스트레스 조건에서의 성장능을 확인하였다. 그 결과, GAS1 유전자가 결손된 균주는 세포벽 스트레스 조건에서 성장하지 못하였으나, 이로부터 Gas1을 발현하도록 제조된 변이주는 성장능을 회복한 것을 확인할 수 있었다. 한편, 상기 Gas1과 Gcase 또는 GLA와의 융합 단백질을 생산하는 효모 변이주는 Gas1을 단독으로 발현하는 변이주보다는 성장능이 감소되었으나, GAS1 유전자가 결손된 균주에 비해서는 향상된 성장능을 나타내는 것을 확인할 수 있었다(도 3 및 도 7).
본 발명에 따른 스크리닝 방법은 분비능이 높은 균주의 선별을 위하여 효모 변이주 라이브러리에 적용할 수 있다. 상기 효모 변이주 라이브러리는 돌연변이의 도입에 의해 제작할 수 있으나, 이에 제한되지 않으며, 당업계에 공지된 라이브러리 제조방법을 사용하여 수행될 수 있다. 바람직하게 상기 돌연변이는 효모의 단백질 분비능을 향상시키기 위하여 수행되는 것일 수 있다.
한편, 분비능을 향상시키기 위한 상기 돌연변이는 효모 변이주 자체에 도입되거나, 목적 단백질에 도입될 수 있다. 이때, 상기 돌연변이는 무작위 돌연변위일 수 있다.
상기 효모 변이주 자체에 무작위 돌연변이를 도입하는 방법은 당업계에 공지된 방법을 제한없이 사용할 수 있다. 예컨대, EMS(ethyl methanesulfonate) 또는 NTG(N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine) 등과 같은 돌연변이 유발물질(mutagen)을 사용하는 화학적인 방법; 또는 DNA 복제시 복구(repair)와 관련된 유전자가 결손된 숙주를 사용하거나 교정기능이 손상된 POL3 유전자를 도입하는 유전학적인 방법 등을 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한 목적 단백질에 돌연변이를 도입하는 방법은 당업계에 공지된 방법을 제한없이 사용할 수 있다. 바람직하게는 돌연변이가 도입된 목적 단백질을 코딩하는 유전자 절편과 절단된 벡터를 함께 효모 변이주에 첨가하여 효모 내에서의 상동 재조합에 의해 효모 변이주 내의 염색체로 도입될 수 있다.
상기 효모 변이주의 모균주는 당업계에 공지된 Gas1을 발현하는 효모 균주를 제한없이 사용할 수 있다. 바람직하게 Gas1을 코딩하는 유전자를 포함하는 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae), 한세눌라 폴리모르파(Hansenula polymorpha), 피키아 파스토리스(Pichia pastoris) 또는 야로위아 리폴리티카(Yarrowia lipolytica)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서, 용어 "신호 펩타이드(signal peptide; SP)"는 신호 서열, 리더 서열 또는 리더 펩타이드라고도 불리는 5 내지 30 아미노산 길이의 짧은 펩타이드로 분비경로(secretory pathway)를 향해 예정된 새롭게 합성된 단백질의 대부분의 N-말단에 존재한다. 상기 신호 펩타이드는 단백질의 특수한 아미노산 배열로 형성된 영역으로 핵 이행 신호, 미토콘드리아 이행 신호 등이 있으며, 이는 이를 포함하는 단백질의 경로를 결정한다. 상기 단백질은 세포로부터 분비되거나 대부분의 세포막에 삽입되어 특정 기관(예컨대, 세포질세망(endoplasmic reticulum), 골지(golgi) 또는 엔도솜(endosome)) 내에 존재하는 단백질에 포함된다. 대부분의 제1형 막-결합 단백질이 신호 펩타이드를 포함함에도 불구하고 제2형 및 멀티-스패닝 막-결합 단백질의 대부분은 절단되지 않는 것을 제외하고는 신호 서열과 생화학적으로 유사한 첫번째 통과막 도메인(transmembrane domain)에 의해 분비경로로 표적화된다. 상기 신호 펩타이드를 포함하는 제1형 막-결합 단백질은 정지-이동 고정 서열(stop-transfer anchor sequence)를 갖는 지질막에 결합하며, 합성과정 동안 세포질세망 내강(성숙형이 원형질막(plasmalemma)에 위치하는 경우, 세포외 공간)을 표적하는 N-말단을 포함한다. 전술한 바와 같이 신호 펩타이드는 이를 포함하는 단백질의 세포 내 경로를 결정하므로 해당 단백질의 분비 효율을 결정하는 중요한 요소이다. 상기 신호 펩타이드는 극도로 비균질(heterogeneous)하며, 많은 원핵성 및 진핵성 신호 펩타이드는 심지어는 다른 종에서도 기능적으로 상호교환가능하다.
따라서, 본 발명의 융합 단백질을 발현하는 효모 변이주는 신호 펩타이드로서 상기 융합 단백질에 사용되는 Gas1 유래 또는 상기 Gas1 이외의 단백질 유래의 신호 펩타이드를 제한없이 포함할 수 있다. 이때, 상기 Gas1 이외의 단백질은 다른 효모 균주의 Gas1 또는 Gas1이 아닌 다른 단백질, 바람직하게는 제1형 막-결합 단백질일 수 있다. 바람직하게는 종이나 단백질의 종류에 무관하게 단백질의 분비 효율을 향상시킬 수 있는 신호 펩타이드를 이용할 수 있다.
본 발명에 따른 GAS1 결손 효모 변이주를 이용하는 단백질 분비 효모 균주의 스크리닝 방법의 상기 (b) 단계에서 세포벽 스트레스 조건은 바람직하게 세포벽 합성 저해제를 포함하는 배지에 배양하거나, 정상적인 배양 온도보다 높은 온도에서 배양함으로써 제공될 수 있으나, 이에 제한되지 않으며, 당업계에 공지된 세포벽에 스트레스를 부여할 수 있는 배양조건을 적용할 수 있다.
상기 세포벽 합성 저해제의 비제한적인 예는 콩고레드(Congo red; CR), 칼코플루오로 화이트(Calcofluor white), 카페인(caffeine), 캐스포펀진(caspofungin), 하이그로마이신(hygromycin), 소디움 도데실 설페이트(sodium dodecyl sulfate; SDS) 및 이들의 조합을 포함할 수 있다.
한편, 사카로마이세스 세레비지애의 경우 정상적인 배양 온도보다 높은 37℃에서 배양함으로써 세포벽 스트레스 조건을 달성할 수 있다.
다른 하나의 양태로서, 본 발명은 효모 균주에 N-말단에 신호 펩타이드를 포함하고 목적 단백질과 Gas1 단백질이 융합된 융합 단백질을 코딩하는 핵산을 도입하는 단계를 포함하는, 목적 단백질의 분비능을 향상시키는 방법을 제공한다.
상기 신호 펩타이드는 전술한 바와 같이 이에 결합된 단백질의 분비 효율을 결정하며, 이는 이를 발현하는 종이나 단백질의 종류에 무관하게 상호 교환 가능하므로, Gas1 단백질의 신호 펩타이드 서열에 제한되지 않고, 종이나 단백질의 종류에 무관하게 단백질의 분비능을 향상시킬 수 있는 신호 펩타이드를 선택하여 사용할 수 있다.
다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 스크리닝하는 방법에 의해 스크리닝된 효모 균주에 목적 단백질을 코딩하는 핵산을 도입하는 단계를 포함하는, 목적 단백질의 제조방법을 제공한다.
바람직하게 상기 목적 단백질은 돌연변이에 의해 분비능이 향상될 수 있으며, 상기 돌연변이는 무작위 돌연변위일 수 있다.
또한 바람직하게 상기 목적 단백질은 추가로 신호펩타이드를 포함할 수 있으며, 상기 신호펩타이드는 전술한 바와 같이, 종이나 단백질의 종류에 무관하게 단백질의 분비능을 향상시킬 수 있는 신호 펩타이드를 선택하여 사용할 수 있다.
또한 바람직하게 상기 제조방법은 스크리닝된 효모 균주가 결실된 Gas1을 코딩하는 유전자를 회복한 것일 수 있다.
다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 스크리닝하는 방법에 의해 스크리닝된 효모 균주에 N-말단으로부터 차례로 신호 펩타이드, 목적 단백질, 링커 및 Gas1 단백질의 신호 펩타이드를 제외한 도메인이 융합된 융합 단백질을 코딩하는 핵산을 도입하는 단계를 포함하는, 목적 단백질의 제조방법을 제공한다.
바람직하게 상기 목적 단백질은 전술한 바와 같이, 돌연변이에 의해 분비능이 향상될 수 있으며, 상기 돌연변이는 무작위 돌연변위일 수 있고, 추가로 신호펩타이드를 포함할 수 있으며, 상기 신호펩타이드는 종이나 단백질의 종류에 무관하게 단백질의 분비능을 향상시킬 수 있는 신호 펩타이드를 선택하여 사용할 수 있다.
바람직하게 상기 제조방법은 분비된 융합 단백질로부터 목적 단백질을 회수하기 위하여 Gas1 단백질로부터 목적 단백질을 분리시키는 단계를 추가로 수행할 수 있다. 상기 목적 단백질을 분리시키는 단계는 당업계에 공지된 방법을 제한없이 이용하여 수행될 수 있다. 또한 상기 목적 단백질의 분리를 용이하게 하기 위하여 상기 Gas1 단백질과 목적 단백질이 용이하게 절단될 수 있는 링커를 통하여 연결된 융합 단백질의 형태로 발현하도록 융합 단백질을 코딩하는 핵산을 고안할 수 있다. 상기 링커는 이에 제한되지 않으나, 제한효소에 의해 절단될 수 있도록 특이적인 결합자리를 갖는 서열로 구성되는 펩타이드 등일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 Gas1 또는 이의 융합 단백질의 분비능이 향상된 효모 변이주의 제조방법으로서, (a) Gas1 단백질을 발현하는 효모에 돌연변이를 도입하여 효모 변이주를 준비하는 단계; (b) Gas1 단백질을 발현하는 효모에서 Gas1의 유전자 또는 이의 발현에 관여하는 부위에 돌연변이를 유발시켜 Gas1 단백질의 발현을 저해시키는 단계; 및 (c) 상기 (a) 및 (b) 단계를 수행하여 획득한 효모 변이주에 Gas1 단백질 또는 이의 융합 단백질을 코딩하는 핵산을 도입하는 단계; 및 (d) 상기 (c) 단계로부터 획득한 효모 변이주를 세포벽 스트레스 조건 하에서 배양시 생존하는 효모 변이주를 선별하는 단계를 포함하고, 상기 (a) 및 (b) 단계는 순차적 또는 역순으로 수행될 수 있는 것인 제조방법을 제공한다.
상기 Gas1 단백질을 발현하는 효모 자체에 돌연변이를 도입하는 (a) 단계와 Gas1 단백질을 발현하는 효모에서 Gas1의 유전자 또는 이의 발현에 관여하는 부위에 돌연변이를 유발시켜 Gas1 단백질의 발현을 저해시키는 (b) 단계는 서로 독립적인 단계이므로, 상기 두 단계의 수행 순서는 본 발명의 제조방법에 영향을 미치지 않는다. 따라서, 순차적으로 또는 역순으로 수행될 수 있다.
전술한 바와 같이, 상기 신호 펩타이드는 종이나 단백질의 종류에 무관하게 단백질의 분비능을 향상시킬 수 있는 신호 펩타이드를 선택하여 사용할 수 있다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 스크리닝하는 방법에 의해 스크리닝된 야생형에 비하여 목적 단백질의 분비능이 향상된 효모 균주를 제공한다.
바람직하게 상기 목적 단백질의 분비능이 향상된 효모 균주는 상기 스크리닝된 효모 균주의 결실된 Gas1을 코딩하는 유전자를 회복시킨 것일 수 있다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 (a) Gas1 단백질을 발현하는 효모 또는 이의 변이주에 N-말단에 신호 펩타이드를 포함하고 목적 단백질과 Gas1 단백질이 융합된 융합 단백질을 코딩하는 핵산을 도입하는 단계; 및 (b) 상기 핵산을 도입한 효모 변이주를 세포벽 스트레스 조건 하에서 배양하는 단계를 포함하는, 목적 단백질의 제조방법을 제공한다.
바람직하게 상기 변이주는 Gas1 단백질을 발현하는 효모에서 Gas1의 유전자 또는 이의 발현에 관여하는 부위에 돌연변이가 유발되어 Gas1 단백질의 발현이 저해된 것일 수 있으며, 보다 바람직하게는 Gas1 단백질을 코딩하는 유전자인 GAS1을 제거한 GAS1 결손 변이주일 수 있다.
전술한 바와 같이, 상기 신호 펩타이드는 종이나 단백질의 종류에 무관하게 단백질의 분비능을 향상시킬 수 있는 신호 펩타이드를 선택하여 사용할 수 있다.
상기 분비된 융합 단백질로부터 목적 단백질을 회수하기 위하여 Gas1 단백질로부터 목적 단백질을 분리시키는 단계를 추가로 수행할 수 있다. 상기 목적 단백질을 분리시키는 단계는 당업계에 공지된 방법을 제한없이 이용하여 수행될 수 있다. 또한 상기 목적 단백질의 분리를 용이하게 하기 위하여 상기 Gas1 단백질과 목적 단백질이 용이하게 절단될 수 있는 링커를 통하여 연결된 융합 단백질의 형태로 발현하도록 융합 단백질을 코딩하는 핵산을 고안할 수 있다. 상기 링커는 이에 제한되지 않으나, 제한효소에 의해 절단될 수 있도록 특이적인 결합자리를 갖는 서열로 구성되는 펩타이드 등일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시에에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: S. cerevisiae 효모의 GAS1 스크리닝 시스템용 벡터 제작
실시예 1.1: ScGAS1 유전자 발현벡터의 제작
미국 국립생물정보센터(National Center for Biotechnology Information; NCBI) 웹사이트(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)로부터 검색을 통하여 S. cerevisiae 효모의 GAS1(ScGAS1) 유전자 서열을 확보하였다. 선행문헌으로부터 559개 아미노산 서열 중 N-말단 1 내지 22번의 신호 펩타이드를 포함하며, 23 내지 559번에 활성도메인 및 세포 표면에 대한 고정(localization) 정보가 존재함을 확인하였다(Carotti et al., Eur. J. Biochem., 2004, 271(18): 3635-3645). 상기 세포 표면에 단백질을 고정시키는 역할을 하는 글리코실포스파티딜이노시톨-앵커(glycosylphosphatidylinositol-anchor; GPI-anchor) 도메인은 C-말단에 위치한다. 본 발명에서는 사카로마이세스 세레비지애(S. cerevisiae) BY4741 균주로부터 분리한 염색체 DNA를 주형으로 하고 ScGas1-F(서열번호 1) 및 ScGas1-R(서열번호 2)를 프라이머로 이용하여 PCR을 수행하여 ScGAS1 유전자를 수득하였다. 상기 수득한 DNA 절편을 BamHI 제한효소를 이용하여 YEp352ScGAPDHpt 벡터에 클로닝하여 YEp352-G1을 제작하였다(도 2B 좌측). 또한, ScGAS1의 신호 펩타이드(N-말단으로부터 1 내지 22번)를 MFα(mating factor α)의 신호 펩타이드로 교체하기 위한 클로닝을 수행하였다. 구체적으로 Invitrogen 사의 pPICZαA 벡터를 주형으로 사용하고, MFa-F(YEp352)(서열번호 3) 및 MFaR(YEp352)(서열번호 4) 프라이머쌍을 이용하여 MFα의 N-말단 신호 펩타이드를 포함하는 prepro 서열을 PCR로 증폭시켰다. 이후 BY4741 균주로부터 분리한 염색체 DNA를 주형으로 하고 ScGas1_w/o_SP-F(서열번호 5) 및 ScGas1-R(서열번호 2)를 프라이머로 이용하여 신호 펩타이드의 후방의 ScGAS1 유전자 서열을 증폭시켰으며, 융합 PCR(fusion PCR)을 수행하여 이를 앞서 수득한 MFα의 prepro 부분 DNA와 결합시켰다. 최종 융합 PCR에는 MFa-F(서열번호 3)와 ScGas1-R(서열번호 2) 프라이머쌍을 사용하였다. 증폭된 DNA는 BamHI 제한효소를 이용하여 YEp352ScGAPDHpt 벡터에 클로닝하여 YEp352-M-G1을 제작하였다(도 2B 좌측).
실시예 1.2: ScGas1과 외래 재조합 단백질의 융합 단백질 발현을 위한 발현벡터의 제작
본 발명에서는 외래 재조합 단백질로서 인간 글루코세레브로시다아제(glucocerebrosidase; Gcase) 및 α-갈락토시다아제(α-galactosidase; GLA) 효소 단백질을 선택하였다. 상기 단백질은 각각 고셔병(Gaucher disease)과 파브리병(Fabry disease) 환자에 투여되는 고가의 효소 치료제로서 현재로서는 동물세포인 CHO(chinese hamster ovary) 세포를 이용하여 생산되고 있으나, 분비 발현이 어려운 단백질이다. 본 발명자들은 인간의 cDNA로부터 Gcase-F(서열번호 6) 및 Gcase-R(서열번호 7)의 프라이머쌍을 이용하여 PCR을 통해 Gcase 유전자를 증폭하여 수득하였다. 이후, SpeI 제한효소를 사용하여 상기 실시예 1.1.에서 구축한 YEp352-M-G1 벡터에 이를 클로닝하여 YEp352-M-Gcase-G1 벡터를 제작하였다(도 2B 우측). 마찬가지로 GLA-F(서열번호 8) 및 GLA-R(서열번호 9)를 프라이머쌍으로 이용하여 전술한 방법으로 GLA 유전자를 증폭시켜 수득하고 이를 YEp352-M-G1 벡터에 클로닝하여 YEp352-M-GLA-G1 벡터를 제작하였다(도 2B 우측).
실시예 2: ScGAS1 결손 균주에서 ScGas1과 외래 재조합 단백질의 융합 단백질 발현을 통한 세포벽 스트레스 저항성 회복
Gas1 융합 단백질의 세포벽 스트레스 저항성 회복기능을 이용한 고 분비 균주 스크리닝 시스템의 개념을 증명하기 위하여 S. cerevisiae 효모의 GAS1 결손 균주를 이용하였다. 상기 ScGAS1 결손 균주(S. cerevisiae BY4741 ScGAS1Δ, YSC1021-551615)는 오픈 바이오세스템스 사로부터 구입하여 사용하였다. 상기 ScGAS1Δ 균주에 실시예 1에서 제작한 YEp352-G1, YEp352-M-G1, YEp352-M-Gcase-G1 및 YEp352-M-GLA-G1 벡터를 형질전환으로 도입하였다. 이후 이들 형질전환 균주들을 세포벽 스트레스 조건에서 배양하여 성장 정도를 확인하였다. 대조군으로는 야생형 균주 및 GAS1 결손 균주를 사용하였다. 세포벽 스트레스 조건을 제공하기 위하여 세포벽 합성 저해제인 콩고레드 또는 칼코플루오르 화이트를 각각 50 ㎍/㎖과 8 ㎍/㎖로 포함하는 2% 포도당 복합배지를 사용하였다.
구체적으로, S. cerevisiae BY4741 야생형 균주, ScGAS1 유전자 결손 변이주(S. cerevisiae BY4741 ScGAS1Δ), Gas1을 발현시킨 ScGAS1 결손 변이주(ScGAS1Δ/YEp352-G1), MFα 신호 펩타이드를 가진 Gas1을 발현시킨 ScGAS1 결손 변이주(ScGAS1Δ/YEp352-M-G1), MFα 신호 펩타이드, Gcase 및 Gas1로 연결된 융합 단백질을 발현시킨 ScGAS1 결손 변이주(ScGAS1Δ/YEp352-M-Gcase-G1), 및 MFα 신호 펩타이드, GLA 및 Gas1로 연결된 융합 단백질을 발현시킨 ScGAS1 결손 변이주(ScGAS1Δ/YEp352-M-GLA-G1)를 각각 3 ml 씩 2% 포도당 복합배지에 30℃에서 200 rpm으로 진탕배양하였다. 상기 배양한 균주들을 지수 성장기(exponential growth phase)에 수득하여 멸균수 1 ml에 초기 OD600 값을 1로 조절하고 1/10씩 연속적으로 희석하였다. OD를 1로 조절한 균주 및 일련의 희석한 균주를 2% 포도당 복합배지, 50 ㎍/㎖ 콩고레드를 포함하는 배지 및 8 ㎍/㎖ 칼코플루오르 화이트를 포함하는 배지에 1 ㎕씩 집적하여 30℃에서 2일 또는 3일간 배양하였고, 그 결과를 도 3에 나타내었다.
그 결과, 도 3에 나타난 바와 같이, 야생형 균주는 세포벽 스트레스 조건인 50 ㎍/㎖ 콩고레드 또는 8 ㎍/㎖ 칼코플루오르 화이트를 포함하는 배지에서도 뛰어난 성장능을 나타낸 반면, ScGAS1 결손 변이주는 성장이 저해되었다. 그러나, ScGas1 또는 MFα의 신호 펩타이드를 포함하는 ScGas1을 발현하는 ScGAS1 결손 변이주에서는 세포벽 스트레스 조건에서 성장능이 회복되는 것을 확인하였다. 한편, 세포 밖으로 분비가 잘 되지 않는 Gcase 또는 GLA 단백질과 연결된 융합 단백질을 발현하는 경우에는 전방의 Gcase 또는 GLA 단백질로 인해 ScGas1 단백질이 분비되더라도 세포 밖으로 분비되어 세포 표면에 정상적으로 위치하지 못하여 세포벽 스트레스 조건에서 성장이 크게 저해되는 것을 관찰할 수 있었다. 다만, 상대적으로 분비능이 다소 높은 GLA와의 융합 단백질을 발현하는 변이주의 경우 Gcase와의 융합 단백질을 발현하는 변이주보다 다소 높은 성장능을 나타내나 여전히 ScGas1 단백질을 발현하는 변이주보다는 성장이 현저히 저해되었다.
실시예 3: 돌연변이에 의해 분비능이 향상된 효모 균주의 선별
실시예 3.1: 실수유발(error-prone) PCR에 의한 외래 재조합 단백질 내 돌연변이의 도입
실수유발 PCR을 이용하여 외래 재조합 단백질에 무작위적인 돌연변이를 도입하고 이를 생체 내 상동 재조합 클로닝 방법을 이용하여 ScGas1과 융합 단백질로 ScGAS1 결손 균주에서 발현되도록 하여 세포벽 스트레스 조건에서 성장능이 향상된 균주를 선별하고자 하였다.
구체적으로, 인간 Gcase 유전자를 효모에서 고 발현 되도록 코돈이 최적화된 Gcase 유전자(cGcase)를 합성하여 사용하였다(DNA2.0). 상기 합성된 cGcase 유전자를 주형으로 하고 error-cGcase-F(서열번호 10)와 error-cGcase-R(서열번호 11) 프라이머를 사용하였으며, 클론테크 사의 Diversify PCR Random Mutagenesis Kit를 이용하여 실수유발 PCR을 수행하였다. 상기 프라이머들은 YEp352-M-G1 벡터의 MFα 신호 펩타이드 및 GAS1 유전자와 각각 30 bp 이상 중첩되도록 제작하였다(도 4). 이와 같이 증폭된 DNA 절편을 SpeI 제한효소로 절단한 YEp352-M-G1 벡터와 함께 형질전환에 의해 ScGAS1 결손 균주(S. cerevisiae BY4741 ScGAS1Δ)에 도입시켰다. 이로부터, 효모 내에서 상동 재조합 반응에 의해서 환형(circular)으로 완성된 재조합 벡터 YEp352-M-errorGcase-G1을 형성하여 외래 재조합 단백질 부위에 돌연변이가 도입된 Gas1 융합단백질을 발현시켰다. 상기 제조한 일련의 돌연변이 Gcase가 연결된 ScGas1 융합 단백질을 분비하는 균주를 100 ㎍/㎖ 콩고레드 SC-URA 최소 배지에서 배양하여 성장능을 확인하고 분비 발현 능력이 향상된 변이주를 선별하여 확보하였다.
실시예 3.2: 효모 균주에 돌연변이의 도입
상기 실시예 3.1.에서는 외래 재조합 단백질에 돌연변이를 도입하여 분비 발현능력이 향상된 효모 균주를 선별하는 전략을 제시하였다. 또 다른 방법으로서 외래 재조합 단백질보다는 효모 균주 자체에 무작위 돌연변이를 도입하고, 본 발명에 따른 Gas1 스크리닝 시스템을 이용하여 분비 발현능이 향상된 돌연변이 변이주를 선별할 수 있다. 효모 균주에 무작위 돌연변이를 도입하는 방법으로는 EMS 또는 NTG 등과 같은 돌연변이 유발물질(mutagen)을 사용하는 화학적인 방법 또는 DNA 복제시 복구(repair)와 관련된 유전자가 결손된 숙주를 사용하거나 교정 기능이 손상된 POL3 유전자를 도입하는 등의 유전학적인 방법 등을 사용할 수 있다.
실시예 4: 한세눌라 폴리모르파( Hansenula polymorpha ) 효모 균주에서 Gas1 기반 분비 발현 균주의 선별
본 발명자들은 GAS1 결손 균주에 Gas1 단백질과 외래 재조합 단백질을 융합 발현시켜서 성장이 회복되는 생존 스크리닝 방법이 S. cerevisiae 효모에만 국한되지 않고, 다른 효모들에도 적용이 되는지 확인하고자 하였다. 이를 위해서 메탄올자화 효모 피키아 파스토리스(Pichia pastoris)와 더불어 재조합 단백질 분비 발현용으로 널리 사용되고 있는 H. polymorpha 효모에 상기 본 발명에 따른 Gas1 기반 스크리닝 시스템이 적용될 수 있는지를 테스트하였다.
4.1: HpGAS1 유전자 발현벡터의 제작
본 발명자들은 대한민국 특허공개번호 제2013-0142900호에서 규명하였던 H. polymorpha의 GAS1 유전자(HpGAS1)가 발현하는 아미노산 서열과 SignalP 프로그램(www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)을 이용하여 신호 펩타이드 부위를 예측하였다. 그 결과, 전체 546개의 아미노산 중 1 내지 21번의 아미노산이 신호 펩타이드인 것으로 예측되었다. 따라서, 22 내지 546번까지의 아미노산에 활성 도메인과 세포 표면에 고정을 위한 GPI-앵커 도메인이 존재할 것으로 유추할 수 있었다. 본 발명자들은 H. polymorpha DL1 균주로부터 분리한 염색체 DNA를 주형으로 하고, HpGas1-F(서열번호 12) 및 HpGas1-R(서열번호 13) 프라이머들을 이용하여 PCR을 통해 HpGAS1 유전자를 수득하였다. 이렇게 수득한 DNA 절편을 HindIII 제한효소를 이용해서 pDLMOX 벡터에 클로닝하여 pDLMOX-G1을 제작하였다(도 6B의 좌측). 또한, HpGas1의 신호 펩타이드를 MFα 또는 ASS의 신호 펩타이드로 바꾸어 주기 위한 클로닝도 수행하였다. 이를 위하여 Invitrogen 사의 pPICZαA 벡터를 주형으로 하고, MFa-F(pDLMOX)(서열번호 14) 및 MFa-R(pDLMOX)(서열번호 15) 프라이머들을 이용하여 MFα N-말단의 신호 펩타이드를 포함한 prepro 서열을 PCR로 증폭시켰다. 또한, DL1 균주로부터 분리한 염색체 DNA를 주형으로 하고, HpGas1_w/o_SP-F(서열번호 17) 및 HpGas1-R(서열번호 13) 프라이머들을 이용하여 신호 펩타이드 후방의 HpGAS1 유전자 서열을 증폭시켰으며, 이를 앞에서 수득한 MFα의 prepro 부분 DNA와 융합 PCR(fusion PCR)을 통해서 연결하였다. 최종 융합 PCR에는 MFa-F(pDLMOX)(서열번호 14)와 HpGas1-R(서열번호 13) 프라이머를 사용하였다. 증폭된 DNA는 HindIII 제한효소를 이용해서 pDLMOX 벡터에 클로닝하여 pDLMOX-M-G1을 제작하였다(도 6B의 좌측). 아밀라아제의 신호 펩타이드, ASS는 단일 프라이머 AmylasesSS_HpGas1-F(서열번호 16)를 이용하여 HpGas1 단백질에 연결하였다. 구체적으로, DL1 균주로부터 분리한 염색체 DNA를 주형으로 하고, AmylasesSS_HpGas1-F(서열번호 16)와 HpGas1-R(서열번호 13) 프라이머들을 이용하여 증폭하였으며, 이를 HindIII 제한효소를 이용하여 pDLMOX 벡터에 도입하여 pDLMOX-A-G1을 제작하였다(도 6B의 좌측).
실시예 4.2: 외래 재조합 단백질과 융합한 HpGAS1 유전자 발현벡터의 제작
본 발명자들은 외래 재조합 단백질들로서 상기 S. cerevisiae 균주에서와 동일하게 인간 글루코세레브로시다아제(Gcase)와 α-갈락토시다아제(GLA) 효소 단백질을 선택하였다. 본 발명자들은 인간의 cDNA로부터 Gcase-F(MFa-tag)(서열번호 18)와 Gcase-R(preHpGas-tag)(서열번호 20) 프라이머를 이용하여 PCR을 통해 Gcase 유전자를 증폭시켜 수득하였다. 나아가, 상기 수득한 유전자를 EcoRI 제한효소를 이용하여 실시예 4.1.에서 구축한 pDLMOX-M-G1 벡터에 클로닝하여 pDLMOX-M-Gcase-G1 벡터를 제작하였다. 또한, Gcase-F(Amyl-tag)(서열번호 19)와 Gcase-R(preHpGas-tag)(서열번호 20) 프라이머를 이용하여 Gcase 유전자를 증폭하고 EcoRI 제한효소를 이용하여 실시예 4.1.에서 구축한 pDLMOX-A-G1 벡터에 클로닝하여 pDLMOX-A-Gcase-G1 벡터를 구축하였다. 마찬가지로 GLA-F(MFa-tag)(서열번호 21)와 GLA-R(preHpGas-tag)(서열번호 23) 프라이머를 이용하여 GLA 유전자를 PCR로 증폭하여 수득하였고, 이를 EcoRI 제한 효소를 이용하여 pDLMOX-M-G1 벡터에 클로닝하여 pDLMOX-M-GLA-G1 벡터를 제작하였다. 또한, GLA-F(Amyl-tag)(서열번호 22)와 GLA-R(preHpGas-tag)(서열번호 23) 프라이머를 이용하여 GLA 유전자를 증폭하고 EcoRI 제한효소를 이용하여 실시예 4.1.에서 구축한 pDLMOX-A-G1 벡터에 클로닝하여 pDLMOX-A-GLA-G1 벡터를 구축하였다.
실시예 4.3: HpGAS1 결손 균주에서 HpGas1과 외래 재조합 단백질의 융합 단백질 발현을 통한 세포벽 스트레스 저항성 회복
상기 실시예 2를 통해 S. cerevisiae 효모에서 검증된 Gas1 융합 단백질의 세포벽 스트레스 저항성 회복 기능을 이용한 스크리닝 시스템이 H. polymorpha 효모에서도 작동하는지를 알아보기 위하여 추가적인 실험을 수행하였다. 산업적 활용 가능성을 고려하여 효모 특이적인 당사슬을 부가하는 HpOCH1 유전자가 결손된 DL1-g22 균주를 모균주로 사용하였다(Cheon et al, J. Micorbiol., 2012, 50: 341-348). 본 발명자들은 대한민국 특허공개번호 제2013-0142900호에서 사용하였던 Ura 카셋트를 이용한 HpGAS1 유전자 결손과 동일한 방법을 사용하여 H. polymorpha DL1-g22 균주에서 HpGAS1 유전자를 결손시켜 g22-HpGas1Δ 균주를 제작하였다. 그리고, g22-HpGas1Δ 균주에 실시예 4.1. 및 4.2.에서 제작한 pDLMOX-G1, pDLMOX-M-G1, pDLMOX-A-G1, pDLMOX-M-Gcase-G1, pDLMOX-A-Gcase-G1, pDLMOX-M-GLA-G1 및 pDLMOX-A-GLA-G1 벡터들을 형질전환으로 도입하였다. 상기 형질전환 균주들과 대조군으로써 DL1-g22 균주를 세포벽 스트레스 조건에서 배양하여 성장을 비교하였다. 세포벽 스트레스 조건을 위해서는 세포벽 합성 저해제로서 100 ㎍/㎖ 콩고레드와 탄소원으로서 1% 메탄올(MeOH)을 포함하는 복합 배지를 사용하였다.
구체적으로, HpOCH1 유전자 결손 한세눌라 폴리모르파 DL1-g22 균주(DL1-g22), HpGAS1 결손 변이주(g22-HpGAS1Δ), HpGas1을 발현시킨 HpGAS1 결손 변이주(HpGAS1Δ/pDLMOX-G1), MFα 신호 펩타이드를 가진 HpGas1을 발현시킨 HpGAS1 결손 변이주(HpGAS1Δ/pDLMOX-M-G1), ASS 신호 펩타이드를 가진 HpGas1을 발현시킨 HpGAS1 결손 변이주(HpGAS1Δ/pDLMOX-A-G1), MFα 신호 펩타이드, Gcase 및 HpGas1로 연결된 융합 단백질을 발현시킨 HpGAS1 결손 변이주(HpGAS1Δ/pDLMOX-M-Gcase-G1), ASS 신호 펩타이드, Gcase 및 HpGas1로 연결된 융합 단백질을 발현시킨 HpGAS1 결손 변이주(HpGAS1Δ/pDLMOX-A-Gcase-G1), MFα 신호 펩타이드, GLA 및 HpGas1로 연결된 융합 단백질을 발현시킨 HpGAS1 결손 변이주(HpGAS1Δ/pDLMOX-M-GLA-G1), 및 ASS 신호 펩타이드, GLA 및 HpGas1로 연결된 융합 단백질을 발현시킨 HpGAS1 결손 변이주(HpGAS1Δ/pDLMOX-A-GLA-G1)를 각각 3 ml씩 37℃에서 1% 포도당 복합 배지에 200 rpm으로 진탕배양하였다. 상기 배양한 균주들을 지수 성장기에 수득하여 멸균수 1 ml에 초기 OD600 값을 1로 조절하고 1/10씩 연속적으로 희석하였다. 상기 OD를 1로 조절한 균주 및 일련의 희석한 균주를 1% 메탄올 복합 배지(도 7A) 및 100 ㎍/㎖ 콩고레드를 포함하는 배지(도 7B)에 1 ㎕씩 집적하여 37℃에서 2일 또는 3일간 배양하였다.
그 결과, 도 7에 나타난 바와 같이, 야생형은 세포벽 스트레스 조건인 100 ㎍/㎖ 콩고레드를 포함하는 배지에서도 우수한 성장능을 나타내는데 반해, HpGAS1 결손 균주는 성장이 현저히 저해되는 것을 확인하였다. 한편, HPGAS1 결손 균주에 HpGas1 또는 다른 신호 펩타이드를 포함하는 HpGas1 단백질을 발현하게 되면, 신호 펩타이드의 종류와 무관하게, 세포벽 스트레스 조건에서도 성장능이 회복됨을 확인하여였다. 또한, Gcase 또는 GLA와 HpGas1을 융합한 단백질들의 경우에서도 HpGas1 단백질만 발현시킨 경우보다는 미약하지만 HpGAS1 결손 균주에 비해서는 성장이 다소 회복되는 것을 관찰할 수 있었다.
이와 같은 결과는, 본 발명의 Gas1 기반 스크리닝 시스템이 다양한 효모 종류에서 분비능이 우수한 효모를 스크리닝할 수 있음을 시사하는 것이며, 이와 같이 스크리닝된 효모 균주를 이용해 다양한 목적 단백질을 대량 생산할 수 있음을 시사하는 것이다.
본 명세서는 본 발명의 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자이면 충분히 인식하고 유추할 수 있는 내용은 그 상세한 기재를 생략하였으며, 본 명세서에 기재된 구체적인 예시들 이외에 본 발명의 기술적 사상이나 필수적 구성을 변경하지 않는 범위내에서 보다 다양한 변형이 가능하다. 따라서 본 발명은 본 명세서에서 구체적으로 설명하고 예시한 것과 다른 방식으로 실시될 수 있으며, 이는 본 발명의 기술 분야에 통상의 지식을 가진 자이면 이해할 수 있는 사항이다.

Claims (19)

  1. (a) Gas1을 코딩하는 유전자가 결실된 효모 변이주에 N-말단으로부터 차례로 신호 펩타이드, 목적 단백질 및 Gas1 단백질의 신호 펩타이드를 제외한 도메인이 융합된 융합 단백질을 코딩하는 핵산을 도입하는 단계;
    (b) 상기 핵산을 도입한 효모 변이주를 세포벽 스트레스 조건 하에서 배양하는 단계; 및
    (c) 상기 융합 단백질을 코딩하는 핵산을 도입한 효모 변이주의 성장 정도를 Gas1을 코딩하는 유전자가 결실된 효모 변이주와 비교하는 단계를 포함하는, 야생형에 비하여 목적 단백질의 분비능이 향상된 효모 균주를 스크리닝하는 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 효모 변이주는 효모 변이주 라이브러리인 것인 방법.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 효모 변이주의 모균주는 Gas1을 코딩하는 유전자를 포함하는 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae), 한세눌라 폴리모르파(Hansenula polymorpha), 피키아 파스토리스(Pichia pastoris) 및 야로위아 리폴리티카(Yarrowia lipolytica)로 구성된 군으로부터 선택되는 균주인 것인 방법.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 신호 펩타이드는 융합 단백질에 사용되는 Gas1 유래 또는 상기 Gas1 이외의 단백질 유래인 것인 방법.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 Gas1 이외의 단백질은 상기 (a) 단계의 효모 변이주 이외의 다른 효모 균주의 Gas1; 또는 Gas1이 아닌 다른 단백질인 것인 방법.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 (b) 단계에서 세포벽 스트레스 조건은 세포벽 합성 저해제를 포함하는 배지에 배양하거나, 정상적인 배양 온도보다 높은 온도에서 배양함으로써 제공되는 것인 방법.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 세포벽 합성 저해제는 콩고레드, 칼코플루오로 화이트, 카페인, 캐스포펀진, 하이그로마이신 및 소디움 도데실 설페이트로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 세포벽 합성 저해제인 것인 방법.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 효모 변이주는 무작위 돌연변이에 의해 분비능이 향상된 것인 방법.
  9. Gas1 단백질을 발현하는 효모 또는 이의 변이주에 N-말단에 신호 펩타이드를 포함하고 목적 단백질과 Gas1 단백질이 융합된 융합 단백질을 코딩하는 핵산을 도입하는 단계를 포함하는, 목적 단백질의 분비능을 향상시키는 방법.
  10. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 방법에 의해 스크리닝된 효모 균주에 목적 단백질을 코딩하는 핵산을 도입하는 단계를 포함하는, 목적 단백질의 제조방법.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 목적 단백질은 무작위 돌연변이에 의해 분비능이 향상된 것인 제조방법.
  12. 제10항에 있어서,
    상기 목적 단백질은 추가로 신호펩타이드를 포함하는 것인 제조방법.
  13. 제10항에 있어서,
    상기 스크리닝된 효모 균주는 결실된 Gas1을 코딩하는 유전자가 회복된 것인 제조방법.
  14. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 방법에 의해 스크리닝된 효모 균주에 N-말단으로부터 차례로 신호 펩타이드, 목적 단백질, 링커 및 Gas1 단백질의 신호 펩타이드를 제외한 도메인이 융합된 융합 단백질을 코딩하는 핵산을 도입하는 단계를 포함하는, 목적 단백질의 제조방법.
  15. 제14항에 있어서,
    상기 융합 단백질의 링커를 제한효소로 절단하여 목적 단백질을 분리시키는 것인 제조방법.
  16. Gas1 또는 이의 융합 단백질의 분비능이 향상된 효모 변이주의 제조방법으로서,
    (a) Gas1 단백질을 발현하는 효모에 돌연변이를 도입하여 효모 변이주를 준비하는 단계;
    (b) Gas1 단백질을 발현하는 효모에서 Gas1의 유전자 또는 이의 발현에 관여하는 부위에 돌연변이를 유발시켜 Gas1 단백질의 발현을 저해시키는 단계; 및
    (c) 상기 (a) 및 (b) 단계를 수행하여 획득한 효모 변이주에 Gas1 단백질 또는 이의 융합 단백질을 코딩하는 핵산을 도입하는 단계; 및
    (d) 상기 (c) 단계로부터 획득한 효모 변이주를 세포벽 스트레스 조건 하에서 배양시 생존하는 효모 변이주를 선별하는 단계를 포함하고, 상기 (a) 및 (b) 단계는 순차적 또는 역순으로 수행될 수 있는 것인 제조방법.
  17. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 방법에 의해 스크리닝된 야생형에 비하여 목적 단백질의 분비능이 향상된 효모 균주.
  18. (a) Gas1 단백질을 발현하는 효모 또는 이의 변이주에 N-말단에 신호 펩타이드를 포함하고 목적 단백질과 Gas1 단백질이 융합된 융합 단백질을 코딩하는 핵산을 도입하는 단계; 및
    (b) 상기 핵산을 도입한 효모 변이주를 세포벽 스트레스 조건 하에서 배양하는 단계를 포함하는, 목적 단백질의 제조방법.
  19. 제18항에 있어서,
    상기 변이주는 Gas1 단백질을 발현하는 효모에서 Gas1의 유전자 또는 이의 발현에 관여하는 부위에 돌연변이가 유발되어 Gas1 단백질의 발현이 저해된 것인 제조방법.
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