WO2014195552A1 - Hidrogeles multicomponentes basados en vinilpirrolidona y su aplicación en ingeniería de tejidos y/o medicina regenerativa - Google Patents

Hidrogeles multicomponentes basados en vinilpirrolidona y su aplicación en ingeniería de tejidos y/o medicina regenerativa Download PDF

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Alberto Gallardo Ruiz
Inmaculada Aranaz Corral
María NASH
Myriam GÓMEZ TARDAJOS
Carlos Elvira Pujalte
Helmut Reinecke
Enrique MARTÍNEZ CAMPOS
Viviana RAMOS LINO
José Luis LÓPEZ LACOMBA
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Universidad Complutense de Madrid
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Universidad Complutense de Madrid
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    • C12N2533/00—Supports or coatings for cell culture, characterised by material
    • C12N2533/30—Synthetic polymers

Definitions

  • the present invention relates to a hydrogel with crosslinked multicomponent polymeric network structure comprising vinyl pyrrolidone, an anionic or anionizable alkylene monomer, preferably an anionic acrylic monomer, and one or more crosslinkers. It also refers to a process for obtaining the hydrogel where the multicomponent network is formed in a single polymerization stage. Additionally, the present invention also relates to the use of hydrogel in tissue engineering and / or regenerative medicine, preferably in cell culture and cell monolayer transplantation.
  • thermosensitive platforms The high number of publications of the last two decades dedicated to the development and optimization of this type of thermosensitive platforms speaks of the importance of this field in biomedicine.
  • substrates such as poly-N-isopropylacrylamide (pNlPAm), which inherently possess a thermosensitive behavior in a physiologically relevant range.
  • pNlPAm substrates At temperatures above the LCST (lower critical solution temperature) pNlPAm substrates assume a collapsed hydrophobic state that under certain conditions give rise to cell adhesion and proliferation. Some of these conditions can be quite strict, such as the thickness of the substrate, which must be very small.
  • cell layers composed of epithelial cells of the oral mucosa, epithelial corneal keratinocytes, skeletal tissue myoblasts or myocardiocytes.
  • cell layers have been superimposed to achieve tissue-like 3D systems, using one or more cell types and maintaining their physiological and morphological integrity.
  • the cellular layers obtained in this way have been proposed for many clinical applications, such as dilated cardiomyopathy, reconstructive and regenerative plastic surgery, esophageal ulceration and ophthalmology.
  • the coating is considered biorepulsive, that is, few cells bind and proliferate.
  • biorepulsive that is, few cells bind and proliferate.
  • Other techniques for producing pNlPAm coatings describe similar correlations between thickness and cell adhesion and therefore the vast majority of successful cell detachment technologies through pNlPAm use technologically and economically expensive methods for the formation of ultra-thin films. Therefore, there is still a need to develop alternatives for the gentle detachment of cells and cell layers.
  • polymeric materials with double network structure are known in the state of the art. These can be described as interpenetrated polymer networks (IPNs) in which the two independent networks have a highly asymmetric cross-linking, that is, one network is much more cross-linked than the other.
  • IPNs interpenetrated polymer networks
  • the first RD was described by Gong et al and consists of a first highly cross-linked ionic network of poly-2-acrylamido-2-methylpropanesulfonic acid (PAMPS) and a second, slightly cross-linked neutral network of soluble polyacrylamide polymer ( PAAm), in which the overall molar ratio of monomers (AMPS / AA) varies between 1 and 0.05.
  • PAMPS poly-2-acrylamido-2-methylpropanesulfonic acid
  • PAAm slightly cross-linked neutral network of soluble polyacrylamide polymer
  • the first network has a 4% molar crosslinker, while the second network contains only 0.1% crosslinker.
  • double networks have, at high swelling values, mechanical properties superior to those corresponding to their simple networks. So far, these double networks are prepared in two steps to obtain the first and second networks, respectively.
  • a single asymmetric crosslinker with homology to M1 and M2 would give rise to a multicomponent network with a structure that tends to cored; while a mixture of two crosslinkers, the first one with homology towards M1 and the second with homology towards M2, would give rise to a multicomponent network with a structure that tends to an IPN.
  • HEMA 2-hydroxyethyl methacrylate
  • AA acrylamide
  • crosslinking agents including a mixture of ethylene glycol dimethacrylate (EGDMA) and bisacrylamide (BIS), being EGDMA homologous to HEMA and BIS homologous to AA; or acrylamide ethylene methacrylate (METAA), an asymmetric compound that simultaneously comprises acrylamide and methacrylate functionality.
  • EGDMA ethylene glycol dimethacrylate
  • BIS bisacrylamide
  • METAA acrylamide ethylene methacrylate
  • the present invention provides a hydrogel with crosslinked multicomponent polymeric network structure, preferably which tends to a double network structure (RD), characterized in that it comprises:
  • crosslinker (s) units derived from at least one crosslinker; provided that the crosslinker (s) are:
  • the present invention relates to a process for obtaining the hydrogel as described in this patent application, wherein said process comprises contacting the monomers (A) and (V) with the crosslinkers E1 and E2, or the E3 crosslinker, under conditions of radical polymerization.
  • the formation of the hydrogel with crosslinked multicomponent polymeric network structure of the present invention preferably tending to a double network structure, hydrogel based on vinyl pyrrolidone and with improved mechanical properties at high swelling with respect to the monocomponent hydrogel of only vinyl pyrrolidone, it can be obtained in a single polymerization stage due to the great difference in reactivity between (A) and (V), since vinyl pyrrolidone is a monomer with very low reactivity in radical polymerization, compared to other alkylene monomers such as, for example , acrylic or styrenic monomers.
  • the present invention relates to the hydrogel as described in the first aspect of the present invention, preferably when (A) is an anionic acrylic monomer, in biological, biomedical or biotechnological applications that require a non-toxic hydrogel interaction -cell. Preferably, in tissue engineering or regenerative medicine.
  • the hydrogel as described in this patent application can be used in cell culture.
  • the hydrogel as described in this patent application can be used in transplanting cell monolayers grown on said hydrogel to the desired locations.
  • Hydrogels with crosslinked multicomponent polymeric network structure of the present invention preferably with a structure that tends to a double network, are capable of harboring cells until confluence, although the most surprising aspect of this invention is that cell layers can be rapidly detached. , preferably in seconds, by simple mechanical agitation.
  • the cell layers can be transplanted simply by growing the cells in the hydrogel until the desired confluence level has been reached, followed by flipping it over the desired transplant surface. After an appropriate time to allow the cells to bind to the new support, the hydrogel can be removed and the cell layer remains at the site of transplantation.
  • the hydrogels of the present invention have advantages over pNlPAm-based hydrogels.
  • the hydrogel preparation of the present invention a Through the process comprising a single stage of polymerization it is simple and inexpensive when compared to the complicated and laborious grafting techniques.
  • cell growth on these hydrogels results in the formation of cell monolayers, without the need to consider aspects such as the thickness of the membranes where cell cultures are performed.
  • the fact that the substrates are not bound to any support allows an easy manipulation of the hydrogels such as their transport to the chosen transplant site.
  • the cells are transplanted directly from the hydrogel to the transplant site, there is no need to develop or employ a 'superstratum' to prevent bending the layer on itself.
  • the cells are detached by gentle agitation, there is no need to apply a reduction in temperature to start peeling.
  • the present invention provides a hydrogel with cross-linked multicomponent polymeric network structure, characterized in that it comprises:
  • crosslinker (s) units derived from at least one crosslinker; provided that the crosslinker (s) are:
  • component is used to define any of the two families of polymer chains that are formed in the binary copolymerization of two monomers with high differential reactivity such as (A) and (V): a family of chains rich in (A ) and the family of rich chains in (V).
  • a differential reactivity of (A) and (V) sufficiently high in the copolymerization gives rise to two main types of polymer chain families or two types of components .
  • the invention requires that the reactivity ratio of (A) be greater than or equal to 0.5 and that the reactivity ratio of ( V) is less than or equal to 0.5, that is, r A ⁇ 0.5 and r v ⁇ 0.5.
  • the first family of chains or the first component mostly comprises units derived from monomer (A) and is formed at the beginning of the polymerization reaction; while the second family of chains or the second component mostly comprises units derived from monomer (V), preferably it is basically composed of vinyl pyrrolidone, and is formed once (A) has been consumed in the reaction medium.
  • V monomer
  • nyr 2 reactivity ratios applied to a binary radical copolymerization of two monomers 1 and 2 described compositionally by the terminal model, are the parameters that define the reactivity of the different species during polymerization.
  • a reactivity ratio greater than or less than 1 means that a growing chain ending in 1, -Mi, is more reactive towards monomer 1 or towards monomer 2 respectively.
  • the term "homology" is to be understood as referring to the crosslinker comprising polymerizable functional groups, in particular double bonds, with reactivity comparable to the monomers (A) and / or (V) in the radical copolymerization reactions described in this invention.
  • Reactivity homology is generally associated with the existence of structural homology, that is, with the presence of functional groups close to the equivalent polymerizable double bond in reactivity during monomer and crosslinking copolymerization.
  • crosslinkers comprising vinyl groups in which the double bond is attached to an oxygen or nitrogen, such as vinyl ethers, vinyl esters such as the vinyl group of vinyl methacrylate, vinylamines or vinylamides such as vinyl pyrrolidone derivatives, show homology of reactivity towards vinylpyrrolidone itself (V); while crosslinkers comprising alkyl methacrylate groups have reactivity homology with respect to anionic acrylic monomers (A) such as, for example, alkali metal salts of methacrylate alkyl sulphonate.
  • A anionic acrylic monomers
  • partial homology applied to a crosslinker refers to the fact that at least one of the crosslinkable polymerizable groups exhibits homology as defined in the previous paragraph.
  • the expression ⁇ 1 has at least partial homology with respect to (A) "is to be understood in the sense that the crosslinker E1 is a compound with at least two polymezable double bonds, of which at least one has reactivity in radical copolymerization with (V) comparable to the anionic or anionizable alkylene monomer (A).
  • (V) and one of the polymezable groups of the E1 crosslinker have, in binary radical copolymerization, maximum and minimum reactivity ratios of 0.5 respectively, r v ⁇ 0.5, r E ⁇ 0.5
  • the expression ⁇ 2 has at least partial homology with respect to (V) "is to be understood in the sense that the E2 crosslinker is a compound with at least two polymezable double bonds, of which at least one has reactivity in radical copolymerization with (A) comparable to vinyl pyrrolidone (V).
  • one of the polymezable groups of the crosslinker E2 and (A) have, in binary radical copolymerization, maximum and minimum reactivity ratios of 0.5 respectively, r E 2 ⁇ 0.5, r A ⁇ 0.5.
  • the expression ⁇ 3 presents homology with respect to (A) and (V) "is to be understood in the sense that the E3 crosslinker is a compound with at least two polymezable double bonds, where at least one of them exhibits comparable radical polymerization reactivity to (A) and at least another of them has reactivity in radical polymerization comparable to (V).
  • the present invention relates to the hydrogel with crosslinked multicomponent polymeric network structure, where (A) is selected from the group consisting of acrylic monomer and styrenic monomer, in both cases comprising at least one anionic or anionizable group.
  • acrylic is used to encompass the family of monomers whose polymerizable double bond is a methacrylate, acrylate, methacrylamide or acrylamide.
  • (A) is an anionic or anionizable acrylic monomer comprising at least one d-do alkyl chain that can be linear or branched.
  • the crosslinked multicomponent polymeric network structure hydrogel as described in this patent application comprises units derived from monomer (A) where the anionic or anionizable group is sulphonate or an anionizable sulfonic group.
  • the sulfonate group can be found in the hydrogel in the form of an alkaline or ammonium salt; or in the form of sulfonic acid.
  • alkaline salts sodium or potassium salt is especially preferred.
  • the hydrogel of the present invention comprises units derived from (A), where (A) is an acrylic sulfonate comprising at least one linear or branched dC-io alkyl chain.
  • (A) is an acrylic sulfonate comprising at least one linear or branched dC-io alkyl chain.
  • the crosslinked multicomponent polymeric network structure hydrogel of the present invention comprises units derived from (A), where (A) is an alkaline or ammonium salt of d-do alkylsulfonate methacrylate, where the alkyl can be linear or branched.
  • a sodium, potassium or ammonium salt of propylsulfonate methacrylate Preferably, a sodium, potassium or ammonium salt of propylsulfonate methacrylate.
  • hydrogels comprising crosslinker units E3 have worse mechanical properties than those obtained using the mixture of crosslinkers E1 and E2.
  • poorly manageable hydrogels are obtained that break in the jaws before starting the elongation test.
  • the crosslinked multicomponent polymeric network structure hydrogel as defined in this patent application comprises units derived from vinyl pyrrolidone (V), units derived from an anionic acrylic monomer (A), units derived from an E1 crosslinker with at least partial homology with respect to (A) and units derived from an E2 crosslinker with at least partial homology with respect to (V).
  • V vinyl pyrrolidone
  • A anionic acrylic monomer
  • E1 crosslinker with at least partial homology with respect to (A) units derived from an E2 crosslinker with at least partial homology with respect to (V).
  • (A) is described as indicated above in this patent application.
  • the crosslinked multicomponent polymeric network structure hydrogel as described in this patent application comprises units derived from E1, where this crosslinker is an oxy-, oxy-amino- or ermine-derived precursor. with two or more alcohols and / or primary or secondary amines in which at least two of said alcohols or amines have been derivatized to acrylics to form the E1 crosslinker.
  • crosslinker E1 is a compound with polymerizable groups of formula E1
  • z1 has a value between 2 and 5, preferably between 2 and 4;
  • each R 2 is independently selected from the group consisting of H and CH 3 ;
  • Ri is selected from the group consisting of:
  • the alkyl group present in any one of the definitions of Ri as described in this patent application may comprise one or more heteroatoms.
  • it may comprise one or more hydroxyl groups and / or one or more alkyl ethers.
  • chain end oxy group is understood as an oxygen atom (-0-) which in the crosslinker E1 is attached to the polymerizable group forming the acrylic functionality.
  • chain end amino group means an amino group of the formula -NR-, where R is selected from the group consisting of hydrogen and linear, branched C 1 -C 2 0 alkyl cyclic, which in the crosslinker of formula E1 is attached to the polymerizable group forming the acrylic functionality.
  • the oxygen atom (-0-) corresponding to the last ethoxy or propoxy unit corresponds to the chain end oxy group which is bound to the polymerizable group forming the acrylic functionality of the crosslinker of formula E1.
  • the oxyalkyl of option a) is selected from the group consisting of:
  • R 3 is a linear, branched or cyclic C1-C20 alkyl group
  • Oxy derivative selected from the group consisting of glycerol, tnmethylolpropane, neopentyl glycol, pentaehtrol, thglycerol, di (trimethylolpropane) and di (pentaerythrol).
  • the amino-oxy-alkyl of option b) has a structure -0- R4-NH-, where R 4 is a linear, branched or cyclic C1-C20 alkyl group.
  • the amino-alkyl of option c) has a structure -HN-R5-NH-, where R 5 is a linear, branched or cyclic C1-C20 alkyl group.
  • the amino-alkyl of option d) is a piperazine or a hexahydrotriazine.
  • the group R 3 , R 4 or R 5 is a linear or branched C1-C6 alkyl.
  • the E1 crosslinker may comprise more than two acrylic functionalities such as, for example, acrylic derivatives of glycerol, tnmethylolpropane or pentaerythrol.
  • the hydrogel of the present invention comprises units derived from crosslinker E1 as described, this being a symmetric compound.
  • E1 is selected from the group consisting of ethylene glycol dimethachlate and bisachlamide.
  • the hydrogel with interconnected interconnected polymer network structure as described in this patent application comprises units derived from E2, where the polymerizable groups of E2 have homology with (V), as is the case with vinyl ethers, vinylamines, vinylamides or vinylesters, so that the ratios of binary radical copolymerization of any of the polymerizable groups of E2 and (A) have maximum and minimum values of 0.5 respectively, r E 2 ⁇ 0.5, r A ⁇ 0.5 .
  • the E2 crosslinker is an oxy-, oxy-amino-, carboxy- or ermine-derived from a precursor with two or more alcohols, one or more alcohols and one or more primary or secondary amines, two or more acids, or two or more primary or secondary amines; wherein at least two of said alcohols, at least one alcohol and one amine, at least two acids, or at least two amines have been derivatized to vinyl to form the E2 crosslinker.
  • E2 has structure E2a or E2b, with E2a being a compound of the formula:
  • z4 has a value between 2 and 5, preferably between 2 and 4;
  • R 6 is selected from the group consisting of:
  • the alkyl group present in any one of the preferred definitions of R 6 as described in this patent application may comprise one or more heteroatoms.
  • it may comprise one or more hydroxyl groups and / or one or more alkyl ethers.
  • chain end oxy group means an oxygen atom (-0-) which in the crosslinker of formula E2a is attached to one of the vinyl groups.
  • chain end amino group means an amino group of formula -NR- where R is selected from the group consisting of hydrogen and linear, branched or cyclic C1-C20 alkyl, which in The crosslinker of formula E2a is linked to one of the vinyl groups.
  • carboxy chain end group means a carboxyl group (-COO-) which in the crosslinker of formula E2a is linked to one of the vinyl groups through an oxy link (-0-) .
  • R 6 is an oxyalkyl selected from the group consisting of: a1) -0- [CH 2 -CH2-0] z5-CH2-CH 2 -0-, where z5 is a value between 1 and 20, more preferably between 1 and 5;
  • R 7 is a linear, branched or cyclic C1-C20 alkyl group.
  • R 6 is a carboxy-alkyl of structure -OOC-R9-COO-, where R 9 is a linear, branched or cyclic C1-C20 alkyl group. More preferably, the group R 7 , R 8 or R 9 is a linear or branched C1-C6 alkyl.
  • R-io is selected from the group consisting of:
  • R11-O-R12 where R-n and R12 are independently linear or branched C1-C20 aliphatic alkyl. More preferably, the R-io, Rn or R12 group is a linear or branched C1-C6 alkyl.
  • E2 is a compound of formula (E2b) selected from the group consisting of 3,3'-propyl di-pyrrolidone and 3,3'-oxidiethyl-di-vinyl pyrrolidone.
  • the hydrogel as described in this patent application comprises a larger number of units derived from the crosslinker E1 than from the crosslinker E2.
  • the polymerization of (A) and (V) in the presence of a high percentage of the E1 crosslinker with the least partial homology with respect to the monomer (A) and a small amount of the crosslinker E2 with at least partial homology with respect to the monomer (V) results in the formation of a structure formed by a first component that mainly comprises units derived from the monomer (A) and highly crosslinked by means of the crosslinker E1, and a second component comprising mostly units derived from monomer (V) slightly crosslinked by means of crosslinker E2, both formed in a single step polymerization; that is, it results in the formation of a structure that tends to a double network.
  • An illustration of this reaction is shown in Figure 1.
  • the crosslinked multicomponent polymeric network structure hydrogel as described in this patent application comprises units derived from E3, wherein:
  • At least one of the polymerizable groups of E3 has homology with (V), such as the vinyl group of vinyl methacrylate or the vinyl amides of the derivatives of (V), so that the binary radical copolymerization reactivity ratios of one of those groups polymerizable from E3 and (A) have maximum and minimum values of 0.5 respectively, r E 3a ⁇ 0.5, r A ⁇ 0.5; Y
  • At least one of E3 polymerizable groups has homology with
  • (A) such as acrylic groups, so that the binary radical copolymerization reactivity ratios of one of those polymerizable groups of E3 and (V) have minimum and maximum values of 0.5 respectively, r v ⁇ 0.5, r E3b ⁇ 0.5.
  • E3 is selected from the group consisting of vinyl methacrylate and a compound of the formula:
  • Xi is selected from the group consisting of O and NH;
  • R-I4 is selected from the group consisting of H and CH 3 ;
  • R-I 3 is linear or branched d-do alkyl.
  • E3 ' is 3-ethyl vinyl pyrrolidone methacrylate.
  • the polymerization of (A) and (V) in the presence of E3 results in the formation of a structure formed by a two components that mainly comprise units derived from monomer (A) and units derived from monomer (V), respectively, crosslinked by crosslinking medium E3; both formed in a single step polymerization and with a structure that tends to a co-network.
  • the present invention provides a hydrogel that combines the improved mechanical properties under high swelling conditions of the two component structure, which preferably tends to a double network structure, with the biocompatibility of polyvinylpyrrolidone, a polymer used in a wide variety of biomedical applications. and whose use is approved in food and medicine by the FDA.
  • the present invention also provides a process for obtaining the hydrogel as defined in this patent application, wherein said process comprises contacting the monomers (A) and (V) with the crosslinkers E1 and E2, or the E3 crosslinker, under conditions of radical polymerization.
  • said process comprises contacting the monomers (A) and (V) with the crosslinkers E1 and E2, or the E3 crosslinker, under conditions of radical polymerization.
  • both monomers (A) and (V), and crosslinkers E1, E2 or E3 have the meaning indicated in the first aspect of the present invention.
  • (A) be an anionic or anionizable acrylic monomer. More preferably, an alkali or ammonium salt of Ci-do-alkylsulfonate of methacrylate.
  • the process for obtaining the hydrogel of the present invention can be carried out in the presence of at least one solvent, preferably in aqueous medium.
  • solvents are polar solvents capable of dissolving salts such as dimethylsulfoxide, dimethylformamide, dimethylacetamide or alcohols such as methanol, ethanol, isopropanol. More preferably, ethanol or dimethylsulfoxide due to its lower toxicity.
  • the process for obtaining the hydrogel with crosslinked multicomponent polymeric network structure described in this patent application takes place in water, where the initial concentration of anionic or anionizable alkylene monomer (A), in moles per liter of The total mixture is in the range 0.01 mol / L ⁇ [A] ⁇ 5 mol / L. More preferably in the range 0.5 mol / L ⁇ [A] ⁇ 1 mol / L.
  • the process of the present invention comprises adding an initial amount of anionic or anionizable alkylene monomer (A) and vinyl pyrrolidone (V) to the polymerization medium such that the molar ratio between them is 0.001 ⁇ [A] / [V ] ⁇ 2.
  • the process for obtaining the hydrogel as described in this patent application comprises adding to the polymerization medium an initial amount of E1 crosslinker between 0.1-100 mole% with respect to the initial amount of monomer (A); and an initial amount of E2 crosslinker between 0.001 -10 mole% with respect to the initial amount of vinyl pyrrolidone.
  • E1 crosslinker between 0.1-100 mole% with respect to the initial amount of monomer (A)
  • E2 crosslinker between 0.001 -10 mole% with respect to the initial amount of vinyl pyrrolidone.
  • the process for obtaining the hydrogel with crosslinked multicomponent polymeric network structure of the present invention comprises adding to the polymerization medium an initial amount of anionic or anionizable alkylene monomer (A), vinyl pyrrolidone (V) and crosslinkers E1 and E2 such that the molar relationship between them is:
  • (A) be an alkali metal salt of d- of alkylsulfonate
  • E1 is ethylene glycol dimethacrylate or bisacrylamide
  • E2 a compound of structure E2b as defined above.
  • the process for obtaining the hydrogel as described in this patent application comprises adding to the polymerization medium an initial amount of E3 crosslinker between 0.1-100 mole% with respect to the initial amount of monomer (A) .
  • E3 crosslinker between 0.1-100 mole% with respect to the initial amount of monomer (A) .
  • These quantities can also be expressed by the following molar ratio: 1 ⁇ [A] / [E3] ⁇ 1000. More preferably 5 ⁇ [A] / [E3] ⁇ 100.
  • the process for obtaining the hydrogel with the structure of interconnected interconnected polymer networks of the present invention comprises adding to the polymerization medium an initial amount of anionic or anionizable alkylene monomer (A), vinyl pyrrolidone (V) and E3 crosslinker such that the molar relationship between them is:
  • hydrogels of the present invention can be prepared by the process as described in this patent application using any conventional radical polymerization technique, for example, by photopolymerization, thermal initiation, or redox initiation.
  • the process for obtaining the hydrogel as defined in this patent application comprises contacting the monomers (A) and (V) with the crosslinkers E1 and E2, or the crosslinker E3, under photopolymerization conditions, where the polymerization takes place in the presence of a solvent, preferably water, since the monomer (A) is generally not soluble in vinyl pyrrolidone.
  • the cross-linked multicomponent polymer network structure Once the cross-linked multicomponent polymer network structure has been obtained, it can be swollen in water and washed to remove any unreacted residue or residue.
  • the present invention also relates to the hydrogel with crosslinked multicomponent polymeric network structure, preferably with a double network structural tendency, as described in the first aspect of the present invention, obtained by the process in a single polymerization stage such as described in the second aspect of the present invention.
  • the ratio of (A), (V), and the crosslinkers E1 and E2, or crosslinker E3 are those indicated in the second aspect of the present invention.
  • the present invention relates to a product comprising the hydrogel as described in this patent application, preferably where (A) is an alkaline salt of d-do alkylsulfonate methacrylate, E1 is ethylene glycololdimethacrylate or bisacrylamide and E2 a compound of structure E2b as defined above.
  • this product is selected from the group consisting of a cell culture platform, a cell culture kit, a dressing to protect wounds and a controlled release medicament.
  • the present invention relates to the use of the hydrogel as described in the first aspect of the present invention, being especially preferably that (A) is an alkaline salt of dC-io alkylsulfonate methacrylate, E1 is ethylene glycol dimethyl acrylate or Bisacrylamide and E2 is a compound of structure E2b as defined above, in in vitro biological, biomedical or biotechnological applications that require a non-toxic hydrogel-cell interaction.
  • the present invention relates to the use of the crosslinked multi-component polymer network hydrogel as described in this patent application in tissue engineering or regenerative medicine.
  • tissue engineering or regenerative medicine Preferably, in those applications that require high cellular biocompatibility and / or high aqueous diffusion capacity of solutes.
  • the hydrogel of the present invention can be used in applications that require a barrier effect to prevent the penetration of unwanted cell types.
  • the hydrogel as described in this patent application can be used in cell culture in vitro.
  • the presence of the anionic group in the hydrogel of the present invention helps to improve its mechanical properties, while facilitating the detachment of the cells.
  • the present invention relates to the use of the hydrogel as described in the first aspect of the present invention, being especially preferably that (A) is an alkaline salt of d-do alkylsulfonate methacrylate, E1 is ethylene glycololdimethacrylate or bisacrylamide and E2 be a compound of structure E2b as defined above, to manufacture a product for use in biological, biomedical or biotechnological applications that require a non-toxic hydrogel-cell interaction.
  • the present invention relates to the use of the hydrogel as described in this patent application to manufacture a support for cell transplantation in vivo, preferably cell monolayers.
  • the present invention relates to the use of the hydrogel as described in this patent application to manufacture a product to act as a barrier system in the treatment of wounds. Preferably, to make a dressing for the treatment of wounds.
  • the hydrogel as described in this patent application can be used to make a drug controlled release drug for the treatment of a disease.
  • hydrogel is part of the present invention as described in the first aspect of the present invention, especially preferably (A) being an alkaline salt of d-do alkylsulfonate methacrylate, E1 be ethylene glycololdimethacrylate or bisacrylamide and E2 is a compound of structure E2b as defined above, for use in biological, biomedical or biotechnology applications that require a non-toxic hydrogel-cell interaction.
  • A being an alkaline salt of d-do alkylsulfonate methacrylate
  • E1 be ethylene glycololdimethacrylate or bisacrylamide
  • E2 is a compound of structure E2b as defined above, for use in biological, biomedical or biotechnology applications that require a non-toxic hydrogel-cell interaction.
  • the present invention relates to the hydrogel as described in this patent application as a support for cell transplantation in vivo. It also refers to a support comprising the hydrogel of the invention for cell transplantation in vivo. Preferably, for the transplantation of cell monolayers.
  • the present invention relates to the hydrogel as described in this patent application as a barrier system in the treatment of wounds. It also refers to a dressing comprising the hydrogel of the invention for the treatment of wounds.
  • the present invention relates to a drug controlled release drug comprising the hydrogel as described in this patent application, for the treatment of a disease.
  • a method of using the hydrogel as described in the first aspect of the present invention forms part of the present invention, being especially preferably that (A) is an alkali metal salt of dC-io alkyl sulfonate methacrylate, E1 is ethylene glycol dimethacrylate or bisacrylamide and E2 is a compound of structure E2b as defined above, in biological, biomedical or biotechnological applications that require a non-toxic hydrogel-cell interaction.
  • the present invention relates to a method for performing cell transplantation in vivo, preferably transplantation of cell monolayers, which comprises growing the cells in the hydrogel as described in this patent application.
  • the present invention relates to a method of protecting wounds comprising using the hydrogel as described in this patent application as a barrier system. Preferably, it comprises suspending the hydrogel in a dressing.
  • the present invention relates to a method of treating a disease comprising administering a drug controlled release drug comprising the hydrogel as described in this patent application.
  • Figure 1 Illustrative scheme of the formation of the cross-linked multicomponent polymeric network structure according to the method of the invention, where a molar ratio of E1 significantly greater than E2 is used.
  • Figure 2 Micrographs show cell growth in a type 4 hydrogel at 24h (fig. 2A), 48h (fig. 2B) and 168h (fig. 2C) incubation, respectively. Initial adhesion and cell proliferation is initially delayed but after a few days of incubation the number of cells begins to grow in the hydrogels and after 168 h confluent growth is observed on the gels.
  • Figure 3 Metabolic assay AlamrBIue on the seventh day of cell culture on hydrogels.
  • Figure 4 Peel off cells from hydrogel type 2 (fig. 4A), hydrogel type 3 (fig. 4B), hydrogel type 4 (fig. 4C) and hydrogel type 5 (fig. 4D). A complete monolayer of cells was recovered in hydrogels 3, 4 and 5. In the case of hydrogel 2 in those who did not reach confluence recovered small cell agglomerates.
  • FIG. 5 The micrographs show the cells detached, disintegrated and reseeded in TCP from hydrogels 1 (fig. 5A), 2 (fig. 5B) and 4 (fig. 5C).
  • the cell monolayers were broken down by repeated pipetting and incubated 24 hours after being reseeded in TCP wells.
  • Figure 6 Images showing the monolayers transplanted in TCP wells after removing the hydrogel. (3 upper images; fig. 6A hydrogel Type 1; fig. 6B hydrogel Type 3 and fig. 6C hydrogel Type 4). The cells detach from the hydrogels and pass to the lower plastic wells assuming a morphology that is typical of this type of cells when they are attached to a support. After 24h re-incubation the cells continue to proliferate (3 central images; fig. 6D hydrogel Type 1; fig. 6E hydrogel Type 3 and fig. 6F hydrogel Type 4) and still grow more after 48h (3 lower images; fig. 6G Hydrogel Type 1; Fig. 6H Hydrogel Type 3 and Fig. 61 Hydrogel Type 4).
  • Potassium sulfopropyl methacrylate (M; monomer type A), vinyl pyrrolidone (V), ethylene glycol dimethacrylate (C1, crosslinker type E1), 1-hydroxycyclohexylphenyl ketone (HCPK) and azobisisobutyronitrile (AIBN) were purchased from Sigma.
  • the monomer (V) was distilled before being used and stored at 4 ° C.
  • AIBN was recrystallized from ethanol and stored at 4 ° C.
  • the divinyl compound C2 (crosslinking type E2) shown in scheme 1, which is a derivative of (V), was synthesized in our laboratory of according to [Tardajos, MG; Nash, M .; Rochev, Y .; Reinecke, H .; Elvira, C; Gallardo, A. Macromolecular Chemistry and Physics 2012, 213, 529].
  • C2C12- GMP were supplied by ATTC, fetal bovine serum was purchased from GIBCO UK, and Penicillin-Streptomycinen Lonza.
  • hydrogels with different initial molar ratios M / V and M / C1 have been prepared (see Table 1). All hydrogels were prepared using an initial concentration of M of 1 mol / L and 1 molar% of C2 with respect to V. The molar ratio V / C2 was always 1000.
  • the hydrogels were synthesized by conventional radical polymerization in a single stage. , using water as solvent. For this, an aqueous solution of V was prepared in appropriate concentration (between 1 and 7 mol / L) and C2 was added in a percentage of 0.1 molar relative to V. To this solution M was added according to the M / V ratio.
  • the hydrogels were recovered from the vials or molds and allowed to swell in water until equilibrium. Subsequently they were thoroughly washed with water to remove residues and material not attached to the network, and they were punched into cylinders.
  • the swollen cylinders were weighed and dried until constant heavy.
  • the water content in equilibrium (CAE) was defined as the amount of water in the equilibrium state per gram of dry hydrogel (equation 1).
  • Samples obtained by thermal initiation The mechanical properties were analyzed in a universal Instron model 3366 in compression mode using cylinders 5mm high and 4.3mm in diameter, determining the maximum resistance to fracture (or max ) and compression to breakage ( £ ma ).
  • the elastic modulus was calculated as the slope of the compression-deformation curve in the linear range.
  • the photopolymerization samples were studied by elongation. Samples 10mm long and 5mm wide were elongated at a constant speed (5mm / min) until the fracture determining the tensile strength (or max ) and the elongation at break (£ max) .
  • the Young's modulus (E) was determined from the tension-elongation curve in the linear range.
  • Table 1 summarizes the properties of the samples selected for the cell culture study.
  • the mechanical stability of the samples was high, the samples can be easily handled despite swelling in water approximately up to 1000% (10 g water / g polymer).
  • the C2C12 mouse myoblastic cell line that constitutively expressed the gene encoding the green fluorescent protein (GFP), previously inserted into the cell genome by infection with lentivirus, has been used as a model.
  • the cells were grown in DMEM with high glucose content, supplemented with 10% Fetal Bovine Serum plus 1% antibiotics (Penicillin / Streptomycin). The cells were grown at 37 ° C in a humid atmosphere with 5% CO2 and for their maintenance cell passes were made to reach 80% confluence.
  • Hydrogel samples were cut in the form of cylinders (16.26 mm in diameter) that covered the bottom of the well of a 24-well plate and were sterilized by exposure to UV light for 90 minutes. Each sterile hydrogel was washed 3 times in PBS and placed in a well of a 24-well plastic plate without pre-treatment for cell adhesion and then, washed 3 times with culture medium (DMEM) prior to seeding. the cells. 20,000 cells were seeded per sample, using in the experiment 12 replicates for each type of hydrogel. Later, 800 ⁇ of complete and tempered medium was added to each well, and the samples were incubated at 37 ° C with 5% CO2. The samples were observed after 24, 48, 72, 96, 120, 144 and 168 hours, using an Olympus Bx51 microscope to take the images with fluorescence.
  • DMEM culture medium
  • the hydrogels were removed from their wells with tweezers, and placed in a new well of a P6 with pre-treated plastic, leaving the monolayer in contact with the surface of the well so that the hydrogels behave as a substrate for transplantation, followed by incubation to allow the cells to adhere to the new surface. After incubation, the hydrogels were removed and discarded, and the cell monolayers were observed and photographed using the fluorescence microscope. These transplants were incubated for a further 48 hours in order to observe cell growth. Finally, the transplanted cell monolayers were trypsinized and reseeded to analyze if the cells detached from the hydrogels had been affected after growing on them for a week.
  • the separated cells were reseeded in TCP and incubated overnight to determine if detached cells retained their viability and bound and grew on plastic control wells similar to detached cells by traditional methods. In all cases, the cells grew in TCP and showed a typical morphology for this type of cell line, which is dependent on adhesion (Figure 5).

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Abstract

Hidrogel con estructura de red polimérica multicomponente entrecruzada, caracterizado porque comprende: a) unidades derivadas de vinilpirrolidona (V) y unidades derivadas de un monómero alquénico aniónico o anionizable (A), donde las relaciones de reactividad en copolimerización radical binaria de (V) y (A) tienen valores máximo y mínimo de 0.5 respectivamente; y b) unidades derivadas de al menos un entrecruzante; siempre que el ó los entrecruzantes sean i) dos entrecruzantes E1 y E2, donde E1 presenta homología al menos parcial respecto a (A) y E2 presenta homología al menos parcial respecto a (V); ó ii) un entrecruzante E3 que presenta homología respecto a (A) y (V). Procedimiento de obtención del mencionado hidrogel que comprende poner en contacto los monómeros (A) y (V) con los entrecruzantes E1 y E2, o el entrecruzante E3, en condiciones de polimerización radicalaria. Uso del hidrogel en aplicaciones biológicas, biomédicas o biotecnológicas que requieran una interacción no tóxica hidrogel-célula.

Description

DESCRIPCIÓN
HIDROGELES MULTICOMPONENTES BASADOS EN VINILPIRROLIDONA Y SU APLICACIÓN EN INGENIERÍA DE TEJIDOS Y/O MEDICINA REGENERATIVA
SECTOR TÉCNICO
La presente invención se refiere a un hidrogel con estructura de red polimérica multicomponente entrecruzada que comprende vinilpirrolidona, un monómero alquénico aniónico o anionizable, preferiblemente un monómero acrílico aniónico, y uno o más entrecruzantes. También se refiere a un procedimiento de obtención del hidrogel donde la red multicomponente se forma en una única etapa de polimerización. Adicionalmente, la presente invención también se refiere al uso del hidrogel en ingeniería de tejidos y/o medicina regenerativa, preferiblemente en cultivo celular y transplante de monocapas celulares.
ESTADO DE LA TÉCNICA Las metodologías tradicionales usadas para el despegado celular implican el uso casi genérico de enzimas proteolíticas agresivas, siendo la más común la tripsina, o métodos de raspado celular. Ambas aproximaciones pueden ser perjudiciales para las células recolectadas. Hay estudios que muestran que el daño causado está asociado a la disrupción de la membrana celular que puede originar una cascada de fallos en la funcionalidad celular. Por ejemplo, se ha descrito que el despegado proteolítico causa alteraciones en la expresión proteómica, concretamente con una mayor expresión de proteínas relacionadas con la apoptosis y una menor expresión de proteínas relacionadas con el metabolismo y el crecimiento. El despegado mecánico de células causa pérdida de DNA intracelular, da lugar a un bajo número de células y además son células con una matriz de tipo cristalina rodeando las células recuperadas, lo cual es indicativo de fuga intracelular debido a la ruptura de la membrana. [Nash, M. E.; Carroll, W. ; Healy, D.; Elvira, C; Rochev, Y. Journal of Materials Chemistry 2012, 22, 19376]. Esta disrupción celular constituye una deficiencia muy significativa en estas aproximaciones de desagregado celular, y por tanto existe una búsqueda de métodos alternativos de despegado celular más suaves. A principios de los 90 se desarrollaron plataformas termosensibles capaces de albergar células hasta confluencia y de despegarlas mediante un cambio de la temperatura. Esta aproximación de despegado celular representa un modo más suave y no destructivo de recolección de células que supera las limitaciones de las técnicas tradicionales.
El alto número de publicaciones de las últimas dos décadas dedicadas al desarrollo y optimización de este tipo de plataformas termosensibles habla de la importancia de este campo en biomedicina. La gran mayoría de estas publicaciones describen substratos tipo poli-N-isopropilacrilamida (pNlPAm), los cuales poseen de forma inherente un comportamiento termosensible en un rango fisiológicamente relevante. A temperaturas por encima de la LCST (lower critical solution temperature) los substratos de pNlPAm asumen un estado hidrofóbico colapsado que bajo ciertas condiciones dan lugar a adhesión y proliferación celular. Algunas de estas condiciones pueden ser bastante estrictas como, por ejemplo, el espesor del sustrato que debe ser muy pequeño. Una vez que el crecimiento celular ha alcanzado el nivel deseado de confluencia, una capa de células puede ser despegada mediante un simple descenso de temperatura por debajo de la LCST. Este descenso convierte el pNlPAm en hidrofílico de forma que la capa polimérica se expande repeliendo la capa celular. Tras este proceso se recolecta la capa celular. La manipulación exitosa de la capa celular requiere el desarrollo de un 'superstrato' celular, es decir, una membrana superior plana, que se usa para facilitar el recolectado de la capa celular evitando que se doble sobre sí misma e impidiendo su contracción. [Nash, M. E.; Carroll, W.; Healy, D.; Elvira, C; Rochev, Y. Journal of Materials Chemistry 2012, 22, 19376]. Las ventajas de despegar células de esta manera, desde un punto de vista biomédico, son fundamentalmente tres. En primer lugar, se ha observado que las células recolectadas de substratos termosensibles mediante modulación térmica retienen su funcionalidad específica y su metabolismo, además no sufren los daños asociados con las técnicas de despegado tradicionales. En segundo lugar, mientras que los métodos clásicos de despegado rinden células individuales o pequeños grupos de células ya que se rompen o separan físicamente las uniones célula-célula, célula-substrato o célula-ECM (proteínas de la matriz extracelular), los despegados obtenidos usando superficies termosensibles solo afectan a las uniones célula-substrato, manteniendo las uniones célula-célula y célula-ECM. Es por tanto posible despegar una capa celular completa junto al ECM asociado. Las capas de células recolectadas pueden así ser usadas en aplicaciones de ingeniería de tejidos tales como el la reparación de tejido dañado o en la preparación de constructos biomédicos 2D o 3D. Por poner unos pocos ejemplos, esta aproximación de ingeniería de capas celulares ha resultado en la recolección de capas celulares compuestas de células epiteliales de la mucosa oral, epiteliales de la córnea, queratinocitos epidérmicos, mioblastos del tejido esquelético o miocardiocitos. Además, capas celulares se han superpuesto para conseguir sistemas 3D similares a tejidos, usando una o más tipos de células y manteniendo su integridad fisiológica y morfológica. [Nagase, K.; Kobayashi, J.; Okano, T. The Royal Society Society, Interface 2009, 3, 293]. Las capas celulares obtenidas de este modo se han propuesto para muchas aplicaciones clínicas, como miocardiopatía dilatada, cirugía plástica reconstructiva y regenerativa, ulceración del esófago y oftalmología. El trasplante de capas celulares autólogas recolectadas de pNlPAm a pacientes humanos ha sido descrito recientemente. Estas terapias de capas celulares se han usado en el trasplante de capas celulares epiteliales de mucosa oral a córneas para evitar la opacificación corneal del paciente y mantener transparencia de la córnea, así como en el trasplante de capas celulares de mioblastos autólogos en multicapas para tratar miocardiopatía dilatada en un paciente, enfermedad coronaria habitual. En el primer estudio el trasplante sin sutura se restableció la transparencia óptica en los 4 pacientes tratados y en el segundo se mejoró significativamente la función cardiaca del paciente. Ya que esta aproximación empleó células autólogas se evitaron los problemas de rechazo inmunológico presentes en otras terapias alternativas. Es importante resaltar que se deben realizar otros ensayos clínicos antes de que estas terapias puedan ser ampliamente adoptadas. [Kobayashi, J.; Okano, T. Science and Technology of Advanced Materials 2010, 11, 1 . Sawa, Y.; Miyagawa, S.; Sakaguchi, T.; Fujita, T.; Matsuyama, A.; Saito, A.; Shimizu, T.; Okano, T. Surgery Today 2012]. Por último, los requisitos clínicos en ingeniería de tejidos han sufrido un desplazamiento colectivo hacia la adopción de prácticas en cultivo celular que eviten el uso de productos derivados de animales tales como tripsina debido al riesgo asociado con la exposición involuntaria a patógenos inesperados presentes en la fuente animal. Por tanto, un despegado de células que no use productos derivados de animales cumpliría los requerimientos de segundad en aquellos cultivos celulares en los que las células van a ser usadas en aplicaciones clínicas/terapéuticas.
El hecho de que tales substratos estén ahora disponibles en el mercado a nivel mundial apoya los esfuerzos dedicados al desarrollo de este tipo de plataformas, aunque el alto coste de los substratos disponibles comercialmente hace su uso prohibitivo como material de rutina en cultivo celular. [Nash, M. E.; Carroll, W.; Healy, D.; Elvira, C; Rochev, Y. Journal of Materials Chemistry 2012, 22, 19376]. Ya que los substratos puros de pNlPAm son pobres soportes celulares, se han desarrollado diversas técnicas para producir recubrimientos en base pNlPAm que propicien bioadhesión. Hay que destacar la polimerización mediante haz electrónico de NIPAm para formar una capa ultra- fina de pNlPAm que se ha descrito como apropiada para el crecimiento celular para un amplio rango de líneas celulares. Si el recubrimiento de pNlPAm supera los ~30nm de espesor el recubrimiento se considera biorepulsivo, es decir, pocas células se unen y proliferan. [Nagase, K.; Kobayashi, J.; Okano, T. The Royal Society Society, Interíace 2009, 3, 293. Kobayashi, J.; Okano, T. Science and Technology of Advanced Materials 2010, 11, 1 ]. Otras técnicas para producir recubrimientos de pNlPAm describen correlaciones similares entre el espesor y la adhesión celular y por tanto la gran mayoría de tecnologías exitosas de despegado celular a través de pNlPAm usan métodos tecnológicamente y económicamente costosos para la formación de filmes ultra-finos. Por ello, sigue existiendo la necesidad de desarrollar alternativas para el despegado suave de células y capas celulares.
Por otro lado, en el estado de la técnica se conocen materiales poliméricos con estructura de redes dobles (RD). Éstas pueden describirse como redes poliméricas interpenetradas (IPNs según sus siglas en inglés) en las que las dos redes independientes tienen un entrecruzamiento altamente asimétrico, es decir, una red está mucho más entrecruzada que la otra. La primera RD fue descrita por Gong et al y consiste en una primera red iónica altamente entrecruzada de poli-ácido 2-acrilam¡do-2-met¡lpropanosulfón¡co (PAMPS) y una segunda red neutra ligeramente entrecruzada del polímero soluble poliacrilamida (PAAm), en la que la relación molar global de monómeros (AMPS/AA) varía entre 1 y 0.05. En particular, la primera red presenta un 4 % molar de entrecruzante, mientras que la segunda red contiene únicamente un 0, 1 % de entrecruzante. [Gong, J. P.; Katsuyama, Y.; Kurokawa, T.; Osada, Y. Advanced Materials 2003, 15, 1 155].
Se ha descrito que las redes dobles presentan, a altos valores de hinchamiento, propiedades mecánicas superiores a las correspondientes a sus redes sencillas. Hasta el momento, estas redes dobles se preparan en dos pasos para obtener la primera y la segunda red, respectivamente.
Investigadores del mismo grupo que los inventores han descrito teóricamente que las propiedades topológicas de una red formada por dos monómeros M1 y M2 con alta reactividad diferencial, siendo M1 mucho más reactivo que M2, puede ser controlada por la naturaleza del entrecruzante utilizado. [Reinecke, H.; Gallardo, A. Macromolecular Theory and Simulations 2009, 18, 25]. Esta alta reactividad diferencial hace que se formen dos principales familias de cadenas, o dos tipos de componentes macromoleculares: un primer componente que comprende mayoritariamente unidades derivadas del monómero M1 y se forma al principio de la reacción de polimerización; mientras que el segundo componente comprende mayoritariamente unidades derivadas del monómero M2, y se forma una vez que M1 se ha consumido en el medio de reacción. En la formación de la red un único entrecruzante asimétrico con homología a M1 y M2 daría lugar a una red multicomponente con una estructura que tiende a una cored; mientras que una mezcla de dos entrecruzantes, el primero de ellos con homología hacia M1 y el segundo con homología hacia M2, daría lugar a una red multicomponente con una estructura que tiende a una IPN.
Investigadores pertenecientes al mismo grupo también han descrito la copolimerización radicalaria de 2-hidroxietilmetacrilato (HEMA) y acrilamida (AA) en presencia de varios agentes de entrecruzamiento, entre ellos, una mezcla de etilenglicoldimetacrilato (EGDMA) y bisacrilamida (BIS), siendo EGDMA homólogo a HEMA y BIS homólogo a AA; o acrilamidaetilenmetacrilato (METAA según sus siglas en inglés), compuesto asimétrico que comprende simultáneamente funcionalidad acrilamida y metacrilato. Los resultados obtenidos muestran que el hidrogel obtenido en presencia de METAA presenta un aumento significativo del modulo elástico, mientras que el uso de la mezcla EGDMA y BIS únicamente lo incrementa ligeramente. [Demirgóz D.; Navarro R.; Pérez M.; Reinecke H.: Gallardo A. Journal of Applied Polymer Science, 2009, 115, 896-900].
DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN
Breve descripción de la invención En un primer aspecto, la presente invención proporciona un hidrogel con estructura de red polimérica multicomponente entrecruzada, preferiblemente que tiende a una estructura de red doble (RD), caracterizado porque comprende:
a) unidades derivadas de vinilpirrolidona (V) y unidades derivadas de un monómero alquénico aniónico o anionizable (A), donde las relaciones de reactividad en copolimerización radical binaria de (V) y (A) tienen unos valores máximo y mínimo de 0.5 respectivamente, es decir, rv≤0.5, rA≥0.5; y
b) unidades derivadas de al menos un entrecruzante; siempre que el o los entrecruzantes sean:
i) dos entrecruzantes E1 y E2, donde E1 presenta homología al menos parcial respecto a (A) y E2 presenta homología al menos parcial respecto a (V); o
¡i) un entrecruzante E3 que presenta homología respecto a (A) y (V).
En un segundo aspecto, la presente invención se refiere a un procedimiento de obtención del hidrogel tal como se describe en esta solicitud de patente, donde dicho procedimiento comprende poner en contacto los monómeros (A) y (V) con los entrecruzantes E1 y E2, o el entrecruzante E3, en condiciones de polimerización radicalaria. De esta forma, la formación del hidrogel con estructura de red polimérica multicomponente entrecruzada de la presente invención, preferiblemente que tiende a una estructura de red doble, hidrogel basado en vinilpirrolidona y con propiedades mecánicas mejoradas a alto hinchamiento respecto al hidrogel monocomponente de solo vinilpirrolidona, se puede obtener en una única etapa de polimerización debido a la gran diferencia de reactividad entre (A) y (V), ya que la vinilpirrolidona es un monómero con muy baja reactividad en polimerización radicalaria, en comparación con otros monómeros alquénicos como, por ejemplo, monómeros acrílicos o estirénicos. El procedimiento en una sola etapa es muy simple: una polimerización radical convencional, que puede ser iniciada térmicamente, mediante iniciación redox o mediante irradiación UV. En un tercer aspecto, la presente invención se refiere al hidrogel tal como se describe en el primer aspecto de la presente invención, preferiblemente cuando (A) es un monómero acrílico aniónico, en aplicaciones biológicas, biomédicas o biotecnologías que requieran una interacción no tóxica hidrogel-célula. Preferiblemente, en ingeniería de tejidos o medicina regenerativa.
En una de las realizaciones preferidas, el hidrogel tal como se describe en esta solicitud de patente puede utilizarse en cultivo celular.
En otra de las realizaciones preferidas, el hidrogel tal como se describe en esta solicitud de patente puede utilizarse en transplante de monocapas celulares crecidas sobre dicho hidrogel a las localizaciones deseadas. Los hidrogeles con estructura de red polimérica multicomponente entrecruzada de la presente invención, preferiblemente con una estructura que tiende a una red doble, son capaces de albergar células hasta confluencia, aunque el aspecto más sorprendente de esta invención es que las capas celulares pueden ser despegadas rápidamente, preferiblemente en segundos, mediante simple agitación mecánica. Además, las capas celulares pueden ser trasplantadas simplemente mediante el crecimiento de las células en el hidrogel hasta que el nivel de confluencia deseado ha sido alcanzado, seguido por el volteo del mismo sobre la superficie de trasplante deseada. Después de un tiempo apropiado para permitir que las células se unan al nuevo soporte, el hidrogel se puede retirar y la capa celular permanece en el lugar de trasplante.
Los resultados descritos en esta solicitud de patente muestran que estos hidrogeles pueden utilizarse como alternativa a los sistemas termosensibles que se usan actualmente. Además de compartir las ventajas de los soportes tipo pNlPAm frente a los métodos de despegado tradicionales, los hidrogeles de la presente invención presentan ventajas sobre los hidrogeles basados en pNlPAm. En primer lugar, la preparación de hidrogel de la presente invención a través del procedimiento que comprende una única etapa de polimerización es simple y barata si se compara con las complicadas y laboriosas técnicas de injerto. Además, el crecimiento celular sobre estos hidrogeles da lugar a la formación de monocapas celulares, sin necesidad de considerar aspectos como el grosor de las membranas donde se realizan los cultivos celulares. En segundo lugar, el hecho de que los substratos no están ligados a ningún soporte, a diferencia de las superficies injertadas de pNlPAm, permite una fácil manipulación de los hidrogeles como por ejemplo su transporte al lugar de trasplante elegido. Además, ya que las células son trasplantadas directamente del hidrogel al lugar de trasplante, no hay necesidad de desarrollar o emplear un 'superstrato' para prevenir el doblado de la capa sobre sí misma. Finalmente, ya que las células se despegan mediante agitación suave, no hay necesidad de aplicar una reducción en la temperatura para iniciar el despegado.
Por otra parte, una vez separada la monocapa del hidrogel, la incubación posterior del hidrogel en medio de cultivo celular no produce señales detectables de ninguna actividad celular (Alamar Blue, MTS), lo cual nos indica que las células no han penetrado en el interior del hidrogel. Además, la observación al microscopio del hidrogel, aunque no permite una gran profundidad de campo, no detecta la presencia de ningún tipo celular. Por todo ello, estos hidrogeles tal y como se describen en esta solicitud de patente pueden utilizarse como sistemas barrera en aplicaciones in vivo. Descripción detallada de la invención
En un primer aspecto, la presente invención proporciona un hidrogel con estructura de red polimérica multicomponente entrecruzada, caracterizado porque comprende:
a) unidades derivadas de vinilpirrolidona (V) y unidades derivadas de un monómero alquénico aniónico o anionizable (A), donde las relaciones de reactividad en copolimerización radical binaria de (V) y (A) presentan valores máximo y mínimo de 0.5 respectivamente, es decir, rv≤0.5, rA≥0.5; y
b) unidades derivadas de al menos un entrecruzante; siempre que el o los entrecruzantes sean:
i) dos entrecruzantes E1 y E2, donde E1 presenta homología al menos parcial respecto a (A) y E2 presenta homología al menos parcial respecto a (V); o
¡i) un entrecruzante E3 que presenta homología respecto a (A) y (V). En esta solicitud de patente se entiende por "unidades derivadas de", la estructura química obtenida al someter a polimerización radicalaria el monómero o entrecruzante al que se esté haciendo referencia.
Adicionalmente, se usa el término "componente" para definir cualquiera de las dos familias de cadenas poliméricas que se forman en la copolimerización binaria de dos monómeros con alta reactividad diferencial como (A) y (V): una familia de cadenas ricas en (A) y la familia de cadenas ricas en (V).
Una reactividad diferencial de (A) y (V) suficientemente alta en la copolimerización, como la que se da por ejemplo cuando (A) es un monómero acrílico aniónico, da lugar a dos tipos principales de familias de cadenas poliméricas o dos tipos de componentes. En concreto, y usando el modelo terminal para descnbir composicionalmente la copolimerización radicalaria binaria de (A) y (V), la invención requiere que la relación de reactividad de (A) sea mayor o igual que 0.5 y que la relación de reactividad de (V) sea menor o igual que 0.5, es decir, rA≥0.5 y rv≤0.5. La primera familia de cadenas o el primer componente comprende mayoritariamente unidades derivadas del monómero (A) y se forma al principio de la reacción de polimerización; mientras que la segunda familia de cadenas o el segundo componente comprende mayoritariamente unidades derivadas del monómero (V), preferiblemente está compuesta básicamente por vinilpirrolidona, y se forma una vez que (A) se ha consumido en el medio de reacción. Después del entrecruzamiento, estas primera y segunda familias de cadenas, se convierten, respectivamente, en el primer y segundo componente de la estructura de red polimérica entrecruzada, con tendencia a estructura tipo red doble en el caso de usar mezcla de E1 y E2, o con tendencia a estructura tipo co-red si se usa E3.
Adicionalmente los términos "relaciones de reactividad n y r2", aplicados a una copolimerización radical binaria de dos monómeros 1 y 2 descrita composicionalmente por el modelo terminal, son los parámetros que definen la reactividad de las diferentes especies durante la polimerización. El modelo terminal es el modelo que considera que la reactividad del radical en crecimiento depende de la naturaleza de la unidad terminal. Estas relaciones de reactividad vienen dadas por = kn/k12 y r2 = k22/k21, donde k¡¡ (/j=1 ,2) es la constante cinética de la reacción de adición del monómero M¡ a una cadena en crecimiento acabada en i, ~M¡. Por ejemplo, una relación de reactividad mayor o menor que 1 , significa que una cadena en crecimiento acabada en 1 , -Mi, es más reactiva hacia el monómero 1 o hacia el monómero 2 respectivamente. [Gallardo, A.; Aguilar, M.R.; Abraham, G.A.; San Román, J. Chain Copolymerization Reactions. An Algorithm to Predict the Reaction Evolution with Conversión. J. Chem. Edu. 2004, 81 , 1210].
Adicionalmente, el término "homología" ha de entenderse que hace referencia a que el entrecruzante comprende grupos funcionales polimerizables, en particular dobles enlaces, con reactividad comparable a los monómeros (A) y/o (V) en las reacciones de copolimerización radicalaria descritas en esta invención. La homología de reactividad generalmente está asociada con la existencia de homología estructural, es decir, con la presencia de grupos funcionales cercanos al doble enlace polimerizable equivalentes en reactividad durante la copolimerización de monómero y entrecruzante. A modo de ejemplo, sin carácter limitante, entrecruzantes que comprenden grupos vinílicos en los que el doble enlace está unido a un oxígeno o nitrógeno, como por ejemplo viniléteres, vinilésteres como el grupo vinilo del vinilmetacrilato, vinilaminas o vinilamidas como los derivados de vinilpirrolidona, muestran homología de reactividad respecto a la propia vinilpirrolidona (V); mientras que entrecruzantes que comprenden grupos metacnlato de alquilo presentan homología de reactividad respecto monómeros acrílicos aniónicos (A) como, por ejemplo, sales alcalinas de alquilsulfonato de metacnlato.
Adicionalmente, el término "homología parcial" aplicado a un entrecruzante hace referencia a que al menos uno de los grupos polime zables del entrecruzante presenta homología tal como se ha definido en el párrafo anterior.
En particular, la expresión Έ1 presenta homología al menos parcial respecto a (A)" ha de entenderse en el sentido que el entrecruzante E1 es un compuesto con al menos dos dobles enlaces polimehzables, de los cuales al menos uno posee reactividad en copolimerización radicalaria con (V) comparable al monómero alquénico aniónico o anionizable (A). Preferiblemente, (V) y uno de los grupos polimehzables del entrecruzante E1 presentan, en copolimerización radical binaria, relaciones de reactividad máxima y mínima de 0.5 respectivamente, rv≤0.5, rEi≥0.5. De forma análoga, la expresión Έ2 presenta homología al menos parcial respecto a (V)" ha de entenderse en el sentido que el entrecruzante E2 es un compuesto con al menos dos dobles enlaces polimehzables, de los cuales al menos uno posee reactividad en copolimerización radicalaria con (A) comparable a la vinilpirrolidona (V). Preferiblemente, uno de los grupos polimehzables del entrecruzante E2 y (A) presentan, en copolimerización radical binaria, relaciones de reactividad máxima y mínima de 0.5 respectivamente, rE2≤0.5, rA≥0.5.
Adicionalmente, la expresión Έ3 presenta homología respecto a (A) y (V)" ha de entenderse en el sentido que el entrecruzante E3 es un compuesto con al menos dos dobles enlaces polimehzables, donde al menos uno de ellos presenta reactividad en polimerización radicalaria comparable a (A) y al menos otro de ellos presenta reactividad en polimerización radicalaria comparable a (V).
En una realización preferida, la presente invención se refiere al hidrogel con estructura de red polimérica multicomponente entrecruzada, donde (A) se selecciona del grupo que consiste en monómero acrílico y monómero estirénico, comprendiendo en ambos casos al menos un grupo aniónico o anionizable. En la presente invención se usa el término acrílico para englobar a la familia de monómeros cuyo doble enlace polimerizable es un metacrilato, acrilato, metacrilamida o acrilamida.
En una realización aún más preferida, (A) es un monómero acrílico aniónico o anionizable que comprende al menos una cadena alquílica d-do que puede ser lineal o ramificada.
En otra realización preferida, el hidrogel con estructura de red polimérica multicomponente entrecruzada tal como se describe en esta solicitud de patente comprende unidades derivadas del monómero (A) donde el grupo aniónico o anionizable es sulfonato o un grupo sulfónico anionizable. El grupo sulfonato puede encontrarse en el hidrogel en forma de sal alcalina o amónica; o en forma de ácido sulfónico. Como sales alcalinas se prefieren especialmente la sal sódica o potásica.
En una realización aún más preferida, el hidrogel de la presente invención comprende unidades derivadas de (A), donde (A) es un sulfonato acrílico que comprende al menos una cadena alquílica d-C-io lineal o ramificada. Por ejemplo, sal potásica de metacrilato de propilsulfonato o sal sódica de acr¡lam¡do-2-met¡l-1 -propanosulfonato. En una realización especialmente preferida, el hidrogel con estructura de red polimérica multicomponente entrecruzada de la presente invención comprende unidades derivadas de (A), donde (A) es una sal alcalina o amónica de metacrilato de d-do alquilsulfonato, donde el alquilo puede ser lineal o ramificado. Preferiblemente, una sal sódica, potásica o amónica de metacrilato de propilsulfonato.
Los inventores han observado que los hidrogeles que comprenden unidades de entrecruzante E3 presentan peores propiedades mecánicas que los obtenidos empleando la mezcla de entrecruzantes E1 y E2. Así por ejemplo, cuando se utiliza la técnica de fotopolimerización para obtener los hidrogeles con relación molar [A]/[V]= 0.17 empleando un porcentaje de entrecruzante E3 del 4% mol respecto (A), cuyo equivalente empleando la mezcla de entrecruzantes E1 y E2 sería el gel tipo 4 del ejemplo, se obtienen hidrogeles poco manejables que se rompen en las mordazas antes de iniciar el ensayo de elongación.
Por otra parte, si se emplea un porcentaje de entrecruzante E3 del 12% mol respecto al monómero (A), cuyo equivalente en la preparación que usa mezcla de entrecruzantes E1 + E2 sería el gel tipo 7 del ejemplo, se obtienen redes con pobres propiedades mecánicas mostrando una elongación máxima del 5% y una tensión máxima de 1 1 KPa. Tal y como se observa en la tabla 1 del ejemplo, las prestaciones mecánicas de los geles tipo 4 y tipo 7, que usan mezcla de entrecruzantes E1 + E2, son muy superiores. Este hecho no excluye que los hidrogeles que comprenden el entrecruzante E3 sean manipulables para las aplicaciones indicadas en esta solicitud de patente, en particular como soportes en cultivo celular; por lo que estos hidrogeles también se consideran parte de la presente invención.
En otra realización preferida, el hidrogel con estructura de red polimérica multicomponente entrecruzada tal como se define en esta solicitud de patente, comprende unidades derivadas de vinilpirrolidona (V), unidades derivadas de un monómero acrílico aniónico (A), unidades derivadas de un entrecruzante E1 con homología al menos parcial respecto a (A) y unidades derivadas de un entrecruzante E2 con homología al menos parcial respecto a (V). Preferiblemente, (A) se describe tal como se ha indicado anteriormente en esta solicitud de patente.
En una realización aún más preferida, el hidrogel con estructura de red polimérica multicomponente entrecruzada tal como se describe en esta solicitud de patente comprende unidades derivadas de E1 , donde este entrecruzante es un oxi-, oxi-amino- o armiño-derivado de un precursor con dos o más alcoholes y/o aminas primarias o secundanas en los que al menos dos de dichos alcoholes o aminas han sido derivatizados a acrílicos para formar el entrecruzante E1 .
En una realización especialmente preferida, el entrecruzante E1 es un compuesto con grupos polime zables de fórmula
Figure imgf000017_0001
E1
donde
z1 tiene un valor entre 2 y 5, preferiblemente entre 2 y 4;
cada R2 se selecciona independientemente del grupo que consiste en H y CH3; y
Ri se selecciona del grupo que consiste en:
a) oxialquilo C1-C30 lineal, ramificado o cíclico con al menos dos grupos oxi de extremo de cadena;
amino-oxi-alquilo C1-C20 lineal, ramificado o cíclico con al menos un grupo oxi de extremo de cadena y al menos un grupo amino de extremo de cadena;
c) amino-alquilo C1-C20 lineal, ramificado o cíclico con al menos dos grupos amino de extremo de cadena; d) amino-alquilo d-do cíclico con al menos dos aminas formando parte del ciclo y al menos dos de estas aminas estando unidas a grupos polimerizables formando las funcionalidades acrílicas de la estructura E1 ;
e) derivado oxi de Bisfenol A o Bisfenol F; y
f) derivado etoxilado o propoxilado de alguna de las estructuras oxi- propuestas en a) o e), donde al menos dos de los grupos oxi de extremo de cadena de estas estructuras propuestas en a) o e) están etoxilados o propoxilados con entre 1 y 20 unidades etoxi o propoxi, más preferiblemente entre 1 y 5 unidades.
El grupo alquilo presente en una cualquiera de las definiciones de Ri según se describe en esta solicitud de patente, puede comprender uno o más heteroátomos. En particular, puede comprender uno o más grupos hidroxilo y/o uno o más éteres alquílicos.
En esta solicitud de patente se entiende por "grupo oxi de extremo de cadena", un átomo de oxígeno (-0-) que en el entrecruzante E1 está unido al grupo polimerizable formando la funcionalidad acrílica. Adicionalmente, en esta solicitud de patente se entiende por "grupo amino de extremo de cadena", un grupo amino de fórmula -NR-, donde R se selecciona del grupo que consiste en hidrógeno y alquilo C1-C20 lineal, ramificado o cíclico, que en el entrecruzante de fórmula E1 está unido al grupo polimerizable formando la funcionalidad acrílica.
Por otro lado, cuando R1 es un derivado etoxilado o propoxilado tal como se describe en la opción f), el átomo de oxígeno (-0-) correspondiente a la última unidad etoxi o propoxi corresponde al grupo oxi de extremo de cadena que está unido al grupo polimerizable formando la funcionalidad acrílica del entrecruzante de fórmula E1 . Preferiblemente, el oxialquilo de la opción a) se selecciona del grupo que consiste en:
a1 ) -0-[CH2-CH2-0]z2-CH2-CH2-0-, donde z2 es un valor entre 1 y 20, más preferiblemente entre 1 y 5;
a2) -0-[CH2-CH2-CH2-0]z3-CH2-CH2-CH2-0-, donde z3 es un valor entre 1 y 20, más preferiblemente entre 1 y 3;
a3) -O-R3-O-, donde R3 es un grupo alquilo C1-C20 lineal, ramificado o cíclico; y
a4) derivado oxi seleccionado del grupo que consiste en glicerol, tnmetilolpropano, neopentilglicol, pentaehtrol, thglicerol, di(trimetilolpropano) y di(pentaeritrol).
Preferiblemente, el amino-oxi-alquilo de la opción b) tiene una estructura -0- R4-NH-, donde R4 es un grupo alquilo C1-C20 lineal, ramificado o cíclico.
Preferiblemente, el amino-alquilo de la opción c) tiene una estructura -HN-R5- NH-, donde R5 es un grupo alquilo C1-C20 lineal, ramificado o cíclico.
Preferiblemente, el amino-alquilo de la opción d) es una piperazina o una hexahidrotriazina.
Más preferiblemente, el grupo R3, R4 o R5 es un alquilo C1-C6 lineal o ramificado. Así, el entrecruzante E1 puede comprender más de dos funcionalidades acrílicas tal como, por ejemplo, derivados acrílicos de glicerol, tnmetilolpropano o de pentaeritrol.
En otra realización especialmente preferida, el hidrogel de la presente invención comprende unidades derivadas del entrecruzante E1 tal como se describe, siendo éste un compuesto simétrico. Preferiblemente, E1 se selecciona del grupo que consiste en etilénglicoldimetachlato y bisachlamida. En otra realización aún más preferida, el hidrogel con estructura de redes poliméricas entrecruzadas interconectadas tal como se describe en esta solicitud de patente comprende unidades derivadas de E2, donde los grupos polimerizables de E2 presentan homología con (V), como es el caso de los viniléteres, vinilaminas, vinilamidas o vinilesteres, de forma que las relaciones de reactividad en copolimerización radical binaria de cualquiera de los grupos polimerizables de E2 y (A) presentan valores máximos y mínimos de 0.5 respectivamente, rE2≤0.5, rA≥0.5.
En una realización especialmente preferida, el entrecruzante E2 es un oxi-, oxi- amino-, carboxi- o armiño-derivado de un precursor con dos o más alcoholes, uno o más alcoholes y una o más aminas primarias o secundarias, dos o más ácidos, o dos o más aminas primarias o secundarias; en los que al menos dos de dichos alcoholes, al menos un alcohol y una amina, al menos dos ácidos, o al menos dos aminas han sido derivatizados a vinílicos para formar el entrecruzante E2.
Más prefenblemente, E2 tiene estructura E2a o E2b, siendo E2a un compuesto de fórmula:
Figure imgf000020_0001
donde
z4 tiene un valor entre 2 y 5, prefenblemente entre 2 y 4; y
R6 se selecciona del grupo que consiste en:
a) oxialquilo C1-C20 lineal, ramificado o cíclico con al menos dos grupos oxi de extremo de cadena;
b) amino-alquilo C1-C20 lineal, ramificado o cíclico con al menos dos grupos amino de extremo de cadena; c) amino-alquilo d-do cíclico con al menos dos aminas formando parte del ciclo y al menos dos de estas aminas estando unidas a grupos polimerizables formando las funcionalidades vinílicas de la estructura E2a; y d) carboxi-alquilo C1-C20 lineal, ramificado o cíclico con al menos dos grupos carboxi de extremo de cadena.
El grupo alquilo presente en una cualquiera de las definiciones preferidas de R6 según se describe en esta solicitud de patente, puede comprender uno o más heteroátomos. En particular, puede comprender uno o más grupos hidroxilo y/o uno o más éteres alquílicos.
En esta solicitud de patente se entiende por "grupo oxi de extremo de cadena", un átomo de oxígeno (-0-) que en el entrecruzante de fórmula E2a está unido a uno de los grupos vinílicos.
Adicionalmente, en esta solicitud de patente se entiende por "grupo amino de extremo de cadena", un grupo amino de fórmula -NR- donde R se selecciona del grupo que consiste en hidrógeno y alquilo C1-C20 lineal, ramificado o cíclico, que en el entrecruzante de fórmula E2a está unido a uno de los grupos vinílicos.
De forma análoga, se entiende por "grupo carboxi de extremo de cadena", un grupo carboxilo (-COO-) que en el entrecruzante de fórmula E2a está unido a uno de los grupos vinílicos a través de un enlace oxi (-0-).
Preferiblemente, R6 es un oxialquilo seleccionado del grupo que consiste en: a1 ) -0-[CH2-CH2-0]z5-CH2-CH2-0-, donde z5 es un valor entre 1 y 20, más preferiblemente entre 1 y 5;
a2) -0-[CH2-CH2-CH2-0]z6-CH2-CH2-CH2-0-, donde z6 es un valor entre 1 y 20, más preferiblemente entre 1 y 3; y
a3) -O-R7-O-, donde R7 es un grupo alquilo C1-C20 lineal, ramificado o cíclico. Preferiblemente, R6 es un carboxi-alquilo de estructura -OOC-R9-COO-, donde R9 es un grupo alquilo C1-C20 lineal, ramificado o cíclico. Más preferiblemente, el grupo R7, R8 o R9 es un alquilo C1-C6 lineal o ramificado.
Y E2b es un compuesto de fórmula
Figure imgf000022_0001
donde
R-io se selecciona del grupo que consiste en:
alquilo alifático C1-C20 lineal o ramificado;
estructura -[CH2-CH2-0]z7-CH2-CH2-, donde z7 es un valor entre 1 y 20, más preferiblemente entre 1 y 5;
estructura -[CH2-CH2-CH2-0]z8-CH2-CH2-CH2-, donde z8 es un valor entre 1 y 20, más preferiblemente entre 1 y 3; y
estructura R11-O-R12, donde R-n y R12 son independientemente alquilo alifático C1-C20 lineal o ramificado. Más preferiblemente, el grupo R-io, Rn o R12 es un alquilo C1-C6 lineal o ramificado.
Preferiblemente, E2 es un compuesto de fórmula (E2b) seleccionado del grupo que consiste en 3,3'-propil di-vinilpirrolidona y 3,3'-oxidietil-di-vinilpirrolidona.
En otra realización preferida, el hidrogel tal como se describe en esta solicitud de patente comprende una mayor cantidad de unidades derivadas del entrecruzante E1 que del entrecruzante E2. Así, la polimerización de (A) y (V) en presencia de un alto porcentaje del entrecruzante E1 con homología el menos parcial respecto al monómero (A) y una pequeña cantidad del entrecruzante E2 con homología al menos parcial con respecto al monómero (V), da lugar a la formación de una estructura formada por un primer componente que comprende mayoritariamente unidades derivadas del monómero (A) y altamente entrecruzado por medio del entrecruzante E1 , y a un segundo componente que comprende mayoritariamente unidades derivadas del monómero (V) ligeramente entrecruzado por medio del entrecruzante E2, ambos formados en una polimerización en un solo paso; es decir, da lugar a la formación de una estructura que tiende a una red doble. Una ilustración de esta reacción se muestra en la figura 1 .
En otra realización preferida, el hidrogel con estructura de red polimérica multicomponente entrecruzada tal como se describe en esta solicitud de patente comprende unidades derivadas de E3, donde:
al menos uno de grupos polimerizables de E3 presenta homología con (V), como por ejemplo el grupo vinilo del vinilmetacrilato o las vinilamidas de los derivados de (V), de forma que las relaciones de reactividad en copolimerización radical binaria de uno de esos grupos polimerizables de E3 y (A) presentan valores máximos y mínimos de 0.5 respectivamente, rE3a≤0.5, rA≥0.5; y
al menos uno de grupos polimerizables de E3 presenta homología con
(A), como son los grupos acrílicos, de forma que las relaciones de reactividad en copolimerización radical binaria de uno de esos grupos polimerizables de E3 y (V) presentan valores mínimos y máximos de 0.5 respectivamente, rv≤0.5, rE3b≥0.5.
Más preferiblemente, E3 se selecciona del grupo que consiste vinilmetacrilato y un compuesto de fórmula:
Figure imgf000023_0001
donde:
Xi se selecciona del grupo que consiste en O y NH;
R-I4 se selecciona del grupo que consiste en H y CH3; y
R-I 3 es alquilo d-do lineal o ramificado.
Preferiblemente, E3' es metacrilato de 3-etil-vinilpirrolidona.
La polimerización de (A) y (V) en presencia de E3 da lugar a la formación de una estructura formada por un dos componentes que comprenden mayoritariamente unidades derivadas del monómero (A) y unidades derivadas del monómero (V), respectivamente, entrecruzados por medio del entrecruzante E3; ambos formadas en una polimerización en un solo paso y con una estructura que tiende a una co-red. La presente invención proporciona un hidrogel que combina las propiedades mecánicas mejoradas en condiciones de alto hinchamiento de la estructura de dos componentes, que preferiblemente tiende a una estructura de red doble, con la biocompatibilidad de la polivinilpirrolidona, polímero utilizado en una amplia variedad de aplicaciones biomédicas y cuyo uso está aprobado en alimentación y medicina por la FDA.
En un segundo aspecto, la presente invención también proporciona un procedimiento de obtención del hidrogel tal como se define en esta solicitud de patente, donde dicho procedimiento comprende poner en contacto los monómeros (A) y (V) con los entrecruzantes E1 y E2, o el entrecruzante E3, en condiciones de polimerización radicalaria. De esta forma, la polimerización de los dos componentes que forman la estructura de red polimérica multicomponente entrecruzada del hidrogel tiene lugar en una única etapa de polimerización.
En el procedimiento de la presente invención se prefiere que tanto los monómeros (A) y (V), como los entrecruzantes E1 , E2 o E3 tengan el significado indicado en el primer aspecto de la presente invención. En particular, se prefiere que (A) sea un monómero acrílico aniónico ó anionizable. Más preferiblemente, una sal alcalina o amónica de C-i-do-alquilsulfonato de metacrilato.
En otra realización preferida, el procedimiento de obtención del hidrogel de la presente invención puede realizarse en presencia de al menos un disolvente, preferiblemente en medio acuoso. Otros disolventes preferidos son disolventes polares capaces de disolver sales como dimetilsulfóxido, dimetilformamida, dimetilacetamida o alcoholes como metanol, etanol, isopropanol. Más preferiblemente, etanol o dimetilsulfóxido debido a su menor toxicidad.
En otra realización preferida, el procedimiento de obtención del hidrogel con estructura de red polimérica multicomponente entrecruzada que se describe en esta solicitud de patente tiene lugar en agua, donde la concentración inicial de monómero alquénico aniónico o anionizable (A), en moles por litro de la mezcla total, está en el rango 0.01 mol/L < [A] < 5 mol/L. Más preferentemente en el rango 0.5 mol/L < [A] < 1 mol/L. En otra realización preferida, el procedimiento de la presente invención comprende añadir al medio de polimerización una cantidad inicial de monómero alquénico aniónico o anionizable (A) y vinilpirrolidona (V) tal que la relación molar entre ellos es 0.001 < [A]/[V] < 2. En una realización aún más preferida, el procedimiento de obtención del hidrogel tal como se describe en esta solicitud de patente comprende añadir al medio de polimerización una cantidad inicial de entrecruzante E1 entre 0.1 - 100% molar respecto a la cantidad inicial de monómero (A); y una cantidad inicial de entrecruzante E2 entre 0.001 -10% molar respecto a la cantidad inicial de vinilpirrolidona. Estas cantidades también pueden expresarse mediante la siguiente relación molar: 1 < [A]/[E1 ] < 1000; y 10 < [V]/[E2] < 10000. En una realización especialmente preferida, el procedimiento de obtención del hidrogel con estructura de red polimérica multicomponente entrecruzada de la presente invención comprende añadir al medio de polimerización una cantidad inicial de monómero alquénico aniónico o anionizable (A), vinilpirrolidona (V) y entrecruzantes E1 y E2 tal que la relación molar entre ellos sea:
0.05 < [A]/[V] < 1 ;
5 < [A]/[E1 ] < 50; y
100 < [V]/[E2] < 10000. En las realizaciones descritas en los párrafos anteriores indicando las cantidades preferidas de los diferentes reactivos del procedimiento de la invención, se prefiere adicionalmente que (A) sea una sal alcalina de metacrilato de d-do alquilsulfonato, E1 sea etilénglicoldimetacrilato o bisacrilamida y E2 un compuesto de estructura E2b tal como se ha definido anteriormente.
En otra realización aún más preferida, el procedimiento de obtención del hidrogel tal como se describe en esta solicitud de patente comprende añadir al medio de polimerización una cantidad inicial de entrecruzante E3 entre 0.1 - 100% molar respecto a la cantidad inicial de monómero (A). Estas cantidades también pueden expresarse mediante la siguiente relación molar: 1 < [A]/[E3] < 1000. Más preferentemente 5 < [A]/[E3] < 100.
En una realización especialmente preferida, el procedimiento de obtención del hidrogel con estructura de redes poliméricas entrecruzadas interconectadas de la presente invención comprende añadir al medio de polimerización una cantidad inicial de monómero alquénico aniónico o anionizable (A), vinilpirrolidona (V) y entrecruzante E3 tal que la relación molar entre ellos sea:
0.05 < [A]/[V] < 1 ; y
5 < [A]/[E3] < 50. En las realizaciones descritas en los párrafos anteriores indicando las cantidades preferidas de los diferentes reactivos del procedimiento de la invención, se prefiere adicionalmente que (A) sea una sal alcalina de metacrilato de d-do alquilsulfonato y E3 sea un compuesto de estructura E3' tal como se ha definido anteriormente.
Los hidrogeles de la presente invención pueden prepararse mediante el procedimiento tal como se describe en esta solicitud de patente empleando cualquier técnica de polimerización radical convencional, por ejemplo, por fotopolimerización, iniciación térmica, o iniciación redox.
En otra realización preferida, el procedimiento de obtención del hidrogel tal como se define en esta solicitud de patente comprende poner en contacto los monómeros (A) y (V) con los entrecruzantes E1 y E2, o el entrecruzante E3, en condiciones de fotopolimerización, donde la polimerización tiene lugar en presencia de un disolvente, preferiblemente agua, ya que el monómero (A) generalmente no es soluble en vinilpirrolidona.
Al preparar las muestras fototérmicas algunas muestras tienen gran afinidad por el molde de polipropileno y se tienen que hinchar en presencia de dicho molde, del que se despegan durante el hinchamiento en agua.
Una vez se ha obtenido la estructura de red polimérica multicomponente entrecruzada, ésta se pueden hinchar en agua y lavar para eliminar cualquier residuo o resto sin reaccionar.
Adicionalmente, la presente invención también se refiere al hidrogel con estructura de red polimérica multicomponente entrecruzada, preferentemente con tendencia estructural a red doble, tal como se describe en el primer aspecto de la presente invención, obtenido por el procedimiento en una única etapa de polimerización tal como se describe en el segundo aspecto de la presente invención. Preferiblemente, cuando la relación de (A), (V), y los entrecruzantes E1 y E2, o el entrecruzante E3, son las indicadas en el segundo aspecto de la presente invención.
En un tercer aspecto, la presente invención se refiere a un producto que comprende el hidrogel tal como se describe en esta solicitud de patente, preferiblemente donde (A) es una sal alcalina de metacrilato de d-do alquilsulfonato, E1 sea etilénglicoldimetacrilato o bisacrilamida y E2 un compuesto de estructura E2b tal como se ha definido anteriormente. En una realización aún más preferible, este producto se selecciona del grupo que consiste en una plataforma para cultivo celular, un kit para cultivo celular, un aposito para proteger heridas y un medicamento de liberación controlada.
En un cuarto aspecto, la presente invención se refiere al uso del hidrogel tal como se describe en el primer aspecto de la presente invención, siendo especialmente preferiblemente que (A) sea una sal alcalina de metacrilato de d-C-io alquilsulfonato, E1 sea etilénglicoldimetacrilato o bisacrilamida y E2 sea un compuesto de estructura E2b tal como se ha definido anteriormente, en aplicaciones biológicas, biomédicas o biotecnológicas in vitro que requieran una interacción no tóxica hidrogel-célula.
En una realización preferida, la presente invención se refiere al uso del hidrogel con estructura de red polimérica multicomponente entrecruzada tal como se describe en esta solicitud de patente en ingeniería de tejidos o medicina regenerativa. Preferiblemente, en aquellas aplicaciones que requieran una alta biocompatibilidad celular y/o elevada capacidad de difusión acuosa de solutos.
En una realización aún más preferida, el hidrogel de la presente invención puede utilizarse en aplicaciones que requieran un efecto barrera para impedir la penetración de tipos celulares indeseados. En otra realización aún más preferida, el hidrogel tal como se describe en esta solicitud de patente puede utilizarse en cultivo celular in vitro.
La presencia del grupo aniónico en el hidrogel de la presente invención colabora a mejorar sus propiedades mecánicas, a la vez que facilita el despegado de las células.
Adicionalmente, la presente invención se refiere al uso del hidrogel tal como se describe en el primer aspecto de la presente invención, siendo especialmente preferiblemente que (A) sea una sal alcalina de metacrilato de d-do alquilsulfonato, E1 sea etilénglicoldimetacrilato o bisacrilamida y E2 sea un compuesto de estructura E2b tal como se ha definido anteriormente, para fabricar un producto para utilizar en aplicaciones biológicas, biomédicas o biotecnológicas que requieran una interacción no tóxica hidrogel-célula.
En una realización aún más preferible, la presente invención se refiere al uso del hidrogel tal como se describe en esta solicitud de patente para fabricar un soporte para el transplante celular in vivo, preferiblemente de monocapas celulares.
En otra realización aún más preferida, la presente invención se refiere al uso del hidrogel tal como se describe en esta solicitud de patente para fabricar un producto para actuar de sistema de barrera en el tratamiento de heridas. Preferiblemente, para fabricar un aposito para el tratamiento de heridas.
En otra realización aún más preferida, el hidrogel tal como se describe en esta solicitud de patente puede utilizase para fabricar un medicamento de liberación controlada de fármacos para el tratamiento de una enfermedad.
Adicionalmente, ha de entenderse que forma parte de la presente invención el hidrogel tal como se describe en el primer aspecto de la presente invención, siendo especialmente preferiblemente que (A) sea una sal alcalina de metacrilato de d-do alquilsulfonato, E1 sea etilénglicoldimetacrilato o bisacrilamida y E2 sea un compuesto de estructura E2b tal como se ha definido anteriormente, para utilizar en aplicaciones biológicas, biomédicas o biotecnologías que requieran una interacción no tóxica hidrogel-célula.
En una realización aún más preferible, la presente invención se refiere al hidrogel tal como se describe en esta solicitud de patente como soporte para el transplante celular in vivo. Así como también se refiere a un soporte que comprenda el hidrogel de la invención para el transplante celular in vivo. Preferiblemente, para el transplante de monocapas celulares.
En otra realización aún más preferida, la presente invención se refiere al hidrogel tal como se describe en esta solicitud de patente como sistema de barrera en el tratamiento de heridas. Así como también se refiere a un aposito que comprende el hidrogel de la invención para el tratamiento de heridas.
En otra realización aún más preferida, la presente invención se refiere a un medicamento de liberación controlada de fármacos que comprende el hidrogel tal como se describe en esta solicitud de patente, para el tratamiento de una enfermedad.
Adicionalmente, ha de entenderse que forma parte de la presente invención un método para utilizar el hidrogel tal como se describe en el primer aspecto de la presente invención, siendo especialmente preferiblemente que (A) sea una sal alcalina de metacrilato de d-C-io alquilsulfonato, E1 sea etilénglicoldimetacrilato o bisacrilamida y E2 sea un compuesto de estructura E2b tal como se ha definido anteriormente, en aplicaciones biológicas, biomédicas o biotecnologías que requieran una interacción no tóxica hidrogel-célula. En una realización aún más preferible, la presente invención se refiere a un método para realizar trasplante celular in vivo, preferiblemente trasplante de monocapas celulares, que comprende hacer crecer las células en el hidrogel tal como se describe en esta solicitud de patente.
En otra realización aún más preferida, la presente invención se refiere a un método para proteger heridas que comprende utilizar el hidrogel tal como se describe en esta solicitud de patente como sistema de barrera. Preferiblemente, comprende suspender el hidrogel en un aposito.
En otra realización aún más preferida, la presente invención se refiere a un método de tratamiento de una enfermedad que comprende administrar un medicamento de liberación controlada de fármacos que comprende el hidrogel tal como se describe en esta solicitud de patente.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
Figura 1 : Esquema ilustrativo de la formación de la estructura de red polimérica multicomponente entrecruzada según el procedimiento de la invención, donde se utiliza una relación molar de E1 significativamente superior a E2. Figura 2: Las micrografías muestran el crecimiento celular en un hidrogel tipo 4 a las 24h (fig. 2A), 48h (fig. 2B) y 168h (fig. 2C) de incubación, respectivamente. La adhesión inicial y proliferación celular está inicialmente retardada pero después de algunos días de incubación el número de células comienza a crecer en los hidrogeles y tras 168 h se observa crecimiento confluente sobre los geles.
Figura 3: Ensayo metabólico AlamrBIue en el séptimo día de cultivo de las células sobre los hidrogeles. Figura 4: Despegado de células del hidrogel tipo 2 (fig. 4A), hidrogel tipo 3 (fig. 4B), hidrogel tipo 4 (fig. 4C) y hidrogel tipo 5 (fig. 4D). En los hidrogeles 3, 4 y 5 se recuperó una monocapa completa de células. En el caso del hidrogel 2 en los que no se llegó a confluencia se recuperaron pequeños aglomerados celulares.
Figura 5: Las micrografías presentan las células despegadas, disgregadas y resembradas en TCP a partir de los hidrogeles 1 (fig. 5A), 2 (fig. 5B) y 4 (fig. 5C). Las monocapas celulares se disgregaron por pipeteo repetido y se incubaron 24h después de ser resembradas en pocilios de TCP. Las células se despegaron y proliferaron en los pocilios de TCP y retuvieron su morfología elongada característica.
Figura 6: Imágenes mostrando las monocapas trasplantadas en pocilios de TCP después de eliminar el hidrogel. (3 imágenes superiores; fig. 6A hidrogel Tipo 1 ; fig. 6B hidrogel Tipo 3 y fig. 6C hidrogel Tipo 4). Las células se despegan de los hidrogeles y pasan a los pocilios de plástico inferiores asumiendo una morfología que es típica de este tipo de células cuando se pegan a un soporte. Después de la reincubación durante 24h las células continúan proliferando (3 imágenes centrales; fig. 6D hidrogel Tipo 1 ; fig. 6E hidrogel Tipo 3 y fig. 6F hidrogel Tipo 4) y todavía crecen más después de 48h (3 imágenes inferiores; fig. 6G hidrogel Tipo 1 ; fig. 6H hidrogel Tipo 3 y fig. 61 hidrogel Tipo 4).
EJEMPLOS
Materiales y tratamientos previos
Sulfopropilmetacrilato potásico (M; monómero tipo A), vinilpirrolidona (V), etilenglicol dimetacrilato (C1 , entrecruzante tipo E1 ), 1 - hidroxiciclohexilfenilcetona (HCPK) y azobisisobutironitrilo (AIBN) fueron adquiridos en Sigma. El monómero (V) fue destilado antes de ser usado y almacenado a 4 °C. AIBN fue recristalizado en etanol y almacenado a 4 °C. El compuesto divinílico C2 (entrecruzante tipo E2) que se muestra en el esquema 1 , el cual es un derivado de (V), fue sintetizado en nuestro laboratorio de acuerdo a [Tardajos, M. G.; Nash, M.; Rochev, Y.; Reinecke, H.; Elvira, C; Gallardo, A. Macromolecular Chemistry and Physics 2012, 213, 529]. C2C12- GMP fueron suministrados por ATTC, el suero fetal bovino se adquirió en GIBCO UK, y Penicillin-Streptomycinen Lonza.
Figure imgf000033_0001
Esquema 1
Síntesis de los hidrogeles
En este trabajo se han preparado hidrogeles con diferentes relaciones molares iniciales M/V y M/C1 (ver Tabla 1 ). Todos los hidrogeles se prepararon utilizando una concentración inicial de M de 1 mol/L y 1 % molar de C2 con respecto a V. La relación molar V/C2 fue siempre de 1000. Los hidrogeles se sintetizaron mediante polimerización radical convencional en una única etapa, usando agua como disolvente. Para ello, se preparó una disolución acuosa de V en concentración apropiada (entre 1 y 7 mol/L) y se añadió C2 en un porcentaje de 0.1 % molar con respecto a V. A esta disolución se añadió M según la relación M/V elegida y finalmente su entrecruzante homólogo C1 en el porcentaje molar seleccionado con respecto al contenido de M. En el caso de reacciones iniciadas térmicamente, se añadió AIBN (1 .5*10"2 M) como iniciador; tras burbujear la mezcla con N2 los viales se cerraron y las reacciones se llevaron a cabo a 60 °C durante 24 horas. En el caso de reacciones foto- iniciadas, se añadió HCPK (0.5 % en peso); tras burbujear con N2 la disolución de traspasó con una jennga a un molde de polipropileno con un espaciador de silicona para obtener muestras de 0.4 mm de espesor; la polimerización se llevó a cabo durante 40 minutos bajo radicación UV en una lámpara de curado UVP ultravioleta (modelo CL-1000L, 230V). Para ambos tipos de reacciones, tras el tiempo de reacción elegido, los hidrogeles se recuperaron de los viales o moldes y se les permitió hinchar en agua hasta el equilibrio. Posteriormente se lavaron exhaustivamente con agua para eliminar residuos y material no unido a la red, y se troquelaron en cilindros.
Contenido en agua y grado de hinchamiento en el equilibrio
Los cilindros hinchados se pesaron y se pusieron a secar hasta pesada constante. El contenido en agua en el equilibrio (CAE) se definió como la cantidad de agua en el estado de equilibrio por gramo de hidrogel seco (ecuación 1 ).
~ ¾ [1 ]
donde Ph y Ps son los pesos en estado hinchado y seco respectivamente.
Ensayos mecánicos
Muestras obtenidas mediante iniciación térmica: Se analizaron las propiedades mecánicas en un equipo Instron universal modelo 3366 en modo de compresión empleando cilindros de 5mm de altura y 4.3mm de diámetro determinándose la máxima resistencia a la fractura (omax) y la compresión a rotura (£ma ). El módulo elástico se calculó como la pendiente de la curva compresión-deformación en el rango lineal. Las muestras de fotopolimerización se estudiaron por elongación. Muestras de 10mm de largo y 5 mm de ancho se elongaron a una velocidad constante (5mm/min) hasta la fractura determinándose la resistencia a la tracción (omax) y el alargamiento de rotura (£maX). De la curva tensión-elongación en el rango lineal se determinó el modulo de Young (E).
5 El hinchamiento en agua de todas las muestra fue muy alto. La tabla 1 resume las propiedades de las muestras seleccionadas para el estudio de cultivo celular. La estabilidad mecánica de las muestras fue elevada, las muestras se pueden manejar fácilmente a pesar de hinchar en agua aproximadamente hasta un 1000% (10 g agua/ g polímero).
0
Tabla 1 . Características de los hidrogeles utilizados en los estudios de cultivo celulares.
Figure imgf000035_0001
Todos los hidrogeles de la tabla 1 se prepararon utilizando una concentración 5 inicial de M de 1 mol/L y 1 % molar de C2 con respecto a V. Las letras F y T se refieren al modo de iniciación (F: fotoiniciación y T: térmica)
Se estudiaron como referencias las redes sencillas, redes sólo formadas por V o M y su entrecruzante homólogo; redes dobles sin utilizar el entrecruzante C2, 0 así como una red de V con ambos entrecruzantes. Estos controles, en especial la red pura de M que estalló durante los ciclos de lavado, presentan peores propiedades mecánicas que los hidrogeles de la presente invención y no se muestran en la tabla 1 .
Cultivos celulares
En este trabajo se ha utilizado como modelo la línea celular mioblástica de ratón C2C12 que expresaba constitutivamente el gen que codifica la proteína verde fluorescente (GFP), insertado previamente en el genoma celular mediante infección con lentivirus. Las células se cultivaron en DMEM con alto contenido en glucosa, suplementado con un 10% de Suero Bovino Fetal más un 1 % de antibióticos (Penicilina/Estreptomicina). Las células se cultivaron a 37 °C en una atmósfera húmeda con un 5% de CO2 y para su mantenimiento se realizaron los pases celulares al alcanzar el 80% de confluencia.
Procedimiento general para el análisis de las muestras In vltro
Las muestras de hidrogel fueron cortadas en forma de cilindros (16.26 mm de diámetro) que cubnesen el fondo del pocilio de una placa de 24 pocilios y fueron esterilizadas mediante exposición a luz UV durante 90 minutos. Cada hidrogel estéril se lavó 3 veces en PBS y se colocó en un pocilio de una placa de plástico de 24 pocilios sin pre-tratamiento para la adherencia celular y después, se lavaron 3 veces con medio de cultivo (DMEM) previo a la siembra de las células. Se sembraron 20000 células por muestra, utilizando en el experimento 12 réplicas para cada tipo de hidrogel. Más tarde, se añadió a cada pocilio 800 μΙ de medio completo y atemperado, y las muestras se incubaron a 37°C con un 5% de CO2. Las muestras se observaron tras 24, 48, 72, 96, 120, 144 y 168 horas, utilizando un microscopio Olympus Bx51 para tomar las imágenes con fluorescencia.
Para realizar el estudio del proceso de separación de la monocapa celular, los hidrogeles se retiraron de sus pocilios con unas pinzas, y se colocaron en un nuevo pocilio de una P6 con plástico pre-tratado, dejando la monocapa en contacto con la superficie del pocilio de modo que los hidrogeles se comportan como superestrato para el trasplante, seguido de una incubación para permitir que las células se adhieran a la nueva superficie. Tras la incubación, los hidrogeles se retiraron y descartaron, y las monocapas celulares se observaron y fotografiaron usando el microscopio de fluorescencia. Estos trasplantes se incubaron durante 48 horas más con objeto de observar el crecimiento celular. Finalmente, las monocapas celulares trasplantadas se tripsinizaron y resembraron para analizar si las células despegadas desde los hidrogeles habían sido afectadas tras crecer sobre ellos durante una semana.
En otro experimento, se observó que un suave pipeteo podía separar la monocapa celular del hidrogel sin necesidad de adherirse a otro sustrato. La viabilidad celular no se veía comprometida si este pipeteo se continuaba hasta disgregar la monocapa en células aisladas. Estas células se resembraron en una placa con plástico pre-tratado observándose que las células se adherían y crecían con su comportamiento habitual. Una vez más, se tomaron imágenes con el microscopio de fluorescencia. Ensayo de proliferación celular con Alamar Blue
El ensayo de actividad metabólica con Alamar Blue se realizó según las instrucciones del fabricante (Biosource, Camarillo, CA, USA). Antes de cada medida se añadieron 80 μΙ de Alamar Blue en cada pocilio, y se incubó la muestra durante 90 minutos. Tras el período de incubación, se midió por triplicado la intensidad de la fluorescencia (λ=590 nm) usando un lector de placas (Synergy HT, Brotek) restando los valores de sus respectivos blancos.
Resultados
La biocompatibilidad de los hidrogeles se estudio sembrando las células e incubándolas (10,000 C2C12-GMP células / cm2) sobre los geles descritos en la Tabla 1 . El crecimiento celular se siguió por microscopía durante los siguientes 7 días después del sembrado. Durante los primeros 2 días se observó un retardo en la adhesión y proliferación de las células en comparación con las células sembradas sobre placas control de plástico (TCP). Al tercer día es evidente la proliferación celular en todas las muestras observándose el mayor crecimiento en las muestras tipo 3, 4 y 5. Al séptimo día de incubación se observa crecimiento en confluencia en las muestras tipo 3, 4 y 5 y crecimiento en subconfluencia (~60 %) en los hidrogeles tipo 1 y 2 (Figura 2 mostrando hidrogel tipo 4). En el séptimo día se llevó a cabo un ensayo de AlamarBlue por triplicado en otro grupo de muestras para determinar la actividad metabólica. La mayor actividad metabólica se observó en los hidrogeles tipo 3, 4 y 5 siendo la mayor actividad observada en el hidrogel tipo 4. La menor actividad se detectó en los hidrogeles tipo 1 y 2 lo que indica un menor crecimiento celular en concordancia con la observación microscópica cualitativa (Figura 3).
Después de reponer el medio de cultivo (séptimo día) se observó un comportamiento sorprendente cuando las células unidas a los hidrogeles se despegaron espontáneamente de la superficie de los mismos. En el caso de los hidrogeles tipo 2 se desprendieron aglomerados o pequeñas monocapas de células; pero en el caso de los hidrogeles tipo 3,4 y 5 se obtuvieron monocapas de mayor tamaño de células en confluencia flotando en el medio de cultivo (Figura 4). Teniendo en cuenta la popularidad del desarrollo de plataformas para cultivo celular útiles en regeneración tisular era necesario comprobar la reproducibilidad del resultado de recolección/extracción celular y por tanto el despegado de las células fue repetido utilizando nuevos hidrogeles lo que confirmó el potencial de los hidrogeles en regeneración de células y monocapas de células. Además, se despegaron células de un nuevo grupo de hidrogeles y se disgregaron suavemente por pipeteo repetido. Las células separadas se resembraron en TCP y se incubaron durante la noche para determinar si las células despegadas conservaban su viabilidad y se unían y crecían sobre los pocilios control de plástico de forma similar a las células despegadas por métodos tradicionales. En todos los casos, las células crecieron en TCP y mostraron una morfología típica para este tipo de línea celular, que es dependiente de la adhesión (Figura 5).
Aunque el rápido despegado de las células es un resultado deseable, también es ventajoso ser capaces de transplantar las monocapas celulares a un lugar de transplante de elección. Con esto en mente, se sembraron células sobre otro grupo de hidrogeles y se incubaron tal y como se ha descrito anteriormente durante 7 días. Los hidrogeles portadores de las células fueron entonces volteados y transferidos con la zona superior, que contiene las células, hacía abajo sobre pocilios de plástico de diámetro superior al de los hidrogeles (diámetro de 3.46 cm) y las células se reincubaron de nuevo. De esta manera los hidrogeles que estaban actuando como sustrato se convierten en superestratos del trasplante. Después de la incubación los hidrogeles se retiraron y fue posible ver claramente una monocapa celular circular unida al pocilio de plástico cuyo tamaño corresponde con los hidrogeles retirados. En el caso de los hidrogeles 3 y 4 con menor confluencia que la observada en el hidrogel 3. Este resultado confirma el éxito del trasplante de la lámina celular, ver Figura 6. Estos discos se reincubaron durante la noche para determinar si las células eran capaces de seguir creciendo sobre el pocilio de plástico, Como se observa en la Figura 6, las células continuaron desarrollándose y se expandieron cuando se incubaron otras 24 o 48h. Las células se tripsinizaron y resembraron en placas de 6 pocilios. En todos los casos las células crecieron de manera normal confirmando que las células no sufren efectos negativos después de crecer sobre los hidrogeles durante 1 semana en todos los tipos de hidrogel.

Claims

REIVINDICACIONES
1 . - Hidrogel con estructura de red polimérica multicomponente entrecruzada, caracterizado porque comprende:
a) unidades derivadas de vinilpirrolidona (V) y unidades derivadas de un monómero alquénico aniónico o anionizable (A), donde las relaciones de reactividad en copolimerización radical binaria de (V) y (A) tienen unos valores máximo y mínimo de 0.5 respectivamente; y
b) unidades derivadas de al menos un entrecruzante; siempre que el o los entrecruzantes sean:
i) dos entrecruzantes E1 y E2, donde E1 presenta homología al menos parcial respecto a (A) y E2 presenta homología al menos parcial respecto a (V); o
¡i) un entrecruzante E3 que presenta homología respecto a (A) y (V).
2. Hidrogel con estructura de red polimérica multicomponente entrecruzada según la reivindicación 1 , donde (A) se selecciona del grupo que consiste en monómero acrílico y monómero estirénico, comprendiendo en ambos casos al menos un grupo aniónico o anionizable.
3. Hidrogel con estructura de red polimérica multicomponente entrecruzada según una cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, donde el grupo aniónico o anionizable de (A) es sulfonato o un grupo sulfónico anionizable.
4. Hidrogel con estructura de red polimérica multicomponente entrecruzada según la reivindicación 3, donde (A) es una sal alcalina o amónica de metacrilato de C-i-do-alquilsulfonato.
5. Hidrogel con estructura de red polimérica multicomponente entrecruzada según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, que comprende unidades derivadas de vinilpirrolidona (V), unidades derivadas de un monómero acrílico aniónico (A), unidades derivadas de un entrecruzante E1 con homología al menos parcial respecto a (A) y unidades derivadas de un entrecruzante E2 con homología al menos parcial respecto a (V).
6. Hidrogel con estructura de redes poliméricas entrecruzadas interconectadas según la reivindicación 5, donde E1 es un oxi-, oxi-amino- o armiño-derivado de un precursor con dos o más alcoholes y/o aminas primarias o secundarias, en los que al menos dos de dichos alcoholes o aminas han sido derivatizados a acrílicos para formar el entrecruzante E1 .
7. Hidrogel con estructura de red polimérica multicomponente entrecruzada según una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 6, donde E2 es un oxi-, oxi- amino-, carboxi- o armiño-derivado de un precursor con dos o más alcoholes, uno o más alcoholes y una o más aminas primarias o secundarias, dos o más ácidos, o dos o más aminas primarias o secundarias; en los que al menos dos de dichos alcoholes, al menos un alcohol y una amina, al menos dos ácidos, o al menos dos aminas han sido derivatizados a vinílicos para formar el entrecruzante E2.
8. Hidrogel con estructura de red polimérica multicomponente entrecruzada según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, donde E3 corresponde a un compuesto de fórmula:
Figure imgf000041_0001
donde
Xi se selecciona del grupo que consiste en O y NH;
R-I4 se selecciona del grupo que consiste en H y CH3; y
R-I 3 es alquilo d-do lineal o ramificado.
9. Procedimiento de obtención del hidrogel tal como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, donde dicho procedimiento comprende poner en contacto los monómeros (A) y (V) con los entrecruzantes E1 y E2, o el entrecruzante E3, en condiciones de polimerización radicalaria.
10. Procedimiento de obtención del hidrogel según la reivindicación 9, que comprende añadir al medio de polimerización una cantidad inicial de monómero alquénico aniónico o anionizable (A) y vinilpirrolidona (V) tal que la relación molar entre ellos es 0.001 < [A]/[V] < 2.
1 1 . Procedimiento de obtención del hidrogel según la reivindicación 10, que comprende añadir al medio de polimerización una cantidad inicial de entrecruzante E1 entre 0.1 -100% molar respecto a la cantidad inicial de monómero (A); y una cantidad inicial de entrecruzante E2 entre 0.001 -10% molar respecto a la cantidad inicial de vinilpirrolidona.
12. Hidrogel con estructura de red polimérica multicomponente entrecruzada según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, obtenido por el procedimiento tal como se descnbe en una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 1 1 .
13. Producto que comprende el hidrogel tal como se describe en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 o en la reivindicación 12.
14. Uso del hidrogel tal como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 o 12, o del material tal como se descnbe en la reivindicación 13 para cultivo celular in vitro.
15. Uso del hidrogel tal como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 o 12, para fabricar un soporte para transplante celular in vivo.
16. Uso del hidrogel tal como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 o 12, para fabricar un producto para actuar como sistema de barrera en el tratamiento de heridas.
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WO2018130739A1 (es) * 2017-01-16 2018-07-19 Consejo Superior De Investigaciones Científicas (Csic) Recubrimientos tipo hidrogel en base vinil-lactamas

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