WO2014195207A1 - Verfahren zur detektion von partikeln - Google Patents

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Detektion von sich entlang einer Trajektorie bewegenden Partikeln, welche elektromagnetische Strahlung, ein elektrisches Feld oder ein magnetisches Feld erzeugen oder zumindest beeinflussen, wobei die elektromagnetische Strahlung S, das elektrische oder das magnetische Feld detektiert wird, bei dem eine Strukturierungseinrichtung verwendet wird, die entweder dafür Sorge trägt, dass die Partikel entlang der Trajektorie im Wesentlichen nur in nicht-periodischen räumlichen Abständen elektromagnetische Strahlung, ein elektrisches Feld oder ein magnetisches Feld erzeugen oder zumindest beeinflussen oder dafür Sorge trägt, dass die elektromagnetische Strahlung S, das elektrische oder das magnetische Feld im Wesentlichen nur in nicht-periodischen räumlichen Abständen entlang der Trajektorie detektiert wird. Um ein Verfahren zur Detektion von sich entlang einer Trajektorie bewegenden Partikeln, welche elektromagnetische Strahlung, ein elektrisches Feld oder ein magnetisches Feld erzeugen oder zumindest beeinflussen, wird erfindungsgemäß vorgeschlagen, dass das detektierte Signal S mit Hilfe eines mismatched-Filters F₁ verarbeitet wird und, wenn das derart gefilterte Signal D_F1 (S) ein vordefiniertes Schwellwertkriterium erfüllt, ein Partikel detektiert wird, und, wenn das derart gefilterte Signal das vordefinierte Schwellwertkriterium nicht erfüllt, kein Partikel detektiert wird.

Description

Verfahren zur Detektion von Partikeln

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Detektion von sich entlang einer Trajektorie bewegenden Partikeln, welche elektromagnetische Strahlung, ein elektrisches Feld oder ein magnetisches Feld erzeugen oder zumindest beeinflussen. Dabei wird die elektromagnetische Strah- lung S, das elektrische oder das magnetische Feld detektiert. Des Weiteren wird eine Strukturier- ungseinrichtung verwendet, die entweder dafür Sorge trägt, dass die Partikel entlang der Trajektorie im Wesentlichen nur in nicht-periodischen räumlichen Abständen elektromagnetische Strahlung, ein elektrisches Feld oder ein magnetisches Feld erzeugen oder zumindest beeinflussen oder dafür Sorge trägt, dass die elektromagnetische Strahlung S, das elektrische oder das magnetische Feld im Wesentlichen nur in nicht-periodischen räumlichen Abständen entlang der Trajektorie detektiert wird.

Ein solches Verfahren wird beispielsweise in Durchflusszytometern verwendet. Bei der Durchfluss- zytometrie wird eine Zellsuspension durch eine Durchflussmesszelle geleitet. Die Zellsuspension wird mit einer Lichtquelle, bestehend meist aus mehreren Lasern, bestrahlt, wodurch die zu detek- tierenden Zellen oder ein an den Zellen gebundener Farbstoff angeregt werden und Fluoreszenzsignale emittieren. Als Strukturierungseinrichtung wird eine nicht-periodische, strukturierte Maske verwendet und die Partikel werden an einer Seite der Maske mit einer Geschwindigkeit v vorbeigeführt und auf der anderen Seite wird die durch die Maske tretende elektromagnetische Strahlung S, das elektrische oder das magnetische Feld mit einem geeigneten Detektor detektiert.

Es versteht sich aber, dass die Strukturierungseinrichtung keine Schattenmaske sein muss. Es wäre beispielsweise auch denkbar, dass die zu detektierenden Partikel mit Hilfe einer Anregungsstrahlung angeregt werden müssen, um eine elektromagnetischen Strahlung zu erzeugen. Diese Anregungsstrahlung könnte beispielsweise mit Hilfe von diffraktiven optischen Elementen nur in nicht-periodischen räumlichen Abständen entlang der Trajektorie zur Verfügung gestellt werden, so dass im Wesentlichen auch nur an diesen Orten die zu detektierende elektromagnetische Strahlung emittiert wird. Die Strukturierungseinrichtung besteht dann aus den diffraktiven optischen Elementen. Die vorliegende Erfindung wird im Folgenden anhand eines Verfahrens zur Detektion von Strahlungsemittierenden Partikeln beschrieben. Dennoch kann das Verfahren auch zur Detektion von beispielsweise ein Magnetfeld oder ein elektrisches Feld erzeugende oder beeinflussende Teilchen verwendet werden. Auch wäre es denkbar, elektromagnetische Strahlung durch die Maske zu leiten und zu detektieren, so dass die vorbei geführten Partikel die gerichtete elektromagnetische Strahlung beim Passieren der Masken kurzzeitig abschwächen oder zumindest beeinflussen.

In einer Ausführungsform wird die zeitliche Modulation des Fluoreszenzsignales durch eine entlang der Bewegungsrichtung des Partikels strukturierte Schattenmaske erzeugt. Fenster in dieser Schattenmaske erlauben Transmission des Fluoreszenzlichtes und entsprechen dem Transmissionszustand„1 ". Geschlossene Bereiche der Maske verhindern die Transmission und entsprechen dem Zustand „0". Die räumliche Strukturierung der Maske wird mathematisch beschrieben durch sogenannte binäre Sequenzen, eine Folge aus Nullen und Einsen. Daher wird die strukturierte Maske auch als binäre Maske bezeichnet. Grundsätzlich wären aber auch Bereiche mit verminderter Transmission, denen dann ein Zwischenzustand von z.B. „1/2" zugewiesen werden könnte, denkbar. Auch wenn die Erfindung im Folgenden am Beispiel von binären Masken erläutert wird, wären auch strukturierte Masken mit Zwischenzuständen denkbar. Diese Fluoreszenzsignale werden detektiert und ausgewertet, um Rückschlüsse auf Anzahl, Art, Intensität und Geschwindigkeit der einzelnen Partikel zu ziehen.

Ein solches Verfahren ist beispielsweise beschrieben in Kiesel et al., Appl. Phys. Lett. 94, 041 107- 1 (2009). Hierbei wird das gemessene Signal mittels eines Optimalfilters gefiltert, um eine Pulskompression zu erreichen, und dann nach der Zeit abgeleitet, um einen möglichen Signaloffset zu beseitigen. Bei dem sich dann ergebenden Signal wird ein fester Schwellwert zur Ereigniserfassung eingesetzt.

Das detektierte Signal ist naturgemäß unipolar, da es bei der Fluoreszenzemission keine negativen Amplituden geben kann. Genau genommen gilt dies natürlich nur für ideale Signale. In der Praxis verursacht elektronisches Rauschen u. U. auch negative Amplituden. Unter einem Optimalfilter wird ein Filter verstanden, welches ein gefiltertes Signal mit dem größten Signal-Rausch- Verhältnis liefert. Solch ein Filter hat für den Fall eines unipolaren Signals immer ausschließlich unipolare Filterkoeffizienten. Im Allgemeinen entspricht der Optimalfilter in seinem funktionalen Verlauf dem Signal auf das gefiltert werden soll, bis auf einen multiplikativen Vorfaktor, der auf alle Koeffizienten gleichermaßen angewandt werden kann. Die Verwendung von nicht-periodischen Masken bzw. Signalverläufen dient der Verbesserung des Signal-Rausch-Verhältnisses sowie der zeitlichen Pulskompression. Allerdings treten bei diesem Verfahren Signal-Nebenkeulen bei Korrelationssignalen auf, was die Entdeckungswahrscheinlichkeit schwach fluoreszierender Objekte in Gegenwart von größeren, stärker leuchtenden Objekten deutlich erschwert.

Zur Verdeutlichung wird auf die Figuren 1 bis 4 verwiesen. Figur 1 zeigt eine schematische Darstellung eines Messsignals in Abhängigkeit von der Zeit ohne Berücksichtigung des Rausch- und Offsetanteils. In Figur 2 sind die amplitudenmodulierten Rechtecksignale für zwei Teilchen dargestellt. Man erkennt, dass die Messsignale unterschiedlich große Strahlungsintensitäten besitzen. Das erste Signal besitzt die doppelte Amplitude des zweiten Signals. Durch Überlagerung ergibt sich ein drittes Niveau, welches 1 ,5 Mal den Wert des ersten Signals annimmt. Die Rechtecksignale für die einzelnen Partikel haben jedoch nicht nur unterschiedliche Amplituden, sie sind auch zeitlich (in X-Richtung) verschoben, d.h. es wird der Fall betrachtet, in dem zwei Partikel unterschiedlicher Lichtstärke und unterschiedlicher Ausdehnung kurz hintereinander an der binären Maske vorbeiwandern, so dass das Gesamtsignal, welches mit einem Detektor erfasst wird, eine Überlagerung der von den einzelnen Partikeln herrührenden Einzelsignale ist.

Dieses Signal wird üblicherweise mit einem Optimalfilter bearbeitet, wodurch sich das in Figur 3 dargestellte gefilterte Signal ergibt. Das Signal des ersten Teilchens ist deutlich zu erkennen, während das schwächere Signal des zweiten Partikels nur schwach ausgeprägt ist. Für eine automatisierte Teilchendetektion wird in der Regel ein Grenzwert festgelegt und Signale, die stärker als der festgelegte Grenzwert sind, werden als Teilchendetektion interpretiert. Insbesondere bei der Detektion von mehreren Teilchen mit unterschiedlichen Signalstärken ist dies jedoch nicht möglich. Beispielhaft sind in Figur 3 zwei Schwellwerte als gestrichelte Linien eingezeichnet worden. Wird der größere Wert als Schwellwert verwendet, wird lediglich das erste Partikel detektiert, da die Signalstärke des zweiten Partikels unterhalb des größeren Schwellwertes liegt. Wählt man stattdessen einen Schwellwert, der so klein ist, dass das zweite Partikel korrekt identifiziert wird, liegt jedoch das mit dem ersten Partikel verknüpfte Untergrundsignal ebenfalls über dem Schwellwert, so dass das erste Partikel gegebenenfalls fälschlich mehrfach gezählt wird.

Daher wird üblicherweise das gefilterte Signal nach der Zeit abgeleitet, wodurch das in Figur 4 gezeigte Signal erhalten wird. Das Signal weist keinen Offset mehr auf. Wieder ist das Signal des ersten Partikels (p1 ) gut zu erkennen, während das Signal des zweiten Partikels (p2) nur geringfügig größer ist als die Signale in den Nebenkeulen („sidelobes"). In der Figur ist beispielhaft ein Schwellwert eingezeichnet worden. Ist der Schwellwert zu hoch, wird das Signal des zweiten Teilchens nicht detektiert. Ist hingegen der Schwellwert zu niedrig, wird nicht nur das zweite Partikel detektiert, sondern es werden zusätzlich Peaks der Nebenkeulen, die in der Figur mit einer punktierten Linie hervorgehoben sind, fälschlicherweise als Ereignis erfasst.

Durch die Nebenkeulen des größeren bzw. helleren Objektes wird also im Zeitbereich, in dem die Nebenkeulen vorliegen, die untere Erkennungsschwelle für weitere, kleinere, d.h. dunklere, Objekte angehoben.

Der bislang übliche feste globale Schwellwert zur Ereigniserfassung, der auf das entsprechend abgeleitete und vorgefilterte Signal angewandt wird, besitzt daher den Nachteil, dass eine bestimmte minimale Signalenergie, d.h. ein Fluoreszenzsignal einer Mindestgröße, vorhanden sein muss, um ein Objekt detektieren zu können. Insbesondere bei einem breiten Größenspektrum von Objekten kommt es durch die starken Nebenkeulenamplituden bei einem zu gering gesetzten Schwellwert zu vielen Fehldetektionen. Ein höher gewählter Schwellwert macht die Entdeckung von kleineren Objekten vor dem Hintergrund der Nebenkeulen des größeren, stärker leuchtenden Objektes im Größenspektrum unmöglich.

Ausgehend von dem beschriebenen Stand der Technik ist es daher Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur Verfügung zu stellen, das deutlich verbessert ist und auch im Zeitbereich der Nebenkeulen eines größeren Objektes zuverlässig Signale kleinerer Objekte erfassen kann.

Erfindungsgemäß wird diese Aufgabe dadurch gelöst, dass das detektierte Signal S mit Hilfe eines mismatched Filters Fi verarbeitet wird und, wenn das derart gefilterte Signal D FI (S) ein vordefiniertes Schwellwertkriterium erfüllt, ein Partikel detektiert wird, und, wenn das derart gefilterte Signal das vordefinierte Schwellwertkriterium nicht erfüllt, kein Partikel detektiert wird.

Unter einem mismatched Filter wird ein Filter verstanden, welches nicht das größte Signal-Rausch- Verhältnis im gefilterten Signal ergibt. Da ein Optimalfilter, d. h. ein an das größte Signal-Rausch- Verhältnis Filter angepasste Filter, nur unipolare, z.B. nur positive Filterkoeffizienten aufweist, ist jedes Filter mit mindestens einem Filterkoeffizienten mit umgekehrtem Vorzeichen ein mismatched-Filter im Sinne dieser Anmeldung. Aber auch Filter mit ausschließlich unipolaren Filterkoeffizienten können mismatched-Filter sein, wenn sie nicht an das größte Signal-Rausch- Verhältnis angepasst sind. Es hat sich nämlich überraschenderweise gezeigt, dass die Signaldynamik deutlich verbessert werden kann, wenn gerade kein Optimalfilter verwendet wird, obgleich dadurch das Signal- Rausch-Verhältnis verschlechtert wird. Selbstverständlich kann auch ein gewichtetes Multilevel-Filter (multilevel mismatched) verwendet werden. Ein Mulitlevel-Filter bedeutet in diesem Zusammenhang, dass die Filterkoeffizienten nicht nur binäre Werte (Level) annehmen dürfen, sondern auch jeden beliebigen Zwischenwert (Multilevel).

In einem einfachen bevorzugten Fall kann ein mismatched-Filter aus einem Optimalfilter durch Subtraktion eines vorgegebenen Wertes (der ungleich Null ist) von allen Filterkoeffizienten errechnet werden. Dadurch wird der Offset verringert. Am besten wird der vorgegebene Wert auf die durchschnittliche Größe der Filterkoeffizienten des Optimalfilters bestimmt. Dann wird der Offset ohne Differenzierungsschritt entfernt.

Solch ein offsetkorrigierendes Filter beseitigt sowohl den konstanten Untergrund als auch den dreiecksförmigen Verlauf des Korrelationssignales und komprimiert die gesamte Signalenergie in das scharfe Hauptmaximum.

Der einfache, unipolare Filter F_j mit f_t = m_; > 0 wird ersetzt durch einen bipolaren Filter mit den Koeffizienten e {h > 0, l < 0}.

In einer bevorzugten Ausführungsform ist vorgesehen, dass das detektierte Signal S mit Hilfe einer Mehrzahl von unterschiedlichen digitalen mismatched-Filtern (F, , i=1 ,2,...) verarbeitet wird, um eine Mehrzahl von digital gefilterten Signalen DFI (S) (i=1 ,2,...) zu erzeugen, dass aus der Mehrzahl von digital gefilterten Signalen DF_I (S) (i= 1 ,2, ... ) anhand eines vorbestimmten Auswahlkriteriums ein bestes digital gefiltertes Signal ÜFbest ausgewählt wird und, wenn das beste digital gefilterte Signal ÜFbest ein vordefiniertes Schwellwertkriterium erfüllt, ein Partikel detektiert wird, und, wenn das beste digital gefilterte Signal ÜFbest das vordefinierte Schwellwertkriterium nicht erfüllt, kein Partikel detektiert wird.

Erfindungsgemäß wird somit ein Satz von unterschiedlichen mismatched-Filtern bereitgestellt und das detektierte Signal mit den unterschiedlichen mismatched-Filtern verarbeitet und aus den unterschiedlichen digital gefilterten Signalen dann eines als bestes gefiltertes Signal Ü Fbest ausgewählt und dieses für die Ereigniserfassung verwendet.

Das mismatched-Filter Fi kann an eine Partikelgeschwindigkeit vi und an die nicht-periodische, binäre Maske angepasst sein. Beispielsweise könnte eine übliche Partikelgeschwindigkeit gewählt werden und das theoretische Strahlungssignal aufgrund der gewählten nicht-periodischen, binären Maske berechnet werden. In einem weiteren Schritt kann dann das mismatched-Filter Fi so gewählt werden, dass das digital gefilterte Signal möglichst aus nur einem Peak und keinen Seitenkeulen besteht. Bewegt sich dann das Partikel mit der angenommenen Geschwindigkeit durch das Durchflusszytometer, so wird aufgrund des derart ermittelten mismatched-Filters ein deutliches Signal mit stark unterdrückten Nebenkeulen erzielt. Für ein solches Filter wird also sowohl eine hohe Pulskompression, als auch eine hohe Dynamik durch einen verbesserten Peak-zu-Nebenkeulen-Abstand erreicht.

In der Regel ist es jedoch nicht möglich, die exakte Geschwindigkeit der Partikel im Durchflusszytometer vorherzusagen. In der Praxis stellen sich hier Geschwindigkeitsvariationen ein, die nicht vernachlässigbar sind.

Da jedoch das mismatched-Filter an nur eine spezifische Geschwindigkeit angepasst ist, wird nur dann, wenn das Partikel in etwa die verwendete spezifische Geschwindigkeit aufweist, ein deutliches Signal ohne Nebenkeulen erhalten.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform wird eine Mehrzahl von mismatched-Filtern verwendet, die jeweils an eine Partikelgeschwindigkeit v, angepasst sind, wobei jedes mismatched- Filter an eine andere Partikelgeschwindigkeit v, angepasst ist. Wird nun ein Partikel mit unbekannter Geschwindigkeit durch das Durchflusszytometer geleitet, kann das detektierte Signal S mit Hilfe der Mehrzahl von unterschiedlichen digitalen mismatched- Filtern verarbeitet werden, um eine Mehrzahl von digital gefilterten Signalen zu erzeugen. Da jedoch nur dann ein deutliches Signal mit stark unterdrückten Nebenkeulen erhalten wird, wenn die Partikelgeschwindigkeit in etwa mit der bei der Entwicklung des mismatched-Filters verwendeten spezifischen Geschwindigkeit übereinstimmt, liefern die verschiedenen mismatched- Filter gefilterte Signale unterschiedlicher Qualität, d.h. Signale mit unterschiedlicher Peakhöhe. In der Regel wird die Filterung mit dem mismatched-Filtern das beste digital gefilterte Signal liefern, das an eine Partikelgeschwindigkeit v, angepasst wurde, die der tatsächlichen Geschwindigkeit v am nächsten liegt.

So kann in einer bevorzugten Ausführungsform die Geschwindigkeit v des Partikels dadurch näherungsweise bestimmt werden, dass die Geschwindigkeit, an die das mismatched-Filter, welches zu dem besten digital gefilterten Signal Ü Fbest führt, angepasst ist, als Partikelgeschwindigkeit festgelegt wird.

Es hat sich gezeigt, dass vorzugsweise die Länge des oder der mismatched-Filter mindestens der Länge des - mittels mismatched-Filter - zu filternden Signals entsprechen muss und ab der dreifachen Länge des - mittels mismatched-Filter - zu filternden Signals kaum noch Verbesserungen am Peak-zu-Nebenkeulen-Abstand zu beobachten sind.

Filter angegeben. Dabei bezeichnet M die Länge des erfassten Signals. Wird beispielsweise ein Signal mit einer Dauer von 5 Sekunden mit einer Abtastrate von 10/s abgetastet, ergibt sich eine Länge von 50. Wird dieses Signal direkt der mismatched-Filterung zugeführt, so muss das mismatched-Filter eine Mindestlänge von 50 (=M) haben. Bessere Ergebnisse werden jedoch mit längeren Filtern erzielt. Ein Filter mit einer Länge von mehr als 150 (=3M) bringt aber keine zusätzliche Verbeserung.

Wegen der guten Resultate bei moderatem Rechenaufwand ist für die meisten Anwendungsfälle die letzte Zeile mit einer optimalen mismatched-Länge von 3M zu bevorzugen.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform werden das mismatched-Filter oder die mismatched-Filter mittels einer Optimierung eines digital gefilterten Testsignals ermittelt, wobei als Testsignal ein für eine Partikelgeschwindigkeit v, und die verwendete binäre Maske zu erwartendes Signal verwendet wird. Mit anderen Worten wird das Testsignal digital gefiltert und der mismatched- Filter so lange optimiert, bis das digital gefilterte Signal eine optimale Form einnimmt. In einer bevorzugten Ausführungsform werden die mismatched-Filter mittels einer Maximierung des Peak-zu-Nebenkeulen-Verhältnis (PSLR) oder einer Minimierung des integrierten Nebenkeulen-zu-Peak-Verhältnis (ISLR) des digital gefilterten Testsignals ermittelt. In der Praxis hat sich gezeigt, dass die Minimierung des integrierten Nebenkeulen-zu-Peak-Verhältnis das etwas bessere Ergebnis ergibt. Die Umgebung des Hauptpeaks ist für das ISLR weniger wellig, da die Betragsquadrate der Abweichungen in die Optimierung eingehen. Beim PSLR werden die größtmöglichen positiven (maximalen) Ausschläge wegoptimiert. Dies kann dann zur Folge haben, dass negative Ausreißer auftreten, die sich wiederum mit Hauptpeaks andere Signale überlagern können. Bei der Optimierung auf das ISLR erscheint die Umgebung des Hauptpeaks homogener. Mit anderen Worten werden die Koeffizienten des mismatched-Filters solange variiert, bis das integrierte Nebenkeulen-zu-Peak-Verhältnis minimal wird.

In einer bevorzugten Ausführungsform wird als vorbestimmtes Auswahlkriterium ein relativer Schwellwert verwendet.

Es hat sich gezeigt, dass trotz der erfindungsgemäßen Verwendung von mismatched-Filtern Nebenpeaks aufgrund von Interferenzen zwischen verschiedenen Filterkanälen auftreten können. Diese Interferenzen sind umso größer, je größer die Signalenergie eines Objektes ist. Mit Vorteil wird daher ein relativer Schwellwert berechnet, um unabhängig von der Signalenergie die Falschdetektionsrate konstant zu halten.

Ein solches Verfahren ist aus der Radartechnik bekannt, wird dort als„Constant False Alarm Rate Detection" bezeichnet. Dieses Verfahren muss jedoch auf den vorliegenden Fall der Partikeldetektion angepasst werden.

Beispielsweise wird zur Detektion das Ausgangssignal eines„cell-averaging" CFARs (CACFAR), eine„cell averaging greatest of" CFAR (CAGO CFAR) oder eines„ordered statistic" CFARs (OS CFAR) verwendet. Beispiele hierfür werden später beschrieben.

Die genannten Erfassungstechniken sind beschrieben in„Radar CFAR Thresholding in Clutter and Multiple Target Situations", Hermann Rohling, IEEE Transactions on Aerospace and electronic Systems, Vol. AES-19, No. 4, July 1983. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist vorgesehen, dass v < v,₊i gewählt wird, dass aus der Mehrzahl von unterschiedlichen mismatched-Filtern (F, , i=1 ,2,...) eine Untergruppe von mismatched-Filtern (F, , i= (k + c x i) mit einer Konstanten k und einem Faktor c) ausgewählt wird, und dass das detektierte Signal S mit Hilfe der Untergruppe von unterschiedlichen mismatched- Filtern (Fi , i=1 ,2,...) verarbeitet wird, um eine Mehrzahl von digital gefilterten Signalen DFI (S) (i= 1 ,2, ... ) zu erzeugen. Aus der Mehrzahl von digital gefilterten Signalen DR (S) (i= 1 ,2, ... ) wird dann anhand eines vorbestimmten Auswahlkriteriums ein bestes digital gefiltertes Signal Ü Fbest ausgewählt. In einem weiteren Schritt wird eine weitere Untergruppe von digitalen mismatched- Filtern (Fi , i( Best-c ....Best+c) ausgewählt, deren Elemente auf Basis von Partikelgeschwindigkeiten ermittelt wurden, die in einem vorbestimmten Intervall um die Partikelgeschwindigkeit liegen, an welche der ausgewählte beste mismatched-Filter angepasst wurde. Der Verarbeitungsschritt und der Auswahlschritt wird dann erneut unter Verwendung der weiteren Untergruppe durchgeführt und wenn das beste digital gefilterte Signal ÜFbest ein vordefiniertes Schwellwertkriterium erfüllt, wird ein Partikel detektiert, und, wenn das beste digital gefilterte Signal ÜFbest das vordefinierte Schwellwertkriterium nicht erfüllt, wird kein Partikel detektiert.

Insbesondere dann, wenn die Auflösung des erfindungsgemäßen Verfahrens weiter erhöht werden soll, müssen eine große Zahl von unterschiedlichen mismatched-Filtern verwendet werden, die jeweils an unterschiedliche Partikelgeschwindigkeiten angepasst sind. Ist beispielsweise mit Partikelgeschwindigkeiten zwischen 3 und 6 m/s zu rechnen, könnten mismatched-Filter für die Geschwindigkeiten 3, 3,1 , 3,2, 5,8, 5,9 und 6 m/s verwendet werden. Allerdings müsste dann das detektierte Signal parallel mit 31 unterschiedlichen mismatched-Filtern verarbeitet werden, was die notwendige Rechenleistung stark erhöht.

Gemäß einer Ausführungsform wird daher diese Rechnung zunächst nur für eine Untergruppe der mismatched-Filter durchgeführt. In dem genannten Beispiel könnte beispielsweise die digitale Filterung zunächst mit Hilfe der mismatched-Filter, die an die Geschwindigkeiten 3, 4, 5 und 6 m/s angepasst sind, erfolgen. Wenn sich hier jetzt beispielsweise zeigt, dass der an die Geschwindigkeit von 4 m/s angepasste mismatched-Filter das beste Ergebnis zeigt, wird das Signal erneut mit einer Untergruppe von digitalen mismatched-Filtern gefiltert, die beispielsweise an die Geschwindigkeiten 3,5, 3,6, 4,0, 4,4, 4,5 m pro Sekunde angepasst sind. Es wird dann erneut das beste digitale Signal ausgewählt, um die Ereignisdetektion durchzuführen. Durch das beschriebene Verfahren erfolgt somit zunächst eine Art Grobrasterung und sobald bestimmt wurde, in welchem Geschwindigkeitsbereich sich die tatsächliche Partikelgeschwindigkeit befindet, wird in diesem Bereich eine Feinrasterung durchgeführt. Dies reduziert den Rechenaufwand für dieses Beispiel von anfänglich 31 auf 4+1 1 =15 Kanäle. Alternativ dazu könnte ein bekannter Funktionenverlauf (z.B. quadratisch) an die Grobrasterung angepasst werden (Fit), um das Maximum zu finden.

In einigen Anwendungsfällen kann es von Vorteil sein, wenn das detektierte Signal zunächst mit einem Optimalfilter vorgefiltert wird und dann mit einem mismatched-Filter weiterverarbeitet wird. Auch kann es in manchen Anwendungsfällen von Vorteil sein, wenn das per Optimalfilter vorgefilterte Signal nach der Zeit abgeleitet wird und dann mit dem mismatched-Filter verarbeitet wird. Grundsätzlich können jedoch sowohl die Funktionen des Optimalfilters als auch der Ableitung nach der Zeit von dem mismatched-Filter mit übernommen werden. Weitere Vorteile, Merkmale und Anwendungsmöglichkeiten der vorliegenden Erfindung werden deutlich anhand der folgenden Beschreibung eines bevorzugten Verfahrens und der zugehörigen Figuren. Es zeigen: Figur 1 eine vereinfachte Form eines Messsignals mit der Amplitude 1 ohne Rauschen und Offset,

Figur 2 eine vereinfachte Darstellung eines überlagerten Messsignals,

Figur 3 das mit einem Optimalfilter gefilterte Signal,

Figur 4 das differenzierte Signal von Figur 3

Figur 5 eine schematische Querschnittsdarstellung eines Durchflusszytometeraufbaus,

Figur 6 schematische Darstellungen von Signalauswertungsketten,

Figur 7 ein Beispiel für optimierte Filterkoeffizienten,

Figur 8 ein mit einem mismatched-Filter gefiltertes Signal,

Figur 9 eine Simulation der Erkennungsraten eines Durchflusszytometers für verschiedene

Fälle der Signalerzeugung und Auswertung,

Figur 10 eine 2D-Darstellung einer beispielhaften Messung,

Figur 1 1 eine schematische Darstellung des CFAR-Prinzips,

Figur 12 eine schematische Darstellung des erwarteten Signals und der Filterkoeffizienten für die Signalauswertungskette K5,

Figur 13 eine schematische Darstellung des gemäß Signalauswertungskette K5 gefilterten

Signals,

Figur 14a die Filterkoeffizienten eines Optimalfilters,

Figur 14b die Filterkoeffizienten eines offsetkorrigierenden Filters und

Figur 15 das mittels offsetkorrigierenden Filters gefilterte Signal.

Das erfindungsgemäße Verfahren wird am Beispiel eines Durchflusszytometers, wie es schematisch in Figur 5 gezeigt ist, erläutert. Die Figur 5 zeigt einen Querschnitt. Das Durchflusszytometer weist einen auf einem Substrat 1 aufgebrachten Mikrokanal 2 auf, durch den fluoreszierende Objekte 3 bewegt werden. Dabei erreichen sie eine Anregungszone 4, welche mittels beispielsweise eines Laserstrahls beleuchtet wird, wodurch die Objekte angeregt werden und fluoreszierende Strahlung emittieren. In diesem Bereich ist ein optisches Amplitudengitter 5, d.h. ein nicht-periodisches, binäres Filter 5 vorgesehen, durch welches Fluoreszenzstrahlung austreten kann, welche über den optischen Filter 6 auf den Detektor 7 gelangt. Dort wird im Wesentlichen das in Figur 2 oben gezeigte Signal empfangen. Das Signal besteht somit aus verschiedenen Rechteckpulsen, deren Breite der Breite der Öffnungen im binären Filter entsprechen.

In Figur 6 sind schematisch 5 Signalauswertungsketten K1 - K5 dargestellt. Die erste Signalaus- wertungskette K1 beschreibt den Stand der Technik. Die weiteren Signalauswertungsketten K2 - K5 sind Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung. Die einzelnen Komponenten der Signalauswertungsketten können die folgenden Aufgaben wahrnehmen: A: Datenerfassung, B: SNR-Optimierung und Pulskompression, C: Offset- Eliminierung, D: Nebenkeulenreduzierung und E: Partikeldetektion. Allen Signalauswertungsketten gemein ist ein Analog-Digital-Wandler 8 für die Datenerfassung. Das Signal besteht aus einzelnen Messpunkten s_;, die im zeitlichen Abstand dt kontinuierlich aufgezeichnet werden. Für die Signalverarbeitung wird aus dem Signal jeweils nach Erfassung eines neuen Messpunktes k ein Ausschnitt der Länge N_j herausgenommen, wobei für die Abdeckung des Laufzeitbereichs der Partikel unterschiedliche N_j gewählt werden können. Der Signalausschnitt hat zum Zeitpunkt t_k die allgemeine Form

Sj(tk) ⁼ Sjk ⁼ (sk-Nj + ^sk-Nj+2>■■■ > ^sk ) ⁼ B fk) + R tk) + A^■ (m_k__Nj+1, m_k__N .₊₂, ... , m_k

(m_; e {0,1})). Die Signalverarbeitung kann beginnen, sobald die ersten N_j Messpunkte eingelaufen sind und das Signal somit vollständig vorliegt. Das Signal enthält einen Rauschanteil (R(t_k) = (r_k__Nj+1, r_k__Nj+2, ... , r_k )) und einen Offsetanteil (B(t_k) = (b_k__Nj+1, b_k__Nj+2, ... , ö_k )). Solange der Offsetanteil zeitlich konstant ist, gilt: b_k__Nj+1 = b_k__Nj+2 = ... = b_k. A - (m_k__Nj+1, m_k__Nj+2, ... , m_k ^ ist das gesuchte Partikelsignal. Zu Zeitpunkten an denen sich ein Partikel vor einer Öffnung der Maske befindet, liefert das Partikel einen Beitrag m_k > 0. Der Vorfaktor A gibt die Amplitude des Partikelsignals wieder.

An den Flanken des Signals ergeben sich im Allgemeinen Abrundungen durch die endliche Ausdehnung der Partikel bzw. Objekte und durch die optische Abbildung auf den Detektor. Außerdem kann die Amplitude entlang des Signals schwanken, da z.B. das Anregungslicht entlang des Partikelpfades inhomogen in seiner Intensität verteilt ist. Eine schematische Darstellung eines Messsignals in Abhängigkeit von der Zeit ohne Berücksichtigung des Rausch- und Offsetanteils ist in Figur 1 dargestellt. Wie bereits eingangs beschrieben, ist es bekannt (K1 ), die erfassten Daten mit Hilfe eines Optimalfilters 9 zu filtern, um die Pulskompression zu erhalten und das SNR zu optimieren.

Das Signal kann hierzu beispielsweise mit einem Optimalfilter korreliert werden, dessen Filterkoeffizienten exakt dem erwarteten idealen Signalverlauf entsprechen. D.h. der Filter hat die allgemeine Form: ^Fj = ^Ki^■ (fjl> fj2 fjNj ) . (fji ^e i⁰'!}).

Wenn der Filter so gewählt wird, dass er dem exakten Signalverlauf entspricht, gilt: j = m_;. Der Kalibrierfaktor K_j kann dazu verwendet werden, die aus der Korrelation resultierende Amplitude auf die Signalintensität zu kalibrieren. Da die Signallänge nicht notwendigerweise bekannt ist, werden verschiedene Filterlängen N_j „ausprobiert". Die Korrelation erfolgt nach der Rechenvorschrift:

Nj

C_j(t_k) ⁼ S_jk X F_j = ^ S_k__{Nj+ i} ^■ K_j ^■ fji

i=l Die Filterlängen werden ausprobiert, da unterschiedliche lange Signalsequenzen vorliegen, was auf die unterschiedlichen Geschwindigkeiten der Partikel zurückzuführen ist. Für eine feste Gesamtlänge der physikalischen Modulationsmaske L und der Abtastzeit T_s eine Gesamtlänge der Signalsequenz

L

¹ Vj X T_s

Die Vorbeiflugzeit eines Partikels mit Geschwindigkeit v_j an einer einzigen Öffnungen ist dann gegeben mit τ,- und entspricht einer gewissen Anzahl an Signalsamples, die für diese Geschwindigkeit, physikalischen Maskenlänge und Abtastrate spezifisch ist. Die Gesamtbeobachtungsdauer für ein solches Partikel ist dann gegeben mit

T_j = M_jTs

Die Anwendung einer solchen Korrelationstechnik in Verbindung mit binären Modulationssequenzen hat zwei wesentliche Gründe:

1 ) Verbesserung des Signal-zu Rauschen Verhältnisses (Signal to noise ratio, SNR) 2) Pulskompression

Zu 1 ) Wie oben beschrieben, besteht das Gesamtsignal, das während der Beobachtungsdauer 7} vorliegt aus dem Anteil des tatsächlichen Signals, dem (konstanten) Offset und der Rauschamplitude mit Erwartungswert Null und gegebener Standardabweichung σ. Alle Signalanteile können als additiv angesehen werden und der eigentliche absolute Signalanteil kann erheblich kleiner sein als das Offsetsignal und die Standardabweichung der Rauschamplitude. Ein quasi zeitkontinuierlicher Korrelationsprozess sorgt dann dafür, dass, genau dann wenn der Filter mit dem zu erwartenden Signal resonant (deckungsgleich) ist, die zeitlich verteilte Gesamt- Signalamplitude gewichtet (d.h. per Multiplikation) integriert (aufsummiert) C_j(t_k) wird: Während ein zeitlich unveränderter Offset immer den gleichen Beitrag C °^ft (t_k) zum Korrelationsergebnis liefert, variiert der Signalbeitrag je nach dem, wieviele„Einsen" (m_m > 0) der Modulationssequenz zu diesem Zeitpunkt deckungsgleich mit den entsprechenden Filterkoeffizienten sind. Das eigentliche Nutzsignal liefert also ein Wechsel-Signal, das dem korrelierten Offsetsignal C_; ⁰ (t_k) additiv aufmoduliert ist. Da aber auch unterhalb des Nutzsignal erhebliche DC-Anteile enthalten sind, ergibt sich beim Korrelationsprozess ein zusätzliche Offsetanteil, der eine dreieckige Form aufweist und charakteristisch für die jeweilige Modulationssequenz ist (Figur 3). Der größte Ausschlag für das korrelierte Nutzsignal ist dann zu erwarten, wenn das Nutzsignal komplett eingelaufen und deckungsgleich mit den Filterkoeffizienten ist. Die Ausgangsspannung des Filters ist dann ein Maß für die Signalenergie (Äj x 7}), die über die Beobachtungszeit auf dem Detektor deponiert wurde. Das Rauschsignal hingegen, das einen zeitlichen Mittelwert von Null besitzt, wird durch die Integration stark gedämpft. Diese Dämpfung ist umso stärker, je länger die Integration stattfindet, sprich je länger 7} ist. Eine lange Integrationszeit 7), die alleine durch die vergrößerte Detektionszone ohne Modulation ebenfalls erreichbar wäre, brächte jedoch den Nachteil mit sich, dass sich das zeitliche/räumliche Auflösungsvermögen der Apparatur verschlechtert. Aus diesem Grund werden spezielle binäre Modulationssequenzen verwendet (anstatt einer einzigen großen Öffnung), die während des Korrelationsprozesses zusätzlich zu einer Pulskompression führen.

Zu 2) Wie bereits erläutert, wird bei einer vergrößerten Detektionszone mehr Fluoreszenzlicht, sprich Energie, auf dem Detektor deponiert. Durch Integration kann diese Signalenergie dann als vor einem überlagerten Rauschhintergrund sichtbar gemacht und ein Partikelsignal somit detektiert werden, während die Rauschamplitude ihrerseits gedämpft wird. Würde man die Detektionszone stetig vergrößern, könnte man so ein beliebig gutes SNR für einzelne Partikel erzeugen. Mit einer Vergrößerung der Detektionszone steigt jedoch auch die Wahrscheinlichkeit, dass sich mehrere Partikel in der Detektionszone befinden können, sodass eine Unterscheidbarkeit zwischen diesen Partikeln ab einer gewissen Größe der Detektionszone unmöglich wird. Aus diesem Grund wird die Detektionszone zusätzlich, gemäß einer binären Sequenz, strukturiert, wobei es wie eingangs beschrieben Bereiche gibt, in denen das Fluoreszenzlicht abgeschattet wird und solche, in denen es transmittiert wird und auf den Detektor treffen kann. Diese Sequenzen sind so optimiert, dass ein Korrelationsprozess zwischen Nutzsignal und entsprechendem Filter nur dann die volle Signalenergie am Ausgang anzeigt, wenn Signal und Filter zeitlich exakt deckungsgleich sind. Für alle anderen Zeitpunkte sind die Sequenzen so gewählt, dass ein möglichst geringer Überlapp zwischen den „Einsen" des Signals und den „Einsen" der Filterkoeffizienten besteht und das Korrelationssignal verhältnismäßig niedrig ist. Trotzdem lassen sich Schwankungen nicht ganz vermeiden und es kommt neben einem charakteristischen dreieckförmigen Offset zu sogenannten Signal-Nebenkeulen. Für den Zeitpunkt des vollständigen Signaleinlaufs und damit der Deckungsgleichheit aus Signal und Filter, ist dennoch ein hoher Ausschlag (Peak) am Filterausgang zu erwarten, der sich deutlich von seiner Umgebung abhebt. Die zeitliche Breite dieses Peaks entspricht dabei gerade τ,- , also der Zeit, die das Partikel zum Passieren einer kleinsten Maskenöffnung benötigt. Je kleiner die Strukturen der Schattenmaske sind, d.h. je mehr Einsen und Nullen auf die Länge L kommen, desto schärfer ist der zu erwartenden Peak. Diese Technik wird als Pulskompression bezeichnet und hängt direkt mit der Länge der gewählten binären Sequenz zusammen (je mehr Öffnungen auf L kommen, desto kleiner werden die Öffnungen und damit τ_;). Zusammengefasst bedeutet dies, das bei der Pulskompression die Signalenergie, die zunächst auf die Gesamtdauer des Signals entsprechend der Codierung verteilt ist, in einen zeitlich wesentlich kürzeren Einzelpuls komprimiert wird.

Für verschiedene Geschwindigkeitskanäle kommt es vor, dass auch benachbarte Kanäle den Effekt der Pulskompression auslösen. Da die Filterkoeffizienten jedoch zunehmend unpassender werden (off-resonant), fällt die Signalamplitude am Filterausgang rasch mit der Verstimmung ab. Der Kanal, der die beste Passung besitzt, liefert daher das stärkste Korrelationssignal das später für die Weiterverarbeitung gewählt wird.

Es ist weiterhin bekannt, das mittels Optimalfilters 9 bearbeitetet Signal abzuleiten 10 und das Ergebnis der Partikeldetektion 1 1 zuzuführen, welche einen festen Schwellwert verwendet. Das erhaltene Korrelationssignal kann beispielsweise diskret abgeleitet werden, um den im Korrelationssignal enthaltenen Offset C °^ff(t_k) und den für das Signal charakteristischen, dreieckigen Offset (Figur 2), zu eliminieren. dC_]it_k) = C_] (t_k) - C_j(t_k_₁)

Dies liefert eine charakteristische Signalform in der einem Minimum direkt ein Maximum folgt oder umgekehrt. Die beste Passung zwischen Signalausschnitt und angenommener Filterlänge N_j liefert das stärkste abgeleitete Korrelationssignal das daher für die Weiterverarbeitung verwendet, indem z.B. ein Schwellwert zur Partikeldetektion angewendet wird.

Erfindungsgemäß wird nun ein mismatched-Filter, also ein Nichtoptimalfilter verwendet, der zwar dazu führt, dass das Signal-Rausch-Verhältnis minimal verschlechtert wird, jedoch die Erkennungsrate durch eine deutlich erhöhte Peak-zu-Nebenkeulen Dynamik verbessert. In einer ersten bevorzugten Ausführungsform (K3) wird daher ein Filter verwendet, dessen Filterkoeffizienten sich aus den Filterkoeffizienten eines Optimalfilters berechnen, in dem von den Filterkoeffizienten des Optimalfilters das arithmetische Mittel der Filterkoeffizienten des Optimalfilters abgezogen wird. Dieser auch als offsetkorrigierende Filter 15 bezeichnete Filter hat auch negative Filterkoeffizienten. Durch diese Maßnahme kann auf die Differenzierung des Signals verzichtet werden, wodurch die Erkennungsrate deutlich verbessert wird. Der offsetkorrigierende Filter übernimmt daher die Aufgaben B und C (s. Signalauswertungskette K3 in Figur 6).

In Figur 9 ist die prozentuale Erkennungsrate über dem Signal-Rausch-Verhältnis für Messungen am Einzelspalt (♦), für Messungen des Standes der Technik mit einer binären Maske (■) und für Messungen mit Verwendung eines offsetkorrigierenden Filters (A) dargestellt. Man erkennt, dass bei Verwendung eines Einzelspaltaufbaus die Erkennungsrate für Signal-Rausch- Verhältnisse von kleiner als 2 deutlich abfällt. Durch die Verwendung der binären Maske kann selbst bei einem Signal-Rausch-Verhältnis von 0,6 oder besser noch eine Erkennungsrate von nahezu 100 % erreicht werden. Sinkt das Signal-Rausch-Verhältnis jedoch unter 0,6 erfolgt keine zuverlässige Erkennung mehr. Durch die erfindungsgemäße Verwendung eines offsetkorrigierenden Filters kann jedoch selbst bei einem Signal-Rausch-Verhältnis von etwa 0,35 noch eine sehr hohe Erkennungsrate erzielt werden.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform kann auf das Entscheidungselement 1 1 mit festem Schwellwert verzichtet werden und stattdessen das Signal zur weiteren Dynamikoptimierung an einen mismatched-Filter 12 geleitet werden, dessen Ausgang über ein CFAR-Element mit einem adaptiven Schwellwert 13/14 belegt wird (siehe Signalauswertungskette K2 von Figur 6).

In weiteren Ausführungsformen ist es auch möglich, das mismatched Filter 12 der Signalauswertungskette K2 durch ein offsetkorrigierendes mismatched Filter 16 zu ersetzen, so dass das Differenzieren entfallen kann (Signalauswertungskette K4), oder das mismatched Filter 12 durch ein mismatched Filter 17 zu ersetzen, welches die Aufgabe des Optimalfilters 9 und des Differenzzierglied 10 ebenfalls übernimmt, so dass diese Elemente entfallen können (siehe Signalauswertungskette K5).

Beispielhaft ist in Figur 12 für das Verfahren gemäß der Signalauswertungskette K5 sowohl die Amplitude des erwarteten Signals als auch die optimierten Filterkoeffizienten in willkürlichen Einheiten über der Zeit dargestellt. Man erkennt, dass der Filter 3 mal so lang ist, wie das erwartete ideale Signal. Das ideale Signal hat die Länge 81 . In Figur 13 ist dann das derart gefilterte Ausgangssignal dargestellt. Die beiden Partikelpeaks sind deutlich zu erkennen. Die Nebenkeulen sind deutlich unterdrückt. Zur Verdeutlichung des Verfahrens gemäß der Signalauswertungskette K2 sind in Figur 14a die Filterkoeffizienten eines sich für ein zu filterndes Signal geeignetes Optimalfilter dargestellt. Erfindungsgemäß wird jedoch gerade kein Optimalfilter verwendet, sondern zum Beispiel ein offsetkorrigierendes Filter. Die Filterkoeffizienten eines solchen offsetkorrigierenden Filters sind in Figur 14b dargestellt. Die Filterkoeffizienten sind aus den Filterkoeffizienten des Optimalfilters durch Subtraktion des geometrischen Mittels der Filterkoeffizienten des Optimalfilters errechnet worden. Bei der Verwendung des offsetkorrigierenden Filters erhält man das in Figur 15 gezeigte gefilterte bzw. korrelierte Signal. Ein nachfolgender Ableitungsschritt, welcher das Rauschen noch verstärkt kann dadurch vermieden werden.

Die vorliegende Erfindung ist während der Entwicklung eines miniaturisierten Durchfluss- zytometers entstanden. Die Kernidee zur Partikelidentifikation besteht dabei in der Verwendung einer nicht-periodischen binären Maske, d.h. einem Amplitudengitter, die das Fluoreszenzlicht angeregter Partikel entsprechend amplitudenmoduliert. Insbesondere bei miniaturisierten Objekten ist die Signalaufbereitung aufgrund der geringen Signalstärke besonders wichtig.

Wie bereits erläutert, besitzen abgeleitete Signale in der Regel starke Signalnebenkeulen. Diese sind spezifisch für die Intensität und die Geschwindigkeit der passierenden Partikel. Im Grunde genommen kann man sie daher in ihrer Gesamtstruktur als „Fingerabdruck" der Partikel bezeichnen. Ein einfacher globaler (fester) Schwellwert kann grundsätzlich auf eine vorgewählte Signalamplitude so eingestellt werden, dass Objekte mit entsprechender Signalenergie nachgewiesen werden können. Ein globaler Schwellwert berücksichtigt jedoch nur die maximale Amplitude, nicht jedoch die charakteristische Gesamtsequenz eines Partikels. Erfindungsgemäß wird daher die Gesamtsequenz, d.h. der vollständige „Fingerabdruck" des Partikelsignals berücksichtigt. Dies erfolgt mit Hilfe von mismatched-Filtern, d.h. zum Beispiel mit Transversalfiltern mit endlicher Impulsantwort.

Da das Autokorrelationssignal eines binären Signals immer eine Länge von 2N-1 besitzt, wobei N die Länge des binären Ursprungssignals ist, liefert eine zeitkontinuierliche Ableitung des Signals erneut ein Signal mit der Länge 2N. Für die Weiterverarbeitung durch einen Filter unter Berücksichtigung des charakteristischen Gesamtsignals muss daher die Länge eines entsprechend angepassten Filters mindestens der Länge des zu behandelnden Signals entsprechen. Längere Filterstrukturen, die ein Vielfaches dieser Grundlänge besitzen, können die Unterdrückung der Signalnebenkeulen weiter verbessern. Im Folgenden wird jedoch exemplarisch ein mismatched-Filter der Länge 2N beschrieben. Die zeitlich scharfe Detektion eines Objektes hängt direkt mit dem Maß an Pulskompression zusammen. Wird diese durch einen längeren Binärcode erhöht, erhöht sich zum Einen die räumliche Lokalisierungsgenauigkeit des Objektes im Kanal, zum Anderen können Einzelpartikel selbst in Gegenwart vieler anderer Partikel identifiziert werden. Trotz der hohen zeitlichen Auflösung bietet das erfindungsgemäße Verfahren den Vorteil, einen hohen Signal-Rausch- Abstand gewährleisten zu können.

Der Filterausgang des gewichteten mismatched-Filters sollte für ein spezifisches Eingangssignal bestenfalls ein deltaformiges Ausgangssignal liefern (zeitlich scharf begrenzt) mit einer vergleichsweise großen Peakhöhe (im Verhältnis zu den Nebenkeulen) und in einem festen Verhältnis der Peakhöhe zur Energie des Ursprungssignals.

In einer Ausführungsform wird daher das gewichtete Filter bzw. dessen Filterkoeffizienten dadurch bestimmt, dass zunächst ein Testeingangssignal für eine bestimmte Partikelgeschwindigkeit unter Zugrundelegung der verwendeten binären Maske entwickelt wird. Dieses Testsignal wird mit Hilfe des digitalen Filters gefiltert und das gefilterte Signal optimiert, indem die Filterkoeffizienten verändert werden. Solch eine Optimierung kann in Form einer globalen Optimierungsroutine durchgeführt werden. Globale Optimierungsroutinen suchen immer nach dem globalen Minimum einer problemspezifischen Minimierungsfunktion und werden in vielen Instanzen ausgeführt, um eine Konvergenz gegen lokale Minima zu vermeiden. Minimierungsfunktionen können beispielsweise das Nebenkeulen-zu-Peak- Verhältnis (PSLR)

¹ I I

PSLR = (max . „ R. )

R oder das integrierte Nebenkeulen-zu-Peak-Verhältnis (ISLR)

1

ISLR = Σ _t „ R_t

R sein, wobei Rk die zeitdiskreten Ausgangssignale des vorgefilterten Signals bei festen Filterkoeffizienten bezeichnen. R₀ ist der Wert, der sich ergibt, wenn das Eingangssignal im zeitlichen Verlauf die gesamte Filterlänge zum Zeitpunkt to einnimmt.

Für nicht-periodische Rechteckmuster, wie sie sich bei dem Durchflusszytometer ergeben, hat sich gezeigt, dass die besten Ergebnisse unter Minimierung des ISLR erzielt werden können. Eine Optimierung kann beispielsweise mit Hilfe des Programms LabView durchgeführt werden. In Figur 7 sind beispielhaft die optimierten Filterkoeffizienten (Y-Achse) für einen gewichteten Filter für ein abgeleitetes Korrelationssignal der Länge 162 (binäres Ursprungssignal der Länge 81 ) gezeigt. (Das binäre Ursprungssignal entspricht dem in Figur 12 gezeigten Signal.) Es ergeben sich hier 162 Koeffizienten (=2M). Man erkennt sofort, dass die Filterkoeffizienten völlig von der mathematischen Darstellung der binären Maske abweichen. Der zugehörige Signalverarbeitungspfad ist Pfad 2 in Figur 6.

Wie bereits eingangs ausgeführt, ist der ausschlaggebende Grund für die Entwicklung einer erweiterten Signalprozesskette die Schwellwertproblematik für ein Mehrpartikelsignal. In der in Figur 8 gezeigten Darstellung wird qualitativ gezeigt, wie sich ein gewichteter Filter auf das in Figur 2 gezeigte Signal auswirkt. Man erkennt, dass sich aus den Amplituden des Hauptpeaks nach der Anwendung des gewichteten digitalen Filters die Partikelintensität aus den verwendeten Filterkoeffizienten gewinnen lässt. Es ist bereits hier zu erkennen, dass die Nebenkeulen deutlich unterdrückt sind, sodass die Gefahr, dass zu viele falsche Ereignisse detektiert werden oder Ereignisse mit geringer Strahlungsintensität übersehen werden, minimiert wird.

In der Praxis weisen die Partikel jedoch aufgrund ihrer unterschiedlichen Größe und des Strömungsprofils in den Mikrokanälen unterschiedliche Geschwindigkeiten auf. Entsprechend der maximal zu erwartenden Geschwindigkeit muss daher die Abtastrate des Analog-Digital-Wandlers angepasst werden, um den Geschwindigkeitsbereich entsprechend quantisieren zu können. Dies ermöglicht zudem eine hohe Flankensteilheit des binär modulierten Messsignals und damit eine hohe zeitliche Auflösung. Der Binärcode kann sich dabei auf viele 100 bis 1000 Abfragen für ein Teilchen ausdehnen, was viele Filterkanäle, die an die jeweilige Gesamtabfragezahl angepasst sind, erfordert. Während ein binäres Signal leicht gestaucht und gestreckt werden kann, muss ein Filter, das im Allgemeinen gebrochen rationale Werte enthält, auf die Messsignalstellen entsprechend extrapoliert werden. Eine lineare Extrapolation hat sich für den konkreten Fall als die beste Variante herausgestellt. Um das Problem der unterschiedlichen Geschwindigkeiten zu lösen, werden daher gewichtete digitale Filter für eine Vielzahl von unterschiedlichen Geschwindigkeiten entwickelt und diese in unterschiedlichen Geschwindigkeitskanälen verwendet. Dabei kann - wie oben beschrieben - die Optimierung für jeden einzelnen mismatched-Filter separat erfolgen. Alternativ - und in den meisten Fällen bevorzugt - kann nur für eine Partikelgeschwindigkeit mittels der beschriebenen Optimierung der geeignete mismatched-Filter bestimmt werden, und die mismatched-Filter für die anderen Partikelgeschwindigkeiten aus einer geeigneten Extrapolation der Filterkoeffizienten bestimmt werden. Es hat sich nämlich gezeigt, dass durch Stauchung oder Streckung eines für eine Partikelgeschwindigkeit optimierten Filters nahezu optimierte Filter für andere Partikelgeschwindigkeiten ermittelt werden können. Dadurch wird der für die Optimierung notwendige Rechenaufwand deutlich reduziert.

In Figur 10 ist der Ausgang eines gewichteten Filters auf 400 Geschwindigkeitskanälen (y-Achse) für ein Einpartikelsignal gezeigt. In x-Richtung ist die Zeit aufgetragen. Im Grunde genommen wird das gleiche zeitliche Messsignal in 400 unterschiedlichen Geschwindigkeitskanälen mit 400 unterschiedlichen gewichteten digitalen Filtern verarbeitet. Die entsprechenden Auswerteergebnisse sind in Figur 10 dargestellt. Tatsächlich sind die meisten Filter nicht an die Partikelgeschwindigkeit angepasst (d. h. sind nicht resonant zur Geschwindigkeit) und führen daher zu Signalen mit großem Hintergrund. Diese sind in den mit der Bezugszahl 18 gekennzeichneten Bereichen zu erkennen.

Diese sogenannten„mismatched"-gefilterten Signale weisen eine gewisse Interferenzstruktur auf. Diese Struktur verjüngt sich, wie in Figur 10 deutlich zu erkennen ist, zu der tatsächlichen Teilchenposition 19 hin bis sie schließlich nahezu verschwindet. Es lässt sich somit anhand von Figur 10 bereits erkennen, dass das erfasste Partikel eine Partikelgeschwindigkeit hat, die im Wesentlichen der Geschwindigkeit entspricht, an die der im Geschwindigkeitskanal 125 verwendete mismatched-Filter angepasst wurde. Diese Form kann für einen CFAR-Detektor ausgenutzt werden.

Ein CFAR-Detektor besteht im Wesentlichen aus einer gewissen Zahl von Speicherzellen, die als „First In - First Ouf-Speicher (FIFO) fungieren, ähnlich einem digitalen Transversalfilter. Den beteiligten Zellen werden dabei verschiedene Funktionen zugeschrieben: 1. untersuchte Zelle („cell under test" oder „CUT"), 2. Führungszellen („guarding cells") und 3. Durchschnittszellen („averaging cells").

Die getestete Zelle ist die mittlere Zelle. Ihr Inhalt wird verglichen mit den äußeren Zellen. Die Zellen, die sich unmittelbar um die mittlere Zelle befinden, werden zur Berechnung nicht herangezogen. Dies sind die sogenannten Führungszellen, deren Anzahl nach jeder Seite in etwa der halben Peak-Breite in Samples entspricht. In Abhängigkeit der Implementierung kann der Vergleich durch einen Komparator und somit die Bildung eines dynamischen Schwellwertes unterschiedlich erfolgen: So kann zum Beispiel ein durchschnittlicher CFAR (CACFAR) oder ein geordneter statistischer CFAR (OSCFAR) verwendet werden. Eine weitere Variante des CACFAR ist das CAGOCFAR, wobei„GO" für„greatest of" steht. Diese CFAR Variante funktioniert ähnlich dem CACFAR, ist jedoch zusätzlich in der Lage eine Unterscheidung zwischen zeitlich vorhergehenden und vorauseilenden Signalen zu treffen, die dann mit dem Wert der CUT verglichen werden. Während die erste Variante des Detektors den multiplikativ gewichteten Durchschnitt aller äußeren Zellen mit dem Wert der getesteten Zelle vergleicht, indem sie sie beispielsweise ins Verhältnis setzt, findet bei OSCFAR zunächst eine Sortierung der Amplitudenwerte nach ihrer Größe statt. Anschließend wird der Wert eines vorher festgelegten statistischen Ranges der sortierten Werte mit dem Wert der getesteten Zelle verglichen. Das Prinzip ist in Figur 1 1 dargestellt. Da eine Sortierung zeitaufwändig ist, ist die Variante des CACFARs leichter zu implementieren und wird im Folgenden näher diskutiert.

Die Überprüfung auf einen gültigen Signalpeak erfolgt beim CACFAR mathematisch über einen Vergleich der CUT mit dem gewichteten Wert der Durchschnittszellen nach der Vorschrift:

CUT > ⁽X X ^ urchschnittszellen

Mit dem Gewichtungsfaktor a.

Wandert ein gültiges peakförmiges Signal durch die Filterstruktur und ist der Geschwindigkeitskanal resonant mit der Teilchengeschwindigkeit, d.h. entspricht die Teilchengeschwindigkeit, an die das auf dem Geschwindigkeitskanal hinterlegte digitale Filter angepasst ist, der tatsächlichen Teilchengeschwindigkeit, wird der Komparator einen Ausschlag für ein gefundenes Teilchen liefern, da sich dann in den äußeren Zellen kaum Signalanteile finden. Für einen nicht-resonanten Kanal hingegen befinden sich starke Signalnebenkeulen in den Durchschnittszellen und der Komparator wird das Partikel in einem solchen Kanal nicht detektieren. Eine starke Welligkeit auf nicht-resonanten Kanälen wird also nicht zu einer Detektion auf einem solchen Kanal führen.

Alternativ kann dieses Entscheidungskriterium auch dann herbeigeführt werden, wenn nur eine Seite des CFARs diese Bedingung erfüllt (CAGOCFAR). Diese getrennte Betrachtung kann zu einer verbesserten Detektionsaussage führen, wenn sich z.B. ein zweiter Peak im Bereich der Durchschnittszellen befindet

Das Entscheidungskriterium des CFAR-Prozessors wird je nach Signalstärke immer relativ getroffen, da hohe Signale hohe Nebenkeulen besitzen, kleine Signale kleine Nebenkeulen. Durch einen gewichteten Vergleich des Peaks (CUT) mit dem gewichteten Mittelwert seiner charakteristischen Nebenkeulen (CACFAR), wird daher nicht die absolute Signalamplitude diskriminiert, sondern die Gestalt des Signals („Fingerabdruck"). Mit anderen Worten erlaubt das CFAR-Prinzip eine dynamische Schwellwertbildung genau dann, wenn auf einem resonanten Kanal ein optimales oder annähernd optimales Filterergebnis erzielt wird. Man erhält auf diesem Weg eine Möglichkeit zur dynamischen, an die Signalenergie angepassten Nachweisgrenze.

Allen CFAR Verfahren ist gemein, dass sie über den Vergleich der CUT mit ihrem Umfeld eine relative Aussage über eine gültiges Partikelsignal vornehmen können (Partikel potentiell vorhanden oder nicht). Da dies auf mehreren Kanälen und Zeitpunkten um den tatsächlichen Peak erfolgen kann (Abhängig von Anzahl der Durchschnitts-/Führungszellen und Gewichtungsfaktor), muss im Anschluss das Feld an Korrelationssignalen in diesem Bereich auf das tatsächliche Maximum abgesucht werden, um die tatsächliche Peakposition in der Zeit und Geschwindigkeitskanal ausfindig zu machen.

Beispielsweise zeigt der CFAR zu den Zeitpunkten t_k— t_k_₅ auf den Geschwindigkeits- kanälenv_;_₂ ··· v_j+2 ein gültiges Signal an. Insgesamt kommen somit 25 verschiedene Werte in Frage ( (t_k, Vj_₂), (t_k, Vj_₁), - - - (t_k-₅, Vj₊₂), bei denen der tatsächliche Peak zu finden ist. Eine sofortige oder nachträgliche Maximumsuche auf allen Kanälen oder nur in diesem Ausschnitt der Korrelationsdaten ist daher unerlässlich, um sowohl Zeitpunkt, Amplitude und Geschwindigkeit des Partikels mit bestmöglicher Genauigkeit zu bestimmen.

Claims

P a t e n t a n s p r ü c h e

Verfahren zur Detektion von sich entlang einer Trajektorie bewegenden Partikeln, welche elektromagnetische Strahlung, ein elektrisches Feld oder ein magnetisches Feld erzeugen oder zumindest beeinflussen, wobei die elektromagnetische Strahlung S, das elektrische oder das magnetische Feld detektiert wird, bei dem eine Strukturierungseinrichtung verwendet wird, die entweder dafür Sorge trägt, dass die Partikel entlang der Trajektorie im Wesentlichen nur in nicht-periodischen räumlichen Abständen elektromagnetische Strahlung, ein elektrisches Feld oder ein magnetisches Feld erzeugen oder zumindest beeinflussen oder dafür Sorge trägt, dass die elektromagnetische Strahlung S, das elektrische oder das magnetische Feld im Wesentlichen nur in nicht-periodischen räumlichen Abständen entlang der Trajektorie detektiert wird, dadurch gekennzeichnet, dass das detektierte Signal S mit Hilfe eines mismatched-Filters Fi verarbeitet wird und, wenn das derart gefilterte Signal DFI(S) ein vordefiniertes Schwellwertkriterium erfüllt, ein Partikel detektiert wird, und, wenn das derart gefilterte Signal das vordefinierte Schwellwertkriterium nicht erfüllt, kein Partikel detektiert wird.

Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass als Strukturierungseinrichtung eine nicht-periodischen, strukturierten Maske verwendet wird und die Partikel an einer Seite der Maske mit einer Geschwindigkeit v vorbeigeführt werden und auf der anderen Seite die durch die Maske tretende elektromagnetische Strahlung S, das elektrische oder das magnetische Feld detektiert wird.

Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Filterkoeffizienten des digitalen mismatched-Filter aus den Filterkoeffizienten eines Optimalfilters berechnet werden, so dass der mismatched-Filter die um einen vorgegebenen Wert reduzierten Filterkoeffizienten des Optimalfilters aufweist.

Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass der vorgegebene Wert im Wesentlichen gleich dem arithmetischen Durchschnitt aller Filterkoeffizienten des Optimalfilters ist.

Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass das detektierte Signal S mit Hilfe einer Mehrzahl von unterschiedlichen mismatched-Filtern (F, , i=1 ,2,...) verarbeitet wird, um eine Mehrzahl von digital gefilterten Signalen DFI (S) (i=1 ,2,...) zu erzeugen, dass aus der Mehrzahl von digital gefilterten Signalen DFI (S) (i=1 ,2,...) anhand eines vorbestimmten Auswahlkriteriums ein bestes digital gefiltertes Signal ÜFbest ausgewählt wird und wenn das beste digital gefilterte Signal ÜFbest ein vordefiniertes Schwellwertkriterium erfüllt, ein Partikel detektiert wird, und, wenn das beste digital gefilterte Signal ÜFbest das vordefinierte Schwellwertkriterium nicht erfüllt, kein Partikel detektiert wird.

Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass das mismatched-Filter Fi an eine Partikelgeschwindigkeit vi und an die nichtperiodische, binäre Maske angepasst ist, wobei im Falle der Verarbeitung mit einer Mehrzahl von digitalen mismatched-Filtern (F, , i=1 ,2, ...), jedes digitale mismatched-Filter (F, , i=1 ,2, ...) an die nichtperiodische, binäre Maske und an eine Partikelgeschwindigkeit v, angepasst ist, wobei jedes mismatched-Filter (F, , i=1 ,2, ...) an eine andere Partikelgeschwindigkeit v, angepasst ist.

Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass, wenn ein Partikel detektiert wird, dessen Geschwindigkeit v näherungsweise bestimmt wird, in dem die Geschwindigkeit v zu Vßest bestimmt wird, wobei Vßest die Partikelgeschwindigkeit ist, an welche der digitale mismatched-Filter Fßest angepasst ist, welcher das beste digital gefilterte Signal ÜFbest liefert.

Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Länge des oder der mismatched Filter mindestens M beträgt, wobei M die Länge des mittels mismatched Filter zu filternden Signales ist, wobei vorzugsweise die Länge des mismatched Filter größer als M ist und am besten maximal 3M beträgt.

Verfahren nach einem der Ansprüche 1 ,2, 5 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass das mismatched Filter oder die mismatched-Filter mittels einer Optimierung eines digital gefilterten Testsignals ermittelt werden, wobei als Testsignal ein für eine Partikelgeschwindigkeit v, und die verwendete binäre Maske zu erwartendes Signal verwendet wird, wobei vorzugsweise das mismatched Filter oder die mismatched Filter ermittelt werden mittels einer Minimierung des Nebenkeulen-zu-Peak-Verhältnis (SPLR) oder einer Minimierung des integrierten Nebenkeulen-zu-Peak-Verhältnis (ISLR) des digital gefilterten Testsignals, wobei besonders bevorzugt die Ermittlung über die Minimierung des minimalen integrierten Nebenkeulen-zu-Peak-Verhältnis (ISLR) erfolgt.

Verfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass als vorbestimmtes Auswahlkriterium durch ein CCFAR, ein OSCFAR oder ein CAGOCFAR herbeigeführt wird.

Verfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass v, < v,₊i gewählt wird, dass aus der Mehrzahl von unterschiedlichen mismatched-digitalen Filtern (Fi , i=1 ,2, ...) eine Untergruppe von digitalen mismatched-Filtern (F, , i= (k + c x i) mit einer Konstanten k und einem Faktor c ausgewählt wird, und das detektierte Signal S mit Hilfe der Untergruppe von unterschiedlichen digitalen mismatched-Filtern (F, , i=1 ,2, ...) verarbeitet wird, um eine Mehrzahl von digital gefilterten Signalen DFI (S) (i=1 ,2, ...) zu erzeugen, dass aus der Mehrzahl von digital gefilterten Signalen DR (S) (i=1 ,2, ...) anhand eines vorbestimmten Auswahlkriteriums ein bestes digital gefiltertes Signal Ü Fbest ausgewählt wird,

dass in einem weiteren Schritt eine weitere Untergruppe von digitalen mismatched-Filtern (F. , i(Best-c....Best+c) ausgewählt wird, deren Elemente auf Basis von Partikelgeschwindigkeiten ermittelt wurden, die in einem vorbestimmten Intervall um die Partikelgeschwindigkeit liegen, mit welcher der ausgewählte beste Filter bestimmt wurde, dass der Verarbeitungsschritt und der Auswahlschritt erneut unter Verwendung der weiteren Untergruppe durchgeführt wird, und wenn das beste digital gefilterte Signal ÜFbest ein vordefiniertes Schwellwertkriterium erfüllt, ein Partikel detektiert wird, und, wenn das beste digital gefilterte Signal ÜFbest das vordefinierte Schwellwertkriterium nicht erfüllt, kein Partikel detektiert wird.

Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 1 1 , dadurch gekennzeichnet, dass das detektierte Signal S zunächst mit einem Optimalfilter vorgefiltert wird und dann mit dem digitalen mismatched-Filter verarbeitet wird.

Verfahren nach Anspruch 1 2, dadurch gekennzeichnet, dass das vorgefilterte Signal nach der Zeit abgeleitet wird und dann mit dem digitalen mismatched-Filter verarbeitet wird.

Verfahren nach Anspruch 9 oder einem auf Anspruch 9 rückbezogenen Anspruch, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens ein erster, an eine Partikelgeschwindigkeit angepasster mismatched-Filter mittels Optimierung bestimmt wird und mindestens ein zweiter, an eine andere Partikelgeschwindigkeit angepasster mismatched-filter mittels Extrapolation oder Interpolation der Filterkoeffizienten des ersten Filters bestimmt wird.