WO2014166299A1 - 与调控蛋白PhaR相关物质的新用途 - Google Patents
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Definitions
- PhaR have two binding regions, DNA binding regions and particle binding regions (Maehara et al, J. Bacteriol. 184 (2002) 3992-4002).
- the DNA binding region can specifically bind to the THC-rich region and the TGC-rich region upstream of the phaP gene, thereby regulating the PhaP protein and its own expression.
- the hydrophobic particle binding region can be bound to the surface of the PHA particle by hydrophobic interaction.
- the A4 is an inclusion body of the regulatory protein PhaR;
- the aqueous phase is an aqueous solution of the A4, and the protein concentration of the aqueous solution of A4 is 3000 ⁇ ⁇ / ⁇ 1;
- the A1 is a product consisting of a regulatory protein PhaR inclusion body, a PHA synthase PhaC inclusion body, and a PHA degrading enzyme PhaZ inclusion body;
- the A3 is composed of the regulatory protein PhaR inclusion body and the PHA degrading enzyme PhaZ inclusion body
- the components of the Al, the A2, the A3 and the A5 may be packaged separately or may be mixed together.
- the regulatory protein PhaR may be a protein of the following al), a2) or a3): al) a protein having the amino acid sequence of SEQ ID No. 2;
- A2) a fusion protein obtained by adding 6 histidines before the 1st position of SEQ ID No. 2; a3) SEQ ID No. 2 is substituted and/or deleted and/or one or several amino acid residues are added.
- a mutant protein having the same activity as the protein represented by SEQ ID No. 2; the PHA synthase PhaC may be a protein of bl), b2) or b3) as follows:
- the PHA-degrading enzyme PhaZ in the PHAZ inclusion body of the PHA-degrading enzyme may be a protein of the following cl), c2) or c3):
- C2 a fusion protein obtained by adding 6 histidines before the 1st position of SEQ ID No. 6; c3) subjecting SEQ ID No. 6 to substitution and/or deletion and/or addition of one or several amino acid residues
- the mutant protein having the same activity as the protein represented by SEQ ID No.
- the mass ratio of the regulatory protein PhaR to the PHA synthase PhaC may be 1:
- the mass ratio of the regulatory protein PhaR inclusion body, the PHA synthase PhaC inclusion body and the PHA degrading enzyme PhaZ inclusion body may be 1: 1: 1;
- the mass ratio of the regulatory protein PhaR inclusion body to the PHA synthase PhaC inclusion body may be 1:1;
- the mass ratio of the regulatory protein PhaR inclusion body to the PHA degrading enzyme PhaZ inclusion body in the A3 may be 1: Lo
- the regulatory protein PhaR and the regulatory protein PhaR inclusion body are obtained by introducing a regulatory protein PhaR gene into Escherichia coli to express the regulatory protein PhaR gene, the PHA synthase PhaC and the PHA synthase.
- the PhaC inclusion body is obtained by introducing the PHA synthase PhaC gene into Escherichia coli to express the PHA synthase PhaC gene, and the PHA degrading enzyme PhaZ inclusion body is a PHA degrading enzyme PhaZ gene introduced into Escherichia coli to make the PHA degrading enzyme PhaZ Gene expression obtained.
- the coding sequence of the regulatory protein PhaR gene may specifically be SEQ ID No. 1
- the coding sequence of the PHAC gene of the PHA synthase may specifically be SEQ ID No. 3
- the PHA degrading enzyme PhaZ gene The coding sequence may specifically be SEQ ID No. 5.
- the E. coli is specifically i3 ⁇ 4 BL21 (DE3).
- the regulatory protein PhaR is obtained by introducing the regulatory protein PhaR gene into Escherichia coli and expressing the regulatory protein PhaR gene at 16-18 ° C, wherein the PHA synthase PhaC is introduced into the PHAC synthase PhaC gene.
- Escherichia coli expresses the PHA synthase PhaC gene at 16-18 ° C
- the regulatory protein PhaR inclusion body is obtained by introducing the regulatory protein PhaR gene into Escherichia coli and expressing the regulatory protein PhaR gene at 25 ° C.
- the PHA synthase PhaC inclusion body is obtained by introducing the PHA synthase PhaC gene into Escherichia coli to express the PHA synthase PhaC gene at 25 ° C, and the PHA degrading enzyme PhaZ inclusion body is the PHA shown.
- the degradation enzyme PhaZ gene was introduced into Escherichia coli to express the PHA degrading enzyme PhaZ gene at 25 °C. The above expression was carried out under the induction of IPTG of 0.3 mM to 0.5 mM.
- the coding sequence of the regulatory protein PhaR gene is SEQ ID No. 1
- the coding sequence of the PHAC synthase PhaC gene is SEQ ID No. 3
- the PHA degrading enzyme PhaZ gene The coding sequence is SEQ ID No. 5.
- the oil phase may be a petrochemical oil or an edible oil.
- the petrochemical oil may be diesel or lubricating oil; the edible oil may be soybean oil.
- the emulsification may employ vortex oscillation, and the vortex oscillation speed may be 1300 rpm.
- the oscillation time is 120 seconds.
- the mass ratio of the regulatory protein PhaR to the PHA synthase PhaC is 1:1; in the A2, the regulatory protein PhaR inclusion body, the PHA synthase PhaC contains The mass ratio of the PHAZ inclusion body to the PHA degrading enzyme is 1:1; in the A3, the mass ratio of the regulatory protein PhaR inclusion body to the PHA synthase PhaC inclusion body is 1:1; The mass ratio of the regulatory protein PhaR inclusion body to the PHA degrading enzyme PhaZ inclusion body is 1:1.
- Figure 1 is a physical map of the recombinant expression plasmid pET28a-PhaR.
- Figure 2 shows the SDS-PAGE electrophoresis pattern of PhaZ, PhaR and PhaC protein expression.
- lane 1 PhaZ expression strain was induced by IPTG induction
- Lane 2 PhaZ expression strain was not induced by IPTG
- Lane 3 PhaR expression strain was induced by IPTG
- Lane 4 PhaR expression strain was not induced by IPTG
- Lane 5 PhaC expression The strain was not induced by the addition of IPTG
- Lane 6 PhaC expression strain was induced by IPTG
- Lane 7 Marker
- Figure 3 is a SDS-PAGE electropherogram of purified PhaR and PhaC.
- a is PhaC and b is PhaR.
- Figure 4 is a SDS-PAGE electrophoresis pattern of E. coli BL21 (DE3) whole protein and purified PhaP expressing PhaP.
- the emulsifying ability is used to embody the emulsifying ability in the following examples.
- the specific experimental method is as follows: The aqueous solution of the substance to be tested is mixed with an equal volume of various oil phase materials at 20 ° C in a glass vial of the same specification for emulsification treatment.
- the emulsification treatment method is a vortex oscillator oscillation treatment.
- the vortex oscillator was oscillated using a vortex oscillator (XH-C, Jinyi, Jintan Medical Instrument Factory) and oscillated at 1300 rpm for 120 seconds.
- the formula for calculating the emulsification value is as follows:
- Emulsifying value emulsifying layer I (oil layer + emulsion layer + water layer) ⁇ % (1)
- Example 1 Prokaryotic expression and purification of the regulatory protein PhaR and its inclusion body, PHA synthase PhaC and its inclusion body, PHA degrading enzyme PhaZ inclusion body, and particle binding protein PhaP
- the PhaR gene encoding the coding sequence of SEQ ID No. 1 was prepared by PCR, and the sequence of the regulatory protein PhaR gene was added to the Ndel recognition site and the protective base (sequence ggaattccat) before the first position of SEQ ID No. 1.
- the Hind III recognition site and the protective base were added after the 552th position of SEQ ID No. 1 (the sequence is (a sequence aagcttgggc).
- the PHA synthase PhaC gene having the coding sequence of SEQ ID No. 3 was prepared by PCR, and the sequence of the PHA synthetase PhaC gene was added to the Ndel recognition site and the protective base before the 3rd position of SEQ ID No. 1 (the sequence was ggaattccat).
- the Hind III recognition site and the protective base were added after the 1776th position of SEQ ID No. 3.
- the recombinant plasmids pET28a-PhaR, pET28a_PhaC and pET28a_PhaZ were transformed into Coli BL21(DE3) competent cells (purchased from Tiangen Biochemical Technology Co., Ltd.), and the resistant plates (containing ampicillin 100 g/ml) were screened. Positive colonies. A positive colony was picked, added to 20 ml of LB medium, and cultured overnight at 37 ° C at 220 rpm, and the obtained culture solution was used as a seed liquid.
- aqueous solution of the test substance The purified PhaP, PhaC and PhaR proteins were each made into 50 (Vg/ml aqueous solution) by ultrapure water, respectively, and the PhaP sample group, the PhaC sample group and the PhaR sample group were respectively obtained; SDS, sodium oleate, Tween 20 and bovine serum albumin were prepared into 500 g/ml aqueous solution with ultrapure water, respectively, and the SDS sample group, the sodium oleate sample group, the Tween 20 sample group and the bovine serum albumin sample group were respectively obtained. Each of the above sample groups was used as an aqueous solution of the test substance.
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Abstract
本发明公开了与调控蛋白PhaR相关物质的新用途。该新用途为与调控蛋白PhaR相关物质在制备油水乳状液中的应用，所述与调控蛋白PhaR相关物质为A1−A6中的任一种：所述A1为由调控蛋白PhaR包涵体、PHA合成酶PhaC包涵体和PHA降解酶PhaZ包涵体组成的产品；所述A2为由所述调控蛋白PhaR包涵体和所述PHA合成酶PhaC包涵体组成的产品；所述A3为所述调控蛋白PhaR包涵体和所述PHA降解酶PhaZ包涵体组成的产品；所述A4为由所述调控蛋白PhaR包涵体；所述A5为由调控蛋白PhaR和PHA合成酶PhaC组成的产品；所述A6为所述调控蛋白PhaR。
Description
与调控蛋白 PhaR相关物质的新用途 技术领域
本发明涉及与调控蛋白 PhaR相关物质的新用途。
背景技术
生物表面活性剂是一大类通过微生物得到两亲性小分子物质（Mulligan 等， Environ Pollut, 133 (2005), 183-98; Khire 等， Adv Exp Med Biol, 672 (2010), 146-57; Morita等， Biotechnol Appl Biochem, 53 (2009), 39-49) ， 一般包 括低分子量的糖脂、 脂肽、 磷脂、 中性类脂等和高分子量的含脂聚合物， 如脂 多糖 (glycolipids) 、 月旨蛋白 (lipopeptides lipoproteins) 、 多糖 -蛋白 -脂肪酸复合物等（Syldatk 等， Z Naturforsch C, 40 (1985)， 61-7； Ogawa 等， Biosci Biotechnol Biochem, 64 (2000), 2466-8; Morita 等， JBiosci Bioeng, 104 (2007), 78-81； Wicke 等， J Nat Prod, 63 (2000), 621-6) 。 它们的分 子结构由两部分组成， 一部分是疏油亲水的极性基团， 如单糖、 聚糖、 氨基酸 和磷酸基等， 另一部分是由疏水亲油的碳氢链组成的非极性基团， 如饱和或非 饱和的脂肪醇及脂肪酸等。 正是由于具有这种既亲油又亲水的两亲性分子结构， 生物表面活性剂才能显著降低界面张力， 或吸附在界面上形成紧密的定向排列 来改变界面的亲水 /亲油性能， 使油 /水两相得以很好的分散。 其中最为代表的 是糖脂类 （Mata-Sandoval等， Microbiol Res, 155 (2001), 249-56; Guilmanov 等， Biotechnol Bioeng, 77 (2002), 489-94; ) 。
聚羟基脂肪酸酯 （Polyhydroxyalkanoic acids, 简称 PHA) 是许多微生物 在非平衡生长条件下合成的一种细胞内碳源和能源的贮藏性聚合物 （Anderson 等， Microbial Rev. , 54 (1990) 450—472; Lee 等， Biotech. Bioeng. , 49 (1996) 1-14) 。 研究发现， 自然条件下的 PHA在细菌体内是以不溶性脂肪颗粒 (granule) 的形式存在。 PHA 分子形成疏水核心， 颗粒表面包裹着一层特殊的 单层膜结构， 由颗粒结合蛋白 （PhaP/Phasin) 、 调控蛋白 （PhaR) 、 PHA 合成 酶 （PhaC) 、 PHA降解酶 （PhaZ) 和单层磷脂膜等组成 （ Steinbiichel等， Can. J. Microbiol. 41 (1995) 94—105; York 等， J. Bacteriol. 183 (2001) 2394-2397) 。 PHA降解酶， PhaZ起着将 PHA大分子降解成小分子寡聚体的作用 (Jendrossek等， Appl. Microbiol. Biotechnol. , 46 (1996) 451-463; Briese 等， J. Environ. Polym. Degrad. , 2 (1994) 75-87) 。 调控蛋白， PhaR存在 两种结合区域， DNA结合区域和颗粒结合区域（Maehara等， J. Bacteriol. 184 (2002) 3992-4002)。 DNA结合区域可以特异性的结合到 phaR基因和 phaP基因 上游富含 TGC的区域， 从而调控 PhaP蛋白和其自身的表达。 而疏水的颗粒结合 区域能通过疏水作用结合在 PHA颗粒表面。 和 PhaP—样， 通过 PhaR和其他疏 水材料的体外结合试验表明 PhaR 的疏水性结合是非特异性的（Yamashita 等， Biomacromolecules, 7 (2006) 2449-2454)。 PHA合成酶， PhaC是 PHA生物合
成过程中的关键酶。
发明公开
本发明所要解决的技术问题是提供与调控蛋白 PhaR相关物质的新用途。 本发明所提供的与调控蛋白 PhaR相关物质的新用途为 1 ) _4 )中的任一种： 1 ) 与调控蛋白 PhaR相关物质在制备油水乳状液中的应用， 所述与调控蛋 白 PhaR相关物质为 A1-A6中的任一种：
所述 A1为由调控蛋白 PhaR包涵体、 PHA合成酶 PhaC包涵体和 PHA降解酶 PhaZ包涵体组成的产品；
所述 A2为由所述调控蛋白 PhaR包涵体和所述 PHA合成酶 PhaC包涵体组成 的产品；
所述 A3为所述调控蛋白 PhaR包涵体和所述 PHA降解酶 PhaZ包涵体组成的
■≠∑： 口
广 ΒΠ；
所述 A4为由所述调控蛋白 PhaR包涵体；
所述 A5为由调控蛋白 PhaR和 PHA合成酶 PhaC组成的产品；
所述 A6为所述调控蛋白 PhaR。
2 )与调控蛋白 PhaR相关物质在制备乳化剂中的应用，所述与调控蛋白 PhaR 相关物质为 A1-A6中的任一种：
所述 A1为由调控蛋白 PhaR包涵体、 PHA合成酶 PhaC包涵体和 PHA降解酶 PhaZ包涵体组成的产品；
所述 A2为由所述调控蛋白 PhaR包涵体和所述 PHA合成酶 PhaC包涵体组成 的产品；
所述 A3为所述调控蛋白 PhaR包涵体和所述 PHA降解酶 PhaZ包涵体组成的
■≠∑： 口
广 ΒΠ；
所述 A4为由所述调控蛋白 PhaR包涵体；
所述 A5为由调控蛋白 PhaR和 PHA合成酶 PhaC组成的产品；
所述 A6为所述调控蛋白 PhaR。
3 )制备油水乳状液的方法， 包括将水相和油相等体积混合进行乳化制备油 水乳状液的步骤， 所述水相是与调控蛋白 PhaR相关物质的水溶液；
所述与调控蛋白 PhaR相关物质为 A1-A6中的任一种：
所述 A1为由调控蛋白 PhaR包涵体、 PHA合成酶 PhaC包涵体和 PHA降解酶
PhaZ包涵体组成的产品；
所述 A2为由所述调控蛋白 PhaR包涵体和所述 PHA合成酶 PhaC包涵体组成 的产品；
所述 A3为所述调控蛋白 PhaR包涵体和所述 PHA降解酶 PhaZ包涵体组成的 产品；
所述 A4为由所述调控蛋白 PhaR包涵体；
所述 A5为由调控蛋白 PhaR和 PHA合成酶 PhaC组成的产品；
所述 A6为所述调控蛋白 PhaR;
所述水相满足 1 ) -6 ) 的条件：
1 ) 所述水相为所述 A1 的水溶液， 所述 A1 的水溶液的蛋白质总浓度为 水相为所述 A2 的水溶液， 所述 A2 的水溶液的蛋白质总浓度为 水相为所述 A3 的水溶液， 所述 A3 的水溶液的蛋白质总浓度为
4 ) 所述水相为所述 A4 的水溶液 ， 所述 A4 的水溶液的蛋白质浓度为 3000μδ/πι1 ;
5 ) 所述水相为所述 Α5 的水溶液， 所述 A5 的水溶液的蛋白质总浓度为 500 g/ml ;
6 ) 所述水相为所述 A6 的水溶液 ， 所述 A6 的水溶液的蛋白质浓度为 500 g/ml。
4) 乳化剂， 为 Al-A3、 A5中的任一种产品：
所述 A1为由调控蛋白 PhaR包涵体、 PHA合成酶 PhaC包涵体和 PHA降解酶 PhaZ包涵体组成的产品；
所述 A2为由所述调控蛋白 PhaR包涵体和所述 PHA合成酶 PhaC包涵体组成 的产品；
所述 A3为所述调控蛋白 PhaR包涵体和所述 PHA降解酶 PhaZ包涵体组成的
■≠∑：口
广 ΒΠ；
所述 A5为由调控蛋白 PhaR和 PHA合成酶 PhaC组成的产品。
上述新用途中，所述 Al、所述 A2、所述 A3和所述 A5的各组分可单独包装， 也可混合在一起。
上述新用途中， 所述乳化剂是使油和水形成乳状液的物质。 所述调控蛋白
PhaR包涵体、 PHA合成酶 PhaC包涵体或 PHA降解酶 PhaZ包涵体是指所述调控 蛋白 PhaR基因、 PHA合成酶 PhaC基因或 PHA降解酶 PhaZ基因的表达产物在细 菌 （如大肠杆菌） 中积累并聚集在一起形成的无膜裸露结构。
上述新用途中， 所述调控蛋白 PhaR可为如下 al ) 、 a2 ) 或 a3 ) 的蛋白质： al ) 氨基酸序列如 SEQ ID No. 2所示的蛋白质；
a2 ) 在 SEQ ID No. 2的第 1位前加入 6个组氨酸得到的融合蛋白； a3 ) 将 SEQ ID No. 2经过取代和 /或缺失和 /或添加一个或几个氨基酸残基 得到的具有氨基酸序列如 SEQ ID No. 2所示的蛋白质相同活性的突变体蛋白； 所述 PHA合成酶 PhaC可为如下 bl ) 、 b2 ) 或 b3 ) 的蛋白质：
bl ) 氨基酸序列如 SEQ ID No. 4所示的蛋白质；
b2 ) 在 SEQ ID No. 4的第 1位前加入 6个组氨酸得到的融合蛋白； b3 ) 将 SEQ ID No. 4经过取代和 /或缺失和 /或添加一个或几个氨基酸残基
得到的具有氨基酸序列如 SEQ ID No. 4所示的蛋白质相同活性的突变体蛋白； 所述 PHA降解酶 PhaZ包涵体中的 PHA降解酶 PhaZ可为如下 cl ) 、 c2 ) 或 c3 ) 的蛋白质：
cl ) 氨基酸序列如 SEQ ID No. 6所示的蛋白质；
c2 ) 在 SEQ ID No. 6的第 1位前加入 6个组氨酸得到的融合蛋白； c3 ) 将 SEQ ID No. 6经过取代和 /或缺失和 /或添加一个或几个氨基酸残基 得到的具有氨基酸序列如 SEQ ID No. 6所示的蛋白质相同活性的突变体蛋白； 上述新用途中， 所述 A5中， 所述调控蛋白 PhaR和所述 PHA合成酶 PhaC的 质量比可为 1 : 1 ;所述 A1中，所述调控蛋白 PhaR包涵体、所述 PHA合成酶 PhaC 包涵体和所述 PHA降解酶 PhaZ包涵体的质量比可为 1 : 1： 1； 所述 A2中， 所述 调控蛋白 PhaR包涵体和所述 PHA合成酶 PhaC包涵体的质量比可为 1 : 1； 所述 A3中所述调控蛋白 PhaR包涵体和所述 PHA降解酶 PhaZ包涵体的质量比可为 1 : l o
上述新用途中， 所述调控蛋白 PhaR和所述调控蛋白 PhaR包涵体是将调控 蛋白 PhaR基因导入大肠杆菌使所述调控蛋白 PhaR基因表达得到的， 所述 PHA 合成酶 PhaC和所述 PHA合成酶 PhaC包涵体是将 PHA合成酶 PhaC基因导入大肠 杆菌使所述 PHA合成酶 PhaC基因表达得到的， 所述 PHA降解酶 PhaZ包涵体是 将 PHA降解酶 PhaZ基因导入大肠杆菌使所述 PHA降解酶 PhaZ基因表达得到的。
上述新用途中， 所述调控蛋白 PhaR基因的编码序列具体可为 SEQ ID No. 1， 所述 PHA合成酶 PhaC基因的编码序列具体可为 SEQ ID No. 3， 所述 PHA降解酶 PhaZ基因的编码序列具体可为 SEQ ID No. 5。
在本发明的一个实施例中， 所述大肠杆菌具体为 i¾ BL21 (DE3)。 所述 调控蛋白 PhaR是将所述调控蛋白 PhaR基因导入大肠杆菌使所述调控蛋白 PhaR 基因在 16-18°C进行表达得到的，所述 PHA合成酶 PhaC是将所述 PHA合成酶 PhaC 基因导入大肠杆菌使所述 PHA合成酶 PhaC基因在 16_18°C表达得到的， 所述调 控蛋白 PhaR包涵体是将所述调控蛋白 PhaR基因导入大肠杆菌使所述调控蛋白 PhaR基因在 25°C表达得到的， 所述 PHA合成酶 PhaC包涵体是将所示 PHA合成 酶 PhaC基因导入大肠杆菌使所述 PHA合成酶 PhaC基因在 25°C表达得到的， 所 述 PHA降解酶 PhaZ包涵体是将所示 PHA降解酶 PhaZ基因导入大肠杆菌使所述 PHA降解酶 PhaZ基因在 25°C表达得到的。 上述表达均在 0. 3 mM-0. 5 mM 的 IPTG 诱导下进行。
在本发明的一个实施例中， 所述调控蛋白 PhaR基因的编码序列是 SEQ ID No. 1， 所述 PHA合成酶 PhaC基因的编码序列是 SEQ ID No. 3， 所述 PHA降解酶 PhaZ基因的编码序列是 SEQ ID No. 5。
上述新用途中， 所述油相可为石化油或食用油。 所述石化油可为柴油或润 滑油； 所述食用油可为大豆油。
上述新用途中，所述乳化可采用涡旋振荡，所述涡旋振荡速度可为 1300rpm，
振荡时间为 120秒。
上述新用途中， 所述 A1中， 所述调控蛋白 PhaR和所述 PHA合成酶 PhaC的 质量比为 1: 1； 所述 A2中， 所述调控蛋白 PhaR包涵体、 所述 PHA合成酶 PhaC 包涵体和所述 PHA降解酶 PhaZ包涵体的质量比为 1: 1； 所述 A3中， 所述调控 蛋白 PhaR包涵体和所述 PHA合成酶 PhaC包涵体的质量比为 1: 1; 所述 A4中所 述调控蛋白 PhaR包涵体和所述 PHA降解酶 PhaZ包涵体的质量比为 1: 1。
附图说明
图 1为重组表达质粒 pET28a-PhaR的物理图谱。
图 2为 PhaZ, PhaR禾口 PhaC蛋白表达 SDS-PAGE电泳图。
图中，泳道 1: PhaZ表达菌株加入 IPTG诱导； 泳道 2: PhaZ表达菌株未加 入 IPTG诱导； 泳道 3: PhaR表达菌株加入 IPTG诱导； 泳道 4: PhaR表达菌株 未加入 IPTG诱导； 泳道 5: PhaC表达菌株未加入 IPTG诱导； 泳道 6: PhaC表 达菌株加入 IPTG诱导； 泳道 7: Marker
图 3为纯化后的 PhaR、 PhaC的 SDS-PAGE电泳图。
a为 PhaC, b为 PhaR。
图 4为融合表达 PhaP的 E. coli BL21 (DE3) 全蛋白和纯化后的 PhaP的 SDS-PAGE电泳图。
其中， 泳道 M: 蛋白 marker, 泳道 1: 没有添加 IPTG诱导表达的菌体全蛋 白， 泳道 2-4: 添加 IPTG诱导表达 PhaP的菌体全蛋白， 泳道 5: 纯化后的 PhaP。 实施发明的最佳方式
以下的实施例便于更好地理解本发明， 但并不限定本发明。 下述实施例中 的实验方法， 如无特殊说明， 均为常规方法。 下述实施例中所用的材料、 试剂 等， 如无特殊说明， 均可从商业途径得到。
下述实施例中用乳化值来体现乳化能力， 具体的实验方法如下： 将待测物 质水溶液与等体积的各种油相物质在 20°C混合于同样规格的玻璃小瓶中进行乳 化处理。 乳化处理方式为涡旋振荡器振荡处理。 涡旋振荡器振荡处理采用涡旋 振荡器 （XH-C，金怡， 金坛市医疗仪器厂） 以 1300转每秒的速度振荡 120秒进 行处理。
乳化处理完成静置一段时间后， 观察记录油层 （oil layer) 、 乳化层 (emulsion layer) 和水层 （water layer) 的高度。 并通过公式 （1) 计算得 到相关的乳化值 （E皿 lsion Index) 。 乳化值计算公式如下：
乳化值 = 乳化层 I (油层 +乳化层 +水层） χΐοο% (1)
其中， 所有层总高是指油层、 乳化层和水层三层的总高度。 但有时水层或 油层在乳化后可能消失， 则总高为余下两层 （layers) 的高度之和。 乳化值越 大， 说明乳化能力越强。
下述实施例中的乳化实验均设三次重复， 乳化值以平均值士标准差表示。
实施例 1、 调控蛋白 PhaR及其包涵体、 PHA合成酶 PhaC及其包涵体和 PHA 降解酶 PhaZ包涵体、 颗粒结合蛋白 PhaP的原核表达以及纯化
一、 表达载体 pET28a - PhaR、 pET28a-PhaC pET28a-PhaZ pET28a-PhaP ¾ 构建
其中， 调控蛋白 PhaR的氨基酸序列为 SEQ ID No. 2， PHA合成酶 PhaC的氨 基酸序列为 SEQ ID No. 4， PHA降解酶 PhaZ包涵体中的 PHA降解酶 PhaZ的氨基 酸序列为 SEQ ID No. 6， 颗粒结合蛋白 PhaP的氨基酸序列为 SEQ ID No. 8。
通过 PCR制备编码序列是 SEQ ID No. 1的调控蛋白 PhaR基因，调控蛋白 PhaR 基因的序列是在 SEQ ID No. 1的第 1位前加入 Ndel 识别位点及保护碱基 （序列 为 ggaattccat ) ， 在 SEQ ID No. 1 的第 552位后加入 Hind III识别位点及保护 碱基 （序列为 （序列为 aagcttgggc ) 。
通过 PCR制备编码序列是 SEQ ID No. 3的 PHA合成酶 PhaC基因， PHA合成 酶 PhaC基因的序列是在 SEQ ID No. 1的第 3位前加入 Ndel 识别位点及保护碱 基 （序列为 ggaattccat ) ， 在 SEQ ID No. 3的第 1776位后加入 Hind III识别位 点及保护碱基 （序列为 aagcttgggc ) 。
通过 PCR制备编码序列是 SEQ ID No. 5的 PHA降解酶 PhaZ基因， PHA降解 酶 PhaZ基因的序列是在 SEQ ID No. 5的第 1位前加入 Ndel 识别位点及保护碱 基 （序列为 ggaattccat ) ， 在 SEQ ID No. 5的第 738位后加入 Hind III识别位 点及保护碱基 （序列为 aagcttgggc)。
通过 PCR制备编码序列是 SEQ ID No. 7的颗粒结合蛋白 PhaP的基因， 颗粒 结合蛋白 PhaP基因的序列是在 SEQ ID No. 7的第 1位前加入 Ndel 识别位点及 保护碱基 （序列为 ggaattccat ) ， 在 SEQ ID No. 7的第 348位后加入 Hind III 识别位点及保护碱基 （序列为 aagcttgggc)。
用 Ndel和 Hind III分别酶切 PhaR基因、 PhaC基因、 PhaZ基因和 PhaP基因， 用 Ndel和 Hind III酶切 pET28a (上海宝曼生物科技有限公司） ， 将 PhaR基因、 PhaC基因、 PhaZ基因和 PhaP基因的 Ndel和 Hind III酶切产物分别和 pET28a的 Ndel和 Hind III酶切产物连接， 对连接产物分别进行 Ndel和 Hind III酶切签订 和测序鉴定， 将用 PhaR基因替换 pET28a的 Ndel和 Hind III之间的片段得到的 PhaR基因表达载体命名为 pET28a-PhaR (图 1 ) ， 将用 PhaC基因替换 pET28a的 Ndel和 Hind III之间的片段得到的 PhaC基因表达载体命名为 PET28a_PhaC， 将 用 PhaZ基因替换 pET28a的 Ndel和 Hind III之间的片段得到的 PhaZ基因表达载 体命名为 pET28a-PhaZ, 将用 PhaP基因替换 pET28a的 Ndel和 Hind III之间的 片段得到的 PhaP基因表达载体命名为 pET28a-PhaP。
在 Ndel和 Hindlll酶切位点之间插入目的基因， 置于 pET28a表达系统自带 的 T7启动子下游， 又由于多克隆位点上下游的 hi s标签，插入的基因可经 T7启 动子高效启动， 并且在得到的蛋白序列上有和下游都加上 his 标签， 便于纯化 处理。
二、 用大肠杆菌 coli BL21 (DE3) 生产重组蛋白及包涵体
将重组质粒 pET28a- PhaR、 pET28a- PhaC、 pET28a- PhaZ、 pET28a- PhaP分另 ij 转化 E. coli BL21(DE3)感受态细胞 （购自北京天 生化科技有限公司） ， 挑取 含重组质粒的单克隆进行诱导培养， 跑全菌蛋白电泳进行蛋白表达鉴定， 结果 显示重组质粒可以正常表达 PhaP、 PhaZ, PhaR和 PhaC蛋白。 但是， PhaZ诱导 表达的菌体超声破碎菌体之后， 发现并未超声至清澈， 离心后发现下层有大量 沉淀，经 SDS-PAGE电泳检测发现 PhaZ蛋白大部分位于下层，上层几乎没有 PhaZ 蛋白， 确定形成了蛋白包涵体。 在优化各种反应条件之后， PhaZ 依然以包涵体 形式表达， 而 PhaP、 PhaR和 PhaC在低温诱导条件下， 倾向于形成可溶性的蛋 白， 而温度达到 25°C时， 也有包涵体产生。 经条件摸索， 发现 IPTG对包涵体的 形成影响较小， 对温度尤其敏感。 在后续试验中， 发现包涵体的一些类表面活 性剂性能， 又由于包涵体的一些优越性， 在大量表达包涵体蛋白之后， 与可溶 性蛋白相互比较研究其表面活性剂方面性能。
1、 PhaP, PhaR或 PhaC的制备
具体方法如下：
(1) 将重组质粒 pET28a- PhaR、 pET28a- PhaC、 pET28a- PhaZ、 pET28a- PhaP 分别转化^ i¾ BL21(DE3)感受态细胞 （购自天根生化科技有限公司） 中， 涂 抹抗性平板 （含氨苄 100 g/ml) 筛选阳性菌落。 挑取一个阳性菌落， 加入 20ml LB 培养基中， 220rpm， 37°C下过夜培养， 将获得的培养液作为种子液。
(2)将种子液加入 1000 ml LB液体培养基中 （含氨苄 100 g/ml ) ， 220rpm,
37°C振荡培养至 0D600为 0.5-0.8，加入终浓度为 0.3 mM-0.5 mM 的 IPTG， 220rpm, 18°C培养 16h，诱导表达融合蛋白， 获得诱导后菌液。 同时设不加 IPTG的菌液为 空白对照。
(3) 5000g下离心菌体 lh， 并用 40ml binding buffer (0.5 M NaCl, 20 mM Tris-HCl, 5 mM 咪唑 （imidazole) ， pH=7.9) 洗涤沉淀两次， 最终将菌体 重悬在 40ml binding buffer中。 将重悬菌体以 40%输出的超声 （400HZ) 破碎 15min。
(4) 12, 000g, 4°C下离心超声破碎液 lh。 收集上清， 即为富含蛋白的粗提 取液。
(5)将细胞粗提物倒入处理好的 His标签亲和层析纯化柱（美国， 默克）， 依次力口入 binding buffer、 wash buffer (0.5 M NaCl, 60 mM Tris-HCl, 20 mM imidazole, pH=7.9)禾口 elute buffer(0.5 M NaCl, 1 M Tris-HCl , 20 mM imidazole, pH=7.9) ， 收集最后得到的液体。
(6) 利用超滤操作除去溶液中多余的盐分
将步骤（5)纯化得到的液体加入超滤管（美国， Miliipore, 型号为 3k Da) 至最大限额， 5000 rpm离心 1小时后， 保留超滤管内管中残余液体。 加入超纯 水至超滤管最大限额， 继续离心， 反复上述操作 5 次。 超滤管内管中液体为除
去多余盐分的 PhaP、 PhaR或 PhaC蛋白溶液。
(7) 利用冷冻干燥技术得到纯的固体粉末状 PhaP
将步骤 （6) 得到的除去多余盐分的 PhaP、 PhaR或 PhaC蛋白溶液在 _8(TC 冷冻， 结冰后放入冷冻干燥机中进行冷冻干燥 24 小时。 得到白色固体粉末状 PhaP、 PhaR或 PhaC蛋白。
称取少量的固体粉末状 PhaP、 PhaR或 PhaC蛋白溶解于超纯水中， 并同未 诱导表达的 coli BL21 (DE3) 全蛋白和融合表达的 coli BL21 (DE3) 全 蛋白一同进行 SDS-PAGE检验。 蛋白电泳结果见图 3和图 4。 从图中可见， PhaP 加上融合表达的 His标签分子大小为约 14 k Da, PhaR加上融合表达的 His标 签分子大小为约 25 k Da， PhaC加上融合表达的 His标签分子大小为约 64 k Da。
2、 PhaZ包涵体、 PhaR包涵体或 PhaC包涵体的制备
( 1)将重组质粒 pET28a-PhaR、 pET28a_PhaC和 pET28a_PhaZ分别转化^: Coli BL21(DE3)感受态细胞 （购自天根生化科技有限公司） 中， 涂抹抗性平板 （含氨 苄 100 g/ml) 筛选阳性菌落。 挑取一个阳性菌落， 加入 20ml LB 培养基中， 220rpm, 37°C下过夜培养， 将获得的培养液作为种子液。
(2)将种子液加入 1000 ml LB液体培养基中 （含氨苄 100 g/ml ) ， 220rpm, 37°C振荡培养至 0D600为 0.5-0.8，加入终浓度为 0.3 mM-0.5 mM 的 IPTG， 220rpm, 25°C培养 16h，诱导表达融合蛋白， 获得诱导后菌液。
(3) 5，000g下离心菌体 lh， 并用 20 mL 预冷水洗涤沉淀两次， 最终将菌 体重悬在 20 mL 预冷水中。 将重悬菌体以 40%输出的超声 （400HZ) 破碎 15min。
(4) 5,000g, 4°C下离心超声破碎液 lh。 收集沉淀， 即得到 PhaZ包涵体、 PhaR包涵体和 PhaC包涵体。
同时， 设置蛋白包涵体的阴性对照组， 以证明是蛋白包涵体在起到乳化作 用而不是其他细胞碎片和杂质起到了乳化作用。
蛋白包涵体的阴性对照组按照如下方法获得：
( 1)将重组质粒 pET28a-PhaR、 pET28a_PhaC和 pET28a_PhaZ分别转化^: Coli BL21(DE3)感受态细胞 （购自天根生化科技有限公司） 中， 涂抹抗性平板 （含氨 苄 100 g/ml) 筛选阳性菌落。 挑取一个阳性菌落， 加入 20ml LB 培养基中， 220rpm, 37°C下过夜培养， 将获得的培养液作为种子液。
(2)将种子液加入 1000 ml LB液体培养基中 （含氨苄 100 g/ml ) ， 220rpm,
37°C振荡培养至 0D600为 0.5-0.8时， 变为 220rpm， 25°C培养 16h， 获得菌液。
(3) 5，000g下离心菌体 lh， 并用 20 mL 预冷水洗涤沉淀两次， 最终将菌 体重悬在 20 mL 预冷水中。 将重悬菌体以 40%输出的超声 （400HZ) 破碎 15min。
(4) 14，000g下离心菌体 lh。 分别收集离心后的上清和沉淀， 沉淀经预冷 灭菌超纯水洗涤 2-3次， 得到 PhaZ包涵体阴性对照上清和 PhaZ包涵体阴性对 照沉淀， PhaR包涵体阴性对照上清和 PhaR包涵体阴性对照沉淀， PhaC包涵体 阴性对照上清和 PhaC包涵体阴性对照沉淀。
实施例 2、 PhaP、 PhaC和 PhaR蛋白水溶液乳化柴油的能力和乳化层稳定 性
PhaP、 PhaC和 PhaR蛋白水溶与相同浓度的传统化工类表面活性剂、商品化 洗涤剂以及牛血清蛋白用于乳化柴油能力的比较。 PhaP、 PhaC和 PhaR蛋白为上 述实施例 1 制备的产品； 传统化工类表面活性剂分别为高纯的十二垸基磺酸钠 (简称 SDS， 美国， Biosharp , 纯度^ 95. 0%) 、 油酸钠 （中国， 华大化工， 纯 度^ 95. 0%)和吐温 20 (中国， 展晨生物， 纯度^ 98. 0%) ； 油相为柴油 （中国， 中石化） 。
具体操作如下：
1、 待测物质水溶液的制备： 将纯化后的 PhaP、 PhaC和 PhaR蛋白分别均用 超纯水配制成 50(Vg/ml水溶液， 同样将 SDS、 油酸钠、 吐温 20和牛血清蛋白分 别均用超纯水配制成 50(Vg/ml 水溶液， 得到 7种待测物质水溶液。
2、 以柴油为油相， 将等体积 （待测物质水溶液和油相均为 0. 5ml ) 的待测 物质水溶液和柴油在 20 °C混合进行乳化处理， 乳化处理采用上述涡旋振荡器振 荡处理， 乳化处理完成在避光 25 °C恒温下静置， 静置 2天和 30天拍照观察并记 录油层、 乳化层和水层的高度。 并通过公式 （1 ) 计算得到相关的乳化值。 同时 以超纯水作为对照。
结果表明静置 2天， PhaP、 PhaC和 PhaR乳化的样品有明显的乳化层； SDS 也有明显的乳化层，油酸钠 、吐温 20、和牛血清蛋白样品组没有明显的乳化层。 静置 30天， PhaP、 PhaC和 PhaR乳化的样品的乳化值依然没有明显变化， 而
SDS和柴油形成的乳化层明显降低， 进一步说明 PhaP、 PhaC和 PhaR乳化的样品 不但具有很强的乳化柴油的能力， 还具有很强的乳化层稳定性。
静置 2天和 30天的不同实验组乳化值的对比显示 PhaP、 PhaC和 PhaR乳 化柴油的乳化值较高， 达到 70%以上， 有类似商品型表面活性剂的乳化活性。 其 中 PhaR乳化的样品静置 2天的乳化值是 PhaP乳化的样品的 1. 1倍， 比 PhaC乳 化的样品稍高； PhaR乳化的样品静置 30天的乳化值是 PhaP乳化的样品的 1. 1 倍， 比 PhaC乳化的样品的稍高 （表 1 ) 。
表 1、 不同待测物质的乳化值
PhaC水溶液 71. 51 ± 1· 24%
PhaR水溶液 74. 24 ± 1· 35%
30天 牛血清蛋白水溶液 10. 42+0. 10%
SDS水溶液 20. 70 ± 1· 06%
PhaP水溶液 68. 23+2. 82% 油酸钠水溶液 8. 21+1. 52% 吐温 20水溶液 13. 66+0. 46% 实施例 3、 PhaP , PhaC和 PhaR蛋白水溶液乳化润滑油能力实验
PhaP, PhaC和 PhaR蛋白水溶与相同浓度的传统化工类表面活性剂以及牛血 清蛋白用于乳化润滑油能力的比较。 PhaP、 PhaC和 PhaR蛋白为上述实施例 1制 备的产品； 传统化工类表面活性剂分别为高纯的十二垸基磺酸钠 （简称 SDS， 美 国， Biosharp , 纯度^ 95. 0%) 、 油酸钠 （中国， 华大化工， 纯度^ 95. 0%)和吐 温 20 (中国， 展晨生物， 纯度^ 98. 0%) ； 油相为润滑油 （美国， 美孚） 。
具体操作如下：
1、 待测物质水溶液的制备： 将纯化后的 PhaP、 PhaC和 PhaR蛋白分别均用 超纯水配制成 50(Vg/ml水溶液， 分别得到 PhaP样品组、 PhaC样品组、 PhaR样 品组； 同样将 SDS、 油酸钠、 吐温 20 和牛血清蛋白分别均用超纯水配制成 500 g/ml 水溶液， 分别得到 SDS样品组、 油酸钠样品组、 吐温 20样品组和牛 血清蛋白样品组， 将上述各样品组分别作为待测物质水溶液。
2、 以润滑油为油相， 将等体积 （待测物质水溶液和油相均为 0. 5ml ) 的待 测物质水溶液和润滑油在 20 °C混合进行乳化处理， 乳化处理采用上述涡旋振荡 器振荡处理， 乳化处理完成在避光 25 °C恒温下静置， 静置 2天和 30天拍照观察 并记录油层、 乳化层和水层的高度。 并通过公式 （1 ) 计算得到相关的乳化值。 同时以超纯水作为对照。
结果表明静置 2天， PhaP、 PhaC和 PhaR的样品组有明显的乳化层； 十二 垸基磺酸钠有明显的水层、 油层和乳化层， 乳化值较低。 油酸钠、 吐温 20和牛 血清蛋白的样品组没有明显的乳化层。 同为蛋白质的牛血清蛋白， 未能乳化润 滑油。 静置 30天， PhaP、 PhaC和 PhaR的样品组产生的乳化层没有变化。 说明 PhaP, PhaC和 PhaR不但具有很强的乳化润滑油的能力， 还具有很强的乳化层稳 定性。
表 2、 不同表面活性剂乳化润滑油的乳化值
静置时间 样品组 乳化值
PhaC 67. 96+1. 81%
PhaR 54. 81+1. 92%
牛血清蛋白 14. 58+0. 84%
2天 SDS 40. 50+0. 64%
PhaP 53. 80 ± 2· 22% 油酸钠 6. 99+0. 14%
吐温 20 8. 36+2. 13%
PhaC 67. 96+1. 81%
PhaR 54. 81+1. 92%
牛血清蛋白 10. 42+0. 10%
30天
SDS 25. 36+1. 92%
PhaP 51. 75+2. 20%
油酸钠 8. 21+1. 52%
吐温 20 13. 66+0. 46%
从表 2可以看出， PhaP、PhaC和 PhaR乳化润滑油的乳化值明显高于油酸钠、 吐温 20和牛血清蛋白乳化润滑油的乳化值。
实施例 4、 PhaP , PhaC和 PhaR蛋白水溶液乳化大豆油能力实验
PhaP, PhaC和 PhaR蛋白水溶与相同浓度的传统化工类表面活性剂以及牛血 清蛋白用于乳化食用大豆油能力的比较。 PhaP、 PhaC和 PhaR蛋白为上述实施例 1制备的产品；传统化工类表面活性剂分别为高纯的十二垸基磺酸钠（简称 SDS， 美国， Biosharp , 纯度^ 95. 0%) 、 油酸钠 （中国， 华大化工， 纯度^ 95. 0%)和 吐温 20 (中国， 展晨生物， 纯度^ 98. 0%) ； 油相选择食用大豆油 （中国， 金龙 鱼） 。
具体操作如下：
1、 待测物质水溶液的制备： 将纯化后的 PhaP、 PhaC和 PhaR蛋白分别用超 纯水均配制成 50(Vg/ml水溶液， 分别得到 PhaP样品组、 PhaC样品组、 PhaR样 品组； 同样将 SDS、 油酸钠、 吐温 20 和牛血清蛋白分别用超纯水均配制成 500 g/ml 水溶液， 分别得到 SDS样品组、 油酸钠样品组、 吐温 20样品组和牛 血清蛋白样品组， 将上述各样品组分别作为待测物质水溶液。
2、 以食用大豆油为油相， 将等体积 （待测物质水溶液和油相均为 0. 5ml ) 的待测物质水溶液和食用大豆油在 20 °C混合进行乳化处理， 乳化处理采用上述 涡旋振荡器振荡处理， 乳化处理完成在避光 25 °C恒温下静置， 静置 2天和 30天 拍照观察并记录油层、 乳化层和水层的高度。 并通过公式 （1 ) 计算得到相关的 乳化值。 同时以超纯水作为对照。
结果表明静置 2天， PhaC、 PhaR和 PhaP样品组都有明显的乳化层； 牛血清 蛋白的样品组没有明显的乳化层， 同为蛋白质的牛血清蛋白， 未能乳化大豆油；
SDS 的样品组有明显的乳化层、 水层和油层。 静置 30天， PhaC、 PhaR和 PhaP 样品组产生的乳化层没有变化。 说明 PhaC、 PhaR和 PhaP不但具有很强的乳化 大豆油的能力，还具有很强的乳化层稳定性。在 50(Vg/ ml浓度下， PhaC和 PhaR 都有较强的乳化大豆油的能力， PhaR乳化大豆油的能力稍微优于 PhaC。
表 3、 不同表面活性剂乳化大豆油的乳化值
实施例 5、 PhaP, PhaC和 PhaR蛋白作为表面活性剂 /乳化剂的热稳定性实 验
具体操作如下：
1、 待测物质水溶液的制备： PhaP、 PhaC和 PhaR蛋白为上述实施例 1制备 的产品， 将纯化后的 PhaP、 PhaC和 PhaR蛋白分别用超纯水均配制成 50( g/ml 水溶液。分别对 50(Vg/ml的 PhaP、 PhaC和 PhaR蛋白水溶液 95 °C热处理 30 min 和 60 min, 得到 6种待测物质水溶液。
2、 以柴油 （中国， 中石化） 为油相， 将等体积 （待测物质水溶液和油相均 为 0. 5ml ) 的待测物质水溶液和柴油在 20 °C混合进行乳化处理， 乳化处理采用 上述涡旋振荡器振荡处理， 乳化处理完成在避光 25 °C恒温下静置， 静置 2天拍 照观察并记录油层、 乳化层和水层的高度。 并通过公式 （1 ) 计算得到相关的乳 化值。 同时以超纯水作为对照。
实施例 6、 PhaZ , PhaC和 PhaR包涵体蛋白乳化柴油的效果
测定实施例 1制备的 PhaZ包涵体、 PhaR包涵体和 PhaC包涵体、 PhaZ包涵 体阴性对照上清、 PhaZ包涵体阴性对照沉淀， PhaR包涵体阴性对照上清、 PhaR 包涵体阴性对照沉淀、 PhaC包涵体阴性对照上清和 PhaC包涵体阴性对照沉淀中 的蛋白量， 加水稀释包涵体和包涵体阴性对照上清均至 5000 ug/ml蛋白浓度。 并相同比例稀释包涵体阴性对照沉淀。 -20 °C保存备用。
具体操作如下：
1、 将 PhaZ、 PhaC和 PhaR包涵体蛋白分别用超纯水均配制成 3000 μδ/ ml、 1000 μδ/ ml、 500 μδ/ ml和 0 μ / ml的水溶液。 将 PhaZ包涵体阴性对照上清、 PhaC 包涵体阴性对照上清、 PhaR 包涵体阴性对照上清分别均用超纯水稀释成 3000μδ/ ml , 将 PhaZ 包涵体阴性对照沉淀、 PhaC 包涵体阴性对照沉淀、 PhaR 包涵体阴性对照沉淀分别用超纯水按 0D6。。值稀释至包涵体蛋白 300(Vg/ ml浓度 下的菌体裂解沉淀量， 得到 16种待测物质水溶液。
2、 以柴油 （中国， 中石化） 为油相， 将等体积 （待测物质水溶液和油相均 为 0. 5ml ) 的待测物质水溶液和柴油在 20 °C混合进行乳化处理， 乳化处理采用 上述涡旋振荡器振荡处理， 乳化处理完成在避光 25 °C恒温下静置， 静置 2天和 30天拍照观察并记录油层、 乳化层和水层的高度。 并通过公式 （1 )计算得到相 关的乳化值。
结果表明 300(Vg/ ml的 PhaZ包涵体阴性对照上清水溶液、 PhaC包涵体阴 性对照上清水溶液、 PhaR包涵体阴性对照上清水溶液静置 2天和 30天的乳化值 均相同， 具体见表 5中的阴性对照上清和阴性对照沉淀。 在相同浓度 （300(Vg/ ml ) 时， PhaZ、 PhaC和 PhaR包涵体蛋白乳化柴油的效果与阴性对照对比， 可以 确定乳化效果是由包涵体与柴油的相互作用产生。 阴性对照上清相同量的可溶 性蛋白有较弱的乳化柴油能力， 排除包涵体中残留上清蛋白的影响。 阴性对照 沉淀有较弱的乳化柴油能力， 排除包涵体中残留菌体裂解物的影响。 最后结果 表明包涵体蛋白确实具有乳化柴油的能力。
500 9. 66+2. 37%
3000 68. 96+1. 92%
PhaC包涵体 1000 42. 35+1. 60%
500 7. 77+0. 15% 阴性对照上清 3000 19. 23+2. 69% 阴性对照沉淀 5. 46+0. 23%
3000 72. 00+0%
PhaZ包涵体 1000 12. 00+0. 08%
500 2. 88+1. 68%
3000 67. 61+2. 22%
PhaR包涵体 1000 45. 19+1. 92%
30天 500 8. 65+4. 83%
3000 68. 27+1. 92%
PhaC包涵体 1000 40. 25+1. 58%
500 6. 73+1. 92% 阴性对照上清 3000 16. 35+1. 92% 阴性对照沉淀 2. 00+0% 实施例 7、 PhaZ , PhaC和 PhaR蛋白包涵体作为表面活性剂的热稳定性 测定实施例 1制备的 PhaZ包涵体、 PhaR包涵体和 PhaC包涵体中的蛋白量， 加超纯水稀释包涵体至 3000 ug/ml蛋白浓度， 得到 300(Vg/ml的 PhaZ包涵体 水溶液、 300(Vg/ml的 PhaC包涵体水溶液和 300( g/ml的 PhaR包涵体水溶液。 分别对 3000μδ/πι1 的 PhaZ包涵体水溶液、 300(Vg/ml 的 PhaC包涵体水溶液和 3000μδ/πι1的 PhaR包涵体水溶液 95 °C热处理 30 min和 60 min, 得到 6种待测 物质水溶液。
以柴油 （中国， 中石化） 为油相， 将等体积 （待测物质水溶液和油相均为 0. 5ml ) 的待测物质水溶液和柴油在 20 °C混合进行乳化处理， 乳化处理采用上述 涡旋振荡器振荡处理， 乳化处理完成在避光 25 °C恒温下静置， 静置 2天之后拍 照观察并记录油层、 乳化层和水层的高度。 并通过公式 （1 ) 计算得到相关的乳 化值。
结果显示， PhaZ, PhaC和 PhaR蛋白包涵体经热处理之后依然保有很强的乳 化柴油的能力 （表 6 ) 。
表 6、 PhaZ, PhaC和 PhaR蛋白包涵体热处理不同时间的乳化值
3000μδ/πι1 PhaC包涵体水溶
68. 13+1. 52% 66. 27+1. 92% 液
PhaZ, PhaC和 PhaR蛋白包涵体热处理的稳定性都相当好， 说明蛋白包涵体 内部不容易受到破坏， 这也正是包涵体蛋白较可溶性蛋白的一个优势： 稳定存 在， 不受胞内酶解， 不易受外力破坏。
实施例 8、 PhaR与 PhaC混合液乳化润滑油和柴油的能力
1、 待测物质水溶液的制备： 将实施例 1纯化后的 PhaC和 PhaR蛋白分别用 超纯水均配制成 50(Vg/ml水溶液， 得到 50(Vg/ml 的 PhaC水溶液 （简称 PhaC 水溶液） 和 50(Vg/ml的 PhaR水溶液 （简称 PhaR水溶液） ， 作为两种待测物质 水溶液。 同时将上述两种溶液按体积比 1 : 1 混合， 配制成 PhaR 和 PhaC 均为 250 g/ml的混合表面活性剂水溶液， 得到第三种待测物质水溶液。
2、 以润滑油 （美国， 美孚）或柴油 （中国， 中石化）为油相， 将等体积（待 测物质水溶液和油相均为 0. 5ml ) 的待测物质水溶液和油相在 20 °C混合进行乳 化处理， 乳化处理采用上述涡旋振荡器振荡处理， 乳化处理完成在避光 25 °C恒 温下静置， 静置 2 天拍照观察并记录油层、 乳化层和水层的高度。 并通过公式 ( 1 ) 计算得到相关的乳化值。
结果如表 7所示， 表明 PhaR和 PhaC混合蛋白为表面活性剂的样品乳化润 滑油和柴油均有明显的乳化层； 乳化层高度介于分别用 PhaR和 PhaC乳化润滑 油和柴油时的乳化层。
表 7 的结果表明， 混合表面活性剂乳化柴油和润滑油的乳化值比 PhaR或 PhaC单独用来乳化油相时的乳化值高约 10%。 表明 PhaR和 PhaC混合后依然有 乳化柴油和润滑油的能力而且乳化能力得到了有效增强。
实施例 9、 PhaR, PhaC和 PhaZ包涵体混合液乳化柴油的能力
1、测定实施例 1制备的 PhaZ包涵体、 PhaR包涵体和 PhaC包涵体中的蛋白 量， 加超纯水稀释包涵体至 3000 ug/ml蛋白浓度， 分别得到 300(Vg/ml的 PhaZ 包涵体水溶液（简称 PhaZ包涵体水溶液）、 300(Vg/ml的 PhaC包涵体水溶液（简 称 PhaC包涵体水溶液） 和 300(Vg/ml的 PhaR包涵体水溶液 （简称 PhaR包涵体 水溶液） ， 作为三种待测物质水溶液。 同时， 将 PhaZ包涵体水溶液与 PhaC包
涵体水溶液按体积比 1 : 1 混合， 配制成 PhaZ包涵体和 PhaC包涵体均为 1500 ug/ml蛋白浓度的水溶液， 得到 PhaZ和 PhaC混合包涵体水溶液， 作为第四种待 测物质水溶液； 将 PhaZ包涵体水溶液与 PhaR包涵体水溶液按体积比 1： 1混合， 配制成 PhaZ包涵体和 PhaR包涵体均为 1500 ug/ml蛋白浓度的水溶液，得到 PhaZ 和 PhaR混合包涵体水溶液， 作为第五种待测物质水溶液； 将 PhaC包涵体水溶 液与 PhaR包涵体水溶液按体积比 1： 1混合， 配制成 PhaC包涵体和 PhaR包涵体 均为 1500 ug/ml蛋白浓度的水溶液， 得到 PhaC和 PhaR混合包涵体水溶液， 作 为第六种待测物质水溶液； 将 PhaR包涵体水溶液、 PhaZ包涵体水溶液与 PhaC 包涵体水溶液按体积比 1： 1： 1混合， 配制成 PhaR包涵体、 PhaZ包涵体和 PhaC 包涵体均为 1000 ug/ml蛋白浓度的水溶液， 得到 PhaZ、 PhaR和 PhaC混合包涵 体水溶液， 作为第七种待测物质水溶液。
2、 以柴油 （中国， 中石化） 为油相， 将等体积 （待测物质水溶液和油相均 为 0. 5ml ) 的待测物质水溶液和柴油在 20 °C混合进行乳化处理， 乳化处理采用 上述涡旋振荡器振荡处理， 乳化处理完成在避光 25 °C恒温下静置， 静置 2天拍 照观察并记录油层、 乳化层和水层的高度。 并通过公式 （1 ) 计算得到相关的乳 化值。
结果如表 8所示， 表明 PhaZ、 PhaR和 PhaC混合包涵体依然有乳化柴油的 能力。 当 PhaZ和 PhaC两种包涵体混合之后， 混合液的乳化作用降低。 但是含 有 PhaR的混合液的乳化能力比每种包涵体单独用来乳化的乳化效果显著增强。
实验证明 PhaZ、 PhaC和 PhaR包涵体蛋白都具有乳化柴油、 润滑油和食用 油的能力， 且静止长时间乳化层保持稳定， 热处理之后也有很好的乳化能力。 可溶蛋白的乳化性能与包涵体类似， 但是在加热条件下， 很容易降解， 导致其 热稳定性下降， 乳化能力降低。 而包涵体的强热稳定性， 可以在很高温度下， 依然保持结构稳定， 保证了高温下蛋白的乳化能力。 在保存过程中， 可溶蛋白
也极易降解， 而包涵体蛋白则更稳定。 在运输过程中， 可溶蛋白容易震荡极易 起泡沫， 而包涵体则相对稳定。
Claims
1、 与调控蛋白 PhaR相关物质在制备油水乳状液中的应用， 所述与调控蛋 白 PhaR相关物质为 A1-A6中的任一种：
所述 A1为由调控蛋白 PhaR包涵体、 PHA合成酶 PhaC包涵体和 PHA降解酶
PhaZ包涵体组成的产品；
所述 A2为由所述调控蛋白 PhaR包涵体和所述 PHA合成酶 PhaC包涵体组成 的产品；
所述 A3为所述调控蛋白 PhaR包涵体和所述 PHA降解酶 PhaZ包涵体组成的 产品；
所述 A4为由所述调控蛋白 PhaR包涵体；
所述 A5为由调控蛋白 PhaR和 PHA合成酶 PhaC组成的产品；
所述 A6为所述调控蛋白 PhaR。
2、 根据权利要求 1所述的应用， 其特征在于： 所述调控蛋白 PhaR是如下 al) 、 a2) 或 a3) 的蛋白质：
al) 氨基酸序列如 SEQ ID No.2所示的蛋白质；
a2) 在 SEQ ID No.2的第 1位前加入 6个组氨酸得到的融合蛋白；
a3) 将 SEQ ID No.2经过取代和 /或缺失和 /或添加一个或几个氨基酸残基 得到的具有氨基酸序列如 SEQ ID No.2所示的蛋白质相同活性的突变体蛋白； 所述 PHA合成酶 PhaC是如下 bl) 、 b2) 或 b3) 的蛋白质：
bl) 氨基酸序列如 SEQ ID No.4所示的蛋白质；
b2) 在 SEQ ID No.4的第 1位前加入 6个组氨酸得到的融合蛋白；
b3) 将 SEQ ID No.4经过取代和 /或缺失和 /或添加一个或几个氨基酸残基 得到的具有氨基酸序列如 SEQ ID No.4所示的蛋白质相同活性的突变体蛋白； 所述 PHA降解酶 PhaZ包涵体中的 PHA降解酶 PhaZ是如下 cl)、 c2)或 c3) 的蛋白质：
cl) 氨基酸序列如 SEQ ID No.6所示的蛋白质；
c2) 在 SEQ ID No.6的第 1位前加入 6个组氨酸得到的融合蛋白；
c3) 将 SEQ ID No.6经过取代和 /或缺失和 /或添加一个或几个氨基酸残基 得到的具有氨基酸序列如 SEQ ID No.6所示的蛋白质相同活性的突变体蛋白；
3、 根据权利要求 2所述的应用， 其特征在于：
所述 A5中， 所述调控蛋白 PhaR和所述 PHA合成酶 PhaC的质量比为 1: 1； 所述 A1中， 所述调控蛋白 PhaR包涵体、 所述 PHA合成酶 PhaC包涵体和所 述 PHA降解酶 PhaZ包涵体的质量比为 1: 1： 1；
所述 A2中，所述调控蛋白 PhaR包涵体和所述 PHA合成酶 PhaC包涵体的质 量比为 1: 1；
所述 A3中所述调控蛋白 PhaR包涵体和所述 PHA降解酶 PhaZ包涵体的质量
比为 1 : 1。
4、 根据权利要求 2所述的应用， 其特征在于： 所述调控蛋白 PhaR和所述 调控蛋白 PhaR 包涵体是将调控蛋白 PhaR 基因导入大肠杆菌使所述调控蛋白 PhaR基因表达得到的， 所述 PHA合成酶 PhaC和所述 PHA合成酶 PhaC包涵体是 将 PHA合成酶 PhaC基因导入大肠杆菌使所述 PHA合成酶 PhaC基因表达得到的， 所述 PHA降解酶 PhaZ包涵体是将 PHA降解酶 PhaZ基因导入大肠杆菌使所述 PHA 降解酶 PhaZ基因表达得到的。
5、 根据权利要求 4所述的应用， 其特征在于： 所述调控蛋白 PhaR基因的 编码序列是 SEQ ID No. 1， 所述 PHA合成酶 PhaC基因的编码序列是 SEQ ID No. 3， 所述 PHA降解酶 PhaZ基因的编码序列是 SEQ ID No. 5。
6、根据权利要求 2所述的应用，其特征在于：所述油相为石化油或食用油。
7、与调控蛋白 PhaR相关物质在制备乳化剂中的应用，所述与调控蛋白 PhaR 相关物质为 A1-A6中的任一种：
所述 A1为由调控蛋白 PhaR包涵体、 PHA合成酶 PhaC包涵体和 PHA降解酶 PhaZ包涵体组成的产品；
所述 A2为由所述调控蛋白 PhaR包涵体和所述 PHA合成酶 PhaC包涵体组成 的产品；
所述 A3为所述调控蛋白 PhaR包涵体和所述 PHA降解酶 PhaZ包涵体组成的
■≠∑：口
广 ΒΠ；
所述 A4为由所述调控蛋白 PhaR包涵体；
所述 A5为由调控蛋白 PhaR和 PHA合成酶 PhaC组成的产品；
所述 A6为所述调控蛋白 PhaR。
8、 根据权利要求 7所述的应用， 其特征在于： 所述调控蛋白 PhaR是如下 al ) 、 a2 ) 或 a3 ) 的蛋白质：
al ) 氨基酸序列如 SEQ ID No. 2所示的蛋白质；
a2 ) 在 SEQ ID No. 2的第 1位前加入 6个组氨酸得到的融合蛋白；
a3 ) 将 SEQ ID No. 2经过取代和 /或缺失和 /或添加一个或几个氨基酸残基 得到的具有氨基酸序列如 SEQ ID No. 2所示的蛋白质相同活性的突变体蛋白； 所述 PHA合成酶 PhaC是如下 b l ) 、 b2 ) 或 b3 ) 的蛋白质：
b l ) 氨基酸序列如 SEQ ID No. 4所示的蛋白质；
b2 ) 在 SEQ ID No. 4的第 1位前加入 6个组氨酸得到的融合蛋白；
b3 ) 将 SEQ ID No. 4经过取代和 /或缺失和 /或添加一个或几个氨基酸残基 得到的具有氨基酸序列如 SEQ ID No. 4所示的蛋白质相同活性的突变体蛋白； 所述 PHA降解酶 PhaZ包涵体中的 PHA降解酶 PhaZ是如下 c l ) 、 c2 )或 c3 ) 的蛋白质：
c l ) 氨基酸序列如 SEQ ID No. 6所示的蛋白质；
c2 ) 在 SEQ ID No. 6的第 1位前加入 6个组氨酸得到的融合蛋白；
c3 ) 将 SEQ ID No. 6经过取代和 /或缺失和 /或添加一个或几个氨基酸残基 得到的具有氨基酸序列如 SEQ ID No. 6所示的蛋白质相同活性的突变体蛋白；
9、 根据权利要求 8所述的应用， 其特征在于：
所述 A5中， 所述调控蛋白 PhaR和所述 PHA合成酶 PhaC的质量比为 1 : 1； 所述 A1中， 所述调控蛋白 PhaR包涵体、 所述 PHA合成酶 PhaC包涵体和所 述 PHA降解酶 PhaZ包涵体的质量比为 1 : 1： 1；
所述 A2中，所述调控蛋白 PhaR包涵体和所述 PHA合成酶 PhaC包涵体的质 量比为 1 : 1；
所述 A3中所述调控蛋白 PhaR包涵体和所述 PHA降解酶 PhaZ包涵体的质量 比为 1 : 1。
10、 根据权利要求 8所述的应用， 其特征在于： 所述调控蛋白 PhaR和所述 调控蛋白 PhaR 包涵体是将调控蛋白 PhaR 基因导入大肠杆菌使所述调控蛋白 PhaR基因表达得到的， 所述 PHA合成酶 PhaC和所述 PHA合成酶 PhaC包涵体是 将 PHA合成酶 PhaC基因导入大肠杆菌使所述 PHA合成酶 PhaC基因表达得到的， 所述 PHA降解酶 PhaZ包涵体是将 PHA降解酶 PhaZ基因导入大肠杆菌使所述 PHA 降解酶 PhaZ基因表达得到的。
11、 根据权利要求 10所述的应用， 其特征在于： 所述调控蛋白 PhaR基因 的编码序列是 SEQ ID No. 1，所述 PHA合成酶 PhaC基因的编码序列是 SEQ ID No. 3， 所述 PHA降解酶 PhaZ基因的编码序列是 SEQ ID No. 5。
12、 根据权利要求 8所述的应用， 其特征在于： 所述油相为石化油或食用 油。
13、 制备油水乳状液的方法， 包括将水相和油相等体积混合进行乳化制备 油水乳状液的步骤， 所述水相是与调控蛋白 PhaR相关物质的水溶液；
所述与调控蛋白 PhaR相关物质为 A1-A6中的任一种：
所述 A1为由调控蛋白 PhaR包涵体、 PHA合成酶 PhaC包涵体和 PHA降解酶
PhaZ包涵体组成的产品；
所述 A2为由所述调控蛋白 PhaR包涵体和所述 PHA合成酶 PhaC包涵体组成 的产品；
所述 A3为所述调控蛋白 PhaR包涵体和所述 PHA降解酶 PhaZ包涵体组成的 产品；
所述 A4为由所述调控蛋白 PhaR包涵体；
所述 A5为由调控蛋白 PhaR和 PHA合成酶 PhaC组成的产品；
所述 A6为所述调控蛋白 PhaR;
所述水相满足 1 ) -6 ) 的条件：
1 ) 所述水相为所述 A1 的水溶液， 所述 A1 的水溶液的蛋白质总浓度为
2 ) 所述水相为所述 A2 的水溶液， 所述 A2 的水溶液的蛋白质总浓度为
水相为所述 A3 的水溶液， 所述 A3 的水溶液的蛋白质总浓度为 述水相为所述 A4 的水溶液， 所述 A4 的水溶液的蛋白质浓度为
5) 所述水相为所述 A5 的水溶液， 所述 A5 的水溶液的蛋白质总浓度为 500 g/ml;
6) 所述水相为所述 A6 的水溶液， 所述 A6 的水溶液的蛋白质浓度为 500 g/ml。
14、 根据权利要求 13所述的方法， 其特征在于： 所述调控蛋白 PhaR是如 下 al) 、 a2) 或 a3) 的蛋白质：
al) 氨基酸序列如 SEQ ID No.2所示的蛋白质；
a2) 在 SEQ ID No.2的第 1位前加入 6个组氨酸得到的融合蛋白； a3) 将 SEQ ID No.2经过取代和 /或缺失和 /或添加一个或几个氨基酸残基 得到的具有氨基酸序列如 SEQ ID No.2所示的蛋白质相同活性的突变体蛋白； 所述 PHA合成酶 PhaC是如下 bl) 、 b2) 或 b3) 的蛋白质：
bl) 氨基酸序列如 SEQ ID No.4所示的蛋白质；
b2) 在 SEQ ID No.4的第 1位前加入 6个组氨酸得到的融合蛋白； b3) 将 SEQ ID No.4经过取代和 /或缺失和 /或添加一个或几个氨基酸残基 得到的具有氨基酸序列如 SEQ ID No.4所示的蛋白质相同活性的突变体蛋白； 所述 PHA降解酶 PhaZ包涵体中的 PHA降解酶 PhaZ是如下 cl)、 c2)或 c3) 的蛋白质：
cl) 氨基酸序列如 SEQ ID No.6所示的蛋白质；
c2) 在 SEQ ID No.6的第 1位前加入 6个组氨酸得到的融合蛋白； c3) 将 SEQ ID No.6经过取代和 /或缺失和 /或添加一个或几个氨基酸残基 得到的具有氨基酸序列如 SEQ ID No.6所示的蛋白质相同活性的突变体蛋白；
15、 根据权利要求 14所述的方法， 其特征在于：
所述 A5中， 所述调控蛋白 PhaR和所述 PHA合成酶 PhaC的质量比为 1: 1； 所述 A1中， 所述调控蛋白 PhaR包涵体、 所述 PHA合成酶 PhaC包涵体和所 述 PHA降解酶 PhaZ包涵体的质量比为 1: 1： 1；
所述 A2中，所述调控蛋白 PhaR包涵体和所述 PHA合成酶 PhaC包涵体的质 量比为 1: 1；
所述 A3中所述调控蛋白 PhaR包涵体和所述 PHA降解酶 PhaZ包涵体的质量 比为 1: 1。
16、 根据权利要求 14所述的方法， 其特征在于： 所述调控蛋白 PhaR和所 述调控蛋白 PhaR包涵体是将调控蛋白 PhaR基因导入大肠杆菌使所述调控蛋白 PhaR基因表达得到的， 所述 PHA合成酶 PhaC和所述 PHA合成酶 PhaC包涵体是
将 PHA合成酶 PhaC基因导入大肠杆菌使所述 PHA合成酶 PhaC基因表达得到的， 所述 PHA降解酶 PhaZ包涵体是将 PHA降解酶 PhaZ基因导入大肠杆菌使所述 PHA 降解酶 PhaZ基因表达得到的。
17、 根据权利要求 16所述的方法， 其特征在于： 所述调控蛋白 PhaR基因 的编码序列是 SEQ ID No. 1，所述 PHA合成酶 PhaC基因的编码序列是 SEQ ID No. 3， 所述 PHA降解酶 PhaZ基因的编码序列是 SEQ ID No. 5。
18、 根据权利要求 14所述的方法， 其特征在于： 所述油相为石化油或食用 油。
19、 乳化剂， 为 Al-A3、 A5中的任一种产品：
所述 A1为由调控蛋白 PhaR包涵体、 PHA合成酶 PhaC包涵体和 PHA降解酶
PhaZ包涵体组成的产品；
所述 A2为由所述调控蛋白 PhaR包涵体和所述 PHA合成酶 PhaC包涵体组成 的产品；
所述 A3为所述调控蛋白 PhaR包涵体和所述 PHA降解酶 PhaZ包涵体组成的 产品；
所述 A5为由调控蛋白 PhaR和 PHA合成酶 PhaC组成的产品。
20、 根据权利要求 19所述的乳化剂， 其特征在于：
所述 A5中， 所述调控蛋白 PhaR和所述 PHA合成酶 PhaC的质量比为 1 : 1； 所述 A1中， 所述调控蛋白 PhaR包涵体、 所述 PHA合成酶 PhaC包涵体和所 述 PHA降解酶 PhaZ包涵体的质量比为 1 : 1： 1；
所述 A2中，所述调控蛋白 PhaR包涵体和所述 PHA合成酶 PhaC包涵体的质 量比为 1 : 1；
所述 A3中所述调控蛋白 PhaR包涵体和所述 PHA降解酶 PhaZ包涵体的质量 比为 1 : 1。
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