WO2014163471A1 - Procede de formulation stable d'un produit biofertilisant a base d'une souche fixatrice d'azote atmospherique, azospirillum brasillense - Google Patents

Procede de formulation stable d'un produit biofertilisant a base d'une souche fixatrice d'azote atmospherique, azospirillum brasillense Download PDF

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WO2014163471A1
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strain
product
biofertilizer
product based
azospirillum
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PCT/MA2014/000004
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Inventor
Rafik Errakhi
Ahmed LEHBRIHI
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Valorhyze
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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C05—FERTILISERS; MANUFACTURE THEREOF
    • C05F—ORGANIC FERTILISERS NOT COVERED BY SUBCLASSES C05B, C05C, e.g. FERTILISERS FROM WASTE OR REFUSE
    • C05F11/00—Other organic fertilisers
    • C05F11/08—Organic fertilisers containing added bacterial cultures, mycelia or the like

Definitions

  • Azospirillum represents is one of the best genera known for their ability on the one hand to fix free nitrogen. On the other hand to stimulate the growth of plants. Four aspects of the Azospirillum plant-root interaction are highlighted: the natural habitat, the interaction of plant roots, nitrogen fixation and the biosynthesis of plant growth hormones.
  • Azospirillum species have the ability to promote plant growth. They are able to fix from 1-10 kg N 2 / ha. In addition, the increase in yield is mainly due to their ability to produce phytohormones that improve root growth and therefore a considerable increase in the absorption of water and minerals.
  • the present invention relates to a product based on a bacterium of the genus Azospirillum in liquid form as well as the application and the method of manufacture of this product for improving the crop yields and fixing the free nitrogen.
  • the formulation of a product based on microorganisms remains the most important point in a process for the production of biofertilizing products. As such, the microorganism must remain viable and virulent for improved efficacy once re-enforced.
  • the inventors have found a technique for preserving Azospirillum. According to the inventors of this patent, a better formulation starts from the production of microorganisms.
  • the formulation is included in the manufacturing process.
  • the bacterium presented in this invention was isolated from the barley rhizosphere of aixie agricultural soil. The technique used to have this kind of bacteria is as follows:
  • the isolation of the strain according to the invention can be carried out from samples of the soil rhizosphere of Morocco.
  • Rhizosphere samples obtained sterile after removing 10 cm from the root of the soil.
  • the samples taken are placed in sterile closed polyethylene bags and stored at 4 ° C away from the sun.
  • the fixing strains of free N 2 are then isolated on a specific medium without a nitrogen source and with mannitol as a Carbonne source. But before the sample has undergone four types of successive treatments: treatment by dry grinding, heat 50 ° C for 10 min, agitation 240rpm / min and centrifugation.
  • the strains obtained are transferred to the rich medium.
  • the pure isolines are kept at 4 ° C for 2 months.
  • the cultures are resuspended and stored in glycerol at -20 ° C.
  • Test 1 free nitrogen fixation test
  • the strain was subjected to a N de production test in a culture medium without a nitrogen source.
  • the medium changes color as shown in Figure 1.
  • Test 4 trials on rapeseed under glass. Trials under controlled conditions were performed to show the efficacy of the strain to stimulate the plants. The results of this test show that the strain significantly stimulates the growth of rape plants ( Figure 3A). In addition, it allowed good assimilation of mineral elements with better fixation of nitrogen ( Figure 3B). In the same way they allowed to have very important roots.
  • Test 5 Stability of the product in the formulation
  • FIG. 1 amplification of the NiF gene in the Azospirillum strain.
  • the NiF gene band is indicated by the small arrow on the left
  • Figure 3 effect of treatment of rapeseed seeds by the Azospirillum strain on the growth and assimilation of nutrients.

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
  • Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)

Abstract

La présente invention concerne l'application d'un produit biofertilisant à base d'une souche d'Azospirillum ayant la capacité de fixer l'azote atmosphérique. Cette dernière a été identifiée par son caractère de stimulation de l'assimilation des éléments nutritifs et par l'augmentation du rendement des cultures. De même, l'invention décrite dans ce présent brevet concerne le procédé de formulation qui a été incluse dés le départ dans le procédé de la production en masse de la souche bactérienne. Des essais ont été effectués et sur la stabilité de la souche dans le produit et sur l'efficacité de ce dernier dans l'amélioration des rendements des cultures.

Description

Titre
PROCEDE DE FORMULATION STABLE D'UN PRODUIT BIOFERTILISANT A BASE D'UNE SOUCHE FIXATRICE
D'AZOTE ATMOSPHERIQUE, AZOSPIRILLUM BRASILLENSE
Descriptif
La recherche de nouvelles stratégies, visant à maintenir ou accroître la productivité des systèmes agricoles tout en diminuant les intrants chimiques, peuvent en particulier s'appuyer sur les résultats de recherches récentes, qui ont mis en évidence l'importance cruciale des microorganismes dans le fonctionnement biologiques des sols. Ces recherches ont ainsi conduit à l'émergence de la notion de « biofertilisants », définis comme des produits contenant différents types de microorganismes ayant la capacité de favoriser la croissance des plantes par différents mécanismes encore partiellement élucidés (fixation d'azote atmosphérique, solubilisation d'éléments minéraux, synthèse de phytohormones ou précurseurs). Parmi ces microorganismes on trouve des bactéries, regroupées sous le terme Bactéries Favorisant la Croissance des Plantes (BFCP), en anglais Plant Growth-Promoting Rhizobacteria (PGPR), ainsi que des champignons, notamment mycorhiziens.
Durant les dernières années, plusieurs travaux de recherche ont été focalisés sur les microorganismes libres (non symbiotes) fixateurs d'azote atmosphériques (diazotrophes). Azospirillum représente est l'un des meilleurs genres connu pour leur aptitude d'une part à fixer l'azote libre. D'autre part à stimuler la croissance des plantes. Quatre aspects de l'interaction plante-racine Azospirillum sont mis en évidence: l'habitat naturel, l'interaction des racines des plantes, fixation de l'azote et de la biosynthèse des hormones de croissance des plantes.
Généralement les espèces d'Azospirillum, mais pas toujours, ont la capacité de promouvoir la croissance des plantes. Ils sont capable de fixer de 1-10 kg N2 / ha. De plus, l'augmentation du rendement est principalement due à leur capacité de produire des phytohormones qui améliorent la croissance racinaire et par conséquent une augmentation considérable de l'absorption d'eau et de minéraux.
La présente invention vise un produit à base d'une bactérie du genre Azospirillum sous forme liquide ainsi que l'application et le procédé de fabrication de ce produit pour l'amélioration des rendements de culture et la fixation de l'azote libre.
D'après les chercheurs, la formulation d'un produit à base de microorganismes reste le point le plus important dans un procédé de fabrication de produits biofertilisants. Tel que, le microorganisme doit rester viable et virulent pour une meilleure efficacité une fois remis en application. Dans ce travail, les inventeurs ont trouvé une technique pour conserver l'Azospirillum. Selon les inventeurs de ce brevet, une meilleure formulation commence dés la production des microorganismes. Dans la présente invention, la formulation est incluse dans le procédé de fabrication. La bactérie présentée dans cette invention a été isolée de la rhizosphère de l'orge d'un sol agricole marocain. La technique utilisée pour avoir ce genre de bactérie est la suivante :
Mise en présence d'un échantillon biologique (racines + sol) susceptible de contenir la souche en question, avec un milieu approprié pour la sélection de souches ayant cette fonctionnalité,
Traitement dudit échantillon pour isoler les souches
L'isolement de la souche selon l'invention peut être effectué à partir d'échantillons de la rhizosphère du sol de Maroc.
Le protocole de traitement décrit est le suivant :
Des échantillons de la Rhizosphère obtenus de façon stérile après avoir retirer 10 cm de la racine du sol.
Les échantillons prélevés sont placés dans des sachets stériles en polyéthylènes fermés et stockés à 4°C à l'abri du soleil.
Les souches fixatrices de N2 libre sont ensuite isolées sur milieu bien précis sans source d'azote et avec du mannitol comme source de Carbonne. Mais avant l'échantillon a subit quatre types de traitements successifs : traitement par le broyage à sec, la chaleur 50°C pendant 10 min, agitation 240rpm/min et centrifugation.
Les souches obtenues sont transférées sur le milieu riche. Les isolais purs sont maintenus à 4°C pendant 2 mois. Alternativement, les cultures sont resuspendues et conservées dans le glycérol à -20°C
Par la suite des essais de criblage et d'efficacité ont été effectués pour caractériser et montrer le rôle de la souche à fixer l'azote libre et à promouvoir la croissance des plantes.
Essai 1 : test de fixation d'azote libre
La souche a été soumise à un test de production de N¾ dans un milieu de culture sans source d'azote. En cas de production de NH3 le milieu change de couleur comme le montre la figure 1.
Essai 2 : production de phytohormones
Le tableau suivant montre la capacité de la souche à produire l'auxine
Figure imgf000003_0001
Essai 3 : Le gène NiF
La dernière technologie de biologie moléculaire a montré la présence d'un gène chez les bactéries responsable de la fixation de l'azote libre. L'extraction de l'ADN de la souche Azospirillum ainsi que son amplification via les techniques de PCR a révélé la présence du gène NiF comme le montre la figure 2.
Essai 4 : essais sur colza sous serre. Des essais sous conditions contrôlées ont été effectués pour montrer l'efficacité de la souche à stimuler les plantes. Les résultats de cet essai montrent que la souche stimule de façon importante la croissance des plants de colza (Figure 3A). De plus, elle a permis une bonne assimilation d'éléments minéraux avec une meilleure fixation d'azote (Figure 3B). De même elles ont permis d'avoir des racines très importantes.
Essai 5: stabilité du produit dans la formulation
Plusieurs formulations ont été testées pour avoir une longue stabilité des souches pendant la durée du stockage. La façon de conserver les souches était finalement d'inclure le procédé de formulation dans le procédé de production des souches.
En effet, production des souches dans leur milieu de culture industriel adapté dans la phase stationnaire de la production et avant d'arriver à la fin de la phase exponentielle on ajoute un agent de stabilisation et de conservation des deux souches. Les résultats sont montrés sur la figure 4.
La liste des figures avec leur légende
Figure 1 : teste de production de NH3 montrant la fixation de l'azote atmosphérique
Figure 2 : amplification du gène NiF chez la souche Azospirillum. La bande du gène NiF est indiquée par la petite flèche à gauche
Figure 3 : effet de traitement des semences de colza par la souche Azospirillum sur la croissance et l'assimilation des nutriments.
Figure 4 : stabilité des souches dans les deux types de formulation liquide et solide

Claims

Les Revendications
1- Produit biofertilisant à base de bactérie fixatrice d'azote libre non symbiotique caractérisé par ce qu'il est constitué de :
Azospirillum sp.
- CMC avec une quantité qui varie de 0.01% à 0.5%
Agent de conservation et de stabilisation avec une quantité qui varie de 2% à 5%
- Eau stérile
2- Procédé de fabrication du produit de la revendication 1 caractérisé par une étape incluant le procédé de formulation par l'ajout de l'agent stabilisant avant la phase stationnaire et un peu avant la fin de la phase exponentiel de la croissance des deux souches bactériennes.
3- Le produit de la revendication 1 et 2 est appliqué comme produit de la fertilisation agricole pour la fixation biologique de l'azote atmosphérique dans le sol et la stimulation de la croissance de plantes
4- Application du produit, selon les revendications 1, 2 et 3, pour la fertilisation agricole caractérisé par les différents types d'application à savoir traitement de semences, traitement localisé, traitement par pulvérisation sur le sol.
5- Le produit biofertilisant, selon les revendications précédentes, caractérisé par son efficacité de fertilisation agricole du sol et par le procédé de fabrication permettant une bonne stabilité de la souche bactérienne pendant longtemps.
PCT/MA2014/000004 2013-04-05 2014-04-01 Procede de formulation stable d'un produit biofertilisant a base d'une souche fixatrice d'azote atmospherique, azospirillum brasillense WO2014163471A1 (fr)

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