WO2014135593A1 - Procede de capture de virus - Google Patents

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WO2014135593A1
WO2014135593A1 PCT/EP2014/054277 EP2014054277W WO2014135593A1 WO 2014135593 A1 WO2014135593 A1 WO 2014135593A1 EP 2014054277 W EP2014054277 W EP 2014054277W WO 2014135593 A1 WO2014135593 A1 WO 2014135593A1
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viruses
aqueous medium
virus
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Axelle Cadiere
Clément FAYE
Laurent Garrelly
Benoit ROIG
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Colcom
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    • C12N2795/00011—Details
    • C12N2795/00051—Methods of production or purification of viral material

Definitions

  • the present invention relates to a method for capturing viruses present in aqueous media, methods for eliminating, concentrating and quantifying said viruses and materials for their implementation.
  • Contamination of water with viruses is a major cause of public health concern, as it is recognized as an important source of waterborne diseases. More than 120 different types of virus, from infected people and likely to end up in environmental waters, such as drinking water, have been identified. Many of these viruses, such as adenoviruses, enteroviruses and hepatitis A virus, are associated with many gastric diseases, such as gastroenteritis and diarrhea.
  • Virus detection requires a step of efficiently concentrating a large volume of water into a much smaller volume.
  • the different filtration techniques can use filters built from a wide range of materials: glass wool, cellulose ester, nitrocellulose, alginate, fiberglass, polyethersulfone, polycarbonate, PTFE etc. They can be used in the native state or modified by the binding of chemical compounds that can improve their properties. Filters having on their surface charges are generally composed of a surface capable of reacting and covalently bonding organic or inorganic compounds or polymers such as aluminum hydroxide, hydroxyapatite, polyethylenimine, poly methyl methacrylate , polystyrene, etc. However, the retention capacity of these filters are variable depending on the matrix and the type of virus sought.
  • Precipitation techniques can not be used alone and are always coupled with filtration techniques.
  • the decontamination of viruses in water can be carried out by various processes and must lead to a reduction of the viral concentration of 4 logs minimum.
  • the 2 main methods of water treatment are physical disinfection and chemical disinfection.
  • Physical disinfection can be performed by clarification and filtration processes.
  • Granular filtration commonly used, coupled with coagulation, flocculation and clarification allows elimination of 0.1 to 3.4 log of virus.
  • viruses in water may be free or associated with particles, their adsorption depends on a number of factors, such as the isoelectric point and hydrophobicity of both the virus and the particle.
  • microfiltration membrane coupled with coagulation allows elimination of viruses up to 4 log with variable results depending on viruses.
  • Ultrafiltration membranes allows relatively efficient virus removal, however, the observed performance may vary depending on the nature of the membrane used, the nature of the viruses present. Nanofiltration and reverse osmosis techniques, besides their cost, are difficult to implement on a pilot scale and require monitoring of the state of the membranes. These methods are otherwise incompatible with industrial processes.
  • the international application WO 2006/110632 describes filters for eliminating viruses, said filters being made from a mixture of mesoporous and microporous particles coated with polymers which can be chosen from different categories, for example polyvinylamine, poly (N-methylvinylamine), polyallylamine, polyallyldimethylamine, polydiallylmethylamine, polydiallyldimethylammonium chloride, polyvinylpyridinium chloride, poly (2-vinylpyridine), poly (4-vinylpyridine), polyvinylimidazole, poly (4-aminomethylstyrene) ), poly (4-aminostyrene), polyvinyl (acrylamide-co-dimethylaminopropylacrylamide), polyvinyl (acrylamide-co-dimethylaminoethyl methacrylate), polyethyleneimine, polylysine, DAB-Am and PAMAM dendrimers, ethacryl amodopropyl chloride trimethyl ammonium (MAPTAC
  • the application GB 2431472 describes a composite material formed of magnetic particles, of a substance bearing a hydroxyl group and of a substance bearing a cationic group, these different elements being bonded together either by absorption or by covalent bonds. This material, added in the medium containing the viruses to be extracted, fixes the viruses by giving a virus-material complex which is recovered.
  • the application WO2006 / 096199 relates to a method for treating contaminated water by filtration on dendrimers.
  • biodendrimers are mentioned and it is suggested that they could be good candidates for targeting viruses, no biodendrimer is specifically described and all examples relate to a PAMAM dendrimer used to extract copper.
  • the use of dendrimers makes it possible to increase the size of the contaminants to be eliminated, so there is a filtration by size.
  • dendrimers would bring nothing to the capture of viruses, since ultrafiltration is already used.
  • these methods have the disadvantage of generating a high loss of charge.
  • the application WO 2005/108300 discloses a filtration system for eliminating the viruses present in the water through carbon-based filters optionally coated with metal or cationic ions having a beneficial effect against viruses.
  • the filtration capacity of this system is essentially related to the specific porosity of the carbon used and the coatings have no impact on this filtration capacity.
  • the present invention also aims to provide a material coated with polylysine grafted dendrimers (DGL) for the implementation of this new process.
  • DGL polylysine grafted dendrimers
  • the present invention finally aims to provide a method for decontaminating aqueous media and a method for detecting and quantifying viruses implementing said method.
  • the subject of the present invention is therefore a method for capturing viruses from an aqueous medium capable of containing them, said method comprising a step of bringing said aqueous medium into contact with polylysine dendrimers, said dendrimers being either in solution in said aqueous medium, either immobilized on a carrier, to allow the viruses to bind to the dendrimers and form a dendrimer-virus complex.
  • the terms “capture”, “trapping” and “complexation” are equivalent. Indeed, according to the invention, the viruses contained in the aqueous medium are captured or entrapped by attachment to the polylysine dendrimers form a stable virus-dendrimer complex in water.
  • polylysine dendrimers arborescent polymers of L-lysine such as those described by Denkewalter, RG, et al. (Macromolecular highly branched homogeneous compound based on lysine units, in USP, 1981, Allied Corp., US Macromolecular highly branched homogeneous compound, in USP, 1983, Allied Corp .: US) and by Juan Rodriguez-Hernandez, and al. (Highly Branched Poly (L-lysine), Biomacromolecules, (2003), 4: pp. 249-258), Klok H. et al.
  • DGL polylysine grafted dendrimers
  • All these dendrimers are either lysine only, in this case homopolylysines, or more than 30 mol% of lysine and also containing units of other amino acids, in this case is called heteropolylysines.
  • polylysine grafted dendrimers of generations 2 to 7, native or modified are used.
  • nonpolylysine grafted dendrimers means dendrimers in which the amine functions are free.
  • modified polylysine grafted dendrimers means dendrimers in which all or part of the amino functions are covalently or non-covalently bound to another amino acid, to electropositive chemical functions (quaternary amines, guanidine), to hydrophobic functions such as chains (C 2 -C 8) alkyl, functions cholesterols, or poly-ethylene glycol.
  • electropositive chemical functions quaternary amines, guanidine
  • hydrophobic functions such as chains (C 2 -C 8) alkyl
  • cholesterols or poly-ethylene glycol.
  • the polylysine grafted dendrimers are of generations 2 to 5, that is to say those of generations 2, 3, 4 or 5.
  • the method may comprise at least one step chosen from a step of recovering the viruses or one of their constituents, a step of recovering the dendrimer-virus complex formed as a result of the contacting step, a step of quantifying the viruses and a step of identifying the viruses.
  • the method may also comprise several of these steps, for example a step of recovering viruses or one of their constituents and a step quantifying the viruses or a step of recovering the viruses or one of their constituents and a step of identifying the viruses.
  • the process also comprises, after the contacting step, a step of immobilization of the dendrimer-virus complex formed as a result of said step of contacting and a recovery step of the viruses or one of their constituents.
  • the supports used are known to those skilled in the art and may in particular be chosen from the group comprising stationary phases and magnetic or non-magnetic solid beads.
  • the step of recovering the viruses from the complexes fixed on these different materials may be performed by any technique known to those skilled in the art and will depend on the type of material chosen to fix the dendrimer-virus complex; for example, elution, centrifugation and magnetic separation.
  • the latter may be chosen from filter media such as glass fibers, chemical polymer fibers, filters based on natural polymers and filters based on chemical polymers or chromatographic supports.
  • filter media such as glass fibers, chemical polymer fibers, filters based on natural polymers and filters based on chemical polymers or chromatographic supports.
  • organic supports chosen from the group comprising polypropylene, polystyrene, polyethylene, nylon, polytetrafluoroethylene (PTFE), polyvinylidene fluoride (PVDF), polycarbonate (PC) and polysulfones.
  • polyethersulfones PES
  • PET polyethylene terephthalate
  • polymethylmethacrylate or polyacrylic acid alginate and cellulose-based materials (cellulose esters: cellulose acetate, cellulose nitrate, etc.), inorganic supports selected from alumina and glass fibers.
  • the formats of said solid supports may be magnetic or non-magnetic particles or porous matrices inert with a surface-modifying agent.
  • the dendrimers in particular the DGLs, can be immobilized on the surface of these materials either noncovalently by adsorption or covalently, for example by using activated ester functions (NHS and sulfo-NHS), epoxy functional groups, aldehyde functions acrylate or methacrylate functions or plasma surface activation, such as argon, oxygen or iodine plasma.
  • activated ester functions NHS and sulfo-NHS
  • epoxy functional groups epoxy functional groups
  • aldehyde functions acrylate or methacrylate functions
  • plasma surface activation such as argon, oxygen or iodine plasma.
  • the amount of dendrimers fixed on the support is a function of the type of support, the volume and the type of aqueous medium, in particular the volume of water to be treated.
  • the skilled person will know in light of his general knowledge choose the type and amount of support coated dendrimers necessary to achieve optimum efficiency of the method.
  • nucleic acids DNA, or RNA
  • DNA DNA, or RNA
  • the extraction of the nucleic acids can also be carried out directly from the virus-dendrimer complex.
  • the dendrimer can be covalently attached to the support or absorbed after formation of the virus-dendrimer complex.
  • the step of identifying and quantifying the viruses from the nucleic acids can be carried out by any techniques known to those skilled in the art, in particular by polymerase chain reaction (PCR), by amplification by transcription ( TMA or Transcription Mediated Amplification), by ligase chain reaction (LCR), by isothermal nucleic acid amplification and initiated by chimeric primers (ICAN or isothermal and chimeric-primer-driven amplification of nucleic acid), by isothermal loop-mediated amplification of DNA (LAMP or Loop-mediated isothermal amplification of DNA).
  • PCR polymerase chain reaction
  • TMA Transcription Mediated Amplification
  • LCR ligase chain reaction
  • ICAN isothermal nucleic acid amplification and initiated by chimeric primers
  • LAMP isothermal loop-mediated amplification of DNA
  • Viruses can also be identified and quantified by immunodetection or by cell culture techniques.
  • the dendrimers When the dendrimers are used directly in solution in an aqueous medium capable of containing viruses, they are added to said aqueous medium in the form of a solution in water, at a concentration of between 1 milligram and 1 gram / liter, fixed in depending on the quality and origin of the aqueous medium, especially the water to be treated. Those skilled in the art will know how to fix the amounts of dendrimers in the light of their general knowledge.
  • duration of the contact between the aqueous medium and the dendrimers, in particular the DGLs may be from a few seconds to a few minutes depending on the method of homogenization of the mixture and the volume of DGL in solution added to the volume of sample to be treated.
  • aqueous medium means any medium comprising at least 50% by weight of water.
  • Non-limiting examples include water intended for human consumption, water from reservoirs, water from treatment basins, river water, sea water, liquids biological (including plasma, blood, serum, urine, saliva, cell lysate), aqueous food liquids (including fruit juice, vegetable juice, milk .%) and cell culture media. All these media can be treated directly or after dilution, if necessary.
  • the method allows the capture of any enteric virus such as, for example, adenoviruses, rotaviruses, hepatitis A virus and Norovirus I, hepatitis E virus (HEV), rotavirus and enteroviruses (poliovirus, Coxsackie A and B virus, echovirus).
  • enteric virus such as, for example, adenoviruses, rotaviruses, hepatitis A virus and Norovirus I, hepatitis E virus (HEV), rotavirus and enteroviruses (poliovirus, Coxsackie A and B virus, echovirus).
  • the materials used comprise polylysine grafted dendrimers of generations 2 to 7, advantageously of generations 2 to 5 (generations 2, 3, 4 or 5), which are native or modified and immobilized either on a chosen organic support in the group comprising polypropylene, polystyrene, polyethylene, nylon, polytetrafluoroethylene (PTFE), polyvinylidene fluoride (PVDF), polycarbonate (PC), polysulfones, polyethersulfones (PES), polyethylene terephthalate (PET), polymethyl methacrylate or polyacrylic, alginate and cellulose-based materials (cellulose esters: cellulose acetate, cellulose nitrate ...), an inorganic carrier selected from alumina and fibers of glass.
  • the material used has a low pressure drop.
  • the aqueous medium from which viruses are removed is water intended for human consumption.
  • the subject of the present invention is also a method for quantifying viruses in an aqueous medium capable of containing them, characterized in that it comprises:
  • polylysine dendrimers especially polylysine grafted dendrimers, generations 2 to 7, advantageously generations 2, 3, 4 or 5
  • said dendrimers being in solution in said aqueous medium, either immobilized on a support, to allow the viruses to bind to the dendrimers and form a dendrimer-virus complex
  • FIG. 1 gives the composition of the media used in the example Figure 2 illustrates the standard curve for quantifying the concentration of bacteriophage MS2 of the solution. It represents the bacteriophage concentration expressed in pfu / mL as a function of the average of the threshold cycles (Ct) obtained for each concentration ⁇ standard deviation. Each measurement was done in triplicate.
  • FIG. 3 illustrates the average adsorption efficiency calculated from 6 independent experiments for bacteriophage MS2 according to the method described in example 2 and the average recovery efficiency calculated from 3 independent experiments for bacteriophage MS2 according to the method described in Example 2.
  • the error bars represent the standard deviation.
  • FIG. 4 illustrates the linearity of the virus concentration method according to Example 2.
  • the curve represents the logarithm of the expected number of viral particles in a solution as a function of the number of virus particles recovered after concentration.
  • Figure 5 shows the recovery of viral particles.
  • the histograms represent the average particle recovery for each condition: a) concentration, b) batch and c) manipulator. Five replicates of each condition were made and the error bars indicate the standard deviation. Two concentrations were tested at 10 pfu / mL (light gray) and 100 pfu / mL (dark gray).
  • DGL poly-L-lysine
  • the modified GLD is purified by steric exclusion chromatography on a Sephadex ® G25 resin (XK50 column) in an ammonium carbonate buffer (0.1M) at 20 mL / min.
  • the modified DGL is lyophilized.
  • the modified DGL is dissolved in water at the rate of 10 g / l and the solution is degassed for 1 hour.
  • polypropylene filters (SICAM Geotextiles, France, 8.4 mg, 7 mm in diameter, fiber diameter 25 ⁇ m) are washed in an ultrasonic bath, successively with water and then with water.
  • the plasma reactor is composed of two parallel aluminum cylindrical electrodes (diameter: 13 cm, distance between the electrodes: 6 cm) placed in a cylindrical container coupled to an RF generator (13.56 MHz) and equipped with a pump effective vacuum (speed 18 m 3 / h, initial pressure in the device less than 4 Pa).
  • the polypropylene samples are placed on the lower electrode in a glass container.
  • the reactor pressure is adjusted to 4 Pa.
  • the argon is introduced into the chamber to reach the desired pressure. This one is recorded with a regulated gauge of Pirani.
  • the activation is carried out with a power of 10 W for an argon plasma pressure of 40 Pa for about 90 seconds.
  • the plasma-activated filters are coated with a solution of DGL modified at 10 g / L for 2 hours at 25 ° C. to obtain a complete grafting yield.
  • the filters are lyophilized and stored under vacuum at -20 ° C.
  • Example 2 Evaluation of the ability of immobilized DGLs to retain viruses and to be used as a tool for concentration and quantification of viruses
  • a 250 mL flask containing 25 mL Lennox LB medium (see composition FIG. 1) is inoculated with E. coli K12 Hfr cells. coli (NCTC 12486) which are allowed to grow overnight in said LB medium Lennox.
  • the culture is incubated for 90 minutes at 37 ° C with shaking (100 rpm).
  • a bacteriophage MS2 solution (NCTC12487) is added to the culture at a final MS2 concentration of 10 7 pfu / mL. After incubating for 5 hours at 37 ° C. (shaking at 100 rpm), 2.5 ml of chloroform are added to the culture; then the culture medium is cooled to 4 ° C for 18 hours.
  • the number of bacteriophages expressed in unit-forming plates per unit volume is determined by standard titration (NF EN ISO 10705-1 (2001), using Salmonella typhimurium WG49 (NCTC 12484) as host
  • NF EN ISO 10705-1 2001
  • Salmonella typhimurium WG49 NCTC 12484
  • Five hundred microliters of Salmonella typhimurium WG49 stock NCTC 12484
  • TYGB Teryptone yeast extract glucose broth
  • the culture is placed on melted ice
  • Serial dilutions of the bacteriophage solution are performed Alternatively, 1 mL of each dilution is mixed with 1 mL of Salmonella typhimurium culture WG49 and 2 5 ml of TYGA top agar medium (see composition FIG. 1) and poured onto a petri dish containing TYGA medium (see composition in FIG.1) The dishes are incubated for 18 hours at 37 ° C. For each diluent tested, two series are realized. Only one of them is treated with RNAseA at a final concentration of 40 ⁇ g / mL.
  • the graft material prepared according to Example 1 is placed at the lower end of a serological pipette. A 50 mL syringe is used as a reservoir. The virus solution is filtered 10 times through the DGL-coated material. 2.1.4 Extraction of viral RNA
  • the viral RNA is extracted using the QIAamp Viral RNA Mini Kit (Qiagen) according to the supplier's recommendations. The extraction is carried out on 140 ⁇ l of viral suspension in water treated with diethylpyrocarbonate. The RNA is eluted with 60 ⁇ l of AVE buffer. The extracts are immediately stored at -80 ° C.
  • the quantification of the viruses is carried out by chain amplification by quantitative quantitative polymerization in real time (qRT-PCR) after preliminary extraction of the RNA according to Example 2.1.4.
  • QRT-PCR is performed with KAPA SYBR Fast One-Step qRT-PCR kit (CliniSciences) according to the supplier's recommendations.
  • a 168 bp fragment is amplified into triplicates using the KAPA SYBR Fast One-Step kit qRT-PCR (CliniSciences).
  • the reaction media contain 10 ⁇ l of KAPA SYBR Fast qPCR master mix (CliniSciences), 0.4 ⁇ l of KAPA RT (CliniSciences), 100 nM of each primer, 2 ⁇ l of purified RNA and sufficient water. to have a final volume of 20 pL.
  • the sense primer is the sequence MS2-F, 5'-TCGATGGTCCATACCTTAGATGC-3 'and corresponds to the genome region of bacteriophage MS2 1255 to 1277 and the antisense primer is the sequence MS2-R 3' - ACCCCGTTAG CG AAGTTG CT- 5 'and corresponds to the region 1423 to 1404 of the bacteriophage MS2 genome (NC_001417) according to Ogorzaly et al. (Development of real-time RT-PCR methods for specifying detection of F-specific RNA bacteriophage genogroups: application to urban raw wastewater, J Virol Methods, 2006, 138, 131-139).
  • the synthesis of the cDNA is carried out at 42 ° C for 5 min then the reverse transcriptase is inactivated at 95 ° C for 5 min, 40 cycles of PCR are then carried out with a denaturation of 3 sec at 95 ° C, 20 sec of hybridization at 59.7 ° C and 1 sec extension and data acquisition at 72 ° C. This last step is followed by the analysis of a melting curve carried out by increasing the temperature from 50 to 90 ° C, at the rate of an increase of 0.2 ° C every 2 sec with a plateau of reading to obtain the fluorescence signal. 2.1.6 Establishment of standard curves
  • the recovery percentage is calculated as the ratio of the virus concentration after filtration to the theoretical concentration in water.
  • a measurable dilution of virus (10 4 pfu / mL) was used as a PCR standard.
  • MS2 bacteriophage uptake capacity by DGL is determined by comparing the concentration of virus in the water before and after filtration through DGL. 10 milliliters of standard solutions in water with virus concentrations of 10 6 pfu / ml and 10 8 pfu / ml are used to determine the maximum absorption capacity of DGLs. They are filtered through the DGL coated material, eluted directly using the lysis buffer of the RNA extraction kit; the RNAs are then purified.
  • DGL filters The ability of DGL filters to retain viruses was assessed using low virus concentrations (below the limit of detection). Two virus solutions in water at 10 1 pfu / ml and 10 2 pfu / ml respectively in a final volume of IL and 100 mL were used. The extraction of the RNA is carried out directly on the DGLs and the RNA is eluted in 60 ⁇ L. These conditions lead to a concentration factor of 1660 and 16600 times for a drilled volume of respectively 100mL or IL.
  • the tests are carried out five times by three experimenters and two batches of DGL. In total, 60 experiments were carried out, a randomization of the experiments was carried out in order to limit the day effect.
  • the efficiency calculated according to the method given in Example 2.1.6 is 101.8% and the correlation coefficient squared greater than 0.998.
  • the detection limit is the smallest number of genome units that give a PCR result with a 90% threshold. 10 different dilutions prepared at 10 3 pfu / mL and 10 2 pfu / mL were analyzed. The detection limit value is 10 3 pfu / mL corresponding to 4 pfu / well PCR, with 90% of positive samples.
  • the limit of quantification (Lq) corresponding to the first value of the calibration curve is 10 4 pfu / ml, ie 50 pfu / well of PCR.
  • the recovery percentage calculated as the ratio between the number of particles recovered and the number of particles adsorbed on the support is about 77% regardless of the concentration used ( Figure 3B).
  • the DLG allow a high retention and a good recovery of bacteriophages (Figure 5): the recovery percentage ranging from 87% to 258%.
  • RNA from the viruses is carried out on 140 ⁇ of the initially contaminated solution and on 140 ⁇ of each of the 6 samples after their filtration on the SCX cartridge according to the method described in Example 2.1.5.
  • the average recovery yield of the viruses obtained is 103% ⁇ 8%, ie no reduction.
  • RNA extraction is performed with the QIAamp Viral RNA Kit Mini Kit (Qiagen) according to the manufacturer's recommendations.
  • QRT-PCR is performed with KAPA SYBR Fast One-Step qRT-PCR kit (CliniSciences) according to the supplier's recommendations.
  • the HAV68 TCA CCG CCG TTT GCC TAG sequences from position 68 to 85 and reverse primer HAV240: GGA GAG CCC TGG AAG AAA G located from position 241 to 223 of the genome of the hepatitis A virus were used at a final concentration of 215 nM.
  • Example 5 Capturing GI Norovirus in Commercial Water
  • the amount of virus retained on the support was determined by assaying the initial amount of virus in the solution and the amount of virus remaining in the water after filtration.
  • RNA extraction is performed with the QIAamp Viral RNA Kit Mini Kit (Qiagen) according to the manufacturer's recommendations.
  • QRT-PCR is performed with KAPA SYBR Fast One-Step qRT-PCR kit (CliniSciences) according to the supplier's recommendations.
  • the QNIF4 CGC TGG ATG CGN TTC CAT sequences from position 5290 to 5308 and reverse primer NVILCR: CCT TAG ACG CCA TCA TCA TTT AC located from position 5376 to 5353 of the Norovirus GI genome were used at a final concentration of 400 nM. 5.2. Results of the capture of the GI norovirus virus by
  • the amount of virus retained on the support was determined by assaying the initial amount of virus in the solution and the amount of virus remaining in the water after filtration.
  • RNA extraction is performed with QIAamp kit Viral RNA Mini kit

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Abstract

Procédé de capture de virus à partir d'un milieu aqueux susceptible d'en contenir, ledit procédé comprenant une étape de mise en contact dudit milieu aqueux avec des dendrimères de polylysine, lesdits dendrimères étant soit en solution dans ledit milieu aqueux, soit immobilisés sur un support, pour permettre aux virus de se fixer aux dendrimères et former un complexe dendrimères-virus.

Description

PROCEDE DE CAPTURE DE VIRUS
La présente invention concerne un procédé de capture de virus présents dans des milieux aqueux, des méthodes pour éliminer, concentrer et quantifier lesdits virus et des matériaux pour leur mise en œuvre.
La contamination de l'eau par des virus est une cause majeure de préoccupation en matière de santé publique, car elle est reconnue comme une source importante de maladies d'origine hydrique. Plus de 120 types différents de virus, provenant de personnes infectées et donc susceptibles de se retrouver dans les eaux environnementales, comme par exemple l'eau de consommation, ont été identifiés. Plusieurs de ces virus, comme les adénovirus, les entérovirus et le virus de l'hépatite A sont associés à de nombreuses maladies gastriques, comme la gastro-entérite et la diarrhée.
Même à faible concentration, les virus représentent un danger en raison de leurs capacités de virulence.
A l'heure actuelle, la détection et la quantification de virus ainsi que la décontamination sont rendues difficiles :
-d'une part à cause de la grande diversité des virus entériques potentiellement pathogènes pour l'homme (estimés à 120),
-d'autre part à cause des faibles concentrations retrouvées qui nécessitent des systèmes de captures des virus efficaces.
Par conséquent, l'un des principaux défis à relever dans une perspective de gestion des risques est le développement de méthodes de détection des virus présents à faible concentration.
La détection des virus nécessite une étape de concentration efficace d'un grand volume d'eau dans un volume beaucoup plus petit.
Actuellement les méthodologies utilisées sont principalement : la filtration par le procédé d'adsorption-élution, la floculation et la précipitation organique ainsi que l'ultrafiltration.
Les différentes techniques de filtration peuvent utiliser des filtres construits à partir d'une large gamme de matériaux : laine de verre, ester de cellulose, nitrocellulose, alginate, fibre de verre, polyethersulfone, polycarbonate, PTFE etc. Ils peuvent être utilisés à l'état natif ou modifié par la liaison de composés chimiques pouvant améliorer leurs propriétés. Les filtres présentant à leur surface des charges sont généralement composés d'une surface pouvant réagir et lier de manière covalente des composés organiques ou inorganiques ou des polymères tels que l'hydroxyde d'aluminium, l'hydroxyapatite, le polyéthylènimine, le poly méthyl méthacrylate, le polystyrène etc.. Toutefois, les capacités de rétention de ces filtres sont variables en fonction de la matrice et du type de virus recherché.
Les techniques d'ultrafiltration, basées également sur l'utilisation de filtres, modifiés ou non, donnent également des résultats variables en fonction des virus. Ces techniques ont un coût élevé et restent difficile à utiliser sur des gros volumes. (Cashdollar J. L. et al., J. Appt. Microbiol., (2013), Methods for prima ry concentration of viruses from water samples: a review and meta-analysis of récent studi es doi : 10.1111/jam. l243).
Les techniques de précipitation ne peuvent être utilisées seules et sont toujours couplées à des techniques de filtration.
La décontamination des virus dans les eaux peut être réalisée par différents procédés et doit conduire à un abattement de la concentration virale de 4 logs minimum. Les 2 principales méthodes de traitement de l'eau sont la désinfection physique et la désinfection chimique.
La désinfection chimique par des agents tels que la chloramine, le chlore, le dioxyde de chlore et l'ozone, est couramment utilisée. Différentes études visant à évaluer l'efficacité de ces traitements sur l'élimination des virus entériques ont permis de mettre en évidence une variabilité de résistance des virus aux différents traitements rendant nécessaires des prétraitements pour assurer une meilleure décontamination.
La désinfection physique peut être réalisée par les procédés de clarification et de filtration. La filtration granulaire, couramment utilisée, couplée à de la coagulation, de la floculation et de la clarification permet une élimination de 0,1 à 3,4 log de virus. Les virus dans l'eau pouvant être libres ou associés à des particules, leur adsorption dépend d'un certain nombre de facteurs, tels que le point isoélectrique et hydrophobicité à la fois du virus et de la particule. L'utilisation de membrane de microfiltration couplée à de la coagulation permet une élimination des virus jusqu'à 4 log avec des résultats variables en fonction des virus. L'utilisation de membranes d'ultrafiltration permet une élimination des virus relativement efficace, cependant, les performances observées peuvent varier en fonction de la nature de la membrane utilisée, de la nature des virus présents. Les techniques de nanofiltration et d'osmose inverse, outre leur coût, sont difficiles à mettre en œuvre à l'échelle pilote et nécessitent une surveillance de l'état des membranes. Ces méthodes sont par ailleurs peu compatibles avec les procédés industriels.
Aujourd'hui, un des principaux challenges est d'améliorer la détection des virus entériques dans l'eau et donc de développer de nouvelles méthodes de concentration et d'extraction qui permettent de détecter de faibles concentrations de virus dans l'eau.
Ainsi la demande internationale WO 2006/110632 décrit des filtres pour éliminer notamment les virus, lesdits filtres étant réalisés à partir d'un mélange de particules mésoporeuses et microporeuses recouvertes de polymères pouvant être choisis dans différentes catégories, comme par exemple la polyvinylamine, la poly(N-méthylvinylamine), la polyallylamine, la polyallyldiméthylamine, la polydiallylméthylamine, le chlorure de polydiallyldiméthylammonium, le chlorure de polyvinylpyridinium, la poly(2- vinylpyridine), la poly(4-vinylpyridine), le polyvinylimidazole, le poly(4- aminométhylstyrène), le poly(4-aminostyrène), le polyvinyl(acrylamide-co- diméthylaminopropylacrylamide), le polyvinyl(acrylamide-co- diméthyaminoethylméthacrylate), la polyéthylèneimine, la polylysine, les dendrimères DAB-Am et PAMAM, le chlorure d'éthacryl amodopropyl triméthyl ammonium (MAPTAC) et le chlorure de diallyl diméthyl ammonium (DADMAC).
La demande GB 2431472 décrit un matériau composite formé de particules magnétiques, d'une substance portant un groupe hydroxy et d'une substance portant un groupe cationique, ces différents éléments étant liés entre eux soit par absorption, soit par des liaisons covalentes. Ce matériau, ajouté dans le milieu contenant les virus à extraire, fixe les virus en donnant un complexe virus-matériau qui est récupéré.
La demande WO2006/096199 concerne une méthode de traitement des eaux contaminées par filtration sur des dendrimères. Bien que des biodendrimères soient mentionnés et qu'il soit suggéré qu'ils pourraient être de bons candidats pour cibler des virus, aucun biodendrimère n'est spécifiquement décrit et tous les exemples concernent un dendrimère PAMAM mis en œuvre pour extraire du cuivre. L'utilisation des dendrimères permet d'augmenter la taille des contaminants à éliminer, on a donc une filtration par taille. Dans le cas des virus, les dendrimères n'apporteraient rien à la capture des virus, puisque l'ultrafiltration est déjà utilisée. De plus, ces procédés présentent l'inconvénient de générer une forte perte de charges. La demande WO 2005/108300 divulgue un système de filtration pour éliminer les virus présents dans l'eau grâce à des filtres à base de carbone éventuellement recouvert par des ions métalliques ou cationiques ayant un effet bénéfique à rencontre des virus. La capacité de filtration de ce système est essentiellement liée à la porosité spécifique du carbone utilisé et les revêtements sont sans incidence sur cette capacité de filtration. Toutefois, il existe encore un besoin de disposer d'une méthode qui présente les avantages suivants :
- être techniquement simple et rapidement réalisable,
- avoir un fort rendement,
- concentrer une gamme de virus (peu spécifique),
- déboucher sur un faible volume de concentrât
- être peu chère
- être capable de supporter de grands volumes d'eau
- être répétable et reproductible
- ne pas mettre en œuvre de composés chimiques dangereux pour l'environnement et la santé humaine
Au cours de leurs travaux, les inventeurs ont mis au point un procédé qui permet de satisfaire toutes ces exigences et met en œuvre un matériau qui comprend des polymères arborescents de lysines, appelés dendrimères de polylysine. Ce type de matériau permet de piéger et de retenir les virus afin de les extraire de leur milieu, avec un fort rendement, sans dépense importante d'énergie, à faible coût et dans le respect de l'environnement puisque ces matériaux sont des composés issus de la chimie verte. Aussi la présente invention a-t-elle pour but de fournir un procédé de capture de virus qui pallie les inconvénients des procédés existants.
La présente invention a également pour but de fournir un matériau revêtu de dendrimères greffés de polylysine (DGL) permettant la mise en œuvre de ce nouveau procédé.
La présente invention a enfin pour but de mettre à disposition une méthode de décontamination de milieux aqueux et une méthode de détection et de quantification de virus mettant en œuvre ledit procédé.
La présente invention a donc pour objet un procédé de capture de virus à partir d'un milieu aqueux susceptible d'en contenir, ledit procédé comprenant une étape de mise en contact dudit milieu aqueux avec des dendrimères de polylysine, lesdits dendrimères étant soit en solution dans ledit milieu aqueux, soit immobilisés sur un support, pour permettre aux virus de se fixer aux dendrimères et de former un complexe dendrimères- virus.
Au sens de la présente invention, les termes « capture », « piégeage » et « complexation » sont équivalents. En effet, conformément à l'invention, les virus contenus dans le milieu aqueux sont capturés ou piégés par fixation sur les dendrimères de polylysine forment un complexe virus-dendrimères stable dans l'eau.
Au sens de la présente invention, on entend par « dendrimères de polylysine », des polymères arborescents de L-lysine tels ceux décrits par Denkewalter, R. G., et al. , (Macromolecular highly branched homogeneous compound based on lysine units., in USP. 1981, Allied Corp. : US. ; Macromolecular highly branched homogeneous compound, in USP. 1983, Allied Corp. : US) et par Juan Rodriguez-Hernandez, et al. (Highly Branched Poly (L-lysine). Biomacromolecules, (2003), 4: p. 249-258), Klok H . et al. (Dendritic-Graft Polypeptides, Macromolecules, (2002), 35 : p. 8718-8723) ainsi que ceux à base de D- ou de L-lysine décrits dans la demande internationale WO2006/114528 et appelés dendrimères greffés de polylysine (DGL). Tous ces dendrimères sont soit constitués uniquement de lysine, on parle dans ce cas d'homopolylysines, soit constitués de plus de 30% en mole de lysine et contenant également des unités d'autres aminoacides, on parle dans ce cas d'hétéropolylysines. Dans un mode de réalisation avantageux de l'invention, on utilise des dendrimères greffés de polylysine de générations 2 à 7, natifs ou modifiés.
Des DGL de génération 1 ne permettent pas une bonne fixation des virus alors que des dendrimères de générations supérieures à 7 ont tendance à former des agrégats qui rendent difficile leur utilisation .
On entend par dendrimères greffés de polylysine natifs des dendrimères dans lesquels les fonctions aminés sont libres.
On entend par dendrimères greffés de polylysine modifiés, des dendrimères dont tout ou partie des fonctions aminés sont liées de manière covalente ou non à un autre acide aminé, à des fonctions chimiques électropositives (aminés quaternaires, guanidine), à des fonctions hydrophobes telles que les chaînes (C2-Ci8)alkyles, des fonctions cholestérols, ou des poly-éthylène-glycol . L'homme du métier saura réaliser les modifications de ces groupes aminés en faisant appel à ses connaissances générales ou aux techniques décrites dans la littérature, comme par exemple celles décrites par Rossi J .C. et al. (Functionalisation of free amino groups of lysine dendrigraft (DGL) polymers, Tetrahedron Letters, (2012), 53, p : 2976-2979) . Il saura également choisir le type de modifications à apporter en fonction du virus à cibler. Ainsi avec la méthode selon l'invention, il est possible de capturer et de quantifier tout type de virus capable d'interagir avec un DGL natif ou avec un DGL modifié dont les fonctions aminés ont été modifiées par des fonctions anioniques, hydrophobes ou hydrophobes et anioniques.
Dans un mode de réalisation avantageux de l'invention, les dendrimères greffés de polylysine sont de générations 2 à 5, soit ceux de générations 2, 3, 4 ou 5.
Dans un mode de réalisation avantageux de l'invention, après l'étape de fixation des virus sur les dendrimères, le procédé peut comprendre au moins une étape choisie parmi une étape de récupération des virus ou d'un de leurs constituants, une étape de récupération du complexe dendrimères- virus formé à la suite de l'étape de mise en contact, une étape de quantification des virus et une étape d'identification des virus. Le procédé peut également comprendre plusieurs de ces étapes, par exemple une étape de récupération des virus ou d'un de leurs constituants et une étape de quantification des virus ou une étape de récupération des virus ou d'un de leurs constituants et une étape d'identification des virus.
Lorsque les dendrimères, notamment les DGL, sont utilisés en solution dans le milieu aqueux, le procédé comprend en outre, après l'étape de mise en contact, une étape d'immobilisation du complexe dendrimères- virus formé à la suite de ladite étape de mise en contact et une étape de récupération des virus ou d'un de leurs constituants. Les supports utilisés sont connus de l'homme du métier et peuvent être notamment choisis dans le groupe comprenant des phases stationnaires et des billes solides magnétiques ou non.
L'étape de récupération des virus à partir des complexes fixés sur ces différents matériaux pourra être réalisée par toute technique connue de l'homme du métier et sera fonction du type de matériau choisi pour fixer le complexe dendrimères-virus ; on peut citer à titre d'exemple, l'élution, la centrifugation et la séparation magnétique.
Lorsque les dendrimères, notamment les DGL, sont utilisés immobilisés sur un support, ce dernier peut être choisi parmi les supports filtrants tels que les fibres de verre, les fibres de polymères chimiques, les filtres à base de polymères naturels et les filtres à base de polymères chimiques ou les supports de chromatographies. On peut citer à titre d'exemple les supports organiques choisis dans le groupe comprenant le polypropylène, le polystyrène, le polyéthylène, le nylon, le polytétrafluoroéthylène (PTFE), le polyfluorure de vinylidène (PVDF), le polycarbonate (PC), les polysulfones, les polyéthersulfones (PES), le polytéréphtalate d'éthylène (PET), le polyméthacrylate de méthyle ou polyacrylique, l'alginate et les matériaux à base de cellulose (esters de cellulose : acétate de cellulose, nitrate de cellulose...), les supports inorganiques choisis parmi l'alumine et les fibres de verre. Les formats des dits supports solides peuvent êtres des particules magnétiques ou non ou des matrices poreuses inertes avec un agent de modification de surface. Les dendrimères, notamment les DGL peuvent être immobilisés à la surface de ces matériaux soit de manière non covalente par adsorption, soit de manière covalente, comme par exemple en utilisant des fonctions esters activées (NHS et sulfo-NHS), des fonctions époxy, des fonctions aldéhydes des fonctions acrylate ou méthacrylate ou par l'activation de surface par plasma, tel que le plasma d'argon, d'oxygène ou d'iode.
La quantité de dendrimères fixée sur le support est fonction du type de support, du volume et du type de milieu aqueux, notamment de volume d'eau, à traiter. L'homme du métier saura à la lumière de ses connaissances générales choisir le type et la quantité de support revêtus de dendrimères nécessaires pour obtenir une efficacité optimale de la méthode.
Lorsque les virus ont été récupérés, leurs acides nucléiques (ADN, ou ARN) peuvent être extraits par toute technique connue de l'homme du métier. L'extraction des acides nucléiques peut également être réalisée directement à partir du complexe virus-dendrimère. Le dendrimère peut être fixé de manière covalente sur le support ou absorbé après formation du complexe virus-dendrimère.
L'étape d'identification et de quantification des virus à partir des acides nucléiques peuvent être réalisées par toutes techniques connues de l'homme du métier, notamment par réaction en chaîne par polymérisation (PCR ou polymérisation chain reaction), par amplification par transcription (TMA ou Transcription Mediated Amplification), par réaction en chaîne de ligase (LCR ou ligase chain reaction), par amplification d'acide nucléique isothermique et initiée par des amorceurs chimériques (ICAN ou isothermal and chimeric primer-initiated amplification of nucleic acid), par amplification isothermique d'ADN médiée par des boucles (LAMP ou Loop-mediated isothermal amplification of DNA).
Les virus peuvent également être identifiés et quantifiés par immunodétection ou par des techniques de culture cellulaire.
Lorsque les dendrimères sont utilisés directement en solution dans un milieu aqueux susceptible de contenir des virus, ils sont ajoutés audit milieu aqueux sous forme d'une solution dans l'eau, à une concentration comprise entre 1 milligramme et 1 gramme/litre, fixée en fonction de la qualité et de l'origine du milieu aqueux, notamment de l'eau à traiter. L'homme du métier saura fixer les quantités de dendrimères à la lumière de ses connaissances générales.
L'homme du métier saura fixer la durée de la mise en contact entre le milieu aqueux et les dendrimères, notamment les DGL, à la lumière de ses connaissances générales. Cette durée pourra être de quelques secondes à quelques minutes selon le procédé d'homogénéisation du mélange et du volume de DGL en solution ajouté au volume d'échantillon à traiter.
Au sens de la présente invention, on entend par «milieu aqueux» tout milieu comprenant au moins 50 % en poids d'eau. On peut citer à titre d'exemples non limitatifs, l'eau destinée à la consommation humaine, l'eau de réservoirs, l'eau issue de bassins d'épuration, l'eau de rivière, l'eau de mer, les liquides biologiques (notamment plasma, sang, sérum, urine, salive, lysat cellulaire), les liquides alimentaires aqueux (notamment jus de fruits, jus de légumes, lait ....) et les milieux de culture cellulaires. Tous ces milieux peuvent être traités directement ou après dilution, si cela s'avère nécessaire.
Conformément à l'invention, le procédé permet la capture de tout virus entérique comme par exemple les adénovirus, les rotavirus, le virus de l'hépatite A et le Norovirus I, le virus de l'hépatite E (VHE), les rotavirus et les entérovirus (poliovirus, virus Coxsackie A et B, échovirus).
Conformément à l'invention les matériaux mis en œuvre comprennent des dendrimères greffés de polylysine de générations 2 à 7, avantageusement de générations 2 à 5 (générations 2, 3, 4 ou 5), natifs ou modifiés et immobilisés soit sur un support organique choisi dans le groupe comprenant le polypropylène, le polystyrène, le polyéthylène, le nylon, le polytétrafluoroéthylène (PTFE), le polyfluorure de vinylidène (PVDF), le polycarbonate (PC), les polysulfones, les polyéthersulfones (PES), le polytéréphtalate d'éthylène (PET), le polyméthacrylate de méthyle ou polyacrylique, l'alginate et les matériaux à base de cellulose (esters de cellulose : acétate de cellulose, nitrate de cellulose...), soit un support inorganique choisi parmi l'alumine et les fibres de verre. Avantageusement, le matériau utilisé présente une faible perte de charge.
La présente invention a également pour objet une méthode d'élimination de virus contenus dans un milieu aqueux caractérisée en ce qu'elle comprend :
a. une étape de mise en contact dudit milieu aqueux avec des dendrimères de polylysine, notamment des dendrimères greffés de polylysine, de générations 2 à 7, avantageusement de générations 2, 3, 4 ou 5, lesdits dendrimères étant soit en solution dans ledit milieu aqueux, soit immobilisés sur un support, pour permettre aux virus de se fixer aux dendrimères et former un complexe dendrimères-virus,
b. une étape de récupération du milieu aqueux exempt de virus et éventuellement,
c. une étape de récupération des virus fixés sur les dendrimères
Dans un mode de réalisation avantageux de l'invention, le milieu aqueux duquel on élimine les virus est de l'eau destinée à la consommation humaine.
La présente invention a également pour objet, une méthode de quantification de virus dans un milieu aqueux susceptible d'en contenir caractérisée en ce qu'elle comprend :
a. une étape de mise en contact dudit milieu aqueux avec des dendrimères de polylysine, notamment des dendrimères greffés de polylysine, de générations 2 à 7, avantageusement de générations 2, 3, 4 ou 5, lesdits dendrimères étant soit en solution dans ledit milieu aqueux, soit immobilisés sur un support, pour permettre aux virus de se fixer aux dendrimères et former un complexe dendrimères-virus,
b. une étape de récupération des virus ou du complexe dendrimères-virus, et
c. une étape de quantification des virus, notamment par culture cellulaire, amplification de leur acide nucléique ou immunodétection. Les figures 1 à 5 et les exemples 1 à 7 qui suivent illustrent l'invention.
La figure 1 donne la composition des milieux utilisés dans l'exemple La figure 2 illustre la courbe standard permettant la quantification de la concentration en bactériophage MS2 de la solution. Elle représente la concentration en bactériophage exprimée en pfu/mL en fonction de la moyenne des cycles seuils (Ct) obtenus pour chaque concentration ± l'écart type. Chaque mesure a été réalisée en triplicat.
La figure 3 illustre l'efficacité moyenne d'adsorption calculée à partir de 6 expériences indépendantes pour le bactériophage MS2 selon la méthode décrite à l'exemple 2 et l'efficacité moyenne de récupération calculée à partir de 3 expériences indépendantes pour le bactériophage MS2 selon la méthode décrite à l'exemple 2. Les barres d'erreur représentent l'écart type. (A) Adsorption (B) Récupération.
La figure 4 illustre la linéarité de la méthode de concentration de virus selon l'exemple 2. La courbe représente le logarithme du nombre prévu de particules virales dans une solution en fonction du nombre de particules virales récupérées après concentration.
La figure 5 représente la récupération des particules virales. Les histogrammes représentent la récupération moyenne des particules pour chaque condition : a) concentration, b) lot et c) manipulateur. Cinq réplicats de chaque condition ont été réalisés et les barres d'erreur indiquent l'écart type. Deux concentrations ont été testées 10 pfu/mL (gris clair) et 100 pfu/mL (gris foncé).
Exemple 1 : Procédé de préparation d'un matériau sur lequel sont greffés des dendrimères greffés de polylysine.
Le greffage de dendrimères greffé de poly-L-lysine (DGL) sur des surfaces de polypropylène est réalisé par activation par plasma des surfaces de polypropylène. Brièvement, 5 g de DGL de générations 3 natifs (DGL-G3) sont modifiés en présence de 0,700 g de bicarbonate de sodium par addition de 0,21 g d'anhydride succinique dans 100 mL d'un mélange eau : tétrahydrofurane (H20:THF (1 : 1)) de manière à obtenir 5 à 10 % de groupes carboxyliques à la surface du DGL. Au bout de deux heures, le THF est éliminé sous pression réduite et le DGL modifié est purifié par chromatographie d'exclusion stérique sur une résine Sephadex® G25 (colonne XK50) dans un tampon carbonate d'ammonium (0,1M) à 20 mL/min. Après élimination du carbonate d'ammonium en excès sous pression réduite, le DGL modifié est lyophilisé. Juste avant le greffage, le DGL modifié est dissous dans l'eau à raison de 10 g/L et la solution est dégazée pendant 1 heure. Avant le traitement au plasma, des filtres en polypropylène (SICAM Géotextiles, France ; 8,4 mg ; 7 mm de diamètre, diamètre des fibres 25 pm) sont lavés dans un bain à ultrasons, successivement avec de l'eau puis de l'éthanol pendant 90 secondes et finalement séchés dans un four à 60°C. Le réacteur à plasma est composé de deux électrodes cylindriques parallèles en aluminium (diamètre: 13 cm, distance entre les électrodes: 6 cm) placées dans un récipient cylindrique couplé à un générateur de RF (13,56 MHz) et muni d'une pompe à vide efficace (vitesse 18 m3/h, pression initiale dans le dispositif inférieure à 4 Pa). Les échantillons de polypropylène sont placés sur l'électrode inférieure dans un récipient en verre. La pression du réacteur est ajustée à 4 Pa. Ensuite, l'argon est introduit dans la chambre pour atteindre la pression désirée. Celle-ci est enregistrée avec une jauge régulée de Pirani. L'activation est réalisée avec une puissance de 10 W pour une pression du plasma d'argon de 40 Pa pendant environ 90 secondes. Ensuite, les filtres activés par plasma sont recouverts d'une solution de DGL modifiés à 10 g/L pendant 2 heures à 25°C pour avoir un rendement de greffage complet. Après un lavage rapide par de l'eau, les filtres sont immergés dans un bain de tampon carbonate-bicarbonate 0,25 M à pH = l l,25 avec 50% de méthanol et soniqués pendant 1 heure à la température ambiante. Après un lavage important à l'eau ultrapure, les filtres sont lyophilisés et conservés sous vide à -20°C.
Exemple 2 : Evaluation de la capacité des DGL immobilisés à retenir les virus et à être utilisés comme outil de concentration et de quantification des virus
2.1. Matériel et méthodes
2.1.1. Culture des phages
Un flacon de 250 mL contenant 25 mL de milieu LB Lennox (voir composition figure 1) est inoculé avec des cellules K12 Hfr d'E. coli (NCTC 12486) qui sont laissées croître une nuit entière dans ledit milieu LB Lennox. La culture est incubée pendant 90 minutes à 37°C sous agitation (100 rpm) . Une solution de bactériophage MS2 (NCTC12487) est ajoutée à la culture à une concentration finale en MS2 de 107 pfu/mL. Après 5 heures d'incubation à 37°C (agitation à 100 rpm), 2,5 mL de chloroforme sont ajoutés à la culture; ensuite le milieu de culture est refroidi à 4°C pendant 18 heures. Après cette incubation, la culture est centrifugée à 3 000 g pendant 20 minutes et le surnageant est récolté. Les stocks viraux initiaux de phages sont d'environ 1012 pfu/mL. Des fractions aliquotées de phages sont stockées à 80°C dans du glycérol à 20%.
2.1.2 Méthode de comptage des bactériophages
Le nombre de bactériophages exprimé en plaques formant unité par unité de volume (plaque forming units, pfu per volume unit) est déterminé par titration standard (NF EN ISO 10705-1 (2001), en utilisant Salmonella typhimurium WG49 (NCTC 12484) comme hôte. Cinq cent microlitres de stock de Salmonella typhimurium WG49 (NCTC 12484), conservée à -80°C, sont inoculés dans un flacon de 250 mL contenant 50 mL de milieu TYGB (Tryptone yeast extract glucose broth ; voir composition figure 1). Quand la densité optique atteint 0,250 U DOeoonm, la culture est placée sur de la glace fondue. Des dilutions en série de la solution de bactériophage sont réalisées. Alternativement, 1 mL de chaque dilution est mélangé avec 1 mL de culture de Salmonella typhimurium WG49 et 2,5 mL de milieu TYGA top agar (voir composition figure 1) et versé sur une boîte de pétri contenant du milieu TYGA (voir composition figure 1). Les boîtes sont incubées pendant 18 heures à 37°C. Pour chaque dilution testée, deux séries sont réalisées. Une seule d'entre elles est traitée par de la RNAseA, à une concentration finale de 40 pg/mL.
2.1.3 Filtration sur le matériau
Dix millilitres d'une solution d'eau artificiellement contaminée avec 106 pfu/mL et 108 pfu/mL de virus MS2 ont été utilisés pour déterminer la capacité de rétention des DGL.
Le matériau greffé préparé selon l'exemple 1 est placé à l'extrémité inférieure d'une pipette sérologique. Une seringue de 50 mL est utilisée comme réservoir. La solution de virus est filtrée 10 fois à travers le matériau revêtu de DGL. 2.1.4 Extraction de l'ARN viral
L'ARN viral est extrait en utilisant le Mini kit QIAamp Viral RNA (Qiagen) selon les recommandations du fournisseur. L'extraction est réalisée sur 140 pL de suspension virale dans l'eau traitée par du diéthylpyrocarbonate. L'ARN est élué avec 60pL de tampon AVE. Les extraits sont immédiatement stockés à -80°C.
2.1.5 Quantification des virus
La quantification des virus est réalisée par amplification en chaîne par polymérisation quantitative en temps réel (qRT-PCR) après extraction préalable de l'ARN selon l'exemple 2.1.4. La qRT-PCR est réalisée avec le kit KAPA SYBR Fast One-Step qRT-PCR (CliniSciences) selon les recommandations du fournisseur.
Un fragment de 168 pb est amplifié en triplicats, en utilisant le kit KAPA SYBR Fast One-Step qRT-PCR (CliniSciences). Les milieux de réaction contiennent 10 pL de mélange KAPA SYBR FAST qPCR master (CliniSciences), 0,4 pL de mélange KAPA RT (CliniSciences), 100 nM de chaque amorce, 2 pL d'ARN purifié et de l'eau en quantité suffisante pour avoir un volume final de 20 pL.
L'amorce sens est la séquence MS2-F, 5'-TCGATGGTCCATACCTTAGATGC-3' et correspond à la région du génome du bactériophage MS2 1255 à 1277 et l'amorce antisens est la séquence MS2-R 3 '- ACCCCGTTAG CG AAGTTG CT- 5 ' et correspond à la région 1423 à 1404 du génome du bactériophage MS2 (NC_001417) selon Ogorzaly et al. (Development of real-time RT-PCR methods for spécifie détection of F- spécifie RNA bactériophage genogroups: application to urban raw wastewater. J Virol Methods, 2006, 138, 131-139). La synthèse de l'ADNc est réalisée à 42 °C pendant 5 min puis la rétrotranscriptase est inactivée à 95 °C pendant 5 min, 40 cycles de PCR sont ensuite réalisés avec une dénaturation de 3 sec à 95 °C, 20 sec d'hybridation à 59,7 °C et 1 sec d'extension et d'acquisition des données à 72°C. Cette dernière étape est suivie par l'analyse d'une courbe de fusion réalisée en augmentant la température de 50 à 90°C, à raison d'une augmentation de 0,2°C toutes les 2 sec avec un plateau de lecture pour obtenir le signal de fluorescence. 2.1.6 Etablissement des courbes standards
Des dilutions au l/100ème de stocks d'ARN de phages F-spécifiques (10 - 1012 pfu/ml) sont réalisées avec de l'eau contenant du diéthylpyrocarbonate afin d'établir des courbes standards. Les mesures de qRT-PCR sont réalisées en triplicat. Un contrôle négatif, correspondant à du tampon d'élution AVE sans ARN, est ajouté à chaque essai. La valeur de Ct de chaque dilution amplifiée en triplicat par qRT-PCR est représentée en fonction du logarithme de la quantité initiale de phages exprimée en pfu/mL. Une courbe standard est établie par régression linéaire simple pour des concentrations comprises entre 104 pfu/mL et 1012 pfu/mL
La pente de la courbe standard est utilisée pour déterminer l'efficacité (E) de la PCR selon la relation E = 10(1/s)-l (Kubista et al. The real-time polymerase chain reaction. Mol Aspects Med.,(2006), 27, 95- 125). Ainsi une courbe standard avec une pente de -3,33 correspond à une réaction 100 % efficace.
2.1.7 Calcul du taux de récupération et analyse statistique
Le pourcentage de récupération est calculé comme étant le rapport entre la concentration en virus après la filtration et la concentration théorique ensemencée dans l'eau. Une dilution mesurable de virus (104 pfu/mL) a été utilisée comme standard de PCR.
La capacité d'absorption de bactériophages MS2 par les DGL est déterminée en comparant la concentration de virus dans l'eau avant et après la filtration à travers les DGL. 10 millilitres de solutions standards dans l'eau avec des concentrations en virus de 106 pfu/mL et 108 pfu/mL sont utilisées pour déterminer la capacité d'absorption maximum des DGL. Elles sont filtrées à travers le matériau revêtu de DGL, éluées en utilisant directement le tampon de lyse du kit d'extraction d'ARN ; les ARN sont ensuite purifiés.
L'analyse statistique est effectuée avec le logiciel R Development
Core Team.
La capacité des filtres à DGL à retenir les virus a été évaluée en utilisant de faibles concentrations en virus (en dessous de la limite de détection). Deux solutions de virus dans l'eau à 101 pfu/mL et 102 pfu/mL respectivement dans un volume final de IL et 100 mL ont été utilisées. L'extraction de l'ARN est réalisée directement sur les DGL et l'ARN est élué dans 60 pL. Ces conditions conduisent à un facteur de concentration de 1660 et 16600 fois pour un volume percolé de respectivement lOOmL ou IL.
Les essais sont réalisés cinq fois par trois expérimentateurs et deux lots de DGL. Au total, 60 expériences ont été réalisées, une randomisation des expérimentations a été réalisée afin de limiter l'effet jour.
2.1.8. Linéarité de la méthode de concentration des virus L'appréciation de la linéarité est nécessaire pour s'assurer que le nombre de particules dans un échantillon et le nombre de particules retrouvées après concentration et extraction sont corrélés de manière linéaire sur une plage importante de concentrations. 10 millilitres de 3 solutions titrées contenant respectivement 104, 106 and 108 pfu /mL sont percolées à travers le support à DGL. Le nombre de particules retenues est quantifié par qRT-PCR après extraction des ARN. Le facteur de concentration est de 166 fois.
2.2. Résultats
2.2.1 Courbes standard, efficacité et sensibilité de la qRT-PCR
Les résultats sont donnés dans la figure 2.
On n'observe pas d'amplification avec le témoin négatif.
Pour les concentrations testées, comprises entre 104 pfu/mL et 1012 pfu/mL on obtient une pente de -3,28.
L'efficacité calculée selon la méthode donnée à l'exemple 2.1.6 est de 101,8% et le coefficient de corrélation au carré supérieur à 0,998.
Pour chaque réaction qRT-PCR, des courbes de fusion ont été observées. Un seul pic, correspondant à la fusion de l'amplicon, est observé à 83 °C dans l'analyse des courbes de fusion. Ces données confirment la spécificité de l'amplification du produit de PCR.
La limite de détection correspond au plus petit nombre d'unité génome qui donne un résultat en PCR avec un seuil à 90 %. 10 dilutions différentes préparées à 103 pfu/mL and 102 pfu/mL ont été analysées. La valeur limite de détection est de 103 pfu/mL correspondant à 4 pfu/puits de PCR, avec 90 % d'échantillons positifs.
La limite de quantification (Lq) correspondant à la première valeur de la courbe de calibration est de 104 pfu/mL, i.e 50 pfu/puits de PCR.
2.2.2 Capacité de rétention et efficacité de récupération des bactériophages MS2
Les résultats sont donnés dans les figures 3A et 3 B.
Aux deux concentrations testées, 80% des particules virales sont retenues sur le support DGL (figure 3A) .
Le pourcentage de récupération calculé comme étant le rapport entre le nombre de particules récupérées et le nombre de particules adsorbées sur le support est d'environ 77 % indépendamment de la concentration utilisée (Figure 3B) .
2.2.3. Linéarité de la méthode de concentration des virus Les résultats sont donnés dans la figure 4.
Les données montrent une bonne linéarité avec une pente proche de 1 (0,99 ± 0,04) ; une ordonnée à l'origine proche de zéro (- 0,02 ± 0,28) avec un coefficient de corrélation R2>0,985. 2.2.4. Analyse statistique des performances de rétention des DGL
Les résultats sont donnés dans la figure 5.
En tenant compte de chaque modalité de filtration (manipulateur, lot de DGL, concentration), les DLG permettent une forte rétention et une bonne récupération des bactériophages (Figure 5) : le pourcentage de récupération allant de 87% à 258%.
Une analyse de variance (ANOVA) montre qu'il n'y a aucune interaction entre les différents facteurs.
L'ensemble de ces résultats prouvent que les DGL immobilisés sur support permettent une forte rétention et une récupération élevée des virus et ce indépendamment du volume filtré, de l'expérimentateur et du lot de DGL. Exemple 3 : Méthode de décontamination utilisant des DGL en solution
3.1. Matériels et méthode
Une eau a été artificiellement contaminée avec 109 pfu/mL de bactériophages MS2. Cette eau a ensuite était divisée en 6 fractions égales de 10 mL (soit 1010 pfu). Dans trois d'entre elles, 5 mg de DGL de générations 3 sous forme d'une solution aqueuse à 50 mg/ml ont été ajoutés ; de l'eau pure été ajoutée dans les trois autres fractions (contrôle négatif).
Après une incubation de 30 minutes à température ambiante, les 6 échantillons sont percolés sur une cartouche SCX (Phenomenex®) chargée négativement.
Une extraction des ARN des virus est réalisée sur 140μΙ_ de la solution initialement contaminée et sur 140μΙ_ de chacun des 6 échantillons après leur filtration sur la cartouche SCX selon la méthode décrite à l'exemple 2.1.5.
3.2. Résultats de dénombrement des virus dans les filtrats
Dans les échantillons n'ayant pas été traités avec le DGL, le rendement de récupération moyen des virus obtenus est de 103% ± 8%, soit aucun abattement.
Sur les échantillons traités avec le DGL, aucune quantification ni détection de virus n'a pu être observée suggérant que le taux de virus restant est inférieur à la limite de détection soit à 103 virus/mL.
Un abattement minimum de 6 logs de la contamination virale est donc observé, ce qui traduit l'efficacité du DGL en solution pour la décontamination de l'eau.
Exemple 4: Capture du virus de l'hépatite A dans une eau de source commerciale
4.1. Matériel et méthodes
Une eau de source commerciale a été artificiellement contaminée avec 3.104 génome copie /mL de virus d'hépatite A (lenticule de Health protection agency). L'eau a été percolée sur un support de polypropylene revêtu de DGL fabriqué selon le protocole de l'exemple 1. La quantité de virus retenue sur le support a été déterminée en dosant la quantité initiale de virus dans la solution et la quantité de virus restant dans l'eau après filtration.
L'extraction d'ARN est réalisée avec le kit QIAamp Viral RNA Mini kit (Qiagen) selon les recommandations du fabricant. La qRT-PCR est réalisée avec le kit KAPA SYBR Fast One-Step qRT-PCR (CliniSciences) selon les recommandations du fournisseur. Les séquences HAV68 :TCA CCG CCG TTT GCC TAG située de la position 68 à 85 et amorce reverse HAV240 : GGA GAG CCC TGG AAG AAA G située de la position 241 à 223 du génome du virus de l'hépatite A ont été utilisées à une concentration finale de 215 nM .
4.2. Résultats de capture du virus de l'hépatite A par les DGL Une rétention du virus de l'hépatite A de 88% a été obtenue.
Exemple 5: Capture du Norovirus GI dans une eau de source commerciale
5.1. Matériel et méthodes
Une eau de source commerciale a été artificiellement contaminée avec 4.104 génome copie /mL de Norovirus GI (lenticule de Health protection agency). L'eau a été percolée sur un support de polypropylene revêtu de DGL fabriqué selon le protocole de l'exemple 1.
La quantité de virus retenue sur le support a été déterminée en dosant la quantité initiale de virus dans la solution et la quantité de virus restant dans l'eau après filtration.
L'extraction d'ARN est réalisée avec le kit QIAamp Viral RNA Mini kit (Qiagen) selon les recommandations du fabricant. La qRT-PCR est réalisée avec le kit KAPA SYBR Fast One-Step qRT-PCR (CliniSciences) selon les recommandations du fournisseur. Les séquences QNIF4 : CGC TGG ATG CGN TTC CAT située de la position 5290 à 5308 et amorce reverse NVILCR : CCT TAG ACG CCA TCA TCA TTT AC située de la position 5376 à 5353 du génome du Norovirus GI ont été utilisées à une concentration finale de 400 nM . 5.2. Résultats de capture du virus du norovirus GI par les
DGL
Une rétention du Norovirus GI de 50% a été obtenue. Exemple 6: Capture Mengovirus dans une eau de source commerciale
6.1. Matériel et méthodes
Une eau de source commerciale a été artificiellement contaminée avec 6.104 génome copie /ml_ de Mengovirus (Ceeram tools). L'eau a été percolée sur un support de polypropylène revêtu de DGL fabriqué selon le protocole de l'exemple 1.
La quantité de virus retenue sur le support a été déterminée en dosant la quantité initiale de virus dans la solution et la quantité de virus restant dans l'eau après filtration.
L'extraction d'ARN est réalisée avec le kit QIAamp Viral RNA Mini kit
(Qiagen) selon les recommandations du fabricant. La quantification a été réalisée par RT-qPCR avec le kit Mengo extraction control (Ceeram tools) selon les instructions du fabricant. 6.2. Résultats de capture du virus du mengovirus par les DGL
Une rétention du mengovirus de 89% a été obtenue.
Exemple 7 : Comparaison des capacités de rétention du DGL et de la polylysine linéaire
La capacité de rétention de la polylysine linaire supportée sur un feutre de polypropylène a été évaluée.
Une eau artificiellement contaminée avec 108 pfu/mL de bactériophage MS2, a été percolée sur un support de polypropylène revêtu de polylysine linéaire. La quantité de virus retenue sur le support a été déterminée en dosant la quantité initiale de virus dans la solution et la quantité de virus restant dans l'eau après filtration. Le bactériophage MS2 a été quantifié comme décrit paragraphe 2.1.5.
Seul 56% des virus sont retenus sur ce support alors que 80% sont retenus sur un support revêtu de DGL (voir exemple 2).

Claims

REVENDICATIONS
1. Procédé de capture de virus à partir d'un milieu aqueux susceptible d'en contenir, ledit procédé comprenant une étape de mise en contact dudit milieu aqueux avec des dendrimères de polylysine, lesdits dendrimères étant soit en solution dans ledit milieu aqueux, soit immobilisés sur un support, pour permettre aux virus de se fixer aux dendrimères et former un complexe dendrimères-virus.
2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que les dendrimères sont natifs ou modifiés.
3. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que les dendrimères sont des dendrimères greffés de polylysine de générations 2 à
7, avantageusement de générations 2 à 5, natifs ou modifiés.
4. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que, lorsque les dendrimères, notamment les dendrimères greffés de polylysine de générations 2 à 7 sont en solution dans le milieu aqueux, le procédé comprend en outre une étape d'immobilisation du complexe dendrimères-virus formé à la suite de l'étape de mise en contact, sur un matériau choisi dans le groupe comprenant des phases stationnaires, des billes solides magnétiques ou non et une étape de récupération des virus ou d'un de leurs constituants.
5. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que le milieu aqueux est choisi dans le groupe comprenant l'eau destinée à la consommation humaine, l'eau de réservoirs, l'eau issue de bassins d'épuration, l'eau de rivière, l'eau de mer, les liquides biologiques, les liquides aqueux alimentaires et les milieux de culture.
6. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que les dendrimères greffés de polylysine de générations 2 à 7, avantageusement de générations 2, 3, 4 ou 5, natifs ou modifiés sont immobilisés, soit sur un support organique choisi dans le groupe comprenant le polypropylène, le polystyrène, le polyéthylène, le nylon, le polytétrafluoroéthylène, le polyfluorure de vinylidène, le polycarbonate, les polysulfones, les polyétehrsulfones, le polytéréphtalate d'éthylène, le polyméthacrylate de méthyle ou polyacrylique, l'alginate et les matériaux à base de cellulose, soit un support inorganique choisi parmi l'alumine et les fibres de verre.
7. Méthode d'élimination de virus contenus dans un milieu aqueux caractérisée en ce qu'elle comprend :
a. une étape de mise en contact dudit milieu aqueux avec des dendrimères de polylysine, notamment des dendrimères greffés de polylysine de générations 2 à 7, avantageusement de générations 2, 3, 4 ou 5, lesdits dendrimères étant soit en solution dans ledit milieu aqueux, soit immobilisés sur un support, pour permettre aux virus de se fixer aux dendrimères et former un complexe dendrimères-virus,
b. une étape de récupération du milieu aqueux exempt de virus et éventuellement,
c. une étape de récupération des virus fixés sur les dendrimères.
8. Méthode de quantification de virus dans un milieu aqueux susceptible d'en contenir caractérisée en ce qu'elle comprend :
a. une étape de mise en contact dudit milieu aqueux avec des dendrimères de polylysine, notamment des dendrimères greffés de polylysine de générations 2 à 7, avantageusement de générations 2, 3, 4 ou 5, lesdits dendrimères étant soit en solution dans ledit milieu aqueux, soit immobilisés sur un support, pour permettre au virus de se fixer aux dendrimères et former un complexe dendrimères-virus,
une étape de récupération des virus ou du complexe dendrimères-virus et
une étape de quantification des virus, notamment par culture cellulaire, par amplification de leur acide nucléique ou par immunodétection.
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