WO2014123208A1 - 植物への高効率遺伝子導入能を付与したアグロバクテリウム菌 - Google Patents

植物への高効率遺伝子導入能を付与したアグロバクテリウム菌 Download PDF

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vector
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中村　幸治
聡子 野中
龍彦 染谷
莎 周
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    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
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    • C12Y305/00—Hydrolases acting on carbon-nitrogen bonds, other than peptide bonds (3.5)
    • C12Y305/99—Hydrolases acting on carbon-nitrogen bonds, other than peptide bonds (3.5) in other compounds (3.5.99)
    • C12Y305/99007—1-Aminocyclopropane-1-carboxylate deaminase (3.5.99.7)

Definitions

  • This technology relates to Agrobacterium having improved gene transfer efficiency into plants and its use.
  • the gene introduction method (Agrobacterium method) into the plant via Agrobacterium which is one of the soil bacteria, can be carried out by a simple procedure without requiring any special technique or apparatus.
  • genes can be introduced into plants in a complete form and with a small copy number. For this reason, it is used more frequently in the production of transformed plants than other plant gene introduction methods.
  • Patent Document 1 Reported on Agrobacterium (super Agrobacterium) that has improved the efficiency of gene transfer into plants by holding a plasmid containing the ACC deaminase gene that gives Agrobacterium the ability to suppress ethylene production
  • Patent Document 2 Reported on Agrobacterium (super Agrobacterium) that has improved the efficiency of gene transfer into plants by holding a plasmid containing the ACC deaminase gene that gives Agrobacterium the ability to suppress ethylene production
  • Patent Document 2 Reported on Agrobacterium (super Agrobacterium) that has improved the efficiency of gene transfer into plants by holding a plasmid containing the ACC deaminase gene that gives Agrobacterium the ability to suppress ethylene production
  • Patent Document 2 Reported on Agrobacterium (super Agrobacterium) that has improved the efficiency of gene transfer into plants by holding a plasmid containing the ACC deaminase gene that gives Agrobacterium the ability to suppress ethylene production
  • Patent Document 2 Reported on
  • GABA ⁇ -aminobutyric acid
  • Non-patent Document 2 GABA ( ⁇ -aminobutyric acid) is produced in plants due to injury to plants or infection with Agrobacterium.
  • Non-patent Document 3 high GABA-producing plants have low infection susceptibility to Agrobacterium tumefaciens C58 strain.
  • plant GABA is known to suppress the quorum sensing signal of Agrobacterium and to suppress the replication of Ti plasmid necessary for gene transfer and horizontal propagation between Agrobacterium (non-patented). References 4 and 5).
  • An object of the present invention is to provide Agrobacterium having high gene transfer efficiency.
  • the present inventors have greatly improved the efficiency of gene introduction into plants by Agrobacterium by giving GABA aminotransferase activity to Agrobacterium. As a result, the present invention has been completed.
  • the present invention includes the following.
  • a transformed Agrobacterium that retains an exogenous GABA aminotransferase gene and exhibits improved gene transfer efficiency.
  • the transformed Agrobacterium of the present invention preferably further retains an exogenous ACC deaminase gene.
  • the transformed Agrobacterium of the present invention preferably retains the GABA aminotransferase gene and / or the ACC deaminase gene in the form of a vector.
  • the transformed Agrobacterium of the present invention may further contain a binary vector containing a T-DNA region.
  • the GABA aminotransferase gene is preferably derived from bacteria. It is also preferred that the ACC deaminase gene is derived from bacteria.
  • a method for producing a transformed plant which comprises introducing a gene into a plant using the transformed Agrobacterium of [1] above.
  • the plant can be a monocotyledonous plant or a dicotyledonous plant.
  • the monocotyledonous plant is preferably a gramineous plant, for example.
  • the dicotyledonous plant is preferably a solanaceous plant, for example.
  • a target gene can be efficiently introduced into a plant host genome.
  • FIG. 1 shows a plasmid map of pETgabT having a GABA aminotransferase gene (gabT).
  • FIG. 2 shows a plasmid map of the expression vector pBBRgabT having a GABA aminotransferase gene.
  • FIG. 3 shows the base sequence encoding GABA aminotransferase protein (gabT) in pBBRgabT. The range (lacZ partial fragment) encoding 33 amino acids derived from ⁇ -galactosidase is shown in the figure.
  • FIG. 4 shows the base sequence of gabT fragment 2 (SEQ ID NO: 9) amplified by PCR using pBBRgabT as a template and primers acdS-for and gabT-Rev.
  • FIG. 5 shows a plasmid map of the vector pBBRacdS / gabT that co-expresses the ACC deaminase gene and the GABA aminotransferase gene.
  • FIG. 6 shows the measurement results of gabT enzyme activity in Agrobacterium.
  • FIG. 7 shows the efficiency of gene introduction into tomato by Agrobacterium.
  • A shows the frequency of gene transfer in tomato explants infected with Agrobacterium by a distribution of 6 levels of GUS staining.
  • MCS Agrobacterium strain GV2260 (pBBR1MCS-5, pEKH 2 ), gabT: Agrobacterium strain GV2260 (pBBRgabT, pEKH 2 ).
  • B shows examples of GUS staining levels 0-5.
  • FIG. 8 shows the efficiency of gene introduction into Elianthus by Agrobacterium.
  • the present invention provides a transformed Agrobacterium having improved gene transfer efficiency to a plant infected with GABA aminotransferase activity to Agrobacterium. More specifically, the transformed Agrobacterium according to the present invention is a transformed Agrobacterium that retains an exogenous GABA aminotransferase gene. The transformed Agrobacterium according to the present invention exhibits improved gene transfer efficiency into plants in Agrobacterium-mediated transformation, compared with that before GABA aminotransferase gene transfer.
  • the term “exogenous” GABA aminotransferase gene refers to a GABA aminotransferase gene introduced from the outside into Agrobacterium, or a GABA amino acid maintained in the progeny of the Agrobacterium. Refers to the transferase gene.
  • the GABA aminotransferase gene used in the present invention is a nucleic acid encoding a GABA aminotransferase protein.
  • GABA aminotransferase has an activity of metabolizing GABA ( ⁇ -aminobutyric acid) to succinic semialdehyde and glutamic acid.
  • GABA aminotransferase has an activity of metabolizing GABA ( ⁇ -aminobutyric acid) to succinic semialdehyde and glutamic acid.
  • GABA aminotransferase ⁇ -aminobutyric acid
  • plants are also known to have GABA aminotransferase gene, but natural Agrobacterium is Does not have GABA aminotransferase gene.
  • the GABA aminotransferase gene used in the present invention may be a gene derived from any species having a GABA aminotransferase, such as bacteria, plants, fungi, or animals.
  • Escherichia genus such as Escherichia coli, Rhizobium (Shinorizobium ilmeriloti, etc.), Pseudomonas genus (Pseudomonas syringae, Pseudomonas stutzeri etc.), Clinarium bacterium (Crinalium epipsammum etc.), Cyanobacteria genus (Cyanobacterium ), Streptomyces genus (Streptomyces rimosus etc.), Entrobacter genus (Entrobacter cloacae subsp.
  • a GABA aminotransferase gene derived from a bacterium such as a bacterium (Mycobacterium marinum etc.) can be preferably used.
  • a nucleic acid fragment containing a base sequence encoding the amino acid sequence (SEQ ID NO: 2) of GABA aminotransferase from Escherichia coli Escherichia coli K12 strain for example, the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 is converted into an open reading frame (ORF).
  • ORF open reading frame
  • an open reading frame (ORF) refers to a nucleic acid sequence encoding a protein from a start codon to a stop codon.
  • a nucleic acid fragment consisting of a base sequence encoding a protein having identity and having GABA aminotransferase activity may be used as the GABA aminotransferase gene.
  • the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 consists of an amino acid sequence in which 1 to 50, preferably 1 to 10, for example, 1 to 5 amino acids are deleted, substituted or added, and has GABA aminotransferase activity.
  • a nucleic acid fragment consisting of a base sequence encoding the protein possessed may be used as the GABA aminotransferase gene. Furthermore, it is 70% or more, preferably 80% or more, preferably 85% or more, more preferably 90% or more, for example 95%, 98% or 99% or more of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 (full length).
  • a nucleic acid fragment consisting of an amino acid sequence having identity and a base sequence encoding a protein having GABA aminotransferase activity may be used as the GABA aminotransferase gene.
  • the GABA aminotransferase activity can be confirmed using a known GABA aminotransferase activity measuring method, and can be measured, for example, according to the method described in Example 5 described later. Specifically, the protein was added to the reaction solution (0.1M Bicine-NaOH, 0.1M pyridoxal phosphate, 10mM 2-ketoglutarate, 10mM GABA) and incubated at 37 ° C. After a certain reaction time The amount of glutamic acid that is a reaction product of the GABA aminotransferase reaction may be measured.
  • the reaction solution 0.1M Bicine-NaOH, 0.1M pyridoxal phosphate, 10mM 2-ketoglutarate, 10mM GABA
  • the measurement of the amount of glutamic acid is not limited, but can be measured using any commercially available kit exhibiting sufficient measurement sensitivity, for example, Yamasa L-glutamic acid measurement kit II (Yamasa Soy Sauce Co., Ltd.). If it is detected that the amount of glutamic acid has increased over time, it can be determined that GABA aminotransferase activity has been confirmed.
  • the “nucleic acid fragment” may be DNA or RNA. In the present invention, the “nucleic acid fragment” may also include a modified nucleic acid or an artificial nucleic acid.
  • nucleic acid fragment encoding a GABA aminotransferase protein having an amino acid sequence that does not affect enzyme activity added to the N-terminus or C-terminus can also be used.
  • a nucleic acid fragment consisting of a base sequence encoding a protein having 1 to 50, for example, 1 to 33 amino acids added to the N-terminus of the GABA aminotransferase protein may be used as the GABA aminotransferase gene.
  • Such an amino acid sequence that does not affect the enzyme activity can be, for example, a selectable marker gene product or a reporter gene product, or a fragment thereof, and preferred examples include ⁇ -galactosidase-derived protein fragments (for example, 1 to 1 of SEQ ID NO: 6). Amino acid sequence at position 33).
  • a GABA aminotransferase protein containing such an additional sequence is, for example, a protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6, and an example of a nucleic acid fragment encoding such a protein includes the base sequence shown in SEQ ID NO: 5. It is a nucleic acid fragment.
  • the GABA aminotransferase gene of the present invention can be isolated from a biological nucleic acid by a conventional method based on its base sequence (in the case of Escherichia coli, for example, the base sequence of SEQ ID NO: 1). Designed based on the GABA aminotransferase gene sequence using, for example, total mRNA prepared from organisms such as bacteria by conventional methods, cDNA obtained from RT-PCR by RT-PCR, cDNA library, etc. as a template By performing PCR using the primer set, the GABA aminotransferase gene can be obtained as a DNA amplified fragment. The obtained DNA amplified fragment can be extracted and purified by a conventional method.
  • a probe is prepared using a GABA aminotransferase gene (for example, a DNA consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1) or a part thereof, and the whole mRNA prepared from a living organism such as a bacterium by a conventional method
  • a GABA aminotransferase gene can also be obtained as a clone by hybridizing to RNA such as cDNA or cDNA library obtained by RT-PCR from RNA.
  • the GABA aminotransferase gene of the present invention may also be synthesized using chemical synthesis methods.
  • a GABA aminotransferase gene can also be produced by modifying a GABA aminotransferase gene isolated or synthesized from a natural source by a mutation-introducing method such as site-directed mutagenesis. .
  • a mutation-introducing method such as site-directed mutagenesis.
  • a known method such as the Kunkel method, the Gapped duplex method, or a similar method can be employed. Mutation introduction into a gene can be easily performed by those skilled in the art using, for example, a commercially available site-directed mutagenesis kit.
  • nucleotide sequence can be determined by a known method such as a Maxam-Gilbert chemical modification method or a dideoxynucleotide chain termination method, but it may be usually performed using an automatic nucleotide sequencer (eg, DNA sequencer manufactured by ABI).
  • the GABA aminotransferase gene is not intended to introduce the GABA aminotransferase gene into the plant genome by including it in the T-DNA region, but to introduce the gene into Agrobacterium and retain the activity of the gene product. It is intended to improve (enhance) the gene transfer efficiency (gene transfer ability) to plants in Agrobacterium. Therefore, in the present invention, the GABA aminotransferase gene is preferably introduced into Agrobacterium using a vector that does not contain a T-DNA region.
  • the T-DNA region is a region between the right border sequence (RB) and the left border sequence (LB) that exists in the extrachromosomal vector of Agrobacterium. It is a region that is cut out from a vector and integrated into the plant genome upon conversion.
  • the vector that does not contain a T-DNA region preferably used in the present invention is not a vector having a T-DNA region that can be inserted into a plant genome via Agrobacterium (typically a binary vector).
  • Agrobacterium typically a binary vector.
  • These include an expression vector for inducing expression of a target gene in Agrobacterium and a homologous recombination vector for incorporating the target gene into the Agrobacterium genome.
  • the vector used in the present invention is preferably a plasmid vector.
  • the vector used in the present invention is also preferably a broad host range vector. Examples of the wide host range vector that can be suitably used in the present invention include, but are not limited to, pBBR1MCS-5, pBBR122, and RK2, and derivatives thereof.
  • the GABA aminotransferase gene introduced into Agrobacterium is preferably placed under the control of a promoter in a vector, preferably a vector that does not contain a T-DNA region.
  • the promoter used here may be any promoter that can function in bacteria, in particular Agrobacterium, and may be a constitutive promoter, an inducible promoter, a transient promoter, an organ, tissue or cell specific promoter. May be.
  • these genes when a plurality of genes are contained under the control of a single promoter, these genes have the same orientation at short intervals (for example, 100 bp or less, preferably 50 bp or less) so as to be controlled by the same promoter. It is preferable that it is connected.
  • Agrobacterium into which the GABA aminotransferase gene is introduced is not limited, but includes Agrobacterium tumefaciens, Agrobacterium vitis, Agrobacterium rhizogenes. ), And any Agrobacterium that can be used in the Agrobacterium method, such as Agrobacterium radiobacter.
  • Agrobacterium tumefaciens GV2260, Agrobacterium tumefaciens C58 strain, Agrobacterium vitis S4 strain, Agrobacterium rhigenes (Agrobacterium rhigenes) ) A4 strain, and Agrobacterium actradiobacter K84 strain, and their derivatives, and other Agrobacterium strains used for plant transformation can be suitably used, for example, , GV2260, C58C1RifR, GV3850, GV3101, EHA101, EHA105, AGL1, LBA4404, and K84N6 strains, but are not limited thereto.
  • Agrobacterium having a vector containing a vir region involved in gene transfer into a plant cell or a genomic region is preferred for use in plant transformation.
  • the introduction of a vector containing a GABA aminotransferase gene into Agrobacterium is not limited, but can typically be performed by electroporation.
  • the transformed Agrobacterium can be selected by culturing the vector-introduced Agrobacterium in a selective medium containing an antibiotic corresponding to a selection marker such as a drug resistance gene contained in the vector, for example.
  • the introduced GABA aminotransferase gene may be retained by culturing the selected transformed Agrobacterium in a selective medium.
  • the introduced GABA aminotransferase gene may be retained in the form of a vector outside the chromosome (in a state contained in a vector such as a plasmid) in the resulting transformed Agrobacterium, It may be integrated and retained in the genome.
  • the GABA aminotransferase gene is introduced into Agrobacterium using an expression vector, the GABA aminotransferase gene is retained in the state of being contained in the autonomously replicating expression vector. It is preferred to express the protein.
  • the GABA aminotransferase gene is introduced into Agrobacterium using a homologous recombination vector targeting the Agrobacterium genome, the GABA aminotransferase gene is retained in the genome.
  • an Agrobacterium having an introduced GABA aminotransferase gene or a descendant thereof, which is capable of exhibiting GABA aminotransferase activity relates to the present invention.
  • a transformed Agrobacterium is used.
  • exogenous ACC deaminase gene refers to an ACC deaminase gene introduced from the outside into Agrobacterium or an ACC deaminase gene maintained in the progeny of the Agrobacterium.
  • the ACC deaminase gene used in the present invention encodes ACC deaminase.
  • ACC deaminase can decompose ethylene biosynthesis intermediate ACC (1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid) into ⁇ -ketobutyric acid and ammonia, thereby suppressing intracellular ethylene production.
  • Plants produce ethylene as a defense against pathogenic bacteria, and ethylene has the action of suppressing the expression of the vir gene of Agrobacterium. Therefore, by suppressing ethylene production by the action of ACC deaminase, The suppression of the expression of the vir gene can be released, and as a result, the efficiency of gene introduction into cells via Agrobacterium can be further increased. Ethylene production is a defense mechanism common to plants.
  • the ACC deaminase gene used in the present invention may be a gene encoding an enzyme having ACC degrading activity derived from any biological species.
  • Pseudomonas sp. ACP strain Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas putida, Pseudomonas stutzeri, Pseudomonas entomophila PS-PJH strain, etc.
  • Panonibacter genus Panonibacter genus (Pannonibacter phragmatetus PB-Rt1.
  • Enterobacter genus Enterobacter genus (Enterobacter cloacae LH-R2 etc.) ACC deaminase genes derived from soil microorganisms such as bacteria such as Bacter spp. (Achromobacter sp, etc.), Sinorizobium spp. (Sinorhizobium sp. BL3 etc.), Mesorhizobium spp. (Mesorhizobium loti, etc.) it can.
  • an ACC deaminase gene suitable for use in combination with a GABA aminotransferase gene for example, a nucleic acid fragment derived from Pseudomonas sp.
  • ACP strain and containing a base sequence encoding the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 14, such as SEQ ID NO: 13 A nucleic acid fragment having the indicated base sequence as an open reading frame (ORF) may be used as the ACC deaminase gene.
  • a nucleic acid fragment consisting of a base sequence encoding a protein having identity and having ACC deaminase activity may be used as the ACC deaminase gene.
  • a protein having an ACC deaminase activity comprising an amino acid sequence in which 1 to 50, preferably 1 to 10, for example, 1 to 5 amino acids have been deleted, substituted or added in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 14;
  • a nucleic acid fragment consisting of the encoded base sequence may be used as the ACC deaminase gene. Furthermore, it is 70% or more, preferably 80% or more, preferably 85% or more, more preferably 90% or more, for example 95%, 98% or 99% or more of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 14 (full length).
  • a nucleic acid fragment consisting of an amino acid sequence having identity and a base sequence encoding a protein having ACC deaminase activity may be used as the ACC deaminase gene.
  • the ACC deaminase activity can be confirmed using a known ACC deaminase activity measuring method. Specifically, for example, 1-aminocyclopropanecarboxylic acid (ACC) and pyridoxal-5′-phosphate (PLP) are added to a protein solution having ACC deaminase activity and incubated at 30 ° C.
  • ACC 1-aminocyclopropanecarboxylic acid
  • PDP pyridoxal-5′-phosphate
  • ⁇ -ketobutyric acid is produced from 1-aminocyclopropanecarboxylic acid (ACC) by the catalytic action of ACC deaminase, it has been shown that the amount of ⁇ -ketobutyric acid increases as the amount of protein increases. Thus, it can be determined that ACC deaminase activity has been confirmed. Furthermore, a nucleic acid fragment encoding an ACC deaminase protein in which an amino acid sequence that does not affect enzyme activity is added to the N-terminus or C-terminus may be used.
  • a nucleic acid fragment consisting of a base sequence encoding a protein having 1 to 50, for example, 1 to 33 amino acids added to the N-terminus of the ACC deaminase protein may be used as the ACC deaminase gene.
  • Such an amino acid sequence that does not affect the enzyme activity can be, for example, a selectable marker gene product or a reporter gene product, or a fragment thereof, and preferred examples include ⁇ -galactosidase-derived protein fragments (for example, 1 to 1 of SEQ ID NO: 6). Amino acid sequence at position 33).
  • the ACC deaminase gene can be obtained according to the method for obtaining the GABA aminotransferase gene described above.
  • the ACC deaminase gene introduced into Agrobacterium is preferably placed under the control of a promoter in a vector, preferably a vector that does not contain a T-DNA region.
  • a promoter the promoter mentioned above regarding the GABA aminotransferase gene can be used preferably.
  • One or two or more copies of the ACC deaminase gene may be included under the control of the promoter, and this is also as described above for the GABA aminotransferase gene.
  • the introduced ACC deaminase gene may express the ACC deaminase protein in a state in which it is retained in the form of a vector outside the chromosome (contained in a vector such as a plasmid) in the resulting transformed Agrobacterium.
  • the ACC deaminase protein may be expressed in a state of being incorporated and retained in the genome of Agrobacterium.
  • the GABA aminotransferase gene and the ACC deaminase gene may be introduced into Agrobacterium by including them in separate vectors.
  • the GABA aminotransferase gene and the ACC deaminase gene may be introduced in a single vector.
  • each gene may be arranged in tandem under the control of one promoter, but it is more preferable to arrange a promoter upstream of each gene. .
  • These promoters may be the same as or different from each other, but it is also preferable to use the lac promoter.
  • the introduction of the ACC deaminase gene into Agrobacterium can be performed by the same method as described above for the method of introducing the GABA aminotransferase gene into Agrobacterium.
  • the GABA aminotransferase gene and / or ACC deaminase gene is preferably introduced into Agrobacterium along with one or more other foreign genes such as a marker gene in a vector.
  • the GABA aminotransferase gene and the ACC deaminase gene are preferably arranged upstream of other foreign genes in the vector.
  • Suitable marker genes include drug resistance genes such as gentamicin resistance gene, neomycin resistance gene, hygromycin resistance gene, puromycin resistance gene, zeocin resistance gene, blasticidin resistance gene, dihydrofolate reductase gene, and ampicillin resistance gene.
  • a reporter gene such as a gene encoding a fluorescent protein may be used.
  • a sequence that stably holds the plasmid in Agrobacterium cells is used as another foreign gene, such as GABA aminotransferase gene and / or ACC.
  • the “other foreign gene” is a gene other than the GABA aminotransferase gene and the ACC deaminase gene, and encodes a protein or functional RNA, and the host Agrobacterium is naturally present. Means a gene that does not.
  • a transcription termination sequence exists between the GABA aminotransferase gene and / or ACC deaminase gene and the other foreign gene. It is preferable.
  • the transcription termination sequence is not particularly limited as long as it can function as a transcription termination signal of mRNA.
  • a transcription termination sequence that each gene naturally has downstream may be used, or a transcription termination sequence existing downstream of any known gene may be prepared by PCR amplification or the like.
  • Specific examples include a transcription termination sequence of an ampicillin drug resistance gene.
  • the transcription termination sequence of the ampicillin drug resistance gene for example, the base sequence shown in SEQ ID NO: 12, or 80% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% or more, such as 98% or 99% or more, relative to the sequence. And a base sequence having a terminator activity.
  • gene introduction into a plant can be performed with high efficiency.
  • the gene introduction into the plant using the transformed Agrobacterium according to the present invention can be performed according to the procedure of a normal Agrobacterium method. Specifically, for example, between the right border sequence (RB) and the left border sequence (LB) of a vector such as a plasmid having a T-DNA region for plant transformation (typically a binary vector), a promoter and a terminator An arbitrary gene (target gene) to be introduced into a plant under control is incorporated, and the vector is introduced into the transformed Agrobacterium according to the present invention by a conventional method and used for gene introduction into the plant.
  • a marker gene as described above may be incorporated into the T-DNA region together with the target gene.
  • the present invention includes a vector containing a T-DNA region into which a target gene has been inserted (preferably a binary vector containing a T-DNA region) in addition to a vector containing a GABA aminotransferase gene and / or an ACC deaminase gene.
  • a transformed Agrobacterium is also provided.
  • the binary vector containing the T-DNA region for example, pIG121-Hm, pEKH 2, pRI 909, pRI 910, a number of well-known T-DNA binary vector such BIBAC1 (Lee, LY and Gelvin, SB (2008) T -DNA Binary Vectors and Systems, Pant Physiology 146: 325-332 etc.).
  • pIG121-Hm has a GUS gene placed under the 35S promoter control in the T-DNA region
  • pEKH 2 has a GUS gene placed under the Ubi promoter control from maize in the T-DNA region.
  • the transformed Agrobacterium according to the present invention must retain the vir region involved in gene transfer into plant cells in a state where it can be expressed.
  • a helper vector having the vir region is also introduced. You can do it.
  • the GABA aminotransferase gene and / or the ACC deaminase gene may be incorporated into a helper vector having a vir region in Agrobacterium.
  • the co-culture medium used for co-culture is not particularly limited, but a medium based on MS medium is also preferable.
  • the co-culture medium preferably contains acetosyringone (for example, 50 ⁇ M to 500 ⁇ M, preferably 100 ⁇ M to 300 ⁇ M) and glucose (for example, 0.5 to 10%, preferably 1 to 5%).
  • the Agrobacterium-mediated transformation method using the transformed Agrobacterium of the present invention can be carried out on any plant that can be infected by Agrobacterium.
  • the plant to be transformed using the Agrobacterium according to the present invention may be a dicotyledonous plant or a monocotyledonous plant.
  • the corresponding plant is not particularly limited, but, for example, eggplant (Solanum melongena L.), tomato (Solanum lycopersicum), pepper (Capsicum annuum L. var.
  • Angulosum Mill. Red pepper (Capsicum annuum L.), Tobacco (Nicotiana tabacum L.)], Gramineae [Oryza sativa), wheat (Triticum aestivum L.), barley (Hordeum vulgare L.), maize (Zea mays L.), sorghum (Sorghum bicolor (L.
  • Moench Moench
  • Eliansus ravennae Guinea grass (Panicum maximum Jacq.), Miscanthus (Miscanthus spp)
  • Sugar cane Saccharum officinarum L.
  • Napiergrass Piergrass
  • Pampas grass Crop f
  • Perennial ryegrass Liumenperenne L.
  • Italian ryegrass Lium multiflorum Lam.
  • Meadow fescue Festuca pratensis Huds.
  • legumes [soybean (Glycine max), azuki bean (Vigna angularis Willd.), Green beans (Phaseolus vulgaris L.), broad bean (Vicia faba L.), etc.], cucurbitaceae (Cucumis sativus L.), melon (Cucumis melo L.), watermelon (Citrullus vulgaris Sch ), Pumpkin (C. moschata Duch., C.
  • the plant tissue, plant cell (callus, etc.), seed, etc. in which the target gene is incorporated into the genome via the Agrobacterium according to the present invention can be regenerated into a plant body by a known method.
  • a transformed plant cell into which a target gene has been incorporated is cultured in a selective medium according to a conventionally known plant tissue culture method, and surviving callus is transformed into a regeneration medium (an appropriate concentration of plant hormones (auxin, cytokinin, (Including gibberellin, abscisic acid, ethylene, brassinolide, etc.)), the transformed plant body (especially shoot) can be regenerated.
  • a regeneration medium an appropriate concentration of plant hormones (auxin, cytokinin, (Including gibberellin, abscisic acid, ethylene, brassinolide, etc.)
  • An example of cytokinin is zeatin.
  • the regenerated plant can be further transplanted to a rooting medium for growth.
  • Whether the target gene has been inserted into the plant genome is determined by examining the transformant based on the activity of the gene product of the target gene, or the activity of the marker gene product when the marker gene is integrated into the plant genome together with the target gene. This can be confirmed by testing the transformant based on the above.
  • the target gene and / or marker gene introduced into the genome can be specifically confirmed by PCR amplification and determining the nucleotide sequence.
  • the gene transfer efficiency refers to the ratio of host explants or host cells showing the phenotype generated by gene transfer out of the number of host explants or host cells contacted with Agrobacterium. .
  • the gene transfer efficiency in the present invention can also be expressed as the proportion of transformed individuals in which the gene transfer into the genome has been confirmed among the number of host explants contacted with Agrobacterium.
  • the evaluation of gene transfer efficiency is performed using different methods depending on the type of target gene or marker gene to be transferred, but can basically be performed as described in Examples 6 to 8.
  • the level of improvement in gene transfer efficiency is not limited, but is, for example, an improvement of 10% or more, preferably 20% or more, more preferably 50% or more, still more preferably 100% or more, particularly 200% or more.
  • the transformed Agrobacterium having the GABA aminotransferase gene introduced therein as described above is used in the Agrobacterium-mediated transformation (gene introduction) method, so that the plant cells are remarkably highly efficient.
  • a target gene can be introduced to produce a transformed plant efficiently.
  • the target gene can also be introduced into plant cells with higher efficiency by using a transformed Agrobacterium having both the GABA aminotransferase gene and the ACC deaminase gene introduced therein.
  • a sufficient effect can be obtained by the existing transformation method (Patent Document 1) in which an ACC deaminase gene is independently introduced into Agrobacterium according to the type of plant such as Elianthus. Even if it is not possible, gene transfer efficiency can be significantly improved.
  • Patent Document 1 a large improvement in gene transfer efficiency is observed just by introducing a GABA aminotransferase gene alone into Agrobacterium, but by introducing the GABA aminotransferase gene in combination with the ACC deaminase gene, Furthermore, gene transfer efficiency can be further improved.
  • succinic semialdehyde a metabolite of GABA
  • succinic semialdehyde a metabolite of GABA
  • the transformation according to the present invention In the development process of Agrobacterium, succinic semialdehyde could inhibit gene transfer by metabolizing GABA with GABA aminotransferase.
  • the present inventors can greatly improve gene transfer efficiency without causing significant inhibition by GABA metabolites by imparting GABA aminotransferase activity to Agrobacterium. showed that.
  • the present invention also provides a method for producing such a transformed plant.
  • the GABA aminotransferase gene was cloned from Escherichia coli K12 strain.
  • Escherichia coli K12 strain was grown and maintained in LB medium at 37 ° C.
  • Total DNA was extracted from E. coli K12 by the method of Sambrook et al. (2001) and used as a PCR template.
  • gabT GABA aminotransferase
  • PCR was performed using the total DNA extracted above and these primers under the following conditions: 94 ° C, heat denaturation for 2 minutes, 94 ° C for 45 seconds, 58 ° C for 45 seconds, and 72 ° C. The 2 minute temperature cycle was repeated 35 times.
  • the expected 1294 bp PCR product (gabT fragment 1) was cloned into the cloning vector pET-21b (+) (Promega, USA) (pETgabT) (FIG. 1).
  • the base sequence was determined using DNA sequencer ABI310 and DNA Sequencing Kit Big Dye Terminator cycle sequencing Ready Reaction (Applied Biosystems, Tokyo), and the registered sequence (accession number NC_010473.
  • Example 2 Construction of gabT expression vector Plasmid pETgabT was extracted from the recombinant Escherichia coli E. coli DH5 ⁇ (pETgabT) obtained in Example 1 according to a conventional method, and the GABA aminotransferase gene (gabT) was isolated with restriction enzyme HindIII. It was excised with XbaI and subcloned into the multiple cloning site of the broad host range vector pBBR1MCS-5 (Kovach et al., 1995, Gene 166, 175-176) (pBBRgabT, FIG. 2).
  • the GABA aminotransferase protein expressed from this recombinant plasmid has 33 amino acids derived from ⁇ -galactosidase encoded by a sequence (fragment of lacZ gene) in pBBR1MCS-5 added to its N-terminus. (FIG. 3, nucleotide sequence: SEQ ID NO: 5, amino acid sequence: SEQ ID NO: 6).
  • the 33 amino acids derived from ⁇ -galactosidase added to the N-terminus do not affect the activity of GABA aminotransferase.
  • Expression of the gabT gene on this plasmid is placed under the control of the lac promoter.
  • Example 3 Construction of expression vector for co-expression of GABA aminotransferase gene and ACC deaminase gene Using the pBBRgabT expression vector prepared in Example 2 as a template, primer acdS-for (5'-tctgcgcgtaatctgctgcttgagcgcaacgcaattaatg-3 '(sequence) No. 7)) and a primer gabT-Rev (5′-cgattctagactactgcttcgcctcatcaaaac-3 ′ (SEQ ID NO: 8)) was used to amplify a DNA fragment containing the GABA aminotransferase gene (gabT) by PCR.
  • the obtained amplified fragment (gabT fragment 2; SEQ ID NO: 9) was subjected to GABA degradation in which a 5 'untranslated region containing a lac promoter (including a ribosome binding sequence) and 33 amino acids derived from ⁇ -galactosidase were added to the N-terminus.
  • a sequence encoding the enzyme protein is included ( Figure 4).
  • the obtained two amplified fragments gabT fragment 2 and amp-term fragment were ligated by fusion PCR using primers amp_ter-for2 and gabT-Rev.
  • the obtained PCR product was digested with restriction enzymes EcoRI and XbaI.
  • Example 4 Gene introduction into Agrobacterium
  • the plasmid vector pBBRgabT constructed in Example 2 and the plasmid vector pBBRacdS / gabT constructed in Example 3 were each an Agrobacterium strain carrying the binary plasmid pIG121-Hm.
  • Agrobacterium tumefaciens GV2260 or Agrobacterium strains Agrobacterium tumefaciens GV2260 which holds the binary plasmid PEKH 2 was introduced by electroporation Paule Deployment method.
  • GV2260 has a helper plasmid having a vir region.
  • the GUS (uidA) gene is inserted into these binary plasmids and can be used as an index for gene introduction into plants.
  • Agrobacterium strain GV2260 (pBBRgabT, pIG121-Hm), Agrobacterium strain GV2260 (pBBRgabT, pEKH 2 ), Agrobacterium strain GV2260 (pBBRacdS / gabT, pIG121-Hm), and Agrobacterium strain carrying the transfer vector GV2260 (pBBRacdS / gabT, pEKH 2 ) is an LB medium containing the antibiotics gentamicin 50 mg / L, kanamycin 100 mg / L, and ampicillin 100 mg / L, or gentamicin 50 mg / L, spectinomycin 50 mg / L, and ampicillin 100 mg. It was obtained by culturing and maintaining in LB medium containing / L.
  • Agrobacterium has two types of plasmids at the same time by direct PCR using colony as a template, primers gabTF and gabTR for detection of gabT gene, and primer GUSF (5'-atccacgccgtattcgg- for detection of uidA) 3 ′ (SEQ ID NO: 15)) and primer GUSR (5′-catgaagatgcggacttacg-3 ′ (SEQ ID NO: 16)) were used for confirmation.
  • Agrobacterium strain GV2260 (pBBR1MCS-5, pIG121-Hm) carrying plasmid vector pBBR1MCS-5 that does not contain the gabT gene was used in the same manner as described above except that plasmid vector pBBR1MCS-5 was introduced.
  • Agrobacterium strain GV2260 (pBBR1MCS-5, pEKH 2 ) was obtained.
  • Agrobacterium strain GV2260 (pBBRacdS, pIG121-Hm) carrying the ACC deaminase gene expression plasmid vector pBBRacdS was obtained in the same manner as described above except that the plasmid vector pBBRacdS was introduced.
  • Example 5 Measurement of GABA aminotransferase activity
  • the gabT activity in Agrobacterium strain GV2260 (pBBRgabT, pEKH 2 ) and Agrobacterium strain GV2260 (pBBRacdS / gabT, pEKH 2 ) prepared in Example 4 was measured.
  • the gabT activity of Agrobacterium strain GV2260 (pBBR1MCS-5, pEKH 2 ) was also measured.
  • These Agrobacterium are cultured in LB medium containing gentamicin 50 mg / L, spectinomycin 50 mg / L, and ampicillin 100 mg / L.
  • Agrobacterium 22 hours after the start of culture The cells were collected and lysed using a bacteria-derived protein extraction reagent BugBuster Master mix (Novagene). A protease inhibitor (Protease Inhibitor Cocktail set II, Novagen) was added, and the mixture was rotated and mixed at room temperature for 20 minutes. Thereafter, the mixture was centrifuged at 16,000 ⁇ g for 20 minutes, and the supernatant was transferred to a new tube. Subsequently, the protein concentration of the supernatant was measured using a protein assay kit BCA Protein Assay kit (Novabene).
  • reaction solution 0.1 M Bicine-NaOH, 0.1 M pyridoxal phosphate, 10 mM 2-ketoglutarate, 10 mM GABA
  • the enzyme reaction was performed at 37 ° C., and the reaction times were 0 minutes, 10 minutes, 20 minutes, 30 minutes, 60 minutes, 120 minutes, and 180 minutes.
  • the amount of glutamic acid as a reaction product was measured using Yamasa L-glutamic acid measurement kit II (Yamasa Soy Sauce Co., Ltd.).
  • the L-glutamate oxidase included in the kit oxidizes the glutamic acid of the reaction product to generate hydrogen peroxide, and a blue dye is formed from the hydrogen peroxide by a peroxidase reaction.
  • the amount of glutamic acid in the reaction solution is measured by measuring with Yamasa L-glutamic acid measurement kit II (Yamasa Soy Sauce Co., Ltd.).
  • Agrobacterium strain As a result of the enzymatic reaction, when using the crude enzyme extract obtained from Agrobacterium strain GV2260 (pBBRgabT, pEKH 2 ) and Agrobacterium strain GV2260 (pBBRacdS / gabT, pEKH 2 ), Agrobacterium strain as a control
  • the amount of glutamic acid, a reaction product was measured more than when a crude enzyme extract derived from GV2260 (pBBR1MCS-5, pEKH 2 ) was used, and it was shown that it increased with increasing reaction time (Fig. 6). This indicates that the GABA aminotransferase derived from E.
  • coli is stably expressed in the Agrobacterium cell and has activity from the vector introduced into the Agrobacterium cell. Thus, it was shown that the activity can be imparted to Agrobacterium by introducing the GABA aminotransferase gene into Agrobacterium.
  • Example 6 Evaluation of gene transfer efficiency into plants-1 About Agrobacterium strain GV2260 (pBBRgabT, pIG121-Hm), Agrobacterium strain GV2260 (pBBRgabT, pEKH 2 ), and Agrobacterium strain GV2260 (pBBRacdS / gabT, pEKH 2 ) introduced with the GABA aminotransferase gene, The ability of gene transfer into plants was evaluated.
  • the gene to be introduced into the plant is a GUS gene contained in the T-DNA region of the binary vectors pIG121-Hm and pEKH 2 and used as a marker for gene introduction into the plant (Hiei et al., Plant J., 6 (2): 271-282 (1994)).
  • Agrobacterium strain GV2260 (pBBRgabT, pIG121-Hm) and Agrobacterium strain GV2260 (pBBR1MCS-5, pIG121-Hm) as a control, respectively.
  • dicotyledon tomato Solanumcolycopersicum 'Money Maker'
  • Tomato seeds were aseptically sown on 1 / 2MS (Murasige-Skoog) 1.5% sucrose medium, and the cotyledons obtained by growing the seeds were cut off from the top and bottom, and the two-divided sections were used as tomato explants.
  • the tomato explants were immersed in the prepared bacterial solution for 20 minutes, and then co-cultured at 28 ° C. under dark conditions for 72 hours.
  • the co-culture medium used was prepared by adding 3% glucose, 200 ⁇ M acetosyringone, 1.5 mg / L zeatin to MS medium.
  • tomato cotyledon explants were GUS-stained to evaluate gene transfer efficiency. Specifically, tomato cotyledon explants after co-cultivation were prepared using EDTA (10 mM), ferricyan potassium (5 mM), potassium ferrocyanide (5% mM), Triton X-100 (0.1%), and 5- It was immersed in a 100 mM phosphate buffer containing bromo-4-chloro-3-indoxyl-glucuronide (X-Glu) (0.5 mg / L) and incubated overnight at 37 ° C. As a result, in the cells into which the GUS gene has been introduced, the substrate X-Glu is decomposed and stained dark blue by the function of the GUS gene product.
  • X-Glu bromo-4-chloro-3-indoxyl-glucuronide
  • GUS gene into tomato of Agrobacterium strain GV2260 (pBBRgabT, pIG121-Hm) imparted with gabT activity
  • introduction of GUS gene into tomato of Agrobacterium strain GV2260 (pBBR1MCS-5, pIG121-Hm) as a control
  • the ratio of the number of explants in which GUS spots were observed (%) and the average frequency of appearance of GUS spots per sheet were significantly increased in Agrobacterium strains with gabT activity (FIG. 7A). From this, it was shown that an Agrobacterium strain having an excellent ability to introduce a gene into a plant can be produced by imparting GABA aminotransferase activity to Agrobacterium.
  • Example 7 Evaluation of gene transfer efficiency into plants-2 Next, Agrobacterium strain GV2260 (pBBRgabT, pEKH 2 ) imparted with GABA aminotransferase activity, Agrobacterium strain GV2260 (pBBRacdS / gabT, pEKH 2 ) imparted with GABA aminotransferase activity and ACC deaminase activity Agrobacterium strain GV2260 (pBBRacdS, pEKH 2 ) imparted with ACC deaminase activity and Agrobacterium strain GV2260 (pBBR1MCS-5, pEKH 2 ) as a control group were used, respectively, ) To evaluate the efficiency of introduction of the GUS gene into.
  • Elianthus were cultured in MS medium containing 3% maltose, 2 mg / L 2,4-dichlorophenoxyacetic acid, 0.2% bacterial alkaline phosphatase (BAP) and 0.3% gellite to induce callus.
  • Elian Saskars was placed on fresh medium 3 days before infection with Agrobacterium.
  • the collected Agrobacterium was resuspended in liquid MS medium and the turbidity was adjusted to OD600 0.4-0.5. The treatment of placing Elian Saskars into Agrobacterium suspension and placing it under 0.8 MPa for 10 minutes was repeated twice. Next, Erian sascal callus soaked in Agrobacterium solution was collected and co-cultured at 28 ° C. under dark conditions for 72 hours. The co-culture medium was prepared by adding 3% glucose and 200 ⁇ M acetosyringone to MS medium.
  • Erian sascalus was stained with GUS to evaluate gene transfer efficiency. Specifically, Erianthus callus after co-cultivation was performed using EDTA (10 mM), potassium ferricyanide (5 mM), potassium ferrocyanide (5 mM), Triton X-100 (0.1%), and 5-bromo-4 -Soaked in 100 mM phosphate buffer containing -chloro-3-indoxyl-glucuronide (X-Glu) (0.5 mg / L) and incubated overnight at 37 ° C. As a result, in the cells into which the GUS gene has been introduced, the substrate X-Glu is decomposed and stained dark blue by the function of the GUS gene product.
  • EDTA 10 mM
  • potassium ferricyanide 5 mM
  • potassium ferrocyanide 5 mM
  • Triton X-100 0.1%)
  • Example 8 Evaluation of gene transfer efficiency into plants-3 Gene transfer efficiency to dicotyledonous tomato plants using Agrobacterium strain GV2260 (pBBRgabT, pIG121-Hm) and Agrobacterium strain GV2260 (pBBRacdS / gabT, pIG121-Hm) introduced with GABA aminotransferase gene was evaluated.
  • the genes to be introduced into plants are the GUS gene, kanamycin resistance gene, and hygromycin resistance gene contained in the T-DNA region of the binary vector pIG121-Hm (Hiei et al., Plant J., 6 (2): 271-282 (1994)).
  • a kanamycin resistance gene was used as a marker for gene introduction.
  • Agrobacterium strain GV2260 (pBBRgabT, pIG121-Hm), Agrobacterium strain GV2260 (pBBRacdS / gabT, pIG121-Hm) and Agrobacterium strain GV2260 (pBBR1MCS-5, pIG121-Hm) as a control, Agrobacterium
  • the dicotyledonous plant tomato (Solanumcolycopersicum 'Micro Tom') was transformed with each of E. coli strains GV2260 (pBBRacdS, pIG121-Hm), and the production efficiency of stable transformants was evaluated.
  • tomato seeds were aseptically sown on 1 / 2MS (Murasige-Skoog) 1.5% sucrose medium, and the top and bottom of the cotyledons obtained by growing it were cut off, and the section divided into two was cut into tomato explants. Used for gene transfer (test section).
  • the tomato explants were immersed in the prepared bacterial solution for 20 minutes, and then co-cultured at 28 ° C. under dark conditions for 72 hours.
  • the co-culture medium used was prepared by adding 3% glucose, 200 ⁇ M acetosyringone, 1.5 mg / L zeatin, and 0.3% gellan gum to MS medium to pH 5.2.
  • the tomato explants were placed on a sterilization and callus induction medium.
  • the sterilization and callus induction medium was adjusted to pH 5.8 by adding 3% sucrose, 1.5 mg / L zeatin, 0.3% gellan gum, 100 mg / L kanamycin, and 375 mg / L augmentin to MS medium.
  • Shoots were formed after tomato explants were cultivated for 3 to 4 weeks at 25 ° C. under a light condition of 60 ⁇ mol ⁇ 2 S ⁇ 1 in a sterilized and callus medium for 16 hours. Callus that formed shoots were transplanted to shoot elongation medium.
  • the shoot elongation medium was prepared by adding 3% sucrose, 1.0 mg / L zeatin, 0.3% gellan gum, 100 mg / L kanamycin, 375 mg / L augmentin to MS medium and adjusting the pH to 5.8. After the shoots extended to 1 to 2 cm, the shoots were cut off and transplanted to the rooting medium. The rooting medium was adjusted to pH 5.8 by adding 15% sucrose, 0.3% gellan gum, 100 mg / L kanamycin, 375 mg / L augmentin to 1 / 2MS medium. Individuals (rooted individuals) rooted within 2 weeks in the rooting medium were selected as transformant candidates. A rooted individual was taken from the main root. Among rooting individuals, diploid ones were selected using a flow cytometer.
  • Genomes were extracted from diploid individuals, and Southern hybridization was performed using each transgene fragment as a probe to confirm gene introduction into the genome. Several experiments were performed, and the average value of the ratio of transgenic individuals (positive for Southern hybridization) (transformation efficiency) to the number of test sections (80 to 156 used per strain for each experiment) was calculated. (Table 1).
  • Agrobacterium strain GV2260 (pBBRgabT, pIG121-Hm) to which gabT activity was imparted, transformation efficiency (individual genome) was compared with the case of using Agrobacterium strain VGV2260 (pBBR1MCS-5, pIG121-Hm) as a control. Gene transfer efficiency) increased significantly to about 235%. Furthermore, in Agrobacterium strain GV2260 (pBBRacdS / gabT, pIG121-Hm) into which both genes acdS and gabT were introduced, only one of the control (GV2260 (pBBR1MCS-5, pIG121-Hm)) and acdS or gabT was introduced.
  • the present invention can be used to improve gene transfer efficiency in plant transformation based on the Agrobacterium method. For example, in order to improve the production efficiency of recombinant plants in plant species that have been reported to have been introduced with Agrobacterium, recombinant plants have been used in plant species that have previously been difficult to introduce genes. To produce it, the Agrobacterium of the present invention and the method of the present invention can be used. The present invention makes it possible to improve varieties using genetic recombination in a wide range of plant species.
  • SEQ ID NO: 1 Base sequence encoding GABA aminotransferase protein derived from Escherichia coli strain
  • SEQ ID NO: 2 GABA aminotransferase protein
  • SEQ ID NO: 3 Primer gabTF Sequence number 4: Primer gabTR
  • SEQ ID NO: 5 Base sequence encoding GABA aminotransferase protein added with 33 amino acids derived from ⁇ -galactosidase
  • SEQ ID NO: 6 GABA aminotransferase protein added with 33 amino acids derived from ⁇ -galactosidase
  • SEQ ID NO: 7 Primer acdS- for Sequence number 8: Primer gabT-Rev SEQ ID NO: 9: gabT fragment 2
  • Sequence number 10 Primer amp_ter-for2 Sequence number 11: Primer amp_ter-rev2 SEQ ID NO: 12: amp-term fragment
  • SEQ ID NO: 13 ACC deaminase gene
  • SEQ ID NO: 14 ACC deamina

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Abstract

　本発明は、遺伝子導入効率を向上させたアグロバクテリウム菌に関する。外来性のGABAアミノ基転移酵素遺伝子を保持する、向上した遺伝子導入効率を示す形質転換アグロバクテリウム菌、及びそれを用いた形質転換植物の作製方法が提供される。

Description

植物への高効率遺伝子導入能を付与したアグロバクテリウム菌
　本件技術は、植物への遺伝子導入効率が向上したアグロバクテリウム菌及びその使用に関する。
　土壌細菌の一つであるアグロバクテリウム菌を介した植物への遺伝子導入法（アグロバクテリウム法）は、特別な技術や装置を必要とせず簡便な手順で行うことができる。アグロバクテリウム法では、遺伝子を完全な形でかつ少ないコピー数で植物に導入できる。このため、他の植物遺伝子導入法と比較して、形質転換植物の作製に高頻度に用いられている。しかしながら、アグロバクテリウム法による導入効率が低い植物種も多数存在する。そこで植物への遺伝子導入能力を促進したアグロバクテリウムの開発が望まれている。
　アグロバクテリウム菌にエチレン生産を抑制する能力を付与するACCデアミナーゼ遺伝子を含むプラスミドを保持させることにより、植物への遺伝子導入効率を向上させたアグロバクテリウム菌（スーパーアグロバクテリウム）について報告されている（特許文献１、非特許文献１）。しかし様々なメカニズムに基づいて遺伝子導入効率を向上させるべく、遺伝子導入効率の高いアグロバクテリウム菌の開発は依然として望まれている。なお本発明者らは、アグロバクテリウム菌のゲノムの所定領域にACCデアミナーゼ遺伝子を組み込むことにより、アグロバクテリウム菌の遺伝子導入効率を安定して向上させる技術を開発している（特許文献２）。
　ところで、GABA（γ－アミノ酪酸）は植物への傷害やアグロバクテリウム菌感染により植物内で生産される（非特許文献２）。また、GABA高生産植物はアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）C58株に対する感染感受性が低かったという報告がある（非特許文献３）。さらに、植物のGABAはアグロバクテリウム菌のクォーラムセンシングシグナルを抑制し、遺伝子導入に必要なTiプラスミドの複製や、アグロバクテリウム菌体間の水平伝搬を抑制することが知られている（非特許文献４及び５）。しかし植物のGABA活性を、アグロバクテリウム菌の改変により変化させることができるかどうか、またそれにより遺伝子導入効率を変化させることができるかどうかは知られていない。
特開２００５－３１２３４５号公報 特開２０１３－１８３６５９
Nonaka et al., Applied and Environmental Microbiology, Apr. (2008) p. 2526-2528 Haudecoeur et al., (2009) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 106:14587-14592 Chevrot et al., (2006) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103: 7460-7464 Yuan et al., (2007) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 104:11790-5 Pappas (2008) Plasmid 60: 89-107
　本発明は、遺伝子導入効率の高いアグロバクテリウム菌を提供することを課題とする。
　本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討を重ねた結果、アグロバクテリウム菌にGABAアミノ基転移酵素活性を付与することにより、アグロバクテリウム菌による植物への遺伝子導入効率を大きく向上させることができることを見出し、本発明を完成するに至った。
　すなわち、本発明は以下を包含する。
[1]　外来性のGABAアミノ基転移酵素遺伝子を保持する、向上した遺伝子導入効率を示す形質転換アグロバクテリウム菌。
　この本発明の形質転換アグロバクテリウム菌は、外来性のACCデアミナーゼ遺伝子をさらに保持することも好ましい。
　本発明の形質転換アグロバクテリウム菌は、GABAアミノ基転移酵素遺伝子及び／又はACCデアミナーゼ遺伝子をベクター形態で保持することが好ましい。
　本発明の形質転換アグロバクテリウム菌は、T-DNA領域を含むバイナリーベクターをさらに含有してもよい。
　ここで、GABAアミノ基転移酵素遺伝子は細菌由来であることが好ましい。また、ACCデアミナーゼ遺伝子が細菌由来であることも好ましい。
[2]　上記[1]の形質転換アグロバクテリウム菌を用いて、植物への遺伝子導入を行うことを特徴とする、形質転換植物の作製方法。
　この方法では、植物は単子葉植物又は双子葉植物であり得る。単子葉植物は例えばイネ科植物が好ましい。また双子葉植物は例えばナス科植物が好ましい。
　本明細書は本願の優先権主張の基礎となる日本国特許出願 特願2013-023726号の明細書及び図面に記載される内容を包含する。
　本発明によれば、植物宿主ゲノムに目的遺伝子を効率よく導入することができる。
図１は、GABAアミノ基転移酵素遺伝子（gabT）を持つpETgabTのプラスミドマップを示す。 図２は、GABAアミノ基転移酵素遺伝子を持つ発現ベクターpBBRgabTのプラスミドマップを示す。 図３は、pBBRgabT中のGABAアミノ基転移酵素タンパク質（gabT）をコードする塩基配列を示す。図中にβガラクトシダーゼ由来の33アミノ酸をコードしている範囲（lacZ部分断片）を示した。 図４は、pBBRgabTを鋳型としてプライマーacdS-for及びgabT-Revを用いてPCR法で増幅したgabT断片2（配列番号９）の塩基配列を示す。図中にlacプロモーター、リボソーム結合配列（二重下線部）、βガラクトシダーゼ由来33アミノ酸コード配列（lacZ部分断片）、GABAアミノ基転移酵素遺伝子（gabT）（ORF）の範囲を示した。 図５は、ACCデアミナーゼ遺伝子とGABAアミノ基転移酵素遺伝子を共発現するベクターpBBRacdS/gabTのプラスミドマップを示す。 図６は、アグロバクテリウム菌におけるgabT酵素活性の測定結果を示す。MCS：アグロバクテリウム菌株GV2260(pBBR1MCS-5, pEKH2)、gabT：アグロバクテリウム菌株GV2260(pBBRgabT, pEKH2)、acdS/gabT：アグロバクテリウム菌株GV2260(pBBRacdS/gabT, pEKH2)を表す。n=3。エラーバーは標準偏差を表す。 図７は、アグロバクテリウム菌によるトマトへの遺伝子導入効率を示す。Ａは、アグロバクテリウム菌を感染させたトマト外植片における遺伝子導入頻度を６段階のGUS染色レベルの分布で示す。MCS：アグロバクテリウム菌株GV2260(pBBR1MCS-5, pEKH2)、gabT：アグロバクテリウム菌株GV2260(pBBRgabT, pEKH2)を表す。ＢはGUS染色レベル0～5の例を示す。 図８は、アグロバクテリウム菌によるエリアンサスへの遺伝子導入効率を示す。MCS：アグロバクテリウム菌株GV2260(pBBR1MCS-5, pEKH2)、acdS：アグロバクテリウム菌株GV2260(pBBRacdS, pEKH2)、gabT：アグロバクテリウム菌株GV2260(pBBRgabT, pEKH2)、acdS/gabT：アグロバクテリウム菌株GV2260(pBBRacdS/gabT, pEKH2)を表す。n=3。エラーバーは標準偏差を表す。一回の実験に1～2gのカルスを使用した。
　以下、本発明を詳細に説明する。
　本発明は、GABAアミノ基転移酵素活性をアグロバクテリウム菌に付与することにより、それが感染した植物に対する遺伝子導入効率が向上した形質転換アグロバクテリウム菌を提供する。より具体的には、本発明に係る形質転換アグロバクテリウム菌は、外来性のGABAアミノ基転移酵素遺伝子を保持する、形質転換アグロバクテリウム菌である。本発明に係る形質転換アグロバクテリウム菌は、GABAアミノ基転移酵素遺伝子導入前と比較して、アグロバクテリウム媒介形質転換において植物への向上した遺伝子導入効率を示す。本発明において「外来性の」GABAアミノ基転移酵素遺伝子とは、アグロバクテリウム菌中に外部から導入されたGABAアミノ基転移酵素遺伝子、又はそのアグロバクテリウム菌の子孫において維持されているGABAアミノ基転移酵素遺伝子を指す。
　本発明で用いるGABAアミノ基転移酵素遺伝子は、GABAアミノ基転移酵素タンパク質をコードする核酸である。GABAアミノ基転移酵素は、GABA（γ－アミノ酪酸）を、コハク酸セミアルデヒド及びグルタミン酸へと代謝する活性を有する。大腸菌、シュードモナス属菌、マイコバクテリア属、根粒菌等を含む広範な細菌の他、植物等もGABAアミノ基転移酵素遺伝子を有していることが知られているが、天然のアグロバクテリウム菌はGABAアミノ基転移酵素遺伝子を有していない。本発明で用いるGABAアミノ基転移酵素遺伝子は、GABAアミノ基転移酵素を有する任意の生物種（細菌、植物、真菌、又は動物等）由来の遺伝子であってよい。例えば大腸菌（Escherichia coli）等のエシェリキア属菌、根粒菌（Shinorizobium meriloti等)、シュードモナス属菌（Pseudomonas syringae、Pseudomonas stutzeri等）、クリナリウム属菌（Crinalium epipsammum等）、シアノバクテリウム属菌（Cyanobacterium aponinum等）、ストレプトマイセス属菌（Streptomyces rimosus等）、エントロバクター属菌（Entrobacter cloacae subsp.等）、バチルス属菌（Bacillus sp.等）、プロヴィデンシィア属菌（Providencia stuartii等）、マイコバクテリア属菌（Mycobacterium marinum等）のような細菌由来のGABAアミノ基転移酵素遺伝子を好適に用いることができる。
　一実施形態として、例えば大腸菌Escherichia coli K12株由来のGABAアミノ基転移酵素のアミノ酸配列（配列番号２）をコードする塩基配列を含む核酸断片、例えば配列番号１に示す塩基配列をオープンリーディングフレーム（ORF）として有する核酸断片を、GABAアミノ基転移酵素遺伝子として用いてもよい。なお、本発明においてオープンリーディングフレーム（ORF）とは、タンパク質をコードする、開始コドンから終止コドンまでの核酸配列をいう。あるいは、配列番号１に示す塩基配列（全長）に対して70％以上、好ましくは80％以上、好ましくは85％以上、さらに好ましくは90％以上、例えば95％、98％又は99％以上の配列同一性を有し、かつGABAアミノ基転移酵素活性を有するタンパク質をコードする塩基配列からなる核酸断片をGABAアミノ基転移酵素遺伝子として用いてもよい。また配列番号２に示すアミノ酸配列において1～50個、好ましくは1～10個、例えば1～5個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつGABAアミノ基転移酵素活性を有するタンパク質をコードする塩基配列からなる核酸断片をGABAアミノ基転移酵素遺伝子として用いてもよい。さらに、配列番号２に示すアミノ酸配列（全長）に対して70％以上、好ましくは80％以上、好ましくは85％以上、さらに好ましくは90％以上、例えば95％、98％又は99％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつGABAアミノ基転移酵素活性を有するタンパク質をコードする塩基配列からなる核酸断片をGABAアミノ基転移酵素遺伝子として用いてもよい。GABAアミノ基転移酵素活性は、公知のGABAアミノ基転移酵素活性測定方法を用いて確認することができ、例えば、後述の実施例５に記載した方法に従って測定することができる。具体的には、反応液（0.1M Bicine-NaOH、0.1M リン酸ピリドキサール、10mM 2-ケトグルタレート、10mM GABA）にタンパク質を加えて37℃でインキュベートすることにより反応させ、一定の反応時間後、GABAアミノ基転移酵素反応の反応生成物であるグルタミン酸量を測定すればよい。グルタミン酸量の測定は、限定するものではないが、十分な測定感度を示す任意の市販のキット、例えばヤマサL-グルタミン酸測定キットII（ヤマサ醤油株式会社）を用いて測定することもできる。グルタミン酸量が経時的に増加したことが検出されれば、GABAアミノ基転移酵素活性が確認されたものと判断することができる。本発明において「核酸断片」は、DNAであってもRNAであってもよい。本発明において「核酸断片」はまた、修飾核酸又は人工核酸を含んでもよい。
　また、酵素活性に影響を及ぼさないアミノ酸配列がN末端又はC末端に付加されたGABAアミノ基転移酵素タンパク質をコードする核酸断片を用いることもできる。例えばGABAアミノ基転移酵素タンパク質のN末端に1～50個、例えば1～33個のアミノ酸が付加されたタンパク質をコードする塩基配列からなる核酸断片をGABAアミノ基転移酵素遺伝子として用いてもよい。酵素活性に影響を及ぼさないそのようなアミノ酸配列は、例えば選択マーカー遺伝子産物若しくはレポーター遺伝子産物、又はその断片であり得るが、好ましい例としてはβガラクトシダーゼ由来タンパク質断片（例えば、配列番号６の1～33位のアミノ酸配列）が挙げられる。そのような付加配列を含むGABAアミノ基転移酵素タンパク質は、例えば配列番号６に示すアミノ酸配列からなるタンパク質であり、そのようなタンパク質をコードする核酸断片の例は配列番号５に示す塩基配列を含む核酸断片である。
　本発明のGABAアミノ基転移酵素遺伝子は、その塩基配列（大腸菌の場合、例えば配列番号１の塩基配列）に基づいて、生物由来核酸から常法により単離することができる。例えば、細菌等の生物から常法により調製された全mRNA、全RNAからRT-PCRにより得られたcDNA、cDNAライブラリー等の核酸を鋳型とし、GABAアミノ基転移酵素遺伝子の配列に基づいて設計されるプライマーセットを用いてPCRを実施することにより、GABAアミノ基転移酵素遺伝子をDNA増幅断片として取得することができる。得られたDNA増幅断片は、常法により抽出・精製することができる。あるいは、GABAアミノ基転移酵素遺伝子（例えば、配列番号１の塩基配列からなるDNA）又はその一部を用いてプローブを作製し、それを細菌等の生物から常法により調製された全mRNA、全RNAからRT-PCRにより得られたcDNA、cDNAライブラリー等の核酸に対してハイブリダイズさせることにより、GABAアミノ基転移酵素遺伝子をクローンとして取得することもできる。本発明のGABAアミノ基転移酵素遺伝子はまた、化学合成法を利用して合成してもよい。また、天然源から単離された又は合成したGABAアミノ基転移酵素遺伝子を、部位特異的突然変異誘発法等の変異導入法によって改変することにより、GABAアミノ基転移酵素遺伝子を作製することもできる。遺伝子に変異を導入するには、Kunkel法、Gapped duplex法等の公知の手法又はこれに準ずる方法を採用することができる。遺伝子への変異導入は、例えば市販の部位特異的突然変異誘発キットを用いて当業者であれば容易に行うことができる。
　なお、得られたGABAアミノ基転移酵素遺伝子を含む核酸断片については、塩基配列決定によりその配列を確認することが好ましい。塩基配列決定はマキサム-ギルバートの化学修飾法、ジデオキシヌクレオチド鎖終結法等の公知手法により行うことができるが、通常は自動塩基配列決定装置（例えばABI社製DNAシークエンサー）を用いて行えばよい。
　本発明では、GABAアミノ基転移酵素遺伝子をT-DNA領域に含めて植物ゲノムへ導入することは意図しておらず、当該遺伝子をアグロバクテリウム菌に導入しその遺伝子産物の活性を保持させることによりアグロバクテリウム菌における植物への遺伝子導入効率（遺伝子導入能）を向上（増強）させることを意図している。そのため本発明では、GABAアミノ基転移酵素遺伝子を、T-DNA領域を含まないベクターを用いアグロバクテリウム菌に導入することが好ましい。T-DNA領域とは、アグロバクテリウム菌が有する染色体外ベクター中に存在する、右側ボーダー配列（RB）と左側ボーダー配列（LB）で挟まれた領域であって、アグロバクテリウム菌による植物形質転換の際にベクターから切り出されて植物ゲノム中に組み込まれる領域である。すなわち、本発明で好適に用いられる、T-DNA領域を含まないベクターは、アグロバクテリウム菌を介して植物ゲノムに挿入され得るT-DNA領域を有するベクター（典型的にはバイナリーベクター）ではなく、アグロバクテリウム菌において目的遺伝子の発現を誘導するための発現ベクターやアグロバクテリウムゲノムに目的遺伝子を組み込むための相同組換えベクター等である。本発明で用いるベクターは、好ましくはプラスミドベクターである。本発明で用いるベクターは、広宿主域ベクターであることも好ましい。本発明において好適に利用可能な広宿主域ベクターとしては、例えば、pBBR1MCS-5、pBBR122、及びRK2、並びにそれらの派生株等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
　アグロバクテリウム菌に導入されるGABAアミノ基転移酵素遺伝子は、ベクター、好ましくはT-DNA領域を含まないベクター中で、プロモーターの制御下に配置されていることが好ましい。ここで用いるプロモーターは、細菌、特にアグロバクテリウム菌で機能しうる任意のプロモーターであってよく、構成的プロモーター、誘導性プロモーター、一過性プロモーター、器官、組織又は細胞特異的プロモーターのいずれであってもよい。本発明においてアグロバクテリウム菌におけるGABAアミノ基転移酵素遺伝子の発現誘導に好適に使用可能なプロモーターとしては、例えば、lacプロモーター、dnakプロモーター、trpプロモーター、araBプロモーター、Pzt－1プロモーター、recAプロモーター、lppプロモーター、tacプロモーター、virプロモーター等が挙げられるが、これらに限定するものではない。1コピーのみならず、2コピー以上のコピー数のGABAアミノ基転移酵素遺伝子が、ベクター、好ましくはT-DNA領域を含まないベクター中で、プロモーターの制御下に含まれていてもよい。本発明において、１つのプロモーターの制御下に複数個の遺伝子が含まれる場合、それらの遺伝子は同じプロモーターの制御を受ける程度に短い間隔（例えば100 bp以下、好ましくは50 bp以下）で同配向で連結されていることが好ましい。
　GABAアミノ基転移酵素遺伝子を導入するアグロバクテリウム菌は、限定するものではないが、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）、アグロバクテリウム・ビチス（Agrobacterium vitis）、アグロバクテリウム・リゾゲネス（Agrobacterium rhizogenes）、及びアグロバクテリウム・ラジオバクター（Agrobacterium radiobacter）等のアグロバクテリウム法に使用可能な任意のアグロバクテリウム菌であってよい。具体的には、例えば、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）GV2260、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）C58株、アグロバクテリウム・ビチス（Agrobacterium vitis）S4株、アグロバクテリウム・リゾゲネス（Agrobacterium rhizogenes）A4株、及びアグロバクテリウム・ラジオバクター（Agrobacterium radiobacter）K84株、並びにそれらの派生株、また植物形質転換用に使用されている他のアグロバクテリウム菌株を好適に使用することができ、例えば、GV2260、C58C1RifR、GV3850、GV3101、EHA101、EHA105、AGL1、LBA4404、K84N6株が挙げられるが、これらに限定されるわけではない。植物形質転換に利用するため、植物細胞への遺伝子導入に関与するvir領域を含むベクター又はゲノム領域（典型的にはvir領域を持つヘルパープラスミド）を有するアグロバクテリウム菌は好ましい。
　GABAアミノ基転移酵素遺伝子を含むベクターのアグロバクテリウム菌への導入は、限定するものではないが、典型的にはエレクトロポレーション法により行うことができる。ベクターを導入したアグロバクテリウム菌を、例えばベクターに含まれる薬剤耐性遺伝子等の選択マーカーに対応した抗生物質等を含む選択培地で培養することにより、形質転換アグロバクテリウム菌を選択することができる。選択した形質転換アグロバクテリウム菌を選択培地で培養することにより、導入されたGABAアミノ基転移酵素遺伝子を保持させてもよい。
　導入されたGABAアミノ基転移酵素遺伝子は、得られる形質転換アグロバクテリウム菌において染色体外でベクター形態で（プラスミド等のベクターに含まれた状態で）保持されてもよいし、アグロバクテリウム菌のゲノムに組み込まれて保持されてもよい。GABAアミノ基転移酵素遺伝子を発現ベクターを用いてアグロバクテリウム菌に導入した場合には、GABAアミノ基転移酵素遺伝子は、自律複製する発現ベクター中に含まれる状態で保持され、GABAアミノ基転移酵素タンパク質を発現することが好ましい。GABAアミノ基転移酵素遺伝子をアグロバクテリウムゲノムを標的とする相同組換えベクターを用いてアグロバクテリウム菌に導入した場合には、GABAアミノ基転移酵素遺伝子は、ゲノム中に組み込まれた状態で保持され、GABAアミノ基転移酵素タンパク質を発現することが好ましい。本発明では、導入されたGABAアミノ基転移酵素遺伝子を保持しているアグロバクテリウム菌又はその子孫であって、GABAアミノ基転移酵素活性を示すことができるアグロバクテリウム菌を、本発明に係る形質転換アグロバクテリウム菌とする。
　本発明ではまた、GABAアミノ基転移酵素遺伝子に加えて外来性のACCデアミナーゼ遺伝子をアグロバクテリウム菌に導入することも好ましい。本発明において「外来性の」ACCデアミナーゼ遺伝子とは、アグロバクテリウム菌中に外部から導入されたACCデアミナーゼ遺伝子、又はそのアグロバクテリウム菌の子孫において維持されているACCデアミナーゼ遺伝子を指す。本発明で用いるACCデアミナーゼ遺伝子は、ACCデアミナーゼをコードする。ACCデアミナーゼは、エチレン生合成中間体であるACC（1-アミノシクロプロパン-1-カルボン酸）をα－ケト酪酸とアンモニアに分解し、それにより細胞内でのエチレン生産を抑制することができる。植物は病原菌に対する防御作用としてエチレンを生成し、エチレンはアグロバクテリウム菌のvir遺伝子の発現を抑制する作用を有することから、ACCデアミナーゼの作用によりエチレン生成を抑制することで、アグロバクテリウム菌のvir遺伝子の発現抑制を解除し、結果としてアグロバクテリウム菌を介した細胞への遺伝子導入効率をさらに高めることができる。エチレン生成は植物に広く共通した防御反応機構である。
　本発明で用いるACCデアミナーゼ遺伝子は、任意の生物種由来の、ACC分解活性を有する酵素をコードする遺伝子であってよく、例えば、シュードモナス属菌（Pseudomonas sp. ACP株、Pseudomonas fluorescens、Pseudomonas putida、Pseudomonas stutzeri、Pseudomonas entomophila PS-PJH株等）、パノニバクター属菌（Pannonibacter phragmatetus PB-Rt1.等）、エンテロバクター属菌（Enterobacter cloacae LH-R2等）、リゾビウム属菌（Rhizobium sp. QR1等）、アクロモバクター属菌（Achromobacter sp等）、シノリゾビウム属菌（Sinorhizobium sp. BL3株等）、メソリゾビウム属菌（Mesorhizobium loti等）のような細菌をはじめとする土壌微生物由来のACCデアミナーゼ遺伝子を好適に用いることができる。GABAアミノ基転移酵素遺伝子との併用に適したACCデアミナーゼ遺伝子の例として、例えばPseudomonas sp. ACP株由来の、配列番号１４に示すアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む核酸断片、例えば配列番号１３に示す塩基配列をオープンリーディングフレーム（ORF）として有する核酸断片を、ACCデアミナーゼ遺伝子として用いてもよい。あるいは、配列番号１３に示す塩基配列（全長）に対して70％以上、好ましくは80％以上、好ましくは85％以上、さらに好ましくは90％以上、例えば95％、98％又は99％以上の配列同一性を有し、かつACCデアミナーゼ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列からなる核酸断片をACCデアミナーゼ遺伝子として用いてもよい。また配列番号１４に示すアミノ酸配列において1～50個、好ましくは1～10個、例えば1～5個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつACCデアミナーゼ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列からなる核酸断片をACCデアミナーゼ遺伝子として用いてもよい。さらに、配列番号１４に示すアミノ酸配列（全長）に対して70％以上、好ましくは80％以上、好ましくは85％以上、さらに好ましくは90％以上、例えば95％、98％又は99％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつACCデアミナーゼ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列からなる核酸断片をACCデアミナーゼ遺伝子として用いてもよい。ACCデアミナーゼ活性は、公知のACCデアミナーゼ活性測定方法を用いて確認することができる。具体的には、例えば、ACCデアミナーゼ活性を有するタンパク質の溶液に、1-アミノシクロプロパンカルボン酸（ACC）、及びピリドキサール－5’リン酸（PLP）を加え、30℃で保温した後、反応液に100%（w/v）トリクロロ酢酸（TCA）溶液を加えて反応を停止させ、反応液と同等量の0.1%　2,4-ジニトロフェニルヒドラジン（DNPH）溶液を加えて15分間、30℃で保温し、反応液と同等量の3 N 水酸化ナトリウム溶液を加えて呈色反応を停止する。その呈色反応液中に蓄積されたα-ケト酪酸を340 nmの吸収波長で検出する。α-ケト酪酸はACCデアミナーゼの触媒作用により1-アミノシクロプロパンカルボン酸（ACC）から生成されることから、タンパク質の量の増加に応じてα-ケト酪酸の蓄積量が増加することが示されれば、ACCデアミナーゼ活性が確認されたものと判断することができる。さらに、酵素活性に影響を及ぼさないアミノ酸配列がN末端又はC末端に付加されたACCデアミナーゼタンパク質をコードする核酸断片を用いてもよい。例えばACCデアミナーゼタンパク質のN末端に1～50個、例えば1～33個のアミノ酸が付加されたタンパク質をコードする塩基配列からなる核酸断片をACCデアミナーゼ遺伝子として用いてもよい。酵素活性に影響を及ぼさないそのようなアミノ酸配列は、例えば選択マーカー遺伝子産物若しくはレポーター遺伝子産物、又はその断片であり得るが、好ましい例としてはβガラクトシダーゼ由来タンパク質断片（例えば、配列番号６の1～33位のアミノ酸配列）が挙げられる。ACCデアミナーゼ遺伝子は、上述したGABAアミノ基転移酵素遺伝子の取得方法に準じて取得することができる。
　アグロバクテリウム菌に導入されるACCデアミナーゼ遺伝子は、ベクター、好ましくはT-DNA領域を含まないベクター中で、プロモーターの制御下に配置されていることが好ましい。プロモーターとしては、GABAアミノ基転移酵素遺伝子に関して上述したプロモーターを好適に用いることができる。1コピー又は2コピー以上のコピー数のACCデアミナーゼ遺伝子がプロモーターの制御下に含まれ得るが、これに関してもGABAアミノ基転移酵素遺伝子に関して上述したとおりである。
　導入されたACCデアミナーゼ遺伝子は、得られる形質転換アグロバクテリウム菌において染色体外でベクター形態で（プラスミド等のベクターに含まれた状態で）保持された状態でACCデアミナーゼタンパク質を発現してもよいし、アグロバクテリウム菌のゲノムに組み込まれて保持された状態でACCデアミナーゼタンパク質を発現してもよい。
　本発明では、アグロバクテリウム菌に、GABAアミノ基転移酵素遺伝子とACCデアミナーゼ遺伝子をそれぞれ別個のベクターに含めて導入してもよい。あるいは、GABAアミノ基転移酵素遺伝子とACCデアミナーゼ遺伝子を単一のベクターに含めて導入してもよい。単一のベクターにその２つの遺伝子を含めて導入する場合、１つのプロモーターの制御下にそれぞれの遺伝子をタンデムに配置してもよいが、各遺伝子の上流にそれぞれプロモーターを配置することがより好ましい。それらのプロモーターは互いに同一であってもよいし異なるプロモーターであってもよいが、いずれもlacプロモーターを使用することも好ましい。
　アグロバクテリウム菌へのACCデアミナーゼ遺伝子の導入は、GABAアミノ基転移酵素遺伝子のアグロバクテリウム菌への導入方法について上述したのと同様の方法により実施することができる。
　なお、GABAアミノ基転移酵素遺伝子及び／又はACCデアミナーゼ遺伝子は、1つ又は2つ以上の、マーカー遺伝子等の他の外来遺伝子と共にベクター中に含めてアグロバクテリウム菌に導入されることが好ましい。GABAアミノ基転移酵素遺伝子及びACCデアミナーゼ遺伝子は、ベクター中で他の外来遺伝子よりも上流に配置されることが好ましい。マーカー遺伝子としては、ゲンタマイシン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、ピューロマイシン耐性遺伝子、ゼオシン耐性遺伝子、ブラストサイジン耐性遺伝子、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、及びアンピシリン耐性遺伝子等の薬剤耐性遺伝子を好適に用いることができるが、蛍光タンパク質をコードする遺伝子等のレポーター遺伝子を用いてもよい。あるいは、アグロバクテリウム菌細胞中でプラスミドを安定的に保持させる配列（例えば、プラスミドの安定化に関与する遺伝子sta配列等）を、他の外来遺伝子として、GABAアミノ基転移酵素遺伝子及び／又はACCデアミナーゼ遺伝子を含むベクターに含めてもよい。本発明において「他の外来遺伝子」とは、GABAアミノ基転移酵素遺伝子及びACCデアミナーゼ遺伝子以外の遺伝子であって、タンパク質又は機能性RNAをコードしており、宿主アグロバクテリウム菌が天然には有しない遺伝子を意味する。GABAアミノ基転移酵素遺伝子及び／又はACCデアミナーゼ遺伝子と共に他の外来遺伝子がベクターに含まれる場合、GABAアミノ基転移酵素遺伝子及び／又はACCデアミナーゼ遺伝子と他の外来遺伝子の間に転写終結配列が存在することが好ましい。
　転写終結配列は、mRNAの転写終結のシグナルとして機能し得る配列であれば特に限定されない。例えば各遺伝子がその下流に天然に有している転写終結配列を利用してもよいし、公知の任意の遺伝子の下流に存在する転写終結配列をPCR増幅等により調製して用いてもよい。具体例としては、例えば、アンピシリン薬剤耐性遺伝子の転写終結配列が挙げられる。アンピシリン薬剤耐性遺伝子の転写終結配列としては、例えば配列番号１２に示す塩基配列、又はその配列に対して80％以上、好ましくは90％以上、より好ましくは95％以上、例えば98％又は99％以上の配列同一性を有し、かつターミネーター活性を有する塩基配列が挙げられる。
　得られた形質転換アグロバクテリウム菌を用いれば、植物への遺伝子導入を高効率に行うことができる。この本発明に係る形質転換アグロバクテリウム菌を用いた植物への遺伝子導入は、通常のアグロバクテリウム法の手順に従って行うことができる。具体的には例えば、植物形質転換用のT-DNA領域を有するプラスミド等のベクター（典型的はバイナリーベクター）の右側ボーダー配列（RB）及び左側ボーダー配列（LB）の間に、プロモーター及びターミネーターの制御下に植物に導入する任意の遺伝子（目的遺伝子）を組み込み、そのベクターを本発明に係る形質転換アグロバクテリウム菌に常法により導入し、植物への遺伝子導入に用いればよい。目的遺伝子と共に、上述したようなマーカー遺伝子をT-DNA領域内に組み込んでもよい。本発明は、GABAアミノ基転移酵素遺伝子及び／又はACCデアミナーゼ遺伝子を含むベクターに加えて、目的遺伝子が挿入されたT-DNA領域を含むベクター（好ましくはT-DNA領域を含むバイナリーベクター）を含有する形質転換アグロバクテリウム菌も提供する。T-DNA領域を含むバイナリーベクターとしては、例えば、pIG121-Hm、pEKH2、pRI 909、pRI 910、BIBAC1等の公知の多数のT-DNAバイナリーベクター（Lee, L.Y and Gelvin, S.B. (2008) T-DNA Binary Vectors and Systems,　Pant Physiology 146:325-332等を参照）が挙げられる。なおpIG121-HmはT-DNA領域中に35Sプロモーター制御下に配置されたGUS遺伝子を有し、pEKH2はT-DNA領域中にトウモロコシ由来のUbiプロモーター制御下に配置されたGUS遺伝子を有する。なお、本発明に係る形質転換アグロバクテリウム菌は植物細胞への遺伝子導入に関与するvir領域を発現しうる状態で保持する必要があり、そのため必要であれば、vir領域を持つヘルパーベクターも導入してよい。好ましい一実施形態では、ベクターを導入した本発明に係る形質転換アグロバクテリウム菌において、GABAアミノ基転移酵素遺伝子及び／又はACCデアミナーゼ遺伝子を含むベクターと、vir領域を持つヘルパーベクターと、植物に導入する遺伝子を含むT-DNA領域を有するバイナリーベクターが共存する。あるいは、GABAアミノ基転移酵素遺伝子及び／又はACCデアミナーゼ遺伝子は、アグロバクテリウム菌中のvir領域を有するヘルパーベクター中に組み込ませてもよい。
　次いでその形質転換アグロバクテリウム菌を、植物組織、植物細胞（カルス等）又は種子等に接種し共存培養して感染させ、T-DNA領域を植物細胞中のゲノムに挿入させる。共存培養に用いる共存培地は、特に限定されないが、MS培地に基づく培地も好ましい。共存培地は、アセトシリンゴン（例えば、50μM～500μM、好ましい例として100μM～300μM）及びグルコース（例えば、0.5～10％、好ましい例として1～5％）を含有することが好ましい。
　本発明の形質転換アグロバクテリウム菌を用いたアグロバクテリウム媒介形質転換法は、アグロバクテリウム菌が感染可能な任意の植物について実施することができる。例えば、本発明に係るアグロバクテリウム菌を用いて形質転換を行う植物は、双子葉植物であっても単子葉植物であってもよい。該当植物としては、特に限定されないが、例えば、ナス科［ナス（Solanum melongena L.）、トマト（Solanum lycopersicum）、ピーマン（Capsicum annuum L. var. angulosum Mill.）、トウガラシ（Capsicum annuum L.）、タバコ（Nicotiana tabacum L.）等］、イネ科［イネ（Oryza sativa）、コムギ（Triticum aestivum L.）、オオムギ（Hordeum vulgare L.）、トウモロコシ（Zea mays L.）、ソルガム（Sorghum bicolor (L.) Moench）、エリアンサス（Eriansus ravennae）、ギニアグラス（Panicum maximum Jacq.）、ミスカンサス（Miscanthus spp）、サトウキビ（Saccharum officinarum L.）、ネピアグラス（Pennisetum purpureum Schumach）、パンパスグラス（Cortaderia argentea Stapf.）、ペレニアルライグラス（Lolium perenne L.）、イタリアンライグラス（Lolium multiflorum Lam.）、メドウフェスク（Festuca pratensis Huds.）、トールフェスク（Festuca arundinacea Schreb.）、オーチャードグラス（Dactylis glomerata L.）、チモシー（Phleum pratense L.）等］、アブラナ科［シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）、アブラナ（Brassica campestris L.）、ハクサイ（Brassica pekinensis Rupr.）、キャベツ（Brassica oleracea L. var. capitata L.）、ダイコン（Raphanus sativus L.）、ナタネ（Brassica campestris L., B. napus L.）等］、マメ科［ダイズ（Glycine max）、アズキ（Vigna angularis Willd.）、インゲン（Phaseolus vulgaris L.）、ソラマメ（Vicia faba L.）等］、ウリ科［キュウリ（Cucumis sativus L.）、メロン（Cucumis melo L.）、スイカ（Citrullus vulgaris Schrad.）、カボチャ（C. moschata Duch., C. maxima Duch.）等］、ヒルガオ科［サツマイモ（Ipomoea batatas）等］、ユリ科［ネギ（Allium fistulosum L.）、タマネギ（Allium cepa L.）、ニラ（Allium tuberosum Rottl.）、ニンニク（Allium sativum L.）、アスパラガス（Asparagus officinalis L.）等］、シソ科［シソ（Perilla frutescens Britt. var. crispa）等］、キク科［キク（Chrysanthemum morifolium）、シュンギク（Chrysanthemum coronarium L.）、レタス（Lactuca sativa L. var. capitata L.）等］、バラ科［バラ（Rose hybrida Hort.）、イチゴ（Fragaria x ananassa Duch.）等］、ミカン科［ミカン（Citras unshiu）、サンショウ（Zanthoxylum piperitum DC.）等］、フトモモ科［ユーカリ（Eucalyptus globulus Labill）等］、ヤナギ科［ポプラ（Populas nigra L. var. italica Koehne）等］、アカザ科［ホウレンソウ（Spinacia oleracea L.）、テンサイ（Beta vulgaris L.）等］、リンドウ科［リンドウ（Gentiana scabra Bunge var. buergeri Maxim.）等］、ナデシコ科［カーネーション（Dianthus caryophyllus L.）等］の植物が挙げられる。限定するものではないが、単子葉植物ではイネ科、双子葉植物ではナス科の植物は本発明の形質転換にとりわけ好適である。
　本発明に係るアグロバクテリウム菌を介してゲノム中に目的遺伝子を組み込まれた植物組織、植物細胞（カルス等）、又は種子等は、公知の方法で植物体に再生させることができる。例えば、目的の遺伝子が組み込まれた形質転換植物細胞を、従来知られている植物組織培養法に従って選択培地で培養し、生存したカルスを再分化培地（適当な濃度の植物ホルモン（オーキシン、サイトカイニン、ジベレリン、アブシジン酸、エチレン、ブラシノライド等）を含む）で培養することにより、形質転換植物体（特にシュート）を再生することができる。サイトカイニンの例としてはゼアチンが挙げられる。再生した植物体はさらに発根培地に移植して成長させることができる。
　目的遺伝子が植物ゲノムに挿入されたかどうかは、目的遺伝子の遺伝子産物の活性に基づいて形質転換体を試験するか、又は目的遺伝子と共にマーカー遺伝子を植物ゲノムに組み込んだ場合にはマーカー遺伝子産物の活性に基づいて形質転換体を試験することにより、確認することができる。あるいはゲノム中に導入した目的遺伝子及び／又はマーカー遺伝子を特異的にPCR増幅し、塩基配列を決定することにより、より確実に確認することができる。形質転換植物体の場合には、発根培地において発根が認められた植物体のうち２倍体個体についてゲノム中への目的遺伝子の挿入を確認することが好ましい。
　植物形質転換法の詳細は、『島本功、岡田清孝　監修　「新版　モデル植物の実験プロトコール　遺伝学的手法からゲノム解析まで」（2001） 秀潤社』などの一般的な教科書の記載や、Hiei Y. et al., "Efficient transformation of rice (Oryza sativa L.) mediated by Agrobacterium and sequence analysis of the boundaries of the T-DNA." Plant J. (1994) 6, 271-282; Hayashimoto, A. et al., "A polyethylene glycol-mediated protoplast transformation system for production of fertile transgenic rice plants." Plant Physiol. (1990) 93, 857-863等の文献を参照すればよい。
　本発明では、GABAアミノ基転移酵素遺伝子が導入された形質転換アグロバクテリウム菌を用いてアグロバクテリウム媒介形質転換を実施することにより、GABAアミノ基転移酵素遺伝子が導入されていないこと以外は同等のアグロバクテリウム菌と比較して、宿主生物、典型的には植物への、遺伝子導入効率を向上させることができる。本発明において遺伝子導入効率とは、アグロバクテリウム菌を接触させた宿主外植片又は宿主細胞の個数のうち、遺伝子導入により生じる表現型が示された宿主外植片又は宿主細胞の割合をいう。本発明における遺伝子導入効率は、アグロバクテリウム菌を接触させた宿主外植片の個数のうち、ゲノム中への遺伝子導入が確認された形質転換個体の割合として表すこともできる。遺伝子導入効率の評価は、導入する目的遺伝子やマーカー遺伝子の種類によって異なる手法を用いて行うが、基本的には実施例６～実施例８の記載に従って行うことができる。遺伝子導入効率の向上レベルは、限定するものではないが、例えば、10％以上、好ましくは20％以上、さらに好ましくは50％以上、なお好ましくは100％以上、特に200％以上の向上である。本発明では、アグロバクテリウム媒介形質転換（遺伝子導入）法に、上述のようにGABAアミノ基転移酵素遺伝子が導入された形質転換アグロバクテリウム菌を用いることによって、植物細胞に顕著に高効率で目的遺伝子を導入し、形質転換植物を効率よく作製することができる。また本発明では、GABAアミノ基転移酵素遺伝子とACCデアミナーゼ遺伝子を共に導入した形質転換アグロバクテリウム菌を用いることにより、植物細胞にさらに高効率で目的遺伝子を導入することもできる。
　本発明によれば、実施例にも示すように、エリアンサスなど植物の種類によりACCデアミナーゼ遺伝子を単独でアグロバクテリウム菌に導入する既存の形質転換法（特許文献１）で十分な効果が得られない場合にも、遺伝子導入効率を顕著に向上させることができる。本発明では、アグロバクテリウム菌にGABAアミノ基転移酵素遺伝子を単独で導入しただけでも遺伝子導入効率の大きな向上が認められるが、GABAアミノ基転移酵素遺伝子をACCデアミナーゼ遺伝子と組み合わせて導入することで、遺伝子導入効率をさらに向上させることもできる。
　植物はアグロバクテリウム菌感染の際にエチレン以外にも様々な物質を分泌し、アグロバクテリウム菌による遺伝子導入を抑制している。そのため植物種によってはエチレン発生の抑制だけでは遺伝子導入効率を十分に高めることができない場合があるものと思われる。エチレンとGABAでは遺伝子導入を抑制するメカニズムが異なることにより、GABAアミノ基転移酵素遺伝子産物によるGABAの抑制が、エチレンの発生抑制で十分な効果が得られなかった植物種において顕著な効果をもたらすと考えられる。GABAの代謝産物であるコハク酸セミアルデヒドもアグロバクテリウム菌のクォーラムセンシングシグナルを抑制することが報告されていたため（Wang et al., 2006 Molecular Microbiology 62:45-56）、本発明に係る形質転換アグロバクテリウム菌の開発過程では、GABAアミノ基転移酵素によりGABAを代謝することによってコハク酸セミアルデヒドが遺伝子導入を阻害してしまう可能性が考えられた。しかし驚くべきことに本発明者らは、アグロバクテリウム菌にGABAアミノ基転移酵素活性を付与することにより、GABA代謝産物による顕著な阻害を生じることなく、遺伝子導入効率を大きく向上させることができることを示した。本発明は、このような形質転換植物の作製方法も提供する。
　以下、実施例を用いて本件技術をさらに具体的に説明する。但し、本件技術の技術的範囲はこれら実施例に限定されるものではない。
［実施例１］ GABAアミノ基転移酵素遺伝子のクローニングとシークエンス解析
　本実施例では、GABAアミノ基転移酵素遺伝子を大腸菌Escherichia coli K12株からクローニングした。まず、Escherichia coli K12株を37℃にてLB培地で増殖させ、維持した。E. coli K12株から、トータルDNAをSambrook et al.（2001）の方法により抽出して、PCRの鋳型とした。本株のゲノム情報（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NC_010473.1, NCBI GenBankデータベース）に基づいて、GABAアミノ基転移酵素（gabT）遺伝子をクローニングするための２つのプライマーgabTF（5’-aagcttaatgaacagcaataaagagtt-3’(配列番号３)）及びgabTR（5’-tctagactactgcttcgcctcatcaaaac-3’(配列番号４)）を設計し合成した。上記で抽出したトータルDNAとこれらのプライマーを用いて、以下の条件でPCRを行った：94℃、2分間の熱変性の後、94℃で45秒間、58℃で45秒間、及び72℃で2分間の温度サイクルを35回繰り返した。期待した大きさ1294 bpのPCR産物（gabT断片1）を、クローニングベクターpET-21b(+)（Promega, USA）にクローニングした（pETgabT）（図１）。クローン化DNA断片については、DNAシークエンサーABI310及びDNA Sequencing Kit Big Dye Terminator cycle sequencing Ready Reaction（Applied Biosystems, Tokyo）を用いて、塩基配列の決定を行い、GenBankデータベース上の登録配列（アクセッション番号NC_010473.1、Gene ID:6061113、gabT）と同一の配列であることを確認した。得られたクローン化DNAに含まれるGABAアミノ基転移酵素遺伝子gabTのオープンリーディングフレーム（ORF）の塩基配列を配列番号１に、その塩基配列によってコードされるGABAアミノ基転移酵素タンパク質のアミノ酸配列を配列番号２に示す。
［実施例２］ gabT発現ベクターの構築
　実施例１で得た組換え大腸菌E. coli DH5α(pETgabT)からプラスミドpETgabTを常法に従って抽出し、GABAアミノ基転移酵素遺伝子（gabT）を制限酵素HindIIIとXbaIで切り出し、広宿主域ベクターpBBR1MCS-5（Kovach et al., 1995, Gene 166, 175-176）のマルチクローニングサイトにサブクローニングした（pBBRgabT、図２）。この組換えプラスミドから発現されるGABAアミノ基転移酵素タンパク質は、そのN末端に付加された、pBBR1MCS-5中の配列（lacZ遺伝子の断片）にコードされたβガラクトシダーゼ由来の33アミノ酸を有している（図３、塩基配列：配列番号５、アミノ酸配列：配列番号６）。なおN末端に付加されたβガラクトシダーゼ由来の33アミノ酸は、GABAアミノ基転移酵素の活性に影響を及ぼさない。このプラスミド上でgabT遺伝子の発現は、lacプロモーターの制御下に置かれる。
［実施例３］ GABAアミノ基転移酵素遺伝子とACCデアミナーゼ遺伝子を共発現する発現ベクターの構築
　実施例２で作製したpBBRgabT発現ベクターを鋳型として、プライマーacdS-for（5’-tctgcgcgtaatctgctgcttgagcgcaacgcaattaatg-3’（配列番号７））及びプライマーgabT-Rev（5’-cgattctagactactgcttcgcctcatcaaaac-3’（配列番号８））を用いてPCRによりGABAアミノ基転移酵素酵素遺伝子（gabT）を含むDNA断片を増幅した。得られた増幅断片（gabT断片2；配列番号９）には、lacプロモーターを含む5’非翻訳領域（リボソーム結合配列を含む）、及びβガラクトシダーゼ由来の33アミノ酸がN末端に付加されたGABA分解酵素タンパク質をコードする配列が含まれる（図４）。
　次に、pUC18ベクターを鋳型として、二つのプライマーamp_ter-for2（5’-GCTAGAATTCCTGTCAGACCAAGTTTACTC-3’（配列番号１０））及びamp_ter-rev2（5’-CATTAATTGCGTTGCGCTCAAGCAGCAGATTACGCGCAGA-3’（配列番号１１））を用いてPCRによってアンピシリン薬剤耐性遺伝子の転写終結領域を含むDNA断片を増幅した。得られた増幅断片（amp-term断片）の塩基配列を配列番号１２に示す。
　得られた二つの増幅断片gabT断片2とamp-term断片を、プライマーamp_ter-for2とgabT-Revを用いてfusion PCR法により連結した。得られたPCR産物を制限酵素EcoRI及びXbaIで消化した。
　続いて、得られたEcoRI-XbaI消化断片を、制限酵素EcoRI及びXbaIで消化したシュードモナス（Pseudomonas）ACCデアミナーゼ発現ベクターpBBRacdS（Nonaka et al., Appl. Environ. Microbiol., 74, 2526-2528 (2008)）とライゲーションし、大腸菌DH5αにおいてクローニングすることにより、GABAアミノ基転移酵素遺伝子とACCデアミナーゼ遺伝子を共発現する発現ベクター（pBBRacdS/gabT）を作製した（図５）。なお、ACCデアミナーゼ遺伝子の塩基配列を配列番号１３に、その塩基配列によりコードされるACCデアミナーゼタンパク質のアミノ酸配列を配列番号１４に示す。
［実施例４］ アグロバクテリウムへの遺伝子導入
　実施例２で構築したプラスミドベクターpBBRgabT、及び実施例３で構築したプラスミドベクターpBBRacdS/gabTを、それぞれ、バイナリープラスミドpIG121-Hmを保持するアグロバクテリウム菌株Agrobacterium tumefaciens GV2260又はバイナリープラスミドpEKH2を保持するアグロバクテリウム菌株Agrobacterium tumefaciens GV2260へエレクトロポーレション法により導入した。なおGV2260はvir領域を持つヘルパープラスミドを有している。それらのバイナリープラスミドにはGUS(uidA)遺伝子が挿入されており、植物への遺伝子導入の指標として利用することができる。導入ベクターを保持するアグロバクテリウム菌株GV2260(pBBRgabT, pIG121-Hm)、アグロバクテリウム菌株GV2260(pBBRgabT, pEKH2)、アグロバクテリウム菌株GV2260(pBBRacdS/gabT, pIG121-Hm)、及びアグロバクテリウム菌株GV2260(pBBRacdS/gabT, pEKH2)は、抗生物質ゲンタマイシン50 mg/L、カナマイシン100mg/L、及びアンピシリン100mg/Lを含むLB培地、又はゲンタマイシン50mg/L、スペクチノマイシン50mg/L、及びアンピシリン100mg/Lを含むLB培地で培養し維持することにより取得した。
　アグロバクテリウム菌が２種類のプラスミドを同時に保持することは、コロニーを鋳型とする直接PCR法により、gabT遺伝子の検出にはプライマーgabTFとgabTR、uidAの検出にはプライマーGUSF（5’-atccacgccgtattcgg-3’（配列番号１５））,プライマーGUSR（5’-catgaagatgcggacttacg-3’（配列番号１６））をそれぞれ用いて確認した。
　また対照として、プラスミドベクターpBBR1MCS-5を導入すること以外は上記と同様の方法により、gabT遺伝子を含まないプラスミドベクターpBBR1MCS-5を保持するアグロバクテリウム菌株 GV2260(pBBR1MCS-5, pIG121-Hm)及びアグロバクテリウム菌株GV2260(pBBR1MCS-5, pEKH2)を得た。
　さらに、ACCデアミナーゼ遺伝子発現プラスミドベクターpBBRacdSを保持するアグロバクテリウム菌株GV2260(pBBRacdS, pIG121-Hm)を、プラスミドベクターpBBRacdSを導入すること以外は上記と同様の方法により得た。
［実施例５］ GABAアミノ基転移酵素活性の測定
　実施例４で作成したアグロバクテリウム菌株GV2260(pBBRgabT, pEKH2)及びアグロバクテリウム菌株GV2260(pBBRacdS/gabT, pEKH2)におけるgabT活性を測定した。対照として、アグロバクテリウム菌株GV2260(pBBR1MCS-5, pEKH2)のgabT活性も測定した。これらのアグロバクテリウム菌を、ゲンタマイシン50mg/L、スペクチノマイシン50mg/L、及びアンピシリン100mg/Lを含むLB培地で培養し、培養開始から22時間後のアグロバクテリウム菌（O.D.600=0.8）を集菌し、菌由来タンパク質抽出試薬BugBuster Master mix（Novagene）を用いて溶菌した。プロテアーゼインヒビター（Protease Inhibitor Cocktail setII, Novagen）を添加し、20分間室温で回転混和した。その後、16,000×gで20分遠心分離し、上澄みを新しいチューブに移した。次いで、タンパク質アッセイキットBCA Protein Assay kit（Novabene）を用いて上澄みのタンパク質の濃度を測定した。さらに、反応液（0.1M Bicine-NaOH、0.1M リン酸ピリドキサール、10mM 2-ケトグルタレート、10mM GABA）に上澄み（粗抽出酵素タンパク質）を100ng加えてGABAアミノ基転移酵素反応を引き起こした。酵素反応は、37℃で行い、反応時間は、0分、10分、20分、30分、60分、120分、180分とした。
　酵素反応後、反応生成物であるグルタミン酸量を、ヤマサL-グルタミン酸測定キットII（ヤマサ醤油株式会社）を用いて測定した。この測定では、キットに含まれるL-グルタミン酸オキシダーゼにより、反応生成物のグルタミン酸を酸化することにより過酸化水素を生成させ、過酸化水素からペルオキシダーゼ反応により青色色素を形成させ、青色色素を600nmの波長で測定することにより、反応液中のグルタミン酸量が測定される。
　酵素反応の結果、アグロバクテリウム菌株GV2260(pBBRgabT, pEKH2)及びアグロバクテリウム菌株GV2260(pBBRacdS/gabT, pEKH2)から得られた粗酵素抽出液を用いた場合、対照とするアグロバクテリウム菌株GV2260(pBBR1MCS-5, pEKH2)由来の粗酵素抽出液を用いた場合よりも、反応生成物であるグルタミン酸が多く測定され、それは反応時間の増加に伴って増加することが示された（図６）。これは、アグロバクテリウム菌体に導入されたベクターから大腸菌由来のGABAアミノ基転移酵素がアグロバクテリウム菌体内で安定的に発現され、かつ活性を有することを示している。このように、GABAアミノ基転移酵素遺伝子をアグロバクテリウムヘ導入することにより、アグロバクテリウム菌にその活性を付与することができることが示された。
［実施例６］ 植物への遺伝子導入効率の評価－１
　GABAアミノ基転移酵素遺伝子を導入したアグロバクテリウム菌株GV2260(pBBRgabT, pIG121-Hm)、アグロバクテリウム菌株GV2260(pBBRgabT, pEKH2)、及びアグロバクテリウム菌株GV2260(pBBRacdS/gabT, pEKH2)について、植物への遺伝子導入能力の評価を行った。ここで植物に導入する遺伝子は、バイナリーベクターpIG121-Hm及びpEKH2のT-DNA領域中に含まれ、植物への遺伝子導入のマーカーとして用いられているGUS遺伝子である（Hiei et al., Plant J., 6(2): 271-282 (1994)）。
　まず、アグロバクテリウム菌株GV2260(pBBRgabT, pIG121-Hm)、及び対照としてのアグロバクテリウム菌株 GV2260(pBBR1MCS-5, pIG121-Hm)をそれぞれ用いて、双子葉植物トマト（Solanum lycopersicum‘Money Maker’）へのGUS遺伝子の導入効率を評価した。トマトの種子を1/2MS(Murasige-Skoog) 1.5%ショ糖培地へ無菌播種し、それを生育させて得られた子葉の上下を切り落とし、2分割した切片をトマト外植片とした。アグロバクテリウム菌をLB培地（100 mg/L アンピシリン、50 mg/L ゲンタマイシン、及び100 mg/L カナマイシン含有）に植菌して28℃で22時間振盪培養し、濁度O.D.600=0.8になるまで培養した。得られた菌液を遠心して集菌し、菌体をMS液体培地に懸濁した。菌体密度がO.D.600=0.5になるように調製した。調製した菌液にトマト外植片を20分間浸した後、28℃、暗条件で72時間共存培養を行った。共存培地は、MS培地に3% グルコース、200 μM アセトシリンゴン、1.5 mg/L ゼアチンを加えて調製したものを用いた。
　共存培養終了後、トマトの子葉外植片をGUS染色し、遺伝子導入効率を評価した。具体的には、共存培養後のトマトの子葉外植片を、EDTA（10 mM）、フェリシアンカリウム（5 mM）、フェロシアン化カリウム（5 mM）、Triton X-100（0.1%）、及び5-ブロモ-4-クロロ-3-インドキシル-グルクロニド（X-Glu）（0.5 mg/L）を含む100 mMリン酸緩衝液へ浸し、37℃で一晩インキュベートした。これにより、GUS遺伝子が導入された細胞では、GUS遺伝子産物の機能により、基質X-Gluが分解され、濃青色に染色される。37℃で一晩インキュベートした後、染色度合いを観察するために、トマト外植片をリン酸緩衝液から70%エタノールへ移し、GUS染色反応を停止するとともに、クロロフィルを脱色した。70%エタノールを2回交換し、最終的にはトマト外植片を100%エタノールに浸漬した。完全にクロロフィルが脱色された後、濃青色に染色された外植片の出現頻度を調べた。その際に染色レベルを0～5にふり分け（図７Ｂ）、それぞれの染色レベルの外植片の出現頻度を評価した。0はGUS染色スポットが観察されなかったことを意味し、1から5に近づくほど外植片に占めるGUS染色領域の割合が拡大することを意味する。３回の実験で同様の結果を示した。一回の実験当たり３０枚のトマトの子葉切片を使用した。結果を図７に示す。
　gabT活性を付与したアグロバクテリウム菌株GV2260(pBBRgabT, pIG121-Hm)のトマトへのGUS遺伝子導入を、対照としてのアグロバクテリウム菌株GV2260(pBBR1MCS-5, pIG121-Hm)のトマトへのGUS遺伝子導入と比較すると、GUSスポットが観測された外植片の枚数の割合（％）、及び1枚当たりのGUSスポットの平均出現頻度が、gabT活性を付与したアグロバクテリウム菌株において顕著に増加していた（図７Ａ）。このことから、GABAアミノ基転移酵素活性をアグロバクテリウム菌へ付与することにより、植物への遺伝子導入の能力が優れたアグロバクテリウム菌株を作製できることが示された。
［実施例７］ 植物への遺伝子導入効率の評価－２
　次に、GABAアミノ基転移酵素活性を付与したアグロバクテリウム菌株GV2260(pBBRgabT, pEKH2)、GABAアミノ基転移酵素活性とACCデアミナーゼ活性を付与したアグロバクテリウム菌株GV2260(pBBRacdS/gabT, pEKH2)、ACCデアミナーゼ活性を付与したアグロバクテリウム菌株GV2260(pBBRacdS, pEKH2)、及び対照区であるアグロバクテリウム菌株GV2260(pBBR1MCS-5, pEKH2)をそれぞれ用いて、単子葉植物エリアンサス（Eriansus ravennae）へのGUS遺伝子の導入効率を評価した。エリアンサスの完熟種子を、3% マルトース、2 mg/L 2,4-ジクロロフェノキシ酢酸、0.2% 細菌アルカリホスファターゼ（BAP）及び0.3% ゲルライトを含むMS培地で培養してカルスを誘導した。エリアンサスカルスはアグロバクテリウム菌の感染３日前に新しい培地へ置床した。アグロバクテリウム菌はゲンタマイシン50mg/L、スペクチノマイシン50mg/L、及びアンピシリン100mg/Lを含むLB培地２mLで培養し、定常状態に達するまで培養した（前培養）。その後、前培養物を1000倍希釈して、本培養を開始した。本培養の開始から22時間後、O.D.600=0.8に達した時点で集菌した。集菌したアグロバクテリウム菌は、液体MS培地に再懸濁し、濁度をO.D.600 0.4～0.5に調整した。エリアンサスカルスをアグロバクテリウム菌懸濁液へ入れ、0.8 MPa下に10分間置く処理を2回繰り返した。次いで、アグロバクテリウム菌液に浸したエリアンサスカルスを回収し、28℃、暗条件で72時間共存培養を行った。共存培地は、MS培地に3% グルコース、200 μM アセトシリンゴンを加えて調製したものを用いた。
　共存培養終了後、エリアンサスカルスをGUS染色し、遺伝子導入効率を評価した。具体的には、共存培養後のエリアンサスカルスを、EDTA（10 mM）、フェリシアンカリウム（5 mM）、フェロシアン化カリウム（5 mM）、Triton X-100（0.1%）、及び5-ブロモ-4-クロロ-3-インドキシル-グルクロニド（X-Glu）（0.5 mg/L）を含む100 mMリン酸緩衝液へ浸し、37℃で一晩インキュベートした。これにより、GUS遺伝子が導入された細胞では、GUS遺伝子産物の機能により、基質X-Gluが分解され、濃青色に染色される。37℃で一晩インキュベートした後、エリアンサスカルスを70%エタノールへ移して基質X-Gluの分解反応を停止させた。70%エタノールを2回交換し、最終的にはエリアンサスカルスを100%エタノールに浸漬した。カルス中の濃青色に染色されたGUSスポットの数を数え、その結果に基づいてそれぞれの菌株の遺伝子導入能力を評価した。その結果を図８に示す。
　GABAアミノ基転移酵素活性を付与したアグロバクテリウム菌株GV2260(pBBRgabT, pEKH2)によるエリアンサスへのGUS遺伝子導入を、対照としてのアグロバクテリウム菌株GV2260(pBBR1MCS-5, pEKH2)によるエリアンサスへのGUS遺伝子導入と比較すると、カルス１グラム当たりのGUSスポット数が、GABAアミノ基転移酵素活性を付与したアグロバクテリウム菌株において顕著に増加していた。このことから、GABAアミノ基転移酵素活性をアグロバクテリウム菌へ付与することにより、様々な植物に対して高頻度に遺伝子導入することができる菌株を作製できることがさらに示された。また、ACCデアミナーゼ活性を単独でアグロバクテリウム菌へ付与した場合と比較しても、GABAアミノ基転移酵素活性を付与したアグロバクテリウム菌の方が遺伝子導入効率は明らかに高かった。さらに、ACCデアミナーゼ活性とGABAアミノ基転移酵素活性の両方を付与したアグロバクテリウム菌株GV2260(pBBRacdS/gabT, pEKH2)では、ACCデアミナーゼ活性を単独で付与したアグロバクテリウム菌株、及びGABAアミノ基転移酵素を単独で付与したアグロバクテリウム菌株よりもエリアンサスカルス1g当たりに出現するGUSスポット数がさらに増加しており、遺伝子導入能力が特に高くなっていた。以上の結果は、GABAアミノ基転移酵素活性をアグロバクテリウム菌ヘ付与することは、ACCデアミナーゼ活性を単独で付与することよりもアグロバクテリウム菌の遺伝子導入能力の増強に有効であることを示している。特に、アグロバクテリウム菌に付与したACCデアミナーゼ活性によるエチレン生成抑制が遺伝子導入効率をそれほど向上させることができないと思われるエリアンサス等の植物において、GABAアミノ基転移酵素活性の付与は遺伝子導入効率を非常に顕著に向上させることができることが示された。またACCデアミナーゼ活性とGABAアミノ基転移酵素活性の両方を付与することは、その遺伝子導入効率をさらに増大させることができることも示された。
［実施例８］ 植物への遺伝子導入効率の評価－３
　GABAアミノ基転移酵素遺伝子を導入したアグロバクテリウム菌株GV2260(pBBRgabT, pIG121-Hm)、及びアグロバクテリウム菌株GV2260(pBBRacdS/gabT, pIG121-Hm)を用いて、双子葉植物トマトへの遺伝子導入効率の評価を行った。ここで植物に導入する遺伝子は、バイナリーベクターpIG121-HmのT-DNA領域中に含まれているGUS遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、及びハイグロマイシン耐性遺伝子である（Hiei et al., Plant J., 6(2): 271-282 (1994)）。トマトの場合、ハイグロマイシンによる選抜は不可能なので、本実施例においては、カナマイシン耐性遺伝子を遺伝子導入のマーカーとして用いた。
　まず、アグロバクテリウム菌株GV2260(pBBRgabT, pIG121-Hm)、アグロバクテリウム菌株GV2260(pBBRacdS/gabT, pIG121-Hm)及び対照としてのアグロバクテリウム菌株 GV2260(pBBR1MCS-5, pIG121-Hm)、アグロバクテリウム菌株GV2260(pBBRacdS, pIG121-Hm)をそれぞれ用いて、双子葉植物トマト（Solanum lycopersicum‘Micro Tom’）を形質転換し、安定な形質転換体の作出効率を評価した。具体的には、トマトの種子を1/2MS(Murasige-Skoog) 1.5%ショ糖培地へ無菌播種し、それを生育させて得られた子葉の上下を切り落とし、2分割した切片をトマト外植片として遺伝子導入に用いた（供試切片）。アグロバクテリウム菌をLB培地（100 mg/L アンピシリン、50 mg/L ゲンタマイシン、及び100 mg/L カナマイシン含有）に植菌して28℃で22時間振盪培養し、濁度O.D.600=0.8になるまで培養した。得られた菌液を遠心して集菌し、菌体をMS液体培地に懸濁した。菌体密度がO.D.600=0.5になるように調製した。調製した菌液にトマト外植片を20分間浸した後、28℃、暗条件で72時間共存培養を行った。共存培地は、MS培地に3% グルコース、200 μM アセトシリンゴン、1.5 mg/L ゼアチン、0.3% ゲランガムを加えてpH5.2に調製したものを用いた。
　共存培養終了後、トマト外植片を除菌及びカルス誘導培地へ置床した。除菌及びカルス誘導培地は、MS培地に3%スクロース、1.5mg/L ゼアチン、0.3%ゲランガム、100mg/L カナマイシン、及び375mg/L オーグメンチンを加えてpH5.8に調整したものを用いた。トマト外植片を、除菌及びカルス培地で16時間日長、60μmol-2S-1の光条件下、25℃で3～4週間培養した後、シュートが形成された。シュートを形成したカルスをシュート伸長培地へ移植した。シュート伸長培地は、MS培地に3%スクロース、1.0mg/L ゼアチン、0.3%ゲランガム、100mg/L カナマイシン、375mg/L オーグメンチンを加え、pH5.8に調整したものを用いた。シュートが1～2cmまで伸長した後、シュートを切り落とし発根培地へ移植した。発根培地は1/2MS培地に15%スクロース、0.3%ゲランガム、100mg/L カナマイシン、375mg/L オーグメンチンを加えてpH5.8に調整したものを用いた。発根培地で２週間以内に発根した個体（発根個体）を形質転換体の候補として選抜した。主根から側根がでているものを発根個体とした。フローサイトメーターを用いて発根個体のうち、２倍体のものを選抜した。２倍体個体からゲノムを抽出し、それぞれの導入遺伝子の断片をプローブとしてサザンハイブリダイゼーションを行い、ゲノムへの遺伝子導入を確認した。数回の実験を行い、供試切片数（各実験につき菌株当たり80～156個使用）に対する、得られた遺伝子導入個体（サザンハイブリダイゼーション陽性）の割合（形質転換効率）の平均値を算出した（表１）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　gabT活性を付与したアグロバクテリウム菌株GV2260(pBBRgabT, pIG121-Hm)では、対照としてのアグロバクテリウム菌株 GV2260(pBBR1MCS-5, pIG121-Hm)を用いた場合と比較して形質転換効率（個体ゲノムへの遺伝子導入効率）が約235％に有意に上昇した。さらに、遺伝子acdSとgabTの両方を導入したアグロバクテリウム菌株GV2260(pBBRacdS/gabT, pIG121-Hm)では、対照（GV2260(pBBR1MCS-5, pIG121-Hm)）、及びacdS又はgabTの一方のみ導入したアグロバクテリウム菌株GV2260(pBBRacdS, pIG121-Hm)、GV2260(pBBRgabT, pIG121-Hm)を用いた場合と比較しても、形質転換効率がさらに上昇した。この結果から、GABAアミノ基転移酵素活性と共にacdS活性をアグロバクテリウム菌に付与することにより、アグロバクテリウム菌株の遺伝子導入能力をさらに増強できることがさらに裏付けられた。
　本発明は、アグロバクテリウム法に基づく植物形質転換の遺伝子導入効率を向上させるために用いることができる。例えば、従来からアグロバクテリウム菌による遺伝子導入が報告されている植物種では組換え植物の作出効率を向上させるために、また、従来遺伝子導入が困難とされていた植物種においては組換え植物を作出するために、本発明のアグロバクテリウム菌及び本発明の方法を用いることができる。本発明により、広い範囲の植物種で遺伝子組換えを利用した品種の改良が可能になる。
　本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願をそのまま参考として本明細書に組み入れるものとする。
配列番号１：Escherichia coli株由来のGABAアミノ基転移酵素タンパク質をコードする塩基配列
配列番号２：GABAアミノ基転移酵素タンパク質
配列番号３：プライマーgabTF
配列番号４：プライマーgabTR
配列番号５：βガラクトシダーゼ由来33アミノ酸が付加されたGABAアミノ基転移酵素タンパク質をコードする塩基配列
配列番号６：βガラクトシダーゼ由来33アミノ酸が付加されたGABAアミノ基転移酵素タンパク質
配列番号７：プライマーacdS-for
配列番号８：プライマーgabT-Rev
配列番号９：gabT断片2
配列番号１０：プライマーamp_ter-for2
配列番号１１：プライマーamp_ter-rev2
配列番号１２：amp-term断片
配列番号１３：ACCデアミナーゼ遺伝子
配列番号１４：ACCデアミナーゼタンパク質
配列番号１５：プライマーGUSF
配列番号１６：プライマーGUSR

Claims (10)

  1. 　外来性のGABAアミノ基転移酵素遺伝子を保持する、向上した遺伝子導入効率を示す形質転換アグロバクテリウム菌。
  2. 　外来性のACCデアミナーゼ遺伝子をさらに保持する、請求項１に記載の形質転換アグロバクテリウム菌。
  3. 　GABAアミノ基転移酵素遺伝子及び／又はACCデアミナーゼ遺伝子をベクター形態で保持する、請求項１又は２に記載の形質転換アグロバクテリウム菌。
  4. 　T-DNA領域を含むバイナリーベクターをさらに含有する、請求項１～３のいずれか１項に記載の形質転換アグロバクテリウム菌。
  5. 　GABAアミノ基転移酵素遺伝子が細菌由来である、請求項１～４のいずれか１項に記載の形質転換アグロバクテリウム菌。
  6. 　ACCデアミナーゼ遺伝子が細菌由来である、請求項１～５のいずれか１項に記載の形質転換アグロバクテリウム菌。
  7. 　請求項１～６のいずれか１項に記載の形質転換アグロバクテリウム菌を用いて、植物への遺伝子導入を行うことを特徴とする、形質転換植物の作製方法。
  8. 　植物が単子葉植物又は双子葉植物である、請求項７に記載の方法。
  9. 　単子葉植物がイネ科植物である、請求項８に記載の方法。
  10. 　双子葉植物がナス科植物である、請求項８に記載の方法。
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