WO2014118086A1 - Verfahren zur identifikation von 5-hydroxymethylcytosin basen - Google Patents
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Abstract
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Identifikation von 5-Hydroxymethylcytosin in einem DNA-Molekül, einem Kit, um solch ein Verfahren durchzuführen sowie die Verwendung einer 5-Hydroxymethycytosin sensitiven Restriktionsendonuklease zur Identifikation von 5-Hydroxymethylcytosin in einem DNA- Molekül.
Description
Verfahren zur Identifikation von 5-Hvdroxymethylcvtosin Basen
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Identifikation von 5- Hydroxymethylcytosin in einem DNA-Molekül, einem Kit, um solch ein Verfahren durchzuführen sowie die Verwendung einer 5-Hydroxymethycytosin sensitiven Restriktionsendonuklease zur Identifikation von 5-Hydroxymethylcytosin in einem DNA- Molekül.
Hintergrund der Erfindung
Die Identifizierung von chemisch modifizierten Nukleotiden genomischer DNA gehört zu den wichtigsten Arbeitsfeldern in der epigenetischen Forschung. Insbesondere die Methylierung von Cytosinresten stellt ein wichtiges epigenetisches Merkmal dar. Die Methylierung und die Demethylierung genomischer DNA von Säugern geschieht dynamisch während der frühen Embryogenese und spielt eine wesentliche Rolle unter anderen bei der Entwicklung, der X- Chromosominaktivierung, beim Imprinting, bei der Entwicklung der Keimzellen, bei Transkription, dem Silencing von Retrotransposonen sowie bei der Tumorentstehung (siehe z.B. Ooi et al. (2009), J. Cell. Sei., 122:2787-2791 sowie den darin zitierten Referenzen). Beispielsweise tendieren Promotoren von aktiven Genen dazu, hypomethyliert zu sein, was darauf schließen lässt, dass der Grad der DNA-Methylierung mit der Expression der zugehörigen Gene korreliert (Weber et al. (2007), Curr. Op. Cell. Biol., 19:273-280).
Die DNA-Methylierung geschieht beispielsweise durch Methyltransferasen, Enzyme, die Cytosin in 5-Methylcytosin (5-mC) umwandeln können. In Säugerzellen hat 5-mC in etwa 1% Anteil an der Häufigkeit aller Basen und wird fast ausschliesslich als symmetrische Methylierung an CpG Stellen gefunden, was bedeutet, dass die Methylierung auf beiden komplementären Strängen der CpG Stelle vorhanden ist (Ehrlich und Wang (1981), Science, 212:1350-1357).
Es wurden mehrere Methoden im Stand der Technik beschrieben, um die Position von 5-mC Basen in DNA-Sequenzen zu identifizieren und zu detektieren. Das am weitesten verbreitete Verfahren ist die Behandlung von DNA mit Bisulfit, welches zur Deaminierung von allen nicht methylierten Cytosinbasen führt, wodurch Uracil entsteht (Herman et al. (1996), Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 93: 9821-9826). 5-mC reagiert nicht mit Bisulfit, so dass 5-mC Basen im DNA-Molekül aufrecht erhalten werden. Nach der Umwandlung der Cytosine in Uracil kann die Position der 5-Methylcytosine innerhalb des DNA-Moleküls dadurch bestimmt werden, dass die Basenpaarung verändert worden ist. Während 5-mC wie Cytosin eine
Basenpaarung mit Guanin eingeht, geht Uracil hingegen eine Basenpaarung mit Adenin ein. Geeignete Verfahren, um die Position von 5-mC zu detektieren sind beispielsweise DNA- Sequenzierung, PCR, Oligonukleotid Ligation Assay, Einzelbasen-Extensionen und weitere dem Fachmann wohlbekannte Verfahren.
Weitere Verfahren, um den Methylierungszustand von DNA zu analysieren, basieren auf der enzymatischen Deaminierung von nicht methylierten Cytosinen. Beispielsweise beschreibt WO 2005005660 ein Verfahren, welches die schnelle Umwandlung von nicht methyliertem Cytosin in Uracil durch das Enzym Cytosin-Deaminase ausnutzt.
Vor wenigen Jahren wurde eine weitere methylierte Nukleobase entdeckt, 5- Hydroxymethylcytosin (5-hmC). Diese wird vermutlich gebildet, indem 5-mC oxidiert wird, ein Prozess, der durch die TET Familie von Cytosin-Oxygenasen katalysiert werden könnte (Kriaucionis und Heintz (2009), Science, 324(5929): 939-930). Diese Vermutung wird durch die Tatsache erhärtet, dass die 5-hmC Konzentration abnimmt, wenn TET1 depletiert wird (Tahiliani et al. (2009), Science, 324(5929):930-935). 5-hmC ist am häufigsten in der DNA des Gehirns, was eine Rolle in der epigenetischen Rolle der neuronalen Funktion nahe legt (Kriaucionis und Heintz, supra). Ungefähr 0,6% aller Nukleotide in Purkinje Zellen und 0,2% aller granulären Zellen sind 5-hmC, während es in Krebszelllinien nicht gefunden werden kann. Darüberhinaus kommt 5-hmC im Genom von embryonalen Maus Stammzellen vor, was auf eine Rolle als epigenetischer Marker während der Säugetierentwicklung hinweisen könnte.
Verfahren für die zuverlässige Identifikation von 5-hmC in DNA-Molekülen sind erforderlich, um weiter die Rolle dieser Modifikation als epigenetischen Marker und in regulatorischen Netzwerken zu untersuchen. Während die Behandlung der DNA mit Bisulfit ein geeigneter Weg ist, um nicht-methyliertes Cytosin und 5-mC zu unterscheiden, kann dieser Ansatz nicht verwendet werden, um die beiden methylierten Formen 5-mC und 5-hmC zu unterrscheiden, da beide Formen der Nukleobase Cytosin nicht mit Bisulfit reagieren.
Ein Verfahren wurde beschrieben, um spezifisch 5-hmC Reste in DNA-Molekülen zu detektieren. Dieses basiert auf der Glycosylierung von 5-hmC durch eine enzymatische Reaktion mit Hilfe von T4 ß-Glucosyltransferase (T4-BGT) und der anschließenden Restriktion der DNA durch Glykosylierungs-sensitive Endonukleasen. T4-BGT katalysiert
spezifisch die Glycosylierung von 5-hmC in DNA-Molekülen, reagiert aber nicht mit Cytosin- oder 5-mC-Resten.
Jedes 5-hmC, welches innerhalb eines CCGG Sequenzmotivs vorkommt, verändert diese Stelle so, dass sie nicht mehr durch die Restriktionsendonuklease Mspl geschnitten werden kann.
Diese Art der Detektion von 5-hmC wird im EpiMark™ 5-hmC und 5-mC Analyse Kit von New England Biolabs verwendet. Dieses Verfahren ist jedoch nur geeignet, um 5-hmC Basen zu detektieren, die in CCGG Sequenzmotiven vorkommen. 5-hmC Reste, die nicht in dieser Restriktionsendonuklease Erkennungssequenz liegen, können durch dieses Verfahren nicht identifiziert werden. Weiterhin weist dieses Verfahren eine Reihe enzymatischer Schritte auf, so dass die Gefahr besteht, mögliche Fehler während der Reaktion zu akkumulieren.
Daher besteht ein Bedarf für verbesserte Verfahren, die es erlauben, 5-hmC Basen in einem DNA-Molekül spezifisch zu detektieren. Dieses Verfahren sollte einfach durchzuführen sein und möglichst wenige Schritte umfassen.
Die hier vorliegende Erfindung erfüllt diese Bedingungen und stellt ein neuartiges Verfahren zur Verfügung, um spezifisch 5-hmC modifizierte Nukleotide zu detektieren.
Beschreibung der Erfindung
In einem ersten Aspekt bezieht sich die vorliegende Erfindung auf ein Verfahren zur Identifikation von 5-Hydroxymethylcytosin in einem DNA-Molekül, aufweisend die folgenden Verfahrensschritte:
a) In Kontakt Bringen des DNA-Moleküls mit einem Linker (1) und einem Enzym, welches DNA-Stränge verknüpfen kann, unter Bedingungen, die den Linker (1) mit dem DNA-Molekül verknüpfen;
b) In Kontakt Bringen des Linker (l)-DNA-Moleküls mit einer 5-Hydroxymethylcytosin sensitiven Restriktionsendonuklease unter Bedingungen, die ein Schneiden des Linker (l)-DNA-Moleküls an hydroxymethylierten Stellen ermöglichen;
c) In Kontakt Bringen des geschnittenen Linker (l)-DNA-Moleküls mit einem Linker (2) und einem Enzym, welches DNA-Stränge verknüpfen kann, unter Bedingungen, die den Linker (2) an die geschnittene Stelle aus Verfahrensschritt b) verknüpft, so dass ein Linker (l)-DNA-Molekül-Linker (2) Konstrukt entsteht;
d) Analyse des in Verfahrensschritt c) entstandenen Konstruktes.
Die vorliegende Erfindung basiert auf der Entdeckung, dass es Restriktionsendonukleasen gibt, die spezifisch solche DNA-Stränge schneiden, die hydroxymethylierte Cytosine aufweisen, methylierte oder unmethylierte jedoch nicht. Zu diesen Restriktionsendonukleasen gehört beispielsweise PvuRTSll (Szwagierczak et al. (2011), Nucleic Acids Res., 39:5149- 5156; Wang et al. (2011), Nucleic Acids Res., 39:9294-9305).
In einem ersten Schritt wird ein erster Linker (1) mittels eines geeigneten Enzyms an das DNA-Molekül verknüpft, welches auf das Vorhandensein von 5-hmC untersucht werden soll. In einen zweiten Schritt wird das Linker (l)-DNA-Molekül mit einer 5- Hydroxymethylcytosin sensitiven Restriktionsendonuklease in Kontakt gebracht unter Bedingungen, die ein Schneiden dieses Moleküls an hydroxymethylierten Stellen ermöglicht. In einem dritten Schritt wird an diese geschnittene Stelle ein zweiter Linker (2) mittels eines geeigneten Enzyms an das Linker (l)-DNA-Molekül verknüpft, so dass ein DNA-Molekül entsteht, dass an beiden Seiten von jeweils einem Linker eingeschlossen wird.
Mit Hilfe der bekannten Linker-Sequenzen kann das DNA-Molekül in einem vierten Schritt analysiert werden, beispielsweise mittels einer Amplifikations- oder einer Sequenzierungsreaktion.
Das DNA-Molekül, welches auf das Vorhandensein von 5-hmC mit dem erfindungsgemäßen Verfahren untersucht werden soll, kann ein synthetisch hergestelltes oder natürlich vorkommendes DNA-Molekül sein.
Bevorzugt ist das DNA-Molekül ein natürlich vorkommendes DNA-Molekül eines lebenden Organismus und wurde aus einer Probe dieses Organismus gewonnen.
Besonders bevorzugt handelt es sich bei dem DNA-Molekül um genomische DNA aus diesem Organismus.
In einer bevorzugten Ausführungsform stammt die biologische Probe, welche das zu untersuchende DNA-Molekül enthält, aus einem Säuger, in einer besonders bevorzugten Ausführungsform stammt diese von einem Menschen.
Die Probe kann Blut, Liquor, Plasma, Urin, Stuhl, eine Gewebeprobe oder jede andere DNA enthaltende Probe des Organismus sein.
Nach dem Trennen der Probe vom Organismus wird die Probe entsprechend behandelt, um die Isolation der DNA, die untersucht werden soll, zu gewährleisten. Geeignete Behandlungen solcher Proben sind dem Fachmann wohlbekannt.
Beispielsweise können die Zellen der biologischen Probe, welche die DNA beinhalten, zerstört werden, um die DNA freizusetzen, beispielsweise durch eine French Press, durch wiederholte Einfrier- und Auftauzyklen oder durch Ultraschall. Dem Fachmann sind weitere geeignete Verfahren bekannt.
Die zellulären Reste können von den DNA-Bestandteilen abgetrennt werden, beispielsweise durch Zentrifugation oder Filtration.
Die von den Zellen abgetrennte DNA kann anschließend durch jedes beliebige Verfahren, welches im Stand der Technik bekannt ist, aufgereinigt werden. Beispielsweise kann die DNA durch Phenol-Chloroformextraktion, Aufreinigung über Minisäulen oder durch jedes beliebige Kit, welches für die Aufreinigung von DNA geeignet ist, insbesondere für die Aufreinigung von genomischer DNA aus biologischen Proben, aufgereinigt werden.
Geeignete Kits für die Aufreinigung von genomischer DNA aus unterschiedlichen Zell- oder Gewebetypen sind unter anderem der PAXgene blood DNA kit (QIAGEN, Deutschland) oder der QIAsymphony DNA Kit (QIAGEN, Deutschland). Dem Fachmann sind weitere geeignete Kits geläufig.
Das durch das Verfahren der vorliegenden Erfindung zu analysierende DNA-Molekül ist etwa 5, etwa 10, etwa 50, etwa 100, etwa 250, etwa 500, etwa 1000, etwa 10.000, etwa 100.000, oder mehr Nukleotide lang. Das DNA-Molekül umfasst bevorzugt ein Gen, einen Teil eines Gens oder eine regulatorische Sequenz, die die Transkription kontrolliert.
Das Verfahren der vorliegenden Erfindung ist geeignet, um Nukleotide in einem DNA- Molekül zu detektieren, das eine Cytosinbase aufweist, die durch einen 5-hmC Rest modifiziert ist.
Daher ist dieses Verfahren insbesondere geeignet, um den Methylierungsstatus eines DNA- Moleküls festzustellen, z.B. um Aufschluss über den Mechanismus zu erhalten, der die Genexpression durch dynamische DNA-Methylierungsprozesse kontrolliert.
Das DNA-Molekül ist bevorzugt genomische DNA, z.B. chromsomale DNA, die von einem Säuger, bevorzugt von einem Menschen, erhalten worden ist.
Das DNA-Molekül kann einzelsträngig oder doppelsträngig sein. Einzelsträngige DNA- Moleküle müssen zuvor durch dem Fachmann bekannte Verfahren in eine doppelsträngige DNA überführt werden, bevor sie dem erfindungsgemäßen Verfahren unterzogen werden können.
Das von den Zellen abgetrennte und aufgereinigte DNA-Molekül wird in einem ersten Verfahrensschritt a) mit einem Linker (1) und einem Enzym, welches DNA-Stränge verknüpfen kann, in Kontakt gebracht. Die Bedingungen werden so gewählt, dass das Enzym den Linker (1) mit dem DNA-Molekül verknüpfen kann.
Bei den Linkern (1) und (2), die im erfmdungsgemäßen Verfahren Verwendung finden, handelt es sich jeweils um eine Nukleinsäure, die eine bekannte Sequenz aufweist. Dabei kann die Nukleotidabfolge des Linkers (1) mit der des Linkers (2) partiell identisch oder aber völlig unterschiedlich sein. Auch eine vollständige Indentität in der Nukleotidabfolge des Linkers (1) und des Linkers (2) ist möglich, wenn gewährleistet wird, dass nur ein bestimmtes Ende des Linkers an das DNA-Molekül ligiert wird. In diesem Fall kann das Konstrukt mit sense- und antisense-spezifischen Primern in Verfahrensschritt d) analysiert werden.
Die Linker können jeweils für sich eine Sequenz aufweisen, die mit der Sequenz eines Organismus identisch ist oder aber auch eine Sequenz aufweisen, die keine Sequenzhomologie zur Sequenz eines bestimmten Organismus aufweist. Für das erfindungsgemäße Verfahren spielt es keine Rolle, ob die für die Linker verwendete Nukleinsäure aus Ribonukleotiden oder Desoxyribonukleotiden aufgebaut ist, oder aus einer Mischung aus diesen Nukleotiden. Es muss jedoch gewährleistet sein, dass die in Verfahrensschritt d) zur Analyse verwendete Polymerase diese Nukleinsäure als Substrat verwenden kann.
Ebenso ist die Nukleotidabfolge für das erfindungsgemäße Verfahren nicht wesentlich, es muss jedoch gewährleistet sein, dass diese Nukleotidabfolge bekannt ist.
Ebenso kann die für die Linker verwendete Nukleinsäure vollständig oder teilweise aus modifizierten Nukleotiden aufgebaut sein, erfindungswesentlich ist lediglich, dass die Nukleotidabfolge bekannt sein muss. Zu den modifizierten Nukleotiden, die im erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden können, gehören beispielsweise methylierte Nukletide, Phosphorotioat modifizierte Nukleotide, Locked Nucleic Acids, 3-Amino modifizierte Nukleotide, ddNTPs sowie Nukleotide mit abasischen Modifikationen. Dem Fachmann sind weitere geeignete Nukleotide geläufig.
Der Linker (1) und der Linker (2) weisen jeweils eine Länge von 15 bis 150, bevorzugt von 25 bis 100, besonders bevorzugt von 30 bis 80 auf.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist der Linker (1) an einer festen Phase immobilisiert. Bei der festen Phase kann es sich um eine beliebige feste Phase handeln, die dafür geeignet
ist, eine Nukleinsäure zu immobilisieren. Die Art der Immobilisierung der Nukleinsäure an diese feste Phase ist dabei beliebig, es muss nur gewährleistet sein, dass die an diese feste Phase immobilisierte Nukleinsäure noch für Nukleinsäuren modifizierende Enzyme sowie für Hybridisierungen zugänglich ist.
Die Immobilisierung der Nukleinsäure an die feste Phase kann reversibel oder irreversibel sein.
Beispielsweise kann die Nukleinsäure an Glasoberflächen erfolgen, bei der sowohl die Nukleinsäure als auch die feste Phase durch reaktive organische funktionelle Gruppen modifiziert sein können. Durch chemische Aktivierung mit Hilfe von geeigneten Reagenzien kann so eine kovalente Bindung zwischen Nukleinsäure und fester Phase erreicht werden.
Hierfür eignen sich beispielsweise funktionelle Gruppen wie Carboxyl-, Phosphat-, Aldehydoder Aminogruppen.
Dem Fachmann sind weitere geeignete Verfahren und chemische Modifikationen zur Immobilisierung einer Nukleinsäure an eine feste Phase, sowohl reversibel als auch irreversibel, bekannt.
Bei der festen Phase kann es sich um eine planare oder gebogene Fläche, um einen Partikel, um Säulenmaterial oder auch um die Oberfläche von Reaktionsgefäßen handeln. Weitere geeignete Oberflächen sind dem Fachmann geläufig.
Das Material der festen Phase ist nicht erfindungswesentlich. Seine Oberfläche muss lediglich dazu geeignet sein, eine Nukleinsäure reversibel oder irreversibel binden zu können. Es kann sich bei der Oberfläche beispielsweise um eine Silikaoberfläche, eine Nitrozelluloseoberfläche oder um eine funktionalisierte Glasoberfläche handeln. Weitere geeignete Oberflächen sind dem Fachmann geläufig. Bei dem Enzym, welches den Linker (1) und den Linker (2) an das DNA-Molekül verknüpft, kann es sich um ein beliebiges Enzym handeln, welches in der Lage ist, zwei Nukleinsäurestränge miteinander kovalent zu verknüpfen.
In einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei diesem Enzym um eine Ligase. Beispiele für geeignete Ligasen sind DNA Ligase aus E. coli und T4 DNA Ligase. Weitere DNA Ligasen sind dem Fachmann geläufig.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei der Ligase um T4 DNA Ligase.
Dabei werden die Reaktionsbedingungen, beispielsweise Temperatur, Zeitdauer und Salzkonzentration, für die Verknüpfung des Linkers an das DNA-Molekül so gewählt, dass das Enzym in der Lage ist, dafür zu sorgen, dass eine ausreichende Menge Linker mit den DNA-Molekülen verknüpft wird. Dem Fachmann sind die Reaktionsbedingungen in Abhängigkeit des ausgewählten Enzyms geläufig.
Beispielsweise können die Reaktionsbedingungen bei Verwendung von T4 DNA Ligase wie folgt gewählt sein:
10 μΙ_ 2Χ Ugation Buffer IX
Χ μΙ. Fragment 1-10 ng/ μΐ
X μΙ_ Linker 1-10 ng/ μ_
Ι μί T4 DNA Ligase (600 U/ μί) 30 U/ μί
Χ μί Water N/A
20 μί Total Volume Dem Fachmann ist wohlbekannt, dass jedes geeignete Enzym auch bei für es nicht optimalen Reaktionsbedingungen eine ausreichende Aktivität aufweisen kann.
Für die Verknüpfung des Linker (1) an das DNA-Molekül kann dasselbe oder ein unterschiedliches Enzym verwendet werden wie für die Verknüpfung des Linkers (2) an das geschnittene Linker (l)-DNA-Molekül.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird für beide Verknüpfungen dasselbe Enzym verwendet.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei dem Enzym dabei um T4 DNA Ligase. Sofern das DNA-Molekül, welches auf das Vorhandensein von 5-hmC untersucht werden soll, für die Verknüpfung des Linkers (1) an das DNA-Molekül und für die weiteren Verfahrensschritte noch zu lang ist, kann das DNA-Molekül zuvor einer Fragmentierung in kürzere DNA-Moleküle unterworfen werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform liegt die Länge des DNA-Moleküls für die erfindungsgemäßen Verfahrensschritte zwischen 50 und 300 Nukleotiden, jedoch können auch längere oder kürzere DNA-Moleküle eingesetzt werden.
Diese Fragmentierung kann durch jedes dem Fachmann bekannte Verfahren durchgeführt werden, so zum Beispiel durch mechanische Fragmentierung, Beschallung, Nebulisierung, hydrodynamische Scherung oder enzymatische Fragmentierung. Dem Fachmann sind weitere Verfahren zur Fragmentierung von DNA-Molekülen geläufig.
In einer weiteren Ausführungsform kann vor der Verknüpfung des Linkers (1) an das DNA- Molekül noch ein Verfahrensschritt durchgeführt werden, bei dem eine Anreicherung von 5- Hydroxymethylcytosin aufweisenden DNA-Molekülen stattfindet. Dieser Verfahrensschritt dient insbesondere der Vor-Anreicherung der zu untersuchenden DNA-Moleküle, wenn zu erwarten ist, dass eine 5-hmC Modifikation nur in wenigen Bereichen der zu untersuchenden DNA vorkommt.
Diese Vor-Anreicherung von 5-hmC DNA-Molekülen kann durch verschiedene Verfahren durchgeführt werden.
Beispielsweise kann eine Präzipitation 5-hydroxymethylierter DNA-Moleküle mit Hilfe von für diese Modifikation spezifischen Antikörpern durchgeführt werden. Eine weitere Möglichkeit besteht beispielsweise darin, die 5 -hydroxymethylierten DNA-Moleküle durch geeignete chemische Substanzen zu präzipitieren.
Nach der Präzipitation der 5-hmC DNA-Moleküle besteht die Möglichkeit, durch einen optionalen Waschschritt die Antikörper oder die chemischen Substanzen, die zur Präzipitation verwendet wurden, wieder zu entfernen.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird vor der Verknüpfung des Linker (1) an das DNA-Molekül sowohl eine Fragmentierung des DNA-Moleküls in kürzere DNA-Moleküle durchgeführt, als auch eine spezifische Präzipitation 5-hydroxymethylierter DNA-Moleküle durchgeführt.
In einem weiteren Verfahrensschritt b) wird das verknüpfte Linker (l)-DNA-Molekül mit einer 5-Hydroxymethylcytosin sensitiven Restriktionsendonuklease in Kontakt gebracht unter Bedingungen, die ein Schneiden des Linker (l)-DNA-Moleküls an hydroxymethylierten Stellen ermöglichen.
Geeignete Restriktionsendonukleasen für diesen Verfahrensschritt sind solche, welche in der Lage sind, in ihrer Reaktionseffizienz zwischen unmethylierten, methylierten und hydroxymethylierten Cytosinen unterscheiden zu können.
Bevorzugt werden in diesen Verfahrensschritt solche Restriktionsendonukleasen eingesetzt, die an hydroxymethylierten Cytosinen mit hoher Effizienz schneiden, bei methylierten und unmethylierten Cytosinen jedoch nur mit geringer oder gar keiner Effizienz. In einer
bevorzugen Ausführungsform handelt es sich bei der Restriktionsendonuklease um PvuRTsI. Dieses weist eine Restriktionseffizienz für 5-hmC von etwa 95% auf, während sowohl unmethylierte als auch 5-mC Nukleotide nur mit sehr geringer Effizienz geschnitten werden. PvuRTsI schneidet an der Sequenz "CNn-u/ ^ioG, so dass das geschnittene DNA-Molekül einen Überhang von 2 Nukleotiden aufweist, wobei das Ende dieses DNA-Moleküls, welches mit dem Linker (1) verknüpft ist, ein hydroxymethyliertes Cytosin an der geschnittenen Stelle aufweist. Die Reaktionsbedingungen, bei denen das Linker (l)-DNA -Molekül mit einer Restriktionsendonuklease in Kontakt gebracht wird, beispielsweise Temperatur, Zeitdauer und Salzkonzentration, sind so gewählt, dass das Enzym in der Lage ist, an hydroxymethylierten Cytosinen zu schneiden. Für das erfindungsgemäße Verfahren ist es ausreichend, wenn nur ein geringer Prozentsatz der hydroxymethylierten Cytosine geschnitten wird, da diese geschnittenen DNA-Moleküle andere Enden aufweisen als nicht geschnittene DNA-Moleküle und so von diesen leicht unterschieden werden können. Da im Verfahreschschritt d) bei der Analyse eine Vervielfältigung des Signals, beispielsweise durch eine PCR, stattfinden kann, ist ein geringer Prozentsatz an geschnittenen hydroxymethylierten Cytosinen für das erfindungsgemäße Verfahre ausreichend.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird ein Prozentsatz von mehr als 30%, von mehr als 50%, von mehr als 70%, von mehr als 90% aller hydroxymethylierten Cytosine in Verfahrensschritt b) geschnitten.
Dem Fachmann sind die Reaktionsbedingungen in Abhängigkeit des ausgewählten Enzyms geläufig. Dem Fachmann ist wohlbekannt, dass jedes geeignete Enzym auch bei für es nicht optimalen Reaktionsbedingungen eine ausreichende Aktivität aufweisen kann.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird nach diesem Verfahrensschnitt b) ein Waschschritt eingefügt, in dem das Restriktionsenzym sowie die geschnittenen, nicht an eine feste Phase immobilisierten DNA-Moleküle, entfernt werden.
In einem weiteren Verfahrensschritt c) wird das geschnittene Linker (l)-DNA-Molekül mit einem Linker (2) und einem Enzym, welches DNA-Stränge verknüpfen kann, unter Bedingungen, die den Linker (2) an die geschnittene Stelle aus Verfahrensschritt b) verknüpft, so dass ein Linker (l)-DNA-Molekül-Linker (2) Konstrukt entsteht.
Bei den Linkern (1) und (2), die im erfindungsgemäßen Verfahren Verwendung finden, handelt es sich jeweils um eine Nukleinsäure, die eine bekannte Sequenz aufweist. Dabei kann die Nukleotidabfolge des Linkers (1) mit der des Linkers (2) partiell identisch oder aber völlig unterschiedlich sein. Auch eine vollständige Indentität in der Nukleotidabfolge des Linkers (1) und des Linkers (2) ist möglich, wenn gewährleistet wird, dass nur ein bestimmtes Ende des Linkers an das DNA-Molekül ligiert wird. In diesem Fall kann das onstrukt mit sense- und antisense-spezifischen Primern in Verfahrensschritt d) analysiert werden.
Die Linker können jeweils für sich eine Sequenz aufweisen, die mit der Sequenz eines Organismus identisch ist oder aber auch eine Sequenz aufweisen, die keine Sequenzhomologie zur Sequenz eines bestimmten Organismus aufweist. Für das erfindungsgemäße Verfahren spielt es keine Rolle, ob die für die Linker verwendete Nukleinsäure aus Ribonukleotiden oder Desoxyribonukleotiden aufgebaut ist, oder aus einer Mischung aus diesen Nukleotiden. Es muss jedoch gewährleistet sein, dass die in Verfahrensschritt d) zur Analyse verwendete Polymerase diese Nukleinsäure als Substrat verwenden kann.
Ebenso ist die Nukleotidabfolge für das erfindungsgemäße Verfahren nicht wesentlich, es muss jedoch gewährleistet sein, dass diese Nukleotidabfolge bekannt ist.
Ebenso kann die für die Linker verwendete Nukleinsäure vollständig oder teilweise aus modifizierten Nukleotiden aufgebaut sein, erfindungswesentlich ist lediglich, dass die Nukleotidabfolge bekannt sein muss. Zu den modifizierten Nukleotiden, die im erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden können, gehören beispielsweise methylierte Nukletide, Phosphorotioat modifizierte Nukleotide, Locked Nucleic Acids, 3-Amino modifizierte Nukleotide, ddNTPs sowie Nukleotide mit abasischen Modifikationen. Dem Fachmann sind weitere geeignete Nukleotide geläufig.
Der Linker (1) und der Linker (2) weisen jeweils eine Länge von 15 bis 150, bevorzugt von 25 bis 100, besonders bevorzugt von 30 bis 80 auf.
Bei dem Enzym, welches den Linker (1) und den Linker (2) an das DNA-Molekül verknüpft, kann es sich um ein beliebiges Enzym handeln, welches in der Lage ist, zwei Nukleinsäurestränge miteinander kovalent zu verknüpfen.
In einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei diesem Enzym um eine Ligase. Beispiele für geeignete Ligasen sind DNA Ligase aus E. coli und T4 DNA Ligase. Weitere geeignete DNA Ligasen sind dem Fachmann bekannt.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei der Ligase um T4 DNA Ligase.
Dabei werden die Reaktionsbedingungen, beispielsweise Temperatur, Zeitdauer und Salzkonzentration, für die Verknüpfung des Linkers an das DNA-Molekül so gewählt, dass das Enzym in der Lage ist, dafür zu sorgen, dass eine ausreichende Menge Linker mit den DNA-Molekülen verknüpft wird. Dem Fachmann sind die Reaktionsbedingungen in Abhängigkeit des ausgewählten Enzyms geläufig.
Beispielsweise können die Reaktionsbedingungen bei Verwendung von T4 DNA Ligase wie folgt gewählt sein:
10 μ_ 2Χ Ligation Buffer IX
Χ μ_ Fragment 1-10 ng/ \xl
Χ μί Linker 1-10 ng/ xL
Ι μί T4 DNA Ligase (600 U/ μί) 30 U/ μί
Χ μί Water N/A
20 μί Total Volume
Dem Fachmann ist wohlbekannt, dass jedes geeignete Enzym auch bei für es nicht optimalen Reaktionsbedingungen eine ausreichende Aktivität aufweisen kann.
Für die Verknüpfung des Linker (1) an das DNA-Molekül kann dasselbe oder ein unterschiedliches Enzym verwendet werden wie für die Verknüpfung des Linkers (2) an das geschnittene Linker (l)-DNA-Molekül.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird für beide Verknüpfungen dasselbe Enzym verwendet.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei dem Enzym dabei um T4 DNA Ligase.
Nach diesem Verfahrensschritt c) befindet sich das DNA-Moloekül, welches ein hydroxymethyliertes Cytosin aufweist, als Amplikon zwischen zwei Linkern mit jeweils bekannter Nukleinsäuresequenz. Dabei ist die hydroxymethylierte Stelle dem Linker (2) benachbart.
In einem weiteren Verfahrensschritt d) wird das in Verfahrensschritt c) entstandene Konstrukt analysiert.
Da sich das zu untersuchende DNA-Molekül, welches ein hydroxymethyliertes Cytosin aufweist, nach den erfindungsgemäßen Verfahrensschritten a) bis c) zwischen zwei Linkern mit bekannter Nukleinsäuresequenz befindet, ist es nun möglich, das Konstrukt aus Verfahrensschritt c) zu analysieren.
In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst die Analyse des onstruktes eine Amplifikation des Konstruktes.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei der Amplifikation um eine PCR. Dem Fachmann ist wohlbekannt, dass eine PCR in verschiedenen Ausführungsformen durchgeführt werden kann. Beispiele für die Analyse des Konstruktes mittels PCR umfasst beispielsweise Endpunkt-PCR. Dem Fachmann sind weitere Ausführungsformen der PCR bekannt, die für das erfindungsgemäße Verfahren geeignet sind.
In einer weiteren besonders bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei der Amplifikation um eine Sequenzierung. Dem Fachmann ist wohlbekannt, dass eine Sequenzierung in verschiedenen Ausführungsformen durchgeführt werden kann. Beispiele für die Analyse des Konstruktes mittels Sequenzierung umfasst Deep Sequencing, Next Generation Sequencing, oder auch Pyrosequencing, wenn es sich bei der amplifizierten DNA um eine einzelne Sequenz handelt. Dem Fachmann sind weitere Ausführungsformen der Sequenzierung bekannt, die für das erfindungsgemäße Verfahren geeignet sind.
In einer darüber hinaus besonders bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei der Seqeunzierung um Deep Sequencing.
In einer weiteren besonders bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei der Sequenzierung um Pyrosequencing. In einem weiteren Aspekt bezieht sich die vorliegende Erfindung auf die Verwendung einer 5- Hydroxymethylcytosin sensitiven Restriktionsendonuklease zur Identifikation von 5- Hydroxymethylcystosin in einem DNA-Molekül.
In einem weiteren Aspekt bezieht sich die vorliegende Erfindung auf ein Kit zur Identifikation von 5-Hydroxymethylcytosin in einem DNA-Molekül aufweisend einen Linker (1), ein Enzym, welches DNA-Stränge verknüpfen kann, eine 5-Hydroxymethylcytosin sensitive Restriktionsendonuklease, einen Linker (2) sowie optional eine Anweisung für das erfindungsgemäße Verfahren.
Claims
(1) -DNA-Moleküls an hydroxymethylierten Stellen ermöglichen;
c) In Kontakt Bringen des geschnittenen Linker (l)-DNA-Moleküls mit einem Linker
(2) und einem Enzym, welches DNA-Stränge verknüpfen kann, unter Bedingungen, die den Linker (2) an die geschnittene Stelle aus Verfahrensschritt b) verknüpft, so dass ein Linker (l)-DNA-Molekül-Linker (2) Konstrukt entsteht;
d) Analyse des in Verfahrensschritt c) entstandenen Konstruktes.
2) Verfahren gemäß Anspruch 1), dadurch gekennzeichnet, dass vor Verfahrensschritt a) aus Anspruch 1) eine Fragmentierung des DNA-Moleküls in kürzere DNA- Moleküle erfolgt.
3) Verfahren gemäß Anspruch 1), dadurch gekennzeichnet, dass vor Verfahrensschritt a) aus Anspruch 1) eine Anreicherung von 5-Hydroxymethylcytosin aufweisenden DNA-Molekülen stattfindet.
4) Verfahren gemäß Anspruch 1), dadurch gekennzeichnet, dass vor Verfahrensschritt a) aus Anspruch 1) eine Fragmentierung der DNA in kürzere DNA-Moleküle erfolgt und anschließend eine Anreicherung von 5-Hydroxymethylcytosin aufweisenden DNA-Molekülen stattfindet.
5) Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1) bis 4), dadurch gekennzeichnet, dass der Linker (1) in Verfahrensschritt b) aus Anspruch 1) an einer festen Phase immobilisiert ist.
6) Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1) bis 5), dadurch gekennzeichnet, dass die Restriktionsendonuklease in Verfahrensschritt c) aus Anspruch 1) PvuRTsll ist.
7) Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1) bis 6), dadurch gekennzeichnet, dass das Enzym, das das DNA-Molekül mit einem Linker in den Verfahrensschritten a) und c) aus Anspruch 1) verknüpft, eine Ligase ist.
8) Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1) bis 7), dadurch gekennzeichnet, dass die Analyse des onstruktes in Verfahrensschritt d) aus Anspruch 1 eine Amplifikation umfasst.
9) Verfahren gemäß Anspruch 8), dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei der Amplifikation um eine PCR handelt.
10) Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1) bis 7), dadurch gekennzeichnet, dass die Analyse des Konstruktes in Verfahrensschritt d) aus Anspruch 1 eine Sequenzierung umfasst.
11) Verfahren gemäß Anspruch 10), dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei der Sequenzierung um Deep Sequencing handelt.
12) Verfahren gemäß Anspruch 10), dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei der Sequenzierung um Pyrosequencing handelt.
13) Verwendung einer 5-Hydroxymethylcytosin sensitiven Restriktionsendonuklease zur Identifikation von 5-Hydroxymethylcytosin in einem DNA-Molekül.
14) Kit zur Identifikation von 5-Hydroxymethylcytosin in einem DNA-Molekül, aufweisend
a) einen Linker (1);
b) ein Enzym, welches DNA- Stränge verknüpfen kann;
c) eine 5-Hydroxymethylcytosin sensitive Restriktionsendonuklease;
d) einen Linker (2);
e) optional eine Anweisung für ein Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1) bis 12).
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