WO2014118086A1 - Verfahren zur identifikation von 5-hydroxymethylcytosin basen - Google Patents

Verfahren zur identifikation von 5-hydroxymethylcytosin basen Download PDF

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WO2014118086A1
WO2014118086A1 PCT/EP2014/051387 EP2014051387W WO2014118086A1 WO 2014118086 A1 WO2014118086 A1 WO 2014118086A1 EP 2014051387 W EP2014051387 W EP 2014051387W WO 2014118086 A1 WO2014118086 A1 WO 2014118086A1
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dna
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Wolfgang Bielke
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    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
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    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6858—Allele-specific amplification

Definitions

  • the present invention relates to a method of identifying 5-hydroxymethylcytosine in a DNA molecule, a kit for carrying out such a method, and the use of a 5-hydroxymethycytosine-sensitive restriction endonuclease to identify 5-hydroxymethylcytosine in a DNA molecule.
  • the identification of chemically modified nucleotides of genomic DNA is one of the most important fields of research in epigenetic research.
  • the methylation of cytosine residues is an important epigenetic feature.
  • the methylation and demethylation of mammalian genomic DNA occurs dynamically during early embryogenesis and plays an essential role among others in development, X-chromosome activation, imprinting, development of Germ cells, in transcription, the silencing of retrotransposons, and in tumorigenesis (see, eg, Ooi et al., (2009) J. Cell, Sci., 122: 2787-2791, and the references cited therein).
  • promoters of active genes tend to be hypomethylated, suggesting that the degree of DNA methylation correlates with expression of the associated genes (Weber et al., (2007) Curr., Op., Cell, Biol., 19 : 273-280).
  • DNA methylation occurs, for example, through methyltransferases, enzymes that convert cytosine to 5-methylcytosine (5-mC).
  • 5-mC accounts for approximately 1% of the abundance of all bases and is found almost exclusively as symmetric methylation on CpG sites, meaning that methylation is present on both complementary strands of the CpG site (Ehrlich and Wang (1981) , Science, 212: 1350-1357).
  • uracil During 5-mC like cytosine one Base pairing with guanine, uracil, however, enters into a base pairing with adenine.
  • Suitable methods to detect the position of 5 mC are, for example, DNA sequencing, PCR, oligonucleotide ligation assay, single base extensions, and other methods well known to those skilled in the art.
  • WO 2005005660 describes a method which makes use of the rapid conversion of unmethylated cytosine into uracil by the enzyme cytosine deaminase.
  • 5-hydroxymethylcytosine 5-hmC
  • This is believed to be formed by oxidizing 5-mC, a process that could be catalyzed by the TET family of cytosine oxygenases (Kriaucionis and Heintz (2009), Science, 324 (5929): 939-930). This presumption is corroborated by the fact that the 5-hmC concentration decreases when TET1 is depleted (Tahiliani et al., (2009) Science, 324 (5929): 930-935).
  • 5-hmC is most abundant in the DNA of the brain, suggesting a role in the epigenetic role of neuronal function (Kriaucionis and Heintz, supra). Approximately 0.6% of all nucleotides in Purkinje cells and 0.2% of all granular cells are 5-hmC, while it can not be found in cancer cell lines. In addition, 5-hmC is present in the genome of embryonic mouse stem cells, suggesting a role as an epigenetic marker during mammalian development.
  • T4-BGT T4 ß-glucosyltransferase
  • Each 5 hmC occurring within a CCGG sequence motif alters this site so that it can no longer be cleaved by the restriction endonuclease Mspl.
  • This type of 5-hmC detection is used in the EpiMark TM 5-hmC and 5-mC analysis kit from New England Biolabs. However, this method is only suitable for detecting 5-hmC bases found in CCGG sequence motifs. 5-hmC residues not in this restriction endonuclease recognition sequence can not be identified by this method. Furthermore, this process has a number of enzymatic steps, so that there is a risk of accumulating possible errors during the reaction.
  • the present invention fulfills these conditions and provides a novel method to detect specific 5-hmC modified nucleotides.
  • the present invention relates to a method for the identification of 5-hydroxymethylcytosine in a DNA molecule, comprising the following method steps:
  • linker (I) DNA molecule a 5-hydroxymethylcytosine sensitive restriction endonuclease under conditions permitting cleavage of the linker (I) DNA molecule at hydroxymethylated sites;
  • restriction endonucleases that specifically cleave those DNA strands that have hydroxymethylated cytosines, but not methylated or unmethylated.
  • restriction endonucleases include, for example, PvuRTSII (Szwagierczak et al., (2011) Nucleic Acids Res., 39: 5149-5156; Wang et al. (2011), Nucleic Acids Res., 39: 9294-9305).
  • a first linker (1) is linked by means of a suitable enzyme to the DNA molecule, which is to be examined for the presence of 5 hmC.
  • the linker (I) DNA molecule is contacted with a 5-hydroxymethylcytosine-sensitive restriction endonuclease under conditions that allow this molecule to be cut at hydroxymethylated sites.
  • a second linker (2) is linked to this cut site by means of a suitable enzyme to the linker (l) DNA molecule, so that a DNA molecule is formed which is enclosed on both sides by a respective linker.
  • the DNA molecule can be analyzed in a fourth step, for example by means of an amplification or a sequencing reaction.
  • the DNA molecule to be assayed for the presence of 5-hmC by the method of the invention may be a synthetically produced or naturally occurring DNA molecule.
  • the DNA molecule is a naturally occurring DNA molecule of a living organism and was obtained from a sample of this organism.
  • the DNA molecule is particularly preferably genomic DNA from this organism.
  • the biological sample containing the DNA molecule of interest is derived from a mammal, in a particularly preferred embodiment it is derived from a human.
  • the sample may be blood, cerebrospinal fluid, plasma, urine, stool, a tissue sample, or any other DNA-containing sample of the organism.
  • the sample After separating the sample from the organism, the sample is treated appropriately to ensure isolation of the DNA to be tested. Suitable treatments of such samples are well known to those skilled in the art.
  • the cells of the biological sample containing the DNA may be destroyed to release the DNA, for example, by a French press, by repeated freezing and thawing cycles, or by ultrasound.
  • the person skilled in the art is familiar with further suitable methods.
  • the cellular residues can be separated from the DNA components, for example by centrifugation or filtration.
  • the DNA separated from the cells can then be purified by any method known in the art.
  • the DNA may be purified by phenol-chloroform extraction, minicolumn purification, or any kit suitable for purification of DNA, particularly for the purification of genomic DNA from biological samples.
  • Suitable kits for the purification of genomic DNA from different cell or tissue types include the PAXgene blood DNA kit (QIAGEN, Germany) or the QIAsymphony DNA Kit (QIAGEN, Germany). The skilled person is familiar with other suitable kits.
  • the DNA molecule to be analyzed by the method of the present invention is about 5, about 10, about 50, about 100, about 250, about 500, about 1000, about 10,000, about 100,000, or more nucleotides long.
  • the DNA molecule preferably comprises a gene, a part of a gene or a regulatory sequence that controls transcription.
  • the method of the present invention is suitable for detecting nucleotides in a DNA molecule having a cytosine base modified by a 5-hmC residue.
  • this method is particularly suitable for determining the methylation status of a DNA molecule, e.g. To shed light on the mechanism that controls gene expression through dynamic DNA methylation processes.
  • the DNA molecule is preferably genomic DNA, e.g. chromosomal DNA obtained from a mammal, preferably from a human.
  • the DNA molecule can be single-stranded or double-stranded. Single-stranded DNA molecules must first be converted into a double-stranded DNA by methods known to those skilled in the art before they can be subjected to the method according to the invention.
  • the DNA molecule separated and purified from the cells is brought into contact in a first process step a) with a linker (1) and an enzyme which can link DNA strands. The conditions are chosen so that the enzyme can link the linker (1) to the DNA molecule.
  • the linkers (1) and (2) which are used in the method according to the invention are each a nucleic acid which has a known sequence.
  • the nucleotide sequence of the linker (1) with the linker (2) may be partially identical or completely different. Even a complete identity in the nucleotide sequence of the linker (1) and the linker (2) is possible if it is ensured that only a certain end of the linker is ligated to the DNA molecule.
  • the construct can be analyzed with sense- and antisense-specific primers in method step d).
  • the linkers may each have a sequence which is identical to the sequence of an organism or else has a sequence which has no sequence homology to the sequence of a particular organism.
  • the nucleic acid used for the linker is composed of ribonucleotides or deoxyribonucleotides, or of a mixture of these nucleotides.
  • the polymerase used for analysis in method step d) can use this nucleic acid as substrate.
  • nucleotide sequence is not essential to the method of the invention, but it must be ensured that this nucleotide sequence is known.
  • nucleic acid used for the linker can be constructed completely or partially from modified nucleotides, it is essential to the invention that the nucleotide sequence must be known.
  • Modified nucleotides that can be used in the method of the invention include, for example, methylated nuclides, phosphorotioate modified nucleotides, locked nucleic acids, 3-amino modified nucleotides, ddNTPs, and nucleotides with abasic modifications. The skilled worker is familiar with other suitable nucleotides.
  • the linker (1) and the linker (2) each have a length of from 15 to 150, preferably from 25 to 100, particularly preferably from 30 to 80.
  • the linker (1) is immobilized on a solid phase.
  • the solid phase may be any solid phase suitable for it is to immobilize a nucleic acid.
  • the type of immobilization of the nucleic acid to this solid phase is arbitrary, it only has to be ensured that the nucleic acid immobilized on this solid phase is still accessible to nucleic acid-modifying enzymes and for hybridizations.
  • the immobilization of the nucleic acid to the solid phase may be reversible or irreversible.
  • the nucleic acid can be carried out on glass surfaces in which both the nucleic acid and the solid phase can be modified by reactive organic functional groups.
  • chemical activation with the aid of suitable reagents By chemical activation with the aid of suitable reagents, a covalent bond between nucleic acid and solid phase can thus be achieved.
  • the solid phase can be a planar or curved surface, a particle, columnar material or even the surface of reaction vessels.
  • Other suitable surfaces are familiar to the person skilled in the art.
  • the material of the solid phase is not essential to the invention. Its surface must only be suitable for reversibly or irreversibly binding a nucleic acid.
  • the surface may be a silica surface, a nitrocellulose surface or a functionalized glass surface. Other suitable surfaces are familiar to the person skilled in the art.
  • the enzyme which links the linker (1) and the linker (2) to the DNA molecule may be any enzyme which is capable of covalently linking two strands of nucleic acid together.
  • this enzyme is a ligase.
  • suitable ligases are DNA ligase from E. coli and T4 DNA ligase. Other DNA ligases are familiar to the person skilled in the art.
  • the ligase is T4 DNA ligase.
  • the reaction conditions such as temperature, time and salt concentration, for the linkage of the linker to the DNA molecule are chosen so that the enzyme is able to ensure that a sufficient amount of linker is linked to the DNA molecules.
  • the person skilled in the art is familiar with the reaction conditions as a function of the enzyme selected.
  • reaction conditions when using T4 DNA ligase, the reaction conditions may be as follows:
  • the same or a different enzyme can be used as for the linkage of the linker (2) to the cut linker (l) DNA molecule.
  • the same enzyme is used for both linkages.
  • the enzyme is T4 DNA ligase. If the DNA molecule which is to be examined for the presence of 5 hmC is still too long for the linkage of the linker (1) to the DNA molecule and for the further process steps, the DNA molecule can be previously fragmented in be subjected to shorter DNA molecules.
  • the length of the DNA molecule for the method steps according to the invention is between 50 and 300 nucleotides, but longer or shorter DNA molecules can also be used.
  • This fragmentation can be carried out by any method known to the person skilled in the art, for example by mechanical fragmentation, sonication, nebulization, hydrodynamic shearing or enzymatic fragmentation. The skilled worker is familiar with further methods for fragmenting DNA molecules.
  • a further process step may be carried out in which an accumulation of DNA molecules having 5-hydroxymethylcytosine takes place. This process step is used in particular for the pre-enrichment of the DNA molecules to be examined, if it is to be expected that a 5-hmC modification occurs only in a few areas of the DNA to be examined.
  • This pre-enrichment of 5-hmC DNA molecules can be performed by various methods.
  • precipitation of 5-hydroxymethylated DNA molecules can be performed using antibodies specific for this modification.
  • Another possibility is, for example, to precipitate the 5-hydroxymethylated DNA molecules by suitable chemical substances.
  • both a fragmentation of the DNA molecule into shorter DNA molecules is carried out, as well as a specific precipitation of 5-hydroxymethylated DNA molecules.
  • the linked linker (l) DNA molecule is contacted with a 5-hydroxymethylcytosine-sensitive restriction endonuclease under conditions which allow the linker (l) DNA molecule to be cleaved at hydroxymethylated sites.
  • Suitable restriction endonucleases for this process step are those which are capable of being able to distinguish in their reaction efficiency between unmethylated, methylated and hydroxymethylated cytosines.
  • restriction endonucleases which cut with high efficiency on hydroxymethylated cytosines, but only with little or no efficiency in the case of methylated and unmethylated cytosines.
  • the restriction endonuclease is PvuRTsI. This has a restriction efficiency of about 95% for 5-hmC, while both unmethylated and 5-mC nucleotides are cut with very low efficiency.
  • PvuRTsI cleaves the sequence "CNn-u / ioG such that the cut DNA molecule has an overhang of 2 nucleotides, the end of this DNA molecule linked to the linker (1) being a hydroxymethylated cytosine at the nucleotide
  • a restriction endonuclease such as temperature, time, and salt concentration
  • a percentage of greater than 30%, greater than 50%, greater than 70%, greater than 90% of all hydroxymethylated cytosines in step b) is cut.
  • reaction conditions as a function of the enzyme selected. It is well known to those skilled in the art that any suitable enzyme may have sufficient activity even under conditions which are not optimal for it.
  • a washing step is inserted after this process section b), in which the restriction enzyme and the cut, not immobilized on a solid phase DNA molecules are removed.
  • the linkers (1) and (2) which are used in the method according to the invention are each a nucleic acid which has a known sequence.
  • the nucleotide sequence of the linker (1) with the linker (2) may be partially identical or completely different. Even a complete identity in the nucleotide sequence of the linker (1) and the linker (2) is possible if it is ensured that only a certain end of the linker is ligated to the DNA molecule.
  • the onstrukt can be analyzed with sense- and antisense-specific primers in step d).
  • the linkers may each have a sequence which is identical to the sequence of an organism or else has a sequence which has no sequence homology to the sequence of a particular organism.
  • the nucleic acid used for the linker is composed of ribonucleotides or deoxyribonucleotides, or of a mixture of these nucleotides.
  • the polymerase used for analysis in method step d) can use this nucleic acid as substrate.
  • nucleotide sequence is not essential to the method of the invention, but it must be ensured that this nucleotide sequence is known.
  • nucleic acid used for the linker can be constructed completely or partially from modified nucleotides, it is essential to the invention that the nucleotide sequence must be known.
  • Modified nucleotides that can be used in the method of the invention include, for example, methylated nuclides, phosphorotioate modified nucleotides, locked nucleic acids, 3-amino modified nucleotides, ddNTPs, and nucleotides with abasic modifications. The skilled worker is familiar with other suitable nucleotides.
  • the linker (1) and the linker (2) each have a length of from 15 to 150, preferably from 25 to 100, particularly preferably from 30 to 80.
  • the enzyme which links the linker (1) and the linker (2) to the DNA molecule may be any enzyme which is capable of covalently linking two strands of nucleic acid together.
  • this enzyme is a ligase.
  • suitable ligases are DNA ligase from E. coli and T4 DNA ligase. Other suitable DNA ligases are known to the person skilled in the art.
  • the ligase is T4 DNA ligase.
  • reaction conditions such as temperature, time and salt concentration, for the linkage of the linker to the DNA molecule are chosen so that the enzyme is able to ensure that a sufficient amount of linker is linked to the DNA molecules.
  • the person skilled in the art is familiar with the reaction conditions as a function of the enzyme selected.
  • reaction conditions when using T4 DNA ligase, the reaction conditions may be as follows:
  • the same or a different enzyme can be used as for the linkage of the linker (2) to the cut linker (l) DNA molecule.
  • the same enzyme is used for both linkages.
  • the enzyme is T4 DNA ligase.
  • step c) is the DNA Moloekül, which has a hydroxymethylated cytosine, as amplicon between two linkers each having a known nucleic acid sequence.
  • the hydroxymethylated site is adjacent to the linker (2).
  • the construct produced in method step c) is analyzed. Since the DNA molecule to be investigated, which has a hydroxymethylated cytosine, is located after the process steps a) to c) according to the invention between two linkers of known nucleic acid sequence, it is now possible to analyze the construct from process step c).
  • the analysis of the construct comprises amplification of the construct.
  • the amplification is a PCR. It is well known to those skilled in the art that PCR can be performed in various embodiments. Examples of analysis of the construct by PCR include, for example, end-point PCR. The person skilled in the art is aware of further embodiments of the PCR which are suitable for the method according to the invention.
  • the amplification is a sequencing. It is well known to those skilled in the art that sequencing can be performed in various embodiments. Examples of sequencing analysis of the construct include deep sequencing, next generation sequencing, or pyrosequencing when the amplified DNA is a single sequence. The skilled worker is aware of further embodiments of the sequencing which are suitable for the method according to the invention.
  • the sequencing is deep sequencing.
  • the sequencing is pyrosequencing.
  • the present invention relates to the use of a 5-hydroxymethylcytosine sensitive restriction endonuclease to identify 5-hydroxymethylcystosine in a DNA molecule.
  • the present invention relates to a kit for the identification of 5-hydroxymethylcytosine in a DNA molecule comprising a linker (1), an enzyme which can link DNA strands, a 5-hydroxymethylcytosine sensitive restriction endonuclease, a linker ( 2) and optionally an instruction for the method according to the invention.

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Abstract

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Identifikation von 5-Hydroxymethylcytosin in einem DNA-Molekül, einem Kit, um solch ein Verfahren durchzuführen sowie die Verwendung einer 5-Hydroxymethycytosin sensitiven Restriktionsendonuklease zur Identifikation von 5-Hydroxymethylcytosin in einem DNA- Molekül.

Description

Verfahren zur Identifikation von 5-Hvdroxymethylcvtosin Basen
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Identifikation von 5- Hydroxymethylcytosin in einem DNA-Molekül, einem Kit, um solch ein Verfahren durchzuführen sowie die Verwendung einer 5-Hydroxymethycytosin sensitiven Restriktionsendonuklease zur Identifikation von 5-Hydroxymethylcytosin in einem DNA- Molekül.
Hintergrund der Erfindung
Die Identifizierung von chemisch modifizierten Nukleotiden genomischer DNA gehört zu den wichtigsten Arbeitsfeldern in der epigenetischen Forschung. Insbesondere die Methylierung von Cytosinresten stellt ein wichtiges epigenetisches Merkmal dar. Die Methylierung und die Demethylierung genomischer DNA von Säugern geschieht dynamisch während der frühen Embryogenese und spielt eine wesentliche Rolle unter anderen bei der Entwicklung, der X- Chromosominaktivierung, beim Imprinting, bei der Entwicklung der Keimzellen, bei Transkription, dem Silencing von Retrotransposonen sowie bei der Tumorentstehung (siehe z.B. Ooi et al. (2009), J. Cell. Sei., 122:2787-2791 sowie den darin zitierten Referenzen). Beispielsweise tendieren Promotoren von aktiven Genen dazu, hypomethyliert zu sein, was darauf schließen lässt, dass der Grad der DNA-Methylierung mit der Expression der zugehörigen Gene korreliert (Weber et al. (2007), Curr. Op. Cell. Biol., 19:273-280).
Die DNA-Methylierung geschieht beispielsweise durch Methyltransferasen, Enzyme, die Cytosin in 5-Methylcytosin (5-mC) umwandeln können. In Säugerzellen hat 5-mC in etwa 1% Anteil an der Häufigkeit aller Basen und wird fast ausschliesslich als symmetrische Methylierung an CpG Stellen gefunden, was bedeutet, dass die Methylierung auf beiden komplementären Strängen der CpG Stelle vorhanden ist (Ehrlich und Wang (1981), Science, 212:1350-1357).
Es wurden mehrere Methoden im Stand der Technik beschrieben, um die Position von 5-mC Basen in DNA-Sequenzen zu identifizieren und zu detektieren. Das am weitesten verbreitete Verfahren ist die Behandlung von DNA mit Bisulfit, welches zur Deaminierung von allen nicht methylierten Cytosinbasen führt, wodurch Uracil entsteht (Herman et al. (1996), Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 93: 9821-9826). 5-mC reagiert nicht mit Bisulfit, so dass 5-mC Basen im DNA-Molekül aufrecht erhalten werden. Nach der Umwandlung der Cytosine in Uracil kann die Position der 5-Methylcytosine innerhalb des DNA-Moleküls dadurch bestimmt werden, dass die Basenpaarung verändert worden ist. Während 5-mC wie Cytosin eine Basenpaarung mit Guanin eingeht, geht Uracil hingegen eine Basenpaarung mit Adenin ein. Geeignete Verfahren, um die Position von 5-mC zu detektieren sind beispielsweise DNA- Sequenzierung, PCR, Oligonukleotid Ligation Assay, Einzelbasen-Extensionen und weitere dem Fachmann wohlbekannte Verfahren.
Weitere Verfahren, um den Methylierungszustand von DNA zu analysieren, basieren auf der enzymatischen Deaminierung von nicht methylierten Cytosinen. Beispielsweise beschreibt WO 2005005660 ein Verfahren, welches die schnelle Umwandlung von nicht methyliertem Cytosin in Uracil durch das Enzym Cytosin-Deaminase ausnutzt.
Vor wenigen Jahren wurde eine weitere methylierte Nukleobase entdeckt, 5- Hydroxymethylcytosin (5-hmC). Diese wird vermutlich gebildet, indem 5-mC oxidiert wird, ein Prozess, der durch die TET Familie von Cytosin-Oxygenasen katalysiert werden könnte (Kriaucionis und Heintz (2009), Science, 324(5929): 939-930). Diese Vermutung wird durch die Tatsache erhärtet, dass die 5-hmC Konzentration abnimmt, wenn TET1 depletiert wird (Tahiliani et al. (2009), Science, 324(5929):930-935). 5-hmC ist am häufigsten in der DNA des Gehirns, was eine Rolle in der epigenetischen Rolle der neuronalen Funktion nahe legt (Kriaucionis und Heintz, supra). Ungefähr 0,6% aller Nukleotide in Purkinje Zellen und 0,2% aller granulären Zellen sind 5-hmC, während es in Krebszelllinien nicht gefunden werden kann. Darüberhinaus kommt 5-hmC im Genom von embryonalen Maus Stammzellen vor, was auf eine Rolle als epigenetischer Marker während der Säugetierentwicklung hinweisen könnte.
Verfahren für die zuverlässige Identifikation von 5-hmC in DNA-Molekülen sind erforderlich, um weiter die Rolle dieser Modifikation als epigenetischen Marker und in regulatorischen Netzwerken zu untersuchen. Während die Behandlung der DNA mit Bisulfit ein geeigneter Weg ist, um nicht-methyliertes Cytosin und 5-mC zu unterscheiden, kann dieser Ansatz nicht verwendet werden, um die beiden methylierten Formen 5-mC und 5-hmC zu unterrscheiden, da beide Formen der Nukleobase Cytosin nicht mit Bisulfit reagieren.
Ein Verfahren wurde beschrieben, um spezifisch 5-hmC Reste in DNA-Molekülen zu detektieren. Dieses basiert auf der Glycosylierung von 5-hmC durch eine enzymatische Reaktion mit Hilfe von T4 ß-Glucosyltransferase (T4-BGT) und der anschließenden Restriktion der DNA durch Glykosylierungs-sensitive Endonukleasen. T4-BGT katalysiert spezifisch die Glycosylierung von 5-hmC in DNA-Molekülen, reagiert aber nicht mit Cytosin- oder 5-mC-Resten.
Jedes 5-hmC, welches innerhalb eines CCGG Sequenzmotivs vorkommt, verändert diese Stelle so, dass sie nicht mehr durch die Restriktionsendonuklease Mspl geschnitten werden kann.
Diese Art der Detektion von 5-hmC wird im EpiMark™ 5-hmC und 5-mC Analyse Kit von New England Biolabs verwendet. Dieses Verfahren ist jedoch nur geeignet, um 5-hmC Basen zu detektieren, die in CCGG Sequenzmotiven vorkommen. 5-hmC Reste, die nicht in dieser Restriktionsendonuklease Erkennungssequenz liegen, können durch dieses Verfahren nicht identifiziert werden. Weiterhin weist dieses Verfahren eine Reihe enzymatischer Schritte auf, so dass die Gefahr besteht, mögliche Fehler während der Reaktion zu akkumulieren.
Daher besteht ein Bedarf für verbesserte Verfahren, die es erlauben, 5-hmC Basen in einem DNA-Molekül spezifisch zu detektieren. Dieses Verfahren sollte einfach durchzuführen sein und möglichst wenige Schritte umfassen.
Die hier vorliegende Erfindung erfüllt diese Bedingungen und stellt ein neuartiges Verfahren zur Verfügung, um spezifisch 5-hmC modifizierte Nukleotide zu detektieren.
Beschreibung der Erfindung
In einem ersten Aspekt bezieht sich die vorliegende Erfindung auf ein Verfahren zur Identifikation von 5-Hydroxymethylcytosin in einem DNA-Molekül, aufweisend die folgenden Verfahrensschritte:
a) In Kontakt Bringen des DNA-Moleküls mit einem Linker (1) und einem Enzym, welches DNA-Stränge verknüpfen kann, unter Bedingungen, die den Linker (1) mit dem DNA-Molekül verknüpfen;
b) In Kontakt Bringen des Linker (l)-DNA-Moleküls mit einer 5-Hydroxymethylcytosin sensitiven Restriktionsendonuklease unter Bedingungen, die ein Schneiden des Linker (l)-DNA-Moleküls an hydroxymethylierten Stellen ermöglichen;
c) In Kontakt Bringen des geschnittenen Linker (l)-DNA-Moleküls mit einem Linker (2) und einem Enzym, welches DNA-Stränge verknüpfen kann, unter Bedingungen, die den Linker (2) an die geschnittene Stelle aus Verfahrensschritt b) verknüpft, so dass ein Linker (l)-DNA-Molekül-Linker (2) Konstrukt entsteht;
d) Analyse des in Verfahrensschritt c) entstandenen Konstruktes. Die vorliegende Erfindung basiert auf der Entdeckung, dass es Restriktionsendonukleasen gibt, die spezifisch solche DNA-Stränge schneiden, die hydroxymethylierte Cytosine aufweisen, methylierte oder unmethylierte jedoch nicht. Zu diesen Restriktionsendonukleasen gehört beispielsweise PvuRTSll (Szwagierczak et al. (2011), Nucleic Acids Res., 39:5149- 5156; Wang et al. (2011), Nucleic Acids Res., 39:9294-9305).
In einem ersten Schritt wird ein erster Linker (1) mittels eines geeigneten Enzyms an das DNA-Molekül verknüpft, welches auf das Vorhandensein von 5-hmC untersucht werden soll. In einen zweiten Schritt wird das Linker (l)-DNA-Molekül mit einer 5- Hydroxymethylcytosin sensitiven Restriktionsendonuklease in Kontakt gebracht unter Bedingungen, die ein Schneiden dieses Moleküls an hydroxymethylierten Stellen ermöglicht. In einem dritten Schritt wird an diese geschnittene Stelle ein zweiter Linker (2) mittels eines geeigneten Enzyms an das Linker (l)-DNA-Molekül verknüpft, so dass ein DNA-Molekül entsteht, dass an beiden Seiten von jeweils einem Linker eingeschlossen wird.
Mit Hilfe der bekannten Linker-Sequenzen kann das DNA-Molekül in einem vierten Schritt analysiert werden, beispielsweise mittels einer Amplifikations- oder einer Sequenzierungsreaktion.
Das DNA-Molekül, welches auf das Vorhandensein von 5-hmC mit dem erfindungsgemäßen Verfahren untersucht werden soll, kann ein synthetisch hergestelltes oder natürlich vorkommendes DNA-Molekül sein.
Bevorzugt ist das DNA-Molekül ein natürlich vorkommendes DNA-Molekül eines lebenden Organismus und wurde aus einer Probe dieses Organismus gewonnen.
Besonders bevorzugt handelt es sich bei dem DNA-Molekül um genomische DNA aus diesem Organismus.
In einer bevorzugten Ausführungsform stammt die biologische Probe, welche das zu untersuchende DNA-Molekül enthält, aus einem Säuger, in einer besonders bevorzugten Ausführungsform stammt diese von einem Menschen.
Die Probe kann Blut, Liquor, Plasma, Urin, Stuhl, eine Gewebeprobe oder jede andere DNA enthaltende Probe des Organismus sein.
Nach dem Trennen der Probe vom Organismus wird die Probe entsprechend behandelt, um die Isolation der DNA, die untersucht werden soll, zu gewährleisten. Geeignete Behandlungen solcher Proben sind dem Fachmann wohlbekannt. Beispielsweise können die Zellen der biologischen Probe, welche die DNA beinhalten, zerstört werden, um die DNA freizusetzen, beispielsweise durch eine French Press, durch wiederholte Einfrier- und Auftauzyklen oder durch Ultraschall. Dem Fachmann sind weitere geeignete Verfahren bekannt.
Die zellulären Reste können von den DNA-Bestandteilen abgetrennt werden, beispielsweise durch Zentrifugation oder Filtration.
Die von den Zellen abgetrennte DNA kann anschließend durch jedes beliebige Verfahren, welches im Stand der Technik bekannt ist, aufgereinigt werden. Beispielsweise kann die DNA durch Phenol-Chloroformextraktion, Aufreinigung über Minisäulen oder durch jedes beliebige Kit, welches für die Aufreinigung von DNA geeignet ist, insbesondere für die Aufreinigung von genomischer DNA aus biologischen Proben, aufgereinigt werden.
Geeignete Kits für die Aufreinigung von genomischer DNA aus unterschiedlichen Zell- oder Gewebetypen sind unter anderem der PAXgene blood DNA kit (QIAGEN, Deutschland) oder der QIAsymphony DNA Kit (QIAGEN, Deutschland). Dem Fachmann sind weitere geeignete Kits geläufig.
Das durch das Verfahren der vorliegenden Erfindung zu analysierende DNA-Molekül ist etwa 5, etwa 10, etwa 50, etwa 100, etwa 250, etwa 500, etwa 1000, etwa 10.000, etwa 100.000, oder mehr Nukleotide lang. Das DNA-Molekül umfasst bevorzugt ein Gen, einen Teil eines Gens oder eine regulatorische Sequenz, die die Transkription kontrolliert.
Das Verfahren der vorliegenden Erfindung ist geeignet, um Nukleotide in einem DNA- Molekül zu detektieren, das eine Cytosinbase aufweist, die durch einen 5-hmC Rest modifiziert ist.
Daher ist dieses Verfahren insbesondere geeignet, um den Methylierungsstatus eines DNA- Moleküls festzustellen, z.B. um Aufschluss über den Mechanismus zu erhalten, der die Genexpression durch dynamische DNA-Methylierungsprozesse kontrolliert.
Das DNA-Molekül ist bevorzugt genomische DNA, z.B. chromsomale DNA, die von einem Säuger, bevorzugt von einem Menschen, erhalten worden ist.
Das DNA-Molekül kann einzelsträngig oder doppelsträngig sein. Einzelsträngige DNA- Moleküle müssen zuvor durch dem Fachmann bekannte Verfahren in eine doppelsträngige DNA überführt werden, bevor sie dem erfindungsgemäßen Verfahren unterzogen werden können. Das von den Zellen abgetrennte und aufgereinigte DNA-Molekül wird in einem ersten Verfahrensschritt a) mit einem Linker (1) und einem Enzym, welches DNA-Stränge verknüpfen kann, in Kontakt gebracht. Die Bedingungen werden so gewählt, dass das Enzym den Linker (1) mit dem DNA-Molekül verknüpfen kann.
Bei den Linkern (1) und (2), die im erfmdungsgemäßen Verfahren Verwendung finden, handelt es sich jeweils um eine Nukleinsäure, die eine bekannte Sequenz aufweist. Dabei kann die Nukleotidabfolge des Linkers (1) mit der des Linkers (2) partiell identisch oder aber völlig unterschiedlich sein. Auch eine vollständige Indentität in der Nukleotidabfolge des Linkers (1) und des Linkers (2) ist möglich, wenn gewährleistet wird, dass nur ein bestimmtes Ende des Linkers an das DNA-Molekül ligiert wird. In diesem Fall kann das Konstrukt mit sense- und antisense-spezifischen Primern in Verfahrensschritt d) analysiert werden.
Die Linker können jeweils für sich eine Sequenz aufweisen, die mit der Sequenz eines Organismus identisch ist oder aber auch eine Sequenz aufweisen, die keine Sequenzhomologie zur Sequenz eines bestimmten Organismus aufweist. Für das erfindungsgemäße Verfahren spielt es keine Rolle, ob die für die Linker verwendete Nukleinsäure aus Ribonukleotiden oder Desoxyribonukleotiden aufgebaut ist, oder aus einer Mischung aus diesen Nukleotiden. Es muss jedoch gewährleistet sein, dass die in Verfahrensschritt d) zur Analyse verwendete Polymerase diese Nukleinsäure als Substrat verwenden kann.
Ebenso ist die Nukleotidabfolge für das erfindungsgemäße Verfahren nicht wesentlich, es muss jedoch gewährleistet sein, dass diese Nukleotidabfolge bekannt ist.
Ebenso kann die für die Linker verwendete Nukleinsäure vollständig oder teilweise aus modifizierten Nukleotiden aufgebaut sein, erfindungswesentlich ist lediglich, dass die Nukleotidabfolge bekannt sein muss. Zu den modifizierten Nukleotiden, die im erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden können, gehören beispielsweise methylierte Nukletide, Phosphorotioat modifizierte Nukleotide, Locked Nucleic Acids, 3-Amino modifizierte Nukleotide, ddNTPs sowie Nukleotide mit abasischen Modifikationen. Dem Fachmann sind weitere geeignete Nukleotide geläufig.
Der Linker (1) und der Linker (2) weisen jeweils eine Länge von 15 bis 150, bevorzugt von 25 bis 100, besonders bevorzugt von 30 bis 80 auf.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist der Linker (1) an einer festen Phase immobilisiert. Bei der festen Phase kann es sich um eine beliebige feste Phase handeln, die dafür geeignet ist, eine Nukleinsäure zu immobilisieren. Die Art der Immobilisierung der Nukleinsäure an diese feste Phase ist dabei beliebig, es muss nur gewährleistet sein, dass die an diese feste Phase immobilisierte Nukleinsäure noch für Nukleinsäuren modifizierende Enzyme sowie für Hybridisierungen zugänglich ist.
Die Immobilisierung der Nukleinsäure an die feste Phase kann reversibel oder irreversibel sein.
Beispielsweise kann die Nukleinsäure an Glasoberflächen erfolgen, bei der sowohl die Nukleinsäure als auch die feste Phase durch reaktive organische funktionelle Gruppen modifiziert sein können. Durch chemische Aktivierung mit Hilfe von geeigneten Reagenzien kann so eine kovalente Bindung zwischen Nukleinsäure und fester Phase erreicht werden.
Hierfür eignen sich beispielsweise funktionelle Gruppen wie Carboxyl-, Phosphat-, Aldehydoder Aminogruppen.
Dem Fachmann sind weitere geeignete Verfahren und chemische Modifikationen zur Immobilisierung einer Nukleinsäure an eine feste Phase, sowohl reversibel als auch irreversibel, bekannt.
Bei der festen Phase kann es sich um eine planare oder gebogene Fläche, um einen Partikel, um Säulenmaterial oder auch um die Oberfläche von Reaktionsgefäßen handeln. Weitere geeignete Oberflächen sind dem Fachmann geläufig.
Das Material der festen Phase ist nicht erfindungswesentlich. Seine Oberfläche muss lediglich dazu geeignet sein, eine Nukleinsäure reversibel oder irreversibel binden zu können. Es kann sich bei der Oberfläche beispielsweise um eine Silikaoberfläche, eine Nitrozelluloseoberfläche oder um eine funktionalisierte Glasoberfläche handeln. Weitere geeignete Oberflächen sind dem Fachmann geläufig. Bei dem Enzym, welches den Linker (1) und den Linker (2) an das DNA-Molekül verknüpft, kann es sich um ein beliebiges Enzym handeln, welches in der Lage ist, zwei Nukleinsäurestränge miteinander kovalent zu verknüpfen.
In einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei diesem Enzym um eine Ligase. Beispiele für geeignete Ligasen sind DNA Ligase aus E. coli und T4 DNA Ligase. Weitere DNA Ligasen sind dem Fachmann geläufig.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei der Ligase um T4 DNA Ligase. Dabei werden die Reaktionsbedingungen, beispielsweise Temperatur, Zeitdauer und Salzkonzentration, für die Verknüpfung des Linkers an das DNA-Molekül so gewählt, dass das Enzym in der Lage ist, dafür zu sorgen, dass eine ausreichende Menge Linker mit den DNA-Molekülen verknüpft wird. Dem Fachmann sind die Reaktionsbedingungen in Abhängigkeit des ausgewählten Enzyms geläufig.
Beispielsweise können die Reaktionsbedingungen bei Verwendung von T4 DNA Ligase wie folgt gewählt sein:
10 μΙ_ 2Χ Ugation Buffer IX
Χ μΙ. Fragment 1-10 ng/ μΐ
X μΙ_ Linker 1-10 ng/ μ_
Ι μί T4 DNA Ligase (600 U/ μί) 30 U/ μί
Χ μί Water N/A
20 μί Total Volume Dem Fachmann ist wohlbekannt, dass jedes geeignete Enzym auch bei für es nicht optimalen Reaktionsbedingungen eine ausreichende Aktivität aufweisen kann.
Für die Verknüpfung des Linker (1) an das DNA-Molekül kann dasselbe oder ein unterschiedliches Enzym verwendet werden wie für die Verknüpfung des Linkers (2) an das geschnittene Linker (l)-DNA-Molekül.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird für beide Verknüpfungen dasselbe Enzym verwendet.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei dem Enzym dabei um T4 DNA Ligase. Sofern das DNA-Molekül, welches auf das Vorhandensein von 5-hmC untersucht werden soll, für die Verknüpfung des Linkers (1) an das DNA-Molekül und für die weiteren Verfahrensschritte noch zu lang ist, kann das DNA-Molekül zuvor einer Fragmentierung in kürzere DNA-Moleküle unterworfen werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform liegt die Länge des DNA-Moleküls für die erfindungsgemäßen Verfahrensschritte zwischen 50 und 300 Nukleotiden, jedoch können auch längere oder kürzere DNA-Moleküle eingesetzt werden.
Diese Fragmentierung kann durch jedes dem Fachmann bekannte Verfahren durchgeführt werden, so zum Beispiel durch mechanische Fragmentierung, Beschallung, Nebulisierung, hydrodynamische Scherung oder enzymatische Fragmentierung. Dem Fachmann sind weitere Verfahren zur Fragmentierung von DNA-Molekülen geläufig. In einer weiteren Ausführungsform kann vor der Verknüpfung des Linkers (1) an das DNA- Molekül noch ein Verfahrensschritt durchgeführt werden, bei dem eine Anreicherung von 5- Hydroxymethylcytosin aufweisenden DNA-Molekülen stattfindet. Dieser Verfahrensschritt dient insbesondere der Vor-Anreicherung der zu untersuchenden DNA-Moleküle, wenn zu erwarten ist, dass eine 5-hmC Modifikation nur in wenigen Bereichen der zu untersuchenden DNA vorkommt.
Diese Vor-Anreicherung von 5-hmC DNA-Molekülen kann durch verschiedene Verfahren durchgeführt werden.
Beispielsweise kann eine Präzipitation 5-hydroxymethylierter DNA-Moleküle mit Hilfe von für diese Modifikation spezifischen Antikörpern durchgeführt werden. Eine weitere Möglichkeit besteht beispielsweise darin, die 5 -hydroxymethylierten DNA-Moleküle durch geeignete chemische Substanzen zu präzipitieren.
Nach der Präzipitation der 5-hmC DNA-Moleküle besteht die Möglichkeit, durch einen optionalen Waschschritt die Antikörper oder die chemischen Substanzen, die zur Präzipitation verwendet wurden, wieder zu entfernen.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird vor der Verknüpfung des Linker (1) an das DNA-Molekül sowohl eine Fragmentierung des DNA-Moleküls in kürzere DNA-Moleküle durchgeführt, als auch eine spezifische Präzipitation 5-hydroxymethylierter DNA-Moleküle durchgeführt.
In einem weiteren Verfahrensschritt b) wird das verknüpfte Linker (l)-DNA-Molekül mit einer 5-Hydroxymethylcytosin sensitiven Restriktionsendonuklease in Kontakt gebracht unter Bedingungen, die ein Schneiden des Linker (l)-DNA-Moleküls an hydroxymethylierten Stellen ermöglichen.
Geeignete Restriktionsendonukleasen für diesen Verfahrensschritt sind solche, welche in der Lage sind, in ihrer Reaktionseffizienz zwischen unmethylierten, methylierten und hydroxymethylierten Cytosinen unterscheiden zu können.
Bevorzugt werden in diesen Verfahrensschritt solche Restriktionsendonukleasen eingesetzt, die an hydroxymethylierten Cytosinen mit hoher Effizienz schneiden, bei methylierten und unmethylierten Cytosinen jedoch nur mit geringer oder gar keiner Effizienz. In einer bevorzugen Ausführungsform handelt es sich bei der Restriktionsendonuklease um PvuRTsI. Dieses weist eine Restriktionseffizienz für 5-hmC von etwa 95% auf, während sowohl unmethylierte als auch 5-mC Nukleotide nur mit sehr geringer Effizienz geschnitten werden. PvuRTsI schneidet an der Sequenz "CNn-u/ ^ioG, so dass das geschnittene DNA-Molekül einen Überhang von 2 Nukleotiden aufweist, wobei das Ende dieses DNA-Moleküls, welches mit dem Linker (1) verknüpft ist, ein hydroxymethyliertes Cytosin an der geschnittenen Stelle aufweist. Die Reaktionsbedingungen, bei denen das Linker (l)-DNA -Molekül mit einer Restriktionsendonuklease in Kontakt gebracht wird, beispielsweise Temperatur, Zeitdauer und Salzkonzentration, sind so gewählt, dass das Enzym in der Lage ist, an hydroxymethylierten Cytosinen zu schneiden. Für das erfindungsgemäße Verfahren ist es ausreichend, wenn nur ein geringer Prozentsatz der hydroxymethylierten Cytosine geschnitten wird, da diese geschnittenen DNA-Moleküle andere Enden aufweisen als nicht geschnittene DNA-Moleküle und so von diesen leicht unterschieden werden können. Da im Verfahreschschritt d) bei der Analyse eine Vervielfältigung des Signals, beispielsweise durch eine PCR, stattfinden kann, ist ein geringer Prozentsatz an geschnittenen hydroxymethylierten Cytosinen für das erfindungsgemäße Verfahre ausreichend.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird ein Prozentsatz von mehr als 30%, von mehr als 50%, von mehr als 70%, von mehr als 90% aller hydroxymethylierten Cytosine in Verfahrensschritt b) geschnitten.
Dem Fachmann sind die Reaktionsbedingungen in Abhängigkeit des ausgewählten Enzyms geläufig. Dem Fachmann ist wohlbekannt, dass jedes geeignete Enzym auch bei für es nicht optimalen Reaktionsbedingungen eine ausreichende Aktivität aufweisen kann.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird nach diesem Verfahrensschnitt b) ein Waschschritt eingefügt, in dem das Restriktionsenzym sowie die geschnittenen, nicht an eine feste Phase immobilisierten DNA-Moleküle, entfernt werden.
In einem weiteren Verfahrensschritt c) wird das geschnittene Linker (l)-DNA-Molekül mit einem Linker (2) und einem Enzym, welches DNA-Stränge verknüpfen kann, unter Bedingungen, die den Linker (2) an die geschnittene Stelle aus Verfahrensschritt b) verknüpft, so dass ein Linker (l)-DNA-Molekül-Linker (2) Konstrukt entsteht. Bei den Linkern (1) und (2), die im erfindungsgemäßen Verfahren Verwendung finden, handelt es sich jeweils um eine Nukleinsäure, die eine bekannte Sequenz aufweist. Dabei kann die Nukleotidabfolge des Linkers (1) mit der des Linkers (2) partiell identisch oder aber völlig unterschiedlich sein. Auch eine vollständige Indentität in der Nukleotidabfolge des Linkers (1) und des Linkers (2) ist möglich, wenn gewährleistet wird, dass nur ein bestimmtes Ende des Linkers an das DNA-Molekül ligiert wird. In diesem Fall kann das onstrukt mit sense- und antisense-spezifischen Primern in Verfahrensschritt d) analysiert werden.
Die Linker können jeweils für sich eine Sequenz aufweisen, die mit der Sequenz eines Organismus identisch ist oder aber auch eine Sequenz aufweisen, die keine Sequenzhomologie zur Sequenz eines bestimmten Organismus aufweist. Für das erfindungsgemäße Verfahren spielt es keine Rolle, ob die für die Linker verwendete Nukleinsäure aus Ribonukleotiden oder Desoxyribonukleotiden aufgebaut ist, oder aus einer Mischung aus diesen Nukleotiden. Es muss jedoch gewährleistet sein, dass die in Verfahrensschritt d) zur Analyse verwendete Polymerase diese Nukleinsäure als Substrat verwenden kann.
Ebenso ist die Nukleotidabfolge für das erfindungsgemäße Verfahren nicht wesentlich, es muss jedoch gewährleistet sein, dass diese Nukleotidabfolge bekannt ist.
Ebenso kann die für die Linker verwendete Nukleinsäure vollständig oder teilweise aus modifizierten Nukleotiden aufgebaut sein, erfindungswesentlich ist lediglich, dass die Nukleotidabfolge bekannt sein muss. Zu den modifizierten Nukleotiden, die im erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden können, gehören beispielsweise methylierte Nukletide, Phosphorotioat modifizierte Nukleotide, Locked Nucleic Acids, 3-Amino modifizierte Nukleotide, ddNTPs sowie Nukleotide mit abasischen Modifikationen. Dem Fachmann sind weitere geeignete Nukleotide geläufig.
Der Linker (1) und der Linker (2) weisen jeweils eine Länge von 15 bis 150, bevorzugt von 25 bis 100, besonders bevorzugt von 30 bis 80 auf.
Bei dem Enzym, welches den Linker (1) und den Linker (2) an das DNA-Molekül verknüpft, kann es sich um ein beliebiges Enzym handeln, welches in der Lage ist, zwei Nukleinsäurestränge miteinander kovalent zu verknüpfen.
In einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei diesem Enzym um eine Ligase. Beispiele für geeignete Ligasen sind DNA Ligase aus E. coli und T4 DNA Ligase. Weitere geeignete DNA Ligasen sind dem Fachmann bekannt. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei der Ligase um T4 DNA Ligase.
Dabei werden die Reaktionsbedingungen, beispielsweise Temperatur, Zeitdauer und Salzkonzentration, für die Verknüpfung des Linkers an das DNA-Molekül so gewählt, dass das Enzym in der Lage ist, dafür zu sorgen, dass eine ausreichende Menge Linker mit den DNA-Molekülen verknüpft wird. Dem Fachmann sind die Reaktionsbedingungen in Abhängigkeit des ausgewählten Enzyms geläufig.
Beispielsweise können die Reaktionsbedingungen bei Verwendung von T4 DNA Ligase wie folgt gewählt sein:
10 μ_ 2Χ Ligation Buffer IX
Χ μ_ Fragment 1-10 ng/ \xl
Χ μί Linker 1-10 ng/ xL
Ι μί T4 DNA Ligase (600 U/ μί) 30 U/ μί
Χ μί Water N/A
20 μί Total Volume
Dem Fachmann ist wohlbekannt, dass jedes geeignete Enzym auch bei für es nicht optimalen Reaktionsbedingungen eine ausreichende Aktivität aufweisen kann.
Für die Verknüpfung des Linker (1) an das DNA-Molekül kann dasselbe oder ein unterschiedliches Enzym verwendet werden wie für die Verknüpfung des Linkers (2) an das geschnittene Linker (l)-DNA-Molekül.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird für beide Verknüpfungen dasselbe Enzym verwendet.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei dem Enzym dabei um T4 DNA Ligase.
Nach diesem Verfahrensschritt c) befindet sich das DNA-Moloekül, welches ein hydroxymethyliertes Cytosin aufweist, als Amplikon zwischen zwei Linkern mit jeweils bekannter Nukleinsäuresequenz. Dabei ist die hydroxymethylierte Stelle dem Linker (2) benachbart.
In einem weiteren Verfahrensschritt d) wird das in Verfahrensschritt c) entstandene Konstrukt analysiert. Da sich das zu untersuchende DNA-Molekül, welches ein hydroxymethyliertes Cytosin aufweist, nach den erfindungsgemäßen Verfahrensschritten a) bis c) zwischen zwei Linkern mit bekannter Nukleinsäuresequenz befindet, ist es nun möglich, das Konstrukt aus Verfahrensschritt c) zu analysieren.
In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst die Analyse des onstruktes eine Amplifikation des Konstruktes.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei der Amplifikation um eine PCR. Dem Fachmann ist wohlbekannt, dass eine PCR in verschiedenen Ausführungsformen durchgeführt werden kann. Beispiele für die Analyse des Konstruktes mittels PCR umfasst beispielsweise Endpunkt-PCR. Dem Fachmann sind weitere Ausführungsformen der PCR bekannt, die für das erfindungsgemäße Verfahren geeignet sind.
In einer weiteren besonders bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei der Amplifikation um eine Sequenzierung. Dem Fachmann ist wohlbekannt, dass eine Sequenzierung in verschiedenen Ausführungsformen durchgeführt werden kann. Beispiele für die Analyse des Konstruktes mittels Sequenzierung umfasst Deep Sequencing, Next Generation Sequencing, oder auch Pyrosequencing, wenn es sich bei der amplifizierten DNA um eine einzelne Sequenz handelt. Dem Fachmann sind weitere Ausführungsformen der Sequenzierung bekannt, die für das erfindungsgemäße Verfahren geeignet sind.
In einer darüber hinaus besonders bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei der Seqeunzierung um Deep Sequencing.
In einer weiteren besonders bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei der Sequenzierung um Pyrosequencing. In einem weiteren Aspekt bezieht sich die vorliegende Erfindung auf die Verwendung einer 5- Hydroxymethylcytosin sensitiven Restriktionsendonuklease zur Identifikation von 5- Hydroxymethylcystosin in einem DNA-Molekül.
In einem weiteren Aspekt bezieht sich die vorliegende Erfindung auf ein Kit zur Identifikation von 5-Hydroxymethylcytosin in einem DNA-Molekül aufweisend einen Linker (1), ein Enzym, welches DNA-Stränge verknüpfen kann, eine 5-Hydroxymethylcytosin sensitive Restriktionsendonuklease, einen Linker (2) sowie optional eine Anweisung für das erfindungsgemäße Verfahren.

Claims

Ansprüche 1) Verfahren zur Identifikation von 5-Hydroxymethylcytosin in einem DNA-Molekül, aufweisend die folgenden Verfahrensschritte a) In Kontakt Bringen des DNA-Moleküls mit einem Linker (1) und einem Enzym, welches DNA-Stränge verknüpfen kann, unter Bedingungen, die den Linker (1) mit dem DNA-Molekül verknüpfen; b) In Kontakt Bringen des Linker (l)-DNA-Moleküls mit einer 5-Hydroxymethylcytosin sensitiven Restriktionsendonuklease unter Bedingungen, die ein Schneiden des Linker
(1) -DNA-Moleküls an hydroxymethylierten Stellen ermöglichen;
c) In Kontakt Bringen des geschnittenen Linker (l)-DNA-Moleküls mit einem Linker
(2) und einem Enzym, welches DNA-Stränge verknüpfen kann, unter Bedingungen, die den Linker (2) an die geschnittene Stelle aus Verfahrensschritt b) verknüpft, so dass ein Linker (l)-DNA-Molekül-Linker (2) Konstrukt entsteht;
d) Analyse des in Verfahrensschritt c) entstandenen Konstruktes.
2) Verfahren gemäß Anspruch 1), dadurch gekennzeichnet, dass vor Verfahrensschritt a) aus Anspruch 1) eine Fragmentierung des DNA-Moleküls in kürzere DNA- Moleküle erfolgt.
3) Verfahren gemäß Anspruch 1), dadurch gekennzeichnet, dass vor Verfahrensschritt a) aus Anspruch 1) eine Anreicherung von 5-Hydroxymethylcytosin aufweisenden DNA-Molekülen stattfindet.
4) Verfahren gemäß Anspruch 1), dadurch gekennzeichnet, dass vor Verfahrensschritt a) aus Anspruch 1) eine Fragmentierung der DNA in kürzere DNA-Moleküle erfolgt und anschließend eine Anreicherung von 5-Hydroxymethylcytosin aufweisenden DNA-Molekülen stattfindet.
5) Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1) bis 4), dadurch gekennzeichnet, dass der Linker (1) in Verfahrensschritt b) aus Anspruch 1) an einer festen Phase immobilisiert ist.
6) Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1) bis 5), dadurch gekennzeichnet, dass die Restriktionsendonuklease in Verfahrensschritt c) aus Anspruch 1) PvuRTsll ist. 7) Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1) bis 6), dadurch gekennzeichnet, dass das Enzym, das das DNA-Molekül mit einem Linker in den Verfahrensschritten a) und c) aus Anspruch 1) verknüpft, eine Ligase ist.
8) Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1) bis 7), dadurch gekennzeichnet, dass die Analyse des onstruktes in Verfahrensschritt d) aus Anspruch 1 eine Amplifikation umfasst.
9) Verfahren gemäß Anspruch 8), dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei der Amplifikation um eine PCR handelt.
10) Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1) bis 7), dadurch gekennzeichnet, dass die Analyse des Konstruktes in Verfahrensschritt d) aus Anspruch 1 eine Sequenzierung umfasst.
11) Verfahren gemäß Anspruch 10), dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei der Sequenzierung um Deep Sequencing handelt.
12) Verfahren gemäß Anspruch 10), dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei der Sequenzierung um Pyrosequencing handelt.
13) Verwendung einer 5-Hydroxymethylcytosin sensitiven Restriktionsendonuklease zur Identifikation von 5-Hydroxymethylcytosin in einem DNA-Molekül.
14) Kit zur Identifikation von 5-Hydroxymethylcytosin in einem DNA-Molekül, aufweisend
a) einen Linker (1);
b) ein Enzym, welches DNA- Stränge verknüpfen kann;
c) eine 5-Hydroxymethylcytosin sensitive Restriktionsendonuklease;
d) einen Linker (2);
e) optional eine Anweisung für ein Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1) bis 12).
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