WO2014090152A1

WO2014090152A1 - 神经生长因子在制备用于治疗中老年男性性功能低下综合征的药物中的用途

Info

Publication number: WO2014090152A1
Application number: PCT/CN2013/089052
Authority: WO
Inventors: 黄亚东; 苏志坚; 葛仁山; 项琪; 张齐好; 肖飞
Original assignee: 广州暨南大学医药生物技术研究开发中心; 暨南大学
Priority date: 2012-12-14
Filing date: 2013-12-11
Publication date: 2014-06-19
Also published as: CN103861087A; CN103861087B; JP2015525787A; JP6026659B2

Abstract

本发明提供了神经生长因子在制备用于治疗中老年男性性腺功能低下综合征的药物中的用途，主要是用于制备治疗因垂体分泌促黄体生成激素降低或睾丸间质细胞衰老而导致的人体睾酮含量下降的药物，其中所述神经生长因子来源于人、小鼠或大鼠，优选来源于人。所述神经生长因子的氨基酸序列如SEQ ID No:1-3所示。

Description

神经生长因子在制备用于治疗中老年男性性功能低下综合征的药物中的用途

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，涉及神经生长因子的第二医学用途。具体而言，本发明涉及人神经细胞生长因子在制备用于治疗中老年男性性功能低下综合征的药物中的用途。可以通过鼻腔给药或睾丸静脉注射的途径施用人、大鼠和小鼠来源的神经细胞生长因子来治疗人类中老年男性迟发性性腺功能低下综合征。背景技术

人类迟发性性腺功能低下综合征 (late onset hypogonadism in males, LOH)为中老年男性多发的一种与老龄相关的睾丸机能减退，其主要特征包括性欲和勃起质量（特别是夜间勃起）减退、情绪改变伴有脑力和空间定向能力下降、瘦体量（Lean body mass, LBM) 减少伴肌肉容积和肌力下降、体毛减少和皮肤改变、骨密度下降以及内脏脂肪增加等（王玺坤，等，中华男科学杂志， 2012， 18 ( 5)： 475 - 477；郭应禄和李宏军，中华男科学杂志， 2004， 10 ( 8)： 563 - 566)。迟发性性腺功能低下综合征一般好发于 45 - 55岁，也可以早至 40岁或延迟到 65岁，而发病原因与下丘脑 -垂体 -睾丸轴系的功能减退和睾丸间质细胞衰退有关（Wang 等， J. Androl. , 2009， 32 ( 1 )： 1 - 10; Chen等， Endocrindogy, 2002， 143 ( 5)： 1637 - 1642)。

睾丸间质细胞（leydig cell, LC) 是一种具有合成和分泌睾酮功能的细胞，是雄性体内雄激素的最主要来源。人体血清中的睾酮是间质细胞受脑垂体分泌的促黄体生成激素（Luteinizing hormone, LH) 剌激而产生的，并受一系列负反馈机制调节。临床研究表明，男性下丘脑-垂体轴功能随着年龄增长而逐渐下降，从而导致促黄体生成激素脉冲释放的幅度减弱，最终影响睾丸间质细胞合成和分泌雄性激素（陈为想等，内蒙古中医药， 2012,31 ( 5)： 117 - 118. )。此外，睾丸间质细胞在分化发育过程中分为四个显著不同的阶段：间质干细胞（Stem leydig cell, SLC)、间质祖细胞 (Progenitor leydig cell, PLC)、幼稚型间质细胞（Immature leydig cell, ILC) 和成年型间质细胞（Adult leydig cell, ALC)。而这些发育过程中由于增殖分化异常、数量减少及激素合成分泌功能减退也会导致体内雄激素缺乏 (Ge等， Biol. Reprod. , 2005， 72 (6)： 1405 - 1415； 5. Ge 等， Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2006， 103： 2719 - 2724)。

现时，临床上治疗中老年迟发性性腺功能低下综合征主要通过睾酮补充疗法，然而，该疗法除了需要定期注射睾酮以外，还存在显著的安全性问题。首先，长期定量补充睾酮会使患者易生痤疮并患红细胞增多症；其次，容易造成血清睾酮浓度的大幅度波动，进而引起患者情绪和迟发性性腺功能低下综合征症状的明显起伏；再次，患者容易出现水、钠潴留及阴茎异常勃起、排尿困难等不良反应，甚至肝肾功能受损及引发前列腺癌等疾病（史虹莉，中国临床保健杂志， 2009,12 (4)： 386 - 388；范晓博等，中华男科学杂志， 2010， 16 ( 1 )： 68 - 71 )。

神经生长因子（nerve growth factor, NGF)是哺乳动物中最重要的生物活性分子之一，分布在大脑、颌下腺、心脏、虹膜、皮肤及睾丸等组织中。对于神经系统，神经生长因子具有促进神经元发育、轴突生长、递质合成及抑制神经细胞凋亡等功能；而对于心血管、免疫、生殖等其它系统，神经生长因子主要表现在调节免疫系统功能、抑制部分肿瘤细胞的有丝分裂以及促进创口愈合等（Tuszynski等， 2005， Nature Medicine 11 : 551 - 555)。

天然的神经生长因子由 α、 β、 γ三个亚单位组成，其主要活性位点为 β 亚单位。在神经系统中，神经生长因子与受体（nerve growth factor receptor, NGFR)结合后，通过神经生长因子受体介导的内吞机制内在化，形成轴膜包绕小泡，经轴突沿微管逆行转运至胞体。最后，经酪氨酸蛋白激酶、脂酰肌醇钙、内源性环腺苷酸等第二信使体系的转导，启动一系列级联反应而发挥其生物学效应（Ribatti等， Int. J. Exp. Pathol. , 2009， 90 (6)： 615 - 620)。目前，小鼠来源的神经生长因子已经被开发为人注射用神经保护类药物，药物品牌包括恩经复（厦门北大之路生物工程有限公司）、金路捷（武汉海特生物制药股份有限公司）和苏肽生（北京舒泰神药业有限公司）。而大鼠来源的神经生长因子及通过基因工程方式获得的人神经生长因子亦已证明具有相同的生物学功能（Lou et al.， 2012, Neuroscience, 223: 225-237)。

除了在神经系统分布较多以外，神经生长因子和神经生长因子受体也广泛存在于睾丸组织中。近年来研究证实，神经生长因子可以通过自分泌或者旁分泌的方式作用于生精细胞（Spermatogenic Cell),支持细胞（Sertoli Cell) 和睾丸间质细胞（LC) , 促进精子的形成和成熟、睾酮的合成和分泌以及睾丸组织的发育（郝玉娟和张映，国外畜牧学， 2011， 31 (2) : 89-90)。而前人亦已利用眼镜蛇毒神经生长因子治疗男性生殖缺陷及降低棉酚对雄性生精功能影响（ZL 00116192.X) , 但对神经生长因子能否用于治疗迟发性性腺功能低下综合征尚未有报道。发明内容

本发明的主要目的在于提供神经生长因子在制备用于治疗中老年男性性腺功能低下综合征的药物中的用途。在该应用中，可以通过鼻腔给药或者睾丸静脉注射的方式将神经生长因子或其与其他相关治疗剂的组合物送入患者体内，用以促进垂体增加促黄体生成激素分泌及诱导睾丸间质干细胞的增殖分化，从而增加睾丸和血清中睾酮含量，最终改善或者治愈中老年男性性功能低下综合征。

由于神经生长因子已经成为商品化的药物，其组成，结构和性质都是已知，不同药物剂型的制备也是本领域的常规知识，因此，在神经生长因子的新用途已经能够确认的前提下，由神经生长因子和相应载体制备的不同药物剂型也能被本领域技术人员容易实现。

用于本发明的神经生长因子可以包括，但不限于，人神经生长因子，小鼠神经生长因子和大鼠神经生长因子。优选地，本发明所用的神经生长因子为其 β亚基氨基酸序列，更优选地，所述神经生长因子的氨基酸序列如 SEQ ID No: 1-3所示。

本领域技术人员应该理解，用于本发明的神经生长因子可以从相应地动物体或组织中提取（主要是小鼠神经生长因子和大鼠神经生长因子），或者通过基因工程方法在适当的表达宿主中表达获得相应的重组神经生长因子。本发明人在研究中发现，以神经生长因子为主要有效成分制备的治疗中老年男性性腺功能低下综合征药物的作用如下：

1. 所述药物对快速老化鼠血清和睾丸中睾酮偏低的治疗作用

以雄性快速老化小鼠 ( Senescence-accelerated mouse prone-8， SAM P8，

32 周龄， 26±2 克 /只）作为研究对象，并选用同源正常小鼠 ( Senescence-accelerated resistant mouse prone- 1， SAM Rl， 32周齿令， 26士 2 克 /只）作为正常对照组。将小鼠神经生长因子用 0.9%的生理盐水稀释至 1 毫克 /毫升（m_g/mL)，然后按照 250 微克 /公斤体重 g/kg) 通过滴鼻方式给药，每 2天给药一次，连续给药 5周。模型组则以雄性快速老化小 It ( Senescence-accelerated mouse prone-8 , SAM P8 , 32周齿令， 26士 2克 /只) 作为研究对象，与正常对照组一样，用 0.9%生理盐水进行滴鼻，溶液量及给药时间与实验组相同。实验结束后，收集血清和睾丸。然后利用放射性免疫检测方法检测血清以及睾丸内睾酮的含量，荧光定量链式聚合酶方法和蛋白杂交方法检测睾酮合成和分泌过程中几个限速酶的表达情况。在血清睾酮含量分析方面，神经生长因子治疗组小鼠的血清中，其睾酮的平均含量为 18.09纳克 /毫升（n_g/ml)，为正常组的 12.3倍，而仅以生理盐水作为安慰剂的模型组，其血清中的睾酮含量仅为正常对照组的 5.1%。而在睾丸内睾酮含量分析方面，小鼠神经生长因子治疗组小鼠睾丸内睾酮含量与正常对照组的相当，两者间没有显著差异，但均比模型组的高 2.5倍。这个实验结果表明，神经生长因子能够极显著地改善快速老化鼠血清和睾丸中睾酮的含量。由于睾酮的合成和分泌是睾丸间质细胞受脑垂体分泌的促黄体生成激素（Luteinizing hormone, LH)剌激而产生的，因此，用滴鼻方式进入脑部的小鼠神经生长因子可以作用于下丘脑和垂体，从而改善和增加睾丸分泌睾酮的功能。进一歩的分子机制研究表明，相对于生理盐水处理的模型组，小鼠神经生长因子处理组小鼠睾丸间质细胞中的急性激素调控蛋白 ( Steroidogenic acute regulatory protein, Star) 的表达量显著上升 2 倍以上，这个结果说明，小鼠神经生长因子处理组小鼠的血液中促黄体生成激素增多并调控睾丸间质细胞合成更多的睾酮。

2. 所述药物促进快速老化鼠睾丸间质干细胞的增殖和分化

睾丸间质细胞在分化发育过程中分为四个显著不同的阶段：间质干细胞（ Stem leydig cell, SLC)、间质祖细胞（Progenitor leydig cell, PLC)、幼稚型间质细胞（Immature leydig cell, ILC)和成年型间质细胞（Adult leydig cell, ALOo 而这些发育过程中由于增殖分化异常、数量减少及激素合成分泌功能减退也会导致体内雄激素缺乏。睾丸间质细胞发育分化一般只限于胚胎发生和青春期初期，而成年型间质细胞一旦形成，即使在雄性进入衰老状态，其数量也不会发生显著变化。然而，近年来有研究表明，间质干细胞可以重新增殖并分化成新的年型间质细胞。而间质细胞的再生过程也是经历了间质祖细胞、幼稚型间质细胞和成年型间质细胞阶段，且所有的雄激素合成酶的信使核糖核酸（mRNA) 表达及其生理功能都与正常的睾丸间质细胞没有显著性差异。这个结果有力地说明，睾丸中存在"沉默" 状态的间质干细胞，这些细胞可以再次增殖和分化发育到具有睾酮合成能力的成年型间质细胞，而这种再生能力与雄性年龄无关（Stanley et al, 2012_: Endocrinology, 153(10): 5002—5010)。

将雄性 Sprague-Dawley大鼠（12-16周龄， 250±20克 /只，购自中山大学实验动物中心，许可证号： SCXK2011-0029 ) 于实验前 7天腹腔注射乙垸二甲垸硫砜（Ethane dimethane sulfonate, EDS) (90毫克 /公斤体重， mg/kg ) , 二氧化碳窒息处死后，取出睾丸，然后分离曲细精管，于 DMEM/F-12培养基中（含 0.1% 小牛血清白蛋白）， 34°C培养 16小时。然后，将曲细精管分至 24孔板，加入不同浓度的大鼠神经生长因子及促黄体生成激素处理 24小时。用荧光染色剂对细胞核进行染色，激光共聚焦及荧光显微镜观察，结果表明，单独使用促黄体生成激素（LH)并不能 "激活 "SLC，而大鼠神经生长因子则可以促进 SLC的显著增殖并开始分化，且该增殖效果与大鼠神经生长因子呈浓度依赖效应（图 4)。此外， SLC 是分布在曲细精管表面，且神经生长因子和神经生长因子受体也广泛存在于睾丸组织中，因此，含大鼠神经生长因子的药物可通过睾丸静脉注射诱导 SLC进行增殖分化。

进一歩的研究表明，利用含 100纳克 /毫升（ng/ml) 人神经生长因子、 0.1%小牛血清白蛋白及 1 纳克 /毫升（ng/ml) 促黄体生成激素的培养基 ( Dulbecco's Modification of Eagle's Medium/Ham's F-12, DMEM/F- 12 ) 连续培养曲细精管 8周后，培养液中的睾酮已经可以检测到，最高达到 5.4 纳克 /孔 (ng/well, 图 5 )。这个结果可以说明，促黄体生成激素及人神经生长因子可以促进睾丸间质干细胞增殖和分化发育至成体间质细胞，并能合成和分泌睾酮。

上述研究结果充分证明小鼠、大鼠以及人源的神经生长因子可以单独或以与其他相关药剂组合成药物组合物的形式用于治疗中老年男性性腺功能低下综合征，其中所述的药物组合物形式，包括滴鼻剂、针剂或者针粉剂。此外，药物组合物可以含有其他的相关活性成分，还可以含有稳定剂、改变渗透压的盐、缓冲液、或抗氧化剂。

因此，在本发明的另一个方面，本发明还提供一种治疗中老年男性迟发性性腺功能低下综合征的方法，所述方法包括：将大鼠神经生长因子、小鼠神经生长因子或者通过基因工程方法获得人源神经生长因子，以 40 微克 /公斤体重（ g/kg) 的剂量通过滴鼻给药方式施用至受试者（主要是患有迟发性性腺功能低下综合征的中老年男性），隔天一次，一共给药 10 次作为一个疗程，每个疗程结束后检测血液中睾酮的含量，依据血液中睾酮的含量判断是否还需要进行下一疗程的治疗，直至血液中睾酮的含量达到正常水平；或者，也可以将大鼠神经生长因子、小鼠神经生长因子或者通过基因工程方法获得人源神经生长因子，以 1-3微克 /公斤体重 g/kg) 的剂量通过睾丸静脉给药方式施用至受试者（主要是患有迟发性性腺功能低下综合征的中老年男性），每周一次，一共给药 4次作为一个疗程，每个疗程结束后检测血液中睾酮的含量，依据血液中睾酮的含量判断是否还需要进行下一疗程的治疗，直至血液中睾酮的含量达到正常水平。附图说明

从下面结合附图的详细描述中，本发明的上述特征和优点将更明显，其中：

图 1 : 曲细精管表面睾丸间质干细胞增殖和分布（绿色荧光部分显示正在进行核酸复制活动的细胞核）， LH= 促黄体生成激素（LH， 280 ng/ml) +胰岛素-转铁蛋白-亚硒酸钠培养基添加剂（Insulin- Transferrin- Sodium Selenite， ITS )， PDGF AA=胰岛素-转铁蛋白 -亚硒酸钠培养基添加剂（ITS ) + 血小板衍生生长因子 AA (PDGF AA) , NGF 200 =胰岛素-转铁蛋白-亚硒酸钠培养基添加剂（ITS) + 大鼠神经生长因子（200ng/ml); NGF100= 胰岛素-转铁蛋白-亚硒酸钠培养基添加剂（ITS) +大鼠神经生长因子（100 ng/ml); NGF10 =胰岛素-转铁蛋白-亚硒酸钠培养基添加剂（ITS) +大鼠神经生长因子 10 (10 ng/ml); 血小板衍生生长因子 AA (PDGF AA) 的浓度为 10纳克 /毫升（ng/ml), 促黄体生成激素（LH) 浓度为 280 纳克 / 毫升（ng/ml), 处理 24小时后， Click-iT® EdU HCS Assays试剂盒（货号： C10352, 购自 Invitrogen 公司）进行核染色，奥林巴斯 (Olympus) 荧光显微镜（100 X ) 拍照；

图 2: 大鼠神经生长因子诱导睾丸间质干细胞增殖分析；

图 3:睾酮合成通路上关键酶基因表达的定量分析，大鼠神经生长因子的工作浓度为 200纳克 /毫升（ng/ml), 100纳克 /毫升（ng/ml), 10纳克 /毫升（ng/ml )，血小板衍生生长因子 AA (PDGF AA)的浓度为 10纳克 / 毫升（ng/ml), 促黄体生成激素（LH)浓度为 280纳克 /毫升（ng/ml), 处理时间为 72 小时，而后分别将含有上述各种细胞因子的培养基更换为胰岛素-转铁蛋白-亚硒酸钠培养基添加剂（ITS) +促黄体生成激素（LH) 的培养基继续培养至第 21天，每 3.5天更换一次培养基，收集第 14天和第 21天样品提取核糖核酸（RNA), 逆转录试剂盒（购自 Invitrogen 公司，货号： 11753500) 反转录 1 微克（μ^ RNA, 荧光定量链式聚合酶反应 (Polymerase Chain Reaction, PCR) 检测各个基因的表达情况。胰岛素-转铁蛋白-亚硒酸钠培养基添加剂（ITS) 组作为对照组，内参为核糖体蛋白 S16基因（RPS16,其引物序列由深圳华大基因研究院合成）， *** /?<0.001， ** p<0.0\, */?<0.05， vs ITS. n=5_; a*** P < 0.001， b** P < 0.01禾口 c*P < 0.05，促黄体生成激素（LH)， n=5。

图 4:放射性免疫方法分析培养基中睾酮含量，人神经生长因子的浓度为 200纳克 /毫升（ng/ml), 100纳克 /毫升（ng/ml), 10纳克 /毫升（ng/ml), 血小板衍生生长因子 AA (PDGFAA) 的浓度为 10纳克 /毫升（ng/ml), 促黄体生成激素（LH) 浓度为 280纳克 /毫升（ng/ml), 处理时间为 72小时，而后将含有分别将含有上述各种细胞因子的培养基更换为胰岛素 -转铁蛋白-亚硒酸钠培养基添加剂（ITS) +促黄体生成激素（LH) 的培养基继续培养至第 21天，每 3.5天更换一次培养基，收集第 14天和第 21天的培养基上清，放射性免疫试剂盒（购自北京北方生物技术研究所，货号：

B10TFB)检测上清睾酮。胰岛素-转铁蛋白-亚硒酸钠培养基添加剂（ITS) 组作为对照组，内参为 40S核糖体蛋白 S16基因（RPS16, 其引物序列由华大基因研究院合成）， * P<0.05, **Ρ<0.01和 *** Ρ<0.001 对照组 a*** P<0.00\, b** P<0.0\和 c* P<0.05, vs 促黄体生成激素（LH)， vs 促黄体生成激素（LH) n=5。

图 5: 快速老化鼠血清睾酮含量分析，正常小鼠为同系的 SAM R1 系列，模型组小鼠为 SAMP8小鼠（购自天津中医药大学，合格证号： W -J津实动质 M准字第 006号， 26±2克 /只），小鼠神经生长因子组小鼠的给药剂量为 250 微克 /公斤体重（ g/kg), 隔天鼻腔给药，连续给药 5 周，眼球取血，收集血清，放射性免疫方法检测体内睾酮， ***Ρ<0.001 τ¾ 正常

图 6: 快速老化鼠睾丸内睾酮含量分析，将睾丸去除被膜后，放入匀浆器，按 1:5 (质量：体积）的比例加入预冷的磷酸盐缓冲液， 4°C摇床过夜，次日以 3000转 /分钟离心 15分钟后取上清， -20°C保存，放射性免疫法检测睾酮， ** Ρ<0.01τ¾对照， η=4。

图 7:快速老化鼠睾丸间质细胞内合成和分泌睾酮的关键酶基因定量 PCR检测分析，小鼠神经生长因子组小鼠的给药剂量为 250 微克 /公斤体重 g/kg)，鼻腔隔天给药，连续给药 5周，睾丸样品提取核糖核酸 (RNA), 逆转录试剂盒（购自 Invitrogen 公司，货号： 11753500)反转录 1微克（μ^ 核糖核酸（RNA), 42°C逆转录 30分钟后， 85°C处理 5分钟终止反应。 40S 核糖体蛋白 S16基因（RPS16, 其引物序列由华大基因研究院合成）作为内参，荧光定量链式聚合酶反应（PCR) 检测睾酮合成通路上相关酶的表达情况， * P < 0.05， **Ρ <0.01和 <0.001，· ^对照 η=4。

图 8:快速老化鼠曲细精管内支持细胞睾酮转运蛋白基因的表达分析情况，小鼠神经生长因子组小鼠的给药剂量为 250微克 /公斤体重 g/kg), 鼻腔隔天给药，连续给药 5周，睾丸样品提取核糖核酸（RNA), 逆转录试剂盒反转 1微克 g)核糖核酸（RNA), 42°C逆转录 30分钟后， 85°C 处理 5分钟终止反应。 40S核糖体蛋白 S16基因（RPS16, 其引物序列由华大基因研究院合成）作为内参，荧光定量链式聚合酶反应（PCR) 检测睾酮合成通路上相关酶的表达情况， < 0.05， ** Ρ <0.01和 < 0.001; ^对照 η=4。

图 9:快速老化鼠睾丸总蛋白杂交检测结果分析，小鼠神经生长因子组小鼠的给药剂量为 250微克 /公斤体重 g/kg)，鼻腔隔天给药，连续给药 5周，睾丸样品提取蛋白，蛋白杂交方法检测蛋白表达情况。荧光定量链式聚合酶反应（PCR)检测睾酮结合蛋白（Androgen Bingding Protein, ABP) 基因的表达情况， * P < 0.05， ** Ρ <0.01和 <0.001,ra对照 n=4。序列表说明

具体实施方式

下面参照具体的实施例进一歩描述本发明，但是本领域技术人员应该理解，本发明并不限于这些具体的实施例。

另外，本领域技术人员应该理解，除非另外指明，下述实施例中所用的试剂均为市售试剂。

实施例 1: 检测大鼠神经生长因子对大鼠睾丸间质细胞的促增殖作用

材料： Comm_g 12孔板（购自美国康宁公司，货号: 3336)，睾酮放射性免疫检测试剂盒（购自北京北方生物技术研究所，货号： B10TFB ) , 人神经生长因子（购自西格玛奥德里奇上海贸易有限公司，货号： N1408-.1MG) , 大鼠神经生长因子（购自西格玛奥德里奇上海贸易有限公司，货号： N2513-1MG)或者小鼠神经生长因子（购自西格玛奥德里奇上海贸易有限公司，货号： SRP4304-20UG) , 胰岛素-转铁蛋白 -亚硒酸钠培养基添加剂（ITS ,购自西格玛奥德里奇上海贸易有限公司，货号： 11884)，促黄体生成激素（LH，购自西格玛奥德里奇上海贸易有限公司，货号: L9773 ) , 乙垸二甲垸硫砜（EDS , 由中山大学化工学院合成，合成方法参见 Jackson H. Comparative effects of some antispermatogenic chemicals. In: Segal SJ, Crazier R, Corfman PA, Cordliffe PC, eds. The regulation of mammalian reproduction. Illinois: Springfield Press, 1973; 257-268. )， Click-iT® EdU HCS Assays检测试剂盒（购自美国 life technologies公司，货号： C10352) , DMEM/F-12培养基（购自美国 life technologies公司，货号： 0930152DK) , Bio-Rad cDNA合成试剂盒和 Bio-Rad SYBR荧光染料

(购自美国 Bio-Rad公司，货号： 170-8890、 170-8880)，总 RNA抽提试剂盒（购自德国 QIAGEN公司，货号： 74104)。

雄性 Sprague-Dawley大鼠（购自广东省医学动物实验中心， 12周龄， 250±20克 /只）实验前 7天腹腔注射乙垸二甲垸硫砜（EDS , 90毫克 /公斤体重），二氧化碳处死后，将睾丸取出，置于冰冷的磷酸缓冲液中，剪除被膜，将曲细精管分离成单根后，于 DMEM/F-12培养基中（含 0.1% 牛血清白蛋白和 lx胰岛素-转铁蛋白 -亚硒酸钠培养基添加剂） 34°C， 5% 二氧化碳的条件下培养过夜。次日，将曲细精管分至 24孔板中，加入不同浓度的细胞因子（即，血小板衍生生长因子 AA或者神经生长因子）处理曲细精管，具体分组为胰岛素-转铁蛋白-亚硒酸钠培养基添加剂（ITS )组

(阴性对照），促黄体生成激素（LH) +胰岛素-转铁蛋白-亚硒酸钠培养基添加剂（ITS)组，血小板衍生生长因子 AA (PDGF AA) +胰岛素-转铁蛋白-亚硒酸钠培养基添加剂（ITS) 组（阳性对照组），胰岛素-转铁蛋白-亚硒酸钠培养基添加剂（ITS ) + 大鼠神经生长因子组，大鼠神经生长因子的浓度为 200 纳克 /毫升（n_g/ml)， 100纳克 /毫升（n_g/ml)， 10纳克 /毫升

(ng/ml) , 血小板衍生生长因子 AA (PDGF AA) 的浓度为 10纳克 /毫升

(ng/ml) , 促黄体生成激素（LH) 浓度为 280 纳克 /毫升（ng/ml) , 处理 24小时后， Click-iT® EdU HCS Assays试剂盒（购自 Invitrogen 公司，货号： C10352 , ) 进行核染色（如图 1 )。

结果显示，大鼠神经生长因子处理组中， 200纳克 /毫升（ng/ml) , 100 纳克 /毫升（ng/ml) 和 10纳克 /毫升（ng/ml) 的剂量都可以促进间质干细胞（Stem Leydig Cell, SLC) 的增殖，但是与 100纳克 /毫升（ng/ml) 和 10纳克 /毫升（ng/ml) 处理组相比， 200纳克 /毫升（ng/ml)处理组能够显著地促进睾丸间质干细胞（SLC) 的增殖（P < 0.001 对照：)，并且其促增值作用要强于促黄体生成激素（LH)处理组，说明大鼠神经生长因子对睾丸间质干细胞（SLC) 的促进作用存在剂量依赖效应。实施例 2: 检测大鼠神经生长因子对大鼠睾丸间质干细胞的促分化作用雄性 SPRAGUE-DAWLEY大鼠（购自广东省医学动物实验中心， 12 周龄， 250±20 克 /只）实验前 7天腹腔注射乙垸二甲垸硫砜（EDS, 90 毫克 /公斤体重），二氧化碳处死后，将睾丸取出，置于冰冷的磷酸缓冲液中，剪除被膜，血管与曲细精管剥离，将曲细精管分离成单根，于 DMEM/F-12 培养基中（含 0.1% 牛血清白蛋白和 lx胰岛素-转铁蛋白-亚硒酸钠培养基添加剂） 34°C， 5% 二氧化碳的条件下培养过夜。次日，将曲细精管分至 24孔板，加入大鼠神经生长因子处理，大鼠神经生长因子的浓度为 200纳克 /毫升（n_g/ml)， 100纳克 /毫升（n_g/ml)， 10纳克 /毫升（n_g/ml)，血小板衍生生长因子 AA (PDGF AA) 的浓度为 10纳克 /毫升（ng/ml)，促黄体生成激素（LH) 浓度为 280纳克 /毫升（n_g/ml)，处理时间为 72小时，而后分别将含有上述各种细胞因子的培养基更换为胰岛素-转铁蛋白 -亚硒酸钠培养基添加剂（ITS) +促黄体生成激素（LH) 的培养基继续培养至第 21天，每 3.5天更换一次培养基，收集第 14天和第 21天的培养基上清待测睾酮，收集第 14天和 21天样品提取 RNA, 逆转录试剂盒（购自 Invitrogen 公司，货号： 11753500 ) 反转录 1微克（μ^核糖核酸（RNA) , 42°C逆转录 30分钟后， 85°C处理 5分钟终止反应， 40S核糖体蛋白 S16基因（40S核糖体蛋白 S16 基因（RPS16, 其引物序列由华大基因合成）作为内参，荧光定量 PCR检测睾酮合成通路上相关酶的表达情况（如图 2)。

第 14天，各处理对睾酮合成通路中各个酶的表达情况影响不一，类固醇激素合成急性调节蛋白（ Steroidogenic acute regulatory protein, StAR) 基因方面，大鼠神经生长因子 100纳克 /毫升（ng/ml) 组显著地促进了类固醇激素合成急性调节蛋白（StAR), 羟基 -δ-5-类固醇脱氢酶， 3 beta-and 固酉享 δ异构酶 1 ( hydroxy-delta-5 -steroid dehydrogenase, 3 beta- and steroid delta-isomerase 1， hsd3bl ) 禾 Π 17β-羟基类固醇脱氢酶 3 (hydroxysteroid (17-beta) dehydrogenase 3， hsd 17b3 )三个基因的上调表达，其促表达作用明显优于促黄体生成激素（LH) 处理组；而大鼠神经生长因子 200纳克 / 毫升（ng/ml) 组促进了 17β-羟基类固醇脱氢酶 3 (Hsdl7b3 ) 和 5α-还原酶 1 ( steroid-5-alpha-reductase， Srd5al ) 基因的表达上调，而没有影响类固醇激素合成急性调节蛋白（StAR), 羟基 -δ-5-类固醇脱氢酶， 3 β和类固醇 δ异构酶 1 (hsd3bl )基因的表达；神经生长因子 10纳克 /毫升（ng/ml) 组均没有对几个基因的表达出现明显地促进作用。第 21 天，大鼠神经生长因子 200纳克 /毫升（ng/ml)组，大鼠神经生长因子 100纳克 /毫升（ng/ml) 组和神经生长因子 10 ng/ml组均显著地促进了类固醇激素合成急性调节蛋白（StAR), 羟基 -δ-5-类固醇脱氢酶，3 beta-and固醇 δ异构酶 1 (hsd3bl ) 和 17β-羟基类固醇脱氢酶 3 (hsd 17b3 ) 三个基因的上调表达，大鼠神经生长因子 200纳克 /毫升（ng/ml) 组的促进作用明显优于促黄体生成激素

(LH) 组，而大鼠神经生长因子 100纳克 /毫升（ng/ml) 组和神经生长因子 10纳克 /毫升（ng/ml) 组的促进作用不如促黄体生成激素（LH) 组明显。在 5α-还原酶 1 ( Srd5al ) 基因方面，大鼠神经生长因子 10纳克 /毫升

(ng/ml) 促进其高表达，其作用效果与促黄体生成激素（LH) 组基本一致。而大鼠神经生长因子 200纳克 /毫升（ng/ml) 组和神经生长因子 100 纳克 /毫升（ng/ml) 组均没有促进其高表达（图 3 )。实施例 3: 放射性免疫方法分析培养基中睾酮含量

取 90天 SAM R1小鼠（3月龄，体重 26 ± 2 g)，无菌状态下用镊子抽取其睾丸中的曲细精管，用磷酸缓冲液冲洗 6次后，再用 DMEM/F-12 培养基冲洗 3次，加入终浓度为 375 微克 /毫升（ug/ml) 的乙垸二甲垸硫砜（EDS )至含 0.1%的小牛血清白蛋白的 DMEM/F-12培养基中，处理 24 小时。洗涤 3次后，换新鲜培养基，然后置于 34°C及 5%二氧化碳的环境中培养，每隔 3.5天换一次含有不同浓度（10、 100和 200纳克 /毫升）的人神经生长因子、黄体生成激素（LH)和血小板衍生生长因子 AA (PDGF AA) 的细胞培养基。最后通过放射性免疫方法分析培养基中睾酮含量。实验结果表明， 14天时，神经生长因子 10纳克 /毫升（ng/ml) 明显促进睾酮的分泌，其余各组均没有出现明显变化； 21天时，各处理组的睾酮分泌均出现明显上调，尤其以大鼠神经生长因子 10纳克 /毫升（ng/ml)处理组的睾酮变化最为明显；各神经生长因子处理组的促睾酮分泌能力与促黄体生成激素（LH)组相比，均没有明显差异，说明其促进睾酮分泌的能力与促黄体生成激素（LH) 组差异不大（图 4)。

实施例 4: 神经生长因子对快速老化鼠的治疗作用

雄性 SAM P8和 SAM R1小鼠（购自天津中医药大学第一附属医院动物中心， 8月龄，体重 26 ± 2 g) 12只：模型组 5只，小鼠神经生长因子组 5只，正常组 5只；鼻腔隔天给药，连续给药 5周，神经生长因子组的给药量为 250微克 /公斤体重 g/kg); 眼球取血，收集睾丸，放射性免疫方法检测体内睾酮；荧光定量脸上聚合酶反应和蛋白杂交方法检测几个酶在不同水平的表达情况。放射性免疫检测结果显示，神经生长因子能够显著恢复模型组小鼠血清中和睾丸内的睾酮含量。其内睾酮的恢复水平与正常组相当（图 5-6); 荧光定量 PCR的结果显示，在睾酮合成通路类固醇激素合成急性调节蛋白（StAR), 胆固醇侧链裂解酶（cytochrome P450, family 11, subfamily a, polypeptide 1, Cypllal )，羟基 -δ-5-类固醇脱氢酶， 3 β 和类固醇 δ异构酶 1 (hsd3bl )， 17β-羟基类固醇脱氢酶 3 (Hsdl7b3 ) , 5α- 还原酶 1 ( Srd5al ) 的表达方面，小鼠神经生长因子处理组胆固醇侧链裂解酶（Cypllal ) 基因的表达出现明显的上调迹象（图 7，图 9)，与睾酮运输有关的雄激素结合蛋白（ABP) 基因的表达也出现明显上调迹象（图 8 )，其血清睾酮和睾丸睾酮的恢复可能与这两个基因表达的大量上调有关。应该理解，尽管参考其示例性的实施方案，已经对本发明进行具体地显示和描述，但是本领域的普通技术人员应该理解，在不背离由权利要求书所定义的本发明的精神和范围的条件下，可以在其中进行各种形式和细节的变化，可以进行各种实施方案的任意组合。因此，本发明的范围包括在权利说明书等同目的和范围内的所用修改。

Claims

权利要求书：

1. 神经生长因子在制备用于治疗中老年男性性功能低下综合征的药物中的用途。

2. 权利要求 1所述的用途，其中所述神经生长因子来源于人、小鼠或大鼠。

3. 权利要求 1 所述的用途，其中所述神经生长因子的氨基酸序列如 SEQ ID No: 1-3所示。

4. 权利要求 1所述的用途，其中所述药物除了包含有效量的神经生长因子外还包含一种或多种其他有效用于治疗老年男性性功能低下综合征的药物活性成分，例如促黄体生成激素、血小板衍生生长因子 AA。

5. 权利要求 1所述的用途，其中所述药物的剂型包括滴鼻剂、针剂或针粉剂。

6. 一种治疗中老年男性性功能低下综合征的药物，所述药物包含治疗有效量的神经生长因子作为主要活性成分以及药学上可接受的载体。

7. 权利要求 6所述的药物，其中所述神经生长因子来源于人、小鼠或大鼠。

8. 权利要求 6 所述的药物，其中所述神经生长因子的氨基酸序列如 SEQ ID No: 1-3所示。

9. 权利要求 6所述的药物，其中所述药物还包含一种或多种其他有效用于治疗老年男性性功能低下综合征的药物活性成分，例如促黄体生成激素、血小板衍生生长因子 AA。

10. 权利要求 6所述的药物，其中所述药物的剂型包括滴鼻剂、针剂或针粉剂。

11. 一种用于治疗受试者中的中老年男性性功能低下综合征的方法，所述方法包括给所述受试者施用有效量的神经生长因子，其中所述神经生长因子的氨基酸序列如 SEQ ID No: 1-3所示。

12. 权利要求 11所述的方法，所述方法还包括给所述受试者施用一种或多种其他有效用于治疗老年男性性功能低下综合征的药物活性成分，例如促黄体生成激素、血小板衍生生长因子 AA。