WO2014087100A1 - Utilisation de biotine greffee pour le dosage de metaux dans une solution et kit de dosage - Google Patents

Utilisation de biotine greffee pour le dosage de metaux dans une solution et kit de dosage Download PDF

Info

Publication number
WO2014087100A1
WO2014087100A1 PCT/FR2013/052937 FR2013052937W WO2014087100A1 WO 2014087100 A1 WO2014087100 A1 WO 2014087100A1 FR 2013052937 W FR2013052937 W FR 2013052937W WO 2014087100 A1 WO2014087100 A1 WO 2014087100A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
solution
molecule
biotin
use according
uranium
Prior art date
Application number
PCT/FR2013/052937
Other languages
English (en)
Inventor
Nicolas DROGAT
Julien VERGNAUD
Loïc JAUBERTY
Tan-Sothea OUK
Romain VILLEGER
Robert Granet
Vincent CHALEIX
Vincent SOL
Vincent Gloaguen
Original Assignee
Universite De Limoges
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Universite De Limoges filed Critical Universite De Limoges
Publication of WO2014087100A1 publication Critical patent/WO2014087100A1/fr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D311/00—Heterocyclic compounds containing six-membered rings having one oxygen atom as the only hetero atom, condensed with other rings
    • C07D311/02—Heterocyclic compounds containing six-membered rings having one oxygen atom as the only hetero atom, condensed with other rings ortho- or peri-condensed with carbocyclic rings or ring systems
    • C07D311/78—Ring systems having three or more relevant rings
    • C07D311/80—Dibenzopyrans; Hydrogenated dibenzopyrans
    • C07D311/82—Xanthenes
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N31/00—Investigating or analysing non-biological materials by the use of the chemical methods specified in the subgroup; Apparatus specially adapted for such methods
    • G01N31/22—Investigating or analysing non-biological materials by the use of the chemical methods specified in the subgroup; Apparatus specially adapted for such methods using chemical indicators
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/5308—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for analytes not provided for elsewhere, e.g. nucleic acids, uric acid, worms, mites
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/84—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving inorganic compounds or pH

Definitions

  • the present invention relates to the use of particular molecules for the detection and determination of metals in aqueous or organic solutions.
  • the invention also specifically relates to a new molecule and its use for the determination of uranium as well as a dedicated kit.
  • alpha spectrometry which gives very good results
  • fluorescence or inductively coupled plasma mass spectrometry ICP-MS
  • the volumes needed for the analysis are very important, which still poses problems of implementation in practice.
  • the number of samples that can be analyzed during a single manipulation is small.
  • the existing techniques do not allow an immediate diagnosis.
  • the time for the analysis is very long and incompatible with the deadlines of the targeted applications.
  • the treatment plants must be able to adjust the decontamination processes quickly, which they can not do today given the analysis times. Indeed, the time required to obtain the results can reach a week due in particular to sample preparation time of several days and relatively long counting time.
  • the objective of the invention is to overcome the disadvantages of existing processes and to provide a method for the rapid assay of toxic metals on the ground, simple to implement, allowing the analysis of a larger number of samples , with a reduced sample volume, a limited material investment and a non-harmful use for health.
  • the invention aims to use at least one biotin molecule grafted with at least one M molecule to determine the presence and / or dose in a solution of an element E selected from the following metals: Mercury, Lead, Copper, Cadmium, Arsenic, Cobalt, Iron, Aluminum, Nickel, Chromium, Zinc and Uranium, the molecule M being a molecule capable of fixing said element E.
  • an element E selected from the following metals: Mercury, Lead, Copper, Cadmium, Arsenic, Cobalt, Iron, Aluminum, Nickel, Chromium, Zinc and Uranium, the molecule M being a molecule capable of fixing said element E.
  • biotin grafted with an M molecule associated with a biotin labeling system, makes it possible to detect and / or assay the presence of the metal E capable of binding to the molecule M, using techniques simple known visualization.
  • This may be, for example, enzymatic labeling of biotin which makes it possible to detect the presence of the desired metal E by a color change which can be evaluated with the naked eye or with the aid of a device, particular of a spectrophotometer.
  • the invention allows for an extremely short measurement time and a limited hardware investment which allows a rapid dosing (between one and four hours) from a reduced number and volume of samples, and directly in the field, without the need for transfer to an analytical laboratory.
  • the reagents used are not harmful, unlike those potentially used in conventional methods.
  • the invention also relates to the use of a biotin molecule grafted with at least one particular molecule M, namely a bisphosphonate, to determine the presence and / or dose of the amount of uranium in a solution.
  • the invention also encompasses the biotinylated bisphosphonate molecule that can be used to determine the presence and / or dosage of the amount of Uranium in a solution, as follows:
  • X2 a molecular chain composed of one or more of the following: C, H, O, N, P, S.
  • the invention also relates to a kit for detecting Uranium based on the use of biotin grafted with a molecule M.
  • FIG. 1 a schematic representation of a first embodiment of a use according to the invention
  • Figure 2 a schematic representation of a second embodiment of a use according to the invention
  • FIG. 3 a schematic representation of a variant of the second embodiment of a use according to the invention
  • the invention therefore relates to the use of at least one biotin molecule grafted with at least one M molecule to determine the presence and / or dose amount in a solution of an element E selected from the following metals: Mercury, lead , Copper, Cadmium, Arsenic, Cobalt, Iron, Aluminum, Nickel, Chromium, Zinc and Uranium, the molecule M being a molecule capable of fixing said element E.
  • an element E selected from the following metals: Mercury, lead , Copper, Cadmium, Arsenic, Cobalt, Iron, Aluminum, Nickel, Chromium, Zinc and Uranium
  • the molecule M being a molecule capable of fixing said element E.
  • the molecule M is a molecule on which element E attaches when M and E are in contact.
  • binding within the meaning of the invention is meant a complexation between at least two molecules.
  • the molecule M can be a phosphate or a phosphonate in the case where the desired metal E is Uranium, or the molecule M can be a cysteine or a glutathione in the case where the desired metal E is Arsenic .
  • Biotin is grafted with the M molecule to form a BM molecule.
  • the grafting is carried out by any means known to those skilled in the art.
  • Biotin and the molecule M may optionally be separated by an organic spacer to form the BM molecule.
  • the use according to the invention consists in the implementation of a method comprising the following steps: a) fixing at the bottom of a container (10) at least one molecule M, capable of fixing said element E,
  • Step a) consists of functionalizing the bottom of a container (10) with at least one molecule M.
  • the molecule M is a molecule on which the element E binds when M and E are in solution.
  • M and M may be the same or different.
  • M is a molecule M, as shown in Figure 1.
  • the attachment of the molecule M to the bottom of the container (10) can be done by any suitable means.
  • the attachment can be carried out by nucleophilic substitution, electrophilic substitution, cycloaddition or electrostatic fixation. In practice, this step a) is carried out upstream, and a container already functionalized with the molecule M
  • Step b) consists in depositing the solution (12), the sample in which it is necessary to determine the presence and / or dosage of the desired amount of element E.
  • Solution (12) corresponds to the solution sample taken directly or to the pre-prepared sample of sample solution depending on the medium of origin, so that the solution is exploitable, for example in terms of pH conditions, redox, so that the metal E has a speciation allowing it to interact better with M, M and BM.
  • the volume of solution (12) required for use according to the invention is preferably at least 1mL, preferably between 1 and 10mL.
  • the element (s) E contained in the solution (12) introduced into the container (10) are fixed on the molecules M ⁇
  • Step c) consists in adding to the container (10) at least one BM molecule.
  • These BM molecules are specifically fixed via the motif M on the elements E already fixed on the molecules M themselves fixed to the bottom of the container (10).
  • 100 ⁇ l of a concentrated BM solution at 100 ⁇ g / ml is preferably added.
  • a Z enzyme capable of binding to biotin is then added to the container (10) in step d).
  • This enzyme Z may in particular be an avidin-peroxidase or a streptavidin-peroxidase.
  • the added Z enzymes bind irreversibly to the biotin pattern of the BM molecule.
  • 100 ⁇ l of a solution Z obtained by a dilution of 1/2000 of a stock solution is preferably added.
  • a substrate S of this enzyme capable of coloring the solution is then added. It may be, for example, tetramethylbenzidine (TMB), 3,3'-diaminobenzidine (DAB), 2,2'-azino-bis (3'-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid) (ATBS), or still ophenylenediamine dihydrochloride (OPD).
  • TMB tetramethylbenzidine
  • DAB 3,3'-diaminobenzidine
  • ATBS 2,2'-azino-bis (3'-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid)
  • OPD still ophenylenediamine dihydrochloride
  • the substrate S may be, for example, tetramethylbenzidine (TMB) which causes a coloration which changes from colorless to blue.
  • the contact time after addition of the substrate is at least 1 minute, preferably between 1 and 60 minutes.
  • a reagent is added to stop the enzymatic reaction and stabilize the intensity of the coloration.
  • It is preferentially an acid solution, in particular a sulfuric acid, phosphoric acid or hydrochloric. This is particularly the case when Z is an avidin peroxidase or a streptavidin peroxidase and S is tetramethylbenzidine (TMB).
  • the final color (which has changed from blue to yellow, for example in the case of TMB) is stable.
  • the last step of the method consists in determining the presence of the element E by colorimetric measurement.
  • this step consists in reading the optical density of the solution (12) in particular, using a spectrophotometer. This makes it possible to quantify the concentration of the analytes as a function of the absorption intensity at a given wavelength.
  • the use according to the invention consists in the implementation of a method comprising the following steps:
  • Step a) consists in functionalizing the bottom of a container (10) with at least one molecule F.
  • the molecule F is a molecule on which biotin binds when a biotin group and F are in contact.
  • the molecule F may for example be avidin or streptavidin.
  • Fixing the molecule F at the bottom of the container (10) can be done by any suitable means.
  • the attachment may be by nucleophilic substitution or electrostatic interactions.
  • this step a) is performed upstream, and a container already functionalized with the F molecule is used.
  • Step b) consists in depositing the solution (12), the sample in which it is necessary to determine the presence and / or dosage of the desired amount of metal E.
  • Solution (12) corresponds to the solution sample taken directly or to the pre-prepared sample of sample solution depending on the medium of origin, so that the solution is exploitable, for example in terms of pH conditions, redox, so that the metal E has a speciation allowing it to interact better with M, F and BM.
  • the volume of solution (12) required for use according to the invention is at least 1mL, preferably between 1 and 10mL.
  • Step c) then consists in adding to the solution (12) at least two BM molecules. These molecules bind specifically via the motif M on the element (s) E present (s) in the solution (12) to form BM-E-MB complexes. For each complex, one of the two free biotin units is fixed on a molecule F fixed to the bottom of the container (10).
  • the BM molecules are introduced into the solution (12) to be analyzed before they are introduced into the container (10).
  • the BM-E-MB complexes are thus formed in the solution (12) before introduction into the container (10).
  • step b) consists in adding to the solution (12) in which it is necessary to determine the presence and / or quantity of the element E, at least two molecules BM, and step c) in add the solution (12) to the container (10).
  • Steps d) and e) are identical to those of the first embodiment.
  • the container (10) may be any suitable container, preferably a well disposed on a multi-well plate of the microplate type.
  • the different steps may be optionally followed by one or more washes with a buffer solution, to eliminate the excess of molecules that have not been fixed and may interfere with the assay. (BM and Z in particular).
  • the invention is particularly advantageous for detecting the presence and / or selective dosing of Mercury, Lead, Copper, Cadmium, Arsenic, Cobalt, Iron, Aluminum, Nickel, Chromium, Zinc or Uranium in various aqueous or organic solutions.
  • the invention can be used in particular to analyze the element E pollution in streams, bodies of water or drinking water, or to control the E-element depollution of a solution after a depolluting treatment.
  • the use according to the invention is fast (one to four hours), easy and effective. It provides an alternative to long and complex assays for control and analysis laboratories and for health authorities, and enables them to carry out early screening, for example by spectrophotometry, which can be performed in the field.
  • the use according to the invention makes it possible to determine the toxic metals E in their overall form. There is no need to discriminate the shape of the metal in solution, except where the nature of the pollution (natural, industrial or military), the metals can be enriched in certain isotopes depending on its source.
  • the use according to the invention can be applied specifically to the detection and / or the determination of Uranium.
  • the element E is Uranium
  • the molecule M is a bisphosphonate
  • the molecule BM is a biotinylated bisphosphonate corresponding to the following formula:
  • X2 a molecular chain composed of one or more of the following: C, H, ⁇ , ⁇ , P, S.
  • This biotinylated biphosphonate molecule is an object of the invention. It can be obtained by grafting a bisphosphonate on a biotin by any suitable grafting method known to those skilled in the art. Biotin and bisphosphonate can be linked directly or via an organic spacer.
  • the biotinylated bisphosphonate molecule according to the invention can be used specifically for the detection and / or assaying of uranium, by the implementation of the processes described above and illustrated in particular in FIGS. 1 and 2.
  • the molecule M is a bisphosphonate or di-biphosphonate clamp. This bisphosphonate may be identical or different from the molecule M.
  • the method according to the invention using biotinylated bisphosphonate may be useful for any application requiring the determination of uranium in solution. It can be used in particular to analyze the uranium pollution in watercourses or bodies of water, to control the uranium depollution of solutions after treatment, to monitor the radionuclides contained in rainwater or even, for Assay uranium in urine samples including exposed workers (mining, nuclear, military, etc.). It is useful for monitoring the decontamination process, for example to control the saturation of the barks contained in the treatment stations as described in the patent application F -0.957.024.
  • the invention also provides an in situ uranium assay kit comprising biotinylated bisphosphonate molecules.
  • the invention provides a kit for the detection of uranium in solution, comprising in particular:
  • microplate the bottoms of which are functionalized with a bisphosphonate or streptavidin or an avidin,
  • biotinylated bisphosphonate in powder form or in solution,
  • the kit also comprises:
  • biotin grafted with a molecule M useful according to the invention is a biotinylated alendronate corresponding to the following formula:
  • This molecule can be synthesized according to the following synthesis scheme:
  • This synthesis consists in using biotin-NHS which is a form of activated biotin via an N-hydroxysuccinimidyl group which catalyzes the nucleophilic substitution (the use of EDC makes it possible to preserve this catalytic effect) necessary for the grafting of alendronate.
  • biotin-NHS which is a form of activated biotin via an N-hydroxysuccinimidyl group which catalyzes the nucleophilic substitution (the use of EDC makes it possible to preserve this catalytic effect) necessary for the grafting of alendronate.
  • It is the primary amine of alendronate which reacts on biotin-NHS.
  • the reaction is carried out in a mixed solvent DMF / phosphate buffer pH 7.0; DMF preferentially solubilizes biotin-NHS and the buffer solubilizes alendronate.
  • the reaction is therefore in a diluted medium, so that the reaction time required is nine days for the reaction to
  • the product is then isolated by first carrying out a dry evaporation of the solvent to the rotary evaporator.
  • the reaction crude is then dissolved in a minimum volume of distilled water.
  • the molecule of interest is finally isolated pure, by simple precipitation with ethanol.
  • the exact mass of the obtained product measured by H-MS (high resolution mass spectrometry) is 474.0873 g / mol.
  • the use consists in implementing a method as shown in FIG.
  • Step a) consists of functionalizing the bottoms of the wells of a microplate with an alendronate.
  • the bisphosphonate is fixed at the bottom of the wells by nucleophilic substitution.
  • 100 ⁇ l of a solution of a carbonate buffer pH 10 containing 10 ⁇ g of alendronate are deposited in the wells for 2 hours.
  • a series of 3 washes (3x300 ⁇ l) are then carried out with the buffer solution (PBS (phosphate) + 0.05% Tween 20) in order to eliminate the excess of molecules that have not been fixed at the bottom of the wells.
  • Step b) then consists in depositing the sample to be assayed (water containing or not containing uranium) at the bottom of the wells.
  • the sample volume required is 200 ⁇ l per well and the contact time with the wells is 30 minutes.
  • Step (c) consists in depositing in each well 100 ⁇ l of the pH 7.2 buffer solution containing 10 ⁇ g of biotinylated alendronate as described in point I, are deposited in each well. The contact time is 30 minutes.
  • Step d) consists of adding 2 ⁇ l of avidin peroxidase diluted in 1 ml of buffer solution.
  • the contact time with the wells is 15 minutes and the diluted enzyme volume is 100 ⁇ l.
  • 3 washes (3x300 ⁇ ) are again made with the buffer solution to eliminate the excess of molecules that have not been fixed at the bottom of the wells.
  • TMB tetramethylbenzidine
  • hydrochloric acid 100 ⁇ L / purts
  • acids sulfuric, hydrochloric
  • the last step is to read the optical density at 450 nm so as to quantify the Uranium concentration as a function of the intensity of absorption (and therefore of coloration) at this wavelength.
  • three wells correspond to the whites and were obtained by using ultrapure water as the sample to be analyzed;
  • three wells correspond to a test carried out on a sample of water containing lppm (100Oppb) of uranium.
  • the standard curve is shown in FIG.
  • the curve makes it possible to transcribe an OD in a uranium concentration, its correlation coefficient expresses the quality of the reproducibility of the test (here 100%).
  • Example 2 of Use According to the Invention for the Detection of Uranium the use consists in implementing another variant of the invention.
  • Solution A dissolve 5 mg of biotinylated alendronate of Example I in 50 ml of PBS buffer tween 20
  • Solution C prepare a PBS buffer solution tween 20
  • Step a) consists in functionalizing the bottoms of the wells of a microplate with a streptavidin. The plate is then passivated with 300 ⁇ l / well of solution B for 1 hour.
  • Step b) then involves contacting 100 ⁇ of solution A with 10 ml of the sample to be assayed for 1 hour.
  • Step c) deposit 200 ⁇ of this mixture in each well, and leave in contact for 1 hour. Then washed with the solution C 3x300 ⁇ L. The following steps are identical to steps d) and e) of Example 1 (point II).
  • Three wells correspond to a test carried out on a water sample containing 70ppb (70pg / L) of uranium.
  • the curve makes it possible to transcribe an OD into a uranium concentration.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Inorganic Chemistry (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

L'objet de l' invention est l'utilisation d'au moins une molécule de biotine greffée avec au moins une molécule M pour déterminer la présence et/ou doser la quantité dans une solution d'un élément E choisi parmi les métaux suivants : Mercure, Plomb, Cuivre, Cadmium, Arsenic, Cobalt, Fer, Aluminium, Nickel, Chrome, Zinc et Uranium, la molécule M étant une molécule capable de fixer ledit élément E. L'invention concerne également une molécule de biotine greffée particulière, son utilisation et un kit de détection de l'uranium dans une solution.

Description

UTILISATION DE BIOTINE GREFFEE POUR LE DOSAGE DE METAUX DANS UNE SOLUTION ET KIT DE DOSAGE
La présente invention concerne l'utilisation de molécules particulières pour la détection et le dosage de métaux dans des solutions aqueuses ou organiques. L'invention concerne également spécifiquement une nouvelle molécule et son utilisation pour le dosage de l'uranium ainsi qu'un kit dédié.
II existe différentes méthodes pour doser les métaux dans des solutions aqueuses ou organiques. Ces procédés sont notamment utilisés pour pouvoir détecter et quantifier la présence de métaux toxiques dans divers fluides, tels que des cours d'eau, des bassins de rétention d'eau, des eaux de pluies, eaux de consommation, etc.
Parmi les méthodes de dosage de métaux toxiques couramment utilisées, on connaît notamment la spectrométrie alpha qui donne de très bons résultats, ou encore la f luorimétrie ou la spectrométrie de masse couplée à un plasma inductif (ICP-MS).
Toutefois, si les procédés de dosage de métaux toxiques existants sont efficaces, ils présentent de nombreux inconvénients.
Tout d'abord, ces procédés sont généralement mis en oeuvre en laboratoire et ne sont pas transférables sur le terrain. Ils nécessitent du matériel coûteux et du personnel hautement qualifié, et les produits utilisés peuvent potentiellement être nocifs pour la santé.
De plus, les volumes nécessaires à l'analyse sont très importants, ce qui pose encore des problèmes de mise en oeuvre en pratique. De même, le nombre d'échantillons pouvant être analysés au cours d'une même manipulation est faible. Par ailleurs, les techniques existantes ne permettent pas un diagnostic immédiat. Le délai pour l'analyse est très long et incompatible avec les délais des applications visées. Notamment, par exemple, les stations de traitement doivent pouvoir ajuster les procédés de décontamination rapidement, ce qu'elles ne peuvent pas faire aujourd'hui compte-tenu des délais d'analyses. En effet, le temps nécessaire à l'obtention des résultats peut atteindre une semaine du fait notamment de temps de préparation des échantillons de plusieurs jours et de temps de comptage relativement longs.
L'objectif de l'invention est de pallier les inconvénients des procédés existants actuellement et de proposer un procédé permettant le dosage rapide de métaux toxiques sur terrain, simple à mettre en oeuvre, permettant l'analyse d'un plus grand nombre d'échantillons, avec un volume d'échantillons réduit, un investissement matériel limité et une utilisation non nocive pour la santé.
Pour y répondre, l'invention vise l'utilisation d'au moins une molécule de biotine greffée avec au moins une molécule M pour déterminer la présence et/ou doser la quantité dans une solution d'un élémen E choisi parmi les métaux suivants : Mercure, Plomb, Cuivre, Cadmium, Arsenic, Cobalt, Fer, Aluminium, Nickel, Chrome, Zinc et Uranium, la molécule M étant une molécule capable de fixer ledit élément E.
Avantageusement, l'utilisation de biotine greffée avec une molécule M, associée à un système de marquage de la biotine, permet de détecter et/ou doser la présence du métal E capable de se fixer sur la molécule M, à l'aide de techniques de visualisation simples connues. Il peut s'agir par exemple d'un marquage enzymatique de la biotine qui permet de détecter la présence du métal E recherché par un changement de couleur qui peut être évalué à l'œil nu ou à l'aide d'un dispositif, en particulier d'un spectrophotomètre.
L'invention permet un temps de mesure extrêmement réduit et un investissement matériel limité qui permet un dosage rapide (entre une et quatre heures) à partir d'un nombre et d'un volume d'échantillons réduit, et directement sur le terrain, sans nécessité de transfert vers un laboratoire d'analyse. En outre, les réactifs utilisés ne sont pas nocifs, contrairement à ceux potentiellement utilisés dans les méthodes classiques.
L'invention vise également l'utilisation d'une molécule de biotine greffée avec au moins une molécule M particulière, à savoir un biphosphonate, pour déterminer la présence et/ou doser la quantité d'Uranium dans une solution. L'invention couvre aussi la molécule de biphosphonate biotinylé pouvant être utilisée pour déterminer la présence et/ou doser la quantité d'Uranium dans une solution, répondant à la formule suivante :
Figure imgf000004_0001
avec
XI = O ou NH
RU H ou OH
X2 = une chaîne moléculaire composée d'un ou plusieurs des éléments suivants : C, H, O, N, P, S.
Enfin, l'invention concerne également un kit de détection de l'Uranium basé sur l'utilisation de biotine greffée avec une molécule M.
D'autres caractéristiques et avantages ressortiront de la description en détails qui va suivre de l'invention, en regard des figures annexées qui représen en :
- Figure 1 : une représentation schématique d'un premier mode de réalisation d'une utilisation selon l'invention, - Figure 2 : une représentation schématique d'un deuxième mode de réalisation d'une utilisation selon l'invention
- Figure 3 : une représentation schématique d'une variante du deuxième mode de réalisation d'une utilisation selon l'invention
- Figure 4 : une courbe étalon établissant une relation de proportionnalité entre la DO obtenue lors d' un test et la concentration en uranium contenue dans l'échantillon (exemple 1 - point II)
- Figure 5 : une courbe étalon établissant une relation de proportionnalité entre la DO obtenue lors d' un test et la concentration en uranium contenue dans l'échantillon (exemple 2 - point III )
L'invention vise donc l'utilisation d'au moins une molécule de biotine greffée avec au moins une molécule M pour déterminer la présence et/ou doser la quantité dans une solution d'un élément E choisi parmi les métaux suivants : Mercure, Plomb, Cuivre, Cadmium, Arsenic, Cobalt, Fer, Aluminium, Nickel, Chrome, Zinc et Uranium, la molécule M étant une molécule capable de fixer ledit élément E.
La molécule M est une molécule sur laquelle se fixe l'élément E lorsque M et E sont en contact. Par fixation au sens de l'invention on entend une complexation entre au moins deux molécules.
Par exemple, la molécule M peut être un phosphate ou un phosphonate dans le cas où le métal recherché E est l'Uranium, ou encore la molécule M peut être une cystéine ou un glutathion dans le cas où le métal recherché E est l'Arsenic.
La biotine est greffée avec la molécule M pour former une molécule BM. Le greffage est réalisé par tout moyen connu de l'homme du métier. La biotine et la molécule M peuvent être éventuellement séparées par un espaceur organique pour former la molécule BM.
Selon un mode de réalisation représenté sur la Figure 1, l'utilisation selon l'invention consiste en la mise en oeuvre d'un procédé comprenant les étapes suivantes : a) fixer au fond d'un contenant (10) au moins une molécule M, capable de fixer ledit élément E,
b) déposer la solution (12) dans laquelle il faut déterminer la présence et/ou doser la quantité de l'élément E,
c) ajouter dans la solution (12) au moins une biotine greffée avec au moins une molécule M, constituant une molécule BM,
d) ajouter dans la solution (12) une enzyme Z capable de se fixer à la biotine (dl), puis un substrat S de cette enzyme capable de colorer la solution (d2), et enfin un réactif pour stopper la réaction enzymatique,
e) déterminer la présence de l'élément E par mesure colorimétrique.
L'étape a) consiste à fonctionnaliser le fond d'un contenant (10) avec au moins une molécule M\ La molécule M est une molécule sur laquelle se fixe l'élément E lorsque M et E sont en solution. M et M peuvent être identiques ou différentes. Préf érentiellement M est une molécule M, comme représenté sur la Figure 1. La fixation de la molécule M au fond du contenant (10) peut se faire par tout moyen adapté. Par exemple, la fixation peut être réalisée par substitution nucléophile, substitution électrophile, cycloaddition ou fixation électrostatique. En pratique, cette étape a) est réalisée en amont, et on utilise un contenant déjà fonctionnalisé avec la molécule M\
L'étape b) consiste à déposer la solution (12), l'échantillon dans lequel il faut déterminer la présence et/ou doser la quantité d'élément E recherché.
La solution (12) correspond à l'échantillon de solution directement prélevée ou bien à l'échantillon de solution prélevée ayant subi une préparation préalable en fonction du milieu d'origine, de façon à ce que la solution soit exploitable, par exemple en termes de conditions de pH, redox, pour que le métal E présente une spéciation lui permettant d'interagir au mieux avec M, M et BM.
Le volume de solution (12) nécessaire pour l'utilisation selon l'invention est préf érentiellement d'au moins lmL, préf érentiellement entre 1 et lOmL. Le ou les élément(s) E contenus dans la solution (12) introduite dans le contenant (10) se fixent sur les molécules M\
L etape c) consiste à ajouter dans le contenant (10) au moins une molécule BM. Ces molécules BM se fixent spécifiquement via le motif M sur les éléments E déjà fixés sur les molécules M elles-mêmes fixées au fond du contenant (10). Préférentiellement, pour un volume de 100 à 200 μί de solution (12) présente dans le contenant (10), on ajoute préférentiellement 100 μί d'une solution BM concentrée à 100pg/mL.
On ajoute ensuite dans le contenant (10), à l'étape d), une enzyme Z capable de se fixer à la biotine. Cette enzyme Z peut être notamment une avidine- peroxydase ou une streptavidine-peroxydase.
Les enzymes Z ajoutées se fixent de façon irréversible au motif biotine de la molécule BM. Préférentiellement, pour un volume de 100 à 200 μί de solution (12) présente dans le contenant (10), on ajoute préférentiellement 100 μί d'une solution Z obtenue par une dilution de 1/2000 d'une solution mère.
On ajoute ensuite un substrat S de cette enzyme capable de colorer la solution. Il peut s'agir par exemple du tétramethylbenzidine (TMB), du 3,3'- Diaminobenzidine (DAB), du 2,2'-azino-bis(3'-ethyl benzothiazoline-6-sulphonic acid) (ATBS), ou encore du ophenylenediamine dihydrochloride (OPD). Lorsque l'enzyme Z est une avidine-peroxydase ou une streptavidine-peroxydase, le substrat S peut être par exemple le tétraméthylbenzidine (TMB) qui entraîne une coloration qui passe d'incolore à bleue.
Le temps de contact après ajout du substrat est d'au moins 1 minute, préférentiellement entre 1 et 60 minutes.
Après ce temps de contact, on ajoute un réactif pour stopper la réaction enzymatique et stabiliser l'intensité de la coloration. Il s'agit préférentiellement d'une solution acide, notamment un acide sulfurique, phosphorique ou chlorhydrique. C'est le cas en particulier lorsque Z est une avidine-peroxydase ou une streptavidine-peroxydase et S le tétraméthylbenzidine (TMB).
Une fois la réaction stoppée, la coloration finale (qui du bleu est passée au jaune par exemple dans le cas du TMB) est stable.
La dernière étape du procédé consiste à déterminer la présence de l'élément E par mesure colorimétrique.
Il peut s'agir d'une simple détection de changement de couleur à l'œil nu. Préférentiellement, cette étape consiste à lire la densité optique de la solution (12) notamment, à l'aide d'un spectrophotometre. Cela permet de quantifier la concentration des analytes en fonction de l'intensité d'absorption à une longueur d'onde donnée.
En présence de l'élément E dans l'échantillon, la solution se colore et la variation de la coloration est directement proportionnelle à la concentration du métal E en solution.
Selon un autre mode de réalisation représenté sur la Figure 2, l'utilisation selon l'invention consiste en la mise en œuvre d'un procédé comprenant les étapes suivantes :
a) fixer au fond d'un contenant (10) une molécule F capable de fixer la biotine,
b) déposer une solution (12) dans laquelle il faut déterminer la présence et/ou doser la quantité de l'élément E,
c) ajouter dans la solution au moins deux molécules de biotine greffées avec au moins une molécule M, constituant des molécules BM,
d) ajouter dans la solution une enzyme Z capable de se fixer à la biotine (dl), puis un substrat S de cette enzyme Z capable de colorer la solution (d2), et enfin un réactif pour stopper la réaction enzymatique,
e) déterminer la présence de l'élément E par mesure colorimétrique. L'é ape a) consiste à fonctionnaliser le fond d'un contenant (10) avec au moins une molécule F. La molécule F est une molécule sur laquelle se fixe la biotine lorsque un groupement biotine et F sont en contact. La molécule F peut par exemple être une avidine ou une streptavidine.
La fixation de la molécule F au fond du contenant (10) peut se faire par tout moyen adapté. Par exemple, la fixation peut être réalisée par substitution nucléophile ou par interactions électrostatiques.
En pratique, cette étape a) est réalisée en amont, et on utilise un contenant déjà fonctionnalisé avec la molécule F.
L'étape b) consiste à déposer la solution (12), l'échantillon dans lequel il faut déterminer la présence et/ou doser la quantité de métal E recherché.
La solution (12) correspond à l'échantillon de solution directement prélevée ou bien à l'échantillon de solution prélevée ayant subi une préparation préalable en fonction du milieu d'origine, de façon à ce que la solution soit exploitable, par exemple en termes de conditions de pH, redox, pour que le métal E présente une spéciation lui permettant d'interagir au mieux avec M, F et BM.
Le volume de solution (12) nécessaire pour l'utilisation selon l'invention est d'au moins lmL, préférentiellement entre 1 et lOmL.
Les éléments E présents dans la solution (12) versée dans le contenant (10) restent libres dans la solution (12).
L'étape c) consiste ensuite à ajouter dans la solution (12) au moins deux molécules BM. Ces molécules se fixent spécifiquement via le motif M sur le ou les élément(s) E présent(s) dans la solution (12) pour former des complexes BM-E- MB. Pour chaque complexe, un des deux motifs biotine libres se fixe sur une molécule F fixée au fond du contenant (10).
Selon une variante représentée sur la Figure 3, les molécules BM sont introduites dans la solution (12) à analyser avant qu'elles ne soient introduites dans le contenant (10). Les complexes BM-E-MB se forment ainsi dans la solution (12) avant son introduction dans le contenant (10). Dans ce cas, l'étape b) consiste à ajouter dans la solution (12) dans laquelle il faut déterminer la présence et/ou doser la quantité de l'élément E, au moins deux molécules BM, et l'étape c) à ajouter dans le contenant (10) la solution (12).
Les étapes d) et e) sont identiques à celles du premier mode de réalisation.
Pour la mise en oeuvre de l'invention, le contenant (10) peut être tout contenant adapté, préférentiellement un puits disposé sur une plaque multi-puits du type microplaque.
Selon l'un ou l'autre des modes de réalisation, les différentes étapes peuvent être éventuellement suivies d'un ou plusieurs lavages avec une solution tampon, pour éliminer l'excès de molécules n'ayant pas été fixé et pouvant interférer avec le dosage (BM et Z en particulier) .
L'invention est particulièrement avantageuse pour détecter la présence et/ou doser sélectivement le Mercure, le Plomb, le Cuivre, le Cadmium, l'Arsenic, le Cobalt, le Fer, l'Aluminium, le Nickel, le Chrome, le Zinc ou l'Uranium dans diverses solutions aqueuses ou organiques. L'invention peut être utilisée notamment pour analyser la pollution en élémen E dans des cours d'eau, des étendues d'eau ou des eaux de consommation, ou pour contrôler la dépollution en élément E d'une solution après un traitement dépolluant.
L'utilisation selon l'invention est rapide (une à quatre heures), facile et efficace. Elle constitue pour les laboratoires de contrôle et d'analyse et pour les autorités sanitaires, une alternative aux dosages longs et complexes, et leur permet ainsi de procéder à des dépistages précoces, le dosage, par spectrophotométrie par exemple, pouvant être réalisé sur terrain.
De plus, l'utilisation selon l'invention permet de doser les métaux toxiques E dans leur forme globale. Il n'est nullement nécessaire de discriminer la forme du métal en solution, sauf dans le cas où l'on doit déterminer la nature de la pollution (naturelle, industrielle ou militaire), les métaux pouvant être enrichis en certains isotopes en fonction de sa provenance.
L'utilisation selon l'invention peut être appliquée spécifiquement à la détection et/ou au dosage de l'Uranium.
Dans cette variante :
- l'élément E est l'Uranium
- la molécule M est un biphosphonate
- la molécule BM est un biphosphonate biotinylé répondant à la formule suivante :
Figure imgf000011_0001
avec
XI = O ou NH
RU H ou OH
X2 = une chaîne moléculaire composée d'un ou plusieurs des éléments suivants : C, H, Ο, Ν, P, S.
Préférentiellement, X2
Figure imgf000011_0002
avec n entier supérieur ou égal à 1.
Cette molécule de biphosphonate biotinylé constitue un objet de l'invention. Elle peut être obtenue par greffage d'un biphosphonate sur une biotine par toute méthode de greffage adaptée connue de l'homme de l'art. La biotine et le biphosphonate peuvent être liés directement ou par l'intermédiaire d'un espaceur organique. La molécule de biphosphonate biotinylé selon l'invention peur être utilisée spécifiquement pour la détection et/ou le dosage de l'Uranium, par la mise en oeuvre des procédés décrits précédemment et illustrés notamment sur les Figures 1 et 2.
Dans le cas où la molécule de biphosphonate biotinylé est utilisée pour la mise en oeuvre du procédé représenté notamment sur la Figure 1, la molécule M est un bisphosphonate ou une pince di-biphosphonate. Ce biphosphonate peut être identique ou différent de la molécule M.
Le procédé selon l'invention utilisant du biphosphonate biotinylé peut être utile pour toute application nécessitant le dosage de l'uranium en solution. Il peut être utilisé notamment pour analyser la pollution en uranium dans des cours d'eau ou des étendues d'eau, pour contrôler la dépollution en uranium de solutions après traitement, pour surveiller les radionucléides contenus dans les eaux de pluie ou même encore, pour doser l'uranium présent dans des échantillons d'urine notamment des travailleurs exposés (miniers, exploitants nucléaires, militaires, etc.). Il est utile pour le suivi de procédé de décontamination, par exemple pour contrôler la saturation des écorces contenues dans les stations de traitement telles que décrites dans la demande de brevet F -0.957.024.
Pour une utilisation optimisée, l'invention vise également un kit de dosage de l'uranium in situ comprenant des molécules de biphosphonates biotinylés.
Préférentiellement, l'invention vise un kit pour la détection de l'Uranium en solution comprenant notamment :
- une microplaque, dont les fonds des puits sont fonctionnalisés avec un biphosphonate ou une streptavidine ou une avidine,
- du biphosphonate biotinylé, en poudre ou en solution,
- une solution d'avidine-peroxydase ou de streptavidine-peroxydase,
- une solution de substrat de l'avidine peroxydase ou de streptavidine- peroxydase, - une solution pour stopper la réaction entre l'avidine-peroxydase ou la streptavidine-peroxydase et son substrat.
De façon préférée, le kit comprend également :
- une solution de passivation des microplaques, et/ou
- du matériel de prélèvement, et/ou
- une solution tampon, et/ou
- des éléments documentaires relatifs à l'utilisation du kit d'un point de vue technique et/ou sécuritaire.
L'invention est à présent illustrée par des exemples de molécules et d'utilisation selon l'invention.
I. Exemple de biotine greffée avec une molécule M
Un exemple de biotine greffée avec une molécule M utile selon l'invention est un alendronate biotinylé répondant à la formule suivante :
Figure imgf000013_0001
Cette molécule peut être synthétisée selon le schéma de synthèse suivant :
Figure imgf000013_0002
Cette synthèse consiste à utiliser la biotine-NHS qui est une forme de biotine activée via un groupement N-hydroxysuccinimidyl qui catalyse la substitution nucléophile (l'utilisation d'EDC permet de conserver cet effet catalytique) nécessaire au greffage de l'alendronate. C'est l'aminé primaire de l'alendronate qui réagit sur la biotine-NHS. La réaction est réalisée dans un solvant mixte DMF/tampon phosphate pH 7,0 ; le DMF solubilise préférentiellement la biotin- NHS et le tampon solubilise l'alendronate. La réaction se fait donc en milieu dilué, si bien que le temps de réaction nécessaire est de neuf jours pour que la réaction soit totale. Le produit est ensuite isolé en réalisant dans un premier temps une évaporation à sec du solvant à l evaporateur rotatif. Le brut réactionnel est ensuite dissous dans un volume minimum d'eau distillée. La molécule d'intérêt est enfin isolée pure, par simple précipitation à l'ethanol. La masse exacte du produit obtenu mesurée par H -MS (spectrométrie de masse haute résolution) s'élève à 474,0873 g/mole.
II. Exemple 1 d'utilisation selon l'invention pour la détection de l'Uranium
Dans ce premier exemple, l'utilisation consiste à mettre en œuvre un procédé tel que représenté sur la Figure 1.
L'étape a) consiste à fonctionnaliser les fonds des puits d'une microplaque avec un alendronate.
Dans cet exemple, la fixation du bisphosphonate au fond des puits se fait par substitution nucléophile. On dépose dans les puits 100 μί d'une solution d'un tampon carbonate pH 10 contenant 10 μg d'alendronate durant 2 heures. On réalise ensuite une série de 3 lavages (3x300 μί) avec la solution tampon (PBS (phosphate) + 0.05% Tween 20) pour éliminer l'excès de molécules n'ayant pas été fixées au fond des puits.
L'étape b) consiste ensuite à déposer l'échantillon à doser (de l'eau contenant ou non de l'Uranium) au fond des puits. Le volume d'échantillon nécessaire est de 200 μί par puits et le temps de contact avec les puits est de 30 minutes.
On réalise ensuite 3 lavages (3x300 μί) avec la solution tampon pour éliminer l'excès de molécules n'ayant pas été fixé au fond des puits. L'é ape c) consiste à déposer dans chaque puits 100 μί de la solution tampon pH 7.2 contenant 10 μg d'alendronate biotinylé tel que décrit au point I, sont déposés dans chaque puits. Le temps de contact est de 30 minutes.
On réalise à nouveau 3 lavages (3x300 μί) avec la solution tampon pour éliminer l'excès de molécules n'ayant pas été fixé au fond des puits.
L'étape d) consiste à ajouter 2 μί d'avidine peroxydase diluée dans 1 mL de solution tampon. Le temps de contact avec les puits est de 15 minutes et le volume d'enzyme diluée est de 100 μί. On réalise à nouveau 3 lavages (3x300 μί) avec la solution tampon pour éliminer l'excès de molécules n'ayant pas été fixé au fond des puits.
On ajoute ensuite une solution de tétraméthylbenzidine (TMB) contenant également du péroxyde d'hydrogène nécessaire à la coloration. La coloration bleue est due à l'autocomplexation du TMB en présence du radical hydroxyle. Ce radical est obtenu en présence de peroxydase.
On utilise ensuite rapidement une solution d'acide chlorhydrique (100 ^L/purts), nécessaire pour stopper la réaction enzymatique et stabiliser l'intensité de la coloration. Plusieurs acides (sulfurique, chlorhydrique...) peuvent être utilisés pour cette étape.
Une fois la réaction stoppée, la coloration finale - jaune - est stable.
La dernière étape consiste à lire la densité optique à 450 nm de façon à quantifier la concentration en Uranium en fonction de l'intensité d'absorption (et donc de coloration) à cette longueur d'onde.
Des essais réalisés en triplicats, mettant en oeuvre ce procédé, ont été réalisés :
- trois puits correspondent aux blancs et ont été obtenus en utilisant comme échantillon à analyser de l'eau ultrapure,
- trois puits correspondent à un test réalisé sur un échantillon d'eau contenant lppm (lOOOppb) d'uranium. Pour la lecture des résultats, une gamme avec des solutions contenant des teneurs en uranium différentes, est utilisée pour obtenir une courbe étalon établissant une relation de proportionnalité entre la DO obtenue lors d'un test et la concentration en uranium contenue dans l 'échantillon (1 ppb = 1 pg/L). La courbe étalon est représentée sur la figure 4.
La corrélation est de 100 % ( 2 = 1) pour une courbe d'ordre 3 : y = 2~10x3 - 6"7x2 + O.OOlx + 0.067.
La courbe permet de transcrire une DO en une concentration en uranium, son coefficient de corrélation exprime la qualité de la reproductibilité du test (ici 100%).
III. Exemple 2 d'utilisation selon l'invention pour la détection de l'Uranium Dans ce second exemple, l'utilisation consiste à mettre en oeuvre une autre variante de l'invention.
Pour cet exemple, on utilise les solutions suivantes :
- Solution A : dissoudre 5 mg d'alendronate biotinylé de l'exemple I dans 50 mL de tampon PBS tween 20
- Solution B : préparer une solution de tampon PBS tween 20 contenant 1 % de caserne
- Solution C : préparer une solution de tampon PBS tween 20
L'étape a) consiste à fonctionnaliser les fonds des puits d'une microplaque avec une streptavidine. La plaque est ensuite passivée avec 300^/L/puits de la solution B durant 1 heure.
On lave ensuite les puits avec la solution C 3x300 μί.
L'étape b) consiste ensuite à mettre en contact 100 μί de la solution A avec 10 mL de l'échantillon à doser, durant 1 heure.
L'étape c) consiste à déposer 200 μί de ce mélange dans chaque puits, et à laisser en contact durant 1 heure. On lave ensuite avec la solution C 3x300 ^L. Les étapes suivantes sont identiques aux étapes d) et e) de l'exemple 1 (point II).
Des essais réalisés en triplicats, mettant en oeuvre ce procédé ont été réalisés :
- Première rangée :
o trois puits correspondent aux blancs et ont été obtenus en utilisant comme échantillon à analyser de l'eau ultrapure
o trois puits correspondent à un test réalisé sur un échantillon d'eau contenant lOppb (10pg/L) d'uranium
o trois puits correspondent à un test réalisé sur un échantillon d'eau contenant 20ppb (20pg/L) d'uranium
o trois puits correspondent à un test réalisé sur un échantillon d'eau contenant 30ppb (30pg/L) d'uranium
- Deuxième rangée :
o trois puits correspondent à un test réalisé sur un échantillon d'eau contenant 40ppb (40pg/L) d'uranium
o trois puits correspondent à un test réalisé sur un échantillon d'eau contenant 50ppb (50pg/L) d'uranium
o trois puits correspondent à un test réalisé sur un échantillon d'eau contenant 60ppb (60pg/L) d'uranium
o trois puits correspondent à un test réalisé sur un échantillon d'eau contenant 70ppb (70pg/L) d'uranium.
Pour la lecture des résultats, une gamme avec des solutions contenant des teneurs en uranium différentes, est utilisée pour obtenir une courbe étalon établissant une relation de proportionnalité entre la DO obtenue lors d'un test et la concentration en uranium contenue dans l 'échantillon (1 ppb = 1 pg/L). La courbe étalon est représentée sur la figure 5.
La courbe permet de transcrire une DO en une concentration en uranium.

Claims

REVENDICATIONS
1. Utilisation d'au moins une molécule de biotine greffée avec au moins une molécule M pour déterminer la présence et/ou doser la quantité dans une solution d'un élémen E choisi parmi les métaux suivants : Mercure, Plomb, Cuivre, Cadmium, Arsenic, Cobalt, Fer, Aluminium, Nickel, Chrome, Zinc et Uranium, la molécule M étant une molécule capable de fixer ledit élément E.
2. Utilisation selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle consiste en la mise en oeuvre d'un procédé comprenant les étapes suivantes :
a) fixer au fond d'un contenant (10) au moins une molécule M capable de fixer l'élément E,
b) déposer une solution (12) dans laquelle il faut déterminer la présence et/ou doser la quantité de l'élément E,
c) ajouter dans la solution (12) au moins une biotine greffée avec au moins une molécule M, constituant une molécule BM,
d) ajouter dans la solution (12) une enzyme Z capable de se fixer à la biotine, puis un substrat S de cette enzyme Z capable de colorer la solution, et enfin un réactif pour stopper la réaction enzymatique,
e) déterminer la présence de l'élément E par mesure colorimétrique.
3. Utilisation selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle consiste en la mise en oeuvre d'un procédé comprenant les étapes suivantes :
a) fixer au fond d'un contenant (10) une molécule F capable de fixer la biotine,
b) déposer une solution (12) dans laquelle il faut déterminer la présence et/ou doser la quantité de l'élément E,
c) ajouter dans la solution au moins deux molécules de biotine greffées avec au moins une molécule M, constituant des molécules BM, d) ajouter dans la solution une enzyme Z capable de se fixer à la biotine, puis un substrat S de cette enzyme Z capable de colorer la solution, et enfin un réactif pour stopper la réaction enzymatique,
e) déterminer la présence de l'élément E par mesure colorimétrique.
4. Utilisation selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle consiste en la mise en oeuvre d'un procédé comprenant les étapes suivantes :
a) fixer au fond d'un contenant (10) une molécule F capable de fixer la biotine,
b) ajouter dans une solution (12) dans laquelle il faut déterminer la présence et/ou doser la quantité de l'élément E, au moins deux molécules de biotine greffées avec au moins une molécule M, constituant des molécules BM, c) ajouter la solution (12) dans le contenant (10),
d) ajouter dans la solution une enzyme Z capable de se fixer à la biotine, puis un substrat S de cette enzyme Z capable de colorer la solution, et enfin un réactif pour stopper la réaction enzymatique,
e) déterminer la présence de l'élément E par mesure colorimétrique.
5. Utilisation selon la revendication 3 ou 4, caractérisée en ce que la molécule fixée au fond du contenant capable de fixer la biotine est une streptavidine ou une avidine.
6. Utilisation selon l'une des revendications 2 à 5, caractérisée en ce que l'enzyme capable de fixer la biotine à l'étape d) est l'avidine-peroxydase ou la streptavidine-peroxydase.
7. Utilisation selon l'une des revendications 2 à 6, caractérisée en ce que l'étape e) est réalisée par lecture de la densité optique.
8. Utilisation selon l'une des revendications 2 à 7, caractérisée en ce que le contenant de l'étape a) est un puits d'une plaque multi-puits.
9. Utilisation selon l'une des précédentes revendications, pour analyser la pollution en élément E dans des cours d'eau, des étendues d'eau ou des eaux de consommation.
10. Utilisation selon l'une des précédentes revendications, pour contrôler la dépollution en élément E d'une solution après un traitement dépolluant.
11. Utilisation selon l'une des précédentes revendications, caractérisé en ce que l'élément E est l'Uranium et la biotine greffée avec la molécule M un biphosphonate biotinylé répondant à la formule :
Figure imgf000020_0001
avec
Xl = O ou NH
RU H ou OH
X2 = une chaîne moléculaire composée d'un ou plusieurs des éléments suivants : C, H, O, N, P, S.
12. Utilisation selon la revendication 11, caractérisée en ce que X2 = ou X2 = n avec n = entier supérieur ou égal à 1.
13. Utilisation selon l'une des revendications 11 ou 12, pour contrôler la saturation en Uranium des écorces contenues dans les stations de traitement.
14. Utilisation selon l'une des revendications 11 ou 12, pour surveiller les radionucléides contenus dans les eaux de pluie, cours d'eau, étendues d'eau, eaux de consommation.
15. Utilisation selon l'une des revendications 11 ou 12, pour doser l'uranium présent dans des échantillons d'urine.
16. Molécule susceptible d'être utilisée selon l'une des revendications 11 à 15, caractérisée en ce qu'elle répond à la formule :
Figure imgf000021_0001
avec
XI = O ou NH
RU H ou OH
X2 = une chaîne moléculaire composée d'un ou plusieurs des éléments suivants : C, H, O, N, P, S.
Figure imgf000021_0002
17. Molécule selon la revendication 16, caractérisée en ce que X2 o
ou X2 = ~ ' " avec n = entier supérieur ou égal à 1.
18. kit pour doser l'uranium dans des solutions comprenant au moins :
- une microplaque, dont les fonds des puits sont fonctionnalisés avec un biphosphonate ou une streptavidine ou une avidine,
- du biphosphonate biotinylé selon la revendication 17 ou 18, en poudre ou en solution,
- une solution d'avidine-peroxydase ou de streptavidine-peroxydase,
- une solution de substrat de l'avidine peroxydase ou de streptavidine- peroxydase, - une solution pour stopper la réaction entre l'avidine-peroxydase ou la streptavidine-peroxydase et son substrat.
19. kit pour doser l'uranium selon la revendication 18, caractérisé en ce qu'il comprend également :
- une solution de passivation des microplaques, et/ou
- du matériel de prélèvement, et/ou
- une solution tampon, et/ou
- des éléments documentaires relatifs à l'utilisation du kit d'un point de vue technique et/ou sécuritaire.
PCT/FR2013/052937 2012-12-04 2013-12-04 Utilisation de biotine greffee pour le dosage de metaux dans une solution et kit de dosage WO2014087100A1 (fr)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FR1261597 2012-12-04
FR1261597A FR2998969B1 (fr) 2012-12-04 2012-12-04 Utilisation de biotine greffee pour le dosage de metaux dans une solution

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2014087100A1 true WO2014087100A1 (fr) 2014-06-12

Family

ID=48237030

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/FR2013/052937 WO2014087100A1 (fr) 2012-12-04 2013-12-04 Utilisation de biotine greffee pour le dosage de metaux dans une solution et kit de dosage

Country Status (2)

Country Link
FR (1) FR2998969B1 (fr)
WO (1) WO2014087100A1 (fr)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115463643B (zh) * 2022-10-22 2023-05-12 海南大学 一种快速吸铀抗污吸附剂及其制备方法

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1999061655A1 (fr) * 1998-05-29 1999-12-02 Hawaii Biotechnology Group, Inc. Essai par fixation determinant un etat de transition
WO2004033476A1 (fr) * 2002-10-11 2004-04-22 Ahram Biosystems Inc. Systeme de detection de cibles avec sonde sensible par sa conformation, comprenant un transducteur de signaux a base d'acides nucleiques
US20050250214A1 (en) * 2004-05-05 2005-11-10 Gee Kyle R Zinc binding compounds and their method of use
US20080171351A1 (en) * 2006-05-22 2008-07-17 University Of Notre Dame Du Lac Probes for anionic cell surface detection

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1999061655A1 (fr) * 1998-05-29 1999-12-02 Hawaii Biotechnology Group, Inc. Essai par fixation determinant un etat de transition
WO2004033476A1 (fr) * 2002-10-11 2004-04-22 Ahram Biosystems Inc. Systeme de detection de cibles avec sonde sensible par sa conformation, comprenant un transducteur de signaux a base d'acides nucleiques
US20050250214A1 (en) * 2004-05-05 2005-11-10 Gee Kyle R Zinc binding compounds and their method of use
US20080171351A1 (en) * 2006-05-22 2008-07-17 University Of Notre Dame Du Lac Probes for anionic cell surface detection

Also Published As

Publication number Publication date
FR2998969B1 (fr) 2015-01-09
FR2998969A1 (fr) 2014-06-06

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Lin et al. Determination of ammonia nitrogen in natural waters: Recent advances and applications
EP1447665B1 (fr) Méthode pour la réduction d'effet de hématocrite dans la détection d'un analyte dans un échantillon de sang total
Marguí et al. Analytical approaches for Hg determination in wastewater samples by means of total reflection X-ray fluorescence spectrometry
Bobrowski et al. Chromium speciation study in polluted waters using catalytic adsorptive stripping voltammetry and tangential flow filtration
JP2007327887A (ja) イオンセンサー及びイオン検出法
Suah Preparation and characterization of a novel Co (II) optode based on polymer inclusion membrane
Razak et al. Reflectance chemosensor based on bis-thiourea derivative as ionophore for copper (II) ion detection
Qian et al. Complexation of cobalt by natural ligands in freshwater
Salahshoor et al. Detection of Atrazine and its metabolites by photonic molecularly imprinted polymers in aqueous solutions
Lou et al. Lateral flow analysis of Pb (II) in green tea integrated with ionic imprinted paper-based chip
Morales et al. Luminescence methods for study and determination of pollutants in the environment
Galiński et al. Pyrrole bearing diazocrowns: Selective chromoionophores for lead (II) optical sensing
Sun et al. Linkages between optical and molecular signatures of dissolved organic matter along the Yangtze River Estuary-to-East China Sea Continuum
EP2529216A1 (fr) Kit de detection de groupements fonctionnels carboxyliques
Cubuk et al. Phosphonic acid based polymeric fluorescent sensor for Hg (II) analysis
WO2014087100A1 (fr) Utilisation de biotine greffee pour le dosage de metaux dans une solution et kit de dosage
EP2307877A2 (fr) Kit de détection de groupements fonctionnels carboxyliques, thiols et amines.
Amin Application of a triacetylcellulose membrane with immobilizated of 5-(2′, 4′-dimethylphenylazo)-6-hydroxypyrimidine-2, 4-dione for mercury determination in real samples
Cheng et al. Current applications of colourimetric microfluidic devices (smart phone based) for soil nutrient determination
Gong et al. A fluorescence enhancement-based sensor using glycosylated metalloporphyrin as a recognition element for levamisole assay
Kiso et al. Visual determination of nitrite and nitrate in waters by color band formation method
EP3833963B1 (fr) Procédé colorimétrique de détection de mercure organique
US7378281B2 (en) Process to measure PPB levels of dissolved copper in jet fuels and other non-aqueous fluids using a colorimetric process
Gürkan et al. The investigation of a novel indicator system for trace determination and speciation of selenium in natural water samples by kinetic spectrophotometric detection
Hassanein et al. A Highly Sensitive and Selective Photometric Creatinine Assay Using Padina pavonica Silver Nano-Probe

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 13815044

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 13815044

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1