FR2998969A1 - Utilisation de biotine greffee pour le dosage de metaux dans une solution - Google Patents

Abstract

L'objet de l'invention est l'utilisation d'au moins une molécule de biotine greffée avec au moins une molécule M pour déterminer la présence et/ou doser la quantité dans une solution d'un élément E choisi parmi les métaux suivants : Mercure, Plomb, Cuivre, Cadmium, Arsenic, Cobalt, Fer, Aluminium, Nickel, Chrome, Zinc et Uranium, la molécule M étant une molécule capable de fixer ledit élément E. L'invention concerne également une molécule de biotine greffée particulière, son utilisation et un kit de détection de l'uranium dans une solution.

Description

UTILISATION DE BIOTINE GREFFEE POUR LE DOSAGE DE METAUX DANS UNE SOLUTION La présente invention concerne l'utilisation de molécules particulières pour la détection et le dosage de métaux dans des solutions aqueuses ou organiques. L'invention concerne également spécifiquement une nouvelle molécule et son utilisation pour le dosage de l'uranium ainsi qu'un kit dédié.

Il existe différentes méthodes pour doser les métaux dans des solutions aqueuses ou organiques. Ces procédés sont notamment utilisés pour pouvoir détecter et quantifier la présence de métaux toxiques dans divers fluides, tels que des cours d'eau, des bassins de rétention d'eau, des eaux de pluies, eaux de consommation, etc.

Parmi les méthodes de dosage de métaux toxiques couramment utilisées, on connaît notamment la spectrométrie alpha qui donne de très bons résultats, ou encore la fluorimétrie ou la spectrométrie de masse couplée à un plasma inductif (ICP-MS). Toutefois, si les procédés de dosage de métaux toxiques existants sont 15 efficaces, ils présentent de nombreux inconvénients. Tout d'abord, ces procédés sont généralement mis en oeuvre en laboratoire et ne sont pas transférables sur le terrain. Ils nécessitent du matériel coûteux et du personnel hautement qualifié, et les produits utilisés peuvent potentiellement être nocifs pour la santé. 20 be plus, les volumes nécessaires à l'analyse sont très importants, ce qui pose encore des problèmes de mise en oeuvre en pratique. be même, le nombre d'échantillons pouvant être analysés au cours d'une même manipulation est faible.

Par ailleurs, les techniques existantes ne permettent pas un diagnostic immédiat. Le délai pour l'analyse est très long et incompatible avec les délais des applications visées. Notamment, par exemple, les stations de traitement doivent pouvoir ajuster les procédés de décontamination rapidement, ce qu'elles ne peuvent pas faire aujourd'hui compte-tenu des délais d'analyses. En effet, le temps nécessaire à l'obtention des résultats peut atteindre une semaine du fait notamment de temps de préparation des échantillons de plusieurs jours et de temps de comptage relativement longs. L'objectif de l'invention est de pallier les inconvénients des procédés existants actuellement et de proposer un procédé permettant le dosage rapide de métaux toxiques sur terrain, simple à mettre en oeuvre, permettant l'analyse d'un plus grand nombre d'échantillons, avec un volume d'échantillons réduit, un investissement matériel limité et une utilisation non nocive pour la santé. Pour y répondre, l'invention vise l'utilisation d'au moins une molécule de biotine greffée avec au moins une molécule M pour déterminer la présence et/ou doser la quantité dans une solution d'un élément E choisi parmi les métaux suivants : Mercure, Plomb, Cuivre, Cadmium, Arsenic, Cobalt, Fer, Aluminium, Nickel, Chrome, Zinc et Uranium, la molécule M étant une molécule capable de fixer ledit élément E.

Avantageusement, l'utilisation de biotine greffée avec une molécule M, associée à un système de marquage de la biotine, permet de détecter et/ou doser la présence du métal E capable de se fixer sur la molécule M, à l'aide de techniques de visualisation simples connues. Il peut s'agir par exemple d'un marquage enzymatique de la biotine qui permet de détecter la présence du métal E recherché par un changement de couleur qui peut être évalué à l'oeil nu ou à l'aide d'un dispositif, en particulier d'un spectrophotomètre. L'invention permet un temps de mesure extrêmement réduit et un investissement matériel limité qui permet un dosage rapide (entre une et quatre heures) à partir d'un nombre et d'un volume d'échantillons réduit, et directement sur le terrain, sans nécessité de transfert vers un laboratoire d'analyse. En outre, les réactifs utilisés ne sont pas nocifs, contrairement à ceux potentiellement utilisés dans les méthodes classiques.

L'invention vise également l'utilisation d'une molécule de biotine greffée avec au moins une molécule M particulière, à savoir un biphosphonate, pour déterminer la présence et/ou doser la quantité d'Uranium dans une solution. L'invention couvre aussi la molécule de biphosphonate biotinylé pouvant être utilisée pour déterminer la présence et/ou doser la quantité d'Uranium dans une solution, répondant à la formule suivante : o avec X1 = 0 ou NH R1 = H ou OH X2 = une chaine moléculaire composée d'un ou plusieurs des éléments suivants : C, H, 0, N, P, S. Enfin, l'invention concerne également un kit de détection de l'Uranium basé sur l'utilisation de biotine greffée avec une molécule M. D'autres caractéristiques et avantages ressortiront de la description en détails qui va suivre de l'invention, en regard des figures annexées qui représentent : - Figure 1 : une représentation schématique d'un premier mode de réalisation d'une utilisation selon l'invention, OH HO-=O X2 ± R1 Na OH NH NH - Figure 2: une représentation schématique d'un deuxième mode de réalisation d'une utilisation selon l'invention - Figure 3: une représentation schématique d'une variante du deuxième mode de réalisation d'une utilisation selon l'invention - Figure 4: une courbe étalon établissant une relation de proportionnalité entre la DO obtenue lors d'un test et la concentration en uranium contenue dans l'échantillon (exemple 1 - point II) - Figure 5: une courbe étalon établissant une relation de proportionnalité entre la DO obtenue lors d'un test et la concentration en uranium contenue dans l'échantillon (exemple 2 - point III) L'invention vise donc l'utilisation d'au moins une molécule de biotine greffée avec au moins une molécule M pour déterminer la présence et/ou doser la quantité dans une solution d'un élément E choisi parmi les métaux suivants : Mercure, Plomb, Cuivre, Cadmium, Arsenic, Cobalt, Fer, Aluminium, Nickel, Chrome, Zinc et Uranium, la molécule M étant une molécule capable de fixer ledit élément E. La molécule M est une molécule sur laquelle se fixe l'élément E lorsque M et E sont en contact. Par fixation au sens de l'invention on entend une complexation entre au moins deux molécules. Par exemple, la molécule M peut être un phosphate ou un phosphonate dans le cas 20 où le métal recherché E est l'Uranium, ou encore la molécule M peut être une cystéine ou un glutathion dans le cas où le métal recherché E est l'Arsenic. La biotine est greffée avec la molécule M pour former une molécule BM. Le greffage est réalisé par tout moyen connu de l'homme du métier. La biotine et la molécule M peuvent être éventuellement séparées par un espaceur organique 25 pour former la molécule BM. Selon un mode de réalisation représenté sur la Figure 1, l'utilisation selon l'invention consiste en la mise en oeuvre d'un procédé comprenant les étapes suivantes : a) fixer au fond d'un contenant (10) au moins une molécule M', capable de fixer ledit élément E, b) déposer la solution (12) dans laquelle il faut déterminer la présence et/ou doser la quantité de l'élément E, c) ajouter dans la solution (12) au moins une biotine greffée avec au moins une molécule M, constituant une molécule BM, d) ajouter dans la solution (12) une enzyme Z capable de se fixer à la biotine (dl), puis un substrat 5 de cette enzyme capable de colorer la solution (d2), et enfin un réactif pour stopper la réaction enzymatique, e) déterminer la présence de l'élément E par mesure colorimétrique. L'étape a) consiste à fonctionnaliser le fond d'un contenant (10) avec au moins une molécule M'. La molécule M' est une molécule sur laquelle se fixe l'élément E lorsque M et E sont en solution. M et M' peuvent être identiques ou différentes. Préférentiellement M' est une molécule M, comme représenté sur la Figure 1.

La fixation de la molécule M' au fond du contenant (10) peut se faire par tout moyen adapté. Par exemple, la fixation peut être réalisée par substitution nucléophile, substitution électrophile, cycloaddition ou fixation électrostatique. En pratique, cette étape a) est réalisée en amont, et on utilise un contenant déjà fonctionnalisé avec la molécule M'.

L'étape b) consiste à déposer la solution (12), l'échantillon dans lequel il faut déterminer la présence et/ou doser la quantité d'élément E recherché. La solution (12) correspond à l'échantillon de solution directement prélevée ou bien à l'échantillon de solution prélevée ayant subi une préparation préalable en fonction du milieu d'origine, de façon à ce que la solution soit exploitable, par exemple en termes de conditions de pH, redox, pour que le métal E présente une spéciation lui permettant d'interagir au mieux avec M, M' et BM. Le volume de solution (12) nécessaire pour l'utilisation selon l'invention est préférentiellement d'au moins lmL, préférentiellement entre 1 et 10mL.

Le ou les élément(s) E contenus dans la solution (12) introduite dans le contenant (10) se fixent sur les molécules M'. L'étape c) consiste à ajouter dans le contenant (10) au moins une molécule BM. Ces molécules BM se fixent spécifiquement via le motif M sur les éléments E déjà fixés sur les molécules M' elles-mêmes fixées au fond du contenant (10). Préférentiellement, pour un volume de 100 à 200 pL de solution (12) présente dans le contenant (10), on ajoute préférentiellement 100 IL. d'une solution BM concentrée à 100pg/mL. On ajoute ensuite dans le contenant (10), à l'étape d), une enzyme Z capable de 10 se fixer à la biotine. Cette enzyme Z peut être notamment une avidineperoxydase ou une streptavidine-peroxydase. Les enzymes Z ajoutées se fixent de façon irréversible au motif biotine de la molécule BM. Préférentiellement, pour un volume de 100 à 200 IL. de solution (12) présente dans le contenant (10), on ajoute préférentiellement 100 IL. d'une 15 solution Z obtenue par une dilution de 1/2000 d'une solution mère. On ajoute ensuite un substrat 5 de cette enzyme capable de colorer la solution. Il peut s'agir par exemple du tétramethylbenzidine (TMB), du 3,3'- Diaminobenzidine (DAB), du 2,2'-azino-bis(3'-ethyl benzothiazoline-6-sulphonic acid) (ATBS), ou encore du o-phenylenediamine dihydrochloride (OPD). Lorsque 20 l'enzyme Z est une avidine-peroxydase ou une streptavidine-peroxydase, le substrat 5 peut être par exemple le tétraméthylbenzidine (TMB) qui entraîne une coloration qui passe d'incolore à bleue. Le temps de contact après ajout du substrat est d'au moins 1 minute, préférentiellement entre 1 et 60 minutes. 25 Après ce temps de contact, on ajoute un réactif pour stopper la réaction enzymatique et stabiliser l'intensité de la coloration. Il s'agit préférentiellement d'une solution acide, notamment un acide sulfurique, phosphorique ou chlorhydrique. C'est le cas en particulier lorsque Z est une avidine-peroxydase ou une streptavidine-peroxydase et 5 le tétraméthylbenzidine (TMB). Une fois la réaction stoppée, la coloration finale (qui du bleu est passée au jaune par exemple dans le cas du TMB) est stable.

La dernière étape du procédé consiste à déterminer la présence de l'élément E par mesure colorimétrique. Il peut s'agir d'une simple détection de changement de couleur à l'oeil nu. Préférentiellement, cette étape consiste à lire la densité optique de la solution (12) notamment, à l'aide d'un spectrophotomètre. Cela permet de quantifier la concentration des analytes en fonction de l'intensité d'absorption à une longueur d'onde donnée. En présence de l'élément E dans l'échantillon, la solution se colore et la variation de la coloration est directement proportionnelle à la concentration du métal E en solution.

Selon un autre mode de réalisation représenté sur la Figure 2, l'utilisation selon l'invention consiste en la mise en oeuvre d'un procédé comprenant les étapes suivantes : a) fixer au fond d'un contenant (10) une molécule F capable de fixer la biotine, b) déposer une solution (12) dans laquelle il faut déterminer la présence et/ou doser la quantité de l'élément E, c) ajouter dans la solution au moins deux molécules de biotine greffées avec au moins une molécule M, constituant des molécules BM, d) ajouter dans la solution une enzyme Z capable de se fixer à la biotine 25 (dl), puis un substrat 5 de cette enzyme Z capable de colorer la solution (d2), et enfin un réactif pour stopper la réaction enzymatique, e) déterminer la présence de l'élément E par mesure colorimétrique.

L'étape a) consiste à fonctionnaliser le fond d'un contenant (10) avec au moins une molécule F. La molécule F est une molécule sur laquelle se fixe la biotine lorsque un groupement biotine et F sont en contact. La molécule F peut par exemple être une avidine ou une streptavidine.

La fixation de la molécule F au fond du contenant (10) peut se faire par tout moyen adapté. Par exemple, la fixation peut être réalisée par substitution nucléophi le ou par interactions électrostatiques. En pratique, cette étape a) est réalisée en amont, et on utilise un contenant déjà fonctionnalisé avec la molécule F.

L'étape b) consiste à déposer la solution (12), l'échantillon dans lequel il faut déterminer la présence et/ou doser la quantité de métal E recherché. La solution (12) correspond à l'échantillon de solution directement prélevée ou bien à l'échantillon de solution prélevée ayant subi une préparation préalable en fonction du milieu d'origine, de façon à ce que la solution soit exploitable, par exemple en termes de conditions de pH, redox, pour que le métal E présente une spéciation lui permettant d'interagir au mieux avec M, F et BM. Le volume de solution (12) nécessaire pour l'utilisation selon l'invention est d'au moins 1mL, préférentiellement entre 1 et 10mL. Les éléments E présents dans la solution (12) versée dans le contenant (10) restent libres dans la solution (12). L'étape c) consiste ensuite à ajouter dans la solution (12) au moins deux molécules BM. Ces molécules se fixent spécifiquement via le motif M sur le ou les élément(s) E présent(s) dans la solution (12) pour former des complexes BM-EMB. Pour chaque complexe, un des deux motifs biotine libres se fixe sur une molécule F fixée au fond du contenant (10). Selon une variante représentée sur la Figure 3, les molécules BM sont introduites dans la solution (12) à analyser avant qu'elles ne soient introduites dans le contenant (10). Les complexes BM-E-MB se forment ainsi dans la solution (12) avant son introduction dans le contenant (10). bans ce cas, l'étape b) consiste à ajouter dans la solution (12) dans laquelle il faut déterminer la présence et/ou doser la quantité de l'élément E, au moins deux molécules BM, et l'étape c) à ajouter dans le contenant (10) la solution (12).

Les étapes d) et e) sont identiques à celles du premier mode de réalisation. Pour la mise en oeuvre de l'invention, le contenant (10) peut être tout contenant adapté, préférentiellement un puits disposé sur une plaque multi-puits du type microplaque. Selon l'un ou l'autre des modes de réalisation, les différentes étapes peuvent être éventuellement suivies d'un ou plusieurs lavages avec une solution tampon, pour éliminer l'excès de molécules n'ayant pas été fixé et pouvant interférer avec le dosage (BM et Z en particulier) . L'invention est particulièrement avantageuse pour détecter la présence et/ou doser sélectivement le Mercure, le Plomb, le Cuivre, le Cadmium, l'Arsenic, le Cobalt, le Fer, l'Aluminium, le Nickel, le Chrome, le Zinc ou l'Uranium dans diverses solutions aqueuses ou organiques. L'invention peut être utilisée notamment pour analyser la pollution en élément E dans des cours d'eau, des étendues d'eau ou des eaux de consommation, ou pour contrôler la dépollution en élément E d'une solution après un traitement dépolluant.

L'utilisation selon l'invention est rapide (une à quatre heures), facile et efficace. Elle constitue pour les laboratoires de contrôle et d'analyse et pour les autorités sanitaires, une alternative aux dosages longs et complexes, et leur permet ainsi de procéder à des dépistages précoces, le dosage, par spectrophotométrie par exemple, pouvant être réalisé sur terrain. be plus, l'utilisation selon l'invention permet de doser les métaux toxiques E dans leur forme globale. Il n'est nullement nécessaire de discriminer la forme du métal en solution, sauf dans le cas où l'on doit déterminer la nature de la pollution (naturelle, industrielle ou militaire), les métaux pouvant être enrichis en certains isotopes en fonction de sa provenance. L'utilisation selon l'invention peut être appliquée spécifiquement à la détection et/ou au dosage de l'Uranium. bans cette variante : - l'élément E est l'Uranium - la molécule M est un biphosphonate - la molécule BM est un biphosphonate biotinylé répondant à la formule suivante : avec X1 = 0 ou NH R1 = H ou OH X2 = une chai ne moléculaire composée d'un ou plusieurs des éléments suivants : C, H, 0, N, P, S.

Préférentiellement, X2 = i ou X2 = avec n = entier supérieur ou égal à 1. Cette molécule de biphosphonate biotinylé constitue un objet de l'invention. Elle peut être obtenue par greffage d'un biphosphonate sur une biotine par toute méthode de greffage adaptée connue de l'homme de l'art. La biotine et le biphosphonate peuvent être liés directement ou par l'intermédiaire d'un espaceur organique.

La molécule de biphosphonate biotinylé selon l'invention peur être utilisée spécifiquement pour la détection et/ou le dosage de l'Uranium, par la mise en oeuvre des procédés décrits précédemment et illustrés notamment sur les Figures 1 et 2. bans le cas où la molécule de biphosphonate biotinylé est utilisée pour la mise en oeuvre du procédé représenté notamment sur la Figure 1, la molécule M' est un bisphosphonate ou une pince di-biphosphonate. Ce biphosphonate peut être identique ou différent de la molécule M. Le procédé selon l'invention utilisant du biphosphonate biotinylé peut être utile pour toute application nécessitant le dosage de l'uranium en solution. Il peut être utilisé notamment pour analyser la pollution en uranium dans des cours d'eau ou des étendues d'eau, pour contrôler la dépollution en uranium de solutions après traitement, pour surveiller les radionucléides contenus dans les eaux de pluie ou même encore, pour doser l'uranium présent dans des échantillons d'urine notamment des travailleurs exposés (miniers, exploitants nucléaires, militaires, etc.). Il est utile pour le suivi de procédé de décontamination, par exemple pour contrôler la saturation des écorces contenues dans les stations de traitement telles que décrites dans la demande de brevet FR-0.957.024. Pour une utilisation optimisée, l'invention vise également un kit de dosage de l'uranium in situ comprenant des molécules de biphosphonates biotinylés. Préférentiellement, l'invention vise un kit pour la détection de l'Uranium en solution comprenant notamment : - une microplaque, dont les fonds des puits sont fonctionnalisés avec un biphosphonate ou une streptavidine ou une avidine, - du biphosphonate biotinylé, en poudre ou en solution, - une solution d'avidine-peroxydase ou de streptavidine-peroxydase, - une solution de substrat de l'avidine peroxydase ou de streptavidineperoxydase, - une solution pour stopper la réaction entre l'avidine-peroxydase ou la streptavidine-peroxydase et son substrat. be façon préférée, le kit comprend également : - une solution de passivation des microplaques, et/ou - du matériel de prélèvement, et/ou - une solution tampon, et/ou - des éléments documentaires relatifs à l'utilisation du kit d'un point de vue technique et/ou sécuritaire. L'invention est à présent illustrée par des exemples de molécules et d'utilisation selon l'invention. I. Exemple de biotine greffée avec une molécule M Un exemple de biotine greffée avec une molécule M utile selon l'invention est un alendronate biotinylé répondant à la formule suivante : Cette molécule peut être synthétisée selon le schéma de synthèse suivant : r - OH OH 1-10 Leq Cette synthèse consiste à utiliser la biotine-NHS qui est une forme de biotine activée via un groupement N-hydroxysuccinimidyl qui catalyse la substitution nucléophile (l'utilisation d'EDC permet de conserver cet effet catalytique) nécessaire au greffage de l'alendronate. C'est l'amine primaire de l'alendronate 261.EtC DMVHDD Ne* Nit 5 qui réagit sur la biotine-NHS. La réaction est réalisée dans un solvant mixte ()MF/tampon phosphate pH 7,0; le 1)MF solubilise préférentiellement la biotinNHS et le tampon solubilise l'alendronate. La réaction se fait donc en milieu dilué, si bien que le temps de réaction nécessaire est de neuf jours pour que la réaction soit totale. Le produit est ensuite isolé en réalisant dans un premier temps une évaporation à sec du solvant à l'évaporateur rotatif. Le brut réactionnel est ensuite dissous dans un volume minimum d'eau distillée. La molécule d'intérêt est enfin isolée pure, par simple précipitation à l'éthanol. La masse exacte du produit obtenu mesurée par HR-MS (spectrométrie de masse haute résolution) s'élève à 474,0873 g/mole. II. Exemple 1 d'utilisation selon l'invention pour la détection de l'Uranium bans ce premier exemple, l'utilisation consiste à mettre en oeuvre un procédé tel que représenté sur la Figure 1. L'étape a) consiste à fonctionnaliser les fonds des puits d'une microplaque avec un alendronate. bans cet exemple, la fixation du bisphosphonate au fond des puits se fait par substitution nucléophile. On dépose dans les puits 100 pl.. d'une solution d'un tampon carbonate pH 10 contenant 10 pg d'alendronate durant 2 heures. On réalise ensuite une série de 3 lavages (3x300 IL.) avec la solution tampon (PBS (phosphate) + 0.05% Tween 20) pour éliminer l'excès de molécules n'ayant pas été fixées au fond des puits. L'étape b) consiste ensuite à déposer l'échantillon à doser (de l'eau contenant ou non de l'Uranium) au fond des puits. Le volume d'échantillon nécessaire est de 200 IL. par puits et le temps de contact avec les puits est de 30 minutes.

On réalise ensuite 3 lavages (3x300 pl..) avec la solution tampon pour éliminer l'excès de molécules n'ayant pas été fixé au fond des puits.

L'étape c) consiste à déposer dans chaque puits 100 pl_ de la solution tampon pH 7.2 contenant 10 pg d'alendronate biotinylé tel que décrit au point I, sont déposés dans chaque puits. Le temps de contact est de 30 minutes. On réalise à nouveau 3 lavages (3x300 IL.) avec la solution tampon pour éliminer l'excès de molécules n'ayant pas été fixé au fond des puits. L'étape d) consiste à ajouter 2 IL. d'avidine peroxydase diluée dans 1 mL de solution tampon. Le temps de contact avec les puits est de 15 minutes et le volume d'enzyme diluée est de 100 IL.. On réalise à nouveau 3 lavages (3x300 pi.) avec la solution tampon pour éliminer l'excès de molécules n'ayant pas été fixé au fond des puits. On ajoute ensuite une solution de tétraméthylbenzidine (TMB) contenant également du péroxyde d'hydrogène nécessaire à la coloration. La coloration bleue est due à l'autocomplexation du TMB en présence du radical hydroxyle. Ce radical est obtenu en présence de peroxydase.

On utilise ensuite rapidement une solution d'acide chlorhydrique (100 pL/puits), nécessaire pour stopper la réaction enzymatique et stabiliser l'intensité de la coloration. Plusieurs acides (sulfurique, chlorhydrique...) peuvent être utilisés pour cette étape. Une fois la réaction stoppée, la coloration finale - jaune - est stable.

La dernière étape consiste à lire la densité optique à 450 nm de façon à quantifier la concentration en Uranium en fonction de l'intensité d'absorption (et donc de coloration) à cette longueur d'onde. bes essais réalisés en triplicats, mettant en oeuvre ce procédé, ont été réalisés : - trois puits correspondent aux blancs et ont été obtenus en utilisant comme échantillon à analyser de l'eau ultrapure, - trois puits correspondent à un test réalisé sur un échantillon d'eau contenant 1ppm (1000ppb) d'uranium.

Pour la lecture des résultats, une gamme avec des solutions contenant des teneurs en uranium différentes, est utilisée pour obtenir une courbe étalon établissant une relation de proportionnalité entre la DO obtenue lors d'un test et la concentration en uranium contenue dans l'échantillon (1 ppb = 1 pg/L). La courbe étalon est représentée sur la figure 4. La corrélation est de 100 % (R2 = 1) pour une courbe d'ordre 3 : y = 2 4 0x3 67x2 + 0.001x + 0.067. La courbe permet de transcrire une DO en une concentration en uranium, son coefficient de corrélation exprime la qualité de la reproductibilité du test (ici 100%). III. Exemple 2 d'utilisation selon l'invention pour la détection de l'Uranium bans ce second exemple, l'utilisation consiste à mettre en oeuvre une autre variante de l'invention. Pour cet exemple, on utilise les solutions suivantes : - Solution A : dissoudre 5 mg d'alendronate biotinylé de l'exemple I dans 50 mL de tampon PBS tween 20 - Solution B: préparer une solution de tampon PBS tween 20 contenant 1 % de caséine - Solution C: préparer une solution de tampon PBS tween 20 L'étape a) consiste à fonctionnaliser les fonds des puits d'une microplaque avec une streptavidine. La plaque est ensuite passivée avec 3001k./puits de la solution B durant 1 heure. On lave ensuite les puits avec la solution C 3x300 IL.. L'étape b) consiste ensuite à mettre en contact 100 pl... de la solution A avec 10 mL de l'échantillon à doser, durant 1 heure. L'étape c) consiste à déposer 200 IL. de ce mélange dans chaque puits, et à laisser en contact durant 1 heure. On lave ensuite avec la solution C 3x300 IL..

Les étapes suivantes sont identiques aux étapes d) et e) de l'exemple 1 (point II). Des essais réalisés en triplicats, mettant en oeuvre ce procédé ont été réalisés : - Première rangée : o trois puits correspondent aux blancs et ont été obtenus en utilisant comme échantillon à analyser de l'eau ultrapure o trois puits correspondent à un test réalisé sur un échantillon d'eau contenant 1Oppb (10pg/L) d'uranium o trois puits correspondent à un test réalisé sur un échantillon d'eau contenant 2Oppb (20pg/L) d'uranium o trois puits correspondent à un test réalisé sur un échantillon d'eau contenant 3Oppb (30pg/L) d'uranium - Deuxième rangée : o trois puits correspondent à un test réalisé sur un échantillon d'eau contenant 4Oppb (40pg/L) d'uranium o trois puits correspondent à un test réalisé sur un échantillon d'eau contenant 5Oppb (50pg/L) d'uranium o trois puits correspondent à un test réalisé sur un échantillon d'eau contenant 6Oppb (60pg/L) d'uranium o trois puits correspondent à un test réalisé sur un échantillon d'eau contenant 7Oppb (70pg/L) d'uranium. Pour la lecture des résultats, une gamme avec des solutions contenant des teneurs en uranium différentes, est utilisée pour obtenir une courbe étalon établissant une relation de proportionnalité entre la DO obtenue lors d'un test et la concentration en uranium contenue dans l'échantillon (1 ppb = 1 pg/L). La courbe étalon est représentée sur la figure 5. La courbe permet de transcrire une DO en une concentration en uranium.

Claims (19)

1. REVENDICATIONS1 Utilisation d'au moins une molécule de biotine greffée avec au moins une molécule M pour déterminer la présence et/ou doser la quantité dans une solution d'un élément E choisi parmi les métaux suivants -, Mercure, Plomb, Cuivre, Cadmium, Arsenic, Cobalt, Fer, Aluminium, Nickel, Chrome, Zinc et 5 Uranium, Ici molécule M étant une molécule capable de fixer ledit élément E.
2. 2. Utilisation selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle consiste en la mise en oeuvre d'un procédé comprenant les étapes suivantes: a) fixer au fond d'un contenant (10) au moins une molécule M' capable de fixer l'élément E, 10 b) déposer une solution (12) dons laquelle il faut déterminer la présence et/ou doser la quantité de l'élément E, c) ajouter dans la solution (12) au moins une biotine greffée avec au moins une molécule M constituant une molécule BM, d) ajouter dans la solution (12) une enzyme Z capable de se fixer à la 15 biotine, puis un substrat 5 de cette enzyme Z capable de colorer la solution, et enfin un réactif pour stopper la réaction enzymatique, e) déterminer la présence de l'élément E par mesure colorimétrique.
3. 3. Utilisation selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle consiste en la mise en oeuvre d'un procédé comprenant les étapes suivantes ; 20 a) fixer au fond d'un contenant (10) une molécule F capable de fixer la biotine, b) déposer une solution (12) dans laquelle il faut déterminer la présence et/ou doser la quantité de l'élément E, c) ajouter dans la solution au moins deux molécules de biotine greffées 25 avec au moins une molécule M, constituant des molécules SM,d) ajouter dans la solution une enzyme Z capable de se fixer à la biotine, puis un substrat 5 de cette enzyme Z capable de colorer la solution, et enfin un réactif pour stopper la réaction enzymatique, e) déterminer la présence de l'élément E par mesure calorimétrique.
4. 4. Utilisation selon lia revendication 1, caractérisée en ce qu'elle consiste en k mise en oeuvre d'un procédé comprenant les étapes suivantes a) fixer au fond d'un contenant (10) une molécule E capable de fixer la biotine, b) ajouter dans une solution (12) dans laquelle il faut déterminer la 10 présence et/ou doser la quantité de l'élément E, au moins deux molécules de biotine greffées avec au moins une molécule M, constituant des molécules 8 c) ajouter la solution (12) dans le contenant (10), d) ajouter dans fa solution une enzyme Z capable de se fixer à la biotine, puis un substrat 5 de cette enzyme Z capable de colorer la solution, et enfin un 15 réactif pour stopper la réaction enzymatique, e) déterminer la présence de l'élément E par mesure calorimétrique.
5. 5. Utilisation selon la revendication 3 ou 4, caractérisée en ce que la molécule fixée au fond du contenant capable de fixer la biotine est une streptavidine ou une avidine. 20
6. 6. Utilisation selon l'une des revendications 2 à 5, caractérisée en ce que l'enzyme capable de fixer la biotine à l'étape d) est ravidine-peroxydase ou la streptavidine-peroxydase.
7. 7. Utilisation selon l'une des revendications 12. el 6 c.aractérisée en ce que l'étape e) est réalisée par lecture de la densité optique. 25
8. 8. Utilisation selon rune des revendications 2 à 7, carac irisée en ce que le. contenant de l'étape a) est un puits d'une plaque multi-puits.
9. 9. Utilisation selon l'une des précédentes revendications, pour analyser la pollution en élément E dans des cours d'eau, des étendues d'eau ou des eaux de consommation.
10. 10. Utilisation selon rune des précédentes revendications, pour contrôler la dépollution en élément E d'une solution après un traitement dépolluant.
11. 11. Utilisation selon l'une des précédentes revendications, caractérisé en ce que l'élément E est l'Uranium et la biotine greffée avec la molécule M un biphosphonate biotinylé répondant à la formule : o NH OH HO -=O X2 Na o- P==o OH avec 10 Xi 0 ou NH - H ou OH X2 17. une ;chaine moléculaire composée d'un ou plusieurs de éléments suivants C, H, 0, N, P, 5.
12. 12. Utilisation selon la revendication 11, caractérisée en ce que X2 o 15 ou X2 avec n entier supérieur ôu égal à I.
13. 13. Utilisation selon l'une des revendications 11 ou 12, pour contrôler la saturation en Uranium des écorces contenues dans les stations de traitement.
14. 14. Utilisation selon l'une des revendications 11 ou 12, pour surveiller les 20 radionucléides contenus dans les eaux de .pluie, cours d'eau, étendues d'eau, eaux de consommation,
15. 15. Utilisation selon l'une des revendicôt ions n ou 121, doser l'uranium présent dans des échantillons d'urine.
16. 16. Molécule susceptible d'être utilisée selon l'une des revendications 11 à 15, caractérisée en ce qu'elle répond à la formule : avec X1 0 ou NH lk1 H ou OH X2 = une chaine moléculaire composée d'un ou plusieurs des éléments suivants C H, 0, N. P, 5,
17. 17. Molécule selon la revendication 16, caractérisée en ce que X2 = ou X2 r- avec n = entier supérieur ou égal al
18. 18. kit pour doser l'uranium dans des solutions comprenant au moins: - une microplaque, dont les fonds des puits sont fonctionnalisés avec un biphosphonate ou une streptavidine ou une avidine, - du biphosphonate biotinylé selon la revendication 17 ou 18, en poudre ou en solution, une solution d'avidine-peroxydase ou de streptavidine-peroxydase, - une solution de substrat de l'avidine peroxydase ou de streptavidineperoxydase, OH X2 R1 +Cf-P=0 Na OH NH- une solution pour stopper la réaction entre l'avidine-peroxydase ou la streptavicline-peroxydase et son substrat,
19. 19. kit pour doser l'uranium selon la revendication 18, caractérisé en ce qu'il comprend également : - une solution de passivation des rnicroplaques, et/ou - du matériel de prélèvement, et/ou - une solution tampon, et/ou - des éléments documentaires relatifs à l'utilisation du kit d'un point vue technique et/ou sécuritaire.