EP2529216A1 - Kit de detection de groupements fonctionnels carboxyliques - Google Patents

Kit de detection de groupements fonctionnels carboxyliques

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Publication number
EP2529216A1
EP2529216A1 EP11708519A EP11708519A EP2529216A1 EP 2529216 A1 EP2529216 A1 EP 2529216A1 EP 11708519 A EP11708519 A EP 11708519A EP 11708519 A EP11708519 A EP 11708519A EP 2529216 A1 EP2529216 A1 EP 2529216A1
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EP
European Patent Office
Prior art keywords
sample
analyzed
family
per
acid
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP11708519A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Bruno Coulomb
Fabien Robert-Peillard
Edwin Barco Palacio
Jean-Luc Boudenne
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Aix Marseille Universite
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Original Assignee
Aix Marseille Universite
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Aix Marseille Universite, Centre National de la Recherche Scientifique CNRS filed Critical Aix Marseille Universite
Publication of EP2529216A1 publication Critical patent/EP2529216A1/fr
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N31/00—Investigating or analysing non-biological materials by the use of the chemical methods specified in the subgroup; Apparatus specially adapted for such methods
    • G01N31/22—Investigating or analysing non-biological materials by the use of the chemical methods specified in the subgroup; Apparatus specially adapted for such methods using chemical indicators
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/75—Systems in which material is subjected to a chemical reaction, the progress or the result of the reaction being investigated
    • G01N21/77—Systems in which material is subjected to a chemical reaction, the progress or the result of the reaction being investigated by observing the effect on a chemical indicator
    • G01N2021/7769—Measurement method of reaction-produced change in sensor
    • G01N2021/7786—Fluorescence
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    • Y10T436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
    • Y10T436/20—Oxygen containing
    • Y10T436/200833—Carbonyl, ether, aldehyde or ketone containing
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    • Y10T436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
    • Y10T436/20—Oxygen containing
    • Y10T436/200833—Carbonyl, ether, aldehyde or ketone containing
    • Y10T436/201666—Carboxylic acid

Definitions

  • the invention is placed in the field of monitoring the quality of the environment, in particular in the study of soil quality, and more particularly in the management of waste and wastewater, particularly within sludge treatment plants using anaerobic processes (eg anaerobic digestion), in the context of the operation of biological wastewater treatment plants, as well as effluents and water from the food industry, or landfills, but also in the field of health.
  • anaerobic processes eg anaerobic digestion
  • the invention relates to a kit for the identification, characterization and quantification by single detection of the carboxylic, thiol and amine functional groups contained in a sample, as well as the use of said kit for identifying, characterizing and quantifying by single detection the groups functional carboxylic, thiols and amines contained in a sample.
  • dissolved organic compounds generally grouped under the term integrative organic dissolved carbon, DOC
  • DOC integrative organic dissolved carbon
  • a characterization of the functional groups is sometimes carried out by spectral analysis in the near-infrared (PIR) domain, by carbon nuclear magnetic resonance ( 13 C-NMR) or by pyrolysis coupled with chromatography. Gas phase and detection by mass spectrometry (Pyr-GC-MS).
  • the carboxylic function can be estimated by the separate quantification of short-chain aliphatic acids (formic acid, lactic acid, pyruvic acid, propionic acid, succinic acid, glyceric acid and citric acid) by ion chromatography or liquid chromatography generally coupled to a UV-visible conductimetric or spectrophotometric detector. .
  • Liquid chromatography (HPLC) can also be coupled to mass spectrometry detectors (LC / MS).
  • Gas chromatography (GC) has also been applied, coupled with flame ionization detectors or mass spectrometers, the carboxylic acids being quantified after a bypass step and a liquid-liquid extraction step or liquid-solid. More complex couplings of GC / EI-MS type (Electron impact mass spectrometry), CG / CI-MS (chemical ionization mass spectrometry) with quantification after micro-extraction in solid phase can also be mentioned.
  • carboxylic acids have been analyzed by capillary electrophoresis (CE). Some of these methods may have serious interference with di or trivalent metal cations, which can be reduced by adding EDTA before analysis.
  • Souza et al SR Souza et al., Journal of Chromatography A 796, 335-346, 1998) compared the analysis of 7 main carboxylic acids by ion chromatography (IC) and capillary electrophoresis coupled to a UV detector and concluded that the The choice of the analytical method depended on the type of sample analyzed, the IC method having the disadvantage of poorly separating the different acids, the method CE lacking in sensitivity.
  • the thiol function is contained in many sulfur compounds of biological or ecological importance, such as glutathione, phytochelatines, cysteine. These compounds are very often produced by plants or phytoplankton following stress induced by the presence of metal and / or organic micropollutants.
  • Kawakami et al (SK Kawakami et al., Trends in Analytical Chemistry, 25, 2, 133-142, 2006) have reviewed the main methods for detecting thiols in different biological or environmental matrices.
  • Thiols can be determined directly by different electrochemical methods: polarography, voltammetry or amperometry. These methods, however, have disadvantages of selectivity and matrix interference.
  • the thiols are generally dosed indirectly after derivation and separation by liquid chromatography or capillary electrophoresis with detection by visible UV spectrometry or mass spectrometry.
  • Lock and Davis J. Lock, J. Davis Trends in Analytical Chemistry, 21, 12, 807-815, 2002 have published a review of the various bypass agents mainly used for the determination of thiols: haloacetamide, maleimides, benzoxadizoles, isoindoles.
  • the determination of the amine function is generally carried out by separation of the amine compounds by liquid chromatography or capillary electrophoresis after derivatization.
  • A. ⁇ nal (A.Onal Food Chemistry 103, 1475-1486, 2007) has recently published a bibliographic review detailing the various methods of assaying amines of biological interest. It can be noted that the derivation of amines is mainly carried out by 4 compounds: o-phthalaldehyde (OPA), 5-dimethylaminonaphthalene-1-sulfonyl chloride (DNS), 4-chloro-7-nitrobenzofuran or 1,2-naphthoquinone- 4-sulfonate (NQS).
  • OPA o-phthalaldehyde
  • DMS 5-dimethylaminonaphthalene-1-sulfonyl chloride
  • NQS 4-chloro-7-nitrobenzofuran or 1,2-naphthoquinone- 4-sulfonate
  • Detection is provided by a UV-visible or fluorimetric detector.
  • the separation being provided by liquid chromatography or capillary electrophoresis, and detection by conductivity, enzymology or amperometry.
  • the most used method is the separation of dérivés derivatives.
  • OPA reacts with the primary amines in the presence of a thiol compound in a borate buffered medium. Recent research has been conducted to determine which thiol compound yields stable derivatives, or to synthesize reagents reactive with amines and forming more absorbent or more fluorescent derivatives. However, many of these newly synthesized compounds are not commercial.
  • the subject of the invention is a kit for the identification, characterization and quantification by single detection of the carboxylic, thiol and amine functional groups contained in a sample, comprising
  • the kit according to the invention requires only a reasonable investment in the equipment for its implementation which is simple and easily achievable on site.
  • the primary activating agent for carbons bearing carboxylic functional groups may be chosen from carbodiimides, such as, for example, 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC) or N-cyclohexyl- ⁇ , N- (2-morpholinoethyl) carbodiimide methyl-p-toluenesulphonate (CMC), or else N, N'-dicyclohexylcarbodiimide (DCC), ⁇ , ⁇ '-Diisopropylcarbodiimide (DIC), bis (trimethylsilyl) carbodiimide ( BTSC), and preferably EDC or CMC, very preferably EDC.
  • EDC 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide
  • CMC N-cyclohexyl- ⁇
  • the kit may further comprise at least one secondary activating agent, activator of carbodiimides, themselves activators of carbons carrying carboxylic functional groups, which may be chosen from N-hydroxysuccinimide (NHS) or 1-hydroxybenzotriazole (HOBT) or tetrafluorophenol (TTP) or 1-hydroxy-7-azabenzotriazole (HOAT), preferentially ⁇ .
  • activator of carbodiimides themselves activators of carbons carrying carboxylic functional groups, which may be chosen from N-hydroxysuccinimide (NHS) or 1-hydroxybenzotriazole (HOBT) or tetrafluorophenol (TTP) or 1-hydroxy-7-azabenzotriazole (HOAT), preferentially ⁇ .
  • NHS N-hydroxysuccinimide
  • HOBT 1-hydroxybenzotriazole
  • TTP tetrafluorophenol
  • HOAT 1-hydroxy-7-azabenzotriazole
  • the fluorescent primary amine may be a compound of the family of benzofurazanes, or of the aminophenanthrene family, or of the coumarin family, or of the family of "dansyl” derivatives, of N-1-ethylenediaminonaphthalene. (EDAN), or 5-aminofluorescein (5-AF), or monodansylcadaverine (MDC) or Nile Blue Chloride (NBCI), preferentially EDAN.
  • EDAN N-1-ethylenediaminonaphthalene.
  • 5-AF 5-aminofluorescein
  • MDC monodansylcadaverine
  • NBCI Nile Blue Chloride
  • the kit may furthermore comprise a solvent for extracting the fluorescent primary amine, which may be an organic solvent which is immiscible with water, such as, for example, methyl-tert-butyl ether ( MTBE), dibutyl ether (DBE), ethyl acetate, cyclohexane or else dichloromethane, preferentially MTBE.
  • a solvent for extracting the fluorescent primary amine which may be an organic solvent which is immiscible with water, such as, for example, methyl-tert-butyl ether ( MTBE), dibutyl ether (DBE), ethyl acetate, cyclohexane or else dichloromethane, preferentially MTBE.
  • MTBE methyl-tert-butyl ether
  • DBE dibutyl ether
  • ethyl acetate cyclohexane or else dichloromethane, preferentially MTBE.
  • the compound of the family of dialdehydes may for example be ⁇ -phthaldialdehyde (OPA) or naphthalene-2,3-dicarboxyaldehyde (NDA), preferably ⁇ .
  • OPA ⁇ -phthaldialdehyde
  • NDA naphthalene-2,3-dicarboxyaldehyde
  • the non-fluorescent amine may be 2-aminoethanol, glycine, valine, leucine, butylamine, tert-butylamine or else ⁇ - ⁇ -acetyl- L-lysine, preferably 2-aminoethanol.
  • the pH modulator may be a borate buffer, a phosphate buffer, a citrate buffer, an organic buffer such as HEPES (1-piperazineethane sulfonic acid) or a TRIS buffer (tris (hydroxymethyl) aminoethane) , preferably a borate buffer for the determination of thiols and amines and a phosphate buffer for the determination of carboxylic acids.
  • an organic buffer such as HEPES (1-piperazineethane sulfonic acid) or a TRIS buffer (tris (hydroxymethyl) aminoethane
  • the non-fluorescent thiol may be chosen from numerous thiol compounds such as glutathione, mercaptoacetic acid (or thioglycolic acid), cysteine, mercaptoethanesulphonic acid, 2-mercaptoethanol, 3- mercaptopropionic acid, 2-mercaptopropionic acid, mercaptosuccinic acid, N-acetyl-cysteine (NAC), methanethiol, monothioglycerol, sulphite salts or thiosulphate salts, preferably mercaptoethanol.
  • glutathione mercaptoacetic acid (or thioglycolic acid)
  • cysteine mercaptoethanesulphonic acid
  • 2-mercaptoethanol 3- mercaptopropionic acid
  • 2-mercaptopropionic acid 2-mercaptosuccinic acid
  • NAC N-acetyl-cysteine
  • methanethiol monothiogly
  • the kit may further comprise at least one reducing agent, which may advantageously be chosen from compounds of the family of hydrazines, hydrides and thiols, for example dithioerythritol (DTE) or dithiothritol. (DDT), or trialkylphosphines including tri-n-butylphosphine (TBP) or tris-2-carboxyethylphosphine hydrochloride (TCEP), preferably tris-2-carboxyethylphosphine hydrochloride.
  • DTE dithioerythritol
  • DDT dithiothritol
  • TBP tri-n-butylphosphine
  • TCEP tris-2-carboxyethylphosphine hydrochloride
  • the kit may further comprise a buffer for dissolving the sample to be tested, said buffer having a pH which may be between 3.5 and 5.5, preferably between 4.0 and 5. , 0, very preferentially 4.5.
  • the kit may further comprise an acid such as hydrochloric acid (HCl).
  • the kit may further comprise an inorganic base, such as sodium hydroxide (NaOH).
  • the kit may further comprise a fluorescence activator such as a surfactant or a compound of the cyclodextrin family, preferentially a surfactant, at a concentration of between 100 and 120% of its CMC (Critical Micellar Concentration), and very preferably 100% of the CMC.
  • a fluorescence activator such as a surfactant or a compound of the cyclodextrin family, preferentially a surfactant, at a concentration of between 100 and 120% of its CMC (Critical Micellar Concentration), and very preferably 100% of the CMC.
  • the kit may also comprise a halogenated active agent, which may be sodium hypochlorite, N-chlorosuccinimide or a compound of the chloramine family.
  • a halogenated active agent which may be sodium hypochlorite, N-chlorosuccinimide or a compound of the chloramine family.
  • the kit according to the invention can be in any desired form compatible with marketing.
  • it may be in the form of a multi-cellular plate, each cell comprising a sufficient quantity of each of the elements necessary for the identification, characterization and quantification by single detection of the carboxylic, thiol and amine functional groups contained in a sample. as previously described.
  • each cell may contain the elements necessary for the identification, characterization and quantification by single detection of the carboxylic, thiol and amine functional groups contained in a sample in an amount sufficient for analysis.
  • the elements necessary for the identification, characterization and quantification by single detection of the carboxylic, thiol and amine functional groups contained in a sample may be in liquid form and then the plate may be provided with means for closing the cells. or in freeze-dried form.
  • the kit according to the invention can also be integrated into an online analyzer.
  • the subject of the invention is also the use of a kit as described above, for the identification, characterization and quantification by single detection of the carboxylic, thiol and amine functional groups contained in a sample.
  • the kit for the identification, characterization and quantification by single detection of the carboxylic functional groups is simple, the solubility of the various constituents and the reactivity of the reagents of the kit are improved. In addition, the sample volume required for the reaction is decreased and interference is limited.
  • This kit can be implemented in a method for the identification, characterization and quantification by single detection of functional groups carboxylic acid (also in the text referred to as the process for determining carboxylic groups) in which
  • a sample to be analyzed previously sampled is mixed with a solution for dissolving said previously prepared test sample by mixing at least one buffer, a primary activating agent for the carbons carrying the carboxylic functional groups and a secondary activating agent. and incubating this mixture for a time of between 2 and 8 minutes, preferably between 4 and 6 minutes;
  • a fluorescent primary amine dissolved in ultrapure water or in a buffer is added to the mixture obtained in the first step;
  • a compound selected from members of the family of dialdehydes such as naphthalene-2,3-dicarboxyaldehyde (NDA) or ⁇ -phthaldialdehyde (OPA), preferentially ⁇ , previously dissolved in an aqueous buffer of basic pH (borate solution, phosphate, sodium hydroxide, etc.) at a pH of between 6 and 11, preferably between 8 and 9.5, very preferably between 8.5 and 9.5 or in a mixed solvent (organic solvent / water), at a pH of between 5 and 9, preferably 6.5, or in an organic solvent, preferably in an organic solvent.
  • aqueous buffer of basic pH borate solution, phosphate, sodium hydroxide, etc.
  • the induced fluorescence of the mixture obtained above is measured at a wavelength of between 390 and 490 nm, preferably 442 nm, after excitation at a wavelength of between 300 and 350 nm, preferably 335 nm.
  • a fifth step bn reports the value obtained in the fourth step on a standard curve previously established under the same conditions.
  • the buffer of the dissolution solution of the sample to be tested may be a phosphate buffer at a concentration which may be between 2 mM and 60 mM, preferably between 5 mM and 20 mM, very preferably 10 mM.
  • the dissolution solution of the sample to be tested may have a pH of between 2 and 6, preferably between 3.0 and 4.0, very preferably 3.5.
  • the primary activating agent for the carbons carrying the carboxylic functional groups may be chosen from compounds of the carbodiimide family, advantageously from 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC) or N-cyclohexyl-N '- (2-morpholinoethyl) carbodiimide methyl-p-toluene sulfonate (CMC), or ⁇ , ⁇ '-Dicyclohexylcarbodiimide (DCC), from ⁇ , ⁇ ' Diisopropylcarbodiimide (DIC), bis (trimethylsilyl) carbodiimide (BTSC).
  • EDC 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide
  • CMC N-cyclohexyl-N '
  • the primary activating agent for carbons carrying carboxylic functional groups may be EDC or CMC, very preferably EDC.
  • Said primary activating agent may be at a concentration of 0 and 100 mg per ml of sample to be analyzed, preferably 25 to 50 mg and very preferably 37.5 mg per ml of sample to be analyzed, dissolved in an organic solvent miscible with the water.
  • EDC it can be preferentially dissolved in ethanol.
  • the secondary activating agent of the primary activating agent described above can be chosen from NHS (N-hydroxysuccinimide) or 1-hydroxybenzotriazole (HOBT) or tetrafluorophenol (TTP) or 1-hydroxy-7-azabenzotriazole (HOAT), preferentially ⁇ .
  • Said secondary activating agent may be at a concentration of between 0 and 50 mg per ml of sample to be analyzed, preferably between 15 and 30 mg and very preferably 25 mg per ml of sample to be analyzed, dissolved in the dissolution solution of the sample. sample described in the first step ,.
  • the primary fluorescent amine in the second step of the process for determining the carboxylic groups, may be a compound of the family of benzofurazanes, or of the aminophenanthrene family, or of the coumarin family, or of the family "dansyl” derivatives, N-1-ethylenediaminonaphthalene (EDAN), or 5-aminofluorescein (5-AF), or monodansylcadaverine (MDC) or Nile Blue Chloride (NBCI), preferentially from NWS.
  • EDAN N-1-ethylenediaminonaphthalene
  • 5-AF 5-aminofluorescein
  • MDC monodansylcadaverine
  • NBCI Nile Blue Chloride
  • Said fluorescent primary amine may be at a concentration of between 0 and 100 mg per ml of sample to be analyzed, preferably between 25 and 50 mg per ml of sample to be analyzed, very preferably 37.5 mg per ml of sample to be analyzed, advantageously mixed with the liquid sample, at a pH between 5.5 and 11.0, preferably between 8.0 and 9.0, very preferably 8.7.
  • the dissolution buffer of the fluorescent primary amine may be a borate buffer.
  • the NDA or ⁇ is preferentially dissolved in an organic solvent, very preferably in ethanol.
  • the organic solvent constituting the mixed solvent is advantageously chosen from any organic solvent miscible with water, preferably ethanol.
  • the proportions between the organic solvent and water are of little importance, however advantageously according to the invention the mixed solvent (organic solvent / water) is preferably in proportions 75/25, very preferably in proportions 50 / 50.
  • the dialdehyde in the third step of the process for determining the carboxylic groups, may be at a concentration of between 0 and 200 mg per ml of sample to be analyzed, preferably between 20 and 100 mg per ml of sample to be analyzed. very preferably 50 mg per ml of sample to be analyzed.
  • the pH of the mixed solvent can be adjusted with an organic or inorganic base, such as a solution of borate, phosphate or even sodium hydroxide.
  • the fourth step it is possible to perform the fluorescence measurements using at least one pair of excitation / measurement wavelength but also several pairs, advantageously two pairs.
  • the reference carboxylic acid for establishing said previously established standard curve may be chosen from any monocarboxylic acid, for example acetic acid, propionic acid, butyric acid, valeric acid, formic acid, lactic acid, p-hydroxybenzoic acid, preferably acetic acid.
  • the kit for the identification, characterization and quantification by single detection of the thiol functional groups can be implemented in a process in which
  • a sample previously sampled is mixed with a compound chosen from members of the family of dialdehydes, such as naphthalene-2,3-dicarboxyaldehyde (NDA) or o-phthaldialdehyde (OPA) and a non-fluorescent amine preferably 2-aminoethanol, previously dissolved in a mixed solvent (organic solvent / water), at a pH of between 6 and 11, preferably between 8 and 9.5, very preferably between 8.5 and 9.5; b.
  • a compound chosen from members of the family of dialdehydes such as naphthalene-2,3-dicarboxyaldehyde (NDA) or o-phthaldialdehyde (OPA) and a non-fluorescent amine preferably 2-aminoethanol, previously dissolved in a mixed solvent (organic solvent / water), at a pH of between 6 and 11, preferably between 8 and 9.5, very preferably between 8.5 and 9.5; b.
  • the fluorescence of the mixture obtained in the first step after excitation is measured at a wavelength of 335 nm, and measures at a wavelength of 450 nm for the identification, characterization and quantification of the groups functional monothiols;
  • the values obtained in the third step are plotted on standard curves previously established under the same conditions with a compound bearing reference thiol groups.
  • the compound chosen from members of the family of dialdehydes may be naphthalene-2,3-dicarboxyaldehyde (NDA) or o-phthalldialdehyde (OPA), preferably ⁇ .
  • the non-fluorescent amine may be 2-aminoethanol, glycine, valine, leucine, butylamine, tert-butylamine or else ⁇ - ⁇ -acetyl L-lysine, preferably 2-aminoethanol.
  • the organic solvent constituting the mixed solvent is advantageously chosen from any organic solvent miscible with water, preferably methanol.
  • the proportions between the organic solvent and the water are of little importance, however, advantageously according to the invention, the mixed solvent (organic solvent / water) is preferably in proportions of 75/25, very preferably in proportions of about 40.degree. / 60.
  • a reducing agent in the first step of the thiol detection process, may be added chosen from compounds of the family of hydrazines, hydrides and thiols, for example dithioerythritol (DTE) or dithiothritol.
  • DTE dithioerythritol
  • dithiothritol dithiothritol
  • DDT trialkylphosphines including tri-n-butylphosphine (TBP) or else tris-2-carboxyethylphosphine hydrochloride (TCEP), preferably tri-n-butylphosphine, advantageously dissolved in any miscible organic solvent with water, preferably methanol or tris-2-carboxyethylphosphine, advantageously dissolved in an aqueous buffer, and an organic solvent immiscible with water, preferably dichloromethane, in order to reduce the oxidized thiol compounds to monothiol compounds .
  • TBP tri-n-butylphosphine
  • TCEP tris-2-carboxyethylphosphine hydrochloride
  • EDTA ethylene-diamine-tetraacetic acid
  • the fluorescence of the aqueous phase obtained in the first step after excitation is measured wavelength of 335 nm, and measures at a wavelength of 450 nm for the identification, characterization and quantification of total thiol functional groups.
  • the fluorescence measurements using at least one excitation / measurement wavelength pair but also several pairs, advantageously two pairs.
  • a fluorescence activator in the second step of the thiol detection method, may be added as a surfactant or a compound of the cyclodextrin family, preferably a surfactant, and very preferably BRU, at a concentration between 100 and 120% of its CMC (Critical Micellar Concentration), and very preferably 100% of its CMC.
  • CMC Cosmetic Micellar Concentration
  • the reference thiol-containing compound in the third step of the thiol detection method, may be chosen from mercaptoacetic acid (or thioglycolic acid), cysteine, mercaptoethanesulphonic acid and 2-mercaptoethanol, 3-mercaptopropionic acid, glutathione, 2-mercaptopropionic acid, mercaptosuccinic acid, methanethiol, monothioglycerol, preferentially glutathione or cysteine, and very preferably cysteine.
  • the kit for the identification, characterization and quantification by single detection of the amino functional groups can be implemented in a process in which:
  • a sample previously sampled is mixed with a compound chosen from the members of the family of dialdehydes and a non-fluorescent thiol compound such as mercaptoethanol, N-acetylcysteine (NAC), or else the acid 3-mercapto-propionic acid, said thiol compound being previously dissolved in solution at a pH of between 6 and 11, preferably between 9 and 10.5, in an aqueous solvent or in a mixed solvent organic solvent / water;
  • a non-fluorescent thiol compound such as mercaptoethanol, N-acetylcysteine (NAC), or else the acid 3-mercapto-propionic acid
  • the fluorescence of the mixture obtained in the first step is measured at a wavelength of between 430 and 460 nm after excitation at a wavelength between 330 and 340 nm, for the identification, the characterization and the quantification of amino functional groups;
  • the values obtained in the second step are plotted on standard curves previously established under the same conditions with a compound bearing reference amino groups.
  • the compound chosen from members of the family of dialdehydes may be naphthalene-2,3-dicarboxaldehyde (NDA) or ⁇ -phthaldialdehyde (OPA), preferably ⁇ .
  • the non-fluorescent thiol compound may be chosen from numerous thiol compounds such as mercaptoethanol, N-acetyl-cysteine (NAC) or 3-mercaptopropionic acid, preferably 2-mercaptoethanol.
  • thiol compounds such as mercaptoethanol, N-acetyl-cysteine (NAC) or 3-mercaptopropionic acid, preferably 2-mercaptoethanol.
  • the mixed solvent organic solvent / water is advantageously constituted by an organic solvent completely miscible with water, preferably methanol.
  • the reference amino group-bearing compound in the third step of the amine detection method, may be chosen from primary amines, secondary amines, tertiary amines or amino acids, preferably aminoethanol, glycine or butylamine and very preferably glycine.
  • a halogenated active agent which may be sodium hypochlorite, N-chlorosuccinimide or a compound of the family.
  • chloramines preferably sodium hypochlorite, to convert secondary and tertiary amines into primary amines.
  • the measurement of the fluorescence which occurs at the end of the analysis procedure can be carried out on any fluorescence spectrophotometer, particularly on a microplate reader such as those made by PERKIN ELMER or TECAN. According to the invention, it is possible to carry out the fluorescence measurements using at least one excitation / measurement wavelength pair but also several pairs, advantageously two pairs.
  • the sample may be a sample of waste or wastewater or soil, or sludge from a sludge treatment unit by methanation, advantageously in anaerobic processes, a sample from the operation of biological treatment plants, or a sample from the field of health (biological fluids such as urine, blood, salivary samples, sweat, ).
  • kit according to the invention makes it possible at the same time to identify, characterize and single detection quantification (microplate fluorescence) of the carboxylic, thiol and amine functional groups contained in a sample.
  • Figure 1 shows a calibration curve established with acetic acid at concentrations between 25 and 2500 mg / L. The figure shows the fluorescence intensity measured at 396 nm after excitation at 335 nm as a function of the acetic acid concentration.
  • FIG. 2 shows the perfect correlation between the measurements carried out using the kit according to the invention and the measurements carried out according to the standard method (determination of these carboxylic acids by ion chromatography with detection by conductimetry).
  • a reference curve is carried out under the same conditions as those to which the sample was subjected with acetic acid at concentrations of between 25 and 2500 mg / l.
  • This standard curve is shown in FIG. 1.
  • the value of the fluorescence intensity of the sample is then plotted on the standard curve (FIG. 1); it is then possible to express the result of this analysis in equivalent acetic acid and thus to determine the number of equivalent acetic acid in the sample

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Abstract

L'invention a pour objet un kit pour l'identification, la caractérisation et la quantification par détection unique des groupements fonctionnels carboxyliques, thiols et amines contenus dans un échantillon.

Description

Kit de détection de groupements fonctionnels carboxyliques.
L'invention se place dans le domaine de la surveillance de la qualité de l'environnement, en particulier dans l'étude de la qualité des sols, et plus particulièrement encore dans la gestion des déchets et des eaux usées, notamment au sein d'unités de traitement de boues par procédés anaérobies (méthanisation par exemple), dans le cadre de l'exploitation des stations d'épuration biologiques, ainsi qu'au niveau des effluents et eaux de l'industrie agro-alimentaire, ou encore de décharges, mais également dans le domaine de la santé.
L'invention concerne un kit pour l'identification, la caractérisation et la quantification par détection unique des groupements fonctionnels carboxyliques, thiols et aminés contenus dans un échantillon, ainsi que l'utilisation dudit kit pour identifier, caractériser et quantifier par détection unique les groupements fonctionnels carboxyliques, thiols et aminés contenus dans un échantillon.
L'identification de la nature des composés organiques dissous (généralement regroupés sous le terme intégratif de Carbone Organique Dissous, COD) est limitée à une semi-spéciation permettant de déterminer la teneur en composés hydrophiles et hydrophobes (séparation sur résines macroporeuses par filtration de gel puis par ultrafiltration), à estimer un indice d'humification ou, dans le meilleur des cas, en différentes fractions réalisées par extractions séquentielles sur résines ioniques ou non ioniques permettant de définir des teneurs en composés plus ou moins biodisponibles suivant les extractants utilisés.
En aval de ces étapes d'extraction, une caractérisation des groupements fonctionnels est parfois réalisée par analyse spectrale dans le domaine du proche infrarouge (PIR), par Résonance Magnétique Nucléaire du carbone (RMN-C13) ou par Pyrolyse couplée à la Chromatographie en phase Gazeuse et détection par Spectrométrie de Masse (Pyr-CG-SM.).
La fonction carboxylique peut être estimée par la quantification séparée des acides aliphatiques à chaîne carbonée courte (acides formique, lactique, pyruvique, propionique, succinique, glycérique et citrique) par chromatographie ionique ou chromatographie liquide généralement couplée à un détecteur conductimétrique ou spectrophotométrique UV-visible. La chromatographie liquide (HPLC) peut également être couplée à des détecteurs de spectrométrie de masse (LC/MS). La chromatographie en phase gazeuse (GC) a également été appliquée, couplée à des détecteurs à ionisation de flamme ou à des spectromètres de masse, les acides carboxyliques étant quantifiés après une étape de dérivation et une étape d'extraction liquide-liquide ou solide-liquide. On peut également citer des couplages plus complexes de type GC/EI- MS (Spectrométrie de masse à impact d'électron), CG/CI-MS (spectrométrie de masse avec ionisation chimique) avec quantification après micro-extraction en phase solide.
Plus récemment, les acides carboxyliques ont été analysés par électrophorèse capillaire (CE). Certaines de ces méthodes peuvent présenter des interférences sérieuses avec des cations métalliques di ou trivalents, qui peuvent être réduites par l'ajout d'EDTA avant analyse. Souza et collaborateurs (S.R. Souza et al. Journal of Chromatography A 796, 335-346, 1998) ont comparé l'analyse de 7 acides carboxyliques principaux par chromatographie ionique (IC) et électrophorèse capillaire couplées à un détecteur UV et ont conclu que le choix de la méthode analytique dépendait du type d'échantillon analysé, la méthode IC présentant l'inconvénient de mal séparer les différents acides, la méthode CE manquant quant à elle de sensibilité.
Pour améliorer les caractéristiques analytiques de ces méthodes chromatographiques, de nombreux travaux se sont orientés vers la dérivation des acides carboxyliques, afin de former un sous-produit présentant par exemple une fluorescence très intense et permettant une quantification très sensible. Pour atteindre des rendements de dérivation suffisants, il est préalablement nécessaire de procéder à l'activation du groupement carboxylique, à l'aide de réactifs tels que carbodiimides, sels de pyridinium ou disulfites. Pour la dérivation, de nombreux composés fluorescents peuvent être utilisés. Les plus courants sont les bromoalkyles, les diazométhanes, les hydrazines, et les aminés.
La fonction thiol est contenue dans de nombreux composés soufrés d'importance biologique ou écologique, tels que glutathion, phytochélatines, cystéine. Ces composés sont très souvent produits par des plantes ou du phytoplancton suite à un stress induit par la présence de micropolluants métalliques et/ou organiques. Kawakami et collaborateurs (S.K. Kawakami et al. Trends in Analytical Chemistry, 25, 2, 133-142, 2006) ont effectué une revue des principales méthodes de détection des thiols dans différentes matrices biologiques ou environnementales. Les thiols peuvent être dosés directement par différentes méthodes électrochimiques : polarographie, voltamétrie ou bien ampérométrie. Ces méthodes présentent cependant des inconvénients de sélectivité et d'interférences de matrices. Plus classiquement, les thiols sont généralement dosés indirectement après dérivation et séparation par chromatographie liquide ou électrophorèse capillaire avec détection par spectrométrie UV visible ou spectrométrie de masse. Lock et Davis (J. Lock, J. Davis Trends in Analytical Chemistry, 21 , 12, 807-815, 2002) ont publié une revue des différents agents de dérivation principalement utilisés pour le dosage des thiols : haloacétamide, maleimides, benzoxadizoles, isoindoles.
Le dosage de la fonction aminé est généralement effectué par séparation des composés aminés par chromatographie liquide ou électrophorèse capillaire après dérivation. A. Ônal (A. Ônal Food Chemistry 103, 1475-1486, 2007) a récemment publié une revue bibliographique détaillant les différentes méthodes de dosages des aminés d'intérêt biologique. On peut y relever que la dérivation des aminés est principalement réalisée par 4 composés : o-phthalaldéhyde (OPA), Chlorure de 5- dimethylaminonaphtalene-1-sulfonyle (DNS), 4-chloro-7-nitrobenzofurane ou 1 ,2- naphtoquinone-4-sulfonate (NQS). La détection est assurée par un détecteur UV-visible ou fluorimétrique. Il n'existe que quelques méthodes dans lesquelles l'étape de dérivation préalable n'est pas utilisée, la séparation étant assurée par chromatographie liquide ou électrophorèse capillaire, et la détection par conductimétrie, enzymologie ou ampérométrie. La méthode la plus utilisée reste cependant la séparation des dérivés de ΟΡΑ. L'OPA réagit avec les aminés primaires en présence d'un composé thiol, en milieu tamponné par le borate. Des recherches récentes ont été menées afin de déterminer quel composé thiol donne des dérivés stables, ou bien encore pour synthétiser des réactifs réagissant avec les aminés et formant des dérivés plus absorbants ou plus fluorescents. Cependant, nombre de ces composés nouvellement synthétisés ne sont pas commerciaux.
On constate donc que la plupart des méthodes de quantification des composés carboxyliques, thiols ou aminés passent par une étape de séparation chromatographique ou électrophorétique. Ceci induit des temps d'analyse relativement long (10 à 30 minutes suivant les méthodes). D'autre part, ces méthodes utilisent un matériel assez complexe d'utilisation et ne pouvant être mis en œuvre qu'en laboratoire.
II existe donc un besoin en méthodes d'identification, de caractérisation et de quantification par détection unique des groupements fonctionnels carboxyliques, thiols et aminés contenus dans un échantillon simples, rapides, peu coûteuses et surtout utilisables sur le terrain sans avoir besoin de mettre en œuvre des équipements lourds et coûteux.
C'est un des buts de l'invention.
Ainsi l'invention a pour objet un kit pour l'identification, la caractérisation et la quantification par détection unique des groupements fonctionnels carboxyliques, thiols et aminés contenus dans un échantillon, comprenant
a. au moins un agent activateur primaire des carbones porteurs des groupements fonctionnels carboxyliques ;
b. au moins une aminé primaire fluorescente, c. au moins un composé de la famille des dialdéhydes ;
d. au moins une aminé non fluorescente ;
e. au moins un tampon modulateur de pH ;
f. au moins un thiol non fluorescent.
Le kit selon l'invention ne nécessite qu'un investissement raisonnable au niveau de l'appareillage pour sa mise en oeuvre qui est simple et facilement réalisable sur site.
La mise en œuvre dudit kit, bien que ne permettant pas une quantification séparée de tous les composés carboxyliques, aminés ou thiols contenus dans l'échantillon, permet la quantification globale des groupements fonctionnels visés (concentration totale en thiols et concentration totale en aminés, concentration totale en acides carboxyliques aliphatiques : Acides Gras Volatils = AGV) et donne en quelques minutes une indication fiable sur la qualité d'une eau, d'un sol ou d'un déchet, ou bien encore l'état de fonctionnement d'un procédé de traitement.
Selon l'invention, quel que soit le procédé utilisé, il est possible d'effectuer les mesures de fluorescence en utilisant au moins un couple de longueur d'onde d'excitation/mesure mais également plusieurs couples, avantageusement deux couples.
Selon l'invention, l'agent activateur primaire des carbones porteurs des groupements fonctionnels carboxyliques peut être choisi parmi les carbodiimides, comme par exemple le 1-éthyl-3-(3-diméthylaminopropyl)-carbodiimide (EDC) ou le N- Cyclohexyl-A/'-(2-morpholinoethyl)carbodiimide méthyl-p-toluènesulfonate (CMC), ou encore le N, N'-dicyclohexylcarbodiimide (DCC), le Ν,Ν'-Diisopropylcarbodiimide (DIC), le Bis(triméthylsilyl)carbodiimide (BTSC), et préférentiellement de l'EDC ou du CMC, très préférentiellement de l'EDC.
Selon une variante de l'invention, le kit peut comprendre en outre au moins un agent activateur secondaire, activateur des carbodiimides, eux-mêmes activateurs des carbones porteurs des groupements fonctionnels carboxyliques, qui peuvent être choisis parmi la N-hydroxysuccinimide (NHS) ou du 1-hydroxybenzotriazole (HOBT) ou du tétrafluorophénol (TTP) ou du 1 -hydroxy-7-azabenzotriazole (HOAT), préférentiellement de ΙΉΟΑΤ.
Selon l'invention, l'aminé primaire fluorescente peut être un composé de la famille des benzofurazanes, ou de la famille des aminophénanthrènes, ou de la famille des coumarines, ou de la famille des dérivés "dansyles", du N-1- éthylènediaminonaphthalène (EDAN), ou de la 5-aminofluorescéine (5-AF), ou de la monodansylcadavérine (MDC) ou du chlorure de bleu du Nil (NBCI), préférentiellement de l'EDAN. Selon une autre variante de l'invention, le kit peut comprendre en outre un solvant d'extraction de l'aminé primaire fluorescente, qui peut être un solvant organique, non miscible à l'eau, comme par exemple du méthyl-tertiobutyl éther (MTBE), du dibutyl éther (DBE), de l'acétate d'éthyle, du cyclohexane ou encore du dichlorométhane, préférentiellement du MTBE.
Selon l'invention le composé de la famille des dialdéhydes peut par exemple être de ο-phthaldialdéhyde (OPA) ou du naphtalène-2,3-dicarboxyaldéhyde (NDA), préférentiellement de ΟΡΑ.
Toujours selon l'invention, l'aminé non fluorescente peut être du 2-aminoéthanol, de la glycine, de la valine, de la leucine, de la butylamine, de la tert-butylamine ou bien encore de la Ν-ε-acétyl-L-lysine, préférentiellement du 2-aminoéthanol.
Selon encore l'invention, le modulateur de pH peut être un tampon borate, un tampon phosphate, un tampon citrate, un tampon organique comme l'HEPES (acide 1- Piperazineethane sulfonique) ou encore un tampon TRIS (tris(hydroxymethyl)aminoéthane), préférentiellement un tampon borate pour la détermination des thiols et des aminés et un tampon phosphate pour la détermination des acides carboxyliques.
Toujours selon l'invention, le thiol non fluorescent peut être choisi parmi de nombreux composés thiols tels que le glutathion, l'acide mercaptoacétique (ou thioglycolique), la cystéine, l'acide mercaptoéthanesulfonique, le 2-mercaptoéthanol, l'acide 3-mercaptopropionique, l'acide 2-mercaptopropionique, l'acide mercaptosuccinique, de la N-acétyl-cystéine (NAC), le méthanethiol, le monothioglycérol, des sels de sulfites ou encore des sels de thiosulfates, préférentiellement le mercaptoéthanol.
Selon une autre variante de l'invention, le kit peut en outre comprendre au moins un agent réducteur, pouvant être avantageusement choisi parmi les composés de la famille des hydrazines, des hydrures, des thiols comme par exemple le dithioérythritol (DTE) ou le dithiothritol (DDT), ou des trialkylphosphines dont la tri-n-butylphosphine (TBP) ou encore de l'hydrochlorure de tris-2-carboxyéthyl-phosphine (TCEP), préférentiellement de l'hydrochlorure de tris-2-carboxyéthyl-phosphine.
Selon une autre variante de l'invention, le kit peut en outre comprendre un tampon de dissolution de l'échantillon à tester, ledit tampon ayant un pH pouvant être compris entre 3,5 et 5,5, préférentiellement entre 4,0 et 5,0, très préférentiellement 4,5.
Selon une autre variante de l'invention, le kit peut en outre comprendre un acide comme par exemple de l'acide chlorhydrique (HCI). Selon encore une autre variante de l'invention, le kit peut en outre comprendre une base inorganique, comme de la soude (NaOH).
Selon encore une autre variante de l'invention, le kit peut en outre comprendre un activateur de fluorescence comme un tensioactif (ou surfactant) ou un composé de la famille des cyclodextrines, préférentiellement un tensioactif, à une concentration comprise entre 100 et 120% de sa CMC (Concentration Micellaire Critique), et très préférentiellement 100% de la CMC.
Selon une autre variante de l'invention, le kit peut également comprendre un agent actif halogéné, qui peut être de l'hypochlorite de sodium, de la N-chlorosuccinimide ou bien encore un composé de la famille des chloramines.
Le kit selon l'invention peut se présenter sous toutes les formes souhaitées compatibles avec une commercialisation. Avantageusement il pourra se présenter sous la forme d'une plaque multialvéolaire, chaque alvéole comprenant une quantité suffisante de chacun des éléments nécessaires à l'identification, la caractérisation et la quantification par détection unique des groupements fonctionnels carboxyliques, thiols et aminés contenus dans un échantillon tels que décrits précédemment. Selon cette variante, chaque alvéole peut contenir les éléments nécessaires à l'identification, la caractérisation et la quantification par détection unique des groupements fonctionnels carboxyliques, thiols et aminés contenus dans un échantillon en quantité suffisante pour une analyse. Selon encore cette variante les éléments nécessaires pour l'identification, la caractérisation et la quantification par détection unique des groupements fonctionnels carboxyliques, thiols et aminés contenus dans un échantillon peuvent être sous forme liquide et alors la plaque pourra être munie de moyen de fermeture des alvéoles, ou encore sous forme lyophilisée.
Le kit selon l'invention peut également être intégré dans un analyseur en ligne.
L'invention a aussi pour objet l'utilisation d'un kit tel que décrit précédemment, pour l'identification, la caractérisation et la quantification par détection unique des groupements fonctionnels carboxyliques, thiols et aminés contenus dans un échantillon.
Selon l'invention, le kit pour l'identification, la caractérisation et la quantification par détection unique des groupements fonctionnels carboxyliques est simple, la solubilité des différents constituants et la réactivité des réactifs du kit sont améliorées. De plus, le volume d'échantillon nécessaire à la réaction est diminué et les interférences sont limitées.
Ce kit peut être mis en œuvre dans un procédé pour l'identification, la caractérisation et la quantification par détection unique des groupements fonctionnels carboxyliques (par ailleurs dans le texte dénommé procédé de détermination des groupements carboxyliques) dans lequel
a. Dans une première étape on mélange un échantillon à analyser préalablement prélevé, avec une solution de dissolution dudit échantillon à tester préalablement préparée par mélange d'au moins un tampon, un agent activateur primaire des carbones porteurs des groupements fonctionnels carboxyliques et un agent activateur secondaire, et on incube ce mélange pendant un temps compris entre 2 et 8 minutes, préférentiel lement entre 4 et 6 minutes ;
b. dans une seconde étape on ajoute au mélange obtenu à la première étape une aminé primaire fluorescente dissoute dans de l'eau ultrapure ou dans un tampon ;
c. dans une troisième étape on ajoute au mélange obtenu à la seconde étape, un composé choisi parmi les membres de la famille des dialdéhydes, comme la naphtalène-2,3-dicarboxyaldéhyde (NDA) ou Γο-phthaldialdéhyde (OPA), préférentiellement ΓΟΡΑ, préalablement dissout dans un tampon aqueux de pH basique (solution de borate, phosphate, hydroxyde de sodium...) à un pH compris entre 6 et 11 , préférentiellement entre 8 et 9,5, très préférentiellement entre 8,5 et 9,5 ou dans un solvant mixte (solvant organique/eau), à un pH compris entre 5 et 9, préférentiellement 6,5, ou dans un solvant organique, préférentiellement dans un solvant organique. d. dans une quatrième étape on mesure la fluorescence induite du mélange obtenu précédemment à une longueur d'onde comprise entre 390 et 490 nm, de préférence 442 nm, après excitation à une longueur d'onde comprise entre 300 à 350 nm, de préférence 335 nm,
e. dans une cinquième étape bn reporte la valeur obtenue à la quatrième étape sur une courbe étalon préalablement établie dans les mêmes conditions.
Selon l'invention, à la première étape du procédé de détermination des groupements carboxyliques, le tampon de la solution de dissolution de l'échantillon à tester peut être un tampon phosphate à une concentration qui peut être comprise entre 2 mM et 60 mM, préférentiellement entre 5 mM et 20 mM, très préférentiellement 10 mM.
Toujours à la première étape dudit procédé, la solution de dissolution de l'échantillon à tester peut avoir un pH compris entre 2 et 6, préférentiellement entre 3.0 et 4.0, très préférentiellement 3.5. Toujours à la première étape du procédé de détermination des groupements carboxyliques, l'agent activateur primaire des carbones porteurs des groupements fonctionnels carboxyliques peut être choisi parmi les composés de la famille des carbodiimides, avantageusement parmi le 1-éthyl-3-(3-diméthylaminopropyl)- carbodiimide (EDC) ou le N-cyclohexyl-N'-(2-morpholinoéthyl)carbodiimide méthyl-p- - toluène sulfonate (CMC), ou encore le Ν,Ν'-Dicyclohexylcarbodiimide (DCC), du Ν,Ν'- Diisopropylcarbodiimide (DIC), le Bis(triméthylsilyl)carbodiimide (BTSC). Préférentiellement l'agent activateur primaire des carbones porteurs des groupements fonctionnels carboxyliques pourra être de l'EDC ou du CMC, très préférentiellement de l'EDC. Ledit agent activateur primaire peut être à une concentration de 0 et 100 mg par ml d'échantillon à analyser, préférentiellement de 25 à 50 mg et très préférentiellement 37,5 mg par ml d'échantillon à analyser, dissout dans un solvant organique miscible à l'eau. Dans le cas de l'EDC, celui-ci peut être préférentiellement dissout dans de l'éthanol.
Selon l'invention, toujours à ladite première étape, l'agent activateur secondaire de l'agent activateur primaire décrit précédemment, peut être choisi parmi la NHS (N- hydroxysuccinimide) ou la 1-hydroxybenzotriazole (HOBT) ou le tétrafluorophénol (TTP) ou le 1-hydroxy-7-azabenzotriazole (HOAT), préférentiellement de ΙΉΟΑΤ. Ledit agent activateur secondaire peut être à une concentration comprise entre 0 et 50 mg par ml d'échantillon à analyser, préférentiellement entre 15 et 30 mg et très préférentiellement 25 mg par ml d'échantillon à analyser, dissout dans la solution de dissolution de l'échantillon décrite à la première étape,.
Selon l'invention, à la seconde étape du procédé de détermination des groupements carboxyliques, l'aminé primaire fluorescente peut être un composé de la famille des benzofurazanes, ou de la famille des aminophénanthrènes, ou de la famille des coumarines, ou de la famille des dérivés "dansyles", du N-1- éthylènediaminonaphthalene (EDAN), ou de la 5-aminofluorescéine (5-AF), ou de la monodansylcadaverine (MDC) ou du chlorure de bleu du Nil (NBCI), préférentiellement de l'EDAN. Ladite aminé primaire fluorescente peut être à une concentration comprise entre 0 et 100 mg par ml d'échantillon à analyser, préférentiellement entre 25 et 50 mg par ml d'échantillon à analyser, très préférentiellement 37.5 mg par ml d'échantillon à analyser, avantageusement mélangé à l'échantillon liquide, à un pH compris entre 5.5 et 11.0, préférentiellement entre 8.0 et 9.0, très préférentiellement 8.7.
Selon l'invention, toujours à la seconde étape du procédé de détermination des groupements carboxyliques, le tampon de dissolution de l'aminé primaire fluorescente peut être un tampon borate. Selon l'invention, à la troisième étape du procédé de détermination des groupements carboxyliques, le NDA ou ΟΡΑ est préférentiellement dissoute dans un solvant organique, très préférentiellement dans l'éthanol.
Toujours à cette troisième étape, le solvant organique constituant le solvant mixte (solvant organique/eau) est avantageusement choisi parmi tout solvant organique miscible à l'eau, préférentiellement de l'éthanol. Les proportions entre le solvant organique et l'eau n'ont que peu d'importance, cependant avantageusement selon l'invention le solvant mixte (solvant organique/eau), est préférentiellement dans des proportions 75/25, très préférentiellement dans des proportions 50/50.
Selon l'invention, à la troisième étape du procédé de détermination des groupements carboxyliques, le dialdéhyde peut être à une concentration comprise entre 0 et 200mg par ml d'échantillon à analyser, préférentiellement entre 20 et 100 mg par ml d'échantillon à analyser, très préférentiellement 50 mg par ml d'échantillon à analyser.
Selon l'invention, toujours à la troisième étape, le pH du solvant mixte peut être ajusté avec une base organique ou inorganique, comme une solution de borate, de phosphate ou bien encore d'hydroxyde de sodium.
Selon l'invention, à la quatrième étape, il est possible d'effectuer les mesures de fluorescence en utilisant au moins un couple de longueur d'onde d'excitation/mesure mais également plusieurs couples, avantageusement deux couples.
Selon l'invention, à la cinquième étape du procédé de détermination des groupements carboxyliques, l'acide carboxylique de référence pour établir ladite courbe étalon préalablement établie, peut être choisi parmi tout acide monocarboxylique, comme par exemple l'acide acétique, l'acide propionique, l'acide butyrique, l'acide valérique, l'acide formique, l'acide lactique, l'acide p-hydroxybenzoique, préférentiellement l'acide acétique.
Selon l'invention, le kit pour l'identification, la caractérisation et la quantification par détection unique des groupements fonctionnels thiols (par ailleurs procédé de détections des thiols) peut être mis en œuvre dans un procédé dans lequel
a. dans une première étape on mélange un échantillon préalablement prélevé, avec un composé choisi parmi les membres de la famille des dialdéhydes, comme la naphtalène-2,3-dicarboxyaldéhyde (NDA) ou l'o-phthaldialdéhyde (OPA) et une aminé non fluorescente, préférentiellement le 2-aminoéthanol, préalablement dissous dans un solvant mixte (solvant organique/eau), à pH compris entre 6 et 11 , préférentiellement entre 8 et 9,5, très préférentiellement entre 8,5 et 9,5 ; b. dans une deuxième étape on mesure la fluorescence du mélange obtenu à la première étape après excitation à une longueur d'onde de 335 nm, et mesure à une longueur d'onde de 450 nm pour l'identification, la caractérisation et la quantification des groupements fonctionnels monothiols ;
c. Dans une troisième étape on reporte les valeurs obtenues à la troisième étape sur des courbes étalons préalablement établies dans les mêmes conditions avec un composé porteur de groupements thiols de référence. Selon l'invention, à la première étape du procédé de détection des thiols, le composé choisi parmi les membres de la famille des dialdéhydes, peut être le naphtalène-2,3-dicarboxyaldéhyde (NDA) ou ο-phthaldialdéhyde (OPA), préférentiellement ΟΡΑ.
De même à cette première étape, l'aminé non fluorescente peut être du 2- aminoéthanol, de la glycine, de la valine, de la leucine, de la butylamine, de la tert- butylamine ou bien encore de la Ν-ε-acétyl-L-lysine, préférentiellement du 2- aminoéthanol.
Toujours à cette première étape, le solvant organique constituant le solvant mixte (solvant organique/eau) est avantageusement choisi parmi tout solvant organique miscible à l'eau, préférentiellement du méthanol. Les proportions entre le solvant organique et l'eau n'ont que peu d'importance, cependant avantageusement selon l'invention le solvant mixte (solvant organique/eau), est préférentiellement dans des proportions 75/25, très préférentiellement dans des proportions 40/60.
Selon une variante de l'invention, à la première étape du procédé de détection des thiols on peut ajouter un agent réducteur choisi parmi les composés de la famille des hydrazines, des hydrures, des thiols comme par exemple le dithioérythritol (DTE) ou le dithiothritol (DDT), ou des trialkylphosphines dont la tri-n-butylphosphine (TBP) ou encore de l'hydrochlorure de tris-2-carboxyéthyl-phosphine (TCEP), préférentiellement la tri-n-butylphosphine, avantageusement dissoute dans tout solvant organique miscible à l'eau, préférentiellement du méthanol ou la tris-2-carboxyethyl- phosphine, avantageusement dissoute dans un tampon aqueux, et un solvant organique non miscible à l'eau, préférentiellement du dichlorométhane, afin de réduire les composés thiols oxydés en composés monothiols. Selon une variante de l'invention, à cette première étape du procédé, on peut également ajouter de l'acide ethylène-diamine-tetraacétique (EDTA) afin d'éviter la ré-oxydation des thiols réduits et de limiter les interférences des éléments métalliques.
A la deuxième étape du procédé de détection des thiols, on mesure la fluorescence de la phase aqueuse obtenue à la première étape après excitation à une longueur d'onde de 335 nm, et mesure à une longueur d'onde de 450 nm pour l'identification, la caractérisation et la quantification des groupements fonctionnels thiols totaux.
Selon l'invention, à la deuxième étape, il est possible d'effectuer les mesures de fluorescence en utilisant au moins un couple de longueur d'onde d'excitation/mesure mais également plusieurs couples, avantageusement deux couples.
Selon une variante de l'invention, à la deuxième étape du procédé de détection des thiols, on peut ajouter un activateur de fluorescence comme un tensioactif (ou surfactant) ou un composé de la famille des cyclodextrines, préférentiel lement un tensioactif, et très préférentiellement le BRU, à une concentration comprise entre 100 et 120% de sa CMC (Concentration Micellaire Critique), et très préférentiellement 100% de sa CMC.
Selon l'invention, à la troisième étape du procédé de détection des thiols, le composé porteur de groupements thiols de référence peut être choisi parmi l'acide mercaptoacétique (ou thioglycolique), la cystéine, l'acide mercaptoéthanesulfonique, le 2-mercaptoéthanol, l'acide 3-mercaptopropionique, le glutathion, l'acide 2- mercaptopropionique, l'acide mercaptosuccinique, le méthanethiol, la monothioglycérol, préférentiellement le glutathion ou la cystéine, et très préférentiellement la cystéine.
Selon l'invention, le kit pour l'identification, la caractérisation et la quantification par détection unique des groupements fonctionnels aminés (par ailleurs procédé détection des aminés) peut être mis en œuvre dans un procédé dans lequel :
a dans une première étape on mélange un échantillon préalablement prélevé, avec un composé choisi parmi les membres de la famille des dialdéhydes et un composé thiol non fluorescent tel que le mercaptoéthanol, la N-acétyl- cystéine (NAC), ou encore l'acide 3-mercapto propionique, ledit composé thiol étant préalablement dissous en solution à pH compris entre 6 et 11 , préférentiellement entre 9 et 10,5, dans un solvant aqueux ou dans un solvant mixte solvant organique/eau ;
b. dans une deuxième étape, on mesure la fluorescence du mélange obtenu à la première étape à une longueur d'onde comprise entre 430 et 460 nm après excitation à une longueur d'onde comprise entre 330 et 340 nm, pour l'identification, la caractérisation et la quantification des groupements fonctionnels aminés ;
c. dans une troisième étape, on reporte les valeurs obtenues à la deuxième étape sur des courbes étalons préalablement établies dans les mêmes conditions avec un composé porteur de groupements aminés de référence. Selon l'invention, à la première étape du procédé de détection des aminés, le composé choisi parmi les membres de la famille des dialdéhydes peut être le naphthalène-2,3-dicarboxaldéhyde (NDA) ou Γο-phthaldialdéhyde (OPA), préférentiellement ΟΡΑ.
Toujours à cette première étape le composé thiol non fluorescent peut être choisi parmi de nombreux composés thiols tels que le mercaptoéthanol, la N-acétyl-cystéine (NAC), ou encore l'acide 3-mercaptopropionique, préférentiellement le 2-mercaptoéthanol.
Toujours à cette première étape, le solvant mixte solvant organique/eau est avantageusement constitué d'un solvant organique totalement miscible à l'eau, préférentiellement du méthanol.
Selon l'invention, à la troisième étape du procédé de détection des aminés, le composé porteur de groupements aminés de référence peut être choisi parmi des aminés primaires, des aminés secondaires, des aminés tertiaires ou des acides aminés, préférentiellement l'aminoéthanol, la glycine ou la butylamine et très préférentiellement la glycine.
Selon une variante de l'invention, à la première étape du procédé de détection des aminés, on peut ajouter un agent actif halogéné, qui peut être de l'hypochlorite de sodium, de la N-chlorosuccinimide ou bien encore un composé de la famille des chloramines, préférentiellement de l'hypochlorite de sodium, afin de transformer les aminés secondaires et tertiaires en aminés primaires.
Selon l'invention, la mesure de la fluorescence qui intervient en fin de procédure d'analyse peut être réalisée sur tout spectrophotomètre à fluorescence, particulièrement sur un lecteur de microplaques tels ceux de marque PERKIN ELMER ou TECAN. Selon l'invention, il est possible d'effectuer les mesures de fluorescence en utilisant au moins un couple de longueur d'onde d'excitation/mesure mais également plusieurs couples, avantageusement deux couples.
Selon l'invention, l'échantillon peut être un échantillon de déchets ou d'eaux usées ou de sols, ou de boues issues d'une unité de traitement de boues par méthanisation, avantageusement dans les procédés anaérobies, un échantillon issu de l'exploitation des stations d'épuration biologiques, ou encore un échantillon issu du domaine de la santé (fluides biologiques tels que des urines, du sang, des échantillons salivaires, de la sueur, ...).
On comprend bien entendu que l'un des intérêts du kit selon l'invention est qu'il permet de réaliser dans le même temps l'identification, la caractérisation et la quantification par détection unique (fluorescence sur microplaque) des groupements fonctionnels carboxyliques, thiols et aminés contenus dans un échantillon.
La Figure 1 présente une courbe de calibration établie avec de l'acide acétique à des concentrations comprises entre 25 et 2500 mg/L. La figure présente l'intensité de la fluorescence mesurée à 396 nm après excitation à 335 nm en fonction de la concentration en acide acétique.
La Figure 2 présente la parfaite corrélation entre les mesures réalisées à l'aide du kit selon l'invention et les mesures réalisées selon la méthode standard (détermination de ces acides carboxyliques par chromatographie ionique avec détection par conductimétrie).
D'autres caractéristiques et avantages de l'invention ressortiront mieux des exemples qui suivent, donnés à titre illustratif et non limitatif.
Exemple 1
Dans un puits d'une microplaque 96 puits noire en polypropylène on introduit 150 pL d'une solution d'HOAT à 2 mg/mL dissout dans du tampon phosphate 10 mM. Le pH de cette solution a été ajusté à un pH de 3,5. On ajoute ensuite 8 pL d'un échantillon de boues de station d'épuration centrifugé et filtré sur filtre à fibre de verre 0,8 pm. Le pH de cet échantillon a été ajusté à un pH compris entre 3,5 et 5,5. A cette solution sont ajoutés 18 pL d'une solution d'EDC à 3 mg/180 pL d'éthanol.
Après agitation et incubation à 40 °C pendant 4 minutes, on ajoute 50 pL d'une solution d'EDAN à 3 mg/500 pL tampon borate 50 mM pH 8.7. Le mélange est agité et incubé à 40 °C pendant 2 minutes.
On ajoute alors au mélange précédemment obtenu 18 pL d'une solution d'OPA à
4 mg/180 pL d'éthanol. Le mélange est agité et incubé à 40 °C pendant 12 minutes, et on mesure la fluorescence grâce à un lecteur de fluorescence de microplaques à une longueur d'onde d'excitation de 335 nm et une longueur d'onde d'émission de 442 nm.
Parallèlement, une courbe de référence est réalisée dans les mêmes conditions que celles auxquelles l'échantillon a été soumis avec de l'acide acétique à des concentrations comprises entre 25 et 2500 mg/L. Cette courbe étalon est présentée à la figure 1. La valeur de l'intensité de fluorescence de l'échantillon est ensuite reportée sur la courbe étalon (Figure 1) ; il est alors possible d'exprimer le résultat de cette analyse en équivalent acide acétique et donc de déterminer le nombre d'équivalent acide acétique dans l'échantillon

Claims

REVENDICATIONS
1. ) Procédé pour l'identification, la caractérisation et la quantification par détection unique des groupements fonctionnels carboxyliques, dans lequel
a. dans une première étape on mélange un échantillon à analyser préalablement prélevé, avec une solution de dissolution dudit échantillon à tester préalablement préparée par mélange d'au moins un tampon, un agent activateur primaire des carbones porteurs des groupements fonctionnels carboxyliques et un agent activateur secondaire, et on incube ce mélange pendant un temps donné ;
b. dans une seconde étape on ajoute au mélange obtenu à la première étape une aminé primaire fluorescente dissoute dans de l'eau ultrapure ou dans un tampon ;
c. dans une troisième étape on ajoute au mélange obtenu à la seconde étape, un composé choisi parmi les membres de la famille des dialdéhydes, préalablement dissout dans un tampon aqueux de pH basique ou dans un solvant organique, ou dans un solvant mixte (solvant organique/eau).
d. dans une quatrième étape on mesure la fluorescence induite du mélange obtenu précédemment à une longueur d'onde comprise entre 390 et 490 nm, de préférence 442 nm, après excitation à une longueur d'onde comprise entre 300 à 350 nm, de préférence 335 nm.
e. dans une cinquième étape on reporte la valeur obtenue à la quatrième étape sur une courbe étalon préalablement établie dans les mêmes conditions.
2. ) Procédé selon la revendication 1 , caractérisé en ce qu'à la première étape le tampon de la solution de dissolution de l'échantillon à tester est un tampon phosphate à une concentration comprise entre 2 mM et 60 mM, préférentiellement entre 5 mM et 20 mM, très préférentiellement 10 mM.
3. ) Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce que à la première étape la solution de dissolution de l'échantillon à tester a un pH compris entre 2 et 6, préférentiellement entre 3,0 et 4,0, très préférentiellement 3.5.
4. ) Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que à la première étape l'agent activateur primaire des carbones porteurs des groupements fonctionnels carboxyliques est choisi parmi les composés de la famille des carbodiimides, avantageusement parmi le 1 -éthyl-3-(3- diméthylaminopropy -carbodiimide (EDC) ou le N-cyclohexyl-N'-(2- morpholinoéthyl)carbodiimide méthyl-p-toluène sulfonate (CMC), ou encore le Ν,Ν'-Dicyclohexylcarbodiimide (DCC), du Ν,Ν'-Diisopropylcarbodiimide (DIC), le Bis(triméthylsilyl)carbodiimide (BTSC), préférentiellement de l'EDC ou du CMC, très préférentiellement de l'EDC.
5.) Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce qu'à ladite première étape, l'agent activateur primaire est à une concentration comprise entre 0 et 100 mg par ml d'échantillon à analyser, préférentiellement entre 25 et 50 mg par ml d'échantillon à analyser, très préférentiellement 37,5 mg par ml d'échantillon à analyser.
6.) Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce qu'à la première étape l'agent activateur secondaire de l'agent activateur primaire décrit précédemment, est choisi parmi la NHS (N-hydroxysuccinimide) ou la 1- hydroxybenzotriazole (HOBT) ou le tétrafluorophénol (TTP), le 1-hydroxy-7-aza- benzotriazole (HOAT), préférentiellement de ΙΉΟΑΤ.
7.) Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce qu'à ladite première étape, l'agent activateur secondaire est à une concentration comprise entre 0 et 50mg par ml d'échantillon à analyser, préférentiellement entre 15 et 30 mg par ml d'échantillon à analyser, très préférentiellement 25 mg par ml d'échantillon à analyser.
8.) Procédé selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisé en ce qu'à la première étape le mélange est incubé pendant un temps compris entre 2 et 8 minutes, préférentiellement entre 4 et 6 minutes.
9. ) Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisé en ce que à la seconde étape l'aminé primaire fluorescente est ajoutée à une concentration finale comprise entre 0 et 100 mg par ml d'échantillon à analyser, préférentiellement entre 25 et 50 mg par ml d'échantillon à analyser, très préférentiellement 37,5 mg par ml d'échantillon à analyser.
10. ) Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, caractérisé en ce que le mélange obtenu à la seconde étape est à un pH compris entre 5,5 et 11 ,0, préférentiellement entre 8,0 et 9,0, très préférentiellement 8,7.
11. ) Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, caractérisé en ce que à la seconde étape l'aminé primaire fluorescente est un composé de la famille des benzofurazanes, ou de la famille des aminophénanthrènes, ou de la famille des coumarines, ou de la famille des dérivés "dansyles", du N-1- éthylènediaminonaphthalène (EDAN), ou de la 5-aminofluorescéine (5-AF), ou de la monodansylcadavérine (MDC) ou du chlorure de bleu du Nil (NBCI), préférentiellement de l'EDAN.
12. ) Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 11 , caractérisé en ce que à ladite deuxième étape, le tampon de dissolution de l'aminé primaire fluorescente est un tampon borate.
13. ) Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 12, caractérisé en ce qu'à ladite troisième étape, le composé choisi parmi les membres de la famille des dialdéhydes est choisi parmi la naphtalène-2,3-dicarboxyaldéhyde (NDA) ou Γο-phthaldialdéhyde (OPA), préférentiellement l'OPA.
14.) Procédé selon l'une quelconque des revendication 1 à 13, caractérisé en ce que à ladite troisième étape, le membre de la famille des dialdéhydes est dissout dans un solvant organique, très préférentiellement dans l'éthanol.
15. ) Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 14, caractérisé en ce que à ladite troisième étape, le tampon aqueux de pH basique est choisi parmi une solution de borate, une solution de phosphate ou une solution d'hydroxyde de sodium.
16. ) Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 15, caractérisé en ce qu'à ladite troisième étape, le solvant mixte est à un pH compris entre 5 et 9, préférentiellement 6,5.
17.) Procédé selon la revendication 16, caractérisé en ce que le pH du solvant mixte est ajusté avec une base organique ou inorganique.
18.) Procédé selon la revendication 17, caractérisé en ce que la base organique ou inorganique est choisie parmi une solution de borate, une solution de phosphate ou une solution d'hydroxyde de sodium.
19.) Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 18, caractérisé en ce qu'à ladite troisième étape, le solvant organique constituant le solvant mixte (solvant organique/eau) est avantageusement choisi parmi tout solvant organique miscible à l'eau, préférentiellement de l'éthanol.
20. ) Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 19, caractérisé en ce qu'à ladite troisième étape, le dialdéhyde est à une concentration comprise entre
0 et 200mg par ml d'échantillon à analyser, préférentiellement entre 20 et 100 mg par ml d'échantillon à analyser, très préférentiellement 50 mg par ml d'échantillon à analyser.
21. ) Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 20, caractérisé en ce que à la cinquième étape l'acide carboxylique de référence est choisi parmi tout acide monocarboxylique, comme par exemple l'acide acétique, l'acide propionique, l'acide butyrique, l'acide valérique, l'acide formique, l'acide lactique, l'acide p-hydroxybenzoique, préférentiellement l'acide acétique.
Kit pour l'identification, la caractérisation et la quantification par détection unique des groupements fonctionnels carboxyliques contenus dans un échantillon, comprenant
a. au moins un agent activateur primaire des carbones porteurs des groupements fonctionnels carboxyliques;
b. au moins une aminé primaire fluorescente
c. au moins un composé de la famille des dialdéhydes
d. au moins un tampon modulateur de pH
Kit pour l'identification, la caractérisation et la quantification par détection unique des groupements fonctionnels carboxyliques, thiols et aminés contenus dans un échantillon, comprenant
a. au moins un agent activateur primaire des carbones porteurs des groupements fonctionnels carboxyliques;
b. au moins une aminé primaire fluorescente
c. au moins un composé de la famille des dialdéhydes
d. au moins une aminé non fluorescente
e. au moins un tampon modulateur de pH
f. au moins un thiol non fluorescent.
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