WO2014084085A1 - 聴覚障害又は小脳性運動失調症の予防・治療剤 - Google Patents

聴覚障害又は小脳性運動失調症の予防・治療剤 Download PDF

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mice
test
hearing
cerebellar ataxia
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信孝 大神
昌志 加藤
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国立大学法人名古屋大学
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Definitions

  • the present invention relates to a drug effective for the prevention or treatment of hearing impairment or cerebellar ataxia and its use.
  • This application claims the priority based on the Japan patent application 2012-259456 for which it applied on November 28, 2012, The whole content of the said patent application is used by reference.
  • Non-patent Document 1 As an attempt to improve the neurophysiological functions governing hearing and movement, gene therapy in which a viral vector is directly placed in a target tissue such as the inner ear or cerebellum with a microinjector has been studied using experimental animals (Non-patent Document 1, 2). However, this method has not yet been clinically applied because of its extremely high risk.
  • An object of the present invention is to provide an effective preventive or therapeutic means against a decrease in neurophysiological functions governing hearing and exercise.
  • Non-patent Documents 3 and 4 tyrosine kinase receptor RET having nerve growth factor (GDNF) as a ligand plays an important role in the development of ganglia such as small intestine and inner ear.
  • GDNF nerve growth factor
  • Non-patent Document 5 Although there is a report that RET is expressed in Purkinje cells (Non-patent Document 5), the physiological role of RET in the cerebellum is completely unknown.
  • the present inventors examined using a RET dysfunctional mouse (RET-Y1062F-homoknock-in mouse) (Non-patent Document 6).
  • RET dysfunctional mice exhibited a cerebellar ataxia phenotype at 3 weeks of age.
  • RET dysfunctional mice were found to exhibit a cerebellar ataxia phenotype morphologically with a decrease in sonic hedgehog (Shh), one of the secretory factors essential for cerebellar nerve network construction.
  • Shh sonic hedgehog
  • Patched1 which is known as a suppressor of the shh signal transduction system, is expressed in cerebellar granule cells.
  • the present inventors can prevent cerebellar ataxia in RET dysfunctional mice by canceling “suppression by Patched1” if the amount of shh secretion is decreased in RET dysfunctional mice.
  • Patched1 miting RET dysfunctional mice and Patched1 knockout mice revealed that the symptoms of cerebellar ataxia can be reduced.
  • the shh signaling activator was administered at the time of 2-3 days after birth for the purpose of improving cerebellar ataxia in RET dysfunctional mice (once subcutaneous injection), it was significantly Symptoms of cerebellar ataxia improved.
  • Non-patent Document 4 the effectiveness of the shh signal transduction system activator administered by the same administration method as described above for the prevention of hearing loss was examined. As a result, it was found that this activator also exerts a preventive effect on hearing impairment.
  • shh signal transduction system activator is effective against cerebellar ataxia and hearing impairment.
  • shh signal transduction activator showed effective effects when administered subcutaneously immediately after birth until 7 days after birth.
  • a prophylactic / therapeutic agent for hearing impairment or cerebellar ataxia comprising a hedgehog signal transduction system activator.
  • a composition for prevention / treatment of hearing impairment or cerebellar ataxia comprising the prevention / treatment agent according to any one of [1] to [3].
  • the composition for prevention / treatment according to [4] which is a pharmaceutical, a quasi-drug, or a food.
  • a prophylactic / therapeutic agent according to any one of [1] to [3] or a prophylactic / therapeutic composition according to [4] or [5] is administered to a subject in a therapeutically effective amount.
  • a screening method for a substance effective for the prevention or treatment of hearing impairment comprising the following steps (1) to (4): (1) preparing multiple homo Ret-Y1062F-knock-in mice and dividing them into a test group and a control group; (2) administering a test substance to the test group; (3) For the test group after step (2), measure the hearing ability of 1 kHz to 40 kHz before and after noise loading of 80 to 112 dB for 5 to 60 minutes, and determine the level of hearing loss due to noise loading; (4) Compare the hearing loss level determined in step (3) with the hearing loss level determined for the control group treated in the same way as the test group, except that the test substance is not administered. Determining the effectiveness of the substance.
  • a screening method for a substance effective for the prevention or treatment of cerebellar ataxia comprising the following steps (1) to (4): (i) preparing a plurality of homo Ret-Y1062F-knock-in mice and dividing them into a test group and a control group; (ii) administering a test substance to the test group; (iii) for the test group after step (ii), detecting the presence or absence or degree of cerebellar ataxia; (iv) Compare the detection result in step (iii) with the detection result for the control group treated in the same way as the test group, except that the test substance is not administered. Determining.
  • the present invention relates to the use of a compound (hedgehog signal transduction system activator) that has been confirmed to be effective for hearing impairment and cerebellar ataxia.
  • the present invention includes hearing impairment or cerebellar movement comprising the compound.
  • a prophylactic / therapeutic agent for ataxia is provided.
  • SAG N-Methyl-N ′-(3-Pyridinylbenzyl) -N ′-(3-Chlorobenzo [b] thiophene-2-carbonyl) -1 which is a hedgehog signal transduction system activator , 4-Diaminocyclohexane
  • a hedgehog signal transduction system activator is used based on the fact that it is effective against hearing impairment and cerebellar ataxia.
  • Hedgehog signal transduction system activator refers to a substance that up-regulates the hedgehog signal transduction system (hereinafter referred to as “Hh signal transduction system”).
  • Hh signal transduction system The Hh signaling system plays an important role in embryogenesis, tissue regeneration, and stem cell renewal.
  • Hh signaling system is initiated by binding of Hh protein to Patched1.
  • Patched1 When the Hh protein binds to Patched1, the inhibition of Smoothened by Pathced1 is released, and the expression of the Hh target gene by Smo is promoted.
  • Smo The role of Smo is important in the Hh signal transduction system, and search and development of compounds targeting Smo have been carried out.
  • a compound targeting Smo that is, a Smo agonist is used as the Hh signal transduction system activator.
  • Smo agonists include SAG and its related compounds (for example, SAG1.1 (N-Methyl-N ′-(3- (4-benzonitrile) -4-methoxybenzyl) -N ′-(3-chlorobenzo [b] thiophene- 2-carbonyl) -1,4-diaminocyclohexane)), purmorphamine, Hh-Ag1.1 and its derivatives (Hh-Ag 1.2, Hh-Ag 1.3, Hh-Ag 1.4, Hh-Ag 1.5).
  • SAG or SAG1.1 is adopted.
  • SAG can be obtained in the form of hydrochloride or the like from, for example, EMD chemicals, Inc., santa cruz biotechnology, Inc.
  • prophylactic / therapeutic agent refers to a drug that exhibits a preventive and / or therapeutic effect on the target disease or condition, such as hearing impairment or cerebellar ataxia (hereinafter collectively referred to as “target disease”). That means.
  • a typical preventive effect is to prevent or delay the onset (onset) of the target disease.
  • the therapeutic effect includes alleviating the symptoms of the target disease (lightening), preventing or delaying the worsening of symptoms. The latter (preventing or delaying deterioration) can be regarded as one of the preventive effects in terms of preventing aggravation.
  • the preventive effect and the therapeutic effect are partially overlapping concepts, and it is difficult to clearly distinguish them from each other, and there is little practical benefit of doing so.
  • some preventive effect or therapeutic effect is shown with respect to a target disease, it corresponds to the preventive / therapeutic agent with respect to a target disease.
  • the term “deafness” is used as a term encompassing congenital deafness, age-related deafness, noise-induced deafness, and tinnitus.
  • Age-related deafness is sensorineural hearing loss caused by aging and is also called senile deafness. The cause is thought to be aging of the auditory center and sensory cells. Age-related hearing loss almost always occurs in both ears, and symptoms worsen with age. Age-related hearing loss often involves dizziness and tinnitus.
  • noise-induced hearing loss is a hearing loss caused by noise.
  • Noise-induced hearing loss is broadly divided into “professional hearing loss” that occurs when working for a long time under noise and “acoustic hearing loss (acoustic trauma)” that occurs when exposed to high volume at a concert or the like. Often accompanied by tinnitus.
  • Cerebellar ataxia is an ataxia that is accompanied by cerebellar disorders (cerebellar tumors, degenerative diseases, cerebellar atrophy, etc.) or caused by cerebellar disorders. Characterized by gait, balance dysfunction, conversion movement disorder, etc.
  • composition for prevention / treatment of hearing impairment or cerebellar ataxia provides a composition for preventing / treating hearing impairment or cerebellar ataxia, which comprises the preventive / therapeutic agent of the present invention.
  • the form of the composition of this invention is not specifically limited, Preferably it is a pharmaceutical, a quasi-drug, or a foodstuff. Two or more kinds of prophylactic / therapeutic agents may be used in combination.
  • Preparation of the pharmaceutical composition and quasi-drug composition of the present invention can be performed according to a conventional method.
  • other pharmaceutically acceptable ingredients for example, carriers, excipients, disintegrants, buffers, emulsifiers, suspending agents, soothing agents, stabilizers, preservatives, preservatives, physiological Saline solution and the like.
  • excipient lactose, starch, sorbitol, D-mannitol, sucrose and the like can be used.
  • disintegrant starch, carboxymethylcellulose, calcium carbonate and the like can be used. Phosphate, citrate, acetate, etc. can be used as the buffer.
  • emulsifier gum arabic, sodium alginate, tragacanth and the like can be used.
  • suspending agent glyceryl monostearate, aluminum monostearate, methyl cellulose, carboxymethyl cellulose, hydroxymethyl cellulose, sodium lauryl sulfate and the like can be used.
  • soothing agent benzyl alcohol, chlorobutanol, sorbitol and the like can be used.
  • stabilizer propylene glycol, ascorbic acid or the like can be used.
  • preservatives phenol, benzalkonium chloride, benzyl alcohol, chlorobutanol, methylparaben, and the like can be used.
  • preservatives benzalkonium chloride, paraoxybenzoic acid, chlorobutanol and the like can be used.
  • the dosage form in the case of formulating is also not particularly limited, and the pharmaceutical composition or pharmaceutical of the present invention can be used as tablets, powders, fine granules, granules, capsules, syrups, injections, external preparations, suppositories, etc.
  • An quasi-drug composition can be provided.
  • the pharmaceutical composition of the present invention contains an active ingredient in an amount necessary for obtaining an expected therapeutic effect or preventive effect (that is, a therapeutically effective amount).
  • the quasi-drug composition of the present invention contains an active ingredient in an amount necessary for obtaining the expected improvement effect, prevention effect and the like.
  • the amount of the active ingredient contained in the pharmaceutical composition or quasi-drug composition of the present invention generally varies depending on the dosage form and form, but the amount of the active ingredient is, for example, about 0.1% by weight to about 95% so that a desired dosage can be achieved. Set within the weight% range.
  • the pharmaceutical composition and quasi-drug composition of the present invention are oral or parenteral (intravenous, intraarterial, subcutaneous, intramuscular, or intraperitoneal injection, transdermal, nasal, transmucosal depending on the dosage form and form. , Application, etc.).
  • the “subject” here is not particularly limited, and includes humans and non-human mammals (including pet animals, domestic animals, laboratory animals. Specifically, for example, mice, rats, guinea pigs, hamsters, monkeys, cows, pigs, goats. , Sheep, dogs, cats, chickens, quails, etc.).
  • the application subject is a human.
  • the dosage and usage of the pharmaceutical composition and quasi-drug composition of the present invention are set so as to obtain the expected effect.
  • the symptom, age, sex, weight, etc. of the subject of application are generally considered.
  • a person skilled in the art can set an appropriate dose in consideration of these matters.
  • the administration schedule for example, once to several times a day, once every two days, or once every three days can be adopted.
  • the symptom of the application target, the duration of effect of the active ingredient, and the like can be considered.
  • one aspect of the present invention is a food composition containing the preventive / therapeutic agent of the present invention.
  • the “food composition” in the present invention include general foods (cereals, vegetables, meat, various processed foods, confectionery, milk, tea beverages, soft drinks, alcoholic beverages, etc.), dietary supplements (supplements, nutritional drinks) Etc.), food additives, foods for pets, nutritional supplements for pets.
  • Examples of the shape of the food composition of the present invention include powders, granule powders, gums, tablets, pastes, and liquids.
  • the food composition of the present invention preferably contains an active ingredient in an amount that can be expected to have a preventive or therapeutic effect.
  • the amount added can be determined in consideration of the medical condition, health status, age, sex, weight, etc. of the person to whom it is used.
  • the present invention also provides a method (in vivo screening method) for screening a substance effective for prevention / treatment of hearing impairment or cerebellar ataxia using an animal model.
  • the screening method utilizes RET dysfunctional mice (homo Ret-Y1062F-knock-in mice).
  • RET dysfunctional mice homo Ret-Y1062F-knock-in mice.
  • the following steps (1) to (4) are performed.
  • the substance selected by the screening method of this embodiment can be expected to have a preventive or therapeutic effect on hearing loss.
  • step (1) multiple homo Ret-Y1062F-knock-in mice are prepared and divided into a test group and a control group.
  • the number of individuals included in the test group and the control group is not particularly limited. In general, as the number of individuals used increases, a more reliable result can be obtained. However, handling a large number of individuals at the same time is difficult in terms of securing and operating (including breeding) the individuals to be used. Therefore, for example, the number of individuals included in each group is set to 1 to 50, preferably 2 to 30, and more preferably 3 to 20. Normally, the test group and the control group should have the same number of individuals.
  • the test substance is administered to the test group.
  • organic compounds or inorganic compounds having various molecular sizes can be used.
  • organic compounds include nucleic acids, peptides, proteins, lipids (simple lipids, complex lipids (phosphoglycerides, sphingolipids, glycosylglycerides, cerebrosides, etc.), prostaglandins, isoprenoids, terpenes, steroids, polyphenols, catechins, vitamins (B1 B2, B3, B5, B6, B7, B9, B12, C, A, D, E, etc.)
  • Existing components or candidate components such as pharmaceuticals and nutritional foods are also preferable test substances.
  • Plant extracts, cell extracts, culture supernatants, etc. may be used as test substances, and by adding two or more kinds of test substances at the same time, the interaction between the test substances, synergism, etc. will be investigated.
  • the test substance may be derived from a natural product or may be synthetic, in which case, for example, a combinatorial synthesis technique is used. It is possible to build an efficient screening system.
  • the administration mode of the test substance is not particularly limited.
  • food or drinking water containing the test substance is prepared and ingested.
  • a test substance or a solution containing the test substance is prepared and administered.
  • the administration method include oral administration, nasal administration, tracheal administration, intravenous, intraarterial, subcutaneous, intramuscular or intraperitoneal injection.
  • the test substance may be administered multiple times. In that case, each dose may be the same or different. You may decide to administer continuously.
  • the control group is reared under the same conditions except that the test substance is not administered.
  • a noise load is applied to the test group, and the hearing is measured before and after the noise load to determine the level of hearing loss due to the noise load.
  • a noise load 80 to 112 dB and 5 to 60 minutes is employed.
  • the noise load is 82 dB for 10 minutes.
  • the hearing ability to be measured ranges from 1 kHz to 40 kHz.
  • Preferably 12 kHz hearing is measured.
  • an auditory brainstem reaction can be used to determine the hearing loss level.
  • the “auditory brainstem reaction” is a potential in the brainstem (brainstem reaction) obtained by exciting the auditory nervous system.
  • the level of hearing ability can be examined with good reproducibility.
  • Test methods using the auditory brainstem reaction are widely used to determine hearing loss.
  • ABR Handbook Edited by Kimi Takashi Kaga (Kanehara Publishing)
  • a pure tone hearing test or the like may be used.
  • step (4) the effectiveness of the test substance is determined using the hearing loss level of the test group and the hearing loss level of the control group. Specifically, the hearing loss level determined in step (3) (ie, the hearing loss level of the test group) and the hearing loss level determined for the control group treated in the same manner as the test group, except that the test substance is not administered. To determine whether the test substance is effective. At that time, an indicator that “a small hearing loss level is effective in the prevention and treatment of hearing impairment” is used. Therefore, when the hearing loss level of the test group is smaller than the hearing loss level determined for the control group, that is, when the hearing loss level is improved by administration of the test substance, the test is conducted for prevention / treatment of hearing impairment. It will be determined that the substance is effective.
  • Steps (1) to (4) may be performed again using a plurality of test compounds that have been confirmed to be effective to narrow down highly effective substances.
  • the following steps (i) to (iv) are performed in order to find a substance effective for the prevention or treatment of cerebellar ataxia.
  • (i) preparing a plurality of homo Ret-Y1062F-knock-in mice and dividing them into a test group and a control group (ii) administering a test substance to the test group (iii) for the test group after step (ii), Step of detecting presence or absence or degree of cerebellar ataxia
  • the detection result of step (iii) and the detection result of the control group treated in the same manner as the test group except that the test substance is not administered. Step of comparing and determining the effectiveness of the test substance based on the comparison result
  • Steps (i) and (ii) are the same as steps (1) and (2), respectively, and the description thereof is omitted.
  • step (iii) the presence or absence or degree of cerebellar ataxia is detected for the test group administered with the test substance. For example, a rotarod test, a walking pattern test, or both are performed to determine the presence or absence of cerebellar ataxia.
  • step (iv) the detection result of the test group and the detection result of the control group are compared to determine the effectiveness of the test substance. Specifically, “recognizing improvement in cerebellar ataxia in the test group” is adopted as an efficacy index, and the effectiveness of the test substance is determined.
  • Steps (i) to (iv) may be performed again using a plurality of test compounds that have been confirmed to be effective to narrow down highly effective substances.
  • Phenotype of RET dysfunctional mouse (homo-type Ret-Y1062F-knock-in mouse) (1) Method Genetically engineered so that the 1063 tyrosine of the Ret protein is replaced with phenylalanine, and point mutations are introduced into the Ret genes of both alleles
  • the cerebellar physiological function of the homozygous knock-in mouse (Homo Ret-Y1062F-knock-in mouse) (Non-patent Document 6) was analyzed.
  • a specific method is as follows. On the 21st day after the completion of cerebellar development, a rotor rod analysis (rotation speed: 10 or 25 rpm) was performed according to the method of a past paper (Non-Patent Document 7).
  • the mouse was walked on the rod and the time to drop from the rod was measured for up to 2 minutes. A total of 6 measurements were taken at 5 minute intervals.
  • the walking pattern analysis was performed according to the method of a past paper (Non-Patent Document 8). The mouse was placed on one end in a 14 x 44 cm box with red paint on the forelimbs of the mouse, blue paint on the hind limbs that was not harmful to the living body, and white paper placed on it, and the walking pattern was analyzed.
  • sonic hedgehog (Shh) in the cerebellum of homo Ret-Y1062F-knock-in mice was analyzed by immunohistochemical staining. Paraffin specimens of cerebellum collected at 15 days after birth were used. The primary antibody used was an anti-shh antibody (Santa Cruz) diluted 100 times. Positive cells were detected using VECTASTAIN® ABC® kit (Vector) and Envision kit / HRP (diaminobenzidine; DAB) (DAKO).
  • the morphological abnormality is characterized by the fact that Ret itself is expressed in cerebellar Purkinje cells, but the number of Purkinje cells in homo Ret-Y1062F-knock-in mice at 18 days of age is not abnormal ( Fig. 1q) is that granule cells different from Purkinje cells show developmental abnormalities (Fig. 1o, p). Therefore, the expression level of Shh, a humoral factor secreted from Purkinje cells essential for neural network construction including granule cell development in the cerebellum, was examined by immunohistochemical staining.
  • Gli1 was used as a downstream molecular marker of the cerebellar granule cell shh signaling system
  • GABA-alpha6 was used as a granule cell maturation marker.
  • the expression level of Gli shows a positive correlation depending on the activity level of the shh signal transduction system (Gold DA, et al., Neuron 40, 1119-1131 (2003)).
  • Method SAG N-Methyl-N ′-(3-pyridinylbenzyl) -N, which is a shh signal transduction system activator, is used against homo-Ret-Y1062F-knock-in mice.
  • '-(3-chlorobenzo [b] thiophene-2-carbonyl) -1,4-diaminocyclohexane; product number 566660, EMD Chemicals, Inc.) was administered by subcutaneous injection. Administration was started at 0.5 days after birth, and was administered by subcutaneous injection once every 24 hours until 7.5 days after birth.
  • the dose at 0.5 days after birth was 3.3 ⁇ g / g body weight, and after 1.5 days after birth, the dose was 2.5 ⁇ g / g body weight.
  • the effect of homo Ret-Y1062F-knock-in mice on cerebellar ataxia was examined by the same method as in (2. (1) above).
  • the preventive / therapeutic agent of the present invention is effective for the prevention or treatment of hearing impairment or cerebellar movement disorder.
  • the prophylactic / therapeutic agent of the present invention can be applied with procedures that are much easier and less risky than gene therapy.

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Abstract

　聴力や運動などを司る神経生理機能の低下に対して有効な予防又は治療手段を提供することを課題とする。ヘッジホッグシグナル伝達系賦活化剤を含む、聴覚障害又は小脳性運動失調症の予防・治療剤が提供される。

Description

聴覚障害又は小脳性運動失調症の予防・治療剤
　本発明は聴覚障害又は小脳性運動失調症の予防ないし治療に有効な薬剤及びその用途に関する。本出願は、２０１２年１１月２８日に出願された日本国特許出願第２０１２－２５９４５６号に基づく優先権を主張するものであり、当該特許出願の全内容は参照により援用される。
　聴力や歩行運動機能などの神経生理機能の低下は、コミュニケーション能力あるいは身体能力全般の著しい低下を招き、全ての年齢層において生活の質（ＱＯＬ）に多大な影響を及ぼす。日本だけでもおよそ数万人の患者が推計されているが、聴力あるいは歩行運動機能などを司る神経生理機能の低下に対する抜本的な予防・治療法は確立されていない。
　聴力や運動などを司る神経生理機能を改善する試みとして、内耳や小脳などの標的組織にウイルスベクターをマイクロインジェクターで直接うちこむ遺伝子治療が実験動物を用いて検討されている（非特許文献１、２）。しかしながら、当該方法はリスクが極めて大きい等の理由から、未だ臨床応用には至っていない。
Izumikawa, M., et al., Nature Med. 11, 271-276 (2005). Torashima, T., et al., EMBO Rep. 9, 393-399 (2008). Airaksinen, M. S., & Saarma, M. Nat. Rev. Neurosci. 3, 383-394 (2002). Ohgami, N., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 107,13051-13056 (2010). Colucci-D'Amato GL, et al., Cell Growth Differ. 7, 1081-1086 (1996). Jijiwa, M., et al., Mol. Cell Biol. 24, 8026-8036 (2004). Hirai, H., et al., Nat. Neurosci. 8, 1534-1541 (2005). Tamura, H., et al., PLoS ONE. 7, e39807 (2012).
　本発明の課題は、聴力や運動などを司る神経生理機能の低下に対して有効な予防又は治療手段を提供することにある。
　神経成長因子（GDNF）をリガンドとするチロシンキナーゼ型受容体RETは小腸や内耳などの神経節の発達に重要な役割を果たしていることが知られているが（非特許文献３、４）、小脳のプルキンエ細胞にRETが発現しているとの報告があるにも関わらず（非特許文献５）、小脳におけるRETの生理的役割は全く不明である。本発明者らは、RETと小脳失調の関連を探る目的の下、RET機能障害マウス（RET-Y1062F-ホモノックインマウス）（非特許文献６）を用いて検討を行った。その結果、ローターロッド試験などの小脳生理機能解析により、生後3週間の時点でRET機能障害マウスは小脳性失調症の表現型を示すことが判明した。一方、RET機能障害マウスでは、小脳神経ネットワーク構築に必須の分泌因子の一つであるソニックヘッジホッグ（Shh）の減少とともに、形態学的にも小脳失調の表現型を示すことが判明した。ここで、shhシグナル伝達系の抑制因子として知られているPatched1は小脳顆粒細胞に発現している。この事実に注目して本発明者らは、もしもRET機能障害マウスでshhの分泌量が減少しているのであれば、「Patched1による抑制」の解除によってRET機能障害マウスの小脳失調症を予防できる、との仮説を立てた。この仮説を検証すべく、RET機能障害マウスとPatched1ノックアウトマウスを交配させたところ、小脳失調症の症状を軽減できることが明らかとなった。以上の実験の結果を踏まえ、RET機能障害マウスの小脳失調症を改善する目的でshhシグナル伝達系賦活化剤を生後2～3日の時点で投与したところ（皮下注射で１回）、有意に小脳失調症の症状が改善された。また、病理学的解析によって、歩行運動機能と深く関連する小脳の神経細胞の形態異常を有意に改善出来る事が形態学的にも明らかになった。更に、RET機能障害マウスは先天性難聴の表現型を示す事から（非特許文献４）、上記と同様の投与方法で投与されたshhシグナル伝達系賦活化剤の難聴予防への有効性を検討したところ、本賦活化剤は聴覚障害に対する予防効果も発揮する事が判明した。
　以上の通り、本発明者らの検討の結果、shhシグナル伝達系賦活化剤が小脳性運動失調症及び聴覚障害に対して有効であることが判明した。特に重要なことは、shhシグナル伝達系賦活化剤は、生まれた直後から生後7日までに皮下投与する事によって有効な効果を示したことであり、これらの化合物は薬効が高く且つ臨床応用に適したものであるといえる。
　以上の知見・成果に基づき、以下の発明が提供される。
　［１］ヘッジホッグシグナル伝達系賦活化剤を含む、聴覚障害又は小脳性運動失調症の予防・治療剤。
　［２］ヘッジホッグシグナル伝達系賦活化剤がスムーズンド（Smoothened）アゴニストである、［１］に記載の予防・治療剤。
　［３］スムーズンドアゴニストがSAG又はSAG1.1である、［２］に記載の予防・治療剤。
　［４］［１］～［３］のいずれか一項に記載の予防・治療剤を含有する、聴覚障害又は小脳性運動失調症の予防・治療用組成物。
　［５］医薬、医薬部外品又は食品である、［４］に記載の予防・治療用組成物。
　［６］［１］～［３］のいずれか一項に記載の予防・治療剤又は［４］若しくは［５］に記載の予防・治療用組成物を、治療上有効量、対象に投与するステップを含む、聴覚障害又は小脳性運動失調症の予防・治療法。
　［７］以下のステップ(1)～(4)を含む、聴覚障害の予防又は治療に有効な物質のスクリーニング法：
　(1)複数匹のホモRet-Y1062F-ノックインマウスを用意し、試験群と対照群に分けるステップ、
　(2)試験群に被験物質を投与するステップ、
　(3)ステップ(2)後の試験群について、80～112dB、5～60分間の騒音負荷前後に1 kHz～40 kHzの聴力を測定し、騒音負荷による聴力低下レベルを決定するステップ、
　(4)ステップ(3)で決定した聴力低下レベルと、被験物質を投与しないこと以外、試験群と同様の処置を施した対照群について決定した聴力低下レベルとを比較し、比較結果に基づき被験物質の有効性を判定するステップ。
　［８］以下のステップ(1)～(4)を含む、小脳性運動失調症の予防又は治療に有効な物質のスクリーニング法：
　(i)複数匹のホモRet-Y1062F-ノックインマウスを用意し、試験群と対照群に分けるステップ、
　(ii)試験群に被験物質を投与するステップ、
　(iii)ステップ(ii)後の試験群について、小脳性運動失調症の有無又は程度を検出するステップ、
　(iv)ステップ(iii)での検出結果と、被験物質を投与しないこと以外、試験群と同様の処置を施した対照群についての検出結果を比較し、比較結果に基づき被験物質の有効性を判定するステップ。
小脳失調症の表現型を示すホモRet-Y1062F-ノックインマウスの解析結果。a, ホモRet-Y1062F-ノックインマウス(YF/YF)と野生型マウス(WT)を用いた、ローターロッド解析（25 rpm, 平均± SE, n=11）、 b, 歩行パターン解析、 c, 歩幅解析 (cm, 平均 ± SE, n=11)。d-h, 生後14日のYF/YFマウス(e, g)とWTマウス(d, f)のc-Ret陽性(d, eの矢印)、c-Ret-Y1062-リン酸化陽性プルキンエ細胞(f, gの矢印)とc-Ret-Y1062-リン酸化陽性プルキンエ細胞数の定量解析(h, 平均 ± SE, n=6)。 i-l, HE染色による、生後2.5日齢(i, j)と生後18日齢(k, l)のYF/YFマウス(j, l)とWTマウス(i, k)の小脳形態解析。m, YF/YFマウス(△, n=6)とWTマウス(◆, n=6)の小脳posterior fissureの分子層の厚み(k, lの矢印)。n, o, 生後2.5日齢(n)と生後18日齢(o)のYF/YFマウス(白抜きのバー, n=6)とWTマウス(塗りつぶしのバー, n=6)の小脳分子層における未成熟顆粒細胞の細胞密度(細胞数/100μm2, 平均 ± SE)。p, q, 生後21日齢のYF/YFマウス(白抜きのバー, n=6)とWTマウス(塗りつぶしのバー, n=6)の成熟顆粒細胞マーカーであるGABAα6 (p)とプルキンエ細胞マーカーであるcalbindin D28k (q)の陽性細胞密度(細胞数/100μm2, 平均 ± SE) 。スケールバー: 20μm (d-g), 200μm (i-l). 統計学的有意(**, p < 0.01; *, p < 0.05)はMann-Whitney U testを用いて算出した。 RET機能障害マウスの小脳失調のレスキュー実験。a, 生後5日齢 (P5), 生後8日齢(P8), 生後12日齢(P12) 及び生後15日齢(P15)の野生型（WT）マウスの小脳における、Retリン酸化陽性（塗りつぶしのバー）およびshh陽性(白抜きのバー)のプルキンエ細胞数の免疫組織学的検討(平均 ± SE)。b-e, 生後15日齢の野生型（WT）マウス、ホモRet-Y1062F-ノックイン（YF/YF）マウス、ホモRet-Y1062F-ノックインマウスに恒常活性型RETが導入されたレスキューマウス（YF/YF;R-Tg）における、小脳のshh陽性プルキンエ細胞の免疫組織学的検討。e, 陽性細胞率 (平均 ± SE, n=6)。f, 生後21日のホモRet-Y1062F-ノックインマウス (YF/YF, ◆, n=7)、c-Ret-KIY1062F/Y1062F;Patched1-KOマウス(YF/YF;P-KO(+/-), ●, n=5)、shhシグナル伝達系賦活化剤を皮下投与されたホモRet-Y1062F-ノックインマウス (SAG投与のYF/YF, ■, n=8)および野生型マウス(WT, ▲, n=8)を用いたローターロッド解析（10 rpm, 平均 ± SE）。g-p, 免疫組織染色による、生後15日齢のホモRet-Y1062F-ノックインマウス(YF/YF, 左から２番目のバー, n=5) 、ホモRet-Y1062F-ノックイン;ヘテロPatched1ノックアウトマウス(YF/YF;P-KO(+/-), 左から３番目のバー, n=5)、shhシグナル伝達系賦活化剤を皮下投与されたホモRet-Y1062F-ノックインマウス (SAG投与のYF/YF, 右端のバー, n=8)、および野生型マウス(WT, 左端のバー, n=5)の小脳顆粒細胞のshhシグナル伝達系の下流分子マーカーであるGli1 (g)、及び顆粒細胞の成熟マーカーであるGABAα6 (h)の陽性細胞密度 (細胞数/100μm2, 平均 ± SE) 。スケールバー: 20μm (b-d), 50μm (i-p). 統計学的有意(**, p < 0.01)はMann-Whitney U testを用いて算出した。 皮下投与したshhシグナル伝達系賦活化剤の小脳への組織分布。SAG(10μg/μl, PBS中)もしくはPBS（非投与）を、ホモRet-Y1062F-ノックインマウス(n=9)に各々10μlずつ皮下投与し、120分後に小脳を採取した。ホモジナイズ後に酢酸エチルでSAGを抽出し、酢酸エチル:エタノール:水（=60:20:18）混合展開溶媒を用いた薄層クロマトグラフィー（TLC）解析（UVで検出）を実施した。レーン1～4はSAG標準品0、20、100、500 ngを各々スポットした。レーン5は非投与、レーン6はSAG投与マウスから抽出した小脳サンプルを各々スポットした。SAG投与マウスはSAG標準品同様にRf値0.38付近にスポットを示した。 SAG皮下投与による先天性難聴の表現型を持つホモ型Ret-Y1062F-ノックインマウス（Ret機能障害マウス）のレスキュー実験。聴性脳幹反応(ABR)により測定した生後21日齢の野生型マウス(WT, ◆, n=8)、ホモ型Ret-Y1062F-ノックインマウス(YF/YF, ■ n=3)、SAGを皮下投与されたホモ型Ret-Y1062F-ノックインマウス (YF/YF + SAG, ●, n=8)の聴力レベル。S.O.は90-100 dB SPLの音量に全く反応しない聴力レベルを示す。統計的な有意差 (*, P<0.01) はMann-Whitney U testにより解析した。
（聴覚障害又は小脳性運動失調症の予防・治療剤）
　本発明は聴覚障害及び小脳性運動失調症に対して有効性を認めた化合物（ヘッジホッグシグナル伝達系賦活化剤）の用途に関し、第１の局面では当該化合物を含む、聴覚障害又は小脳性運動失調症の予防・治療剤が提供される。
　本発明の一態様では、ヘッジホッグシグナル伝達系賦活化剤であるSAG（N-Methyl-N'-(3-Pyridinylbenzyl)-N'-(3-Chlorobenzo[b]thiophene-2-carbonyl)-1,4-Diaminocyclohexane）に、聴覚障害及び小脳性運動失調症に対する有効性を認めた事実に基づき、ヘッジホッグシグナル伝達系賦活化剤が用いられる。「ヘッジホッグシグナル伝達系賦活化剤」とは、ヘッジホッグシグナル伝達系（以下、「Hhシグナル伝達系」と呼ぶ）を上方調節（アップレギュレート）する物質をいう。Hhシグナル伝達系は胚形成、組織再生、幹細胞の更新などにおいて重要な役割を果たしている。また、腫瘍の増殖にも関与する。Hhシグナル伝達系は、Hhタンパク質がPatched1に結合することによって開始される。Hhタンパク質がPatched1に結合すると、Pathced1によるSmoothened（スムーズンド）の抑制が解除され、SmoによるHh標的遺伝子の発現が促進される。Hhシグナル伝達系においてSmoの役割は重要であり、Smoを標的とした化合物の探索や開発などが行われてきた。本発明の好ましい態様では、Hhシグナル伝達系賦活化剤として、Smoを標的とした化合物、即ち、Smoアゴニストを用いる。Smoアゴニストの例は、SAG及びその類縁化合物（例えばSAG1.1（N-Methyl-N’-(3-(4-benzonitrile)-4-methoxybenzyl)-N’-(3-chlorobenzo[b]thiophene-2-carbonyl)-1,4-diaminocyclohexane））、プルモルファミン、Hh-Ag1.1及びその誘導体（Hh-Ag 1.2、Hh-Ag 1.3、Hh-Ag 1.4、Hh-Ag 1.5）である。好ましくは、SAG又はSAG1.1を採用する。SAGの構造、特性及び製法などについては文献Sinha S, Chen JK. Nat Chem Biol. 2006 Jan;2(1):29-30.及びChen JK, Taipale J, Young KE, Maiti T, Beachy PA. Proc Natl Acad Sci U S A. 2002 Oct 29;99(22):14071-6.に詳しい。同様に、SAG1.1については文献Chen, W., Ren, X. R., Nelson, C. D., Barak, L. S., Chen, J. K., Beachy, P. A.,de Sauvage, F. & Lefkowitz, R. J. (2004) Science 306, 2257-2260に詳しい。一方、プルモルファミンの詳細は文献Sinha S, Chen JK. Nature Chemical Biology 2, 29-30 (2005)を参照されたい。Hh-Ag1.1及びその誘導体の詳細は文献Frank-Kamenetsky M, Zhang XM, Bottega S, Guicherit O, Wichterle H, Dudek H, Bumcrot D, Wang FY, Jones S, Shulok J, Rubin LL, Porter JA. J Biol. 2002 Nov 6;1(2):10.を参照されたい。尚、SAGについては、塩酸塩などの形態で例えばEMD chemicals, Inc.やsanta cruz biotechnology, Inc.等から入手することができる。
　「予防・治療剤」とは、標的の疾病ないし病態である、聴覚障害又は小脳性運動失調症（以下、これらまとめて「標的疾病」という）に対する予防的及び／又は治療的効果を示す薬剤のことをいう。予防的効果の典型的なものは、標的疾病の発現（発症）を阻止ないし遅延することである。他方、治療的効果には、標的疾病の症状を緩和すること（軽症化）、症状の悪化を阻止ないし遅延すること等が含まれる。後者（悪化の阻止ないし遅延）については、重症化を予防するという点において予防的効果の一つと捉えることができる。このように、予防的効果と治療的効果は一部において重複する概念であり、明確に区別して捉えることは困難であり、またそうすることの実益は少ない。尚、標的疾病に対して何らかの予防的効果又は治療的効果を示す限り、標的疾病に対する予防・治療剤に該当する。
　本発明では、先天性難聴、加齢性難聴、騒音性難聴及び耳鳴りを包括する用語として用語「聴覚障害」を用いる。加齢性難聴とは、加齢によって引き起こされる感音難聴であり、老人性難聴とも呼ばれる。その原因は聴覚中枢や感覚細胞などの老化にあると考えられている。加齢性難聴はほとんど場合が両耳に起き、加齢とともに症状が悪化する。加齢性難聴では、めまいや耳鳴りをともなう場合も多い。他方、騒音性難聴とは騒音が原因で生ずる難聴である。騒音性難聴は騒音の下で長時間就業することにより起こる「職業性難聴」と、コンサートなどで大音量に曝されたことによって起こる「音響性難聴（音響外傷）」に大別される。多くの場合、耳鳴りを伴う。
　「小脳性運動失調症」とは、小脳の障害（小脳腫瘍、変性疾患、小脳萎縮など）を伴う或いは小脳の障害が起因となる運動失調症であり、協調性運動不能、起立歩行障害、偏倚歩行、平衡機能障害、変換運動障害等によって特徴付けられる。
（聴覚障害又は小脳性運動失調症の予防・治療用組成物）
　本発明の第２の局面は本発明の予防・治療剤を含有する、聴覚障害又は小脳性運動失調症の予防・治療用組成物を提供する。本発明の組成物の形態は特に限定されないが、好ましくは医薬、医薬部外品又は食品である。尚、２種類以上の予防・治療剤を併用することにしてもよい。
　本発明の医薬組成物及び医薬部外品組成物の製剤化は常法に従って行うことができる。製剤化する場合には、製剤上許容される他の成分（例えば、担体、賦形剤、崩壊剤、緩衝剤、乳化剤、懸濁剤、無痛化剤、安定剤、保存剤、防腐剤、生理食塩水など）を含有させることができる。賦形剤としては乳糖、デンプン、ソルビトール、D-マンニトール、白糖等を用いることができる。崩壊剤としてはデンプン、カルボキシメチルセルロース、炭酸カルシウム等を用いることができる。緩衝剤としてはリン酸塩、クエン酸塩、酢酸塩等を用いることができる。乳化剤としてはアラビアゴム、アルギン酸ナトリウム、トラガント等を用いることができる。懸濁剤としてはモノステアリン酸グリセリン、モノステアリン酸アルミニウム、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ラウリル硫酸ナトリウム等を用いることができる。無痛化剤としてはベンジルアルコール、クロロブタノール、ソルビトール等を用いることができる。安定剤としてはプロピレングリコール、アスコルビン酸等を用いることができる。保存剤としてはフェノール、塩化ベンザルコニウム、ベンジルアルコール、クロロブタノール、メチルパラベン等を用いることができる。防腐剤としては塩化ベンザルコニウム、パラオキシ安息香酸、クロロブタノール等と用いることができる。
　製剤化する場合の剤型も特に限定されず、例えば錠剤、散剤、細粒剤、顆粒剤、カプセル剤、シロップ剤、注射剤、外用剤、及び座剤などとして本発明の医薬組成物又は医薬部外品組成物を提供できる。
　本発明の医薬組成物には、期待される治療効果や予防効果を得るために必要な量（即ち治療上有効量）の有効成分が含有される。同様に本発明の医薬部外品組成物には、期待される改善効果や予防効果等を得るために必要な量の有効成分が含有される。本発明の医薬組成物又は医薬部外品組成物に含まれる有効成分量は一般に剤型や形態によって異なるが、所望の投与量を達成できるように有効成分量を例えば約0.1重量％～約95重量％の範囲内で設定する。
　本発明の医薬組成物及び医薬部外品組成物はその剤型・形態に応じて経口又は非経口（静脈内、動脈内、皮下、筋肉、又は腹腔内注射、経皮、経鼻、経粘膜、塗布など）で対象に適用される。ここでの「対象」は特に限定されず、ヒト及びヒト以外の哺乳動物（ペット動物、家畜、実験動物を含む。具体的には例えばマウス、ラット、モルモット、ハムスター、サル、ウシ、ブタ、ヤギ、ヒツジ、イヌ、ネコ、ニワトリ、ウズラ等である）を含む。好ましい一態様では、適用対象はヒトである。
　本発明の医薬組成物及び医薬部外品組成物の投与量・使用量は、期待される効果が得られるように設定される。有効な投与量の設定においては一般に適用対象の症状、年齢、性別、体重などが考慮される。尚、当業者であればこれらの事項を考慮して適当な投与量を設定することが可能である。投与スケジュールとしては例えば一日一回～数回、二日に一回、或いは三日に一回などを採用できる。投与スケジュールの作成においては、適用対象の症状や有効成分の効果持続時間などを考慮することができる。
　上記の通り本発明の一態様は、本発明の予防・治療剤を含有する食品組成物である。本発明での「食品組成物」の例として一般食品（穀類、野菜、食肉、各種加工食品、菓子類、牛乳、茶飲料、清涼飲料水、アルコール飲料等）、栄養補助食品（サプリメント、栄養ドリンク等）、食品添加物、愛玩動物用食品、愛玩動物用栄養補助食品を挙げることができる。本発明の食品組成物の形状の例として、粉末、顆粒末、ガム状、タブレット、ペースト、液体を例示することができる。食品組成物の形態で提供することによって、本発明の有効成分を日常的に摂取したり、継続的に摂取したりすることが容易となる。
　本発明の食品組成物には、予防的又は治療的効果が期待できる量の有効成分が含有されることが好ましい。添加量は、それが使用される対象となる者の病状、健康状態、年齢、性別、体重などを考慮して定めることができる。
（聴覚障害又は小脳性運動失調症の予防・治療剤のスクリーニング方法）
　本発明は、動物モデルを用いて聴覚障害又は小脳性運動失調症の予防・治療に有効な物質をスクリーニングする方法（in vivoスクリーニング法）も提供する。当該スクリーニング法では、RET機能障害マウス（ホモRet-Y1062F-ノックインマウス）を利用する。一態様では、以下のステップ(1)～(4)を実施する。この態様のスクリーニング方法で選抜される物質には、特に聴覚障害の予防又は治療効果を期待できる。
　(1)複数匹のホモRet-Y1062F-ノックインマウスを用意し、試験群と対照群に分けるステップ
　(2)試験群に被験物質を投与するステップ
　(3)ステップ(2)後の試験群について、80～112dB、5～60分間の騒音負荷前後に1 kHz～40 kHzの聴力を測定し、騒音負荷による聴力低下レベルを決定するステップ
　(4)ステップ(3)で決定した聴力低下レベルと、被験物質を投与しないこと以外、試験群と同様の処置を施した対照群について決定した聴力低下レベルとを比較し、比較結果に基づき被験物質の有効性を判定するステップ
　ステップ(1)では複数匹のホモRet-Y1062F-ノックインマウスを用意し、試験群と対照群に分ける。試験群及び対照群に含まれる個体数は特に限定されない。一般に使用する個体数が多くなるほど信頼性の高い結果が得られるが、多数の個体を同時に取り扱うことは使用する個体の確保や操作（飼育を含む）の面で困難を伴う。そこで例えば各群に含まれる個体数を1～50、好ましくは2～30、さらに好ましくは3～20とする。通常は試験群と対照群の個体数を等しくする。
　ステップ(2)では試験群に被験物質を投与する。被験物質としては様々な分子サイズの有機化合物又は無機化合物を用いることができる。有機化合物の例として、核酸、ペプチド、タンパク質、脂質（単純脂質、複合脂質（ホスホグリセリド、スフィンゴ脂質、グリコシルグリセリド、セレブロシド等）、プロスタグランジン、イソプレノイド、テルペン、ステロイド、ポリフェノール、カテキン、ビタミン（B1、B2、B3、B5、B6、B7、B9、B12、C、A、D、E等）を例示できる。医薬や栄養食品等の既存成分或いは候補成分も好ましい被検物質の一つである。植物抽出液、細胞抽出液、培養上清などを被検物質として用いてもよい。２種類以上の被験物質を同時に添加することにより、被験物質間の相互作用、相乗作用などを調べることにしてもよい。被験物質は天然物由来であっても、或いは合成によるものであってもよい。後者の場合には例えばコンビナトリアル合成の手法を利用して効率的なスクリーニング系を構築することができる。
　被験物質の投与態様は特に限定されない。例えば被験物質を含む餌又は飲料水を用意し、これを摂取させる。或いは、被験物質又は被験物質を含む溶液を用意し、これを投与する。投与方法として経口投与、経鼻投与、経気管投与、静脈内、動脈内、皮下、筋肉内又は腹腔内注射を例示することができる。被験物質を複数回投与することにしてもよい。その場合には各回の投与量は同一であっても異なっていても良い。継続的に投与することにしてもよい。尚、対照群については被験物質を投与しないこと以外は同一の条件下で飼育する。
　ステップ(3)では試験群に騒音負荷を与えるとともに騒音負荷の前後に聴力を測定し、騒音負荷による聴力低下レベルを決定する。本発明では80～112dB、5～60分間の騒音負荷を採用する。好ましくは82dB、10分間の騒音負荷とする。一方、測定する聴力は1 kHz～40 kHzの範囲である。好ましくは12kHz聴力を測定する。聴力低下レベルの決定には例えば聴性脳幹反応を利用できる。「聴性脳幹反応」とは、聴覚神経系を興奮させることによって得られる脳幹部での電位（脳幹の反応）である。所定の音刺激を与えた時の聴性脳幹反応（脳波）を解析することによって、聴力のレベルを再現性良く調べることができる。聴性脳幹反応を利用した検査法は難聴の判定に広く利用されている。聴性脳幹反応を利用した検査法の詳細については例えばABRハンドブック（加我君孝 編（金原出版））を参照することができる。聴性脳幹反応ではなく、純音聴力検査等を利用することにしてもよい。
　ステップ(4)では、試験群の聴力低下レベルと対照群の聴力低下レベルを用いて被験物質の有効性を判定する。詳しくは、ステップ(3)で決定した聴力低下レベル（即ち試験群の聴力低下レベル）と、被験物質を投与しないこと以外、試験群と同様の処置を施した対照群について決定した聴力低下レベルとを比較し被験物質が有効であるか否かを判定する。その際、「聴力低下レベルの小さいことが聴覚障害の予防・治療に有効である」との指標を用いる。従って、対照群について決定した聴力低下レベルよりも、試験群の聴力低下レベルの方が小さいとき、即ち被験物質の投与によって聴力低下レベルに改善が認められたとき、聴覚障害の予防・治療に被験物質が有効であると判定することになる。
　有効性を認めた複数の被験化合物を用いて再度ステップ(1)～(4)を行い、有効性の高い物質の絞り込みを行うことにしてもよい。
　他の一態様では、小脳性運動失調症の予防又は治療に有効な物質を見出すために、以下のステップ(i)～(iv)を実施する。
　(i)複数匹のホモRet-Y1062F-ノックインマウスを用意し、試験群と対照群に分けるステップ
　(ii)試験群に被験物質を投与するステップ
　(iii)ステップ(ii)後の試験群について、小脳性運動失調症の有無又は程度を検出するステップ
　(iv)ステップ(iii)での検出結果と、被験物質を投与しないこと以外、試験群と同様の処置を施した対照群についての検出結果を比較し、比較結果に基づき被験物質の有効性を判定するステップ
　ステップ(i)及び(ii)は上記ステップ(1)及び(2)とそれぞれ同様であるため、その説明を省略する。ステップ(iii)では、被験物質を投与した試験群について、小脳性運動失調症の有無又は程度を検出する。例えば、ローターロッド試験又は歩行パターン試験、或いはこれら両者を行い、小脳性運動失調症の有無又は程度を求める。ステップ(iv)では、試験群の検出結果と対照群の検出結果を比較し、被験物質の有効性を判定する。具体的には、「試験群において小脳性運動失調症の改善を認めること」を有効性の指標として採用し、被験物質の有効性を判定する。
　有効性を認めた複数の被験化合物を用いて再度ステップ(i)～(iv)を行い、有効性の高い物質の絞り込みを行うことにしてもよい。
１．RET機能障害マウス（ホモ型Ret-Y1062F-ノックインマウス）の表現型
（１）方法
　Retタンパク質の1063番目チロシンがフェニルアラニンに置換されるように遺伝子操作し、両方のアレルのRet遺伝子に点変異が導入されたホモ型のノックインマウス（ホモRet-Y1062F-ノックインマウス）（非特許文献６）の小脳生理機能を解析した。具体的な方法は以下の通りである。小脳発達が完了する生後21日において、過去の論文の方法（非特許文献7）に従い、ローターロッド解析（回転速度；10もしくは25 rpm）を実施した。マウスをロッド上で歩行させ、ロッドから落下するまでの時間を最長2分間まで測定した。5分間隔で合計6回測定した。歩行パターン解析は、過去の論文の方法（非特許文献８）に従って実施した。マウスの前肢に赤色を、後ろ肢に青色の生体に害のない塗料をつけ、白紙を置いた14 x 44 cmの箱の中の一端にマウスを置き、歩行パターンを解析した。
　Hhシグナル伝達系に注目し、ホモRet-Y1062F-ノックインマウスの小脳におけるソニックヘッジホッグ（Shh）の発現を免疫組織染色により解析した。生後15日の時点で採取して得られた小脳のパラフィン標本を用いた。一次抗体は抗shh抗体（Santa Cruz）を100倍希釈して用いた。陽性細胞の検出はVECTASTAIN ABC kit (Vector) とEnvision kit/HRP (diaminobenzidine; DAB) (DAKO)を用いた。
（２）結果
　ローターロッド試験及び歩行パターン試験の結果、生後3週間の時点でホモRet-Y1062F-ノックインマウスは小脳失調症の表現型を示すことが判明した（図１a-c）。ホモRet-Y1062F-ノックインマウスの小脳プルキンエ細胞では、Retの1063番目のチロシンのリン酸化レベルが顕著に低下している事が分かった（図１d-h）。更に、生後15日以降、ホモRet-Y1062F-ノックインマウスの小脳は形態学的には発達異常を示す事が分かった（図１i-o）。その形態異常の特徴としては、Ret自体は小脳プルキンエ細胞に発現しているにも関わらず、生後18日時点のホモRet-Y1062F-ノックインマウスのプルキンエ細胞の数は異常がないのに対して（図１q）、プルキンエ細胞とは異なる顆粒細胞が発達異常を示す点にある（図１o, p）。そこで、小脳の顆粒細胞発達を含む神経ネットワーク構築に必須のプルキンエ細胞から分泌される液性因子であるShhの発現レベルを免疫組織染色により検討した。その結果、野生型マウスにおいて、Retの1063番目のチロシンのリン酸化レベル上昇と共に、shh陽性プルキンエ細胞数は増加する事、ホモRet-Y1062F-ノックインマウスでshh陽性プルキンエ細胞数は有意に減少する事が分かった（図2a-c, e）。更に、ホモ型Ret-Y1062F-ノックインマウスの小脳shh減少は、恒常活性型RET遺伝子を導入したc-Ret-KIY1062F/Y1062F;RET-Tgマウス（非特許文献４）ではレスキュー出来た事から、小脳プルキンエ細胞から分泌されるshhレベルはRetのリン酸化により制御されている可能性が示唆された（図2d, e）。
２．RET機能障害マウスの小脳失調のレスキュー実験
（１）方法
　shhシグナル伝達系の抑制因子として知られ、小脳顆粒細胞にも発現を認めるPatched1に注目し、「Patched1による抑制」の解除によってホモRet-Y1062F-ノックインマウスの小脳失調症の表現型をレスキューできるとの仮説の下、以下の実験を行った。まず、ホモRet-Y1062F-ノックインマウスとPatched1ノックアウトマウス（Matthew Scott博士の許可を得て、金沢大学がん研究所 平尾敦教授より提供；Goodrich LV, et al., Science 277, 1109-1113 (1997)）を交配させた。交配によって得られた仔マウス（c-Ret-KIY1062F/Y1062F;Patched1-KO）をローターロッド解析および小脳の病理解析に供した。小脳顆粒細胞のshhシグナル伝達系の下流分子マーカーとしてGli1を、顆粒細胞の成熟マーカーとしてGABA-alpha6を用いた。Gliの発現レベルは、shhシグナル伝達系の活性レベルに依存して正の相関を示す（Gold DA, et al., Neuron 40, 1119-1131 (2003)）。
（２）結果
　生後21日のc-Ret-KIY1062F/Y1062F;Patched1-KOマウスをローターロッド解析および病理解析に供したところ、ホモRet-Y1062F-ノックインマウスの小脳失調症の表現型を、Patched1の発現レベルを低下させる事により、有意にレスキュー出来る事が分かった（図2f）。更に、Gli1の発現レベルおよび成熟顆粒細胞の陽性数もレスキューされる事が分かった（図2g-o）。これらの結果より、Patched1による抑制の解除によって、ホモRet-Y1062F-ノックインマウスの小脳失調症をレスキューできることが判明した。
３．shhシグナル伝達系賦活化剤による予防効果
（１）方法
　ホモRet-Y1062F-ノックインマウスに対して、shhシグナル伝達系賦活化剤であるSAG（N-Methyl-N′-(3-pyridinylbenzyl)-N′-(3-chlorobenzo[b]thiophene-2-carbonyl)-1,4-diaminocyclohexane;製品番号566660、EMD Chemicals, Inc.）を皮下注射で投与した。生後0.5日で投与を開始し、生後7.5日まで24時間毎に一回皮下注射で投与した。生後0.5日での投与量は3.3μg/g体重で生後1.5日以降は2.5μg/g体重の投与量で投与した。約３週後（生後21日目）に上記（２．（１））と同様の方法でホモRet-Y1062F-ノックインマウスの小脳失調に対する効果を検討した。
（２）結果
　SAGを投与したホモRet-Y1062F-ノックインマウスを生後21日でローターロッド解析および病理解析に供したところ、ホモRet-Y1062F-ノックインマウスの小脳失調を有意にレスキュー出来る事が分かった（図2f）。更に、Gli1の発現レベルおよび成熟顆粒細胞の陽性数もレスキューされる事が分かった（図2g-o）。これらの結果より、SAGの皮下投与によって、ホモRet-Y1062F-ノックインマウスの小脳失調をレスキューできることが判明した。
４．shhシグナル伝達系賦活化剤の組織分布
（１）方法
　SAGを投与したホモRet-Y1062F-ノックインマウスの小脳を採取してホモジナイズした後、酢酸エチルでSAGを抽出し、酢酸エチル:エタノール:水（=60:20:18）混合展開溶媒を用いた薄層クロマトグラフィー（TLC）による解析に供した。
（２）結果
　SAGを皮下投与したマウスの小脳から抽出したサンプルをTLCで展開したところ、SAGの標準品のRf値0.38と同じRf値付近にスポットを検出出来た。以上の結果より、皮下投与したSAGは小脳に組織分布する事が分かった（図３）。
５．shhシグナル伝達系賦活化剤による聴覚障害の予防効果
（１）方法
　３．（１）と同様の方法で処理したホモRet-Y1062F-ノックインマウスの聴力レベルを聴性脳幹反応（ABR）により測定し（Ohgami, N., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 107,13051-13056 (2010)）、先天性難聴に対する効果を調べた。統計処理にはMann-Whitney U-testを用いた。
（２）結果
　SAGの投与によって聴力レベルの改善を認めた（図４）。即ち、先天性難聴に対してSAGが予防効果を示すことが明らかとなった。
＜まとめ＞
　shhシグナル伝達系賦活化剤であるSAGが小脳性運動失調症及び聴覚障害に対して有効であることが判明した。
　本発明の予防・治療剤は聴覚障害又は小脳性運動障害の予防又は治療に有効である。本発明の予防・治療剤は、遺伝子治療に比較して格段に容易且つリスクの低い手技で適用可能である。聴覚障害又は小脳性運動障害の発症リスクを予測し、脳血管関門が未だ未成熟な時期に適用することで、これらの疾患の発症・進展を阻止又は遅延させるという利用形態も想定される。
　この発明は、上記発明の実施の形態及び実施例の説明に何ら限定されるものではない。特許請求の範囲の記載を逸脱せず、当業者が容易に想到できる範囲で種々の変形態様もこの発明に含まれる。本明細書の中で明示した論文、公開特許公報、及び特許公報などの内容は、その全ての内容を援用によって引用することとする。

Claims (8)

  1. 　ヘッジホッグシグナル伝達系賦活化剤を含む、聴覚障害又は小脳性運動失調症の予防・治療剤。
  2. 　ヘッジホッグシグナル伝達系賦活化剤がスムーズンド（Smoothened）アゴニストである、請求項１に記載の予防・治療剤。
  3. 　スムーズンドアゴニストがSAG又はSAG1.1である、請求項２に記載の予防・治療剤。
  4. 　請求項１～３のいずれか一項に記載の予防・治療剤を含有する、聴覚障害又は小脳性運動失調症の予防・治療用組成物。
  5. 　医薬、医薬部外品又は食品である、請求項５に記載の予防・治療用組成物。
  6. 　請求項１～３のいずれか一項に記載の予防・治療剤又は請求項４若しくは５に記載の予防・治療用組成物を、治療上有効量、対象に投与するステップを含む、聴覚障害又は小脳性運動失調症の予防・治療法。
  7. 　以下のステップ(1)～(4)を含む、聴覚障害の予防又は治療に有効な物質のスクリーニング法：
    　(1)複数匹のホモRet-Y1062F-ノックインマウスを用意し、試験群と対照群に分けるステップ、
    　(2)試験群に被験物質を投与するステップ、
    　(3)ステップ(2)後の試験群について、80～112dB、5～60分間の騒音負荷前後に1 kHz～40 kHzの聴力を測定し、騒音負荷による聴力低下レベルを決定するステップ、
    　(4)ステップ(3)で決定した聴力低下レベルと、被験物質を投与しないこと以外、試験群と同様の処置を施した対照群について決定した聴力低下レベルとを比較し、比較結果に基づき被験物質の有効性を判定するステップ。
  8. 　以下のステップ(i)～(iv)を含む、小脳性運動失調症の予防又は治療に有効な物質のスクリーニング法：
    　(i)複数匹のホモRet-Y1062F-ノックインマウスを用意し、試験群と対照群に分けるステップ、
    　(ii)試験群に被験物質を投与するステップ、
    　(iii)ステップ(ii)後の試験群について、小脳性運動失調症の有無又は程度を検出するステップ、
    　(iv)ステップ(iii)での検出結果と、被験物質を投与しないこと以外、試験群と同様の処置を施した対照群についての検出結果を比較し、比較結果に基づき被験物質の有効性を判定するステップ。
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