WO2014082570A1 - 含蒿甲醚的药物组合物、制剂及其用途 - Google Patents

含蒿甲醚的药物组合物、制剂及其用途 Download PDF

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陈云建
代晓阳
张雁丽
陈亚娟
刘一丹
杨兆祥
杨旭娟
朱泽
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昆明制药集团股份有限公司
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Definitions

  • Artemether chemical name (3R, 5aS, 6R, 8aS, 9R, 10S, 12R, 12aR) - decahydro-10-decyloxy-3, 6, 9-trimethyl-3, 12-bridge oxygen -12H-pyrano[4,3-j]- l , 2-benzodioxan, the molecular formula is C 16 H 26 0 5 , and the structural formula is as follows:
  • the peroxy bridge is first catalyzed by Fe 2+ to generate oxygen free radicals, which are then converted into more active carbon radicals by molecular rearrangement. These two free radicals have a destructive effect on the cell structure and function of the malaria parasite, but Since carbon radicals can directly alkylate macromolecules of many organisms, artemisinin is now considered to be more active by carbon radicals.
  • artemisinin drugs can inhibit VEGF and KDR
  • the invention also provides the use of a composition of artemether or dihydroartemisinin and an iron agent for the manufacture of a medicament for the treatment of a tumor.
  • the weight ratio of artemether or dihydroartemisinin to iron in the composition is 1: 0.1 - 1 : 1.
  • the human cancer mouse xenograft model maintains the biological characteristics of human tumors to a large extent, it grows slower than animal transplanted tumors, and has a much different biological characteristics from animal-derived tumors. The biological characteristics of human tumors, therefore, we continue to use the human cancer mouse xenograft model for experiments, and further objectively evaluate its efficacy and mechanism.
  • Example 1 Effect of Artemisinolate Freeze-Dried Powder Formulation on Growth of Human Tumor Cells (Compared with Other Artemisinin Derivatives)
  • Artemisinin derivatives were set at 2, 10, 50, 250, 500 ⁇ 5 test concentrations.
  • Artemisinin bulk drug, artemisinin, dihydroartemisinin, artesunate, diacetylsulfoxide (DMSO), artemether lyophilized powder preparation is dissolved in physiological saline (NS), and then added a certain amount
  • DMSO diacetylsulfoxide
  • NS physiological saline
  • the RPMI 1640 complete medium is formulated into a high concentration solution, and each low concentration solution is prepared by diluting it in a high concentration.
  • HL-60 human promyelocytic leukemia cell line
  • K562 human chronic myeloid leukemia cell line
  • ⁇ -29 human colon cancer cell line
  • PC-3 human prostate cancer cell line
  • ⁇ 549 Human non-small cell lung cancer cell line
  • ⁇ -28 human gastric cancer cell line
  • Hep2 human laryngeal cancer cell line
  • the inhibition rate was calculated using Microsoft Excel 2003, and the half-inhibitory concentration IC 5 was used by the LOGIT method. , as a judgment indicator of the suppression ability.
  • ascites-type S180 cells in the logarithmic growth phase were taken, adjusted to a certain concentration, and then inoculated subcutaneously in the right axilla of the mice, and were administered in groups 24 hours later.
  • mice Healthy female ICR mice were selected and randomly divided into negative control group (NS), artemether lyophilized powder low (5mg/kg), medium (10mg/kg), high (20mg/kg) dose group.
  • Intraperitoneal administration (ip), medium dose (10 mg/kg) and intravenous administration (iv) were performed to compare the differences in efficacy of different routes of administration. 1 time / day, for 10 consecutive days. Twenty-four hours after the last administration, the mice were sacrificed by cervical dislocation and the tumor tissues were removed, and the tumor weight was weighed. The tumor inhibition rate was calculated according to the tumor weight.
  • the mean tumor weight of each group of mice was expressed as ⁇ SD, and the one-way analysis of variance was performed using the 'SPSS16.0 statistical software package.
  • the negative tumor weight of the mice in the negative control group was less than 1 g or 20%.
  • Ip intraperitoneal administration
  • iv intravenous administration
  • the artemether lyophilized powder preparation was administered by intraperitoneal injection for 10 days, and the tumor of the mice in the administration group was reduced compared with the negative control group, and the tumor weight was reduced, of which 10 mg/
  • the inhibition rates of S 180 growth at doses of kg and 20 mg/kg were 44.96% and 54.93%, respectively.
  • the inhibition rate of S180 growth by intravenous administration of 10 mg/kg was increased from 44.96% in intraperitoneal injection to 51.48%. , showing that the same dose of intravenous administration is better than intraperitoneal administration.
  • Statistical analysis showed significant differences between the dose groups and the negative control group, ⁇ ⁇ 0.01.
  • N.S is diluted to the desired concentration.
  • Test group (arthrax ether freeze-dried powder)
  • Low-dose group Artemisia ether lyophilized powder 3mg/kg, 0.15ml/10g, 1 time/day, iv;
  • Medium dose group Artemisia sulphate lyophilized powder 10mg/kg, 0.15ml/10g, 1 time/day, Iv;
  • high dose group Artemisia ether lyophilized powder 30mg/kg, 0.15ml/10g, 1 time/day, iv;
  • medium dose + iron group artemether lyophilized powder 10mg/kg, 0.15ml/10g ( Iv), 1 time / day + FeS0 4 3mg / kg, 0.2ml / 10g, intragastric administration ( ig ), 1 time / day;
  • Medium dose + deferoxamine group Artemether lyophilized powder 10mg/kg, 0.15ml/10g (iv), 1 time / day + deferoxamine (DFO) 30mg/kg, 0.1ml/10g, monthly meat injection Administration (im), 1 time/day;
  • Medium dose +Vit C group Artemisia ether lyophilized powder 10 mg/kg, 0.15 ml/10 g (iv), 1 time/day +VitC 150 mg/kg, 0.1 ml/10 g (im), 1 time/day.
  • Healthy female ICR mice were selected and administered according to the above protocol 24 hours after inoculation for 10 consecutive days. Twenty-four hours after the last administration, the mice were sacrificed by cervical dislocation and the tumor tissues were removed, and the tumor weight was weighed. The tumor inhibition rate was calculated according to the tumor weight.
  • Tumor inhibition rate (average tumor weight vs. mean tumor weight administration) / average tumor weight control group ⁇ % The mean tumor weight of each group of mice was expressed as ⁇ SD, and one-way ANOVA was performed using SPSS 16.0 statistical software package.
  • mice that are sensitive to artemisinin derivatives as a tumor-bearing species for in vivo anti-tumor studies.
  • the well-grown tumor tissue was taken from the reference paper, and the tissue was cut into a certain volume and inoculated into the right axilla of the mouse. After a few days of inoculation, the mice with no tumor growth, slow growth or too fast were removed. The mice that had formed a moderate tumor volume (TV) were randomly divided into groups, and the mean tumor volume of each group was approximated.
  • TV moderate tumor volume
  • Test group (arthrax ether freeze-dried powder)
  • Low-dose group Artemisia ether lyophilized powder 3mg/kg, 0.15ml/10g, 1 time/day, iv;
  • Medium dose group Artemisia sulphate lyophilized powder 10mg/kg, 0.15ml/10g, 1 time/day, Iv;
  • high dose group Artemisia ether lyophilized powder 30mg/kg, 0.15ml/10g, 1 time/day, iv;
  • medium dose + iron group artemether lyophilized powder 10mg/kg, 0.15ml/10g ( Iv), 1 time / day + FeS0 4 3mg / kg, 0.2ml / 10g (ig), 1 time / day;
  • Medium dose + deferoxamine group Artemisia ether lyophilized powder 10mg/kg, 0.15ml/10g (iv), 1 time / day +DFO30mg/kg, 0.1ml/10g (im), 1 time / day;
  • Medium dose +Vit C group Artemisia ether lyophilized powder 10 mg/kg, 0.15 ml/10 g (iv), 1 time/day +VitC 200 mg/kg, O.lml/lOg (im), 1 time/day.
  • Tumor volume (TV) was measured 3 times per week and relative tumor volume (RTV) and relative tumor proliferation rate (T/C%) were calculated.
  • RTV relative tumor volume
  • T/C% relative tumor proliferation rate
  • T/C (%) > 60% is invalid; T/C (%) ⁇ 60%, and statistically processed P ⁇ 0.05 is effective. It can also be judged by referring to the Fodstad criterion: T/C (%) > 50% is (-) inactive; T/C (%) ⁇ 50% (+/-) edge activity; T/C (%) ⁇ 40 % is ( + ) medium intensity activity; T/C (%) ⁇ 25% is ( + + ) high intensity activity Sexuality; T/C (%) ⁇ 10% is ( + + + + ) extra strong activity. This study was evaluated using domestic standards. (2) Results
  • v is administered intravenously; ig: intragastric administration im: intramuscular injection; compared with the negative group: *P ⁇ 0.05
  • the positive control 5-Fu injection was administered intravenously for 19 days, and the relative proliferation rate (T/C%) of the tumor was 37.72% (less than 60%).
  • the statistical treatment was significant, PO.05 Artemisia sulphate freeze-dried powder was administered intravenously for 19 days.
  • the T/C% of tumors in the low-dose group was 50.68% (less than 60%).
  • P>0.05 The T/C% of the tumors in the dose and high dose groups were 48.43% and 47.32%, respectively (both less than 60%).
  • the statistical difference was statistically significant (P ⁇ 0.05).
  • Artemisinin is one of the derivatives of artemisinin, which has better antimalarial effects and better in vivo processes.
  • the in vivo and in vitro antitumor activities of the cerium ether and its lyophilized powder preparation were tested, and the in vivo experiments were carried out according to the currently recognized mechanism of oxygen free radical action. Different influencing factors were designed to verify the mechanism of its anti-tumor effect.
  • Dihydroartemisinin has relatively obvious inhibitory effects on HL-60, K562, MKN-28, HT-29 and Hep2 tumor cells, especially MKN-28 cells, IC50 is 16.22 ⁇ .
  • Artemisia ether lyophilized powder is a water-soluble preparation, which is different from other derivatives in in vitro studies, so it is possible to perform intravenous anti-tumor evaluation by intravenous injection. Therefore, although the experimental results show that neither the artemether nor the lyophilized powder of artemether has any obvious cytotoxic effect in vitro, it can be metabolized in vivo because it retains the pharmacodynamic structure of artemisinin-peroxy bridge. It is converted to dihydroartemisinin, so we continue to study the anti-tumor effect of artemether lyophilized powder in vivo.
  • the results of in vivo experiments showed that the lyophilized powder of artemether was administered intraperitoneally at a dose of 5, 10, 20 mg/kg, once a day for 10 days, and the tumor inhibition rate of mouse sarcoma S180 was 29.06% and 44.96%, respectively. 54.93% showed significant tumor inhibition and good dose-dependency, and the difference in statistical analysis was significant in each dose group compared with the negative control group.
  • the 10 mg/kg dose was administered intraperitoneally and intravenously, the effect of intravenous administration was better than that of intraperitoneal administration.
  • the tumor inhibition rates were 44.96% (ip) and 51.48% (iv), respectively.
  • Compound ferrous sulfate folic acid providing ferrous ions
  • deferoxamine is an iron chelating agent, capable of interacting with in vivo Iron ion Fe 2+ forms a chelate to remove ferrous ions in vivo
  • Vit C group antagonizes the oxidation reaction in mice; the inhibition rate of each group is 54.80%, 61.15%, 59.60%, 39.92%.
  • the anti-tumor rate of the iron-added group increased, while the anti-tumor rate of the DFO group decreased.
  • 2+ is related and has a close relationship with the content of Fe 2+ .
  • the human cancer mouse xenograft model maintains the biological characteristics of human tumors to a large extent, it grows slower than animal transplanted tumors, and has a much different biological characteristics from animal-derived tumors. The biological characteristics of human tumors, therefore, we continue to use the human cancer mouse xenograft model for experiments, and further objectively evaluate its efficacy and mechanism.
  • the in vitro cell screening results showed that the human gastric cancer cell line MKN-45 was most sensitive to dihydroartemisinin. Therefore, the human gastric cancer MKN-45 mouse subcutaneous xenograft model was selected for the experiment. According to the results of the H22 mouse model, the dose of Vit C was adjusted from the original 150 mg/kg to 200 mg/kg. The lyophilized powder of artemether was administered intravenously at a dose of 3, 10 g, 30 mg/kg once daily for 5 days/week. On the 19th day after administration, the T/C (%) of tumor tissues were 50.68%, 48.43%, and 47.32%, respectively, indicating inhibition of tumor growth and a certain dose relationship. The difference was statistically analyzed.
  • Artemisia sulphate and its lyophilized powder preparation have no obvious inhibitory effect on the growth and proliferation of human tumor cells in vitro, but the freeze-dried powder of artemether can significantly inhibit the growth of mouse sarcoma S180 and mouse liver cancer H22.
  • Inhibition of growth of human gastric cancer MKN-45 mouse xenografts suggests that artemisinin can exert anti-tumor effects through metabolic activation in vivo. Its anti-tumor mechanism is related to the ferrous ion (Fe 2+ ) mediated by its in vivo production of reactive oxygen species (ROS), which in turn causes tumor cell damage.
  • ROS reactive oxygen species

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Abstract

一种含蒿甲醚的药物组合物、制剂及其在制备治疗肿瘤的药物中的用途。该药物组合物包含蒿甲醚或双氢青蒿素和铁剂，二者的重量比为1：0.0〜1：2。

Description

含蒿甲醚的药物组合物、 制剂及其用途 技术领域
背景技术
蒿曱醚，化学名称为（3R, 5aS, 6R, 8aS , 9R, 10S , 12R, 12aR ) -十氢 -10-曱氧基 -3 , 6, 9-三曱基 -3 , 12-桥氧 -12H-吡喃并 [4, 3-j]- l , 2-苯并二塞平， 分子式为 C16H2605, 结构式如下：
Figure imgf000002_0001
用于各型疟疾， 主要用于抗氯喹恶性疟治疗和凶险型恶性疟的急救。
青蒿素及其衍生物具有公认的抗疟疾疗效。研究发现， 青蒿素及 其衍生物的体内代谢活性产物为双氢青蒿素， 其抗疟活性高， 毒性较 小。许多学者对青蒿素结构中的过氧桥进行了详细研究， 并将其抗疟 原理归纳为两个步骤， 即青蒿素被活化产生自由基， 自由基继而与疟 原蛋白结合。过氧桥还原分解形成自由基时需要低价过渡态金属离子 的存在，目前公认的与自由基产生有关的金属离子是亚铁离子（Fe2+ ), 包括亚铁血红素和游离 Fe2+。过氧桥被 Fe2+催化断裂后首先产生氧自 由基， 后经分子重排转化为更具活性的碳自由基， 这两种自由基对疟 原虫的细胞结构和功能都有破坏作用，但因碳自由基可以直接将许多 生物体的大分子烷基化，故现认为青蒿素更有可能通过碳自由基起活 性作用。
近年研究表明，抗疟疾药物青蒿素及其衍生物具有显著的抗肿瘤 作用， 其药理学作用研究受到广泛关注。 蒿曱醚为青蒿素的主要衍生 物之一， 抗疟疾作用优于青蒿素。 青蒿素类药物不仅可以选择性抑制 和 /或杀灭多种肿瘤细胞， 而且不良反应极少， 且不产生耐药性。 青 蒿素类药物的抗肿瘤作用已经得到多方面的证实，其主要的作用机制 有以下几个方面：
1、铁离子介导的细胞损伤： 恶性肿瘤细胞中 Fe含量要比正常细 胞大得多， 青蒿素类药物可以通过铁离子介导形成内过氧化桥， 并产 生活性氧离子 (ROS)和以碳为核心的自由基， 后者使细胞发生巨大的 分子损伤和细胞死亡；
2、 细胞周期阻滞： 青蒿琥酯可以使 Kaposi's肉瘤细胞周期时间 明显缩短，二氢青蒿素可以使人乳腺癌 MCF-7细胞阻滞在 G0+G1期； 3、 诱导细胞凋亡： 青蒿琥酯可以诱导 Kaposi's肉瘤细胞发生凋 亡， 并呈现出剂量依赖性， 而并不能诱导正常细胞发生凋亡。 青蒿素 可以诱导人红白血病 K562细胞跨膜电位下降而发生凋亡；
4、 抗血管生成作用： 青蒿素类药物可以通过抑制 VEGF和 KDR
/ flk-1的表达从而阻止肿瘤新生血管的形成；
5、 青蒿素类药物可以调节肿瘤相关基因的表达， 从而实现抗肿 瘤的活性；
6、 其它， 如青蒿琥酯还具有对抗多药耐药的能力； 青蒿素可以 抑制星形细胞瘤 T67细胞中的核因子 NF-KB的合成。 不仅如此， 蒿 曱醚可以引起嗜铬细胞瘤 (PC12)细胞的线粒体损伤， 线粒体肿胀、 嵴 断裂、 减少、 消失， 并抑制线粒体呼吸链复合酶 I和 IV的活性， 从而 导致细胞死亡。 发明内容 本发明要解决的技术问题为提供一种治疗肿瘤的药物组合物，包 含蒿曱醚或双氢青蒿素和铁剂。
作为优选， 蒿曱醚或双氢青蒿素与铁剂的重量比为 1 : 0.05 - 1 :
2。
更优选地，蒿曱醚或双氢青蒿素与铁剂的重量比为 1 : 0.1 - 1 : 1。 在本发明的具体实施方式中， 所述肿瘤为肉瘤、 肝癌或胃癌 本发明还提供一种药物制剂，由所述的药物组合物以及药学上可 接受的辅料组成。 作为优选， 所述药物制剂为注射液或冻干粉针剂。
本发明还提供蒿曱醚或双氢青蒿素和铁剂的组合物在制备治疗 治疗肿瘤的药物中的应用。
作为优选， 组合物中蒿曱醚或双氢青蒿素与铁剂的重量比为 1 : 0.05 - 1 : 2。
更优选地， 组合物中蒿曱醚或双氢青蒿素与铁剂的重量比为 1 : 0.1 - 1 : 1。
具体地， 所述肿瘤为肉瘤、 肝癌或胃癌。
本发明以七株人肿瘤细胞为模型， 采用改良 MTT法检测了蒿曱 醚及其冻干粉的体外抗肿瘤活性， 并与青蒿素、 双氢青蒿素和青蒿琥 酯进行了比较。 结果显示， 蒿曱醚及其冻干粉体外对七株人肿瘤细胞 人白血病细胞株（HL-60、 K562 )、 人肺癌细胞株（ Α549 )、 人结肠癌 细胞株 ( ΗΤ-29 )和人前列腺癌细胞株 ( PC-3 )、 人胃癌细胞株
( ΜΚΝ-28 )、 人喉癌细胞株（Hep2 ) 均无明显的抑制作用。 双氢青 蒿素则对 HL-60、 K562、 MKN-28、 HT-29、 Hep2五株肿瘤细胞均有 相对明显的抑制作用， 尤其是对 MKN-28细胞较为敏感， IC5()为 16.22μΜ。 蒿曱醚冻干粉为水溶性制剂， 不同于体外研究中的其它衍 生物， 故使静脉注射进行体内抗肿瘤评价成为可能。 因此， 尽管实验 结果显示无论蒿曱醚还是蒿曱醚冻干粉在体外均无明显的细胞毒作 用， 但鉴于其保留了青蒿素的药效结构-过氧桥， 在生物体内可经代 谢转化为双氢青蒿素， 因此本发明继续采用蒿曱醚冻干粉进行了体内 抗肿瘤作用的研究。
体内实验结果显示， 蒿曱醚冻干粉以 5、 10、 20mg/kg剂量腹腔 注射给药， 1次 /天， 连续 10天， 对小鼠肉瘤 S180 的抑瘤率分别为 29.06%、 44.96%、 54.93%, 显示出明显的抑瘤作用和良好的剂量依 赖性， 且各剂量组与阴性对照组比较， 统计学分析差异具有显著性。 在 10mg/kg剂量分别腹腔注射和静脉注射给药进行对比时发现，静脉 给药的效果优于腹腔给药的效果， 肿瘤抑制率分别为 44.96% ( ip )和 51.48% ( iv ) 。
在以上实验的基础上， 根据目前公认的氧自由基作用机理， 本发 明以小鼠肝癌 H22为模型， 调整剂量和研究方案， 在体内实验中设 计了不同的影响因素并调整了剂量， 以验证其抗肿瘤作用的机理。 结 果显示， 蒿曱醚冻干粉以 3、 10、 30mg/kg剂量静脉注射给药， 1次 / 天， 连续 10天， 显示出明显的抑瘤作用和良好的剂量依赖性， 抑瘤 率分别为： 38.98%、 54.80%、 73.07%。 我们在蒿曱醚冻干粉中剂量 即 10mg/kg的基础上， 分别设计了加铁剂组、 加 Vit C组和加去铁胺 ( DFO )组， 即： 10mg/kg ( iv ) 、 10mg/kg+FeSO43mg/kg ( ig ) 、 lOmg/kg+Vit C150mg/kg ( im ) 、 lOmg/kg+DFO 30mg/kg ( im ) , 其 目的是： 研究 Fe2+在蒿曱醚发挥抗肿瘤作用中的地位。 复方硫酸亚铁 叶酸， 提供亚铁离子； 去铁胺（DFO )为铁螯合剂， 能够与体内的亚 铁离子 Fe2+形成螯合物， 去除体内亚铁离子； Vit C组用来拮抗小鼠 体内的氧化反应； 各组的抑瘤率分别为 54.80%、 61.15%、 59.60%、 39.92%。 与蒿曱醚冻干粉中剂量单独用药相比，加铁剂组的抑瘤率升 高， 而 DFO组的抑瘤率则下降， 推测蒿曱醚冻干粉发挥抗肿瘤作用 的机制与 Fe2+有关， 且与 Fe2+的含量有密切的关系。 考虑到实验周期 短， 动物机体内的内源性 Fe2+的在较短时间内不会发生明显地变化， 对肿瘤生长的抑制作用未能充分显现。由于人癌棵小鼠异种移植瘤模 型在较大程度上保持了人肿瘤的生物学特性， 较动物移植瘤生长慢， 与动物来源肿瘤的生物学特性有较大差别，较大程度地保持了人肿瘤 的生物学特性，因此，我们继续采用人癌棵小鼠移植瘤模型进行实验， 对其疗效及作用机制进一步做出客观的评价。
体外细胞筛选结果显示，人胃癌细胞株 MKN-45对双氢青蒿素最 为敏感， 因此选择人胃癌 MKN-45棵小鼠皮下移植瘤模型进行实验。 根据 H22 小鼠模型的结果， 同时调整了 Vit C 的剂量， 由原来的 150mg/kg提高至 200mg/kg。 蒿曱醚冻干粉以 3、 10g、 30mg/kg剂量 静脉注射给药， 1次 /天， 5天 /周。给药第 19天， 肿瘤组织的 T/C ( % ) 分别为 50.68%、 48.43%、 47.32%, 显示对肿瘤生长的抑制作用， 并 有一定的剂量关系。 统计学分析其差异， 与阴性对照相比， 10、 30mg/kg剂量具有显著性， P<0.05。 阳性对照组 5-Fu在 10mg/kg剂量 的 T/C ( % ) 为 37.72%, 统计学分析其差异性具有显著性， PO.05, 可认为在此条件下模型成立， 且实验结果可信。 蒿曱醚冻干粉 ( 10mg/kg ) 、 蒿曱醚冻干粉 ( 10mg/kg ) +FeS04 ( 3mg/kg ) 、 蒿曱 醚冻干粉（ 10mg/kg ) +Vit C ( 200mg/kg )、 蒿曱醚冻干粉 ( 10mg/kg ) +DFO ( 30mg/kg )给药第 19天，肿瘤组织的 T/C ( % )分别为 48.43%、 48.38%、 96.36%、 91.95%。 与蒿曱醚冻干粉 10mg/kg单独给药相比, FeS04组的 T/C ( % )无明显变化， 提示在本实验条件下， 外源性的 铁剂对蒿曱醚抑制肿瘤生长的作用无明显影响。但随着给药时间的延 长， FeS04逐渐显示出增强蒿曱醚对肿瘤生长的抑制作用。 推测在实 验前期， 由于内源性的 Fe2+能够满足蒿曱醚发挥抗肿瘤作用的需要， 但随着时间的延长， 内源性 Fe2+逐渐消耗， 外源性的铁剂逐渐发挥其 增强蒿曱醚抗肿瘤强度的作用。 DFO组的 T/C ( % )急剧升高， 提示 在本实验条件下耗竭动物体内的内源性 Fe2+,能够抵消蒿曱醚的抗肿 瘤作用， Vit C组 T/C ( % )急剧升高， 提示在本实验条件下消除动物 体内 ROS能够阻止蒿曱醚发挥抗肿瘤作用。
附图内容
图 1为蒿曱醚对小鼠肉瘤 S180生长的抑制作用， H代表蒿曱醚 冻干粉；
图 2为蒿曱醚冻干粉制剂对小鼠肉瘤 S180生长的瘤体抑制作用； 图 3 蒿曱醚冻干粉对小鼠肝癌 H22生长的抑制作用， H代表蒿 曱醚冻干粉；
图 4 为蒿曱醚冻干粉对小鼠肝癌 H22生长的抑制作用， 图中 H 代表蒿曱醚冻干粉；
图 5示蒿曱醚冻干粉对小鼠 H22肝癌生长的抑制作用；
图 6示蒿曱醚对人胃癌 MKN-45棵小鼠移植瘤生长的抑制作用， H代表蒿曱醚冻干粉；
图 7示蒿曱醚对人胃癌 MKN-45棵小鼠移植瘤生长的抑制作用。
具体实施方式 本发明公开了含蒿曱醚的药物组合物、制剂及其在制备治疗肿瘤 的药物中的用途。 本领域技术人员可以借鉴本文内容， 适当改进工艺 参数实现。 特别需要指出的是， 所有类似的替换和改动对本领域技术 人员来说是显而易见的， 它们都被视为包括在本发明。 本发明的产品 与应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本 发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变 更与组合， 来实现和应用本发明技术。
为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结 合具体实施例对本发明作进一步的详细说明。 实施例 1 : 蒿曱醚冻干粉制剂对人肿瘤细胞生长的影响 （与其它 青蒿素衍生物进行比较）
(一） 材料与方法
1. 受试样品及配制
( 1 ) 受试样品
蒿曱醚冻干粉制剂、 蒿曱醚原料药、 青蒿素、 双氢青蒿素、 青蒿 琥酯， 由昆明制药集团股份有限公司研究院提供。
( 2 )样品及配制
① 受试样品的配制
五个青蒿素衍生物均设 2、 10、 50、 250、 500μΜ 5个受试浓度。 蒿曱醚原料药、 青蒿素、 双氢青蒿素、 青蒿琥酯采用二曱基亚砜 ( DMSO )、 蒿曱醚冻干粉制剂采用生理盐水（N.S. )溶解， 后加入一 定量的 RPMI 1640完全培养液配制成高浓度溶液， 各低浓度溶液则 按比例由高浓度稀释配制而成。
② 溶媒对照的配制 蒿曱醚原料药、 青蒿素、 双氢青蒿素、 青蒿琥酯设 500、 250μΜ 两个较高受试浓度中所含 DMSO的浓度为溶媒对照， 用 RPMI 1640 培养液配制， 此时 DMSO的受试浓度为 1%和 0.5%。 蒿曱醚冻干粉 制剂设 500、 250μΜ两个较高受试浓度中所含辅料的浓度作为溶媒对 照。
③ 阳性对照的配制
阳性对照为抗癌药多柔比星 （ADM ), 设 0.1、 1、 10 g/ml 3个 受试浓度（终浓度）。取 ADM原液（ 1 mg/ml )加入一定量的 RPMI 1640 完全培养液配制成高浓度溶液，各低浓度溶液则按比例由高浓度稀释 配制而成。
2·细胞株
HL-60: (人早幼粒细胞白血病细胞株）； K562 (人慢性粒细胞白 血病细胞株 ); ΗΤ-29 (人结肠癌细胞株 ); PC-3 (人前列腺癌细胞株 ); Α549 (人非小细胞肺癌细胞株）； ΜΚΝ-28 (人胃癌细胞株）； Hep2 (人喉癌细胞株）。 均购自中国科学院上海生命科学研究院细胞库。
3·检测方法 （MTT法）
以改良 MTT法测定 5种受试物对 7株人肿瘤细胞增殖的影响。 取处于对数生长期细胞， 调至一定浓度后加入 96孔培养板。 贴 壁细胞培养一定时间待其贴壁后加入受试物，悬浮细胞接种后即加入 受试物。 设 2、 10、 50、 250、 500μΜ 5个受试浓度， 每个浓度设 3 个平行孔， ΙΟμΙ/孔； 溶媒对照为 0.5%和 1%等体积 DMSO, 阳性对照 为 ADM 0.1、 1、 l(^g/ml 3个浓度。 加样后 37°C、 5%C02培养箱中 孵育一定时间后加入 MTT ( 5 mg/ml ), 20μ1/孔， 继续培养一定时间 后加入三联液 [ 10 % SDS-5 %异丁醇—0.012mol / L HCI ( W / V / V ) ], 溶解混匀后继续置 37°C、 5%C02培养箱一定时间， 用酶标仪 在 570 nm波长下测定各孔的 OD值， 根据 OD值进行结果计算。
3. 结果计算和统计学分析
按下列公式计算细胞增殖抑制率：
抑制率（％) = ( 00值对照孔 - 00值加样孔） / 00值对照孔 100% DMSO对细胞的增殖抑制率大于 15%时用以下公式计算： 抑制率（％ ) = ( OD值溶媒组 - OD值给药孔 ) I OD值溶媒组 l 00%
采用 Microsoft Excel 2003计算抑制率， 采用 LOGIT法, 半数抑制浓度 IC5。， 以此作为抑制能力的判断指标。
(二） 结果及分析
1. 5种受试物对 7株人肿瘤细胞生长的抑制作用见表 1-5
表 1. 五种受试物对 K562细胞生长的 Ι( 5。（μΜ)
样 口
试验批次 青蒿素 双 氢 蒿曱醚 肯 咼 蒿曱醚 ADM 作用时间 青蒿素 原料药 琥 酯 冻干粉 (阳性）
( h )
24h >1000 >1000 >1000 >1000 551.04 7.09 第 1 48h >1000 996.6 >1000 322.47 150.21 1.90 次 72h >1000 491.7 >1000 39.26 48.26 0.17
24h >1000 144.06 >1000 >1000 >1000 5.76 第 2 48h >1000 27.97 >1000 >1000 473.45 0.24 次 72h 517.69 44.82 892.61 >1000 209.31 9.93xl0"3
24h >1000 146.34 345.21 493.61 450.17 2.59 第 48h 991.25 80.72 331.11 140.82 543.641 1.69
3次 72h 448.96 60.54 137.27 90.13 292.35 0.74 表 2. 五种受试物对 HL-60细胞生长的 IC5。 ( μΜ ) 样 品 青蒿素 双 氢 蒿曱醚 肯 咼 蒿曱醚 ADM 试验批次 青蒿素 原料药 琥 酯 冻干粉 (阳性） 作用时间 h
24h >1000 >1000 >1000 >1000 982.55 9.24 第 1次 48h >1000 >1000 >1000 >1000 521.16 1.72
72h >1000 >1000 >1000 >1000 149.25 0.78
24h 749.92 74.35 658.09 269.03 248.31 4.19 第 2次 48h 330.74 16.26 77.17 39.51 124.67 0.16 72h 577.06 115.59 248.31 145.40 426.07 0.57 表 3. 五种受试物对 A549细胞生长的 IC5。 ( μΜ ) 样 品 青蒿素 双 氢 蒿曱醚 青 蒿 蒿曱醚 ADM 试验批次 青蒿素 原料药 琥 酯 冻干粉 阳性 作用时间
24h >1000 >1000 >1000 >1000 >1000 38.76 第 48h >1000 >1000 >1000 >1000 >1000 10.72
1次 72h >1000 >1000 >1000 >1000 >1000 0.76
24h 420.92 934.91 640.55 >1000 >1000 >100 第 48h >1000 221.01 >1000 272.44 >1000 0.62
2次 72h >1000 192.36 831.51 225.05 >1000 0.19 表 4. 五种受试物对 HT-29细胞生长的 IC50 ( μΜ ) a
样 r口 青蒿素 双 氢 蒿曱醚 肯 咼 蒿曱醚 ADM 试验批次 青蒿素 原料药 琥 酯 冻干粉 (阳性） 作用时间
24h >1000 288.02 >1000 >1000 >1000 2.28 第 48h >1000 336.88 >1000 >1000 836.76 0.28
1次 72h >1000 160.37 317.71 >1000 363.50 5.7χ10"2
24h >1000 280.34 >1000 323.21 >1000 3.81 第 48h >1000 432.93 >1000 >1000 756.17 0.59
2次 72h >1000 257.50 579.11 438.21 568.17 0.11 表 5. 五种受试物对 PC -3细胞生长的 IC5o ( μΜ ) 样 ' 青蒿素 双 氢 蒿曱醚 肯 咼 蒿曱醚 ADM 试验批次 青蒿素 原料药 琥 酯 冻干粉 阳性 作用时间 h
24h >1000 659.58 >1000 >1000 >1000 33.02 第 1 48h >1000 >1000 >1000 >1000 >1000 7.60 次
72h >1000 230.34 >1000 >1000 379.66 3.16
24h >1000 >1000 >1000 >1000 >1000 47.83 第 2 48h >1000 >1000 >1000 >1000 >1000 9.62 次 72h >1000 >1000 >1000 >1000 >1000 3.74 根据初筛结果， 对进一步的实验做出调整： 筛选出较为敏感的细 胞株， 因蒿曱醚冻干粉含有大量辅料， 溶胀系数较高误差大， 所以仅 选用蒿曱醚原料药进行复筛， 结果见表 6-8。
表 6. 四种受试物对 HT-29细胞生长的 IC50 ( μΜ ), ( 72h ) 样品 青蒿素 双 氢 蒿曱醚 肯 咼 ADM 试验批次 青蒿素 原料药 琥 酯 阳性
第 1次 2349.92 236.40 213.96 328.41 0.11 第 2次 772.95 172.80 262.66 306.08 0.19
HT-29 第 3次 436.91 148.49 245.23 199.72 0.12
均值 544.75 143.00 254.83 225.27 0.11
表 7. 四种受试物对 MKN-28细胞的 IC5。 （μΜ ), ( 72h ) 样品 青蒿素 氢青 蒿曱醚 肯咼 ADM 试验批次 蒿素 原料药 琥酯 阳性 第 1次 587.76 15.10 27895.65 35.30 0.52 第 2次 1438.90 17.07 336.32 28.10 0.53
MKN-28 第 3次 1612.26 16.50 519.55 21.40 0.47 均值 970.36 16.22 402.40 27.92 0.51
表 8· 四种受试物对 Hep2细胞的 IC5。（μΜ), ( 72h ) 样品 青蒿素 双氢 蒿曱醚 肯 咼 ADM 试验批次 青蒿素 原料药 琥 酯 (阳性） 第 1次 350.26 113.72 412.44 119.21 0.41 第 2次 271.29 88.17 >1000 93.22 0.26
Hep2 第 3次 >1000 125.54 >1000 212.06 1.00 均值 951.78 91.96 >1000 149.46 0.51 以上结果显示： 青蒿素、 蒿曱醚及其冻干粉体外对 7株人肿瘤细 胞均无明显抑制作用， 青蒿琥酯仅对 HL-60、 K562、 MKN-28显示出 抑制作用， 双氢青蒿素则对 HL-60、 K562、 MKN-28, HT-29、 Hep2 五株肿瘤细胞均有相对明显的抑制作用，尤其是对 MKN-28细胞较为 敏感， IC50为 16.22μΜ。 实施例 2: 蒿曱醚冻干粉制剂对小鼠移植瘤生长的影响
(一）对小鼠移植性肉瘤 S180生长的影响
1. 材料与方法
( 1 ) 受试样品
蒿曱醚冻干粉制剂， 由昆明制药集团股份有限公司研究院提供。
( 2 )蒿曱醚冻干粉制剂的配制 （受试剂量为所含蒿曱醚原料药 的量， 以下均同）
称取一定量蒿曱醚冻干粉，用生理盐水（N.S )溶解，按 0.2ml/10g 体重的给药体积、 20mg/kg高剂量配制成相应浓度的溶液， 中、 低剂 量由高剂量浓度溶液以 N.S溶液按比例稀释配制。
( 3 ) 实验方法
① 小鼠 S180模型的建立
参照文献方法， 取处于对数生长期的腹水型 S180细胞， 调整至 一定浓度后接种于小鼠右侧腋部皮下， 24 小时后随机分组给药。
② 实验方案
本次实验为预实验， 旨在考察蒿曱醚冻干粉是否具有体内抗肿瘤 作用。 选取健康雌性 ICR小鼠， 接种 24 小时后随机分为阴性对照组 ( N.S )、 蒿曱醚冻干粉低 ( 5mg/kg )、 中（ 10mg/kg )、 高（ 20mg/kg ) 剂量组， 腹腔注射给药 （ip) , 中剂量（10mg/kg) 同时设置静脉给 药 （iv), 以比较不同给药途径疗效的差异。 1次 /天， 连续 10天。 末 次给药 24小时后， 颈推脱臼处死小鼠剥取肿瘤组织、 称瘤重， 根据 瘤重计算抑瘤率。
③ 结果计算及分析
按下列公式计算肿瘤生长的抑制率（抑瘤率）
抑瘤率 = (平均瘤重《 - ,平 '均瘤重!《 ) /平均瘤重《 χ 100% 胸腺（脾）指数 =平均重量（ mg )胸腺 脾) /去瘤后小鼠平均体重（ 10g ) 各组小鼠平均瘤重用 ±SD表示，采用 , ' SPSS16.0统计学软件包进 行单因素方差分析。
④质量控制及评价标准
阴性对照组小鼠平均瘤重小于 1 g或 20%小鼠的瘤重小于
400mg, 表示肿瘤生长不良。 在实验期间给药组小鼠死亡超过 20%或 平均体重（去瘤后）下降（自身对照）超过 15%者， 表示药物的毒性 反应， 应当减少剂量重新试验。 肿瘤生长抑制率（％ ) < 40%为无效； 肿瘤生长抑制率 （％) >40%, 并经统计学处理 PO.05为有效。 2. 结果
( 1 ) 蒿曱醚冻干粉制剂对小鼠肉瘤 S180生长的抑制作用， 结果见 表 9、 图 1-2。
表 9. 蒿曱醚冻干粉对小鼠肉瘤 S180肿瘤生长的抑制作用 （ 土 SD, n=8 )
组别 剂量 给药 动物数 (只 ) 平均瘤重 抑瘤率
(mg/kg) 途径 (8) (%)
(X+SD)
阴性对照 0.2 ip 9 9 2.43±0.54 --
(N.S) ml/lOg 5 ip 8 8 1.72±0.76* 29.06% 蒿曱醚 10 ip 8 8 1.34±0.57** 44.96% 冻干粉 10 iv 8 8 1.18±0.61 ** 51.48%
20 ip 8 8 1.09土 0.52** 54.93% 注： 与阴性对照组相比较： ** P <0.01、 * P <0.05
ip:腹腔注射给药 iv:静脉注射给药
以上结果显示： 与阴性对照组相比， 蒿曱醚冻干粉制剂经腹腔注 射给药 10天， 给药组小鼠肿瘤与阴性对照组相比瘤体减小、 瘤重减 轻，其中 10mg/kg和 20mg/kg剂量对 S 180生长的抑制率分别为 44.96% 和 54.93%; 而 10mg/kg剂量静脉注射给药对 S 180生长的抑制率由腹 腔注射给药的 44.96%升高为 51.48% , 显示同等剂量静脉注射给药效 果优于腹腔注射给药。 各剂量组与阴性对照组相比， 统计学分析均有 显著性差异， Ρ<0.01。
(二 )对小鼠移植性肝癌 Η22生长的影响及作用机制验证
1. 材料与方法
( 1 ) 受试样品
蒿曱醚冻干粉制剂由昆明制药集团股份有限公司研究院提供。
( 2 ) 受试样品配制
① 蒿曱醚冻干粉制剂的配制
称取一定量蒿曱醚冻干粉 Η冻干粉用 N.S溶解， 按 0.15ml/10g 体重的给药体积配制成高剂量 30mg/kg相应浓度的溶液，低、 中剂量 ( 3、 10mg/kg ) 由高剂量浓度以 N.S溶液按比例稀释配制。
② 阳性对照的配制
阳性对照环磷酰胺（CTX )注射剂，剂量 10mg/kg ,按 0.15ml/10g 的给药体积用
N.S稀释至所需浓度。
( 3 ) 实验方法
① 小鼠 H22模型的建立 参照文献方法， 取处于对数生长期的腹水型 H22细胞， 调整为 一定浓度接种于小鼠右侧腋部皮下， 接种 24 小时后随机分组给药。
② 实验方案
目前认为青蒿素类化合物的抗疟机制为： 亚铁离子（Fe2+)介导 青蒿素类化合物产生活性氧（ROS), ROS可氧化蛋白质分子及虫体 内部生物膜结构， 进而引起虫体的死亡。 我们推测亚铁离子 （Fe2+) 和活性氧（ ROS )在其抗肿瘤效应中亦应发挥重要作用。 因此结合预 实验结果， 我们在本次方案中增加以下试验因素： 1. 添加铁剂 （增 加小鼠体内 Fe2+量）; 2. 添加去铁胺（DFO) (减少小鼠体内的 Fe2+ 量）； 3. 添加 VitC (消除活性氧（ROS))。 实验分组如下：
阴性对照组： 生理盐水（NS), 0.15ml/10g体重， iv;
阳性对照组： CTX10mg/kg, 0.15ml/10g, iv;
受试组（蒿曱醚冻干粉）
低剂量组： 蒿曱醚冻干粉 3mg/kg , 0.15ml/10g, 1次 /天， iv; 中剂量组： 蒿曱醚冻干粉 10mg/kg, 0.15ml/10g, 1次 /天， iv; 高剂量组： 蒿曱醚冻干粉 30mg/kg, 0.15ml/10g, 1次 /天， iv; 中剂量 +铁剂组: 蒿曱醚冻干粉 10mg/kg, 0.15ml/10g (iv), 1次 /天 +FeS043mg/kg, 0.2ml/10g, 灌胃给药 ( ig ) , 1次 /天；
中剂量 +去铁胺组： 蒿曱醚冻干粉 10mg/kg, 0.15ml/10g (iv), 1 次 /天 +去铁胺 (DFO) 30mg/kg, 0.1ml/10g, 月几肉注射给药 （im), 1次 /天；
中剂量 +Vit C组： 蒿曱醚冻干粉 10mg/kg, 0.15ml/10g (iv), 1 次 /天 +VitC 150mg/kg, 0.1ml/10g (im), 1次 /天。
选取健康雌性 ICR小鼠，在接种 24 小时后按以上实验方案给药， 连续 10天。 末次给药 24小时后， 颈推脱臼处死小鼠剥取肿瘤组织、 称瘤重， 根据瘤重计算抑瘤率。
③ 结果计算及分析
按下列公式计算肿瘤生长的抑制率（抑瘤率）
抑瘤率 = (平均瘤重对 -平均瘤重给药 ) /平均瘤重对照组 χΐοο% 各组小鼠平均瘤重用 ±SD表示， 采用 SPSS 16.0统计学软件包 进行单因素方差分析。
④质量控制及评价标准
评价同前
2. 结果
( 1 ) 蒿曱醚冻干粉制剂对小鼠肝癌 H22生长的抑制作用见表 10 , 图 3-4。
表 10蒿曱醚冻干粉对小鼠肝癌 H22肿瘤生长的抑制作用 （ ±SD , n=10 )
组别 剂量 给药 动物数 平均瘤 抑瘤率
(mg/kg) 途径 (只） (%) 实 实 (X+SD)
验后
阴性 0.2 ml/lOg iv 10 10 1.33士 0.63 --
( N.S )
3 iv 10 10 0.81±0.58 38.98%
10 iv 10 10 0.60士 0.42 54.80% 蒿曱醚 10+FeSO4 iv 10 9 0.52士 0.30 61.15% 冻干粉 3 mg/kg +ig
10+DFO iv 10 10 0.80士 0.53 39.92%
30mg/kg +im
10+Vit C iv 10 10 0.54士 0.36 59.60%
150mg/kg +im
30 iv 10 10 0.36士 0.22 73.07% 阳性 10 iv 10 10 0.81±0.63 38.98%
( CTX )
im 肉注射 以上结果显示： 与阴性对照组相比， 蒿曱醚冻干粉经 iv给药 10 天， 小鼠肿瘤与阴性对照组相比瘤体减小、 瘤重减轻， 其中蒿曱醚冻 干粉 10mg/kg和 30mg/kg静脉注射给药对 H22生长的抑制率分别为 54.80%和 73.07%, 蒿曱醚冻干粉 10mg/kg与铁剂联用时对 H22生长 的抑制率由原来的 54.80%升高为 61.15%; 蒿曱醚冻干粉 10mg/kg与 去铁胺 ( DFO )联用时对 H22生长的抑制率由原来的 54.80%降低为 为 39.92%。 实施例 3: 蒿曱醚冻干粉制剂对人胃癌棵小鼠移植瘤生长的影响 (一）材料和方法
1. 受试样品及配制
( 1 ) 受试样品
蒿曱醚冻干粉， 由昆明制药集团股份有限公司研究院提供。
( 2 ) 受试样品的配制
称取一定量蒿曱醚冻干粉 H冻干粉用 N.S溶解， 按 0.15ml/10g 体重的给药体积配制成高剂量 30mg/kg相应浓度的溶液，低、 中剂量 ( 3、 10mg/kg ) 由高剂量浓度以 N.S溶液按比例稀释配制。
( 3 ) 阳性对照的配制
取 5-氟尿嘧啶 ( 5-Fu )原液， 剂量 10mg/kg, 按 0.15ml/20g的给 药体积， 以 N.S稀释至所需浓度。
2. 实验方法
( 1 )人胃癌棵小鼠异种移植瘤模型的建立
根据体外结果，我们选择对青蒿素类衍生物较为敏感的人胃癌细 胞株作为体内抗肿瘤研究的受试瘤种。参照文献取棵小鼠体内生长良 好的肿瘤组织，剪切成一定体积的组织小块接种于棵小鼠右侧腋窝皮 下， 接种数天后去除肿瘤未生长、 生长过緩或过快的棵小鼠， 挑选已 形成适度肿瘤体积 (tumor volume, TV) 的棵小鼠随机分组，并使各组 肿瘤体积均值接近。
( 2 ) 实验方案
阴性对照组： N.S. , 0.15ml/10g体重， iv; 阳性对照组： 5-Fu 10mg/kg, 0.15ml/20g, iv;
受试组（蒿曱醚冻干粉）
低剂量组： 蒿曱醚冻干粉 3mg/kg , 0.15ml/10g, 1次 /天， iv; 中剂量组： 蒿曱醚冻干粉 10mg/kg, 0.15ml/10g, 1次 /天， iv; 高剂量组： 蒿曱醚冻干粉 30mg/kg, 0.15ml/10g, 1次 /天， iv; 中剂量 +铁剂组: 蒿曱醚冻干粉 10mg/kg, 0.15ml/10g (iv), 1次 /天 +FeS043mg/kg, 0.2ml/10g (ig), 1次 /天；
中剂量 +去铁胺组： 蒿曱醚冻干粉 10mg/kg, 0.15ml/10g (iv), 1 次 /天 +DFO30mg/kg, 0.1ml/10g (im), 1次 /天；
中剂量 +Vit C组： 蒿曱醚冻干粉 10mg/kg, 0.15ml/10g (iv), 1 次 /天 +VitC200mg/kg, O.lml/lOg (im), 1次 /天。
按以上实验方案分组， 每周给药 5天， 连续 4周。 每周测量肿瘤 体积（TV)3次，并计算相对肿瘤体积（RTV)和相对肿瘤增殖率（T/C %)。 末次给药 3小时后颈推脱臼处死动物取完整肿瘤组织， 称瘤重 并计算抑瘤率。
( 3 ) 结果计算和分析
①按以下公式计算 TV、 RTV和 T/C ( % )
TV= l/2xaxb2, 其中 a、 b分别表示肿瘤组织的长、短径； RTV = Vt/V。， 其中 V。为开始给药 （d。） 时测量所得肿瘤体积， Vt为每次测 量时的肿瘤体积； T/C (%) =TRTV/CRTVxlOO%, TRTV为治疗组 RTV, CRTV为阴性对照组 RTV。 结果用 ±SD表示， 采用 SPSS 16.0统计学 软件
Figure imgf000018_0001
判断标准为： T/C (%) > 60%为无效； T/C (%)≤60%, 并经统计学 处理 P < 0.05为有效。也可参照 Fodstad判断标准进行判断： T/C ( % ) > 50%为（ -）无活性； T/C ( % ) <50% ( +/- )边缘活性； T/C ( % ) ≤40%为 （ + ) 中等强度活性； T/C (%) <25% 为 （ + + ) 高强度活 性； T/C ( % )≤10%为 （ + + + )特强活性。 本研究采用国内标准进 行评价。 (二）结果
蒿曱醚冻干粉对人胃癌棵小鼠移植瘤生长的抑制作用见表 11 , 图 6-7。
表 11化合物 H给药第 19天对人胃癌 MKN-45棵小鼠移植瘤生长影 响
Figure imgf000019_0001
注： v为静脉注射给药； ig:灌胃给药 im:肌肉注射;与阴性组相比 较： *P<0.05
d0: 分笼给药时间； dn: 实际治疗疗效最佳时间
以上结果显示， 蒿曱醚冻干粉给药 1~5天， 各组肿瘤生长速度无 明显差异， 给药至 15~23天， 阴性对照组肿瘤生长速度明显快于其它 各组。 给药后第 24天， 颈推脱臼处死全部动物， 取肿瘤组织测量体 积并进行各参数计算。
阳性对照 5-Fu注射液静脉给药 19天，肿瘤的相对增殖率 （T/C %) 为 37.72% (小于 60% ), 与阴性对照组比较， 统计学处理差异具有显 著性， PO.05; 蒿曱醚冻干粉静脉给药 19天，低剂量组肿瘤的 T/C % 为 50.68% (小于 60% ), 与阴性对照组比较， 统计学处理差异无显著 性，P>0.05;中剂量和高剂量组肿瘤的 T/C % 分别为 48.43%和 47.32% (均小于 60% ), 与阴性对照组比较， 统计学处理差异具有显著性， P<0.05; H冻干粉静脉给药 19天， 中剂量 +铁剂组肿瘤的 T/C% 为 48.38% ,与阴性对照组比较， P=0.05；中剂量 +Vit C组肿瘤的 T/C% 为 96.36%, 与阴性对照组比较， 统计学处理差异无显著性， P>0.05; 中 剂量 +DFO组肿瘤的 T/C% 为 91.95%, 与阴性对照组比较， 统计学 处理差异无显著性， P>0.05; 四、 结果
大量文献报道青蒿素及其衍生物、尤其是双氢青蒿素和青蒿琥酯 具有明显的抗肿瘤活性。 蒿曱醚是青蒿素的衍生物之一， 具有更好的 抗疟作用及及更优的体内过程。本研究在完成了蒿曱醚冻干粉制剂制 备的基础上，检测了蒿曱醚及其冻干粉制剂的体内外抗肿瘤活性， 并 根据目前公认的氧自由基作用机理，在体内实验中设计了不同的影响 因素， 以验证其抗肿瘤作用的机理。
本实验中我们以七株人肿瘤细胞为模型， 采用改良 MTT法检测 了蒿曱醚及其冻干粉的体外抗肿瘤活性， 并与青蒿素、 双氢青蒿素和 青蒿琥酯进行了比较。 结果显示， 蒿曱醚及其冻干粉体外对七株人肿 瘤细胞人白血病细胞株（HL-60、 K562 )、 人肺癌细胞株（ Α549 )、 人 结肠癌细胞株 ( ΗΤ-29 )和人前列腺癌细胞株（PC-3 )、 人胃癌细胞 株（MKN-28 )、 人喉癌细胞株 ( Hep2 ) 均无明显的抑制作用。 双氢 青蒿素则对 HL-60、 K562、 MKN-28、 HT-29、 Hep2五株肿瘤细胞均 有相对明显的抑制作用， 尤其是对 MKN-28细胞较为敏感， IC50为 16.22μΜ。 蒿曱醚冻干粉为水溶性制剂， 不同于体外研究中的其它衍 生物， 故使静脉注射进行体内抗肿瘤评价成为可能。 因此， 尽管实验 结果显示无论蒿曱醚还是蒿曱醚冻干粉在体外均无明显的细胞毒作 用， 但鉴于其保留了青蒿素的药效结构-过氧桥， 在生物体内可经代 谢转化为双氢青蒿素， 因此我们继续采用蒿曱醚冻干粉进行了体内抗 肿瘤作用的研究。
体内实验结果显示， 蒿曱醚冻干粉以 5、 10、 20mg/kg剂量腹腔 注射给药， 1次 /天， 连续 10天， 对小鼠肉瘤 S180 的抑瘤率分别为 29.06%、 44.96%、 54.93%, 显示出明显的抑瘤作用和良好的剂量依 赖性， 且各剂量组与阴性对照组比较， 统计学分析差异具有显著性。 在 10mg/kg剂量分别腹腔注射和静脉注射给药进行对比时发现，静脉 给药的效果优于腹腔给药的效果， 肿瘤抑制率分别为 44.96% ( ip )和 51.48% ( iv ) 。
在以上实验的基础上， 我们又根据目前公认的氧自由基作用机 理， 以小鼠肝癌 H22为模型， 调整剂量和研究方案， 在体内实验中 设计了不同的影响因素并调整了剂量， 以验证其抗肿瘤作用的机理。 结果显示， 蒿曱醚冻干粉以 3、 10、 30mg/kg剂量静脉注射给药， 1 次 /天， 连续 10天， 显示出明显的抑瘤作用和良好的剂量依赖性， 抑 瘤率分别为： 38.98%、 54.80%、 73.07%。 我们在蒿曱醚冻干粉中剂 量即 1 Omg/kg的基础上， 分别设计了加铁剂组、 加 Vit C组和加去铁 胺（DFO )组， 即： 1 Omg/kg ( iv ) 、 10mg/kg+FeSO43mg/kg ( ig ) 、 lOmg/kg+Vit C150mg/kg ( im ) 、 lOmg/kg+DFO 3 Omg/kg ( im ) , 其 目的是： 研究 Fe2+在蒿曱醚发挥抗肿瘤作用中的地位。 复方硫酸亚铁 叶酸， 提供亚铁离子； 去铁胺（DFO )为铁螯合剂， 能够与体内的亚 铁离子 Fe2+形成螯合物， 去除体内亚铁离子； Vit C组用来拮抗小鼠 体内的氧化反应； 各组的抑瘤率分别为 54.80%、 61.15%、 59.60%、 39.92%。 与蒿曱醚冻干粉中剂量单独用药相比，加铁剂组的抑瘤率升 高， 而 DFO组的抑瘤率则下降， 推测蒿曱醚冻干粉发挥抗肿瘤作用 的机制与 Fe2+有关， 且与 Fe2+的含量有密切的关系。 考虑到实验周期 短， 动物机体内的内源性 Fe2+的在较短时间内不会发生明显地变化， 对肿瘤生长的抑制作用未能充分显现。由于人癌棵小鼠异种移植瘤模 型在较大程度上保持了人肿瘤的生物学特性， 较动物移植瘤生长慢， 与动物来源肿瘤的生物学特性有较大差别，较大程度地保持了人肿瘤 的生物学特性，因此，我们继续采用人癌棵小鼠移植瘤模型进行实验， 对其疗效及作用机制进一步做出客观的评价。
体外细胞筛选结果显示，人胃癌细胞株 MKN-45对双氢青蒿素最 为敏感， 因此选择人胃癌 MKN-45棵小鼠皮下移植瘤模型进行实验。 根据 H22小鼠模型的结果， 同时调整了 Vit C的剂量， 由原来的 150mg/kg提高至 200mg/kg。 蒿曱醚冻干粉以 3、 10g、 30mg/kg剂量 静脉注射给药， 1次 /天， 5天 /周。给药第 19天， 肿瘤组织的 T/C ( % ) 分别为 50.68%、 48.43%、 47.32%, 显示对肿瘤生长的抑制作用， 并 有一定的剂量关系。 统计学分析其差异， 与阴性对照相比， 10、 30mg/kg剂量具有显著性， P<0.05。 阳性对照组 5-Fu在 10mg/kg剂量 的 T/C ( % ) 为 37.72%, 统计学分析其差异性具有显著性， PO.05, 可认为在此条件下模型成立， 且实验结果可信。 蒿曱醚冻干粉
( 10mg/kg ) 、 蒿曱醚冻干粉 ( 10mg/kg ) +FeS04 ( 3mg/kg ) 、 蒿曱 醚冻干粉（ 10mg/kg ) +Vit C ( 200mg/kg )、 蒿曱醚冻干粉 ( 10mg/kg ) +DFO ( 30mg/kg )给药第 19天，肿瘤组织的 T/C ( % )分别为 48.43%、 48.38%、 96.36%、 91.95%。 与蒿曱醚冻干粉 10mg/kg单独给药相比, FeS04组的 T/C ( % )无明显变化， 提示在本实验条件下， 外源性的 铁剂对蒿曱醚抑制肿瘤生长的作用无明显影响。但随着给药时间的延 长， FeS04逐渐显示出增强蒿曱醚对肿瘤生长的抑制作用。 推测在实 验前期， 由于内源性的 Fe2+能够满足蒿曱醚发挥抗肿瘤作用的需要， 但随着时间的延长， 内源性 Fe2+逐渐消耗， 外源性的铁剂逐渐发挥其 增强蒿曱醚抗肿瘤强度的作用。 DFO组的 T/C ( % )急剧升高， 提示 在本实验条件下耗竭动物体内的内源性 Fe2+,能够抵消蒿曱醚的抗肿 瘤作用， Vit C组 T/C ( % )急剧升高， 提示在本实验条件下消除动物 体内 ROS能够阻止蒿曱醚发挥抗肿瘤作用。 五、 结论
蒿曱醚及其冻干粉制剂在体外对人肿瘤细胞的生长增殖无明显 的抑制作用， 但蒿曱醚冻干粉在体内能够明显抑制小鼠肉瘤 S180以 及小鼠肝癌 H22的生长， 并明显抑制人胃癌 MKN-45棵小鼠移植瘤 的生长， 提示蒿曱醚可通过体内代谢活化而发挥抗肿瘤作用。 其抗肿 瘤作用机制与体内亚铁离子（Fe2+ )介导其产生活性氧（ROS )进而 引起肿瘤细胞损伤有关。 以上所述仅是本发明的优选实施方式， 应当指出， 对于本技术领 域的普通技术人员来说， 在不脱离本发明原理的前提下， 还可以做出 若干改进和润饰， 这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

权 利 要 求
1. 一种治疗肿瘤的药物组合物， 包含蒿曱醚或双氢青蒿素和铁 剂。
2. 根据权利要求 1所述的药物组合物， 其特征在于， 蒿曱醚或 双氢青蒿素与铁剂的重量比为 1: 0.05-1: 2。
3. 根据权利要求 2述的药物组合物， 其特征在于， 蒿曱醚或双 氢青蒿素与铁剂的重量比为 1: 0.1 -1: 1。
4. 根据权利要求 1-3任一项所述的药物组合物， 其特征在于， 所述肿瘤为肉瘤、 肝癌或胃癌。
5. 药物制剂， 由权利要求 1-4任一项所述的药物组合物以及药 学上可接受的辅料组成。
6. 根据权利要求 5所述的药物制剂， 其特征在于， 为注射液或 冻干粉针剂。
7. 蒿曱醚或双氢青蒿素和铁剂的组合物在制备治疗治疗肿瘤的 药物中的应用。
8. 根据权利要求 7所述的应用， 其特征在于， 组合物中蒿曱醚 或双氢青蒿素与铁剂的重量比为 1: 0.05- 1: 2。
9. 根据权利要求 7所述的应用， 其特征在于， 组合物中蒿曱醚 或双氢青蒿素与铁剂的重量比为 1: 0.1 ~ 1: 1。
10. 根据权利要求 7-9任一项所述的应用， 其特征在于， 所述肿 瘤为肉瘤、 肝癌或胃癌。
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