WO2014077723A1 - Способ получения пробиотического препарата корпускулярных антигенов коринебактерий, пробиотический бактериальный препарат для профилактики и лечения туберкулеза и симбионтный штамм - Google Patents

Способ получения пробиотического препарата корпускулярных антигенов коринебактерий, пробиотический бактериальный препарат для профилактики и лечения туберкулеза и симбионтный штамм Download PDF

Info

Publication number
WO2014077723A1
WO2014077723A1 PCT/RU2012/000950 RU2012000950W WO2014077723A1 WO 2014077723 A1 WO2014077723 A1 WO 2014077723A1 RU 2012000950 W RU2012000950 W RU 2012000950W WO 2014077723 A1 WO2014077723 A1 WO 2014077723A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
tuberculosis
precipitate
cells
preparation
probiotic
Prior art date
Application number
PCT/RU2012/000950
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Елена Александровна ШМЕЛЕВА
Original Assignee
Shmeleva Elena Alexandrovna
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Shmeleva Elena Alexandrovna filed Critical Shmeleva Elena Alexandrovna
Priority to PCT/RU2012/000950 priority Critical patent/WO2014077723A1/ru
Publication of WO2014077723A1 publication Critical patent/WO2014077723A1/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/02—Bacterial antigens
    • A61K39/05—Actinobacteria, e.g. Actinomyces, Streptomyces, Nocardia, Bifidobacterium, Gardnerella, Corynebacterium; Propionibacterium
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/34—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Corynebacterium (G)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205—Bacterial isolates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/58—Medicinal preparations containing antigens or antibodies raising an immune response against a target which is not the antigen used for immunisation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/15—Corynebacterium
    • C12R2001/16—Corynebacterium diphtheriae

Definitions

  • the invention relates to medical biotechnology, in particular to the production of bacterial preparations, and can be used for the treatment and prevention of tuberculosis in humans and animals.
  • Tuberculosis remains one of the most common and dangerous infectious diseases, despite the fact that up to 85% of the world's children are vaccinated against BC with the BCG vaccine and therapeutic chemotherapy is constantly being improved [12, 3].
  • Tuberculosis is a chronic infectious disease that most often affects the lungs.
  • the main pathogenetic link of tuberculosis is a granulomatous change in the structure of the tissue around the foci of infection.
  • the process of formation of tuberculous granuloma begins with the penetration of M. tuberculosis in the composition of fine aerosols into the alveoli, where they are absorbed by resident macrophages.
  • Tuberculosis determines the further development of the tuberculosis process. Tuberculosis is considered a classic intramacrophagous infection [2, 5]. With a high level of nonspecific resistance, tuberculous bacteria that enter macrophage lysosomes are actively destroyed, and antigens released at the same time
  • M tuberculosis induces macrophages to further stimulate inflammatory reactions, mainly of a non-specific nature. Preimmune granuloma is formed, the infection process breaks off [2].
  • M. tuberculosis With a weak potency of immunity, the leading role in the development of the infectious process belongs to M. tuberculosis.
  • the cell walls of M. tuberculosis contain a huge number of various lipids, which are not only part of the surface
  • lipopeptide-polysaccharide composition of M. tuberculosis cell walls allows them to banefully affect lysosomes during intramacrophagous stay, inhibiting their formation or
  • M. tuberculosis of such macrophage behavior allows them to escape from acute inflammation, enhancing the effector resources of granulomas.
  • Delay in the inflammatory process contributes to the reproduction of M. tuberculosis and thereby contributes to the development of the infectious process.
  • Pre-immune granuloma in people with low levels of immunity does not stop tuberculosis infection. Further events are closely associated with specific inflammation, which is based on the formation of an immune granuloma and an allergic reaction
  • TB protection is determined by the presence of a high level of nonspecific and / or specific immunity.
  • the standard WHO treatment regimen recommended by WHO is a six-month daily
  • composition comprising a carrier and purified
  • mycobacteria producing mycolic acids are used.
  • composition includes the individual components of the lipids of the cell wall of mycobacteria - mycolic acids or their mixture, isolated chemically. Since the selected substance has
  • composition of purified mycolic acids isolated from M. tuberculesis H37Rv has immunoregulatory and immunogenic properties and can be used for
  • a bacterial preparation for the prevention and treatment of tuberculosis in humans and animals and a method for its manufacture are provided.
  • the aim of the invention is to obtain a safe
  • probiotic strains of corynebacteria identical in chemical composition and antigenic properties to the components of the cell walls of mycobacteria.
  • the resulting preparation is harmless, effective for creating both non-specific and specific anti-tuberculosis immunity.
  • the claimed invention relates to a bacterial preparation for the prevention and treatment of tuberculosis, non-toxic and capable of inducing non-specific and specific
  • corynebacteria and mycobacteria corynebacteria and mycobacteria. It was shown that arabinomannan and arabinogalactan of the cell walls of corynebacteria and mycobacteria are responsible for cross-serological reactions [6, 7].
  • corpuscular antigens of the cell walls of corynebacteria in contrast to corpuscular antigens
  • Mycobacterium tuberculosis is harmless, non-toxic.
  • the aim of the invention is the preparation of the drug
  • corynebacteria identical in chemical composition and antigenic properties to the components of the cell walls of mycobacteria, for
  • This goal is mainly achieved due to the fact that for the preparation of the preparation of antigens of cell walls (lipopeptidopolysaccharides), symbiotic probiotic strains of corynebacteria with antigenic affinity with
  • the present invention relates to a method for producing a probiotic preparation of corpuscular antigens of Corynebacterium lipopeptidopolysaccharide nature for the prevention and treatment of tuberculosis, in which:
  • step (f) purifying the disintegrate obtained in step (e) from whole cells by centrifugation with acceleration sufficient to precipitate whole cells
  • step (e) the supernatant obtained in step (f) is centrifuged at an acceleration sufficient to precipitate corpuscular antigens of the cell walls,
  • step (h) the precipitate obtained in step (e) is resuspended, disintegrated, diluted, sterilized and dried.
  • step (b) cell deposition in step (b) is carried out by centrifugation.
  • step (d) said precipitate in step (d) is suspended in a solution of sodium chloride.
  • said liquid culture medium comprises a casein hydrolyzate.
  • the cells in step (e) are disintegrated at a temperature of 25 nZO "C for 15 minutes at a frequency of 20 kilohertz and an amplitude of 14 ⁇ m.
  • centrifugation in step (f) is performed at an acceleration of 5000 d.
  • step (e) centrifugation in step (e) is carried out at 14,000 d in
  • the precipitate in step (h) is disintegrated at a temperature of 25 ° C for 5 minutes at a frequency of 20 kilohertz and an amplitude of 14 micrometers.
  • drying is carried out by lyophilization.
  • the present invention relates to a probiotic bacterial preparation for the prevention and treatment of tuberculosis, containing corpuscular antigens
  • the present invention relates to a symbiotic strain of Corynebacteriura diphtheriae tox " ⁇ ⁇ 5047, deposited in the State collection of microorganisms of normal microflora Federal State Budgetary Institution" GNII Gabrichevsky Rospotrebnadzor "to obtain a drug for the prevention and treatment of tuberculosis.
  • the invention is intended for the manufacture of dosage forms for parenteral administration or for the manufacture of dosage forms in the form of a spray for topical application of the oropharynx.
  • Figure 1 shows the direct (I) and IgG mediated (II) reactivity of human neutrophils to the corpuscular antigens of probiotic corynebacteria.
  • the abscissa shows the corpuscular antigens (in mg / ml), the abscissa shows the number of stimulated neutrophils (in%).
  • FIG. Figure 2 shows the effect of the opsonizing concentration of IgG on the reactivity of human neutrophils to the corpuscular antigens of probiotic corynebacteria.
  • concentration of IgG mg / ml
  • the number of stimulated neutrophils % -
  • probiotic strain of corynebacteria ⁇ '2, GISK them probiotic strain of corynebacteria ⁇ '2, GISK them.
  • the biomass is grown for 16-18 hours on a dense nutrient medium of known composition (for example, a fish hydrolyzate with the addition of cattle serum) at a temperature of 37 ° C. Then the culture is washed off with a liquid nutrient medium of a known composition based on casein hydrolyzate.
  • a dense nutrient medium of known composition for example, a fish hydrolyzate with the addition of cattle serum
  • Microbial cells are pelleted by centrifugation at 5000 d for 20 minutes and washed three times with sodium chloride solution at
  • centrifugation in a mode of at least 5000 d for 20 minutes.
  • Corynebacteria are weighed, suspended in a buffered sodium chloride solution (pH 7.2) to a cell concentration of 5%. Then
  • a suspension of whole cells is disintegrated on an ultrasonic unit for 20 minutes at a frequency of 20 KHz and an amplitude of 14 ⁇ m, when cooled with ice or water to 25-30 ° C. Then suspension
  • the disintegrate is centrifuged at 5000 d for 20 minutes to separate undamaged cells and their fragments from the cell walls.
  • the precipitate was removed, the supernatant was centrifuged at 14000 d for 20 minutes.
  • the precipitate was resuspended in sodium chloride solution and centrifuged again at 14000 d for 20 minutes.
  • Washed corpuscular antigens are resuspended in a solution of ⁇ -glycine stabilizer (15 mg in 1 ml) and re-disintegrated in the same mode.
  • the concentration of the biologically active lipopeptide polysaccharide is determined by the content of pentoses and hexoses. Then the preparation is diluted to the required concentration (250 + 25 ⁇ g), sterilized at a temperature of 100 ° C and freeze-dried for use in an injectable or spray form.
  • the amount of active principle in 1 dose of the final drug depends on the dosage form and age of the person or
  • mice are subcutaneously immunized with corpuscular antigens of symbiotic corynebacterial strains at a dose of 200 mcg. Two weeks later, a live culture of diphtheria pathogens (C. diptheriae tox + ) is introduced into the abdominal cavity of the experimental animals. Efficiency
  • phagocytosis is evaluated in a peritonial test according to I.F. Zdrodovsky. A sample is taken 3 hours after infection. The main indicators of the effectiveness of phagocytosis were: the number of free cells
  • the table shows that 3 hours after infection
  • phagocytic cells of control animals are concentrated in the infection site, the number of free bacteria of C. diptheriae tox + reaches 300, they continue to multiply, phagocytic cells account for 57.9%. Destruction of bacterial cells within macrophages does not occur. In mice immunized with corpuscular antigens
  • Macrophages are giant cells with a well differentiated nucleus, cytoplasm, and a large number of free lysosomes.
  • neutrophils in conjunction with macrophages is to destroy whole cells of microorganisms and process
  • neutrophils and macrophages are a pre-phase of creation
  • Neutrophil activation in a direct (without IgG opsonization) reaction of interaction with Corynebacteriae cell wall antigens indicates the functionality of Corynebacteriae cell wall antigens in the activation of phagocytic cells (Fig. 1, 2).
  • the activation of neutrophils by corpuscular antigens of symbiont corynebacteria leads to an increase in nonspecific resistance of the microorganism.
  • FIG. 1 shows direct (I) and IgG mediated (II) reactivity of human neutrophils to antigens of the cell wall Corynebacteriae.
  • FIG. Figure 2 shows the effect of the opsonizing concentration of IgG on the reactivity of human neutrophils to the corpuscular antigens of probiotic corynebacteria.
  • the control group includes animals,
  • mice of both experimental groups and the mice of the control group are injected with a virulent strain of the causative agent of tuberculosis in doses of 10-3, 10-5, 10-6 microbial cells.
  • Table 2 presents data on the effect of the drug on the resistance of outbred white mice on infection with their virulent strain of the causative agent of tuberculosis.
  • the drug is a corpuscular antigens (lipopeptidopolysaccharides) of the cell walls of symbiotic probiotic corynebacteria, identical in chemical composition and antigenic properties to the components of the cell walls of mycobacteria, which ensures its non-toxicity,
  • Tuberculosis protection is carried out by creating intense nonspecific and specific immunity.
  • the drug is suitable for use in various dosage forms for the prevention and treatment of tuberculosis in humans and animals.
  • Patent EP 09771733 Al 13 Patent US 6643301

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Abstract

Предложен симбионтный пробиотический бактериальный препарат для профилактики и лечения туберкулеза у людей и животных и способ его приготовления. Для изготовления препарата используют штамм Corynebacterium diphtheriae tox- №5047, депонированный в Государственной коллекции микроорганизмов нормальной микрофлоры ФБУН «МНИИЭМ им. Г.Н.Габричевского Роспотребнадзора». Полученный препарат безвреден, эффективен для создания как неспецифического так и специфического противотуберкулезного иммунитета.

Description

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРОБИОТИЧЕСКОГО ПРЕПАРАТА КОРПУСКУЛЯРНЫХ АНТИГЕНОВ КОРИНЕБАКТЕРИЙ, ПРОБИОТИЧЕСКИЙ БАКТЕРИАЛЬНЫЙ ПРЕПАРАТ ДЛЯ ПРОФИЛАКТИКИ И ЛЕЧЕНИЯ ТУБЕРКУЛЕЗА И СИМБИОНТНЫЙ ШТАММ
ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ
Изобретение относится к медицинской биотехнологии, в частности к производству бактериальных препаратов, и может быть использовано для лечения и профилактики туберкулёза у людей и животных .
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Туберкулёз остается одним из самых распространенных и опасных инфекционных заболеваний, несмотря на то, что до 85 % детей планеты вакцинированы против туберкулеза вакциной БЦЖ и постоянно совершенствуются терапевтические химиопрепараты [12, 3] .
Одной из причин недостаточной эффективности борьбы с туберкулёзом является недостаточная эффективность вакцины БЦЖ на фоне постоянного роста числа лиц с пониженным иммунитетом.
Другой причиной является рост числа штаммов М . tuberculosis, обладающих множественной лекарственной устойчивостью к
применяемым химиопрепаратам и отсутствие этиотропных
иммунопрепаратов .
Туберкулёз - хроническое инфекционное заболевание, наиболее часто поражающее лёгкие. Основным патогенетическим звеном туберкулёза является грануломатозное изменение структуры ткани вокруг очагов инфекции. Процесс формирования туберкулёзной гранулемы начинается с проникновения М. tuberculosis в составе мелкодисперсных аэрозолей в альвеолы, где они поглощаются резидентными макрофагами. Взаимоотношение микобактерий с
макрофагами определяет дальнейшее развитие туберкулезного процесса. Туберкулёз считается классической внутримакрофагальной инфекцией [2, 5] . При высоком уровне неспецифической резистентности туберкулезные бактерии, попавшие в макрофагальные лизосомы, активно уничтожаются, высвободившиеся при этом антигены
М . tuberculosis побуждают макрофаги к дальнейшей стимуляции воспалительных реакций, в основном неспецифического характера. Образуется доиммунная гранулема, инфекционный процесс обрывается [2] .
При слабой потенции иммунитета ведущая роль в развитии инфекционного процесса принадлежит М. tuberculosis . Клеточные стенки М. tuberculosis содержат огромное количество разнообразных липидов, которые входят не только в состав поверхностной
мембраны, но и пронизывают весь сложный регидный каркас
пептидогликана и арабиногалактана [6, 7] . Уникальный
липопептидополисахаридный состав клеточных стенок М. tuberculosis позволяет им во время внутримакрофагального пребывания гибельно воздействовать на лизосомы, подавляя их образование или
превращая в комфортную для себя зону. Замедленный процесс роста, длительное пребывание М. tuberculosis в лизосомах,
беспрепятственный выход в цитоплазму, устойчивость к
антимикробным факторам или их инактивация ослабляют
чувствительность макрофагов к активирующим сигналам лимфоцитов, снижают их антигенпредставляющую функцию и уменьшают реакцию цитотоксических лимфоцитов. Инициирование М . tuberculosis такого поведения макрофагов дает им возможность ускользать от острого воспаления, усиливая эффекторные ресурсы гранулемы. Задержка воспалительного процесса способствует размножению М . tuberculosis и тем самым способствует развитию инфекционного процесса.
Доиммунная гранулема у людей с низким уровнем иммунитета не останавливает туберкулезную инфекцию. Дальнейшие события тесно связаны со специфическим воспалением, в основе которого лежит образование иммунной гранулемы и аллергическая реакция
макроорганизма на антигены М. tuberculosis [1, 2, 8]. Таким образом, противотуберкулезная защита определяется наличием высокого уровня неспецифического и/или специфического иммунитета .
В настоящее время для лечения туберкулеза используют различные химиопрепараты и антибиотики - тубазид, салюзид, метазид, изониазид, фтивазид, этамбутол, ' рифампицин,
пиразинамид, стрептомицин и многие другие соединения.
Стандартная схема лечения обычного туберкулеза, рекомендованная ВОЗ (схема DOTS) заключается в шестимесячном ежедневном
применении стандартного набора лекарств (рифампицин, изониазид, паразинамид, этамбутол, стрептомицин) . Однако туберкулез
продолжает оставаться актуальнейшей социальной проблемой.
Известны попытки использовать в качестве дополнительных средств лечения туберкулеза различных биологически активных соединений, например, прополисного масла [9].
Бактериальные пробиотические препараты для лечения и
профилактики туберкулеза неизвестны.
Известна композиция, включающая носитель и очищенный
компонент липидов клеточной стенки микобактерий, предлагаемая для профилактики и лечения туберкулёза и для повышения
неспецифической резистентности при различных аутоиммунных
состояниях [11-18] .
При этом в качестве очищенного компонента липидов клеточной стенки предлагают использовать миколовые кислоты, обладающие биологической активностью. В качестве носителя возможно
использование фармакологически подходящего носителя или
адъюванта, в частности масло Marcol 52 или парообразную
жидкость .
Для получения очищенного компонента липидов клеточной стенки используют микобактерий, продуцирующие миколовые кислоты.
Возможно также использование Corynebacteriae, Nocardia и
Rodococcus .
Композиция включает отдельные компоненты липидов клеточной стенки микобактерий - миколовые кислоты или их смесь, выделенные химическим путем. Так как выделенная субстанция обладает
токсичностью, её подвергают дополнительной очистке.
Результаты испытания миколовых кислот на животных
подтверждают гипотезу авторов, что миколовые кислоты являются иммуногенами, способными индуцировать продукцию антител к
миколовым кислотам. Результаты испытания композиции на людях, больных туберкулезом свидетельствуют о том, что миколовые
кислоты у больных способны вызывать выработку антимиколовых антител. Однако антитела были обнаружены всего у 2 из 58 больных туберкулезом. Антитела являются специфическими.
Авторы заключают, что композиция очищенных миколовых кислот, выделенных из М. tuberculesis H37Rv, обладает иммунорегуляторными и иммуногенными свойствами и может быть использована для
профилактики и/или терапии болезней, особенно связанных с
микобактериями .
Сведений о практическом использовании вышеуказанных составов для лечения и профилактики туберкулеза нет.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
В соответсствии с настоящим изобретением предлагается бактериальный препарат для профилактики и лечения туберкулёза у людей и животных и способ его изготовления.
Целью изобретения является получение безопасного и
эффективного препарата для профилактики и лечения туберкулеза у людей и животных на основе симбионтных пробиотических бактерий.
Поставленная цель достигается тем, что для приготовления препарата используют корпускулярные антигены
(липопептидополисахаридов) клеточных стенок симбионтных
пробиотических штаммов коринебактерий идентичные по химическому составу и антигенным свойствам компонентам клеточных стенок микобактерий .
В качестве симбионтного пробиотического штамма используют штамм Corynebacterium diphtheriae tox" Ν' 5047, депонированный в Государственной коллекции микроорганизмов нормальной микрофлоры ФБУН «МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора» .
Полученный препарат безвреден, эффективен для создания как неспецифического так и специфического противотуберкулезного иммунитета .
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Заявляемое изобретение касается бактериального препарата для профилактики и лечения туберкулеза, не обладающего токсичностью и способного индуцировать неспецифический и специфический
противотуберкулезный иммунитет и способа его получения.
Известно, что возбудитель туберкулеза М . tuberculosis
относится к роду Mycobacterium семейства Mycobacteriaceae, которые входят в порядок Actinomycetales . К этому порядку
принадлежит и род Corynebacterium. Их объединяют общие
морфологические, физиологические, генотипические признаки, общая ультраструктура и химический состав клеточных клеток, которые отличаются от других прокариот.
Общность химической структуры основного компонента клеточных стенок Corynebacteriae и Mycobacteriae пептидогликана является наиболее надежным доказательством родственных связей между ними [6, 7] .
Близкое родство коринебактерий и микобактерий, идентичность антигенов их клеточных стенок подтверждена иммунологическим
(серологическим) ответом на их антигены. Серологическими методами (агглютинацией, преципитацией, электроиммунофорезом) выявлено наличие гомологичных антигенов в поверхностных структурах
коринебактерий и микобактерий. Показано, что арабиноманнан и арабиногалактан клеточных стенок коринебактерий и микобактерий ответственны за перекрестные серологические реакции [6, 7].
Вместе с тем, корпускулярные антигены клеточных стенок коринебактерий в отличие от корпускулярных антигенов
микобактерий туберкулеза безвредны, нетоксичны. Целью изобретения является приготовление препарата
корпускулярных антигенов (липопептидополисахаридов)
коринебактерий, идентичных по химическому составу и антигенным свойствам компонентам клеточных стенок микобактерий, для
получения безопасного и эффективного препарата для профилактики и лечения туберкулёза у человека и животных.
Поставленная цель главным образом достигается благодаря тому, что для приготовления препарата антигенов клеточных стенок (липопептидополисахаридов) используют симбионтные пробиотические штаммы коринебактерий, обладающие антигенным родством с
возбудителями туберкулёза.
В своем первом аспекте настоящее изобретение относится к способу получения пробиотического препарата корпускулярных антигенов коринебактерий липопепдидополисахаридной природы для профилактики и лечения туберкулеза, в котором:
(a) наращивают биомассу симбионтного штамма
Corynebacterium diphtheriae tox" Ν' 5047, депонированного в
Государственной коллекции микроорганизмов нормальной микрофлоры ФБУН « НИИЭМ им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора» в жидкой питательной среде,
(b) осаждают клетки, полученные на этапе (а) ,
(c) промывают осадок, полученный на этапе (Ь) ,
(d) суспендируют клетки из промытого осадка, полученного на этапе (с) ,
(e) дезинтегрируют клетки в суспензии, полученной на этапе
(d) ,
(f) очищают дезинтеграт, полученный на этапе (е) , от целых клеток посредством центрифугирования при ускорении, достаточном для осаждения целых клеток,
(д) надосадок, полученный на этапе (f) , центрифугируют при ускорении, достаточном для осаждения корпускулярных антигенов клеточных стенок,
(h) осадок, полученный на этапе (д) , ресуспендируют, дезинтегрируют, разбавляют, стерилзуют и высушивают. В одном из предпочтительных вариантов осуществления
осаждение клеток на этапе (Ь) осуществляют центрифугированием.
В еще одном предпочтительном варианте осуществления
упомянутый осадок на этапе (d) суспендируют в растворе хлорида натрия .
В другом предпочтительном варианте осуществления упомянутая жидкая питательная среда содержит гидролизат казеина.
В одном из предпочтительных вариантов осуществления клетки на этапе (е) дезинтегрируют при температуре 25-нЗО "С в течение 15 мин при частоте 20 килогерц и амплитуде 14 мкм.
В еще одном из предпочтительных вариантов осуществления центрифугирование на этапе (f) осуществляют при ускорении 5000 д.
В другом предпочтительном варианте существления
центрифугирование на этапе (д) осуществляют при 14000 д в
течение 20 мин.
В одном из предпочтительных вариантов осуществленя осадок на этапе (h) дезинтегрируют при температуре 25- ЗО °С в течение 5 минут при частоте 20 килогерц и амплитуде 14 микрометров.
В еще одном из предпочтительных вариантов осуществления дезинтеграт клеточных стенок, полученный на этапе (h) ,
разбавляют до концентрации 225-^275 микрограм/милилитр .
В другом предпочтительном варианнте осуществления
высушивание осуществляют посредством лиофилизации .
В своем втором аспекте настоящее изобретение относится к пробиотическому бактериальному препарату для профилактики и лечения туберкулеза, содержащий корпускулярные антигены
коринебактерий липопептидополисахаридной природы, полученной в соответствии с любым из вышеописанных способов.
В своем третьем аспекте настоящее изобретение относится к симбионтному штамму Corynebacteriura diphtheriae tox" Ν· 5047, депонированный в Государственной коллекции микроорганизмов нормальной микрофлоры ФБУН «МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора» для получения препарата для профилактики и лечения туберкулеза.
Препараты, полученные в соответствии с настоящим
изобретением предназначены для изготовления лекарственных форм для парентерального введения или для изготовления лекарственных форм в виде спрея для местной аппликации ротоглотки.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ФИГУР
На фиг.1 показана прямая (I) и IgG опосредованная (II) реактивность нейтрофилов человека к корпускулярным антигенам пробиотических коринебактерий . По оси абсцисс - корпускулярные антигены (в мг/мл) , по оси абсцисс - количество стимулированных нейтрофилов (в %) .
На фиг. 2 показано влияние опсонизирующей концентрации IgG на реактивность нейтрофилов человека к корпускулярным антигенам пробиотических коринебактерий. По оси абсцисс - концентрация IgG (мг/мл) , по оси ординат - количество стимулированных нейтрофилов ( %) -
ОСУЩЕСТВЛЕНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ ПРИМЕР 1
ПОЛУЧЕНИЕ БИОМАССЫ
Для приготовления препарата используют симбионтный
пробиотический штамм коринебактерий Ν' 2, ГИСК им.
Л .А. Тарасевича . Биомассу наращивают в течение 16-18 часов на плотной питательной среде известного состава (например, рыбный гидролизат с добавлением сыворотки крупного рогатого скота) при температуре 37 "С. Затем культуру смывают жидкой питательной средой известного состава на основе гидролизата казеина.
Культивируют в течение 5 часов при 37 °С. Затем вносят в
ферментер с той же питательной средой и проводят в течение 16-18 часов выращивание биомассы при постоянном аэрировании при 37 °С. Микробные клетки осаждают центрифугированием при 5000д в течение 20 минут и трижды промывают раствором хлорида натрия при
центрифугировании в режиме не менее 5000д в течение 20 минут.
ПРИМЕР 2
ПОЛУЧЕНИЕ ПРЕПАРАТА КОРПУСКУЛЯРНЫХ АНТИГЕНОВ
(ЛИПОПЕПТИДОПОЛИСАХАРИДОВ) КОРИНЕБАКТЕРИИ
Полученный по примеру 1 влажный осадок целых клеток
коринебактерий взвешивают, суспендируют в забуференном растворе хлорида натрия (рН 7.2) до концентрации клеток 5%. Затем
суспензию целых клеток дезинтегрируют на ультразвуковой установке в течение 20 минут при частоте 20 КГц и амплитуде 14 мкм, при охлаждении льдом или водой до 25-30 °С. Затем суспензию
дезинтеграта центрифугируют при 5000д в течение 20 минут с целью отделения неразрушенных клеток и их фрагментов от клеточных стенок. Осадок удаляют, надосадочную жидкость центрифугируют при 14000д в течение 20 минут. Осадок ресуспендируют в растворе хлорида натрия и снова центрифугируют при 14000д в течение 20 минут. Отмывание корпускулярных антигенов клеточных стенок от примесей цитоплазмы и питательной среды повторяют 3 раза. Отмытые корпускулярные антигены ресуспендируют в растворе стабилизатора -глицина (15 мг в 1 мл) и повторно дизинтегрируют в том же режиме .
В полученном препарате определяют концентрацию биологически активного липопептидополисахарида по содержанию пентоз и гексоз. Затем 'препарат разводят до необходимой концентрации (250+25 мкг) , подвергают стерилизации при температуре 100°С и лиофильно высушивают для использования в инъекционной форме или форме спрея .
Количество активного начала в 1 дозе конечного препарата зависит от лекарственной формы и возраста человека или
ивотного .
Примеры, подтверждающие эффективность препарата
корпускулярных антигенов симбионтных коринебактерий для создания неспецифического и специфического противотуберкулезного иммунитета, приведены ниже.
ПРИМЕР 3
АКТИВНОСТЬ ФАГОЦИТИРУЮЩИХ КЛЕТОК ПЕРИТОНИАЛЬНОГО ЭКССУДАТА МЫШЕЙ, ИММУНИЗИРОВАННЫХ ПРЕПАРАТОМ КОРПУСКУЛЯРНЫХ АНТИГЕНОВ
КЛЕТОЧНОЙ СТЕНКИ CORY EBACTERIAE
Мышей подкожно иммунизируют корпускулярными антигенами симбионтных штаммов коринебактерий в дозе 200 мкг. Через две недели опытным животным в брюшную полость вводят живую культуру возбудителей дифтерии (С . diptheriae tox+) . Эффективность
фагоцитоза оценивают в перитониальной пробе по И.Ф. Здродовскому. Пробу берут через 3 часа после заражения. Основными показателями эффективности фагоцитоза были: количество свободных клеток
С. diptheriae tox+, процент фагоцитирующих клеток в пробе
перитонеального экссудата (в 30 полях зрения) , а также
завершенность фагоцитоза.
Результаты исследования приведены в таблице 1.
ТАБЛИЦА 1
Figure imgf000012_0001
Из таблицы видно, что через 3 часа после заражения
фагоцитирующие клетки контрольных животных концентрируются в очаге заражении, количество свободных бактерий С. diptheriae tox+ достигает 300, они продолжают размножаться, фагоцитирующие клетки составляют 57,9%. Разрушения бактериальных клеток внутри макрофагов не происходит. У мышей, иммунизированных корпускулярными антигенами
клеточных стенок симбионтных C.diptheriae, выявлена повышенная активность фагоцитирующих клеток, процент макрофагов,
завершающих фагоцитоз, составляет всего 11,8%, что
подтверждается полным отсутствием свободных клеток C.diptheriae tox+ в пробе экссудата. Макрофаги представляют собой гигантские клетки с хорошо дифференцированным ядром, цитоплазмой, большим количеством свободных лизосом.
Таким образом, после иммунизации животных корпускулярными антигенами симбионтных C.diptheriae в зоне контакта «иммунных» макрофагов с C.diptheriae tox+, они быстро активизируются, адсорбируют, поглощают и утилизируют токсичные C.diptheriae tox+.
ПРИМЕР 4
ПОВЫШЕНИЕ АКТИВНОСТИ НЕИТРОФИЛОВ ПОД ВЛИЯНИЕМ КОРПУСКУЛЯРНЫХ АНТИГЕНОВ СИМБИОНТНЫХ КОРИНЕБАКТЕРИЙ
Роль нейтрофилов совместно с макрофагами заключается в разрушении целых клеток микроорганизмов и переработке
бактериальных антигенов в форму, пригодную для восприятия их иммунокомпетентными клетками. Неспецифические реакции
нейтрофилов и макрофагов являются предфазой создания
специфического иммунитета.
В тесте НСТ показана активация кислородзависимого
метаболизма нейтрофилов под влиянием корпускулярных антигенов клеточных стенок симбионтных Corynebacteriae . Антигены активно взаимодействуют с нейтрофилами человека, подвергаясь опсонизации нормальными антителами человека IgG-изотипа (антитела выделены из сыворотки здоровых людей) .
Активация нейтрофилов в прямой (без опсонизации IgG) реакции взаимодействия с антигенами клеточных стенок Corynebacteriae свидетельствует о функциональных возможностях антигенов клеточных стенок Corynebacteriae в активации фагоцитирующих клеток, (рис 1, 2) . Таким образом, активация нейтрофилов корпускулярными антигенами симбионтных коринебактерии приводит к повышению неспецифической резистентности микроорганизма.
На фиг. 1 показана прямая (I) и IgG опосредованная (II) реактивность нейтрофилов человека к антигенам клеточных стенок Corynebacteriae .
На фиг. 2 показано влияние опсонизирующей концентрации IgG на реактивность нейтрофилов человека к корпускулярным антигенам пробиотических коринебактерий .
ПРИМЕР 5
ПРОТЕКТИВНЫЕ СВОЙСТВА КОРПУСКУЛЯРНЫХ АНТИГЕНОВ СИМБИОНТНЫХ
КОРИНЕБАКТЕРИЙ
Две группы беспородных белых мышей иммунизируют
корпускулярными антигенами симбионтных коринебактерий в дозах 200мкг и 400 мкг. В контрольную группу входят животные,
иммунизированные вакциной БЦЖ. Через 48 суток мышам обеих опытных групп и мышам контрольной группы вводят вирулентный штамм возбудителя туберкулёза в дозах 10-3, 10-5, 10-6 микробных клеток. В таблице 2 представлены данные по влиянию препарата на устойчивость беспородных белых мышей на заражение их вирулентным штаммом возбудителя туберкулёза .
Как видно, препарат корпускулярных антигенов клеточных стенок (липопептидополисахаридов) пробиотических коринебактерий повышает резистентность мышей к туберкулезной инфекции. Это проявляется в выживаемости животных при заражении их вирулентным штаммом М . tuberculosis .
ТАБЛИЦА 2
ВЫЖИВАЕМОСТЬ МЫШЕЙ, ИММУНИЗИРОВАННЫХ КОРПУСКУЛЯРНЫМИ АНТИГЕНАМИ СИМБИОНТНЫХ КОРИНЕБАКТЕРИЙ, ПРИ ЗАРАЖЕНИИ ВОЗБУДИТЕЛЕМ
ТУБЕРКУЛЕЗА
Figure imgf000014_0001
Figure imgf000015_0001
Контроль 40 35 10
Таким образом, впервые предложен бактериальный препарат для профилактики и лечения туберкулёза, направленный на повышение неспецифической резистентности, конкретно на активацию
макрофагального звена клеточного иммунитета, а также на
формирование специфического иммунитета. Препарат представляет собой корпускулярные антигены (липопептидополисахариды) клеточных стенок симбионтных пробиотических коринебактерий, идентичные по химическому составу и антигенным свойствам компонентам клеточных стенок микобактерий, что обеспечивает его нетоксичность,
безопасность и эффективность . Противотуберкулезная защита осуществляется за счет создания напряженного неспецифического и специфического иммунитета. Способ получения препарата
технологичен, безвреден. Препарат пригоден для использования в различных лекарственных формах для профилактики и лечения туберкулеза у людей и животных.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Апт А. С, Кондратьева Т.К. Туберкулёз: патогенез, иммунный ответ и генетика хозяина. Молекулярная биология, 2008, т. 42, N'5, с. 880-890.
2. Маянский А.Н. Туберкулёз (микробиологические и иммунологические аспекты). Иммунология, 2001, N'2, с. 53-63.
3. Dolin, PJ, МС Raviglione and A Koch, 1994. Global tuberculosis incidence and mortality during 1990-2000. Bulletin of the World Health Organization, 72, (2), 213-230.
4. Fine, РЕМ. 1994. Immunities in and to tuberculosis'4 Implications for pathogenesis and vaccination. In: Tuberculosis Back to the Future, London School of Hygiene & Tropical
Medicine. Third Annual Public Health Forum$ Editors: J.D.H.
Porter and K.P.J. mcAdam. Publishers John Wiley & Sons,
Chichester, New York, Brisbone, Toronto, Singapore, Chpt. 1, pp 13-33.
5. McDonough, KA, Y Kress BR and Bloom. 1993.
Pathogenesis of tuberculosis: interaction of Mycobacterium tuberculosis with macrophages. Infect Immunol, 61, 1763-1773.
6. Нестеренко О. ., Квасников Е.И., Ногина T.M.
Нокардиоподобные и коринеподобные бактерии . -1998. Киев. Изд. «Наукова думка», с. 334.
7. Cummins С. Chemical and antigenic studies on cell walls of Mycobacteriae, Corynebacteriae and Nocardia// Am. Rev. Resp. Dis. -1965. V.92. P.63-72.
8. Fenton, MJ and MV Vermuelen. 1996. Immunopathology of Tuberculosis. Roles of Macrophages and MONOCYTES. Minireview, Infect Immun, 64, 683-689.
9. Заявка РФ Ν· 98105041
10. Bergey, S. Manual of Determinative Bacteriology-9,
1994.
11. Патент WO/1998/039025A
12. Патент AU 6631298 A
12. Патент ЕР 09771733 Al 13. Патент US 6643301
14. Патент US 7122577
15. Патент US 2002082296 Al
16. Патент DE 69839782 Dl
17. Патент US 2002082296 Al

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Способ получения пробиотического препарата
корпускулярных антигенов коринебактерий
липопепдидополисахаридной природы для профилактики и лечения туберкулеза, в котором:
(a) наращивают биомассу симбионтного штамма
Corynebacterium diphtheriae tox" N« 5047, депонированного в
Государственной коллекции микроорганизмов нормальной микрофлоры ФБУН « НИИЭМ им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора» в жидкой питательной среде,
(b) осаждают клетки, полученные на этапе (а) ,
(c) промывают осадок, полученный на этапе (Ь) ,
(d) суспендируют клетки из промытого осадка, полученного на этапе (с) ,
(e) дезинтегрируют клетки в суспензии, . полученной на этапе
(d) ,
(f) очищают дезинтеграт, полученный на этапе (е) , от целых клеток посредством центрифугирования при ускорении, достаточном для осаждения целых клеток,
(д) надосадок, полученный на этапе (f) , центрифугируют при ускорении, достаточном для осаждения корпускулярных антигенов клеточных стенок,
(h) осадок, полученный на этапе (д) , ресуспендируют, дезинтегрируют, разбавляют, стерилзуют и высушивают.
2. Способ по п.1, в котором осаждение клеток на этапе (Ь) осуществляют центрифугированием.
3. Способ по любому из пп.1 или 2, в котором упомянутый осадок на этапе (d) суспендируют в растворе хлорида натрия.
4. Способ по любому из пп.1-3, в котором упомянутая жидкая питательная среда содержит гидролизат казеина.
5. Способ по любому из пп.1-4, в котором клетки на этапе
(e) дезинтегрируют при температуре 25+30 "С в течение 15 мин при частоте 20 килогерц и амплитуде 14 мкм.
6. Способ по любому из пп.1-5, в котором
центрифугирование на этапе (f) осуществляют при ускорении 5000 д.
7. Способ по любому из пп.1-6, в котором
центрифугирование на этапе (д) осуществляют при 14000 д в течение 20 мин.
8. Способ по любому из пп.1-7, в котором осадок на этапе (h) дезинтегрируют при температуре 25-^30 "С в течение 5 минут при частоте 20 килогерц и амплитуде 14 микрометров.
9. Способ по любому из пп.1-8, в котором дезинтеграт клеточных стенок, полученный на этапе (h) , разбавляют до
концентрации 225-^275 микрограм/милилитр .
10. Способ по любому из пп.1-9, в котором высушивание осуществляют посредством лиофилизации.
11. Пробиотический бактериальный препарат для профилактики и лечения туберкулеза, содержащий корпускулярные антигены коринебактерий липопептидополисахаридной природы, полученной способом по любому из пунктов 1-10.
12. Симбионтный штамм Corynebacterium diphtheriae tox" Ν' 5047, депонированный в Государственной коллекции микроорганизмов нормальной микрофлоры ФБУН «МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского
Роспотребнадзора» для получения препарата для профилактики и лечения туберкулеза.
PCT/RU2012/000950 2012-11-19 2012-11-19 Способ получения пробиотического препарата корпускулярных антигенов коринебактерий, пробиотический бактериальный препарат для профилактики и лечения туберкулеза и симбионтный штамм WO2014077723A1 (ru)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PCT/RU2012/000950 WO2014077723A1 (ru) 2012-11-19 2012-11-19 Способ получения пробиотического препарата корпускулярных антигенов коринебактерий, пробиотический бактериальный препарат для профилактики и лечения туберкулеза и симбионтный штамм

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PCT/RU2012/000950 WO2014077723A1 (ru) 2012-11-19 2012-11-19 Способ получения пробиотического препарата корпускулярных антигенов коринебактерий, пробиотический бактериальный препарат для профилактики и лечения туберкулеза и симбионтный штамм

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2014077723A1 true WO2014077723A1 (ru) 2014-05-22

Family

ID=50731514

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/RU2012/000950 WO2014077723A1 (ru) 2012-11-19 2012-11-19 Способ получения пробиотического препарата корпускулярных антигенов коринебактерий, пробиотический бактериальный препарат для профилактики и лечения туберкулеза и симбионтный штамм

Country Status (1)

Country Link
WO (1) WO2014077723A1 (ru)

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1998039025A2 (en) * 1997-03-03 1998-09-11 Adcock Ingram Limited A composition comprising a carrier and a purified mycobacterial lipid cell-wall component and its use in the prevention, treatment and diagnosis of disease
RU2230113C1 (ru) * 2002-11-12 2004-06-10 Шмелева Елена Александровна Способ получения пробиотического бактериального препарата, содержащего структурные компоненты микробной клетки

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1998039025A2 (en) * 1997-03-03 1998-09-11 Adcock Ingram Limited A composition comprising a carrier and a purified mycobacterial lipid cell-wall component and its use in the prevention, treatment and diagnosis of disease
RU2230113C1 (ru) * 2002-11-12 2004-06-10 Шмелева Елена Александровна Способ получения пробиотического бактериального препарата, содержащего структурные компоненты микробной клетки

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BORISOV L.B. ET AL.: "Meditsinskaya mikrobiologiya, virusologiya, immunologiya. M.", MEDITSINSKOE INFORMATSIONNOE AGENTSTVO, 2001, pages 274, 432 - 433 *
F. GERKHARDTA ET AL.: "MIR", METODY OBSCHEI BAKTERIOLOGII POD RED., 1983, pages 142 - 143 *

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Sakai et al. MAIT cell-directed therapy of Mycobacterium tuberculosis infection
Jenkin et al. In vitro studies on the interaction between mouse peritoneal macrophages and strains of Salmonella and Escherichia coli
JP2014512388A (ja) 免疫反応を増進するための組成物および方法
JP2000504032A (ja) 多価ｄｔｐポリオワクチン
Shim et al. Elicitation of Th1/Th2 related responses in mice by chitosan nanoparticles loaded with Brucella abortus malate dehydrogenase, outer membrane proteins 10 and 19
CN1602199B (zh) 用于治疗包含免疫失调的疾病的革兰氏阳性菌制剂
EP0016755A1 (en) Neisseria gonorrhoeae vaccine
JP4875494B2 (ja) 免疫調節物質
Newman et al. Separation of serum bactericidal and opsonizing activities for Haemophilus influenzae type b
Li et al. Immunological evaluation of a recombinant vaccine delivered with an analogous hyaluronic acid chitosan nanoparticle-hydrogel against Toxoplasma gondii in mice
Halder et al. Bacterial ghost cell based bivalent candidate vaccine against Salmonella Typhi and Salmonella Paratyphi A: A prophylactic study in BALB/c mice
Ali et al. Immunotherapeutic effect of chitosan and listeriolysin O on Listeria monocytogenes infection in mice
Mohammadi et al. Alum and metoclopramide synergistically enhance cellular and humoral immunity after immunization with heat-killed Salmonella typhimurium vaccine
JP2009520789A (ja) 子孫の免疫応答を調節するための母体投与のための全細菌細胞（放線菌目）の使用
WO2014077723A1 (ru) Способ получения пробиотического препарата корпускулярных антигенов коринебактерий, пробиотический бактериальный препарат для профилактики и лечения туберкулеза и симбионтный штамм
RU2468816C1 (ru) Пробиотический бактериальный препарат корпускулярных антигенов коринебактерий липопептидополисахаридной природы для профилактики и лечения туберкулеза, способ его получения
CN111558034B (zh) 一种捻转血矛线虫纳米材料亚单位疫苗及其应用
CA2273848C (en) Mycobacterium vaccae for down-regulation of the th2 activity of the immune system
Doft et al. Contrasting effects of BCG on spleen and lymph node antibody responses in nude and normal mice
Nile et al. Liposomal-lipopolysaccharide vaccine extracted from induces moderate TLR4 and CD14 production
RU2542377C1 (ru) Способ лечения коклюша у детей в возрасте до трех лет
Savina et al. The effect of synthetic adjuvant on the formation of the immune response
JPH08500846A (ja) 抗エイズ免疫調節剤複合体
Nile et al. Liposomal-lipopolysaccharide vaccine extracted from P. mirabilis induces moderate TLR4 and CD14 production
Bayed The Effect of Transfer Factor as Immunoprotective in Mice Challenged with Mycobacterium tuberculosis

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 12888227

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

32PN Ep: public notification in the ep bulletin as address of the adressee cannot be established

Free format text: NOTING OF LOSS OF RIGHTS PURSUANT TO RULE 112(1) EPC, FORM 1205A DATED 05-10-2015

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 12888227

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1