WO2014042167A1 - Ｅｂａｇ９に対するモノクローナル抗体、及びハイブリドーマ、並びにｅｂａｇ９に対するモノクローナル抗体の利用 - Google Patents

Ｅｂａｇ９に対するモノクローナル抗体、及びハイブリドーマ、並びにｅｂａｇ９に対するモノクローナル抗体の利用 Download PDF

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ebag9
cancer
monoclonal antibody
hybridoma
antibody
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井上　聡
和博 池田
暢広 伊地知
崇 重川
均 津田
利明 宮崎
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学校法人埼玉医科大学
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    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57407—Specifically defined cancers
    • G01N33/57415—Specifically defined cancers of breast
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    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
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    • A—HUMAN NECESSITIES
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
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    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/04—Antineoplastic agents specific for metastasis

Definitions

  • the present invention relates to a monoclonal antibody against EBAG9, a hybridoma producing the monoclonal antibody against EBAG9, a method for predicting endocrine therapy-resistant breast cancer using the monoclonal antibody against EBAG9, and a prediction of endocrine therapy-resistant breast cancer including the monoclonal antibody against EBAG9.
  • Diagnostic agent or kit tumor growth inhibitor containing monoclonal antibody against EBAG9, cancer metastasis inhibitor containing monoclonal antibody against EBAG9, and medicament containing at least one of the tumor growth inhibitor and cancer metastasis inhibitor About.
  • breast cancer is common among women over 40 years of age and is also increasing in Japan. Many breast cancers are estrogen receptor positive, and it is known that endocrine therapy using endocrine therapy drugs such as antiestrogens is effective. However, many breast cancers have acquired resistance (resistance) to endocrine therapy drugs in the course of treatment, which is problematic because of poor prognosis. Therefore, there is a need for a technique that enables early diagnosis of whether or not a breast cancer has acquired resistance to an endocrine therapy drug.
  • EBAG9 Estrogen receptor-binding fragment associated gene 9 was isolated as an estrogen-responsive gene, and later studies revealed that it is involved in glycosylation of cancer cells and in avoidance from the immune system.
  • EBAG9 is breast cancer, ovarian cancer, prostate cancer, liver cancer, kidney cancer, bladder cancer, testicular tumor, brain tumor, uterine cancer, thyroid cancer, gallbladder cancer, bile duct cancer, pancreatic cancer, colon cancer, stomach cancer, esophageal cancer, lung cancer, It has been reported in laryopharyngeal cancer, squamous cell carcinoma, malignant lymphoma, malignant mesothelioma, and Paget's disease, and is thought to be involved in cancer progression and metastasis.
  • a polyclonal antibody against EBAG9 has been prepared using the full length of EBAG9 as an immunogen, and analysis by immunostaining using the polyclonal antibody and a breast cancer sample has been performed (for example, non-patent literature). 1).
  • the analysis shows that the immunostaining of EBAG9 correlates with the estrogen receptor immunostaining as well as the reduced infiltration of CD3 positive T cells into the tumor tissue.
  • the relationship with the prognosis of breast cancer such as whether or not it acquires resistance to endocrine therapy drugs, has not been elucidated.
  • EBAG9 is breast cancer, ovarian cancer, prostate cancer, liver cancer, kidney cancer, bladder cancer, testicular tumor, brain tumor, uterine cancer, thyroid cancer, gallbladder cancer, bile duct cancer, pancreatic cancer, colon cancer, gastric cancer, esophagus.
  • lung cancer laryngeal cancer, squamous cell carcinoma, malignant lymphoma, malignant mesothelioma, and Paget's disease has been reported, it is thought that antibodies against EBAG9 can be effective in the prevention or treatment of cancer, No such antibody has yet been provided.
  • the present invention makes it a subject to solve the said conventional problems and to achieve the following objectives. That is, the present invention can be used for diagnosing whether or not a breast cancer has acquired resistance to an endocrine therapy drug, and can also suppress tumor growth and cancer metastasis, and a monoclonal antibody against EBAG9.
  • the present inventors can predict endocrine therapy-resistant breast cancer by using a monoclonal antibody against EBAG9 produced using a specific part of EBAG9 as an immunogen.
  • the present inventors have found that it is possible to suppress tumor growth or to suppress cancer metastasis, and have completed the present invention.
  • the present invention is based on the above findings by the present inventors, and means for solving the above problems are as follows. That is, ⁇ 1> a step of administering to a mouse a polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 and not containing the full-length amino acid sequence of EBAG9 protein as an immunogen; Recovering antibody-producing cells from the mouse; Cell fusion of the antibody-producing cells and myeloma to prepare a hybridoma; The antibody produced by the hybridoma is brought into contact with a polypeptide containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 and not containing the full-length amino acid sequence of EBAG9 protein, and the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 is included.
  • a monoclonal antibody against EBAG9 obtained by a method comprising a step of recovering an antibody produced by the selected hybridoma.
  • ⁇ 4> a step of measuring EBAG9 in a sample derived from a subject using the monoclonal antibody against EBAG9 according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 2>; And a step of evaluating whether or not the breast cancer has resistance to an endocrine therapy drug using the measurement result as an index.
  • a diagnostic agent or kit for predicting endocrine therapy-resistant breast cancer comprising the monoclonal antibody against EBAG9 according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 2>.
  • ⁇ 6> A tumor growth inhibitor comprising the monoclonal antibody against EBAG9 according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 2>.
  • a cancer metastasis inhibitor comprising the monoclonal antibody against EBAG9 according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 2>.
  • a pharmaceutical comprising at least one of the tumor growth inhibitor according to ⁇ 6> and the cancer metastasis inhibitor according to ⁇ 7>.
  • a method for preventing or treating cancer comprising: providing an individual with the tumor growth inhibitor according to ⁇ 6>, the cancer metastasis inhibitor according to ⁇ 7>, and the ⁇ 8>.
  • a method comprising administering at least one of the pharmaceuticals.
  • ⁇ 10> as an immunogen, administering to a mouse a polypeptide comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1 and not containing the full-length amino acid sequence of EBAG9 protein; Recovering antibody-producing cells from the mouse; Cell fusion of the antibody-producing cells and myeloma to prepare a hybridoma; The antibody produced by the hybridoma is brought into contact with a polypeptide containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 and not containing the full-length amino acid sequence of EBAG9 protein, and the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 is included.
  • a method for producing a monoclonal antibody against EBAG9 comprising the step of recovering an antibody produced by the selected hybridoma.
  • a method for producing a hybridoma that produces a monoclonal antibody against EBAG9 Administering as an immunogen a polypeptide comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1 and not containing the full-length amino acid sequence of EBAG9 protein to a mouse; Recovering antibody-producing cells from the mouse; Cell fusion of the antibody-producing cells and myeloma to prepare a hybridoma; The antibody produced by the hybridoma is brought into contact with a polypeptide containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 and not containing the full-length amino acid sequence of EBAG9 protein, and the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 is included. And a step of selecting a hybridoma that produces an antibody that binds to a polypeptide that does not contain the full-length amino acid sequence.
  • the said various problems in the past can be solved, the said objective can be achieved, it can be used for the diagnosis whether it is a breast cancer which acquires the tolerance with respect to an endocrine therapy drug, and tumor growth and cancer
  • FIG. 1 is a diagram schematically showing human EBAG9 protein and a portion used as an immunogen.
  • FIG. 2 is a diagram showing the results of Western blot analysis using an EBAG9 monoclonal antibody produced by a hybridoma selected by the primary screening in Production Example 1.
  • FIG. 3 is a diagram showing the results of Western blot analysis using the EBAG9 monoclonal antibody produced by the monocloned hybridoma in Production Example 1.
  • FIG. 4 is a diagram showing the results of Western blot analysis in Test Example 1.
  • FIG. 5 is a diagram showing an example of immunohistochemical staining results in Test Example 2.
  • FIG. 6 is a diagram showing another example of the immunohistochemical staining result in Test Example 2.
  • FIG. 1 is a diagram schematically showing human EBAG9 protein and a portion used as an immunogen.
  • FIG. 2 is a diagram showing the results of Western blot analysis using an EBAG9 monoclonal antibody produced by a hybridom
  • FIG. 7 shows the results of survival analysis of breast cancer patients based on EBAG9 immunoreactivity in Test Example 2.
  • FIG. 8 is a diagram showing the results of Western blot analysis in “Epitope identification-1” in Test Example 3.
  • FIG. 9 is a view showing the results of Western blot analysis in “Epitope identification-2” in Test Example 3.
  • FIG. 10A is a graph showing the results of measuring the amount of light emitted per second in Test Example 4.
  • FIG. 10B is an example of a photograph taken by the in vivo imaging apparatus of Test Example 4.
  • FIG. 11A is an example of a photograph examining lung metastasis in Test Example 4.
  • FIG. 11B is a graph showing the results of measuring the number of metastatic lesions in Test Example 4.
  • the monoclonal antibody of the present invention is a monoclonal antibody against EBAG9 and can be produced by the following method for producing a monoclonal antibody.
  • the monoclonal antibody of the present invention will be described together with the description of the production method of the monoclonal antibody.
  • the monoclonal antibody production method includes an immunogen administration step of administering an immunogen, an antibody-producing cell collection step of collecting antibody-producing cells, a hybridoma preparation step of preparing a hybridoma, and a hybridoma selection step of selecting a hybridoma.
  • An antibody recovery step for recovering the antibody and further includes other steps as necessary.
  • the immunogen administration step is a step of administering to the mouse a polypeptide containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 and not containing the full-length amino acid sequence of the EBAG9 protein as the immunogen.
  • the immunogen is not particularly limited as long as it is a polypeptide that includes the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1 and does not include the full-length amino acid sequence of the EBAG9 protein, and can be appropriately selected according to the purpose.
  • a polypeptide consisting only of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 a polypeptide (fusion protein) in which a Glutathione S-transferase (GST) protein is fused to the N-terminus of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 and the likecan be mentioned.
  • Glutathione S-transferase (GST) protein is fused to the N-terminus of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 is preferable from the viewpoint of high water solubility and easy purification.
  • the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1 corresponds to the 48th to 213rd amino acids of human EBAG9 protein.
  • the human EBAG9 protein has an N-terminal transmembrane domain and a C-terminal coiled-coil domain as two functional domains.
  • the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1 does not include the transmembrane domain of human EBAG9 protein, but consists of 166 amino acid sequences including a coiled-coil domain (see FIG. 1).
  • a method for preparing a polypeptide comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1 and not including the full-length amino acid sequence of EBAG9 protein is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose.
  • Examples include a method in which DNA encoding the amino acid sequence of No. 1 is incorporated into a plasmid, the plasmid is introduced into a host cell and expressed.
  • the method for preparing DNA encoding the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose.
  • a method of preparing by chemical synthesis, expressing EBAG9 For example, the total RNA is extracted from the cells in question and synthesized by synthesizing cDNA.
  • a method for purifying a polypeptide containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 and not containing the full-length amino acid sequence of the EBAG9 protein is not particularly limited, and a known method can be appropriately employed.
  • the method for preparing a polypeptide in which the GST protein is fused to the N-terminus of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 is not particularly limited and can be appropriately selected depending on the purpose.
  • a known GST fusion protein examples thereof include a method of preparing an expression vector by incorporating a DNA encoding the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, introducing the vector into a host cell, and expressing the vector.
  • Examples of the method for preparing DNA encoding the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 include the same methods as described above.
  • a method for purifying a polypeptide in which a GST protein is fused to the N-terminus of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 is not particularly limited, and a known method can be appropriately employed.
  • Glutathione Sepharose 4B GE The method of refine
  • a method for administering the immunogen is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose.
  • administration with an adjuvant may result in an immune response to the mouse immunogen. It is preferable at the point which can improve property.
  • a well-known adjuvant can be selected suitably, For example, Freund's complete adjuvant, Freund's incomplete adjuvant, etc. are mentioned. These may be used individually by 1 type and may use 2 or more types together.
  • the immunogen may be administered once or multiple times.
  • the adjuvant used when the immunogen is administered a plurality of times may be the same or different each time.
  • the antibody-producing cell collection step is a step of collecting antibody-producing cells from the mouse.
  • the method for collecting the antibody-producing cells is not particularly limited and can be appropriately selected according to the purpose. Examples thereof include a method of removing enlarged lymph nodes from both feet of a mouse, knocking out the cells, and collecting them by centrifugation. Can be mentioned.
  • the hybridoma preparation step is a step of preparing a hybridoma by fusing the antibody-producing cells with myeloma.
  • mouse-derived myeloma There is no restriction
  • the mouse-derived myeloma is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose. Examples thereof include P3U1, P3X63-Ag8.653, SP2 / O-Ag14, and the like.
  • the cell fusion method is not particularly limited, and a known method can be appropriately selected. Examples thereof include a method using polyethylene glycol (PEG method), a method using Sendai virus, and a method using an electrofusion device. Can be mentioned.
  • the method for selecting the cell-fused cells is not particularly limited, and a known method can be appropriately selected. For example, cells can be selected using a hypoxan-aminopterin-thymidine medium (HAT medium) as a selection medium. Examples thereof include a culture method. By using the HAT medium, the parent cell line is killed and only the cell-fused cells grow.
  • HAT medium hypoxan-aminopterin-thymidine medium
  • the hybridoma selection step includes at least a treatment of bringing the antibody produced by the hybridoma into contact with a polypeptide containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 and not containing the full-length amino acid sequence of the EBAG9 protein. Furthermore, other processing is included. By the hybridoma selection step, a hybridoma that produces an antibody that binds to EBAG9 can be selected.
  • the ELISA method for example, when a polypeptide in which a GST protein is fused to the N-terminus of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 is used as the immunogen, for example, as shown in SEQ ID NO: 1
  • a polypeptide in which the GST protein is fused to the N-terminus of the amino acid sequence, or GST protein is immobilized on a sensitive plate, and then a culture supernatant containing the antibody produced by the hybridoma is added and reacted, and then an enzyme label
  • examples include a method in which anti-mouse IgG is added and reacted, and then an enzyme substrate (coloring agent) is added to cause color development, followed by measuring the absorbance at a wavelength of 450 nm.
  • a plate on which a polypeptide in which the GST protein is fused to the N-terminus of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 is immobilized except for those having high reactivity to the plate on which the GST protein is immobilized.
  • Examples of the Western blotting method include preparing a lysate of cells expressing full-length human EBAG9, separating the lysate by SDS-PAGE, and using the antibody produced by the hybridoma as a primary antibody.
  • Examples of the secondary antibody include a method of using a horseradish peroxidase-labeled antibody and detecting a luminescence signal. By combining with the ELISA method, hybridomas producing antibodies more specific to EBAG9 can be selected.
  • the method for separating the selected hybridoma is not particularly limited, and a known method can be appropriately selected. Examples thereof include a limiting dilution method, a soft agar method, a method using a fluorescence excitation cell sorter, and the like.
  • the antibody recovery step is a step of recovering an antibody produced by the selected hybridoma.
  • the method for recovering the antibody produced by the selected hybridoma is not particularly limited and can be appropriately selected depending on the purpose.
  • the method for recovering from the culture supernatant of the hybridoma the method of recovering the mouse transplanted with the hybridoma A method of collecting from ascites is mentioned.
  • the method of culturing the hybridoma in the method of recovering from the culture supernatant of the hybridoma is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose.
  • stationary culture high-density culture, spinner flask culture, etc. Is mentioned.
  • the culture conditions are not particularly limited and may be appropriately selected depending on the purpose.
  • the method for recovering from the ascites of the mouse transplanted with the hybridoma is not particularly limited, and a known method can be appropriately selected.
  • intraperitoneal injection into a mouse administered with a substance having an immunosuppressive action such as pristane examples include a method of transplanting the hybridoma and collecting ascites after about 1 week to 3 weeks.
  • the purification step is a step of purifying the antibody recovered by the recovery step.
  • the purification method There is no restriction
  • the monoclonal antibody against EBAG9 of the present invention has an epitope within the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 13, as shown in Test Example 3 described later.
  • the monoclonal antibody against EBAG9 of the present invention can be suitably used as a monoclonal antibody against human EBAG9.
  • the monoclonal antibody against EBAG9 can be suitably used as a method for predicting endocrine therapy-resistant breast cancer, a diagnostic agent for predicting endocrine therapy-resistant breast cancer, or a kit, which will be described later.
  • the hybridoma of the present invention is a hybridoma that produces a monoclonal antibody against EBAG9, and can be produced by the following method for producing a hybridoma.
  • the hybridoma of the present invention will be described together with the description of the method for producing the hybridoma.
  • the hybridoma production method includes an immunogen administration step of administering an immunogen, an antibody-producing cell recovery step of recovering antibody-producing cells, a hybridoma preparation step of preparing a hybridoma, and a hybridoma selection step of selecting a hybridoma. Further, other steps are included as necessary.
  • the immunogen administration step can be performed in the same manner as the immunogen administration step in the method for producing a monoclonal antibody.
  • the antibody-producing cell recovery step can be performed in the same manner as the antibody-producing cell recovery step in the monoclonal antibody production method.
  • Hybridoma preparation process can be performed in the same manner as the hybridoma preparation step in the method for producing a monoclonal antibody.
  • Hybridoma selection process can be performed in the same manner as the hybridoma selection step in the monoclonal antibody production method.
  • the hybridoma C57-8 strain of the present invention was applied for deposit at the Patent Evaluation Microorganism Deposit Center (National Institute of Technology and Evaluation 2-5-8, Kazusa Kamashichi, Kisarazu, Chiba 292-0818). It was deposited domestically on the 15th, after which it was requested to transfer to the international deposit under the Budapest Treaty on July 11, 2013, and deposited internationally under the deposit number: NITE BP-01406.
  • the method for predicting endocrine therapy-resistant breast cancer of the present invention includes a measurement step for measuring EBAG9 and an evaluation step for evaluating whether the breast cancer has resistance to an endocrine therapy drug, and further steps as necessary. Including.
  • the measurement step is a step of measuring EBAG9 in a sample derived from a subject using a monoclonal antibody against EBAG9.
  • the sample derived from the subject is not particularly limited and can be appropriately selected depending on the purpose.
  • a well-known method can be selected suitably.
  • the measurement method is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose. Examples thereof include a method by immunohistochemical staining.
  • the immunohistochemical staining method for example, Dako's EnVision + visualization kit can be used. Specifically, after pre-treating a breast cancer tissue section, the monoclonal antibody against EBAG9 was reacted as a primary antibody, and then, using a horseradish-derived peroxidase-labeled Envision + horseradish peroxidase-labeled polymer as a secondary antibody. To form an antigen-antibody complex.
  • the method for visualizing the antigen-antibody complex is not particularly limited and can be appropriately selected according to the purpose.
  • DAB Vector's 3,3′-diaminobenzidine
  • the evaluation step is a step of evaluating whether or not the breast cancer has resistance to an endocrine therapy drug using the measurement result as an index.
  • Endocrine therapy There is no restriction
  • the anti-estrogen agent include tamoxifen, toremifene, raloxifene and the like.
  • the aromatase inhibitor include anastrozole, exemestane, letrozole and the like.
  • it can be suitably predicted whether or not the breast cancer acquires resistance to tamoxifen.
  • the breast cancer when it is determined that the breast cancer is EBAG9-positive breast cancer using the measurement result as an index, the breast cancer can be evaluated as endocrine therapy resistant breast cancer.
  • the method for determining whether or not the cancer is EBAG9-positive breast cancer is not particularly limited and can be appropriately selected according to the purpose.
  • positive cells against the monoclonal antibody against EBAG9 are present in the field of view under a microscope. Examples include a method of determining that the breast cancer is EBAG9-positive if it is detected or the ratio of the monoclonal antibody-positive cells to EBAG9 is 50% or more.
  • the method of determining that the breast cancer is EBAG9 positive when the ratio of the monoclonal antibody positive cells to EBAG9 is 50% or more in the visual field in the microscopic observation is preferable.
  • the microscope include an optical microscope (DMLB 100S, manufactured by Leica).
  • the evaluation is preferably performed by a pathologist. In the case of cancer of tissues other than the breast cancer tissue, evaluation can be performed in the same manner.
  • the other steps are not particularly limited as long as the effects of the present invention are not impaired, and can be appropriately selected according to the purpose.
  • Examples thereof include a sample preparation step for preparing a sample derived from a subject.
  • the diagnostic agent or kit for predicting endocrine therapy-resistant breast cancer includes the above-described monoclonal antibody against EBAG9 of the present invention, and further includes other components as necessary.
  • the other configuration is not particularly limited as long as the effects of the present invention are not impaired, and a configuration used in a known diagnostic agent or diagnostic kit can be appropriately selected according to the purpose.
  • a configuration used in a known diagnostic agent or diagnostic kit can be appropriately selected according to the purpose.
  • Specific examples of the label include enzymes and their chromogenic substrates, radioisotopes, luminescent substances, fluorescent substances, and colored substances.
  • the tumor growth inhibitor contains a monoclonal antibody against EBAG9, and further contains other components as necessary.
  • the tumor growth inhibitor may be a monoclonal antibody itself against EBAG9.
  • the tumor to which the tumor growth inhibitor is applied is not particularly limited and can be appropriately selected according to the purpose.
  • the present invention also relates to a method for inhibiting tumor growth, which comprises allowing a monoclonal antibody against EBAG9 to act on a tumor.
  • the cancer metastasis inhibitor includes the monoclonal antibody against EBAG9, and further includes other components as necessary.
  • ⁇ Monoclonal antibody against EBAG9 Details of the monoclonal antibody against EBAG9 are as described in the item of monoclonal antibody against EBAG9 of the present invention. There is no restriction
  • the cancer metastasis inhibitor may be a monoclonal antibody itself against EBAG9.
  • the cancer to which the cancer metastasis inhibitor is applied is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose.
  • the cancer metastasis inhibitor can suitably suppress cancer metastasis to the lung.
  • the present invention also relates to a method for inhibiting cancer metastasis, which comprises using the monoclonal antibody against EBAG9.
  • the medicament contains at least one of the tumor growth inhibitor and the cancer metastasis inhibitor, and further contains other components as necessary.
  • the content of at least one of the tumor growth inhibitor and the cancer metastasis inhibitor in the medicine is not particularly limited and can be appropriately selected depending on the purpose. Further, the medicament may be the tumor growth inhibitor itself, the cancer metastasis inhibitor itself, or only the tumor suppressor and the cancer metastasis inhibitor. Good.
  • the application target of the medicine is not particularly limited and may be appropriately selected according to the purpose.
  • the dosage form of the tumor growth inhibitor, the cancer metastasis inhibitor, and the pharmaceutical is not particularly limited, and can be appropriately selected according to, for example, a desired administration method as described below.
  • Agents tablettes, coated tablets, granules, powders, capsules, etc.), oral liquids (internal solutions, syrups, elixirs, etc.), injections (solutions, suspensions, solid preparations for dissolution, etc.), ointments , Patches, gels, creams, powders for external use, sprays, inhaled powders and the like.
  • Examples of the oral solid preparation include, for example, excipients and further additives such as binders, disintegrants, lubricants, colorants, flavoring and flavoring agents as necessary, in addition to the active ingredients.
  • Examples of the excipient include lactose, sucrose, sodium chloride, glucose, starch, calcium carbonate, kaolin, microcrystalline cellulose, silicic acid and the like.
  • Examples of the binder include water, ethanol, propanol, simple syrup, glucose solution, starch solution, gelatin solution, carboxymethylcellulose, hydroxypropylcellulose, hydroxypropyl starch, methylcellulose, ethylcellulose, shellac, calcium phosphate, polyvinylpyrrolidone and the like. It is done.
  • Examples of the disintegrant include dry starch, sodium alginate, agar powder, sodium bicarbonate, calcium carbonate, sodium lauryl sulfate, stearic acid monoglyceride, and lactose.
  • Examples of the lubricant include purified talc, stearate, borax, and polyethylene glycol.
  • Examples of the colorant include titanium oxide and iron oxide.
  • Examples of the flavoring / flavoring agent include sucrose, orange peel, citric acid, tartaric acid and the like.
  • the oral solution can be produced by a conventional method, for example, by adding additives such as a flavoring / flavoring agent, a buffering agent, and a stabilizer to the active ingredient.
  • additives such as a flavoring / flavoring agent, a buffering agent, and a stabilizer
  • the flavoring / flavoring agent include sucrose, orange peel, citric acid, tartaric acid and the like.
  • the buffer include sodium citrate.
  • the stabilizer include tragacanth, gum arabic, and gelatin.
  • a pH adjuster, a buffer, a stabilizer, a tonicity agent, a local anesthetic, etc. are added to the active ingredient, and subcutaneous, intramuscular, intravenous use are performed by a conventional method.
  • Etc. can be manufactured.
  • the pH adjusting agent and the buffering agent include sodium citrate, sodium acetate, sodium phosphate and the like.
  • the stabilizer include sodium pyrosulfite, EDTA, thioglycolic acid, thiolactic acid, and the like.
  • the isotonic agent include sodium chloride and glucose.
  • the local anesthetic include procaine hydrochloride and lidocaine hydrochloride.
  • a known base, stabilizer, wetting agent, preservative and the like may be blended with the active ingredient and mixed by a conventional method.
  • the base include liquid paraffin, white petrolatum, white beeswax, octyldodecyl alcohol, and paraffin.
  • the preservative include methyl paraoxybenzoate, ethyl paraoxybenzoate, propyl paraoxybenzoate, and the like.
  • a cream, gel or paste as the ointment can be applied to a known support by a conventional method.
  • the support include woven fabric, nonwoven fabric, soft vinyl chloride, polyethylene, polyurethane and other films made of cotton, suf, and chemical fibers, and foam sheets.
  • the tumor growth inhibitor, the cancer metastasis inhibitor, and the animal to which the medicament is administered are not particularly limited and can be appropriately selected according to the purpose.
  • humans, mice, rats, cows, pigs, Examples include monkeys, dogs, cats, etc. Among these, humans are particularly preferable.
  • the method for administering the tumor growth inhibitor, the cancer metastasis inhibitor, and the medicament is not particularly limited, and may be, for example, the tumor growth inhibitor, the pharmaceutical dosage form, the type of disease, the patient condition, etc.
  • either local administration or systemic administration can be selected.
  • administration is performed by directly injecting the tumor growth inhibitor, the cancer metastasis inhibitor, and the pharmaceutical active ingredient (monoclonal antibody against EBAG9) to a desired site (for example, a tumor site). can do.
  • a conventionally known method such as injection can be appropriately used.
  • the tumor growth inhibitor, the cancer metastasis inhibitor, and the active ingredient of the medicament include It is preferable to appropriately apply a conventionally known drug delivery technique so that it can be stably and efficiently delivered to a desired site (for example, a tumor site).
  • the dosage of the tumor growth inhibitor, the cancer metastasis inhibitor, and the medicament is not particularly limited and may be appropriately selected according to the age, weight, desired degree of effect, etc. of the patient to be administered. it can.
  • the number of administrations of the tumor growth inhibitor, the cancer metastasis inhibitor, and the pharmaceutical is not particularly limited, and is appropriately selected according to the age, weight, desired degree of effect, etc. of the patient to be administered. Can do.
  • the administration timing of the tumor growth inhibitor, the cancer metastasis inhibitor, and the medicament is not particularly limited and can be appropriately selected according to the purpose. For example, it is administered prophylactically against the disease. It may be administered therapeutically.
  • the present invention also relates to a method for preventing or treating cancer, comprising administering to the individual at least one of the tumor growth inhibitor, the cancer metastasis inhibitor, and the medicine.
  • the cancer is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose.
  • breast cancer uterine cancer, prostate cancer, bladder cancer, kidney cancer, lung cancer, liver cancer, ovarian cancer, colon cancer, gastric cancer, testicular tumor , Brain tumor, thyroid cancer, gallbladder cancer, bile duct cancer, pancreatic cancer, esophageal cancer, laryngeal cancer, squamous cell carcinoma, malignant lymphoma, malignant mesothelioma, paget disease, breast cancer, prostate cancer, bladder cancer, renal cancer are preferred More preferably, breast cancer is particularly preferred.
  • SEQ ID NO: 2 5'-ccggaattctattattcatcagttcctaagcagac-3 '
  • SEQ ID NO: 3 5'-ccgctcgagtttagaaaattttcacaccatttt-3 '
  • the amplified product obtained by the PCR is digested with restriction enzymes EcoRI and XhoI, and then inserted into a pGEX-4T-1 vector (manufactured by GE Healthcare) digested with EcoRI and XhoI.
  • the plasmid 1 was transformed into E. coli BL21 (Takara Bio Inc.).
  • the transformed E. coli was cultured, recovered and purified as follows to prepare the GST-fused EBAG9 (48-213) protein described in SEQ ID NO: 4.
  • the transformed Escherichia coli was placed in two 200 mL L-Broth (LB medium), cultured at 30 ° C. with shaking, and cultured until the absorbance at 600 nm reached 0.6 to 0.8. Thereafter, Isopropyl ⁇ -D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) was added to a final concentration of 0.1 mM, and further cultured with shaking at 30 ° C. for 2 hours.
  • IPTG Isopropyl ⁇ -D-1-thiogalactopyranoside
  • the culture solution was centrifuged at 5,000 rpm, 4 ° C. for 10 minutes, and the precipitate was added to 5 mL of solution A (20 mM Tris-HCl (pH 7.5), 10% Glycerol, 80 mM KCl, 1 mM MgCl 2 , 0.2 mM ethylenediaminetic acid (EDTA ), 0.5 mM dithiothreitol (DTT), 0.5 mM phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF), 1% Triton X-100) and sonicated (4 times for 30 seconds).
  • solution A (20 mM Tris-HCl (pH 7.5), 10% Glycerol, 80 mM KCl, 1 mM MgCl 2 , 0.2 mM ethylenediaminetic acid (EDTA ), 0.5 mM dithiothreitol (DTT), 0.5 mM phenylmethylsulfonyl fluoride (
  • ⁇ Immunogen administration process> An equal amount of a 1 mg / mL solution of the purified GST-fused EBAG9 (48-213) protein and an adjuvant were mixed to prepare an emulsion. 50 ⁇ L of the emulsion was administered to the sole of a mouse (manufactured by Japan SLC Co., Ltd.). The immunogen was administered three times every other week. As the adjuvant, Cat No F5881 Freund's Adjuvant Complete made by Sigma was used for the first administration, and Cat No F5506 Freund's Adjuvant Complete made by Sigma was used for the second and subsequent administrations.
  • ⁇ Antibody producing cell recovery step> After 3 days from the last immunogen administration in the immunogen administration step, enlarged lymph nodes were removed from both feet of the immunized mouse, the cells were knocked out, and centrifuged at 1,400 rpm for 5 minutes to collect the cells.
  • ⁇ Hybridoma preparation process As myeloma cells, P3U1 cells were used, and those grown in culture flasks (four 75 cm 2 flasks) were collected. The cells collected in the antibody-producing cell collection step (collected from 2 mice) and the P3U1 were mixed and centrifuged at 1,400 rpm for 5 minutes. PEG (polyethylene glycol) solution (equal dilution with RPMI medium) was added to the pellet to perform cell fusion. The cells subjected to the cell fusion were washed and then suspended, and then seeded in a 96-well plate. When colony formation was confirmed, primary screening in the hybridoma selection step described later was performed.
  • PEG polyethylene glycol
  • HAT medium HAT / 15% FBS / PS / RPMI; aminopterin (Cat. No. A3411, manufactured by SIGMA, HT (Cat. No. 11067-030, manufactured by GIBCO)) was used as the medium in the 96-well plate. .
  • ⁇ Hybridoma selection process> Primary screening- The primary screening was performed by ELISA.
  • the fusion protein or GST protein used as the immunogen was diluted with PBS (0.01 mol / L phosphate buffered saline) to prepare 5 ⁇ g / mL, and then a sensitive plate (Cat No 466667 manufactured by NUNC). 50 ⁇ L / well, and left at 4 ° C. overnight. Thereafter, the protein solution was removed, and 100 ⁇ L / well of blocking buffer (manufactured by Medical and Biological Laboratories) was dispensed, and allowed to stand at 4 ° C. overnight.
  • PBS 0.01 mol / L phosphate buffered saline
  • a sensitive plate Cat No 466667 manufactured by NUNC
  • the GST protein was used as the immunogen except that plasmid 1 was replaced with a pGEX-4T-1 vector (a vector in which the partial sequence of EBAG9 was not incorporated) in the preparation of the fusion protein used as the immunogen. Prepared in the same manner as the fusion protein. 50 ⁇ L / well of each culture supernatant in which colony formation was confirmed was added and reacted at room temperature for 60 minutes.
  • POD conjugated anti-mouse IgG (# 330, manufactured by Medical and Biological Laboratories Co., Ltd.) is diluted 10,000 times with blue buffer (Diluted solution manufactured by Medical and Biological Laboratories Co., Ltd.) Was added at 50 ⁇ L / well and allowed to react at room temperature for 60 minutes.
  • blue buffer Diluted solution manufactured by Medical and Biological Laboratories Co., Ltd.
  • a chromogenic substrate manufactured by Medical and Biological Laboratories Co., Ltd.
  • absorbance was measured at 450 nm and 620 nm. The 620 nm is for background measurement, and the sample was evaluated at 450 nm.
  • the reactivity of the fusion protein used as the immunogen to the plate is an OD value of 0.2 or more
  • the reactivity of the GST protein to the plate is OD value 0.
  • 32 hybridoma strains of less than or equal to 2 were obtained.
  • Table 1-1 shows the results of measuring the reactivity of the fusion protein used as an immunogen to the plate
  • Table 1-2 shows the results of measuring the reactivity of the GST protein to the plate
  • Table 1-3 shows the list of hybridoma clones. Show.
  • the parentheses indicate the hybridoma strains that were not selected, and the others indicate the selected hybridoma strains.
  • SEQ ID NO: 5 5'-ccgggaattcgccatcaccccattttcggttttt-3 '
  • SEQ ID NO: 6 5′-ccgctcgagtattgaaagtttcacaccatttt-3 ′
  • the amplification product obtained by the PCR was digested with restriction enzymes EcoRI and XhoI, and then inserted into a pcDNA vector (manufactured by Invitrogen) digested with EcoRI and XhoI.
  • a synthetic DNA having a sequence in which a Flag tag sequence is sandwiched between a BamHI recognition sequence (5 ′ side) and an EcoRI recognition sequence (3 ′ side) is prepared, inserted into the BamHI and EcoRI sites of the vector, and pcDNA3-FLAG -HEBAG9 was made.
  • a Flag sequence is fused to the N-terminal side of the 2nd to 213rd amino acids of the EBAG9 protein (see SEQ ID NO: 7).
  • cell lysate 2 was prepared in the same manner as the cell lysate 1 except that the expression plasmid 2 was used instead of the vector pcDNA3 in the preparation of the cell lysate 1.
  • B15, B16, C33, C35, C36, C57, C63, B65, C76, C77, C80 and C95 represent hybridoma strains producing antibodies, and Flag Ab. Indicates an antibody using anti-Flag antibody, “1” indicates cell lysate 1 and “2” indicates cell lysate 2.
  • FIG. 2 a strong signal was observed in the Western blot analysis for those that had high reactivity by ELISA. Among them, the antibody produced by C57 has the highest antibody titer and specificity as an anti-EBAG9 antibody.
  • B16, C35, and C57 for which strong signals were observed were diluted to 1 cell / well in a 96-well plate and cultured, and a plurality of single clones (B16-1, B16-2) were cultured.
  • Each single clone was subjected to Western blot analysis in the same manner as the Western blot analysis in the primary screening.
  • rabbit polyclonal anti-mouse EBAG9 antibody (4,000-fold dilution, Tsuchiya et al, Biochem Biophys Res Commun. 284 (1): 2-10, 2001) was used as the primary antibody.
  • the results are shown in FIG.
  • B16-1, B16-2, B16-6, B16-7, C35-1, C35-5, C35-6, C35-7, C57-2, C57-4, C57-6, C57- 8 shows a hybridoma strain producing the antibody, Mouse EBAG9 Ab.
  • Indicates a rabbit polyclonal anti-mouse EBAG9 antibody “1” indicates cell lysate 1 and “2” indicates cell lysate 2.
  • FIG. 3 reveals that the antibody produced by the C57-8 strain derived from the C57 strain is the most reactive antibody.
  • the hybridoma C57-8 strain was filed for deposit at the Patent Microorganism Deposit Center (2-5-8, Kazusa-Kamashita, Kisarazu City, Chiba Prefecture, 292-0818, Japan) on August 15, 2012. After that, on July 11, 2013, a request was made to transfer to an international deposit under the Budapest Treaty, and the deposit was made internationally as NITE BP-01406.
  • ⁇ Antibody recovery process The culture amount of the resulting clone of the hybridoma C57-8 strain was increased to 10 L and cultured for 1.5 months, and then the culture supernatant was recovered and the antibody was recovered.
  • the antibody contained in the culture supernatant was purified as follows. First, a column packed with Protein A was applied with the collected culture supernatant filtered through a filter, and the antibody was adsorbed onto the column packed with Protein A. After the column was washed with PBS, an elution buffer (0.5 M arginine, pH 4.1) was added, and the antibody was recovered for each fraction. The recovered antibody was immediately neutralized with 1M Tris-HCl (pH 8.0). Among the obtained fractions, the fractions having high absorbance in the reactivity with POD conjugated anti-mouse IgG were pooled. The pooled purified antibody was dialyzed against PBS to obtain a monoclonal antibody against EBAG9 having a purified IgG fraction (sometimes referred to as “mouse monoclonal anti-EBAG9 antibody”).
  • mice monoclonal anti-EBAG9 antibody obtained in Production Example 1 was evaluated by comparison with various existing antibodies by Western blotting. The following three types of existing antibodies were prepared. Note that RCAS1 is an alias for EBAG9. -Existing antibodies- (A) Rabbit polyclonal anti-mouse EBAG9 antibody (Tsuchiya et al, Biochem Biophys Res Commun.
  • mice monoclonal anti-EBAG9 antibody and existing various antibodies were diluted with TBST buffer so that the concentrations of the respective antibodies were almost the same, and diluted solutions were prepared.
  • the mouse monoclonal anti-EBAG9 antibody obtained in Production Example 1 and the rabbit anti-mouse EBAG9 antibody of (A) were diluted 5,000 times, and the mouse monoclonal anti-RCAS1 antibody of (B) and (C) was a 2,000-fold dilution.
  • cell lysate 1 and cell lysate 2 were prepared in the same manner as the Western blot analysis in the hybridoma selection step of Production Example 1.
  • FIG. 4 shows that the mouse monoclonal anti-EBAG9 antibody (purified monoclonal anti-human EBAG9 antibody derived from C57-8) obtained in Production Example 1 contains endogenous EBAG9 protein in addition to exogenous tagged EBAG9 protein. In addition, almost no non-specific band was observed.
  • the rabbit polyclonal anti-mouse EBAG9 antibody was able to detect both the foreign-tagged EBAG9 protein and the endogenous EBAG9 protein, but also detected many non-specific bands.
  • the RCAS1 (1) antibody was able to detect EBAG9 protein with an exogenous tag, endogenous EBAG9 protein could not be detected under the same conditions, and the sensitivity was low.
  • the RCAS1 (2) antibody both exogenous tagged EBAG9 protein and endogenous EBAG9 protein could not be detected under the same conditions, and the sensitivity was low. Therefore, it was shown that the mouse monoclonal anti-EBAG9 antibody obtained in Production Example 1 has a very high specificity and a low background in addition to sufficient sensitivity.
  • this Test Example 2 after performing postoperative endocrine therapy, cases in which distant metastasis was observed within the 5-year follow-up period were defined as a relapse group, and cases in which distant metastasis was not identified were defined as a non-relapse group.
  • ER ⁇ represents estrogen receptor ⁇
  • PgR progesterone receptor
  • Immunohistochemical analysis of EBAG9 expression in breast cancer tissue was performed using Dako's EnVision + visualization kit as follows. A 6 ⁇ m-thick breast cancer tissue section was deparaffinized and subjected to re-hydrophilic treatment using a graded ethanol series, and then washed with a Tris buffered phosphate solution (TBST) containing 0.05% Tween-20. Thereafter, as an antigen activation treatment, heat treatment (121 ° C., 5 minutes) using an autoclave apparatus was performed on a section slide immersed in a 10 mM sodium citrate solution (pH 6.0).
  • TST Tris buffered phosphate solution
  • the sections were then treated with 0.3% hydrogen peroxide (H 2 O 2 ) for 30 minutes to inhibit endogenous peroxidase activity in breast cancer tissue, and then 10% bovine to mask nonspecific antigens. Treated with fetal serum (FBS) for 30 minutes.
  • FBS fetal serum
  • 150 ⁇ L of a mouse monoclonal anti-EBAG9 antibody solution obtained by diluting the mouse monoclonal anti-EBAG9 antibody obtained in Production Example 1 200 times as a primary antibody was added and reacted at 4 ° C. overnight.
  • 150 ⁇ L of horseradish-derived peroxidase-labeled Envision + horseradish peroxidase-labeled polymer was added as a secondary antibody and allowed to react at room temperature for 1 hour.
  • a plasmid (pGEX-hEBAG9 (48-136)) expressing a fusion protein of GST protein and amino acids 48 to 136 of human EBAG9 protein was prepared as follows. By cutting the plasmid 1 (pGEX-hEBAG9 (48-213)) prepared in Preparation Example 1 with restriction enzymes BglII and XhoI, it corresponds to the 213th amino acid from the 137th amino acid on the N-terminal side of the human EBAG9 protein.
  • a fusion protein of the 48th to 136th amino acids of GST protein and EBAG9 protein was prepared.
  • a GST protein is fused to the N-terminal side of the 48th to 136th amino acids of the EBAG9 protein (see SEQ ID NO: 8).
  • SEQ ID NO: 9 5′-ccgggaattctcttagtagattaggcagtcacaa-3 ′
  • SEQ ID NO: 10 5′-ccgctcgagttatgaaaagtttcacaccatttt-3 ′
  • the amplified product obtained by the PCR is digested with restriction enzymes EcoRI and XhoI, and then inserted into a pGEX-4T-1 vector (manufactured by GE Healthcare) digested with EcoRI and XhoI.
  • pGEX-hEBAG9 (128-213) expressing a fusion protein with the 213rd amino acid was prepared.
  • a GST protein is fused to the N-terminal side of the 128th to 213rd amino acids of the EBAG9 protein (see SEQ ID NO: 11).
  • a cell extract was prepared as follows. Each plasmid was introduced into E. coli strain DH5 ⁇ and cultured overnight in LB medium, and then E. coli was recovered by centrifugation and suspended in sample buffer to prepare a cell extract.
  • FIG. 8 The results are shown in FIG. In FIG. 8, the left side shows the results when a mouse monoclonal anti-EBAG9 antibody (EBAG9 monoclonal antibody) is used, and the right side shows the results when an antibody against GST (GST antibody) is used.
  • GST-EBAG9 fusion protein was detected in the E. coli extract into which pGEX-hEBAG9 (48-213) and pGEX-hEBAG9 (128-213) were introduced, but pGEX-hEBAG9 (48-136) was detected.
  • GST-EBAG9 fusion protein was not detected in the extract of Escherichia coli into which was introduced). Therefore, it was first shown that the epitope of the mouse monoclonal anti-EBAG9 antibody exists between the 128th to 213rd amino acid sequences on the N-terminal side of the human EBAG9 protein.
  • ⁇ Epitope identification-2> -peptide- The following peptides were prepared by chemical synthesis (manufactured by Genscript). (1) A peptide consisting of 30 amino acids corresponding to the 128th to 157th amino acids on the N-terminal side of human EBAG9 protein (hereinafter sometimes referred to as “128-157”). N-terminus—SSRLAATQDLPFIHQSSELGDLDTWQENTN-C-terminus (see SEQ ID NO: 12) (2) A peptide consisting of 30 amino acids corresponding to amino acids 148 to 177 on the N-terminal side of human EBAG9 protein (hereinafter sometimes referred to as “148-177”).
  • a cell extract was prepared as follows. Each plasmid was introduced into E. coli strain DH5 ⁇ and cultured overnight in LB medium, and then E. coli was recovered by centrifugation and suspended in sample buffer to prepare a cell extract.
  • the antibody obtained in Production Example 1 was neutralized with a peptide consisting of 30 amino acids (“148-177”) corresponding to amino acids 148 to 177 on the N-terminal side of human EBAG9 protein. Only when no signal was detected. Therefore, it was revealed that the epitope of the mouse monoclonal anti-EBAG9 antibody is localized to the amino acid sequence from the 148th to 177th amino acids on the N-terminal side of the human EBAG9 protein.
  • the amino acid sequence from the 148th to 177th amino acids on the N-terminal side of the human EBAG9 protein contains a lot of acidic amino acids (glutamic acid and aspartic acid), and is considered to contribute to a characteristic structure. It was suggested that a monoclonal antibody having an epitope within this region was produced, so that the antibody had a high titer.
  • mice ⁇ In vivo tumor growth inhibition experiment>
  • the 4T1-Luc cells were transplanted into a mammary fat pad of 8-week-old female BALB / c mice (CLEA Japan).
  • the cells to be transplanted were 5 ⁇ 10 5 cells / animal, and the dose was adjusted to 100 ⁇ L / animal.
  • the mouse monoclonal anti-EBAG9 antibody was dialyzed against PBS and injected into the abdominal cavity at a dose of 0.2 mg / animal twice a week from the second day after tumor implantation (treatment group).
  • normal mouse IgG manufactured by Sigma Aldrich
  • the growth of the tumor was measured once a week using an in vivo imaging apparatus Photon Imager (manufactured by BIOSSPACE LAB) after the intraperitoneal administration of luciferin (3 mg / animal), and the amount of luminescence per second (Counts / s ).
  • FIGS. 10A and 10B The results are shown in FIGS. 10A and 10B.
  • FIG. 10A shows the mean ⁇ SE (bar), “*” indicates P ⁇ 0.05, and “**” indicates P ⁇ 0.01.
  • FIG. 10B is a photograph of a typical example when measured 3 weeks after tumor transplantation, “IgG (control)” represents a typical example in the case of control, and “EBAG9 monoclonal antibody” represents a mouse monoclonal anti-EBAG9 antibody. A typical example of administration of As is clear from FIGS.
  • mice monoclonal anti-EBAG9 antibody obtained in Production Example 1 in the group administered with the mouse monoclonal anti-EBAG9 antibody obtained in Production Example 1, tumor formation was significantly suppressed relative to the control. Therefore, it was revealed that the mouse monoclonal anti-EBAG9 antibody obtained in Production Example 1 has a tumor growth inhibitory effect on breast cancer cells.
  • FIG. 11A is a photograph showing an example of the state of the lungs of a mouse 4 weeks after tumor transplantation, “IgG (control)” is for control, and “EBAG9 monoclonal antibody” is a mouse monoclonal anti-EBAG9 antibody. Is administered.
  • FIG. 11B is a graph showing the number of breast cancer cell metastases, where “IgG (control)” is for control, and “EBAG9 monoclonal antibody” is when a mouse monoclonal anti-EBAG9 antibody is administered. belongs to.
  • FIG. 11A is a photograph showing an example of the state of the lungs of a mouse 4 weeks after tumor transplantation
  • “IgG (control)” is for control
  • EBAG9 monoclonal antibody is a mouse monoclonal anti-EBAG9 antibody.
  • EBAG9 is breast cancer, prostate cancer, bladder cancer, renal cancer, testicular tumor, brain tumor, uterine cancer, ovarian cancer, thyroid cancer, liver cancer, gallbladder cancer, bile duct cancer, pancreatic cancer, colon cancer, gastric cancer, esophageal cancer, lung cancer, laryngopharynx It is highly expressed in cancer, squamous cell carcinoma, malignant lymphoma, malignant mesothelioma, and Paget's disease, and is known to correlate with poor prognosis. Therefore, it was suggested that the monoclonal antibody against EBAG9 can be applied to the treatment of cancer including breast cancer.
  • the monoclonal antibody against EBAG9 of the present invention has high specificity and can be suitably used in a method for predicting endocrine therapy-resistant breast cancer, a diagnostic agent or kit for predicting endocrine therapy-resistant breast cancer, and a tumor growth inhibitor, It can be suitably used as a cancer metastasis inhibitor and an active ingredient of a medicine.
  • the monoclonal antibody against EBAG9 of the present invention can be used for elucidating the mechanism of cancer cell evasion from the immune system and the mechanism of proliferation / metastasis and for elucidating the disease state.
  • the hybridoma of the present invention can be suitably used for the production of a monoclonal antibody against EBAG9 of the present invention.
  • prediction diagnostic agent or kit for endocrine therapy drug-resistant breast cancer of the present invention it becomes possible to diagnose early whether breast cancer has acquired resistance to an endocrine therapy drug.
  • tumor growth inhibitor of the present invention tumor growth can be effectively suppressed.
  • cancer metastasis inhibitor of the present invention cancer metastasis can be effectively suppressed.
  • the medicament of the present invention can be suitably used for prevention or treatment of cancer.

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Abstract

　免疫原として、配列番号１に記載のアミノ酸配列を含み、ＥＢＡＧ９タンパク質の全長のアミノ酸配列は含まないポリペプチドをマウスに投与する工程と、前記マウスから抗体産生細胞を回収する工程と、前記抗体産生細胞とミエローマとを細胞融合し、ハイブリドーマを調製する工程と、前記ハイブリドーマが産生する抗体と、配列番号１に記載のアミノ酸配列を含み、ＥＢＡＧ９タンパク質の全長のアミノ酸配列は含まないポリペプチドとを接触させ、前記配列番号１に記載のアミノ酸配列を含み、ＥＢＡＧ９タンパク質の全長のアミノ酸配列は含まないポリペプチドに結合する抗体を産生するハイブリドーマを選択する工程と、前記選択されたハイブリドーマが産生する抗体を回収する工程とを含む方法により得られるＥＢＡＧ９に対するモノクローナル抗体等である。

Description

ＥＢＡＧ９に対するモノクローナル抗体、及びハイブリドーマ、並びにＥＢＡＧ９に対するモノクローナル抗体の利用
　本発明は、ＥＢＡＧ９に対するモノクローナル抗体、前記ＥＢＡＧ９に対するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ、前記ＥＢＡＧ９に対するモノクローナル抗体を用いた内分泌療法薬耐性乳癌の予測方法、前記ＥＢＡＧ９に対するモノクローナル抗体を含む内分泌療法薬耐性乳癌の予測用診断薬又はキット、前記ＥＢＡＧ９に対するモノクローナル抗体を含む腫瘍増殖抑制剤、前記ＥＢＡＧ９に対するモノクローナル抗体を含む癌転移抑制剤、並びに、前記腫瘍増殖抑制剤及び前記癌転移抑制剤の少なくともいずれかを含む医薬に関する。
　乳癌は、４０歳以上の女性に多く、日本においても増加の傾向にある。前記乳癌は、エストロゲン受容体陽性のものが多く、抗エストロゲン剤等の内分泌療法薬を用いた内分泌療法が奏功することが知られている。しかしながら、乳癌の中には、治療過程において、内分泌療法薬に対する抵抗性（耐性）を獲得するものが多く、予後不良となるため問題となっている。そのため、内分泌療法薬に対する耐性を獲得する乳癌か否かを早期に診断することを可能とする技術が求められている。
　ＥＢＡＧ９（Ｅｓｔｒｏｇｅｎ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ－ｂｉｎｄｉｎｇ　ｆｒａｇｍｅｎｔ　ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｇｅｎｅ　９）は、エストロゲン応答遺伝子として単離され、その後の研究で、癌細胞の糖鎖修飾に関与し、免疫系からの回避に関与することが明らかにされている。また、ＥＢＡＧ９は、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、肝癌、腎癌、膀胱癌、精巣腫瘍、脳腫瘍、子宮癌、甲状腺癌、胆嚢癌、胆管癌、膵癌、大腸癌、胃癌、食道癌、肺癌、喉咽頭癌、扁平上皮癌、悪性リンパ腫、悪性中皮腫、ページェット病での発現が報告されており、癌の進展、転移に関わると考えられている。
　これまでに、免疫原として、前記ＥＢＡＧ９の全長を用いて、ＥＢＡＧ９に対するポリクローナル抗体を作製し、前記ポリクローナル抗体と乳癌サンプルとを用いた免疫染色法による解析が行われている（例えば、非特許文献１参照）。前記解析では、ＥＢＡＧ９の免疫染色性は、エストロゲン受容体の免疫染色性と相関すること、並びに腫瘍組織内へのＣＤ３陽性Ｔ細胞の浸潤の減少と相関することが示されている。しかしながら、内分泌療法薬に対する耐性を獲得する乳癌か否か等の乳癌の予後との関係は、解明されていない。
　したがって、内分泌療法薬に対する耐性を獲得する乳癌か否かを早期に診断することを可能とする技術は未だ開発されておらず、その速やかな開発が強く求められている。
　また、上述のようにＥＢＡＧ９は、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、肝癌、腎癌、膀胱癌、精巣腫瘍、脳腫瘍、子宮癌、甲状腺癌、胆嚢癌、胆管癌、膵癌、大腸癌、胃癌、食道癌、肺癌、喉咽頭癌、扁平上皮癌、悪性リンパ腫、悪性中皮腫、ページェット病での発現が報告されており、ＥＢＡＧ９に対する抗体が癌の予防乃至治療に有効となり得ると考えられるものの、未だそのような抗体は提供されていない。
Ｓｕｚｕｋｉ　ｅｔ　ａｌ．，　ＥＢＡＧ９／ＲＣＡＳ１　ｉｎ　ｈｕｍａｎ　ｂｒｅａｓｔ　ｃａｒｃｉｎｏｍａ：　ａ　ｐｏｓｓｉｂｌｅ　ｆａｃｔｏｒ　ｉｎ　ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ－ｉｍｍｕｎｅ　ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ．　Ｂｒ　Ｊ　Ｃａｎｃｅｒ．　２００１　Ｎｏｖｅｍｂｅｒ；　８５（１１）：１７３１－１７３７
　本発明は、前記従来における諸問題を解決し、以下の目的を達成することを課題とする。即ち、本発明は、内分泌療法薬に対する耐性を獲得する乳癌か否かの診断に用いることができ、また腫瘍の増殖や癌の転移を抑制することも可能なＥＢＡＧ９に対するモノクローナル抗体、前記ＥＢＡＧ９に対するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ、前記ＥＢＡＧ９に対するモノクローナル抗体を含む内分泌療法薬耐性乳癌の予測用診断薬又はキット、前記ＥＢＡＧ９に対するモノクローナル抗体を含む腫瘍増殖抑制剤、前記ＥＢＡＧ９に対するモノクローナル抗体を含む癌転移抑制剤、前記ＥＢＡＧ９に対するモノクローナル抗体を含む癌転移抑制剤、並びに、前記腫瘍増殖抑制剤及び前記癌転移抑制剤の少なくともいずれかを含む医薬を提供することを目的とする。
　本発明者らは、前記目的を達成すべく鋭意検討を行った結果、免疫原として、ＥＢＡＧ９の特定の部分を用いて作製したＥＢＡＧ９に対するモノクローナル抗体を用いることで、内分泌療法薬耐性乳癌を予測でき、また腫瘍の増殖を抑制したり、癌の転移を抑制したりすることも可能であることを知見し、本発明の完成に至った。
　本発明は、本発明者らによる前記知見に基づくものであり、前記課題を解決するための手段としては、以下の通りである。即ち、
　＜１＞　免疫原として、配列番号１に記載のアミノ酸配列を含み、ＥＢＡＧ９タンパク質の全長のアミノ酸配列は含まないポリペプチドをマウスに投与する工程と、
　前記マウスから抗体産生細胞を回収する工程と、
　前記抗体産生細胞とミエローマとを細胞融合し、ハイブリドーマを調製する工程と、
　前記ハイブリドーマが産生する抗体と、配列番号１に記載のアミノ酸配列を含み、ＥＢＡＧ９タンパク質の全長のアミノ酸配列は含まないポリペプチドとを接触させ、前記配列番号１に記載のアミノ酸配列を含み、ＥＢＡＧ９タンパク質の全長のアミノ酸配列は含まないポリペプチドに結合する抗体を産生するハイブリドーマを選択する工程と、
　前記選択されたハイブリドーマが産生する抗体を回収する工程とを含む方法により得られることを特徴とするＥＢＡＧ９に対するモノクローナル抗体である。
　＜２＞　エピトープが、配列番号１３に記載のアミノ酸配列内にあることを特徴とするＥＢＡＧ９に対するモノクローナル抗体である。
　＜３＞　前記＜１＞から＜２＞のいずれかに記載のＥＢＡＧ９に対するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマであって、受託番号：ＮＩＴＥ　ＢＰ－０１４０６であることを特徴とするハイブリドーマである。
　＜４＞　被検体由来の試料中におけるＥＢＡＧ９を前記＜１＞から＜２＞のいずれかに記載のＥＢＡＧ９に対するモノクローナル抗体を用いて測定する工程と、
　前記測定結果を指標として、内分泌療法薬に耐性を有する乳癌か否かを評価する工程とを含むことを特徴とする内分泌療法薬耐性乳癌の予測方法である。
　＜５＞　前記＜１＞から＜２＞のいずれかに記載のＥＢＡＧ９に対するモノクローナル抗体を含むことを特徴とする内分泌療法薬耐性乳癌の予測用診断薬又はキットである。
　＜６＞　前記＜１＞から＜２＞のいずれかに記載のＥＢＡＧ９に対するモノクローナル抗体を含むことを特徴とする腫瘍増殖抑制剤である。
　＜７＞　前記＜１＞から＜２＞のいずれかに記載のＥＢＡＧ９に対するモノクローナル抗体を含むことを特徴とする癌転移抑制剤である。
　＜８＞　前記＜６＞に記載の腫瘍増殖抑制剤、及び前記＜７＞に記載の癌転移抑制剤の少なくともいずれかを含むことを特徴とする医薬である。
　＜９＞　癌を予防乃至治療するための方法であって、個体に、前記＜６＞に記載の腫瘍増殖抑制剤、前記＜７＞に記載の癌転移抑制剤、及び前記＜８＞に記載の医薬の少なくともいずれかを投与することを特徴とする方法である。
　＜１０＞　免疫原として、配列番号１に記載のアミノ酸配列を含み、ＥＢＡＧ９タンパク質の全長のアミノ酸配列は含まないポリペプチドをマウスに投与する工程と、
　前記マウスから抗体産生細胞を回収する工程と、
　前記抗体産生細胞とミエローマとを細胞融合し、ハイブリドーマを調製する工程と、
　前記ハイブリドーマが産生する抗体と、配列番号１に記載のアミノ酸配列を含み、ＥＢＡＧ９タンパク質の全長のアミノ酸配列は含まないポリペプチドとを接触させ、前記配列番号１に記載のアミノ酸配列を含み、ＥＢＡＧ９タンパク質の全長のアミノ酸配列は含まないポリペプチドに結合する抗体を産生するハイブリドーマを選択する工程と、
　前記選択されたハイブリドーマが産生する抗体を回収する工程とを含むことを特徴とするＥＢＡＧ９に対するモノクローナル抗体の製造方法である。
　＜１１＞　ＥＢＡＧ９に対するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマの製造方法であって、
　免疫原として、配列番号１に記載のアミノ酸配列を含み、ＥＢＡＧ９タンパク質の全長のアミノ酸配列は含まないポリペプチドをマウスに投与する工程と、
　前記マウスから抗体産生細胞を回収する工程と、
　前記抗体産生細胞とミエローマとを細胞融合し、ハイブリドーマを調製する工程と、
　前記ハイブリドーマが産生する抗体と、配列番号１に記載のアミノ酸配列を含み、ＥＢＡＧ９タンパク質の全長のアミノ酸配列は含まないポリペプチドとを接触させ、前記配列番号１に記載のアミノ酸配列を含み、ＥＢＡＧ９タンパク質の全長のアミノ酸配列は含まないポリペプチドに結合する抗体を産生するハイブリドーマを選択する工程とを含むことを特徴とするハイブリドーマの製造方法である。
　本発明によれば、従来における前記諸問題を解決し、前記目的を達成することができ、内分泌療法薬に対する耐性を獲得する乳癌か否かの診断に用いることができ、また腫瘍の増殖や癌の転移を抑制することも可能なＥＢＡＧ９に対するモノクローナル抗体、前記ＥＢＡＧ９に対するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ、前記ＥＢＡＧ９に対するモノクローナル抗体を含む内分泌療法薬耐性乳癌の予測用診断薬又はキット、前記ＥＢＡＧ９に対するモノクローナル抗体を含む腫瘍増殖抑制剤、前記ＥＢＡＧ９に対するモノクローナル抗体を含む癌転移抑制剤、前記ＥＢＡＧ９に対するモノクローナル抗体を含む癌転移抑制剤、並びに、前記腫瘍増殖抑制剤及び前記癌転移抑制剤の少なくともいずれかを含む医薬を提供することができる。
図１は、ヒトＥＢＡＧ９タンパク質及び免疫原として用いた部分を模式的に示した図である。 図２は、製造例１における一次スクリーニングにより選択されたハイブリドーマが産生するＥＢＡＧ９モノクローナル抗体を用いたウエスタンブロット解析の結果を示す図である。 図３は、製造例１における単クローン化したハイブリドーマが産生するＥＢＡＧ９モノクローナル抗体を用いたウエスタンブロット解析の結果を示す図である。 図４は、試験例１におけるウエスタンブロット解析の結果を示す図である。 図５は、試験例２における免疫組織化学的染色結果の一例を示す図である。 図６は、試験例２における免疫組織化学的染色結果の他の一例を示す図である。 図７は、試験例２におけるＥＢＡＧ９の免疫反応性に基づく乳癌患者の生存解析の結果を示す図である。 図８は、試験例３の「エピトープの同定－１」におけるウエスタンブロット解析の結果を示す図である。 図９は、試験例３の「エピトープの同定－２」におけるウエスタンブロット解析の結果を示す図である。 図１０Ａは、試験例４の１秒間当たりの発光量を測定した結果のグラフである。 図１０Ｂは、試験例４のインビボイメージング装置で撮影した写真の一例である。 図１１Ａは、試験例４における肺転移を調べた写真の一例である。 図１１Ｂは、試験例４における転移巣の数を測定した結果のグラフである。
（モノクローナル抗体及びその製造方法）
　本発明のモノクローナル抗体は、ＥＢＡＧ９に対するモノクローナル抗体であって、以下のモノクローナル抗体の製造方法により製造することができる。
　以下、モノクローナル抗体の製造方法の説明と併せて本発明のモノクローナル抗体を説明する。
＜モノクローナル抗体の製造方法＞
　前記モノクローナル抗体の製造方法は、免疫原を投与する免疫原投与工程と、抗体産生細胞を回収する抗体産生細胞回収工程と、ハイブリドーマを調製するハイブリドーマ調製工程と、ハイブリドーマを選択するハイブリドーマ選択工程と、抗体を回収する抗体回収工程とを含み、必要に応じて更にその他の工程を含む。
＜＜免疫原投与工程＞＞
　前記免疫原投与工程は、免疫原として、配列番号１に記載のアミノ酸配列を含み、ＥＢＡＧ９タンパク質の全長のアミノ酸配列は含まないポリペプチドをマウスに投与する工程である。
－免疫原－
　前記免疫原としては、前記配列番号１に記載のアミノ酸配列を含み、ＥＢＡＧ９タンパク質の全長のアミノ酸配列は含まないポリペプチドであれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記配列番号１に記載のアミノ酸配列のみからなるポリペプチド、前記配列番号１に記載のアミノ酸配列のＮ末端にＧｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ　Ｓ－ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（ＧＳＴ）タンパク質を融合させたポリペプチド（融合タンパク質）等が挙げられる。これらの中でも、前記配列番号１に記載のアミノ酸配列のＮ末端にＧｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ　Ｓ－ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（ＧＳＴ）タンパク質を融合させたポリペプチドが、水溶性が高く、精製が容易な点で、好ましい。
　前記配列番号１に記載のアミノ酸配列は、ヒトＥＢＡＧ９タンパク質の４８番目から２１３番目のアミノ酸に相当する。前記ヒトＥＢＡＧ９タンパク質は、２つの機能ドメインとして、Ｎ末端側の膜貫通ドメインと、Ｃ末端側のコイルドコイル（ｃｏｉｌｅｄ－ｃｏｉｌ）ドメインとを有している。前記配列番号１に記載のアミノ酸配列は、ヒトＥＢＡＧ９タンパク質の膜貫通ドメインは含まず、コイルドコイル（ｃｏｉｌｅｄ－ｃｏｉｌ）ドメイン含む１６６のアミノ酸配列からなる（図１参照）。
　前記配列番号１に記載のアミノ酸配列を含み、ＥＢＡＧ９タンパク質の全長のアミノ酸配列は含まないポリペプチドの調製方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記配列番号１に記載のアミノ酸配列をコードするＤＮＡをプラスミドに組み込み、前記プラスミドを宿主細胞に導入し、発現させることにより調製する方法等が挙げられる。
　前記配列番号１に記載のアミノ酸配列をコードするＤＮＡを調製する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、化学合成により調製する方法、ＥＢＡＧ９を発現している細胞からトータルＲＮＡを抽出し、ｃＤＮＡを合成することにより調製する方法等が挙げられる。
　前記プラスミドとしては、特に制限はなく、宿主細胞に応じて適宜選択することができ、例えば、ｐＧＥＸベクター等が挙げられる。
　前記宿主細胞としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、大腸菌等が挙げられる。前記宿主細胞の培養条件としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
　前記配列番号１に記載のアミノ酸配列を含み、ＥＢＡＧ９タンパク質の全長のアミノ酸配列は含まないポリペプチドの精製方法としては、特に制限はなく、公知の方法を適宜採用することができる。
　前記配列番号１に記載のアミノ酸配列のＮ末端にＧＳＴタンパク質を融合させたポリペプチドの調製方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、公知のＧＳＴ融合タンパク質発現用ベクターに前記配列番号１に記載のアミノ酸配列をコードするＤＮＡを組み込み、前記ベクターを宿主細胞に導入し、発現させることにより調製する方法等が挙げられる。
　前記配列番号１に記載のアミノ酸配列をコードするＤＮＡを調製する方法は、上記と同様の方法が挙げられる。
　前記ＧＳＴ融合タンパク質発現用ベクターとしては、特に制限はなく、宿主細胞に応じて適宜選択することができ、例えば、ｐＧＥＸベクター等が挙げられる。
　前記宿主細胞としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、大腸菌等が挙げられる。前記宿主細胞の培養条件としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
　前記配列番号１に記載のアミノ酸配列のＮ末端にＧＳＴタンパク質を融合させたポリペプチドの精製方法としては、特に制限はなく、公知の方法を適宜採用することができ、例えば、Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ　Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　４Ｂ（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）を用いて精製する方法等が挙げられる。
－マウス－
　前記マウスとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ＢＡＬＢ／ｃマウス等が挙げられる。
－投与－
　前記免疫原を投与する方法（マウスを免疫する方法）としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、アジュバントとともに投与することが、前記マウスの免疫原への免疫応答性を高めることができる点で、好ましい。
　前記アジュバントとしては、特に制限はなく、公知のアジュバントを適宜選択することができ、例えば、フロイント完全アジュバント、フロイント不完全アジュバント等が挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。
　前記免疫原の投与は、１回であってもよいし、複数回であってもよい。前記免疫原の投与を複数回行う場合に使用するアジュバントは、各回同一であってもよいし、異なっていてもよい。
　前記免疫原の投与を複数回行う場合の投与間隔としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
　前記免疫原の投与量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
　前記アジュバントの投与量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
　前記免疫原及びアジュバントの投与部位としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
＜＜抗体産生細胞回収工程＞＞
　前記抗体産生細胞回収工程は、前記マウスから抗体産生細胞を回収する工程である。
－抗体産生細胞回収－
　前記抗体産生細胞を回収する時期としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、最後の免疫原の投与から３日間後とする等が挙げられる。
　前記抗体産生細胞の回収方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、マウスの両足から肥大したリンパ節を取り出し、細胞をたたき出し、遠心して回収する方法等が挙げられる。
＜＜ハイブリドーマ調製工程＞＞
　前記ハイブリドーマ調製工程は、前記抗体産生細胞とミエローマとを細胞融合し、ハイブリドーマを調製する工程である。
－ミエローマ－
　前記ミエローマの由来としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、マウス由来のものが好ましい。
　前記マウス由来のミエローマとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、Ｐ３Ｕ１、Ｐ３Ｘ６３－Ａｇ８．６５３、ＳＰ２／Ｏ－Ａｇ１４等が挙げられる。
－細胞融合－
　前記細胞融合の方法としては、特に制限はなく、公知の方法を適宜選択することができ、例えば、ポリエチレングリコールを用いる方法（ＰＥＧ法）、センダイウイルスを用いる方法、電気融合装置を用いる方法等が挙げられる。
　前記細胞融合された細胞の選択方法としては、特に制限はなく、公知の方法を適宜選択することができ、例えば、選択培地として、ヒポキサン－アミノプテリン－チミジン培地（ＨＡＴ培地）を用いて細胞を培養する方法等が挙げられる。前記ＨＡＴ培地を用いることにより、親細胞株が死滅し、細胞融合された細胞のみが増殖する。
＜＜ハイブリドーマ選択工程＞＞
　前記ハイブリドーマ選択工程は、前記ハイブリドーマが産生する抗体と、配列番号１に記載のアミノ酸配列を含み、ＥＢＡＧ９タンパク質の全長のアミノ酸配列は含まないポリペプチドとを接触させる処理を少なくとも含み、必要に応じて更にその他の処理を含む。前記ハイブリドーマ選択工程により、前記ＥＢＡＧ９に結合する抗体を産生するハイブリドーマを選択することができる。
－選択－
　前記選択工程における処理としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ＥＬＩＳＡ法による処理、ウエスタンブロット法による処理等が挙げられる。これらは、単独で行なってもよいし、併用してもよいが、併用することが好ましい。
　前記処理の回数としては、特に制限はなく、１回であってもよいし、複数回であってもよい。
　前記ＥＬＩＳＡ法としては、例えば、前記免疫原として、前記配列番号１に記載のアミノ酸配列のＮ末端にＧＳＴタンパク質を融合させたポリペプチドを用いた場合には、例えば、前記配列番号１に記載のアミノ酸配列のＮ末端にＧＳＴタンパク質を融合させたポリペプチド、又はＧＳＴタンパク質を感作用プレートに固相化し、次いで、前記ハイブリドーマが産生する抗体が含まれる培養上清を加え反応させた後、酵素標識抗マウスＩｇＧを加えて反応させ、次いで、酵素基質（発色剤）を加え、発色させた後、波長４５０ｎｍの吸光度を測定する方法等が挙げられる。
　ここで、前記ＧＳＴタンパク質を固相化したプレートに対する反応性が高いものを除き、かつ、前記配列番号１に記載のアミノ酸配列のＮ末端にＧＳＴタンパク質を融合させたポリペプチドを固相化したプレートに対する反応性が高いものを選択することで、よりＥＢＡＧ９に特異的な抗体を産生しているハイブリドーマを選択することができる。
　前記ウエスタンブロット法としては、例えば、全長のヒトＥＢＡＧ９を発現する細胞の溶解液を調製し、前記溶解液をＳＤＳ－ＰＡＧＥにて分離後、一次抗体として、前記ハイブリドーマが産生する抗体を用い、二次抗体として、西洋ワサビパーオキシダーゼ標識された抗体を用い、発光シグナルを検出することにより行う方法等が挙げられる。
　前記ＥＬＩＳＡ法と組み合わせることにより、よりＥＢＡＧ９に特異的な抗体を産生しているハイブリドーマを選択することができる。
　前記選択したハイブリドーマを分離する方法としては、特に制限はなく、公知の方法を適宜選択することができ、例えば、限界希釈法、軟寒天法、蛍光励起セルソーターを用いる方法等が挙げられる。
＜＜抗体回収工程＞＞
　前記抗体回収工程は、前記選択されたハイブリドーマが産生する抗体を回収する工程である。
－抗体回収－
　前記選択されたハイブリドーマが産生する抗体を回収する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ハイブリドーマの培養上清から回収する方法、ハイブリドーマを移植したマウスの腹水から回収する方法等が挙げられる。
　前記ハイブリドーマの培養上清から回収する方法における前記ハイブリドーマの培養方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、静置培養、高密度培養、スピナーフラスコによる培養等が挙げられる。前記各培養の条件としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
　前記ハイブリドーマを移植したマウスの腹水から回収する方法としては、特に制限はなく、公知の方法を適宜選択することができ、例えば、プリスタン等の免疫抑制作用を有する物質を投与したマウスの腹腔内へ前記ハイブリドーマを移植し、約１週間後から３週間後に腹水を採取する方法等が挙げられる。
＜＜その他の工程＞＞
　前記その他の工程としては、本発明の効果を損なわない限り特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、精製工程等が挙げられる。
－精製工程－
　前記精製工程は、前記回収工程により回収された抗体を精製する工程である。
　前記精製の方法としては、特に制限はなく、公知の方法を適宜選択することができ、例えば、ＰｒｏｔｅｉｎＡを充填したカラムに培養上清をアプライし、精製する方法等が挙げられる。
＜モノクローナル抗体＞
　本発明のＥＢＡＧ９に対するモノクローナル抗体は、後述する試験例３に示すように、エピトープが配列番号１３に記載のアミノ酸配列内にある。
　本発明のＥＢＡＧ９に対するモノクローナル抗体は、ヒトＥＢＡＧ９に対するモノクローナル抗体として好適に利用可能である。
　また、前記ＥＢＡＧ９に対するモノクローナル抗体は、後述する内分泌療法薬耐性乳癌の予測方法、内分泌療法薬耐性乳癌の予測用診断薬又はキットとして好適に利用可能である。
（ハイブリドーマ及びその製造方法）
　本発明のハイブリドーマは、前記ＥＢＡＧ９に対するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマであって、以下のハイブリドーマの製造方法により製造することができる。
　以下、ハイブリドーマの製造方法の説明と併せて本発明のハイブリドーマを説明する。
＜ハイブリドーマの製造方法＞
　前記ハイブリドーマの製造方法は、免疫原を投与する免疫原投与工程と、抗体産生細胞を回収する抗体産生細胞回収工程と、ハイブリドーマを調製するハイブリドーマ調製工程と、ハイブリドーマを選択するハイブリドーマ選択工程とを含み、必要に応じて更にその他の工程を含む。
＜＜免疫原投与工程＞＞
　前記免疫原投与工程は、前記モノクローナル抗体の製造方法における免疫原投与工程と同様に行うことができる。
＜＜抗体産生細胞回収工程＞＞
　前記抗体産生細胞回収工程は、前記モノクローナル抗体の製造方法における抗体産生細胞回収工程と同様に行うことができる。
＜＜ハイブリドーマ調製工程＞＞
　前記ハイブリドーマ調製工程は、前記モノクローナル抗体の製造方法におけるハイブリドーマ調製工程と同様に行うことができる。
＜＜ハイブリドーマ選択工程＞＞
　前記ハイブリドーマ選択工程は、前記モノクローナル抗体の製造方法におけるハイブリドーマ選択工程と同様に行うことができる。
＜＜その他の工程＞＞
　前記その他の工程としては、本発明の効果を損なわない限り特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
＜ハイブリドーマ＞
　本発明のハイブリドーマＣ５７－８株は、独立行政法人製品評価技術基盤機構　特許微生物寄託センター（〒２９２－０８１８　千葉県木更津市かずさ鎌足２－５－８）に、寄託申請し、２０１２年８月１５日に国内寄託され、その後、２０１３年７月１１日にブダペスト条約に基づく国際寄託への移管請求がされ、受託番号：ＮＩＴＥ　ＢＰ－０１４０６として国際寄託されている。
（内分泌療法薬耐性乳癌の予測方法）
　本発明の内分泌療法薬耐性乳癌の予測方法は、ＥＢＡＧ９を測定する測定工程と、内分泌療法薬に耐性を有する乳癌か否かを評価する評価工程とを含み、必要に応じて更にその他の工程を含む。
＜測定工程＞
　前記測定工程は、被検体由来の試料中におけるＥＢＡＧ９を前記ＥＢＡＧ９に対するモノクローナル抗体を用いて測定する工程である。
＜＜被検体由来の試料＞＞
　前記被検体由来の試料としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、乳癌組織、子宮癌組織、前立腺癌組織、膀胱癌組織、腎癌組織、肺癌組織、肝癌組織、卵巣癌組織、大腸癌組織、胃癌組織、精巣腫瘍組織、脳腫瘍組織、甲状腺癌組織、胆嚢癌組織、胆管癌組織、膵癌組織、食道癌組織、喉咽頭癌組織、扁平上皮癌組織、悪性リンパ腫組織、悪性中皮腫組織、ページェット病組織等が挙げられる。前記被検体由来の試料の採取方法としては、特に制限はなく、公知の方法を適宜選択することができる。
＜＜測定＞＞
　前記測定の方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、免疫組織化学的染色による方法等が挙げられる。
　前記免疫組織化学的染色の方法としては、例えば、Ｄａｋｏ社のＥｎＶｉｓｉｏｎ＋　ｖｉｓｕａｌｉｚａｔｉｏｎ　ｋｉｔ等を用いて行うことができる。具体的には、乳癌組織切片を前処理した後、一次抗体として、前記ＥＢＡＧ９に対するモノクローナル抗体を用いて反応させ、次いで、二次抗体として、西洋ワサビ由来ペルオキシダーゼ標識したＥｎｖｉｓｉｏｎ＋　ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ　ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ－ｌａｂｅｌｅｄ　ｐｏｌｙｍｅｒを用いて反応させ、抗原抗体複合体を形成する。前記抗原抗体複合体の可視化の方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、Ｖｅｃｔｏｒ社の３，３’－ｄｉａｍｉｎｏｂｅｎｚｉｄｉｎｅ　（ＤＡＢ）　ｓｕｂｓｔｒａｔｅ　ｋｉｔ　ｆｏｒ　ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ等を用いて行うことができる。
　以上のようにして染色された乳癌組織切片を顕微鏡下で観察し、視野内の全細胞における染色された陽性細胞の存在の有無や、割合を測定する。
　なお、前記乳癌組織以外の組織の癌の場合も同様にして、免疫組織化学的染色を行うことができる。
＜評価工程＞
　前記評価工程は、前記測定結果を指標として、内分泌療法薬に耐性を有する乳癌か否かを評価する工程である。
＜＜内分泌療法薬＞＞
　前記内分泌療法薬としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、抗エストロゲン剤、アロマターゼ阻害剤等が挙げられる。
　前記抗エストロゲン剤としては、例えば、タモキシフェン、トレミフェン、ラロキシフェン等が挙げられる。
　前記アロマターゼ阻害剤としては、例えば、アナストロゾール、エキセメスタン、レトロゾール等が挙げられる。
　これらの中でも、本発明の予測方法では、タモキシフェンに対する耐性を獲得する乳癌か否かを好適に予測できる。
＜＜評価＞＞
　前記評価では、前記測定結果を指標として、ＥＢＡＧ９陽性の乳癌であると判断された場合に、内分泌療法薬耐性乳癌であると評価することができる。
　前記ＥＢＡＧ９陽性の乳癌であるか否かの判断方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、顕微鏡観察における視野内に、前記ＥＢＡＧ９に対するモノクローナル抗体に対する陽性細胞が検出された場合や、前記ＥＢＡＧ９に対するモノクローナル抗体陽性細胞の割合が５０％以上の場合にＥＢＡＧ９陽性の乳癌であると判断する方法等が挙げられる。これらの中でも、顕微鏡観察における視野内に前記ＥＢＡＧ９に対するモノクローナル抗体陽性細胞の割合が５０％以上の場合にＥＢＡＧ９陽性の乳癌であると判断する方法が好ましい。
　前記顕微鏡としては、例えば、光学顕微鏡（ＤＭＬＢ　１００Ｓ、Ｌｅｉｃａ社製）等が挙げられる。前記評価は、病理学者が行うことが好ましい。
　なお、前記乳癌組織以外の組織の癌の場合も同様にして、評価を行うことができる。
＜その他の工程＞
　前記その他の工程としては、本発明の効果を損なわない限り特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、被検体由来の試料を調製する試料調製工程等が挙げられる。
　前記試料調製工程の方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
（内分泌療法薬耐性乳癌の予測用診断薬又はキット）
　前記内分泌療法薬耐性乳癌の予測用診断薬又はキットは、前記した本発明のＥＢＡＧ９に対するモノクローナル抗体を含み、必要に応じて更にその他の構成を含む。
＜その他の構成＞
　前記その他の構成としては、本発明の効果を損なわない限り特に制限はなく、公知の診断薬又は診断キットに用いられている構成を目的に応じて適宜選択することができ、例えば、標識、緩衝液、プレート、反応停止液等が挙げられる。前記標識の具体例としては、酵素とその発色基質、放射性同位元素、発光物質、蛍光物質、着色物質等が挙げられる。
（腫瘍増殖抑制剤）
　前記腫瘍増殖抑制剤は、前記ＥＢＡＧ９に対するモノクローナル抗体を含み、必要に応じて更にその他の成分を含む。
＜ＥＢＡＧ９に対するモノクローナル抗体＞
　前記ＥＢＡＧ９に対するモノクローナル抗体の詳細としては、前記した本発明のＥＢＡＧ９に対するモノクローナル抗体の項目に記載したとおりである。
　前記腫瘍増殖抑制剤中の前記ＥＢＡＧ９に対するモノクローナル抗体の含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。また、前記腫瘍増殖抑制剤は、前記ＥＢＡＧ９に対するモノクローナル抗体そのものであってもよい。
＜その他の成分＞
　前記その他の成分としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、医薬的に許容され得る担体等が挙げられる。前記担体としても、特に制限はなく、例えば、剤形等に応じて適宜選択することができる。
　前記腫瘍増殖抑制剤中の前記その他の成分の含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
＜腫瘍＞
　前記腫瘍増殖抑制剤の適用対象となる腫瘍としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、乳癌、子宮癌、前立腺癌、膀胱癌、腎癌、肺癌、肝癌、卵巣癌、大腸癌、胃癌、精巣腫瘍、脳腫瘍、甲状腺癌、胆嚢癌、胆管癌、膵癌、食道癌、喉咽頭癌、扁平上皮癌、悪性リンパ腫、悪性中皮腫、ページェット病が好ましく、乳癌、前立腺癌、膀胱癌、腎癌がより好ましく、乳癌が特に好ましい。
　前記腫瘍増殖抑制剤は、前記ＥＢＡＧ９に対するモノクローナル抗体を含むので、腫瘍の増殖を効果的に抑制することができる。したがって、本発明は、前記ＥＢＡＧ９に対するモノクローナル抗体を腫瘍に作用させることを特徴とする、腫瘍の増殖抑制方法にも関する。
（癌転移抑制剤）
　前記癌転移抑制剤は、前記ＥＢＡＧ９に対するモノクローナル抗体を含み、必要に応じて更にその他の成分を含む。
＜ＥＢＡＧ９に対するモノクローナル抗体＞
　前記ＥＢＡＧ９に対するモノクローナル抗体の詳細としては、前記した本発明のＥＢＡＧ９に対するモノクローナル抗体の項目に記載したとおりである。
　前記癌転移抑制剤中の前記ＥＢＡＧ９に対するモノクローナル抗体の含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。また、前記癌転移抑制剤は、前記ＥＢＡＧ９に対するモノクローナル抗体そのものであってもよい。
＜その他の成分＞
　前記その他の成分としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、医薬的に許容され得る担体等が挙げられる。前記担体としても、特に制限はなく、例えば、剤形等に応じて適宜選択することができる。
　前記癌転移抑制剤中の前記その他の成分の含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
＜癌＞
　前記癌転移抑制剤の適用対象となる癌としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、乳癌、子宮癌、前立腺癌、膀胱癌、腎癌、肺癌、肝癌、卵巣癌、大腸癌、胃癌、精巣腫瘍、脳腫瘍、甲状腺癌、胆嚢癌、胆管癌、膵癌、食道癌、喉咽頭癌、扁平上皮癌、悪性リンパ腫、悪性中皮腫、ページェット病が好ましく、乳癌、前立腺癌、膀胱癌、腎癌がより好ましく、乳癌が特に好ましい。例えば、前記癌転移抑制剤は、癌の肺への転移を好適に抑制することができる。
　前記癌転移抑制剤は、前記ＥＢＡＧ９に対するモノクローナル抗体を含むので、癌の転移を効果的に抑制することができる。したがって、本発明は、前記ＥＢＡＧ９に対するモノクローナル抗体を用いることを特徴とする、癌の転移抑制方法にも関する。
（医薬）
　前記医薬は、前記腫瘍増殖抑制剤及び前記癌転移抑制剤の少なくともいずれかを含み、必要に応じて更にその他の成分を含む。
＜腫瘍増殖抑制剤、癌転移抑制剤＞
　前記腫瘍増殖抑制剤の詳細としては、前記した本発明の腫瘍増殖抑制剤の項目に記載したとおりである。
　前記癌転移抑制剤の詳細としては、前記した本発明の癌転移抑制剤の項目に記載したとおりである。
　前記医薬中の前記腫瘍増殖抑制剤及び前記癌転移抑制剤の少なくともいずれかの含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。また、前記医薬は、前記腫瘍増殖抑制剤そのものであってもよいし、前記癌転移抑制剤そのものであってもよいし、前記腫瘍抑制剤及び前記癌転移抑制剤のみからなるものであってもよい。
＜その他の成分＞
　前記その他の成分としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、医薬的に許容され得る担体等が挙げられる。前記担体としても、特に制限はなく、例えば、剤形等に応じて適宜選択することができる。
　前記医薬中の前記その他の成分の含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
＜適用対象＞
　前記医薬の適用対象としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、乳癌、子宮癌、前立腺癌、膀胱癌、腎癌、肺癌、肝癌、卵巣癌、大腸癌、胃癌、精巣腫瘍、脳腫瘍、甲状腺癌、胆嚢癌、胆管癌、膵癌、食道癌、喉咽頭癌、扁平上皮癌、悪性リンパ腫、悪性中皮腫、ページェット病が好ましく、乳癌、前立腺癌、膀胱癌、腎癌がより好ましく、乳癌が特に好ましい。
＜剤形＞
　前記腫瘍増殖抑制剤、前記癌転移抑制剤、及び前記医薬の剤形としては、特に制限はなく、例えば、後述するような所望の投与方法に応じて適宜選択することができ、例えば、経口固形剤（錠剤、被覆錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤等）、経口液剤（内服液剤、シロップ剤、エリキシル剤等）、注射剤（溶液、懸濁液、用事溶解用固形剤等）、軟膏剤、貼付剤、ゲル剤、クリーム剤、外用散剤、スプレー剤、吸入散剤等が挙げられる。
　前記経口固形剤としては、例えば、前記有効成分に、賦形剤、更には必要に応じて結合剤、崩壊剤、滑沢剤、着色剤、矯味・矯臭剤等の添加剤を加え、常法により製造することができる。
　前記賦形剤としては、例えば、乳糖、白糖、塩化ナトリウム、ブドウ糖、デンプン、炭酸カルシウム、カオリン、微結晶セルロース、珪酸等が挙げられる。
　前記結合剤としては、例えば、水、エタノール、プロパノール、単シロップ、ブドウ糖液、デンプン液、ゼラチン液、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルスターチ、メチルセルロース、エチルセルロース、シェラック、リン酸カルシウム、ポリビニルピロリドン等が挙げられる。
　前記崩壊剤としては、例えば、乾燥デンプン、アルギン酸ナトリウム、カンテン末、炭酸水素ナトリウム、炭酸カルシウム、ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸モノグリセリド、乳糖等が挙げられる。
　前記滑沢剤としては、例えば、精製タルク、ステアリン酸塩、ホウ砂、ポリエチレングリコール等が挙げられる。
　前記着色剤としては、例えば、酸化チタン、酸化鉄等が挙げられる。
　前記矯味・矯臭剤としては、例えば、白糖、橙皮、クエン酸、酒石酸等が挙げられる。
　前記経口液剤としては、例えば、前記有効成分に、矯味・矯臭剤、緩衝剤、安定化剤等の添加剤を加え、常法により製造することができる。
　前記矯味・矯臭剤としては、例えば、白糖、橙皮、クエン酸、酒石酸等が挙げられる。
　前記緩衝剤としては、例えば、クエン酸ナトリウムなどが挙げられる。前記安定化剤としては、例えば、トラガント、アラビアゴム、ゼラチン等が挙げられる。
　前記注射剤としては、例えば、前記有効成分に、ｐＨ調節剤、緩衝剤、安定化剤、等張化剤、局所麻酔剤等を添加し、常法により皮下用、筋肉内用、静脈内用等の注射剤を製造することができる。
　前記ｐＨ調節剤及び前記緩衝剤としては、例えば、クエン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、リン酸ナトリウム等が挙げられる。
　前記安定化剤としては、例えば、ピロ亜硫酸ナトリウム、ＥＤＴＡ、チオグリコール酸、チオ乳酸等が挙げられる。
　前記等張化剤としては、例えば、塩化ナトリウム、ブドウ糖等が挙げられる。
　前記局所麻酔剤としては、例えば、塩酸プロカイン、塩酸リドカイン等が挙げられる。
　前記軟膏剤としては、例えば、前記有効成分に、公知の基剤、安定剤、湿潤剤、保存剤等を配合し、常法により混合し、製造することができる。
　前記基剤としては、例えば、流動パラフィン、白色ワセリン、サラシミツロウ、オクチルドデシルアルコール、パラフィン等が挙げられる。
　前記保存剤としては、例えば、パラオキシ安息香酸メチル、パラオキシ安息香酸エチル、パラオキシ安息香酸プロピル等が挙げられる。
　前記貼付剤としては、例えば、公知の支持体に前記軟膏剤としてのクリーム剤、ゲル剤、ペースト剤等を、常法により塗布し、製造することができる。
　前記支持体としては、例えば、綿、スフ、化学繊維からなる織布、不織布、軟質塩化ビニル、ポリエチレン、ポリウレタン等のフィルム、発泡体シート等が挙げられる。
＜投与＞
　前記腫瘍増殖抑制剤、前記癌転移抑制剤、及び前記医薬の投与対象動物としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ヒト、マウス、ラット、ウシ、ブタ、サル、イヌ、ネコなどが挙げられるが、これらの中でも、ヒトが特に好ましい。
　前記腫瘍増殖抑制剤、前記癌転移抑制剤、及び前記医薬の投与方法としては、特に制限はなく、例えば、前記腫瘍増殖抑制剤、及び前記医薬の剤型、疾患の種類、患者の状態等に応じて、局所投与、全身投与のいずれかを選択することができる。
　例えば、局所投与においては、前記腫瘍増殖抑制剤、前記癌転移抑制剤、及び前記医薬の有効成分（前記ＥＢＡＧ９に対するモノクローナル抗体）を、所望の部位（例えば、腫瘍部位）に直接注入することにより投与することができる。前記注入には、注射等の従来公知の手法を適宜利用することができる。
　また、全身投与（例えば、経口投与、腹腔内投与、血液中への投与等）においては、前記腫瘍増殖抑制剤、前記癌転移抑制剤、及び前記医薬の有効成分（前記ＥＢＡＧ９に対するモノクローナル抗体）が所望の部位（例えば、腫瘍部位）まで安定に、かつ効率良く送達されるよう、従来公知の薬剤送達技術を適宜応用することが好ましい。
　前記腫瘍増殖抑制剤、前記癌転移抑制剤、及び前記医薬の投与量としては、特に制限はなく、投与対象である患者の年齢、体重、所望の効果の程度等に応じて適宜選択することができる。
　前記腫瘍増殖抑制剤、前記癌転移抑制剤、及び前記医薬の投与回数としては、特に制限はなく、投与対象である患者の年齢、体重、所望の効果の程度等に応じて、適宜選択することができる。
　前記腫瘍増殖抑制剤、前記癌転移抑制剤、及び前記医薬の投与時期としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記疾患に対して、予防的に投与されてもよいし、治療的に投与されてもよい。
（癌を予防乃至治療するための方法）
　前記腫瘍増殖抑制剤、前記癌転移抑制剤、及び前記医薬は、前記ＥＢＡＧ９に対するモノクローナル抗体を含むので、癌を患う個体に投与することにより、腫瘍の増殖の抑制や、癌の転移を抑制することができ、癌を予防乃至治療することができる。したがって、本発明は、個体に、前記腫瘍増殖抑制剤、前記癌転移抑制剤、及び前記医薬の少なくともいずれかを投与することを特徴とする、癌の予防乃至治療方法にも関する。
　前記癌としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、乳癌、子宮癌、前立腺癌、膀胱癌、腎癌、肺癌、肝癌、卵巣癌、大腸癌、胃癌、精巣腫瘍、脳腫瘍、甲状腺癌、胆嚢癌、胆管癌、膵癌、食道癌、喉咽頭癌、扁平上皮癌、悪性リンパ腫、悪性中皮腫、ページェット病が好ましく、乳癌、前立腺癌、膀胱癌、腎癌がより好ましく、乳癌が特に好ましい。
　以下、製造例、試験例を挙げて、本発明を説明するが、本発明は、以下の製造例、試験例に何ら限定されるものではない。
（製造例１：ハイブリドーマ及びモノクローナル抗体の製造）
＜プラスミド１の構築＞
　配列番号１に記載のアミノ酸配列（ヒトＥＢＡＧ９タンパク質（全長：２１３アミノ酸）のＮ末端側の４８番目のアミノ酸から２１３番目のアミノ酸に相当（Ｎ末端の１番目から４７番目のアミノ酸を欠く））に相当するｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ　ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を調製し、ＧＳＴタンパク質とＥＢＡＧ９タンパク質の４８番目から２１３番目のアミノ酸との融合タンパク質を発現するプラスミド（ｐＧＥＸ－ｈＥＢＡＧ９（４８－２１３））を以下のようにして作製した。
　ＥＢＡＧ９の全長ｃＤＮＡ（Ｗａｔａｎａｂｅ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｍｏｌ　Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ．　１８（１）：４４２－４４９，　１９９８）を鋳型として、下記配列番号２及び３の合成ＤＮＡをプライマーとしてＰＣＲ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　ｃｈａｉｎ　ｒｅａｃｔｉｏｎ）を行った。
配列番号２：５’－ｃｃｇｇａａｔｔｃｔｔａｔｔｃａｔｃａｇｔｔｃｃｔａａｇｃａｇａｃ－３’
配列番号３：５’－ｃｃｇｃｔｃｇａｇｔｔａｔｇａａａｇｔｔｔｃａｃａｃｃａａｔｔｔｔ－３’
　前記ＰＣＲにより得られた増幅産物を制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＸｈｏＩで消化した後、ＥｃｏＲＩ及びＸｈｏＩで消化したｐＧＥＸ－４Ｔ－１ベクター（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）に挿入し、ＧＳＴタンパク質とＥＢＡＧ９タンパク質の４８番目から２１３番目のアミノ酸との融合タンパク質を発現するプラスミド（ｐＧＥＸ－ｈＥＢＡＧ９（４８－２１３））を作製した。なお、前記融合タンパク質は、前記ＥＢＡＧ９タンパク質の４８番目から２１３番目のアミノ酸のＮ末端側にＧＳＴタンパク質が融合されている。
＜免疫原の調製＞
　前記プラスミド１を大腸菌ＢＬ２１（タカラバイオ株式会社）に形質転換した。
　前記形質転換した大腸菌を以下のようにして、培養、回収、精製し、配列番号４に記載のＧＳＴ融合ＥＢＡＧ９（４８－２１３）タンパク質を調製した。
　２００ｍＬのＬ－Ｂｒｏｔｈ（ＬＢ培地）２本に前記形質転換した大腸菌を入れ、３０℃で振盪培養し、６００ｎｍの吸光度が０．６～０．８になるまで培養した。その後、Ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ　β－Ｄ－１－ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（ＩＰＴＧ）を最終濃度０．１ｍＭになるように添加し、更に３０℃で２時間振盪培養した。
　前記培養液を５，０００ｒｐｍ、４℃、１０分間遠心した沈殿を５ｍＬの溶液Ａ（２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１０％　Ｇｌｙｃｅｒｏｌ、８０ｍＭ　ＫＣｌ、１ｍＭ　ＭｇＣｌ２、０．２ｍＭ　ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃ　ａｃｉｄ（ＥＤＴＡ）、０．５ｍＭ　ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ（ＤＴＴ）、０．５ｍＭ　ｐｈｅｎｙｌｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆｏｎｙｌ　ｆｌｕｏｒｉｄｅ（ＰＭＳＦ）、１％　ＴｒｉｔｏｎＸ－１００）で懸濁し、ソニケート（３０秒間を４回）した。
　次いで、１０，０００ｒｐｍ、４℃、１５分間遠心した上清に、５００μＬのグルタチオンセファロース４Ｂ（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）を加え、４℃で１時間混合して吸着させた後、遠心操作によってＰＢＳで３回洗浄した。最後の洗浄後、Ｅｌｕｔｉｏｎ　ｂｕｆｆｅｒ（５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、２０ｍＭ　ｒｅｄｕｃｅｄ　ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ）１ｍＬを入れて懸濁し、１０分間静置した後、５００×ｇ、４℃、５分間遠心してＧＳＴ融合ＥＢＡＧ９（４８－２１３）タンパク質が含まれる上清を回収した。この工程を３回繰り返し、２．５ｍｇのＧＳＴ融合ＥＢＡＧ９（４８－２１３）タンパク質を精製した。
　このようにして得られたＧＳＴ融合ＥＢＡＧ９（４８－２１３）タンパク質を免疫原とした。
＜免疫原投与工程＞
　前記精製したＧＳＴ融合ＥＢＡＧ９（４８－２１３）タンパク質の１ｍｇ／ｍＬ溶液と、アジュバントとを等量混和し、エマルジョンとした。前記エマルジョンをマウス（日本エスエルシー株式会社製）の足裏に５０μＬ投与した。前記免疫原の投与は、１週間おきに３回行った。なお、前記アジュバントは、１回目の投与では、Ｓｉｇｍａ社製のＣａｔ　Ｎｏ　Ｆ５８８１　Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ　Ａｄｊｕｖａｎｔ　Ｃｏｍｐｌｅｔｅを用い、２回目以降の投与では、Ｓｉｇｍａ社製のＣａｔ　Ｎｏ　Ｆ５５０６　Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ　Ａｄｊｕｖａｎｔ　Ｉｎｃｏｍｐｌｅｔｅを使用した。
＜抗体産生細胞回収工程＞
　前記免疫原投与工程の最後の免疫原の投与から３日間後に免疫したマウスの両足から肥大したリンパ節を取り出し、細胞をたたき出し、１，４００ｒｐｍで５分間遠心して細胞を回収した。
＜ハイブリドーマ調製工程＞
　ミエローマ細胞は、Ｐ３Ｕ１細胞を用い、培養フラスコで増殖させたもの（７５ｃｍ２フラスコ４本分）を回収した。
　前記抗体産生細胞回収工程で回収した細胞（マウス２匹から回収）と、前記Ｐ３Ｕ１とを混和し、１，４００ｒｐｍで５分間遠心した。ペレットにＰＥＧ（ポリエチレングリコール）溶液（ＲＰＭＩ培地で等量希釈）を加え、細胞融合を行った。
　前記細胞融合を行った細胞を洗浄し、次いで、細胞を懸濁した後、９６穴プレートに播種した。コロニー形成が確認されたら、後述のハイブリドーマ選択工程における一次スクリーニングを行った。なお、９６穴プレートにおける培地は、ＨＡＴ培地（ＨＡＴ／１５％ＦＢＳ／ＰＳ／ＲＰＭＩ；アミノプテリン（ＳＩＧＭＡ社製　Ｃａｔ．Ｎｏ．Ａ３４１１、ＨＴ（ＧＩＢＣＯ社製　Ｃａｔ．Ｎｏ　１１０６７－０３０））を用いた。
＜ハイブリドーマ選択工程＞
－一次スクリーニング－
　前記一次スクリーニングはＥＬＩＳＡにより行った。
　まず、前記免疫原とした融合タンパク質、又はＧＳＴタンパク質をＰＢＳ（０．０１ｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝生理食塩水）で希釈し、５μｇ／ｍＬに調製した後、感作用プレート（ＮＵＮＣ社製　Ｃａｔ　Ｎｏ　４６８６６７）に５０μＬ／穴分注し、４℃で一晩静置した。その後、タンパク質溶液を除去し、ブロッキング　バッファー（株式会社医学生物学研究所製）を１００μＬ／穴分注し、４℃で一晩静置した。なお、前記ＧＳＴタンパク質は、前記免疫原とした融合タンパク質の調製において、プラスミド１をｐＧＥＸ－４Ｔ－１ベクター（ＥＢＡＧ９の部分配列が組み込まれていないベクター）に代えた以外は、前記免疫原とした融合タンパク質の調製と同様にして、調製した。
　前記コロニー形成が確認された各培養上清を５０μＬ／穴加え、室温で６０分間反応させた。ＰＢＳで３回洗浄後、ＰＯＤ　ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ　ａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ　ＩｇＧ（＃３３０、株式会社医学生物学研究所製）を青バッファー（株式会社医学生物学研究所製希釈液）で１０，０００倍に希釈したものを５０μＬ／穴加え、室温で６０分間反応させた。３回洗浄後、発色基質（株式会社医学生物学研究所製）を加え１０分間から１５分間発色させた。その後、４５０ｎｍ及び６２０ｎｍで吸光度測定を行った。なお、前記６２０ｎｍはバックグラウンド測定用であり、４５０ｎｍでサンプルの評価を行った。
　前記一次スクリーニングを行い、最終的に、前記免疫原とした融合タンパク質のプレートに対する反応性が、吸光度測定の結果、ＯＤ値０．２以上であり、ＧＳＴタンパク質のプレートに対する反応性が、ＯＤ値０．２以下であるハイブリドーマ株が３２種得られた。表１－１に免疫原とした融合タンパク質のプレートに対する反応性の測定結果を示し、表１－２にＧＳＴタンパク質のプレートに対する反応性の測定結果を示し、表１－３にハイブリドーマのクローンリストを示す。表１－３中、カッコ書きは選択されなかったハイブリドーマ株を示し、それ以外は選択されたハイブリドーマ株を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
－ウエスタンブロット解析－
－－細胞溶解液の調製－－
－－－プラスミド２の構築－－－
　ヒトＥＢＡＧ９（ｈＥＢＡＧ９）タンパク質（全長、ただし１番目のメチオニンを除く）のＮ末端にＦｌａｇタグを付加した融合タンパク質に相当するＤＮＡ配列をｐｃＤＮＡ３プラスミドにサブクローニングし、発現プラスミド２（ｐＣＤＮＡ３－ＦＬＡＧ－ｈＥＢＡＧ９）を以下のようにして構築した。
　ＥＢＡＧ９の全長ｃＤＮＡ（Ｗａｔａｎａｂｅ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｍｏｌ　Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ．　１８（１）：４４２－４４９，　１９９８）を鋳型として、下記配列番号５及び６の合成ＤＮＡをプライマーとしてＰＣＲ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　ｃｈａｉｎ　ｒｅａｃｔｉｏｎ）を行った。
配列番号５：５’－ｃｃｇｇａａｔｔｃｇｃｃａｔｃａｃｃｃａｇｔｔｔｃｇｇｔｔａｔｔｔ－３’
配列番号６：５’－ｃｃｇｃｔｃｇａｇｔｔａｔｇａａａｇｔｔｔｃａｃａｃｃａａｔｔｔｔ－３’
　前記ＰＣＲにより得られた増幅産物を制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＸｈｏＩで消化した後、ＥｃｏＲＩ及びＸｈｏＩで消化したｐｃＤＮＡベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）に挿入した。更に、Ｆｌａｇタグ配列をＢａｍＨＩ認識配列（５’側）とＥｃｏＲＩ認識配列（３’側）で挟んだ配列を有する合成ＤＮＡを作製し、前記ベクターのＢａｍＨＩとＥｃｏＲＩ部位に挿入して、ｐｃＤＮＡ３－ＦＬＡＧ－ｈＥＢＡＧ９を作製した。なお、前記融合タンパク質は、前記ＥＢＡＧ９タンパク質の２番目から２１３番目のアミノ酸のＮ末端側にＦｌａｇ配列が融合されている（配列番号７参照）。
－－－細胞溶解液１の調製－－－
　ヒト腎由来２９３Ｔ細胞にベクターｐｃＤＮＡ３のみ（コントロール）をトランスフェクションした。得られた細胞をＰＢＳで洗浄した後、スクレイプして培養ディッシュより剥がして集め、これを溶解バッファー（２０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．９）、３００ｍＭ　ＮａＣｌ、１ｍＭ　ＥＤＴＡ、１５％　ｇｌｙｃｅｒｏｌ、０．５％　ＮＰ－４０、１ｍＭ　Ｎａ３Ｖｏ４、１ｍＭ　ＰＭＳＦ、１ｍＭ　ＤＴＴ）に懸濁して４℃、５０分間ゆるやかに振盪し、１４，０００ｒｐｍ、４℃、５分間遠心した上清を回収し、細胞溶解液１を調製した。
－－－細胞溶解液２の調製－－－
　細胞溶解液１の調製において、ベクターｐｃＤＮＡ３を用いていた点を、前記発現プラスミド２に代えた以外は、前記細胞溶解液１の調製と同様にして、細胞溶解液２を調製した。
－－ウエスタンブロット－－
　前記各細胞溶解液２０μｇをＳＤＳ－ＰＡＧＥにて分離後、前記一次スクリーニングにより選択されたハイブリドーマＢ１５、Ｂ１６、Ｃ３３、Ｃ３５、Ｃ３６、Ｃ５７、Ｃ６３、Ｂ６５、Ｃ７６、Ｃ７７、Ｃ８０及びＣ９５が産生する抗体を一次抗体（１００倍希釈）として用い、以下の手順により、ウエスタンブロットを行った。なお、コントロールとして、一次抗体として、抗Ｆｌａｇ抗体（３，０００倍希釈）を用いたものも試験した。
　前記ウエスタンブロットは、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ後にＩｍｍｏｂｉｌｏｎ－Ｐ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）へブロッティングした膜を、前記一次抗体とともに室温で１時間、又は４℃で１２時間、ＴＢＳＴバッファー（２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ　ＮａＣｌ、０．１％　Ｔｗｅｅｎ－２０）中で静置した後、二次抗体として、ＨＲＰ（西洋ワサビパーオキシダーゼ）標識された二次抗体（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）とともに室温で１時間反応し、その後、発光シグナルをＥＣＬ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｓｙｓｔｅｍ（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）により検出した。
　結果を図２に示す。図２中、Ｂ１５、Ｂ１６、Ｃ３３、Ｃ３５、Ｃ３６、Ｃ５７、Ｃ６３、Ｂ６５、Ｃ７６、Ｃ７７、Ｃ８０及びＣ９５は抗体を産生するハイブリドーマの株を示し、Ｆｌａｇ　Ａｂ．は抗Ｆｌａｇ抗体を用いたものを示し、「１」は、細胞溶解液１を示し、「２」は細胞溶解液２を示す。
　図２から、ＥＬＩＳＡによって反応性が高かったものが、ウエスタンブロット解析においても強いシグナルが観察される傾向であった。その中でも、Ｃ５７が産生する抗体は、抗ＥＢＡＧ９抗体として抗体価及び特異性が最も高いものであった。
－単クローン化－
　前記図２の結果から、強いシグナルが観察されたＢ１６、Ｃ３５、及びＣ５７について９６穴プレートに１細胞／穴となるように希釈して培養し、複数の単クローン（Ｂ１６－１、Ｂ１６－２、Ｂ１６－６、Ｂ１６－７、Ｃ３５－１、Ｃ３５－５、Ｃ３５－６、Ｃ３５－７、Ｃ５７－２、Ｃ５７－４、Ｃ５７－６、Ｃ５７－８）を得た。
　前記各単クローンについて、前記一次スクリーニングにおけるウエスタンブロット解析と同様にして、ウエスタンブロット解析を行った。なお、コントロールには、一次抗体として、ウサギポリクローナル抗マウスＥＢＡＧ９抗体（４，０００倍希釈、Ｔｓｕｃｈｉｙａ　ｅｔ　ａｌ，　Ｂｉｏｃｈｅｍ　Ｂｉｏｐｈｙｓ　Ｒｅｓ　Ｃｏｍｍｕｎ．　２８４（１）：２－１０，　２００１）を用いた。
　結果を図３に示す。図３中、Ｂ１６－１、Ｂ１６－２、Ｂ１６－６、Ｂ１６－７、Ｃ３５－１、Ｃ３５－５、Ｃ３５－６、Ｃ３５－７、Ｃ５７－２、Ｃ５７－４、Ｃ５７－６、Ｃ５７－８は抗体を産生するハイブリドーマの株を示し、Ｍｏｕｓｅ　ＥＢＡＧ９　Ａｂ．はウサギポリクローナル抗マウスＥＢＡＧ９抗体を用いたものを示し、「１」は、細胞溶解液１を示し、「２」は細胞溶解液２を示す。
　図３から、Ｃ５７株に由来するＣ５７－８株が産生する抗体が、最も反応性に優れた抗体であることが明らかになった。
　前記ハイブリドーマＣ５７－８株は、独立行政法人製品評価技術基盤機構　特許微生物寄託センター（〒２９２－０８１８　千葉県木更津市かずさ鎌足２－５－８）に、寄託申請し、２０１２年８月１５日に国内寄託され、その後、２０１３年７月１１日にブダペスト条約に基づく国際寄託への移管請求がされ、受託番号：ＮＩＴＥ　ＢＰ－０１４０６として国際寄託されている。
＜抗体回収工程＞
　得られたハイブリドーマＣ５７－８株のクローンの培養量を１０Ｌまで増やし、１．５ヶ月間培養した後、培養上清を回収し、抗体を回収した。
＜精製工程＞
　前記培養上清に含まれる抗体を以下のようにして精製した。まず、ＰｒｏｔｅｉｎＡを充填したカラムに、回収した培養上清をフィルターでろ過したものをアプライし、抗体を、ＰｒｏｔｅｉｎＡを充填したカラム吸着させた。前記カラムをＰＢＳで洗浄後、溶出バッファー（０．５Ｍ　アルギニン、ｐＨ４．１）を入れて、抗体をフラクションごとに回収した。
　回収した抗体はすぐに、１Ｍ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）により中和した。
　得られたフラクションのうち、ＰＯＤ　ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ　ａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ　ＩｇＧとの反応性において吸光度の高いフラクションをプールした。プールした精製抗体をＰＢＳに対して透析し、ＩｇＧ分画の精製されたＥＢＡＧ９に対するモノクローナル抗体（「マウスモノクローナル抗ＥＢＡＧ９抗体」と称することもある）を得た。
（試験例１：抗体の評価）
　前記製造例１で得られたマウスモノクローナル抗ＥＢＡＧ９抗体について、ウエスタンブロット法により、既存の各種抗体と比較し、評価した。既存の各種抗体としては、以下の３種類を用意した。なお、ＲＣＡＳ１とは、ＥＢＡＧ９の別名である。
－既存の各種抗体－
（Ａ）　ウサギポリクローナル抗マウスＥＢＡＧ９抗体（Ｔｓｕｃｈｉｙａ　ｅｔ　ａｌ，　Ｂｉｏｃｈｅｍ　Ｂｉｏｐｈｙｓ　Ｒｅｓ　Ｃｏｍｍｕｎ．　２８４（１）：２－１０，　２００１）
（Ｂ）　マウスモノクローナル抗ＲＣＡＳ１抗体（Ｃａｔ＃　ＡＭ７５－１００ＵＧ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）（以下、「ＲＣＡＳ１（１）抗体」と称することがある。）
（Ｃ）　マウスモノクローナル抗ＲＣＡＳ１抗体（Ｃａｔ　Ｄ０６０－３Ｈ、株式会社医学生物学研究所製）（以下、「ＲＣＡＳ１（２）抗体」と称することがある。）
＜ウエスタンブロット法＞
－抗体希釈溶液の調製－
　前記マウスモノクローナル抗ＥＢＡＧ９抗体、及び既存の各種抗体について、各抗体の濃度がほぼ同等となるようにＴＢＳＴバッファーで希釈し、希釈溶液を調製した。前記希釈は、前記製造例１で得られたマウスモノクローナル抗ＥＢＡＧ９抗体及び前記（Ａ）のウサギ抗マウスＥＢＡＧ９抗体は、５，０００倍希釈、前記（Ｂ）及び（Ｃ）のマウスモノクローナル抗ＲＣＡＳ１抗体は、２，０００倍希釈とした。
－細胞溶解液の調製－
　前記製造例１のハイブリドーマ選択工程におけるウエスタンブロット解析と同様にして、プラスミド２、細胞溶解液１、及び細胞溶解液２を調製した。
－ウエスタンブロット－
　前記抗体希釈溶液を用いた点以外は、前記製造例１のハイブリドーマ選択工程におけるウエスタンブロットと同様にして、ウエスタンブロットを行った。
　結果を図４に示す。図４中、「１」は、細胞溶解液１を示し、「２」は細胞溶解液２を示す。
　図４から、前記製造例１で得られたマウスモノクローナル抗ＥＢＡＧ９抗体（Ｃ５７－８由来の精製モノクローナル抗ヒトＥＢＡＧ９抗体）は、外来性のタグ付きのＥＢＡＧ９タンパク質に加え、内在性のＥＢＡＧ９タンパク質をも検出し、しかも非特異的なバンドがほとんど見られなかった。一方、前記ウサギポリクローナル抗マウスＥＢＡＧ９抗体は、外来性のタグ付きのＥＢＡＧ９タンパク質及び内在性のＥＢＡＧ９タンパク質の両者のバンドを検出できるものの、非特異的なバンドも数多く検出した。前記ＲＣＡＳ１（１）抗体は、外来性のタグ付きのＥＢＡＧ９タンパク質を検出できるものの、同様の条件で内在性のＥＢＡＧ９タンパク質は検出できず感度が低かった。前記ＲＣＡＳ１（２）抗体については、同様の条件で外来性のタグ付きのＥＢＡＧ９タンパク質及び内在性のＥＢＡＧ９タンパク質ともに検出できず感度が低かった。
　したがって、前記製造例１で得られたマウスモノクローナル抗ＥＢＡＧ９抗体は、十分な感度を有することに加え、極めて特異性が高く、バックグラウンドが低いことが示された。
（試験例２：ＥＢＡＧ９免疫反応陽性と、乳癌患者の予後不良との相関）
　前記製造例１で得られたマウスモノクローナル抗ＥＢＡＧ９抗体を用い、再発乳癌患者に対する内分泌療法効果についてのケース－コントロール　スタディを行った。
＜患者特性と組織選択＞
　１００症例の乳癌患者を日本国内の３施設（国立がんセンター、国立四国がんセンター、東京都立駒込病院）より収集した。これらの患者は、１９８９年から１９９８年の間に乳癌と診断され、かつ術後タモキシフェン治療を実施後、再発情報が明らかであり、内分泌療法による予後を解析するために好適な症例群である。
　本試験例２では、術後内分泌療法を行った後、５年のフォローアップ期間内で遠隔転移を認めた症例を再発群、認めなかった症例を無再発群と規定した。
　サンプルとして、生検あるいは手術により摘出された乳癌組織をホルマリン固定・パラフィン包埋したサンプルを用いた。
　なお、本試験は、参加施設並びに埼玉医科大学の倫理委員会の承認を受け、インフォームド　コンセントを得ている。患者の臨床病理学的特性を表２に示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
 　表２中、「ＥＲα」は、エストロゲンレセプターαを示し、「ＰｇＲ」は、プロゲステロンレセプターを示す。
＜免疫組織化学的染色＞
　乳癌組織におけるＥＢＡＧ９発現の免疫組織化学的解析は、Ｄａｋｏ社のＥｎＶｉｓｉｏｎ＋　ｖｉｓｕａｌｉｚａｔｉｏｎ　ｋｉｔを用い、以下のようにして行った。
　厚み６μｍの乳癌組織切片を脱パラフィン処理、段階的エタノール系列による再親水処理を行った後、０．０５％　Ｔｗｅｅｎ－２０含有トリス緩衝リン酸溶液（ＴＢＳＴ）により洗浄した。その後、抗原の賦活化処理として、１０ｍＭのクエン酸ナトリウム溶液（ｐＨ　６．０）に浸漬した切片スライドにオートクレーブ機器を用いた熱処理（１２１℃、５分間）を施した。その後、乳癌組織内の内在性ペルオキシダーゼ活性を阻害するため、切片を０．３％の過酸化水素水（Ｈ２Ｏ２）で３０分間処理したのち、非特異的抗原をマスクするため１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）で３０分間処理した。次いで、一次抗体として、前記製造例１で得られたマウスモノクローナル抗ＥＢＡＧ９抗体を２００倍希釈したマウスモノクローナル抗ＥＢＡＧ９抗体溶液を１５０μＬ添加し、４℃で一晩反応させた。ＴＢＳＴで洗浄後、二次抗体として、西洋ワサビ由来ペルオキシダーゼ標識したＥｎｖｉｓｉｏｎ＋　ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ　ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ－ｌａｂｅｌｅｄ　ｐｏｌｙｍｅｒを１５０μＬ添加し、室温で１時間反応させた。抗原抗体複合体の可視化は、Ｖｅｃｔｏｒ社の３，３’－ｄｉａｍｉｎｏｂｅｎｚｉｄｉｎｅ　（ＤＡＢ）　ｓｕｂｓｔｒａｔｅ　ｋｉｔ　ｆｏｒ　ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅを用いた。なお、前記一次抗体の陰性コントロールとして、マウス免疫グロブリン（ＩｇＧ　マウス血清由来、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社製）を用いた。
　前記染色結果の例を図５及び図６に示す。図５及び図６中、スケールバーは、１００μｍを表す。図５及び図６の結果から、ＥＢＡＧ９の免疫反応性は主に乳癌細胞の細胞質で観察された。一方、ほぼ全ての乳腺上皮細胞、筋上皮細胞、間質細胞におけるＥＢＡＧ９免疫反応性は乳癌細胞に比べ弱いかあるいは陰性であった。
＜免疫組織化学的染色結果の判定＞
　前記染色した切片スライドを顕微鏡下で観察し、評価した。前記評価では、視野内全細胞における染色された陽性細胞の割合（以下、「免疫反応性スコア」と称することがある。）を評価した。前記評価は、２名が独立に行い、免疫反応性スコアを算定した。
　なお、２名の評価者の間で免疫反応性スコアが異なった場合、第３の評価者が更に判定に加わり、３者の平均した結果を用いた。
　乳癌組織におけるＥＢＡＧ９免疫反応性と、臨床病理学的パラメーターとの間の相関を明らかにするため、ＥＢＡＧ９陽性細胞の割合が５０％以上の乳癌患者をＥＢＡＧ９陽性とし、一方５０％未満の乳癌患者を陰性とした。
＜統計解析＞
　前記免疫反応性スコアと、臨床病理学的パラメーターとの相関の解析は、カイ２乗検定により行った。Ｐ値が０．０５未満の場合、統計学的に有意であるとした。２群間の差異については、Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ　ｔ－ｔｅｓｔにより解析した。無再発生存期間及び全生存期間における予後曲線は、Ｋａｐｌａｎ－Ｍｅｉｅｒ法により作成し、ｌｏｇ－ｒａｎｋ　（Ｍａｎｔｅｌ－Ｃｏｘ）　ｔｅｓｔにより評価した。
　単変量解析及び多変量解析については、ＳＡＳ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ社のソフトウェアＪＭＰ９．０を用いてロジスティック回帰分析により行った。Ｐ値が０．０５未満を統計学的有意と判定した。
　統計学的解析の結果、細胞質におけるＥＢＡＧ９の免疫反応性は、再発群で有意に上昇していた（ｐ＝０．０１３）（表３参照）。同様に、Ｋａｐｌａｎ－Ｍｅｉｅｒ生存曲線解析の結果、ＥＢＡＧ９陽性患者は陰性患者に比べ、短い無再発生存期間を有していた（ｐ＝０．０２０５、５年間；ｐ＝０．００２４、全フォローアップ期間）（図７参照）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　更に、この乳癌患者の集団において、様々な臨床病理学的パラメーターの予後に対する統計学的有意性を、ロジスティック回帰分析により検討を行った。結果を表４に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
　まず、単変量解析（ｕｎｉｖａｒｉａｔｅ）を行ったところ、腫瘍径（ｐＴ）、ＥＲα、ＰｇＲ、年齢の各因子との相関はみられなかったが、ＥＢＡＧ９陰性とリンパ節転移状態の２つの因子について、５年無再発生存との負の相関関係が有意に観察され、危険因子となることが判明した。
　この結果を受けた多変量解析（Ｍｕｌｔｉｖａｒｉａｔｅ）においても、ＥＢＡＧ９陰性とリンパ節転移陰性のいずれも、より長期の無再発生存を予測しうる独立した予後予測因子であることが示唆された（ｏｄｄｓ　ｒａｔｉｏ，　０．２２　ａｎｄ　０．３７、ｐ－ｖａｌｕｅ，　０．０３５　ａｎｄ　０．０２５）。
　これらの結果から、ＥＢＡＧ９の免疫反応性は術後内分泌療法を受けた乳癌患者の予後不良因子として機能しうることが初めて示された。
（試験例３：ＥＢＡＧ９に対するモノクローナル抗体のエピトープの同定）
　前記製造例１で得られたマウスモノクローナル抗ＥＢＡＧ９抗体のエピトープを以下のようにして同定した。
＜エピトープの同定－１＞
－プラスミド－
　プラスミドとして、前記製造例１で作製したプラスミド１と、以下のようにして構築したプラスミド３及び４を用意した。
－－プラスミド３の構築－－
　ＧＳＴタンパク質とヒトＥＢＡＧ９タンパク質の４８番目から１３６番目のアミノ酸との融合タンパク質を発現するプラスミド（ｐＧＥＸ－ｈＥＢＡＧ９（４８－１３６））を以下のようにして作製した。
　前記製造例１で作製したプラスミド１（ｐＧＥＸ－ｈＥＢＡＧ９（４８－２１３））を制限酵素ＢｇｌＩＩとＸｈｏＩで切断することによって、ヒトＥＢＡＧ９タンパク質のＮ末端側の１３７番目のアミノ酸から２１３番目のアミノ酸に相当するｃＤＮＡを除き、次いで、ＤＮＡ　Ｂｌｕｎｔｉｎｇ　Ｋｉｔ（ＴＡＫＡＲＡ社製）を用いて平滑末端化した後、セルフライゲーションを行ってＧＳＴタンパク質とＥＢＡＧ９タンパク質の４８番目から１３６番目のアミノ酸との融合タンパク質を発現するプラスミド（ｐＧＥＸ－ｈＥＢＡＧ９（４８－１３６））を作製した。なお、前記融合タンパク質は、前記ＥＢＡＧ９タンパク質の４８番目から１３６番目のアミノ酸のＮ末端側にＧＳＴタンパク質が融合されている（配列番号８参照）。
－－プラスミド４の構築－－
　ヒトＥＢＡＧ９タンパク質のＮ末端側の１２８番目から２１３番目のアミノ酸に相当するｃＤＮＡを調製し、ＧＳＴタンパク質とＥＢＡＧ９タンパク質の１２８番目から２１３番目のアミノ酸との融合タンパク質を発現するプラスミド（ｐＧＥＸ－ｈＥＢＡＧ９（１２８－２１３））を以下のようにして作製した。
　ＥＢＡＧ９の全長ｃＤＮＡ（Ｗａｔａｎａｂｅ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｍｏｌ　Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ．　１８（１）：４４２－４４９，　１９９８）を鋳型として、下記配列番号９及び１０の合成ＤＮＡをプライマーとしてＰＣＲを行った。
配列番号９：５’－ｃｃｇｇａａｔｔｃｔｃｔａｇｔａｇａｔｔａｇｃａｇｃｔａｃａｃａａ－３’
配列番号１０：５’－ｃｃｇｃｔｃｇａｇｔｔａｔｇａａａｇｔｔｔｃａｃａｃｃａａｔｔｔｔ－３’
　前記ＰＣＲにより得られた増幅産物を制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＸｈｏＩで消化した後、ＥｃｏＲＩ及びＸｈｏＩで消化したｐＧＥＸ－４Ｔ－１ベクター（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）に挿入し、ＧＳＴタンパク質とＥＢＡＧ９タンパク質の１２８番目から２１３番目のアミノ酸との融合タンパク質を発現するプラスミド（ｐＧＥＸ－ｈＥＢＡＧ９（１２８－２１３））を作製した。なお、前記融合タンパク質は、前記ＥＢＡＧ９タンパク質の１２８番目から２１３番目のアミノ酸のＮ末端側にＧＳＴタンパク質が融合されている（配列番号１１参照）。
－細胞抽出液の調製－
　前記プラスミド１、３、及び４のそれぞれを用い、以下のようにして細胞抽出液を調製した。
　大腸菌株ＤＨ５αに前記各プラスミドを導入し、ＬＢ培地で一晩培養した後、遠心分離によって大腸菌を回収し、サンプルバッファーで懸濁して細胞抽出液を作製した。
－ウエスタンブロット－
　前記各細胞抽出液をＳＤＳ－ＰＡＧＥした後、Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ－Ｐ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）へブロッティングした膜を、前記製造例１で得られたマウスモノクローナル抗ＥＢＡＧ９抗体とともに室温で１時間、又は４℃で１２時間、ＴＢＳＴバッファー（２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ　ＮａＣｌ、０．１％　Ｔｗｅｅｎ－２０）中で静置した後、二次抗体として、ＨＲＰ（西洋ワサビパーオキシダーゼ）標識された二次抗体（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）とともに室温で１時間反応し、その後、発光シグナルをＥＣＬ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｓｙｓｔｅｍ（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）により検出した。
　なお、コントロールとして、前記製造例１で得られたマウスモノクローナル抗ＥＢＡＧ９抗体の代わりにＧＳＴに対する抗体を用い、同様にしてウエスタンブロットを行った。
　結果を図８に示す。図８中、左側はマウスモノクローナル抗ＥＢＡＧ９抗体（ＥＢＡＧ９モノクローナル抗体）を用いた場合の結果を示し、右側はＧＳＴに対する抗体（ＧＳＴ抗体）を用いた場合の結果を示す。
　図８に示すように、ｐＧＥＸ－ｈＥＢＡＧ９（４８－２１３）とｐＧＥＸ－ｈＥＢＡＧ９（１２８－２１３）を導入した大腸菌の抽出液ではＧＳＴ－ＥＢＡＧ９融合タンパク質が検出されたが、ｐＧＥＸ－ｈＥＢＡＧ９（４８－１３６）を導入した大腸菌の抽出液ではＧＳＴ－ＥＢＡＧ９融合タンパク質が検出されなかった。したがって、まず、マウスモノクローナル抗ＥＢＡＧ９抗体のエピトープは、ヒトＥＢＡＧ９タンパク質のＮ末端側の１２８番目から２１３番目のアミノ酸配列の間に存在することが示された。
＜エピトープの同定－２＞
－ペプチド－
　以下の各ペプチドを化学合成により用意した（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ社製）。
（１）　ヒトＥＢＡＧ９タンパク質のＮ末端側の１２８番目から１５７番目のアミノ酸に相当する３０アミノ酸からなるペプチド（以下、「１２８－１５７」と称することがある）。
Ｎ末端－ＳＳＲＬＡＡＴＱＤＬＰＦＩＨＱＳＳＥＬＧＤＬＤＴＷＱＥＮＴＮ－Ｃ末端（配列番号１２参照）
（２）ヒトＥＢＡＧ９タンパク質のＮ末端側の１４８番目から１７７番目のアミノ酸に相当する３０アミノ酸からなるペプチド（以下、「１４８－１７７」と称することがある）。
Ｎ末端－ＤＬＤＴＷＱＥＮＴＮＡＷＥＥＥＥＤＡＡＷＱＡＥＥＶＬＲＱＱＫ－Ｃ末端（配列番号１３参照）
（３）ヒトＥＢＡＧ９タンパク質のＮ末端側の１６７番目から１９６番目のアミノ酸に相当する３０アミノ酸からなるペプチド（以下、「１６７－１９６」と称することがある）。
Ｎ末端－ＷＱＡＥＥＶＬＲＱＱＫＬＡＤＲＥＫＲＡＡＥＱＱＲＫＫＭＥＫＥ－Ｃ末端（配列番号１４参照）
（４）ヒトＥＢＡＧ９タンパク質のＮ末端側の１８７番目から２１３番目のアミノ酸に相当する２７アミノ酸からなるペプチド（以下、「１８７－２１３」と称することがある）。
Ｎ末端－ＥＱＱＲＫＫＭＥＫＥＡＱＲＬＭＫＫＥＱＮＫＩＧＶＫＬＳ－Ｃ末端（配列番号１５参照）
－細胞抽出物の調製－
　前記プラスミド１、４、又はｐＧＥＸ－４Ｔ－１ベクター（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）のそれぞれを用い、以下のようにして細胞抽出液を調製した。
　大腸菌株ＤＨ５αに前記各プラスミドを導入し、ＬＢ培地で一晩培養した後、遠心分離によって大腸菌を回収し、サンプルバッファーで懸濁して細胞抽出液を作製した。
－抗体の中和－
　前記（１）～（４）の各ペプチド　８μｇと、前記製造例１で得られたマウスモノクローナル抗ＥＢＡＧ９抗体とを４℃で一晩混合し、前記抗体を中和させた試料を用意した。なお、コントロールとして、前記ペプチドを含まない以外は同様の操作を行った試料（以下、「Ｎｏｎｅ」と称することがある）も用意した。
－ウエスタンブロット－
　前記各細胞抽出液をＳＤＳ－ＰＡＧＥした後、Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ－Ｐ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）へブロッティングした膜を、前記「抗体の中和」で得られた各試料とともに室温で１時間、又は４℃で１２時間、ＴＢＳＴバッファー（２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ　ＮａＣｌ、０．１％　Ｔｗｅｅｎ－２０）中で静置した後、二次抗体として、ＨＲＰ（西洋ワサビパーオキシダーゼ）標識された二次抗体（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）とともに室温で１時間反応し、その後、発光シグナルをＥＣＬ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｓｙｓｔｅｍ（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）により検出した。
　結果を図９に示す。図９に示すように、前記製造例１で得られた抗体をヒトＥＢＡＧ９タンパク質のＮ末端側の１４８番目から１７７番目のアミノ酸に相当する３０アミノ酸からなるペプチド（「１４８－１７７」）で中和した場合にのみ、シグナルが検出されなかった。したがって、マウスモノクローナル抗ＥＢＡＧ９抗体のエピトープは、ヒトＥＢＡＧ９タンパク質のＮ末端側の１４８番目から１７７番目のアミノ酸配列に局限することが明らかになった。
　前記ヒトＥＢＡＧ９タンパク質のＮ末端側の１４８番目から１７７番目のアミノ酸配列には、酸性アミノ酸（グルタミン酸、アスパラギン酸）が多く含まれており、特徴的な構造に寄与すると考えられる。この領域内をエピトープとするモノクローナル抗体が作製されたことで、力価の高い抗体となっていることが示唆された。
（試験例４：ＥＢＡＧ９に対するモノクローナル抗体の作用）
　前記製造例１で得られたマウスモノクローナル抗ＥＢＡＧ９抗体について、腫瘍増殖抑制作用、及び癌転移抑制作用を以下のようにして調べた。
＜細胞培養＞
　細胞として、ＢＡＬＢ／ｃマウス由来乳癌細胞でルシフェラーゼを発現する４Ｔ１－Ｌｕｃ（Ｈｉｒａｇａ　Ｔ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｉｎｔ　Ｊ　Ｃａｎｃｅｒ．　１０６：９７３－９７９，　２００３）を使用した。
　前記細胞は、１０％　ｆｅｔａｌ　ｂｏｖｉｎｅ　ｓｅｒｕｍと、１００ｕｎｉｔｓ／ｍＬ　ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）と、１００μｇ／ｍＬ　ｓｔｒｅｐｔｍｙｓｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）とを含むＲＰＭＩ１６４０培地（ＮＡＣＡＬＡＩ　ＴＥＳＱＵＥ社製）で、５％　ＣＯ２、３７℃にて培養した。
＜ｉｎ　ｖｉｖｏでの腫瘍増殖抑制実験＞
　８週齢、メスのＢＡＬＢ／ｃマウス（日本クレア社製）のｍａｍｍａｒｙ　ｆａｔ　ｐａｄに前記４Ｔ１－Ｌｕｃ細胞を移植した。移植する細胞は、５×１０５ｃｅｌｌｓ／匹とし、投与量は、１００μＬ／匹となるように調整した。
　前記マウスモノクローナル抗ＥＢＡＧ９抗体は、ＰＢＳに対して透析した後、腫瘍移植後２日目より、週に２回、０．２ｍｇ／匹の投与量で腹腔内に注入した（治療群）。なお、コントロールとして、正常マウスＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ　Ａｌｄｒｉｃｈ社製）を同様に調製して投与した。
　腫瘍の増殖は、ルシフェリン（３ｍｇ／匹）を腹腔内投与した後の発光をインビボイメージング装置Ｐｈｏｔｏｎ　ＩＭＡＧＥＲ　（ＢＩＯＳＰＡＣＥ　ＬＡＢ社製）を用いて週１回計測し、１秒間当たりの発光量（Ｃｏｕｎｔｓ／ｓ）によって解析した。
　結果を図１０Ａ及び図１０Ｂに示す。図１０Ａ中、「○」は正常マウスＩｇＧを投与したコントロール（ｎ＝６）の結果を示し、「●」はマウスモノクローナル抗ＥＢＡＧ９抗体を投与した場合（ｎ＝８）の結果を示す。なお、図１０Ａは、平均±ＳＥ（ｂａｒ）で示しており、「＊」はＰ＜０．０５を示し、「＊＊」はＰ＜０．０１を示す。図１０Ｂは、腫瘍移植から３週間後に計測した際の典型的な例の写真であり、「ＩｇＧ（コントロール）」はコントロールの場合の典型例を示し、「ＥＢＡＧ９モノクローナル抗体」はマウスモノクローナル抗ＥＢＡＧ９抗体を投与した場合の典型例を示す。
　図１０Ａ及び図１０Ｂから明らかなように、前記製造例１で得られたマウスモノクローナル抗ＥＢＡＧ９抗体を投与した群では、コントロールに対して有意に腫瘍形成が抑制された。したがって、前記製造例１で得られたマウスモノクローナル抗ＥＢＡＧ９抗体は、乳癌細胞の腫瘍増殖抑制効果を有することが明らかとなった。
＜癌転移抑制作用の検証＞
　前記ｉｎ　ｖｉｖｏでの腫瘍増殖抑制実験において、腫瘍移植から４週間後のマウスにおける乳癌細胞の肺への転移を調べた。
　図１１Ａは、腫瘍移植から４週間後のマウスの肺の様子の一例を示す写真であり、「ＩｇＧ（コントロール）」はコントロールの場合のものであり、「ＥＢＡＧ９モノクローナル抗体」はマウスモノクローナル抗ＥＢＡＧ９抗体を投与した場合のものである。また、図１１Ｂは、乳癌細胞の転移巣の数を示したグラフであり、「ＩｇＧ（コントロール）」はコントロールの場合のものであり、「ＥＢＡＧ９モノクローナル抗体」はマウスモノクローナル抗ＥＢＡＧ９抗体を投与した場合のものである。なお、図１１Ｂ中、「＊」はＰ＜０．０５を示す。
　図１１Ａから明らかなように、前記製造例１で得られたマウスモノクローナル抗ＥＢＡＧ９抗体を投与した群では、乳癌細胞の肺への転移が抑えられており、また、図１１Ｂから明らかなように、前記製造例１で得られたマウスモノクローナル抗ＥＢＡＧ９抗体を投与した群では、転移巣の数がコントロールに対して有意に低値を示した。
　ＥＢＡＧ９は、乳癌、前立腺癌、膀胱癌、腎癌、精巣腫瘍、脳腫瘍、子宮癌、卵巣癌、甲状腺癌、肝癌、胆嚢癌、胆管癌、膵癌、大腸癌、胃癌、食道癌、肺癌、喉咽頭癌、扁平上皮癌、悪性リンパ腫、悪性中皮腫、ページェット病などで高発現しており、予後不良と相関することが知られている。したがって、ＥＢＡＧ９に対するモノクローナル抗体は、乳癌をはじめとする癌の治療に応用できる可能性が示唆された。
　本発明のＥＢＡＧ９に対するモノクローナル抗体は、特異性が高く、内分泌療法薬耐性乳癌の予測方法、内分泌療法薬耐性乳癌の予測用診断薬又はキットに好適に用いることができ、また、腫瘍増殖抑制剤、癌転移抑制剤、及び医薬の有効成分として好適に利用可能である。また、本発明のＥＢＡＧ９に対するモノクローナル抗体は、癌細胞の免疫系からの回避に関するメカニズムや増殖・転移メカニズムを解き明かし、病態解明への応用にも利用可能である。
　本発明のハイブリドーマは、本発明のＥＢＡＧ９に対するモノクローナル抗体の製造に好適に用いることができる。
　本発明の内分泌療法薬耐性乳癌の予測方法、予測用診断薬又はキットによれば、内分泌療法薬に対する耐性を獲得する乳癌か否かを早期に診断することが可能となる。
　本発明の腫瘍増殖抑制剤によれば、腫瘍の増殖を効果的に抑制することができる。
　本発明の癌転移抑制剤によれば、癌の転移を効果的に抑制することができる。
　本発明の医薬は、癌の予防乃至治療に好適に利用可能である。
　ＮＩＴＥ　ＢＰ－０１４０６

Claims (8)

  1. 　免疫原として、配列番号１に記載のアミノ酸配列を含み、ＥＢＡＧ９タンパク質の全長のアミノ酸配列は含まないポリペプチドをマウスに投与する工程と、
    　前記マウスから抗体産生細胞を回収する工程と、
    　前記抗体産生細胞とミエローマとを細胞融合し、ハイブリドーマを調製する工程と、
    　前記ハイブリドーマが産生する抗体と、配列番号１に記載のアミノ酸配列を含み、ＥＢＡＧ９タンパク質の全長のアミノ酸配列は含まないポリペプチドとを接触させ、前記配列番号１に記載のアミノ酸配列を含み、ＥＢＡＧ９タンパク質の全長のアミノ酸配列は含まないポリペプチドに結合する抗体を産生するハイブリドーマを選択する工程と、
    　前記選択されたハイブリドーマが産生する抗体を回収する工程とを含む方法により得られることを特徴とするＥＢＡＧ９に対するモノクローナル抗体。
  2. 　エピトープが、配列番号１３に記載のアミノ酸配列内にあることを特徴とするＥＢＡＧ９に対するモノクローナル抗体。
  3. 　請求項１から２のいずれかに記載のＥＢＡＧ９に対するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマであって、受託番号：ＮＩＴＥ　ＢＰ－０１４０６であることを特徴とするハイブリドーマ。
  4. 　被検体由来の試料中におけるＥＢＡＧ９を請求項１から２のいずれかに記載のＥＢＡＧ９に対するモノクローナル抗体を用いて測定する工程と、
    　前記測定結果を指標として、内分泌療法薬に耐性を有する乳癌か否かを評価する工程とを含むことを特徴とする内分泌療法薬耐性乳癌の予測方法。
  5. 　請求項１から２のいずれかに記載のＥＢＡＧ９に対するモノクローナル抗体を含むことを特徴とする内分泌療法薬耐性乳癌の予測用診断薬又はキット。
  6. 　請求項１から２のいずれかに記載のＥＢＡＧ９に対するモノクローナル抗体を含むことを特徴とする腫瘍増殖抑制剤。
  7. 　請求項１から２のいずれかに記載のＥＢＡＧ９に対するモノクローナル抗体を含むことを特徴とする癌転移抑制剤。
  8. 　請求項６に記載の腫瘍増殖抑制剤、及び請求項７に記載の癌転移抑制剤の少なくともいずれかを含むことを特徴とする医薬。
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Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20120052508A1 (en) * 2010-08-27 2012-03-01 Rutgers, The State University Of New Jersey Genetic markers and diagnostic methods for resistance of breast cancer to hormonal therapies

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20120052508A1 (en) * 2010-08-27 2012-03-01 Rutgers, The State University Of New Jersey Genetic markers and diagnostic methods for resistance of breast cancer to hormonal therapies

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
"Catalog Number: CPTC-EBAG9-2", ANTIBODY PORTAL, 8 August 2011 (2011-08-08), Retrieved from the Internet <URL:http://antibodies.cancer.gov/apps/site/detail/CPTC-EBAG9#CPTC-EBAG9-2> [retrieved on 20131203] *
"Product code: 392300, Product name: Mouse anti- RCAS-1", MATERIAL SAFETY DATA SHEETS, MANUALS & PROTOCOLS, INVITROGEN, 11 August 2009 (2009-08-11), Retrieved from the Internet <URL:https://tools.lifetechnologies.com/content/sfs/msds/2009/392300_MTR-NAIV_EN.pdf> [retrieved on 20131203] *
KENJIRO AOGI: "Hormone Ryoho Taisei Kijo no Bunshi Seibutsugakuteki Kaimei to Taisei Kokufuku Oyobi Chiryo Koka Yosoku ni Kansuru Kenkyu", SAISHU (SOKATSU) HOKOKUSHO, NATIONAL CANCER CENTER, GAN KENKYU DATABASE, 2009, Retrieved from the Internet <URL:http://crdb.ncc.go.jp/search/DRTV050.do?rpno=012008006300000> [retrieved on 20131203] *
KENZO SONODA: "Novel cancer therapeutic strategies to target RCAS1", 2011 NENDO KENKYU SEIKA HOKOKUSHO, KAKEN: DATABASE OF GRANTS-IN- AID FOR SCIENTIFIC RESEARCH, 23 April 2012 (2012-04-23), Retrieved from the Internet <URL:http://kaken.nii.ac.jp/pdf/2011/seika/C-19/17102/21592134seika.pdf> [retrieved on 20131203] *
SONODA, K.: "RCAS1 is a promising therapeutic target against cancer: its multifunctional bioactivities and clinical significance", EXPERT REVIEW OF OBSTETRICS & GYNECOLOGY, vol. 7, no. 3, May 2012 (2012-05-01), pages 261 - 267 *
TSUCHIYA, F. ET AL.: "Molecular Cloning and Characterization of Mouse EBAG9, Homolog of a Human Cancer Associated Surface Antigen: Expression and Regulation by Estrogen", BIOCHEMICAL AND BIOPHYSICAL RESEARCH COMMUNICATIONS, vol. 284, no. 1, 1 June 2001 (2001-06-01), pages 2 - 10 *

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