WO2014036729A1 - 确定hcv核酸样本中预定区域核酸序列的方法和系统 - Google Patents

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nucleic acid
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nucleotide sequence
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崔路漫
韩颖新
张印新
梅严花
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BGI Shenzhen Co Ltd
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
    • C12Q1/701—Specific hybridization probes
    • C12Q1/706—Specific hybridization probes for hepatitis

Definitions

  • the present invention relates to the field of organic biomolecules in genomics and molecular biology.
  • the present invention relates to methods, PCR primers, kits and uses thereof for determining a predetermined region of a nucleic acid sequence in an HCV nucleic acid sample, and for determining a predetermined HCV nucleic acid sample.
  • HCV Hepatitis C Virus
  • HCV belongs to the Flaviviridae family and is a single-stranded positive-strand RNA virus.
  • the genomic RNA consists of 9500-10000 nucleotides and contains two untranslated regions (UTR) and an open reading frame (ORF) in the order of 5*.
  • UTR untranslated regions
  • ORF open reading frame
  • -C-El-E2/p7-NS2-NS3-NS4-NS5-3* owned The internationally accepted typing standard is the nucleotide sequence analysis of the C, El and NS5 regions of the HCV genome established by Simmonds et al. There are 6 major genotypes, each of which consists of several subtypes.
  • the present invention is directed to solving at least some of the above technical problems or at least providing a useful commercial option.
  • the invention provides a method of determining a predetermined region nucleic acid sequence in a HCV nucleic acid sample.
  • the predetermined region is at least one selected from the group consisting of 5' UTR and NS5, the method comprising the steps of: amplifying the HCV nucleic acid sample using the first primer set to obtain a first amplification product Sequencing the first amplification product to obtain a sequencing result; and determining a nucleic acid sequence of a predetermined region based on the sequencing result described above, wherein the first primer set comprises a combination of the first primer and the second primer, and the third primer and At least one of a combination of a fourth primer having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, the second primer having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2, the third primer The nucleotide sequence shown by SEQ ID NO: 3 having the nucleotide sequence shown by SEQ ID NO: 3 having the nucleotide sequence shown by SEQ ID NO: 3 having the nucleot
  • the above method of determining a predetermined region nucleic acid sequence in a HCV nucleic acid sample may have the following additional technical features:
  • the HCV nucleic acid sample is isolated from a carrier of HCV or an HCV culture device.
  • the HCV nucleic acid sample is selected from at least one of plasma, serum, whole blood, pure virus culture, and a vector organism carrying HCV.
  • the HCV nucleic acid sample is further subjected to reverse transcription prior to amplification of the HCV nucleic acid sample.
  • the method further includes: amplifying the first amplification product by using the second primer set to obtain a second amplification product, and sequencing the second amplification product, wherein the second The primer set includes at least one of a combination of a fifth primer and a sixth primer, and a combination of a seventh primer and an eighth primer, the fifth primer having a nucleotide sequence as shown in SEQ ID NO: 5, the sixth The primer has a nucleotide sequence as shown in SEQ ID NO: 6, the seventh primer having the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 7, the eighth primer having the nucleus as shown in SEQ ID NO: Glycosidic acid sequence.
  • the method further comprises separating and purifying the first amplification product by at least one selected from the group consisting of agarose gel electrophoresis, magnetic bead purification, and purification column purification.
  • sequencing is performed using a first generation sequencing method, preferably using the Sanger method, particularly preferably using a 3730 sequencer (ABI).
  • a first generation sequencing method preferably using the Sanger method, particularly preferably using a 3730 sequencer (ABI).
  • determining the predetermined region nucleic acid sequence in the HCV nucleic acid sample based on the sequencing result further comprises:
  • the invention proposes a set of PCR primers.
  • the PCR primer comprises at least one of a combination of a first primer and a second primer, and a combination of a third primer and a fourth primer, the first primer having the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1, the second primer Having the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 2, the third primer has the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 3, and the fourth primer has the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO:
  • the set of PCR primers of the present invention further comprises a combination of a fifth primer and a sixth primer, and at least one of a combination of a seventh primer and an eighth primer, the fifth primer having SEQ ID NO : nucleoside shown in 5 An acid sequence, the sixth primer having the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 6, the seventh primer having the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 7, the eighth primer having SEQ ID NO: : The nucleotide sequence shown in 8.
  • the invention also provides a kit.
  • the kit comprises any of the set of PCR primers set forth above.
  • the present invention also provides the use of the above kit for detecting a predetermined region nucleic acid sequence of an HCV gene.
  • the invention also provides a system for determining a predetermined region nucleic acid sequence in a HCV nucleic acid sample.
  • the predetermined area is at least one selected from the group consisting of 5' UTR and NS5, the system comprising:
  • An amplification device wherein the amplification device is provided with the above-mentioned set of PCR primers for amplifying the HCV nucleic acid sample to obtain a first amplification product;
  • a sequencing device coupled to the amplification device and adapted to sequence the first amplification product to obtain a sequencing result
  • An analysis device coupled to the sequencing device for determining a predetermined region nucleic acid sequence in the HCV nucleic acid sample based on the sequencing result.
  • the method for determining a predetermined region nucleic acid sequence in an HCV nucleic acid sample described above can be effectively carried out, thereby being able to efficiently determine a sequence of at least one of the HCV predetermined region, for example, from 5' UTR and NS5, thereby The genotype of HCV is further determined by analyzing the determined nucleic acid sequence.
  • the system for determining a predetermined region nucleic acid sequence in an HCV nucleic acid sample of the present invention may further comprise the following additional technical features:
  • the system for determining a predetermined region nucleic acid sequence in an HCV nucleic acid sample of the present invention may further comprise: a nucleic acid separation device adapted to separate the HCV nucleic acid sample from the HCV carrier or the HCV culture device. .
  • the sequencing device is at least one selected from the group consisting of Sanger sequencing devices, preferably a 3730 sequencer (ABI).
  • the analysis device further comprises a aligning unit having a reference sequence stored therein for aligning the sequencing result with a reference sequence for determining a predetermined region nucleic acid sequence in the HCV nucleic acid sample.
  • the technical scheme according to the embodiment of the present invention uses a specific primer to amplify a representative typing region, and uses Sanger direct sequencing to obtain nucleic acid sequence information of the target fragment, thereby obtaining an HCV genotype.
  • nested PCR and mature stable sequencing techniques can ensure that samples with lower viral load can also be detected. Joint detection of two very representative typing regions of 5'UTR and NS5B, ensuring the points The accuracy of the type results.
  • the method is low in cost and short in time, and is suitable for wide application in clinical practice.
  • FIG. 1 shows a schematic flow diagram of a method of determining a predetermined region nucleic acid sequence in a HCV nucleic acid sample, in accordance with one embodiment of the present invention
  • Figure 2 shows a schematic representation of the structure of a system for determining a predetermined region of a nucleic acid sequence in a HCV nucleic acid sample, in accordance with one embodiment of the present invention. Detailed description of the invention
  • HCV genotypes There are many methods for detecting HCV genotypes, such as sequencing, genotype-specific RT-PCR, gene chip, restriction fragment length polymorphism (RFLR), genotype-specific probe hybridization, and Source molecular mobility analysis (HMA) method, enzyme immunoassay (EIA), and the like.
  • the gene chip method requires special analytical instruments and equipment, and the cost is high; the genotype-specific probe hybridization method can distinguish six genotypes and related subtypes, because the number of probes required is cumbersome and unsuitable. A large number of samples were detected; restriction fragment length polymorphism (RFLP), and the 5' UTR and NS5 conserved regions were selected as target genes for RFLP typing.
  • the method has the advantages of correctness, rapidity, and economy, but cannot distinguish all HCV subtypes from the variant genotypes found in Thailand and Vietnam because the nucleotide sequence of the 5' non-coding region is identical to genotype 1 The same.
  • the above methods all have some shortcomings, some of which are costly, cumbersome to operate, low in accuracy and sensitivity, poor in specificity, and incapable of detecting new types, which are difficult to be widely used in clinical practice. Therefore, the development of a convenient, fast and accurate HC V typing method is an urgent problem to be solved.
  • the present invention provides a method of determining a predetermined region nucleic acid sequence in an HCV nucleic acid sample, the predetermined region being at least one selected from the group consisting of 5, UTR and NS5.
  • the method may include:
  • S100 amplifying the HCV nucleic acid sample using a first primer set, optionally performing reverse transcription prior to amplification to obtain a first amplification product;
  • the first primer set comprises at least one of a combination of a first primer and a second primer, and a combination of a third primer and a fourth primer, the first primer having the core shown by SEQ ID NO: a nucleotide sequence, the second primer has the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 2, the third primer has the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 3, and the fourth primer has the SEQ ID NO: 4 Nucleotide sequence, the specific sequence is shown in Table 1 below.
  • the type of the HCV nucleic acid sample which can be used for detection is not particularly limited and may be a DNA sample or an RNA sample.
  • the HCV nucleic acid sample is further subjected to reverse transcription prior to amplification of the HCV nucleic acid sample.
  • the source of the HCV nucleic acid sample is not particularly limited.
  • the HCV nucleic acid sample is isolated from a carrier of HCV or an HCV culture device.
  • the HCV nucleic acid sample is selected from the group consisting of plasma, serum, whole blood, pure virus culture, and at least one vector organism carrying such a virus, more preferably, the HCV nucleic acid sample is taken from HCV. Carrier serum.
  • the first amplification product may be purified.
  • the method for determining a predetermined region nucleic acid sequence in an HCV nucleic acid sample of the present invention further comprises at least one separation by purification selected from agarose gel electrophoresis, magnetic bead purification, and purification column. The resulting first amplification product was purified.
  • S200 Sequencing the first amplification product to obtain a sequencing result.
  • the first amplification product is sequenced for a HCV nucleic acid sample having a lower copy number. Further comprising: amplifying the first amplification product with a second primer set to obtain a second amplification product, and sequencing the second amplification product, wherein the second primer set comprises a fifth primer And a combination of a sixth primer having at least one of a combination of a seventh primer having a nucleotide sequence as shown in SEQ ID NO: 5, and a combination of a sixth primer having SEQ.
  • the method and apparatus that can perform sequencing according to an embodiment of the present invention are not particularly limited.
  • the sequencing may be performed using at least one selected from the group consisting of Sanger sequencing devices, preferably using a 3730 sequencer.
  • the skill and the skilled person can understand that when the sample is large, the second-generation or third-generation high-throughput sequencing platform can be used, and the library construction and sequencing can be carried out according to the corresponding operating procedures, so that the sample can be accurately and efficiently obtained. Sequencing results.
  • the high-throughput sequencing capabilities of these sequencing technologies can be fully utilized, which can greatly reduce the cost of sequencing and improve the efficiency of sequencing.
  • an appropriate means can be selected according to the sequencing technique to determine the nucleic acid sequence of the predetermined region.
  • the predetermined region nucleic acid sequence in the HCV nucleic acid sample can also be determined by comparing the sequencing result with a reference sequence.
  • a reference sequence that can be used can be a HCV whole genome sequence.
  • the obtained nucleic acid sequences can be aligned by online comparison, for example, in an NCBI database to determine the genotype of HCV.
  • the invention also proposes a set of PCR primers.
  • the set of PCR primers comprises at least one of a combination of a first primer and a second primer, and a combination of a third primer and a fourth primer, the first primer having the SEQ ID NO: 1 a nucleotide sequence, the second primer has the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 2, the third primer has the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 3, and the fourth primer has The nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 4.
  • the set of PCR primers may further comprise at least one of a combination of a fifth primer and a sixth primer, and a combination of a seventh primer and an eighth primer, the fifth primer having SEQ. ID NO: the nucleotide sequence shown in 5, the sixth primer has the nucleotide sequence shown as SEQ ID NO: 6, and the seventh primer has the nucleotide shown in SEQ ID NO: a sequence, the eighth primer having the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 8.
  • the set of PCR primers can be used to efficiently amplify a small number of nucleic acid samples, thereby performing the aforementioned method for determining a predetermined region nucleic acid sequence in an HCV nucleic acid sample.
  • the present invention also proposes a kit comprising the PCR primer described above.
  • the kit can efficiently carry out the aforementioned method of determining a predetermined region nucleic acid sequence in a HCV nucleic acid sample.
  • kits for detecting a predetermined region nucleic acid sequence of an HCV gene are also be included in the kit, and details are not described herein again.
  • the present invention provides the use of the above kit for detecting a predetermined region nucleic acid sequence of an HCV gene.
  • the present invention also contemplates a system 1000 for determining a predetermined region nucleic acid sequence in a HCV nucleic acid sample.
  • the system 1000 includes: an amplification device 100, a sequencing device 200, and an analysis device 300.
  • the amplification device 100 is provided with a set of PCR primers shown above for amplifying the HCV nucleic acid sample to obtain a first amplification product.
  • the system for determining a predetermined region nucleic acid sequence in an HCV nucleic acid sample of the present invention may further comprise a nucleic acid separation device (not shown) adapted to isolate the HCV nucleic acid sample from the host of the HCV. Thereby, the nucleic acid sample for detection can be provided to the amplification device 100.
  • the sequencing device 200 is coupled to the amplification device 100 and is adapted to sequence the first amplification product to obtain a sequencing result.
  • the type of the sequencing device is not particularly limited.
  • the sequencing device may be a device suitable for performing Sanger sequencing, preferably a 3730 sequencer.
  • the analysis device 300 is coupled to the sequencing device 200 for determining a nucleic acid sequence of a predetermined region in the HCV nucleic acid sample based on the sequencing result.
  • the predetermined region nucleic acid sequence can be further determined by comparison.
  • the analyzing device further comprises a comparison unit, wherein the comparison unit stores a reference sequence for comparing the sequencing result with the reference sequence to determine the predetermined region of the HCV nucleic acid sample Nucleic acid sequence.
  • the method for determining a predetermined region nucleic acid sequence in an HCV nucleic acid sample described above can be effectively carried out, and the HCV predetermined region can be efficiently determined, for example, from at least one of 5' UTR and NS5, thereby further The genotype of HCV is determined by analyzing the determined nucleic acid sequence.
  • the features and advantages previously described for primers, kits, and methods for determining predetermined region nucleic acid sequences in HCV nucleic acid samples are also applicable to systems for determining predetermined region nucleic acid sequences in HCV nucleic acid samples, and are not described herein. The solution of the present invention will be explained below in conjunction with the embodiments.
  • genotype detection of HCV samples in patients' serum is performed by using 3730 sequencing technology, and the operation steps are as follows:
  • PCR primers were designed according to the 5'UTR and NS5B regions of the hepatitis C virus (HCV) genome sequence (NCBI accession number: NC_004102, GenBank: D14853.1). The primer sequences are as follows:
  • the 5'UTR region amplification primers are:
  • the NS5B region amplification primers are:
  • sequence of the 5'UTR region (bases 63-306, 242b) is:
  • the sequence of the NS5B region (bases 8268-8629, 362 bp in total) is: CCCCCCGGGAGACCCGC (SEQ ID NO: 10).
  • the nested PCR primers were further designed and the second round of PCR amplification was performed after no amplification in the previous round.
  • the second round of PCR primers in the 5' UTR region is:
  • the second round of PCR primers in the NS5B region is:
  • the HCV-RNA was extracted from the hepatitis C serum sample using the QIAamp Viral Genomic RNA Extraction Kit according to the manufacturer's instructions.
  • the HCV-RNA was reverse transcribed into cDNA using the TaKaRa reverse transcription kit according to the manufacturer's instructions to obtain a HCV nucleic acid sample.
  • the PCR amplification reaction was carried out on the 5'UTR region of the HCV-cDNA obtained by reverse transcription.
  • the configuration of the PCR amplification reagent is shown in Table 2:
  • reaction conditions were: 94 ° C, 1 min; denaturation at 94 ° C for 30 s, annealing at 46 ° C for 30 s, extension at 72 ° C for 1 min, Amplification was carried out for 40 cycles, extending at 72 ° C for 5 min, and finally at 12 ° C, maintained.
  • the nested PCR reaction is carried out, that is, the PCR product is used as a template for the second round of PCR amplification, and the reagent configuration is shown in Table 3:
  • the reaction conditions are: 94 °C, 1 min; denaturation at 94 °C for 30 s, annealing at 54 °C for 30 s, extension at 72 °C for 1 min, a total of 40 cycles, 72 °C extension for 5 min, and finally 12 ° C, keep.
  • the PCR amplification reaction was carried out on the NS5B region of the extracted HCV-cDNA, and the configuration of the PCR amplification reagent was shown in the table.
  • reaction conditions were 94 ° C, 1 min; denaturation at 94 ° C for 30 s, annealing at 46 ° C for 30 s, extension at 72 ° C for 1 min, a total of 40 cycles, 72 ° C extension for 5 min, and finally 12 ° C, keep.
  • the nested PCR reaction is carried out, and the PCR product is used as a template for the second round of PCR amplification, and the reagent configuration is shown in Table 5:
  • reaction conditions were 94 °C, 1 min; denaturation at 94 °C for 30 s, annealing at 46 °C for 30 s, extension at 72 °C for 1 min, a total of 40 cycles, 72 °C extension for 5 min, and finally 12 °C. , keep.
  • PCR products were electrophoresed using a 1.5% agarose gel with a voltage of 100 volts and electrophoresis for 1 hour and 30 minutes.
  • the target fragment was then cut under a UV lamp and placed in a fistula.
  • the fraction of interest was recovered according to the instructions of the purification kit and finally dissolved in water.
  • the concentration of the target fragment was determined by electrophoresis.
  • a PCR sequencing reaction was performed on the obtained fragment of interest.
  • the reagents are configured as follows: Bigdye 2
  • reaction conditions were 96 ° C, 2 min; denaturation at 96 ° C for 10 s, annealing at 51 ° C for 10 s, extension at 60 ° C for 190 s, a total of 25 cycles, and finally 12 ° C, maintained.
  • reaction product of the previous step was air-dried for 15 min, force. 8 children's HI-DI, with a regular sealing film, short to 2000rpm.
  • the target fragment sequence information determined by 3730 was compared with the reference sequence in NCBI (NCBI accession number: NC-004102, GenBank: D14853.1). The alignment results showed that the target fragment sequence and several lb-type HCVs in the NCBI database.
  • NCBI accession number: NC-004102, GenBank: D14853.1 NCBI accession number: NC-004102, GenBank: D14853.1.
  • the alignment results showed that the target fragment sequence and several lb-type HCVs in the NCBI database.
  • the base sequence of the virus strain has the largest number of matching bases, and thus, the HCV genotype of the patient is judged to be lb type.
  • the method, PCR primer, kit and use thereof for determining a predetermined region nucleic acid sequence in an HC V nucleic acid sample of the present invention, and a system for determining a predetermined region nucleic acid sequence in an HCV nucleic acid sample can be effectively applied to determine a predetermined region in a HCV nucleic acid sample.
  • a nucleic acid sequence sequence selected from at least one of 5' UTR and NS5 can effectively determine the genotype of HCV.

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Description

确定 HCV核酸样本中预定区域核酸序列的方法和系统
优先权信息
无 技术领域
本发明涉及基因组学和分子生物学中有机生物分子领域， 具体而言， 本发明涉及确定 HCV核酸样本中预定区域核酸序列的方法、 PCR引物、 试剂盒及其用途， 以及确定 HCV 核酸样本中预定区域核酸序列的系统。 背景技术
1989年 Choo等在感染的黑猩猩血液标本中，克隆出了非甲非乙型肝炎的基因片段，将 其命名为 "丙型肝炎病毒（Hepatitis C Virus, HCV )，，。 HCV是经血传播的非甲非乙型肝炎 ( PT-NANBH ) 的主要病原， 呈全球分布， 流行性很强。
HCV属黄病毒科， 为单股正链 RNA病毒， 基因组 RNA由 9500-10000个核苷酸组成， 含两个非翻译区 （ UTR ) 和一个开放读码框架 （ ORF ) , 排列 顺序 为 5*-C-El-E2/p7-NS2-NS3-NS4-NS5-3*„ 国际通用的分型标准是 Simmonds等建立的针对 HCV 基因组 C、 El 和 NS5 区的核苷酸序列分析， 将 HCV分为 6 个主要基因型， 每型又由若干 亚型组成。
然而， 目前针对 HCV的分型方法仍有待改进。 发明内容
本发明旨在至少在一定程度上解决上述技术问题之一或至少提供一种有用的商业选 择。
本发明旨在解决现有技术问题的至少之一。 为此， 根据本发明的一个方面， 本发明提 供了一种确定 HCV核酸样本中预定区域核酸序列的方法。 根据本发明的实施例， 该预定区 域为选自 5' UTR和 NS5的至少之一， 该方法包括下列步骤： 使用第一引物组， 对 HCV核 酸样本进行扩增， 以便得到第一扩增产物； 对第一扩增产物进行测序， 以便得到测序结果； 以及基于上述测序结果， 确定预定区域的核酸序列， 其中， 第一引物组包含第一引物和第 二引物的组合、 以及第三引物和第四引物的组合的至少一种， 该第一引物具有 SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列， 该第二引物具有 SEQ ID NO: 2所示的核苷酸序列， 该第三引物具有 SEQ ID NO: 3所示的核苷酸序列， 该第四引物组具有 SEQ ID NO: 4所示的核苷酸序列。 利用该方法， 能够有效地确定 HCV核酸样本中预定区域例如， 选自 5， UTR和 NS5的至少 之一的序列， 由此， 可以进一步通过对所确定的核酸序列进行分析， 以便确定 HCV的基因 型。
根据本发明的实施例，上述确定 HCV核酸样本中预定区域核酸序列的方法可以具有下 列附加技术特征：
根据本发明的具体示例， HCV核酸样本是从 HCV的携带者或 HCV培养装置中分离 的。
根据本发明的具体示例， HCV核酸样本选自血浆、 血清、 全血、 纯病毒培养物和携带 HCV的媒介生物的至少一种。
根据本发明的具体示例， 在对 HCV核酸样本进行扩增之前， 进一步包括将 HCV核酸 样本进行逆转录。
根据本发明的实施例， 进一步包括： 利用第二引物组， 对第一扩增产物进行扩增， 以 便得到第二扩增产物， 并对该第二扩增产物进行测序， 其中， 上述第二引物组包括第五引 物和第六引物的组合、以及第七引物和第八引物的组合的至少一种，该第五引物具有如 SEQ ID NO: 5所示的核苷酸序列， 该第六引物具有如 SEQ ID NO: 6所示的核苷酸序列， 该第 七引物具有如 SEQ ID NO: 7所示的核苷酸序列， 该第八引物具有如 SEQ ID NO: 8所示的 核苷酸序列。
根据本发明的具体示例， 进一步包括通过选自琼脂糖凝胶电泳切胶、 磁珠纯化和纯化 柱纯化的至少一种分离纯化第一扩增产物。
根据本发明的具体示例， 测序釆用第一代测序方法， 优选地釆用 Sanger法， 特别优选 地釆用 3730测序仪 (ABI)进行测序。
根据本发明的实施例， 基于所述测序结果， 确定 HCV核酸样本中预定区域核酸序列进 一步包括：
将测序结果与参照序列进行比对， 以便确定 HCV核酸样本中预定区域核酸序列。 根据本发明的另一个方面， 本发明提出了一组 PCR引物。 根据本发明的实施例， 该组
PCR 引物包含第一引物和第二引物的组合、 以及第三引物和第四引物的组合的至少一种， 该第一引物具有 SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列， 该第二引物具有 SEQ ID NO: 2所示的 核苷酸序列， 该第三引物具有 SEQ ID NO: 3所示的核苷酸序列， 该第四引物具有 SEQ ID NO: 4所示的核苷酸序列，
根据本发明的实施例，本发明的一组 PCR引物进一步包括第五引物和第六引物的组合、 以及第七引物和第八引物的组合的至少一种，该第五引物具有如 SEQ ID NO: 5所示的核苷 酸序列， 该第六引物具有如 SEQ ID NO: 6所示的核苷酸序列， 该第七引物具有如 SEQ ID NO: 7所示的核苷酸序列， 该第八引物具有如 SEQ ID NO: 8所示的核苷酸序列。
根据本发明的另一个方面， 本发明还提供了一种试剂盒。 根据本发明的实施例， 该试 剂盒包含上述所示的任一组 PCR引物。
根据本发明的再一个方面， 本发明还提供了上述试剂盒在检测 HCV基因的预定区域核 酸序列中的用途。
根据本发明的另一个方面， 本发明还提供了一种确定 HCV核酸样本中预定区域核酸序 列的系统。 根据本发明的实施例， 该预定区域为选自 5 ' UTR和 NS5的至少之一， 该系统 包括：
扩增装置， 该扩增装置中设置有上述的一组 PCR引物， 用于对 HCV核酸样本进行扩 增， 以便得到第一扩增产物；
测序装置， 该测序装置与扩增装置相连， 并且适于对第一扩增产物进行测序， 以便得 到测序结果； 以及
分析装置， 该分析装置与测序装置相连， 用于对基于测序结果， 确定 HCV核酸样本中 预定区域核酸序列。
由此， 可以有效地实施前面所描述的确定 HCV核酸样本中预定区域核酸序列的方法， 从而能够有效地确定 HCV预定区域例如， 自 5' UTR和 NS5的至少之一的序列， 由此， 可 以进一步通过对所确定的核酸序列进行分析， 确定 HCV的基因型。
才艮据本发明的实施例， 本发明的确定 HCV核酸样本中预定区域核酸序列的系统可以进 一步包括下列附加技术特征：
才艮据本发明的实施例， 本发明的确定 HCV核酸样本中预定区域核酸序列的系统可以进 一步包括:核酸分离装置，该核酸分离装置适于从 HCV携带者或 HCV培养装置中分离 HCV 核酸样本。
才艮据本发明的具体示例， 测序装置为选自 Sanger法测序装置的至少一种， 优选为 3730 测序仪 (ABI)。
根据本发明的具体示例， 分析装置进一步包括比对单元， 该比对单元中存储有参照序 列， 用于将测序结果与参照序列进行比对， 以便确定 HCV核酸样本中预定区域核酸序列。
与现有技术相比， 根据本发明实施例的技术方案釆用特异性引物扩增有代表性的分型 区域， 应用 Sanger直接测序法获得目的片段的核酸序列信息， 进而得出 HCV基因型。根据 本发明的实施例， 釆用巢式 PCR的方法和成熟稳定的测序技术， 可以保证病毒载量较低的 样品也可以被检测出来。 联合检测 5'UTR和 NS5B两个极具代表性的分型区域， 确保了分 型结果的准确性。 此外， 该法成本较低， 耗时较短， 适合在临床广泛应用。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出， 部分将从下面的描述中变得明 显， 或通过本发明的实践了解到。 附图说明
本发明的上述和 /或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和 容易理解， 其中：
图 1显示了根据本发明一个实施例的确定 HCV核酸样本中预定区域核酸序列的方法的 流程示意图； 以及
图 2显示了根据本发明一个实施例的确定 HCV核酸样本中预定区域核酸序列的系统的 结构示意图。 发明详细描述
下面详细描述本发明的实施例， 所述实施例的示例在附图中示出， 其中自始至终相同 或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。 下面通过参考附图描 述的实施例是示例性的， 仅用于解释本发明， 而不能理解为对本发明的限制。
需要说明的是， 术语 "第一，，、 "第二，，、 "第三，，、 "第四，，、 "第五，，、 "第六，，、 "第七，， 和 "第八，， 仅用于描述目的， 而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的 技术特征的数量。
目前检测 HCV基因型的方法有很多种， 如测序法、 基因型特异性 RT-PCR方法、 基因 芯片法、 限制性片断长度多态性 (RFLR)法、 基因型特异性探针杂交法、 异源分子迁移率分 析 (HMA)法、 酶免疫试验 (EIA)等。 其中， 基因芯片法， 需要特殊的分析仪器设备， 成本较 高； 基因型特异性探针杂交法， 可以分辨 6种基因型和相关的亚型， 由于需要的探针多， 较 为繁瑣， 不适合检测大量样本； 限制性片段长度多态性（RFLP), —般选 5' UTR和 NS5保 守区作为 RFLP分型的靶基因。该法具有正确、快速、经济等优点，但不能区分所有的 HCV 基因亚型也不能识别在泰国和越南发现的变异基因型， 因为其 5' 端非编码区的核苷酸序列 同基因型 1 的相同。 总之， 上述方法均存在一些缺点， 有的成本高， 操作繁瑣， 有的准确 度和灵敏度低， 特异性差， 有的无法检测出新型别， 都难以在临床广泛应用。 因此， 研发 一种筒便、 快速、 准确的 HC V分型方法是目前亟待解决的问题。 确定 HCV核酸样本中预定区域核酸序列的方法 本发明提供了一种确定 HCV核酸样本中预定区域核酸序列的方法， 该预定区域为选自 5， UTR和 NS5的至少之一。 根据本发明的实施例， 参考图 1 , 该方法可以包括：
S100: 使用第一引物组， 对 HCV核酸样本进行扩增， 任选地可以在扩增之前进行逆转 录， 以便得到第一扩增产物；
根据本发明的实施例， 第一引物组包含第一引物和第二引物的组合、 以及第三引物和 第四引物的组合的至少一种， 第一引物具有 SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列， 第二引物具 有 SEQ ID NO: 2所示的核苷酸序列， 第三引物具有 SEQ ID NO: 3所示的核苷酸序列， 第 四引物具有 SEQ ID NO: 4所示的核苷酸序列， 具体序列见下表 1。
根据本发明的实施例， 可以用于检测的 HCV核酸样本的类型并不受特别限制， 可以是 DNA样品， 也可以是 RNA样本。 根据本发明的实施例， 当釆用 RNA样本时， 在对所述 HCV核酸样本进行扩增之前， 进一步包括将所述 HCV核酸样本进行逆转录。
表 1 引物序列
Figure imgf000006_0001
根据本发明的实施例， HCV核酸样本的来源并不受特别限制。 根据本发明的一些具体 实施例， HCV核酸样本是从 HCV的携带者或 HCV培养装置中分离的。 才艮据本发明的进一 步的实施例， 优选 HCV核酸样本选自血浆、 血清、 全血、 纯病毒培养物和携带此类病毒的 媒介生物的至少一种， 更优选， HCV核酸样本取自 HCV携带者血清。
根据本发明的实施例， 在得到第一扩增产物之后， 可以对第一扩增产物进行纯化。 例 如， 才艮据本发明的实施例， 本发明的确定 HCV核酸样本中预定区域核酸序列的方法进一步 包括通过选自琼脂糖凝胶电泳切胶、 磁珠纯化和纯化柱纯化的至少一种分离纯化所得到的 第一扩增产物。
S200: 对第一扩增产物进行测序， 以便得到测序结果。
根据本发明的实施例， 针对拷贝数较低的 HCV核酸样本， 对第一扩增产物进行测序可 以进一步包括： 利用第二引物组， 对第一扩增产物进行扩增， 以便得到第二扩增产物， 并 对第二扩增产物进行测序， 其中， 所述第二引物组包括第五引物和第六引物的组合、 以及 第七引物和第八引物的组合的至少一种，所述第五引物具有如 SEQ ID NO: 5所示的核苷酸 序列，所述第六引物具有如 SEQ ID NO: 6所示的核苷酸序列，所述第七引物具有如 SEQ ID NO: 7所示的核苷酸序列， 所述第八引物具有如 SEQ ID NO: 8所示的核苷酸序列， 具体 序列见表 1。 由此， 可以针对量非常少的 HCV核酸样本进行有效的扩增， 从而提高了扩增 效率， 进而提高了确定 HC V核酸样本中预定区域核酸序列的方法的效率。
根据本发明的实施例， 可以进行测序的方法和设备， 并不受特别限制。 根据本发明的 实施例， 可以釆用选自 Sanger测序装置的至少一种进行所述测序， 优选地釆用 3730测序仪 进行测序。 此外， 本领与技术人员可以理解， 当样本较多时， 还可以釆用第二代或第三代 的高通量测序平台， 参照相应的操作规程， 进行文库构建及测序， 从而能够准确高效地获 得测序结果。 由此， 可以充分利用这些测序技术的高通量测序能力， 从而可以极大地降低 测序的成本， 提高测序的效率。
S300: 基于测序结果， 确定预定区域的核酸序列，
根据本发明的实施例， 在获得测序结果后， 可以根据测序技术选择适当的手段， 来确 定预定区域的核酸序列。 另外， 根据本发明的实施例， 在得到测序结果之后， 还可以通过 将测序结果与参照序列进行比对， 以便确定所述 HCV核酸样本中预定区域核酸序列。 可以 釆用的参照序列可以为 HCV全基因组序列。 另外， 也可以将所得到的核酸序列通过在线比 对， 例如， 在 NCBI数据库中进行比对， 确定 HCV的基因型。
PCR引物和试剂盒
本发明还提出了一组 PCR引物。根据本发明的实施例， 该组 PCR引物包含第一引物和 第二引物的组合、 以及第三引物和第四引物的组合的至少一种， 所述第一引物具有 SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列， 所述第二引物具有 SEQ ID NO: 2所示的核苷酸序列， 所述第 三引物具有 SEQ ID NO: 3所示的核苷酸序列， 所述第四引物具有 SEQ ID NO: 4所示的核 苷酸序列。 利用该组 PCR引物， 可以有效地实施前述确定 HCV核酸样本中预定区域核酸 序列的方法。 关于该方法的优点和特征， 前面已经进行了详细描述， 不再赘述。
才艮据本发明的实施例， 该组 PCR引物还可以进一步包括第五引物和第六引物的组合、 以及第七引物和第八引物的组合的至少一种，所述第五引物具有如 SEQ ID NO: 5所示的核 苷酸序列， 所述第六引物具有如 SEQ ID NO: 6所示的核苷酸序列， 所述第七引物具有如 SEQ ID NO: 7所示的核苷酸序列， 所述第八引物具有如 SEQ ID NO: 8所示的核苷酸序列。 由此， 可以利用该组 PCR 引物有效地对少量核酸样本进行扩增， 进而实施前述确定 HCV 核酸样本中预定区域核酸序列的方法。
根据本发明的实施例， 本发明还提出了一种试剂盒， 该试剂盒包含前面所述的 PCR引 物。 该试剂盒可以有效地实施前述确定 HCV核酸样本中预定区域核酸序列的方法。 关于该 方法的优点和特征， 前面已经进行了详细描述， 不再赘述。
当然， 本领域技术人员能够理解， 试剂盒中还可以包含其他常用试剂， 在此不再赘述。 此外， 本发明还提供了上述试剂盒在检测 HCV基因的预定区域核酸序列中的用途。 确定 HCV核酸样本中预定区域核 列的系统
本发明还提出了一种确定 HCV核酸样本中预定区域核酸序列的系统 1000。 参考图 2, 才艮据本发明的实施例， 该系统 1000包括： 扩增装置 100、 测序装置 200和分析装置 300。
根据本发明的实施例， 扩增装置 100中设置有前面所示的一组 PCR引物， 用于对所述 HCV核酸样本进行扩增，以便得到第一扩增产物。根据本发明的实施例，本发明的确定 HCV 核酸样本中预定区域核酸序列的系统还可以进一步包括核酸分离装置（图中未示出）， 该核 酸分离装置适于从 HCV的宿主分离 HCV核酸样本， 由此可以为扩增装置 100提供用于检 测的核酸样本。
才艮据本发明的实施例， 测序装置 200与扩增装置 100相连， 并且适于对第一扩增产物 进行测序， 以便得到测序结果。 根据本发明的实施例， 测序装置的类型并不受特别限制。 根据本发明的实施例，测序装置可以为适于进行 Sanger测序法的装置，优选为 3730测序仪。
根据本发明的实施例， 分析装置 300与测序装置 200相连， 用于基于测序结果， 确定 所述 HCV核酸样本中预定区域的核酸序列。 如前所述， 还可以进一步通过比对， 确定预定 区域核酸序列。 因而， 根据本发明的实施例， 分析装置进一步包括比对单元， 该比对单元 中存储有参照序列， 用于将所述测序结果与参照序列进行比对， 以便确定所述 HCV核酸样 本预定区域核酸序列。
由此， 可以有效地实施前面所描述的确定 HCV核酸样本中预定区域核酸序列的方法， 能够有效地确定 HCV预定区域例如， 自 5' UTR和 NS5的至少之一的序列， 由此， 可以进 一步通过对所确定的核酸序列进行分析， 以便确定 HCV的基因型。 需要说明的是， 前面针 对引物、 试剂盒以及确定 HCV核酸样本中预定区域核酸序列的方法所描述的特征和优点， 也适用确定 HCV核酸样本中预定区域核酸序列的系统， 在此不再赘述。 下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。 本领域技术人员将会理解， 下面的实施 例仅用于说明本发明， 而不应视为限定本发明的范围。 实施例中未注明具体技术或条件的， 按照本领域内的文献所描述的技术或条件（例如参考 J.萨姆布鲁克等著， 黄培堂等译的《分 子克隆实验指南》， 第三版， 科学出版社）或者按照产品说明书进行。 所用试剂或仪器未注 明生产厂商者， 均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例 1：
本实施例是釆用 3730测序技术对病人血清中 HCV样品进行基因型检测， 操作步骤如 下：
1.首先根据丙肝病毒 （HCV )基因组的序列（NCBI 登录号： NC_004102 , GenBank: D14853.1)的 5'UTR和 NS5B两个区域分别设计一对 PCR引物， 引物序列如下所示：
5'UTR区域扩增引物为：
上游： 5'-CTGTGAGGAACTACTGTCTT-3， (SEQ ID NO: 1);
下游： 5'-AGGTGCACGGTCTACGAGA-3， (SEQ ID NO: 2);
NS5B区域扩增引物为：
上游： 5'-TATGACACCCGCTGCTTTGA-3， (SEQ ID NO: 3)；
下游： 5'-GAATACCTGGTCATAGCCTC-3' (SEQ ID NO: 4)。
其中， 5'UTR区域（第 63-306位碱基， 共 242b ) 的序列为：
Figure imgf000009_0001
AGCACGAATCCT(SEQ ID NO: 9)；
NS5B区域（第 8268-8629位碱基， 共 362bp ) 的序列为： CCCCCCGGGAGACCCGC(SEQ ID NO: 10)。
针对拷贝数低的样品， 经过上一轮没有扩增结果的， 进一步设计了巢式 PCR引物， 再 进行第二轮 PCR扩增
5'UTR区域第二轮 PCR引物为：
上游： 5'-TTCACGCAGAAAGCGTCTAG-3' (SEQ ID NO: 5)；
下游： 5'-GAGCACCCTATCAGGCAGT-3， (SEQ ID NO: 6)；
NS5B区域第二轮 PCR引物为：
上游： 5'-TGCTTTGACTCAACCGTCAC-3， (SEQ ID NO: 7)；
下游： 5'-ATAGCCTCCGTGAAGGCTC-3， (SEQ ID NO: 8)；
2.HCV-RNA的提取
用 QIAamp病毒基因组 RNA提取试剂盒， 按制造商所提供的操作说明书， 提取丙肝血 清样本 HCV-RNA。
3. HCV-RNA逆转录成 cDNA
用 TaKaRa逆转录试剂盒， 按制造商所提供的操作说明书， 将 HCV-RNA逆转录成 cDNA, 以便获得 HCV核酸样本。
4. PCR扩增反应
对逆转录获得的 HCV-cDNA的 5'UTR区域进行 PCR扩增反应， PCR扩增反应试剂的 配置见表 2:
表 2
Figure imgf000010_0001
其中， 反应条件为： 94°C , 1 min; 94°C变性 30 s, 46°C退火 30 s, 72°C延伸 1 min, 共 扩增 40个循环， 72°C延伸 5 min, 最终 12°C , 保持。
进一步， 针对拷贝数低的样品， 进行巢式 PCR反应， 即将上述 PCR产物作为模板进行 第二轮 PCR扩增， 反应试剂配置见表 3:
表 3
Figure imgf000011_0001
其反应条件为： 94 °C , 1 min; 94 °C变性 30 s, 54°C退火 30 s, 72°C延伸 1 min, 共扩增 40个循环， 72 °C延伸 5 min, 最终 12°C , 保持。
对提取的 HCV-cDNA的 NS5B区域进行 PCR扩增反应， PCR扩增反应试剂的配置见表
4:
表 4
Figure imgf000011_0002
总体积 25
其中， 反应条件为 94°C , 1 min; 94°C变性 30 s, 46°C退火 30 s, 72°C延伸 1 min, 共扩 增 40个循环， 72 °C延伸 5 min, 最终 12°C , 保持。
进一步， 针对拷贝数低的样品， 进行巢式 PCR反应， 将上述 PCR产物作为模板进行第 二轮 PCR扩增， 反应试剂配置见表 5:
表 5
Figure imgf000012_0001
其反应条件为 94 °C , 1 min; 94 °C变性 30 s, 46°C退火 30 s, 72°C延伸 1 min, 共扩增 40个循环， 72 °C延伸 5 min, 最终 12°C , 保持。
5.电泳检测
取 5 μ ί的 PCR产物， 利用 1.5%的琼脂糖凝胶进行电泳检测， 其中电压 140伏， 电泳 23分钟。 然后， ΕΒ染胶 15分钟后， 釆用凝胶成像系统拍照检测。
6. 切胶纯化
利用 1.5%的琼脂糖凝胶， 将所有 PCR产物均进行电泳检测， 其中电压 100伏， 电泳 1 小时 30分。 然后在紫外灯下切下目的片段， 放入 ΕΡ管中。 并根据纯化试剂盒说明书回收 目的片段， 最后溶解于水中。 并电泳鉴定目的片段的回收浓度。
7. 测序反应
对获得的目的片段进行 PCR测序反应。 其中试剂的配置如下：
Figure imgf000012_0002
bigdye 2
模板 DNA 2
总体积 5
反应条件为 96°C , 2min; 96°C变性 10s, 51 °C退火 10s, 60°C延伸 190s, 共扩增 25个 循环， 最终 12°C , 保持。
7. 反应后纯化
7.1 PCR循环完并冷却到 4°C , 取下并马上进行短时间离心 （ 4000rpm离心 lmin )。 7.2 加 2微升的 0.125M的 EDTA于 PCR测序反应产物中， 再加入 16微升常温无水乙 醇， 充分振荡 5min (关键）， 振荡后短时间离心， 避光常温静置 15min。 此时将离心机温度 调至 4°C。
7.3 然后， 将上述反应产物于 4000rpm, 4°C下离心 30min, 并倒出孔中的液体， 倒扣在 干净的纸巾上倒离心 (到 700rpm停止）。
7.4 加 30微升 70%的水乙醇（-20°C ) 于上步的反应产物中， 充分振荡 3min后， 离心
15min, 然后倒出孔中的液体， 倒扣在干净的纸巾上倒离心（到 700rpm停止）。
7.5 将上步的反应产物进行避光风干 15min, 力。 8孩 ί升 HI-DI, 贴普通封口膜， 短甩至 2000rpm。
7.6 变性（96°C , 2min )。 变性完后取出迅速放在水盒上， 并冷却到 4°C后进行短时间 离心 （ 4000rpm离心 30s )。
8. 上 3730测序仪
9. 数据分析
将 3730 测定的目的片段序列信息与 NCBI 中参考序列 (NCBI登录号： NC—004102, GenBank: D14853.1)进行比对， 比对结果显示， 目的片段序列与 NCBI数据库中的几条 lb 型 HCV病毒株的碱基序列比对匹配碱基数目最多，由此，判断病人的 HCV基因型为 lb型。 工业实用性
本发明的确定 HC V核酸样本中预定区域核酸序列的方法、 PCR引物、试剂盒及其用途， 以及确定 HCV核酸样本中预定区域核酸序列的系统， 能够有效地应用于确定 HCV核酸样 本中预定区域例如选自 5' UTR和 NS5的至少之一的核酸序列序列， 进而， 基于对所确 定的核酸序列进行分析， 能够有效地确定 HCV的基因型。 尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述， 本领域技术人员将会理解。 根据已 经公开的所有教导， 可以对那些细节进行各种修改和替换， 这些改变均在本发明的保护范 围之内。 本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。
在本说明书的描述中， 参考术语 "一个实施例"、 "一些实施例"、 "示意性实施例"、 "示 例"、 "具体示例"、 或 "一些示例" 等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、 结 构、 材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。 在本说明书中， 对上述术语 的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。 而且， 描述的具体特征、 结构、 材料或 者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。

Claims

权利要求书
1、一种确定 HCV核酸样本中预定区域核酸序列的方法， 所述预定区域为选自 5' UTR 和 NS5的至少之一， 其特征在于， 所述方法包括下列步骤：
使用第一引物组， 对所述 HCV核酸样本进行扩增， 以便得到第一扩增产物； 对所述第一扩增产物进行测序， 以便得到测序结果； 以及
基于所述测序结果， 确定所述预定区域的核酸序列，
其中， 所述第一引物组包含第一引物和第二引物的组合、 以及第三引物和第四引物的 组合的至少一种， 所述第一引物具有 SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列， 所述第二引物具有 SEQ ID NO: 2所示的核苷酸序列， 所述第三引物具有 SEQ ID NO: 3所示的核苷酸序列， 所述第四引物组具有 SEQ ID NO: 4所示的核苷酸序列。
2、 根据权利要求 1所述的方法， 其特征在于， 所述 HCV核酸样本是从 HCV的携带者 或 HCV培养装置中分离的。
3、 根据权利要求 2所述的方法， 其特征在于， 所述 HCV核酸样本选自血浆、 血清、 全血、 纯病毒培养物和携带 HCV的媒介生物的至少一种。
4、 根据权利要求 1所述的方法， 其特征在于， 在对所述 HCV核酸样本进行扩增之前， 进一步包括将所述 HCV核酸样本进行逆转录。
5、 根据权利要求 1所述的方法， 其特征在于， 进一步包括： 利用第二引物组， 对所述 第一扩增产物进行扩增， 以便得到第二扩增产物， 并对所述第二扩增产物进行测序，
其中， 所述第二引物组包括第五引物和第六引物的组合、 以及第七引物和第八引物的 组合的至少一种， 所述第五引物具有如 SEQ ID NO: 5所示的核苷酸序列， 所述第六引物具 有如 SEQ ID NO: 6所示的核苷酸序列， 所述第七引物具有如 SEQ ID NO: 7所示的核苷酸 序列， 所述第八引物具有如 SEQ ID NO: 8所示的核苷酸序列。
6、 根据权利要求 1所述的方法， 其特征在于， 进一步包括通过选自琼脂糖凝胶电泳切 胶、 磁珠纯化和纯化柱纯化的至少一种分离纯化所述第一扩增产物。
7、 根据权利要求 1所述的方法， 其特征在于， 所述测序釆用第一代测序方法， 优选地 釆用 Sanger法， 特别优选地釆用 3730测序仪进行测序。
8、 根据权利要求 1所述的方法， 其特征在于， 基于所述测序结果， 确定所述 HCV核 酸样本中预定区域的核酸序列进一步包括：
将所述测序结果与参照序列进行比对， 以便确定所述 HCV核酸样本中预定区域的核酸 序列。
9、 一组 PCR引物， 其特征在于， 包含第一引物和第二引物的组合、 以及第三引物和第 四引物的组合的至少一种， 所述第一引物具有 SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列， 所述第二 引物具有 SEQ ID NO: 2所示的核苷酸序列， 所述第三引物具有 SEQ ID NO: 3所示的核苷 酸序列， 所述第四引物具有 SEQ ID NO: 4所示的核苷酸序列。
10、 根据权利要求 9所述的 PCR—组引物， 其特征在于， 进一步包括第五引物和第六 引物的组合、 以及第七引物和第八引物的组合的至少一种， 所述第五引物具有如 SEQ ID NO: 5所示的核苷酸序列， 所述第六引物具有如 SEQ ID NO: 6所示的核苷酸序列， 所述 第七引物具有如 SEQ ID NO: 7所示的核苷酸序列， 所述第八引物具有如 SEQ ID NO; 8所 示的核苷酸序列。
11、 一种试剂盒， 其特征在于， 包含权利要求 9或 10所示的一组 PCR引物。
12、 权利要求 11的试剂盒在检测 HCV基因的预定区域核酸序列的用途。
13、一种确定 HCV核酸样本中预定区域核酸序列的系统，所述预定区域为选自 5' UTR 和 NS5的至少之一， 其特征在于， 所述系统包括：
扩增装置，所述扩增装置中设置有权利要求 9或 10所示的一组 PCR引物，用于对所述 HCV核酸样本进行扩增， 以便得到第一扩增产物；
测序装置， 所述测序装置与所述扩增装置相连， 并且适于对所述第一扩增产物进行测 序， 以便得到测序结果； 以及
分析装置，所述分析装置与所述测序装置相连，用于基于所述测序结果，确定所述 HCV 核酸样本中预定区域的核酸序列。
14、 根据权利要求 13所述的系统， 其特征在于， 进一步包括：
核酸分离装置，所述核酸分离装置适于从 HCV携带者或 HCV培养装置中分离 HCV核 酸样本。
15、 根据权利要求 13所述的系统， 其特征在于， 所述测序装置为选自 Sanger法测序装 置的至少一种， 优选为 3730测序仪。
16、 根据权利要求 13所述的系统， 其特征在于， 所述分析装置进一步包括比对单元， 所述比对单元中存储有参照序列， 用于对所述测序结果与参照序列进行比对， 以便确定所 述 HC V核酸样本中预定区域核酸序列。
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