WO2014030137A1 - Souche vaccinale marquée du virus de la peste des petits ruminants, et son procédé d'obtention. - Google Patents

Souche vaccinale marquée du virus de la peste des petits ruminants, et son procédé d'obtention. Download PDF

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Cécile MINET
Patricia GIL
Emmanuel Albina
Olivier KWIATEK
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Centre De Cooperation Internationale En Recherche Agronomique Pour Le Developpement (Cirad)
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Definitions

  • the present invention relates to a marked vaccine strain of the small ruminant plague virus.
  • Peste desdriven ruminants is an infectious and contagious animal disease. With morbidity and mortality rates of up to 80% and 90-100% respectively, this disease has a significant economic impact in the countries where it is prevalent. It most often affects domestic small ruminants, such as goats and sheep, and more rarely wildlife. Described for the first time in 1942 in Côte d'Irium, PPR can be confused with other diseases of similar symptomatology, including rinderpest. Unlike the latter, PPR has not benefited from an international monitoring and control program, and therefore continues to progress by threatening to expand to other areas than those conventionally affected by the disease.
  • Peste des detrimental ruminants is caused by a virus of the genus Morbillivirus of the family Paramyxoviridae.
  • Morbilliviruses are involved in various diseases, affecting various hosts: the measles virus (MV for measles virus) in humans, the virus responsible for distemper (CDV for canine distemper virus) in canines, the virus of rinderpest virus (Rinderpest virus) affecting cattle and buffaloes, peste desdriven ruminants (PPRV), and morbilliviruses affecting marine mammals, seals with PDV (for phocine distemper virus) and cetaceans with CMV (for cetacean morbillivirus), which includes DMV (for dolphin morbillivirus), dolphin morbillivirus, and PMV (porpoise morbillivirus), porpoise morbillivirus.
  • Morbilliviruses are enveloped, pleomorphic viruses ranging in size from 150 to 700 nm. They have a genome of about 16 kilobases, consisting of a single-stranded negative RNA encoding six structural proteins: the nucleoprotein (N), the phosphoprotein (P), the matrix protein (M), the fusion protein (F ), hemagglutinin (H) and RNA-dependent RNA polymerase (L).
  • Nucleoprotein is the major protein of ribonucleoprotein (RNP), which is the essential minimal structure for transcription and replication of the viral genome in the cell cytoplasm.
  • the vaccine currently used against peste desdriven ruminants was developed in 1989, by attenuation of the virulent strain Nigéria 75/1 by successive passages in cell culture (Diallo et al., Rev Elev Med Vet Pays Trop, 42 (3). 311-319, 1989).
  • This current vaccine provides good protection for animals throughout their economic life, about three years, and has shown, after years of heavy use, all its harmlessness.
  • the sequence of this vaccine is available in GenBank under accession number X74443.
  • the disadvantage of using the current PPRV vaccine is that it is not possible to distinguish serologically between vaccinated and naturally infected animals, which makes it more expensive and time consuming to monitor the vaccine. sickness.
  • DIVA vaccines for "differentiation of infected and vaccinated animais" distinguish serologically a vaccinated animal from an infected animal.
  • Such vaccines may especially be recombinant vaccines, the viral genome being for example labeled by deletion, by substitution or by insertion of nucleotide sequence, or heterologous vaccines derived from the viral genome of another virus phylogenetically close to the virus to be treated, such as rinderpest morbillivirus in the case of a PPR vaccine.
  • a chimeric plague-small rinderpest virus in which the M, F and H genes of the rinderpest virus have been substituted by those of PPRV, has shown its efficacy as a vaccine in the protection of goats against PPRV (Mahapatra et al., J. Gen. Virol., 87: 2021-9, 2006).
  • Enzyme immunoassay in competitive ELISA is generally used.
  • the principle of the technique is to detect the presence of the virus in the serum extracted from a sick animal using a monoclonal antibody specific for one of the proteins constituting the viral particle.
  • an ELISA kit is currently commercialized for the implementation of a serum antibody competition based test with the 38-4 monoclonal antibody recognizing a motif located in the N-terminal region, between amino acids 116 and 150, viral nucleoprotein (Libeau et al., Res Vet Sci, 58 (1): 50-55, 1995).
  • the inventors sought to obtain an infectious clone of PPRV, and then incorporate a tag.
  • Infectious clones manipulated by reverse genetics have already been produced for some morbilliviruses, such as the measles virus (Schneider et al., J. Virol Methods, 64 (1): 57-64, 1997; Radecke et al., Embo, J., 14 (23): 5773-84, 1995, Parks et al., J. Virol., 73 (5): 3560-6, 1999. Takeda et al., J. Virol., 74 (14). ): 6643, 2000. Witko et al., J.
  • Hu et al. (Vet Res., 43: 48, 2012) recently reported obtaining a clone of PPR virus.
  • a DNA c clone (GenBank No. HQ197753) corresponding to the complete genome of the Nigeria 75/1 vaccine strain, placed under the control of the cytomegalovirus (pCMV) promoter, they inserted therein an expression cassette of the GFP ⁇ Green fluorescent protein).
  • pCMV cytomegalovirus
  • they co-transfected Vero cells (ATCC CCL-81) with the plasmid obtained as well as with plasmids expressing the proteins N, P and L of the virus.
  • Modified Vero cells expressing the canine form of the morbillivirus receptor, the SLAM molecule (for signaling lymphocyte activation molecule), were also used for transfection.
  • the inventors have succeeded, by a method different from that described by Hu et al., In obtaining an infectious clone of the PPR virus.
  • the subject of the present invention is therefore a process for obtaining an infectious clone of the small ruminant plague virus, comprising steps of:
  • the cells of the CV-1 cell line are green monkey kidney fibroblasts.
  • Adombi et al. J. Virol, Methods, 173: 306-313, 2011 have described obtaining cells, designated CHS-20, corresponding to CV-1 cells modified to express the goat SLAM protein (GenBank, DQ228869).
  • the cells of the Vero line are green monkey kidney epithelial cells and can be modified to express the goat SLAM protein according to techniques known to those skilled in the art.
  • T7 polymerase is bacteriophage T7 RNA polymerase. As the CV-1 or Vero cells do not express T7 polymerase naturally, it is necessary to provide means for expressing this enzyme in the cell. Methods to express T7 polymerase in a mammalian cell are known to those skilled in the art.
  • the cells are preferably infected beforehand with the aid of a recombinant non-replicative virus of avian pox, called Fowlpox, expressing the T7 polymerase (FP-T7), or transfected with a plasmid expressing T7 RNA polymerase, for example under the promoter of cytomegalovirus (plasmid pCMV-T7).
  • a cloning plasmid including DNA c of the complete genome of the PPR virus is obtained by isolating the viral genomic RNA from cells infected with the virus, amplifying said RNA in several fragments, and assembling said fragments into the cloning plasmid DNA to reconstitute the complete genome 0, under control of the promoter of T7 polymerase.
  • the cloning plasmid may be selected or prepared, by techniques known per se, so as to include a multiple cloning site grouping the enzymatic restriction sites allowing the insertion of the different fragments.
  • commercial cloning plasmids can be used by modifying, if necessary, the multiple cloning site.
  • the viral genome is that of PPRV of the Nigeria strain 75/1, obtained by attenuating the Nigerian virulent strain of PPRV, Nigeria 75/1, by serial passage on Vero cells.
  • the complete genome of this vaccine strain has been sequenced (GenBank, X74443).
  • the invention also relates to an infectious clone of the small ruminant plague virus, such that it can be obtained by the method according to the invention as just defined.
  • step a) further comprises the labeling of the DNA c of the complete genome.
  • This marking may be carried out in different ways, according to known methods of DNA manipulation, and in particular by insertion of a heterologous DNA sequence in this C, by deletion of a fragment of this DNA C, or by substitution of a fragment of this DNA encoding an endogenous C epitope of said viruses with a fragment encoding an exogenous epitope (ie ie, not present in the PPR virus), both epitopes being recognized by different paratopes.
  • the endogenous epitope is chosen in particular for its immunogenicity which must be sufficient to allow a good detection of the PPR virus in the sera of animals that have been naturally infected.
  • the endogenous epitope and the exogenous epitope should be chosen so that the substitution does not alter the function of the protein of interest.
  • their respective sizes which may be identical or different, may for example be between 2 and 30 amino acids, preferably between 3 and 20 amino acids, and more particularly between 4 and 15 amino acids.
  • their size will be the same at 1, 2 or 3 amino acids.
  • Peptides which can be used as an exogenous epitope are, for example, peptides called "tags", are fragments of natural proteins or synthetic peptides, which are marketed as markers for their use in molecular biology.
  • tags are fragments of natural proteins or synthetic peptides, which are marketed as markers for their use in molecular biology.
  • Tag peptides it is possible to replace part of a gene in the genome of the virus. of PPR by a homologous sequence present in another morbillivirus.
  • a homologous sequence is chosen by the usual means of genetics. For example, after alignment of the protein sequences of the different morbilliviruses (RPV, MV, CDV, PDV, CMV) in the region of the genome concerned, the sequences closest to that of PPRV 75/1 are chosen.
  • a chimeric peptide can also be synthesized, for example by taking over the amino acids most frequently found at each of the positions in the different morbilliviruses.
  • the inventors have in particular identified a region in the C-terminal part of the N protein, specific for the PPR virus, as well as marker sequences making it possible to maintain the expression and the functionality of the N protein.
  • the identified epitope within N protein has been named peptide E and is encoded by nucleotides 1557-1592 of the c DNA of the viral genome. Its sequence is XiX 2 REAQRSAEAL (SEQ ID NO: 1), in which Xi represents T or N, and X 2 represents S or P.
  • SEQ ID NO: 14 the sequence of this region of the N protein in the vaccine strain Nigeria 75/1 (GenBank, X74443) is NPREAQRSAEAL (SEQ ID NO: 14).
  • the sequences TSREAQRSAEAL (SEQ ID NO: 15) or TPREAQRSAEAL (SEQ ID NO: 16) were found in other strains of the PPR virus.
  • the exogenous epitope is chosen from the peptide EQKLISEEDL SEQ ID NO. : 2 derivative of the c-myc protein, the peptide EDQVDPRLIDGK SEQ ID NO. : 3 derivative of protein C, and the peptide DPISIQKSAEAL SEQ ID NO. : 4 derivative of the dolphin morbillivirus N protein, said peptide being homologous to the PPR virus E peptide.
  • the choice to modify the N gene is particularly advantageous because the anti-N antibodies are the first synthesized and are the majority during the immune response produced by animals infected or vaccinated with the PPR virus.
  • the subject of the invention is also a recombinant virus labeled with the plague of small ruminants, which can be obtained by this particular embodiment of the process of the invention.
  • said virus comprises the Nigeria 75/1 vaccine strain, wherein amino acids 484 to 495 of nucleoprotein N (GenBank CAA52454.1), corresponding to peptide E, are replaced by a marker epitope selected from peptide SEQ ID NO: 2 derived from the c-myc protein, peptide SEQ ID NO: 3 derived from protein C, and peptide SEQ ID NO: 4 derived from the N protein of dolphin morbillivirus.
  • Another subject of the invention is a method for labeling an infectious clone of the small ruminant plague virus, comprising the substitution of a fragment of the cDNA of said virus encoding an endogenous epitope of sequence SEQ ID NO: 1, with a fragment coding for an exogenous epitope chosen from the peptide SEQ ID NO. : 2 derivative of the c-myc protein, the peptide SEQ ID NO. : 3 derivative of protein C, and the peptide SEQ ID NO. : 4 Derived from the N protein of dolphin morbillivirus.
  • the invention also relates to a DNA molecule encoding the recombinant c marked plague virus of small ruminants as just defined.
  • Another object of the invention is any plasmid containing a DNA molecule encoding the recombinant c marked with the PPR virus.
  • An object of the invention is also a host cell transformed with a plasmid containing a DNA molecule c encoding the recombinant virus labeled small ruminant plague.
  • the invention also relates to the recombinant virus labeled PPR according to the invention for use as a prophylactic or therapeutic vaccine against plague of small ruminants.
  • Another subject of the invention is a labeled vaccine against plague of small ruminants, or an immunogenic composition comprising the recombinant virus labeled according to the invention.
  • Such a vaccine is a DIVA vaccine, allowing the distinction between vaccinated and naturally infected animals.
  • the invention also relates to a kit for the serological diagnosis of peste desdriven ruminants, this kit containing monoclonal antibodies directed specifically against an epitope in the C-terminal part of the N protein of the small ruminant plague virus, having as a sequence SEQ ID NO. 1, and anti-mark monoclonal antibodies directed specifically against a marker epitope such as peptide SEQ ID NO. : 2 derivative of the c-myc protein, the peptide SEQ ID NO. : 3 derivative of protein C, and homologous peptide SEQ ID NO. : 4 Derived from the N protein of dolphin morbillivirus.
  • Monoclonal antibodies that are not already available can be obtained by conventional methods of biology.
  • Such a kit may be used in C-ELISA.
  • the DIVA vaccine according to the invention can be used in particular in a campaign to eradicate PPR and makes it possible to envisage, in association with a C-ELISA diagnosis using a kit according to the invention, that to distinguish between animals naturally infected with the virus and animals vaccinated as part of this campaign.
  • the Nigeria 75/1 vaccine strain is derived from the Nigeria 75/1 virulent strain attenuated by successive passages on cells (Diallo et al., 1989, cited above).
  • the complete genome of the Nigeria 75/1 vaccine strain virus is available in GenBank under number X74443.
  • clone 1 containing the T7 polymerase promoter (pT7), the hammerhead ribozyme sequence (Hammerhead ribozyme, HamRz), the 3'-extracistronic region (the "leader"), the N gene in full, the NP intergenic sequence and the beginning of the P gene;
  • clone 2 (pPMintpCRII), containing the P and M genes in their entirety, a fragment of the N-P and M-F intergenic sequences, and the sequence between the P and M genes;
  • clone 3 (17MLmut) containing part of the M-F intergenic sequence, the entire F gene, the F-H intergenic sequence, the entire H gene, the H-L intergenic sequence, and the beginning of the L gene;
  • clone 4 (pL-BKS-IREST7), containing the end of the H sequence, the HL intergenic part, the L gene as a whole and the 5 '-extracistronic region (the "trailer"), as well as the internal sequence of ribosome entry site (IRES), ribozyme delta of hepatitis C virus and terminator of T7 polymerase (riboT7ter).
  • These clones furthermore include each of the unique restriction sites allowing their assembly in the cloning plasmid pBKSmodifMCS which was obtained by replacing the multiple cloning site (MCS) of the plasmid pBluescriptKSII (Stratagene, France) with a MCS grouping the restriction sites.
  • MCS multiple cloning site
  • adapted to the cloning strategy Bss HII (620), Bgl I (633), Rsr II (639), Age I (645), Sac II (655), Swa I (661)).
  • the four fragments of the whole genome of the Nigeria 75/1 vaccine strain virus could then be assembled according to the strategy shown in Figures 2 and 3.
  • the 17MLmut clone was inserted into the plasmid pBKSmodifMCS to obtain the plasmid passemblagel.
  • clone 3 containing the T7 polymerase promoter, is then inserted into assemblagel to generate the intermediate plasmid passembling2 (FIG. 2).
  • the plasmid pPMintpCRII is inserted in assemble2 to obtain assembly3 in which pL-BKS-IREST7 is cloned to generate the final plasmid assembly4term compatible with the reconstitution system used in Example 2, which contains the complete viral genome of PPRV 75/1, framed in 3 'by the promoter pT7 and HamRz, and in 5' by the ribozyme delta and the terminator T7ter ( Figure 3).
  • the clone obtained was sequenced in its entirety and has the sequence SEQ ID NO. : 5. Twenty-eight sequence differences were noted relative to the parental virus (PPRV Nigeria 75/1 vaccine strain). Eight of these errors (Figure 4) modify the codons: two on the H gene at positions 7961 and 8829, and six on the L gene at positions 9585, 11551, 13212, 13924, 13939 and 14543. These differences in sequence have not been an obstacle to obtaining an infectious clone of the PPR virus.
  • EXAMPLE 2 OBTAINING AN INFECTIOUS CLONE FROM VACCINE VIRUSES PPRV 75/1.
  • the system consists in producing, in the cytoplasm of host cells, plasmid DNA from the RNA corresponding to the viral genome and the mRNA of the proteins N, P and L. These three proteins are then synthesized by the cell and s self-assemble with viral genomic RNA to form ribonucleoprotein (RNP) which will generate an infectious virus.
  • RNP ribonucleoprotein
  • the first two reconstitution tests of the PPRV 75/1 virus were carried out by transfection either on 293-T7 cells stably expressing T7 RNA polymerase, or on Vero cells previously infected with the recombinant Fowlpox-T7 virus (FP -T7).
  • Vero cells (cultured in modified Eagle medium (MEM, Eurobio, France) + 1% L-glutamine + 10% fetal bovine serum (FCS)) and 293-T7 cells (cultured in Dulbecco D EM + medium) 10% FCS) are prepared in a 6-well plate and incubated at 37 ° C. under 5% CO 2 so as to be 60-80% confluent at 24 hours at the time of transfection.
  • MCS modified Eagle medium
  • FCS fetal bovine serum
  • Vero cells do not express T7 RNA polymerase. It is therefore necessary to provide this enzyme through a recombinant virus, in this case the recombinant virus FP-T7.
  • FP-T7 the recombinant virus
  • Vero cells were infected with FP-T7 at a multiplicity of infection (MOI) of 0.1 per cell. After 2 hours of infection, the inoculum was removed and co-transfection performed.
  • MOI multiplicity of infection
  • the plasmid assembly4term was co-transfected with the plasmids containing the N, P and L genes of PPRV placed either under ⁇ 4
  • DogSLA tag which are Vero cells expressing a morbillivirus receptor for distemper (CDV), the CD150 receptor (or SLAM for "signaling lymphocyte activation molecule" of dog (Takeda et al., J. Virol., 80 (9): 4242-8, 2006).
  • CDV morbillivirus receptor for distemper
  • SLAM SLAM for "signaling lymphocyte activation molecule”
  • DogSLAMtag were previously infected with FP-T7 at 0.1 MOI per cell, and then co-transfected with plasmids N, P, L and assemble4term, in the presence of lipofectamine 2000, as previously described for Vero cells.
  • the RT-PCR reaction was carried out in a single step with the "One-step RT-PCR kit” (Qiagen, France), the ⁇ -actin household gene primers, pact1 and act2, and the PPRV-specific primers. 75/1, NP3 and NP4 specific for the N gene and HP46 and HP47 specific for the H gene.
  • the control of the c DNA synthesis was done by PCR specific to the ⁇ -actin household gene. All samples were amplified
  • Figure 7 shows the results of the specific RT-PCR of N-PPRV, obtained with primers NP3 and NP4.
  • Figure 7b shows the results J.6
  • RT-PCR specific RT-PCR of H-PPRV, obtained with primers HP46 and HP47.
  • the top part corresponds to the direct PCR on RNA and the bottom part to RT-PCR.
  • the different tracks are: "+”: PCR positive control; "-": negative control of PCR; 1: supernatant of passage 3; 2: supernatant of passage 4; 3: supernatant of passage 5; D: RNA treated with DNase; d: RNA diluted to be in the same conditions as the RNA treated with DNase.
  • CHS-20 cells are cells of the CV-1 (ATCC # CCL-70) cell line modified to express the goat SLAM protein (GenBank # DQ228869).
  • CHS-20 cells were prepared and transfected in the same manner as described above for Vero cells.
  • DogSLAMtag preparation of the cells 24h in advance to be at 60-80% confluence, infection with FP-T7 at 0.1 MOI per cell for 2h, then transfection with the 4 plasmids pNPC, pPPC, pLPC and reassembly4term in presence of lipofectamine 2000. ⁇ 7
  • RT-qPCR quantitative RT-PCR
  • the harvested supernatants were titrated by indirect immunofluorescence in comparison with the original PPRV 75/1 vaccine strain.
  • the viral titre for the infectious clone is therefore about 3 logs (log 10) lower than the parental PPRV 75/1 virus. This difference can be directly ⁇ 9
  • the labeling strategy chosen is based on the substitution of a highly immunogenic epitope by another immunogenic sequence, which does not lead to a cross-immune reaction with the original epitope to allow the distinction by immunoserological tests between vaccinated animals and animals. infected.
  • a highly immunogenic epitope specific for the plague of small ruminants, the peptide E could be identified in the
  • FIG. 9 shows an alignment of the protein sequences of different morbilliviruses in the homologous zone of the peptide E.
  • the replacement of the peptide E of PPRV 75/1 by the corresponding sequence of another morbillivirus must make it possible to mark the vaccine while remaining the most possible close to a morbillivirus genetic background in order to limit the functional consequences of genome modification.
  • the modification must also be sufficient for it to affect the antigen used in the diagnosis. For this purpose, it is important to choose a morbillivirus sufficiently far from PPRV to avoid cross-reactions.
  • the different peptides Tag and morbillivirus were evaluated on their immunogenic capacity in rabbits and goats.
  • the Tag peptides are injected into the goat intramuscularly, at a rate of 1 ml to 1 mg / ml mixed with 1 ml of complete Freund's adjuvant. A booster injection is given under the same conditions three weeks later.
  • the blood samples are taken every week and the sera are harvested and tested in ELISA.
  • rabbits were immunized to generate polyclonal sera against the different morbillivirus peptides for use as a positive control serum in serology tests associated with the vaccine.
  • the rabbit is the ideal species to produce a large amount of polyclonal serums.
  • a first injection of 1 ml of peptide (at a concentration of 1 mg / ml) mixed with 1 ml of Freund's complete adjuvant is made to the rabbits subcutaneously. Two booster injections are performed 15 days apart.
  • the rabbits are anesthetized (Imalgen, Sanofi, France), then bled to collect the maximum amount of blood.
  • the sera are harvested and tested in ELISA, in comparison with the peptide E.
  • the results of the ELISA tests showed that, among the peptides tested, only the c-myc peptide, the protein C, and the peptide 4 (derived from the morbillivirus of dolphin) are sufficiently immunogenic (Figure 10).
  • the expression of the mutated or non-mutated N genes was verified by immunofluorescence, direct or indirect.
  • the plasmids NPC corresponding to the plasmid including the gene encoding the non-mutated N protein
  • NPCmutdauph corresponding to the plasmid including the gene encoding the N protein integrating the dolphin peptide
  • the anti-peptide E antibody is a rabbit polyclonal specific for the peptide E. This peptide is present only in the nucleoproteins of PPRV and used at a 1/10 dilution. A FITC conjugate antibody, specific for rabbit IgG and diluted 1/80, was then added. The anti-peptide 4 antibody is a rabbit polyclonal specific for peptide 4. This peptide is present only in DMV nucleoproteins and was used at a 1/10 dilution. The monoclonal antibody 38-4 (recognizing the motif consisting of amino acids 116 to y .3
  • the optimal dilution was established using a dilution range of 1/25 to 1/400.
  • Figure 11 shows the in vitro expression results of the modified N protein measured by immunofluorescence (x20 magnification).
  • the red fluorescence relative to the TRITC 38-4 conjugate antibody shows all the N-PPR proteins whether they are mutated or not (FIGS. 11 a and b).
  • Green fluorescence is induced by the detection of peptide 4 by anti-peptide 4 antibody and anti-FITC conjugated rabbit IgG antibody. It thus makes it possible to differentiate the mutated nucleoproteins from those which are not ( Figure 11c and d).
  • the green fluorescence observed in FIG. 11e and f, makes it possible to demonstrate the presence of peptide E, that is to say the presence of non-mutated nucleoproteins.
  • the N-PPR gene of the NPC plasmid induced the production of nucleoproteins (FIG. 11 a) presenting the peptide E (FIG. 11 e).
  • the absence of fluorescence observed during the revelation with the anti-peptide 4 antibody on these same cells confirms that there is no cross-reaction between the anti-peptide 4 antibody and the peptide.
  • the mutated N-PPR gene of the plasmid NPCmutdauph allowed the production of nucleoproteins (FIG. 11b) presenting the peptide 4 (FIG. 11d).
  • FIG. 11 f As the E-peptide site has disappeared, no fluorescence is observed during revelation with the antibody specific for peptide E (FIG. 11 f). This confirms the absence of cross reaction between the anti-peptide E antibody and the peptide 4.
  • the plasmids of the mini-genome and those respectively encoding the N protein (N modified or not), the protein P, and the protein L, were transfected according to the ratio 20: 20: 20: 1 as previously, at the using lipofectamine 2000, 24 hour Vero cells and 60-70% confluence distributed in 12-well plate.
  • the ratio of DNA: transfectant used was 1: 3.
  • the positive control consisted in transfecting the cells possessing the T7 polymerase RNA with the mini-genome and then infecting them with the vaccine strain PPRV75 / 1, at a concentration of 1 DITC 50 .
  • the negative control meanwhile, was obtained in the absence of plasmid encoding polymerase L.
  • Figure 12 shows the results of the detection of eGFP fluorescence in cells. The photographs in the upper line are those in the UV, the lower line showing the same photographs in the visible. Fluorescent cells were observed for the positive controls (Fig. 12b and d) and the modified N protein assay (Fig. 12c). No fluorescence was obtained with the negative control (Fig. 12 a).
  • RNA samples were treated at the z5
  • RNA and mRNA extracts were thus subjected to a reverse transcriptase (RT) reaction using the kit "first strand cDNA synthesis” (GE Healthcare).
  • RT reverse transcriptase
  • the control of the DNA synthesis c was carried out by PCR on household gene Pactin with primers actl and pact2.
  • Primers F and Cl-eGFP eGFP-Cl R, specific of the eGFP gene were used to amplify this eGFP gene present in the cDNA.
  • the amplified fragment has a size of about 600 base pairs (bp).
  • the sequences of the different primers used are shown in Table 5 below.
  • the PCR reaction was carried out according to the instructions of the supplier of the enzyme Taq DNA polymerase (Qiagen, France) as well as according to the program described in Table 6 below. 50-100 ng of DNA or RNA was added to each tube.
  • the negative control consisted of water and the positive control in a peGFP-C1 plasmid containing the gene of interest coding for the eGFP.
  • PCR products were then analyzed on a 1% agarose gel in Tris acetic acid EDTA buffer (TAE) IX, to which 5 ⁇ l of REDGEL® (Interchim, France) was added. 2.5 ⁇ l of loading blue were added to each PCR product, and 12 ⁇ l of each sample were placed in the wells. After about 1 hour of migration at 120V, the visualization of the result was made under UV using an imaging gel (Biorad).
  • TAE Tris acetic acid EDTA buffer
  • Figure 13 shows the RT-PCR results for DNA C obtained from the m RNA (1: Negative control PCR; 2: Positive control PCR; 3: Marker 100 bp; 4: cells alone; 5: Cells + minigenome; 6: Cells + Minigenome + N + P + L; 7: Cells + Minigenome + N Modified + P + L; 8: Cells + Minigenome + PPR). While for the C DNA from the RNA t, there eGFP gene amplification for all samples and the positive control PCR for DNA obtained from C ra RNA, amplification of eGFP gene is only present for samples 6, 7 and 8. The PCR result confirms that observed by fluorescence microscopy reading.
  • the nucleoprotein N-PPRV 75/1 modified by substitution and cloned under pCMV is well functional.

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Abstract

La présente invention concerne l'obtention d'une souche vaccinale marquée du virus de la peste des petits ruminants, par production d'un clone infectieux, et marquage de ce clone par substitution d'un épitope dudit virus par un épitope exogène.

Description

SOUCHE VACCINALE MARQUEE DU VIRUS DE LA PESTE DES PETITS RUMINANTS , ET SON PROCÉDÉ D ' OBTENTION
La présente invention concerne une souche vaccinale marquée du virus de la peste des petits ruminants .
La peste des petits ruminants (PPR) est une maladie animale infectieuse et contagieuse. Avec des taux de morbidité et de mortalité pouvant atteindre respectivement 80 % et 90-100 %, cette maladie a un impact économique important dans les pays où elle sévit. Elle affecte le plus souvent les petits ruminants domestiques, tels que chèvres et moutons, et plus rarement la faune sauvage. Décrite pour la première fois en 1942 en Côte d'Ivoire, la PPR peut être confondue avec d'autres maladies de symptomatologie similaire, notamment la peste bovine. Contrairement à cette dernière, la PPR n'a pas bénéficié de programme international de surveillance et de contrôle, et continue par conséquent de progresser en menaçant de s'étendre à d'autres zones que celles classiquement touchées par la maladie.
La peste des petits ruminants est due à un virus du genre Morbillivirus de la famille des Paramyxoviridae . Les Morbillivirus sont impliqués dans différentes maladies, affectant divers hôtes : le virus de la rougeole (MV pour measles virus) chez l'homme, le virus responsable de la maladie de Carré (CDV pour canine distemper virus) chez les canidés, le virus de la peste bovine (RPV pour rinderpest virus) affectant les bovins et les buffles, le virus de la peste des petits ruminants (PPRV), et les morbillivirus affectant les mammifères marins, les phoques avec le PDV (pour phocine distemper virus) et les cétacés avec le CMV (pour cetacean morbillivirus) , qui regroupe le DMV (pour dolphin morbillivirus) , morbillivirus de dauphin, et le PMV (pour porpoise morbillivirus) , morbillivirus de marsouins. Les morbillivirus sont des virus enveloppés, pléomorphes, dont la taille varie de 150 à 700 nm. Ils ont un génome d'environ 16 kilobases, constitué d'un ARN négatif simple brin codant pour six protéines structurales : la nucléoprotéine (N) , la phosphoprotéine (P) , la protéine de matrice (M), la protéine de fusion (F), l' hémagglutinine (H) et l'ARN polymérase ARN-dépendante (L) . La nucléoprotéine est la protéine majoritaire de la ribonucléoprotéine (RNP) , qui constitue la structure minimale essentielle pour la transcription et la réplication du génome viral dans le cytoplasme cellulaire.
Le vaccin actuellement utilisé contre la peste des petits ruminants a été développé en 1989, par atténuation de la souche virulente Nigéria 75/1 par passages successifs en culture cellulaire (Diallo et al., Rev Elev Med Vet Pays Trop, 42(3) .311-319, 1989). Ce vaccin actuel offre une bonne protection aux animaux durant toute leur vie économique, soit environ trois ans, et a montré, après des années d'utilisation massive, toute son innocuité. La séquence de ce vaccin est disponible dans GenBank sous le numéro d'accession X74443. L'inconvénient lié à l'utilisation du vaccin anti-PPRV actuel est qu'il n'est pas possible de faire de distinction sérologique entre les animaux vaccinés et les animaux infectés naturellement, ce qui rend plus longue et plus coûteuse la surveillance de la maladie. Faire cette distinction serait une amélioration importante pour permettre un programme de vaccination efficace en temps et en coût, en particulier en réalisant une vaccination éclairée et ciblée, et en ne bloquant pas inutilement la circulation des animaux, notamment dans le cadre d'échanges commerciaux des ovins et caprins. Il existe donc aujourd'hui un besoin de développer un vaccin qui permettrait, associé à un test de diagnostic adapté, de faire cette distinction entre animaux vaccinés et animaux infectés.
Les vaccins DIVA (pour "differentiation of infected and vaccinated animais" ) permettent de distinguer sérologiquement un animal vacciné d'un animal infecté. De tels vaccins peuvent être notamment des vaccins recombinants, le génome viral étant par exemple marqué par délétion, par substitution ou par insertion de séquence nucléotidique , ou des vaccins hétérologues dérivés du génome viral d'un autre virus proche phylogénétiquement du virus à traiter, tel que le morbillivirus de la peste bovine dans le cas d'un vaccin contre la PPR. A titre d'exemple, un virus chimère peste bovine-peste des petits ruminants, dans lequel les gènes M, F et H du virus de la peste bovine ont été substitués par ceux du PPRV, a montré son efficacité comme vaccin dans la protection de chèvres contre le PPRV (Mahapatra et al., J. Gen . Virol., 87 : 2021-9, 2006) .
Les symptômes de la PPR pouvant facilement être confondus avec ceux de la peste bovine, il est important de faire un diagnostic sérologique de la maladie. La méthode immuno-enzymatique en ELISA par compétition (C-ELISA) est en général utilisée. Le principe de la technique est de détecter la présence du virus dans le sérum extrait d'un animal malade à l'aide d'un anticorps monoclonal spécifique d'une des protéines constituant la particule virale. Par exemple, un kit ELISA est actuellement commercialisé pour la mise en œuvre d'un test basé sur une compétition des anticorps sériques avec l'anticorps monoclonal 38-4 reconnaissant un motif situé dans la région N-terminale, entre les acides aminés 116 et 150, de la nucléoprotéine virale (Libeau et al., Res Vet Sci, 58(1) : 50-55, 1995). Ce test réalisé sur le sérum d' animaux vaccinés avec le vaccin anti-PPRV constitué de la souche Nigéria 75/1 atténuée donne un résultat similaire à ce même test réalisé sur le sérum d'animaux infectés naturellement par le PPRV. D' autres anticorps monoclonaux dirigés contre des antigènes du PPRV ont été obtenus, notamment dirigés contre la protéine H (Anderson et al., Epidemiol . Infect., 112 : 225-31, 1994), ou contre la protéine N (Libeau et al., Vet. Microbiol., 31 : 147-60, 1992). Pour permettre la distinction entre animaux vaccinés et animaux infectés par le virus sauvage, il faut en plus d'un vaccin DIVA disposer d'un test de diagnostic adapté, en particulier des anticorps monoclonaux adaptés pour la détection des antigènes par C-ELISA.
Il serait avantageux de disposer d'un vaccin anti-PPRV marqué basé sur un virus recombinant de la peste des petits ruminants. Cependant, pour obtenir un tel virus recombinant, il est nécessaire de disposer d'un clone infectieux du virus de la PPR (PPRV) .
Dans ce contexte, les Inventeurs ont cherché à obtenir un clone infectieux du PPRV, pour ensuite y intégrer un marquage. Des clones infectieux manipulés par génétique inverse ont déjà été produits pour certains morbillivirus , tel que le virus de la rougeole (Schneider et al., J. Virol. Methods, 64(1) : 57-64, 1997 ; Radecke et al., Embo. J. , 14(23) :5773-84, 1995 ; Parks et al., J. Virol., 73(5) :3560-6, 1999 ; Takeda et al., J. Virol., 74 (14): 6643, 2000 ; Witko et al., J. Virol. Methods, 135(1) : 91-101, 2006), de la maladie de Carré (Gassen et al., J. Virol., 74(22) :10737-44, 2000 ; Witko et al., 2006, précité) et de la peste bovine (Baron et al., J. Virol., 71(2) .1265-71, 1997 ; Das et al., J. Virol., 74(19) : 9039-47, 2000). Pour des raisons encore non établies mais supposées être liées à la séquence de son génome, la génération d'un clone infectieux du virus de la PPR n'avait pas abouti jusqu'à récemment, malgré l'investissement de plusieurs équipes de recherche au niveau international.
Hu et al. (Vet. Res., 43 :48, 2012) ont récemment décrit l'obtention d'un clone du virus de la PPR. Après avoir obtenu un clone d'ADNc (GenBank n° HQ197753) correspondant au génome complet de la souche vaccinale Nigéria 75/1, placé sous contrôle du promoteur du cytomégalovirus (pCMV) , ils y ont inséré une cassette d'expression de la GFP {Green fluorescent protein) . Puis, ils ont co-transfecté des cellules Vero (ATCC CCL-81) avec le plasmide obtenu ainsi qu'avec des plasmides exprimant les protéines N, P et L du virus. Des cellules Vero modifiées, exprimant la forme canine du récepteur à morbillivirus, la molécule SLAM (pour signalling lymphocyte activation molécule) , ont également été utilisées pour la transfection .
Les Inventeurs ont réussi, par un procédé différent de celui décrit par Hu et al., à obtenir un clone infectieux du virus de la PPR.
La présente invention a donc pour objet un procédé d'obtention d'un clone infectieux du virus de la peste des petits ruminants, comprenant des étapes de :
a) obtention d'un plasmide de clonage incluant l'ADNc du génome complet du virus, sous contrôle du promoteur de la polymérase T7 ;
b) transfection de cellules CV-1 ou Vero, transformées pour exprimer le récepteur SLAM de la chèvre, et exprimant la polymérase T7, avec le plasmide de clonage et avec des plasmides incluant respectivement l'ADNc des gènes N, P et L du virus ;
c) mise en culture des cellules transfectées et amplification du clone infectieux.
Les cellules de la lignée cellulaire CV-1 (ATCC, CCL-70) sont des fibroblastes de rein de singe vert. Adombi et al. (J. Virol. Methods, 173 : 306-313, 2011) ont décrit l'obtention de cellules, appelées CHS-20, correspondant à des cellules CV-1 modifiées pour exprimer la protéine SLAM de la chèvre (GenBank, DQ228869) .
Les cellules de la lignée Vero (ATCC, CCL-81) sont des cellules épithéliales de rein de singe vert et peuvent être modifiées pour exprimer la protéine SLAM de la chèvre selon des techniques connues de l'homme du métier.
La polymérase T7 est l'ARN polymérase du bactériophage T7. Les cellules CV-1 ou Vero n'exprimant pas naturellement la polymérase T7, il est nécessaire d'apporter des moyens d'expression de cette enzyme dans la cellule. Les méthodes pour faire exprimer la polymérase T7 dans une cellule de mammifère sont connues de l'homme du métier. Notamment, les cellules sont préalablement infectées de préférence à l'aide d'un virus recombinant non réplicatif de la variole aviaire, appelé Fowlpox, exprimant la polymérase T7 (FP-T7), ou transfectées avec un plasmide exprimant l'ARN polymérase T7, par exemple sous promoteur du cytomégalovirus (plasmide pCMV-T7).
En particulier, un plasmide de clonage incluant l'ADNc du génome complet du virus de la PPR est obtenu par l'isolement de l'ARN génomique viral à partir de cellules infectées par le virus, l'amplification dudit ARN en plusieurs fragments, et l'assemblage desdits fragments dans le plasmide de clonage pour reconstituer l'ADN0 du génome complet, sous contrôle du promoteur de la polymérase T7. Le plasmide de clonage peut être choisi ou préparé, par des techniques connues en elles-mêmes, de façon à inclure un site multiple de clonage regroupant les sites de restriction enzymatique permettant l'insertion des différents fragments. En particulier, des plasmides de clonage commerciaux peuvent être utilisés en en modifiant si nécessaire le site multiple de clonage.
Par exemple, le génome viral est celui du virus de la peste des petits ruminants de la souche vaccinale Nigéria 75/1, obtenue par atténuation de la souche virulente nigériane du PPRV, Nigéria 75/1, par passages en série sur cellules Vero. Le génome complet de cette souche vaccinale a été séquencé (GenBank, X74443) .
L'invention a également pour objet un clone infectieux du virus de la peste des petits ruminants, tel qu'il peut être obtenu par le procédé selon l'invention tel qu'il vient d'être défini.
Selon un mode de réalisation particulier du procédé de l'invention, pour obtenir un virus marqué, l'étape a) comprend en outre le marquage de l'ADNc du génome complet. Ce marquage peut être réalisé de différentes manières, selon des méthodes connues de manipulation de l'ADN, et notamment par insertion d'une séquence hétérologue dans cet ADNC, par délétion d'un fragment de cet ADNC, ou par substitution d'un fragment de cet ADNC codant pour un épitope endogène dudit virus par un fragment codant pour un épitope exogène (c'est-à-dire n'étant pas présent dans le virus de la peste des petits ruminants) , les deux épitopes étant reconnus par des paratopes différents.
L' épitope endogène est choisi notamment pour son immunogénicité qui doit être suffisante pour permettre une bonne détection du virus de la PPR dans les sérums d'animaux qui auraient été infectés naturellement.
L' épitope endogène et l' épitope exogène doivent être choisis de manière à ce que la substitution n'altère pas la fonction de la protéine concernée. En particulier, leurs tailles respectives, qui peuvent être identiques ou différentes, pourront par exemple être comprises entre 2 et 30 acides aminés, avantageusement entre 3 et 20 acides aminés, et plus particulièrement entre 4 et 15 acides aminés. De préférence, leur taille sera la même à 1, 2 ou 3 acides aminés près.
Des peptides utilisables en tant qu' épitope exogène sont par exemple des peptides appelés « Tag », sont des fragments de protéines naturelles ou des peptides synthétiques, qui sont commercialisés en tant que marqueurs pour leur utilisation en biologie moléculaire. Parmi les peptides Tag disponibles, on choisit de préférence celui ou ceux qui sont les plus couramment utilisés et pour lesquels il existe des réactifs de diagnostic en C-ELISA ou un anticorps monoclonal commercial. Ensuite, pour confirmer qu'un Tag peut être utilisé comme marqueur dans le vaccin anti-PPRV, il faut s'assurer d'une part que des anticorps dirigés contre l' épitope sélectionné sont bien produits par l'animal cible, d'autre part que les sérums d'animaux cibles, infectés ou non par le PPRV, n' interagissent pas naturellement avec le Tag.
A titre d'alternative à ces peptides Tag, on peut remplacer une partie d'un gène dans le génome du virus de la PPR par une séquence homologue présente chez un autre morbillivirus. Une telle séquence homologue est choisie par les moyens habituels de la génétique. Par exemple, après alignement des séquences protéiques des différents morbillivirus (RPV, MV, CDV, PDV, CMV) dans la zone du génome concernée, les séquences se rapprochant le plus de celle de PPRV 75/1 sont choisies. Un peptide chimère peut aussi être synthétisé, en y reprenant par exemple les acides aminés les plus fréquemment retrouvés à chacune des positions dans les différents morbillivirus.
Les Inventeurs ont en particulier identifié une région dans la partie C-terminale de la protéine N, spécifique du virus de la PPR, ainsi que des séquences- marqueurs permettant de maintenir l'expression et la fonctionnalité de la protéine N. L'épitope identifié au sein de la protéine N a été nommé peptide E et est codé par les nucléotides 1557 à 1592 de l'ADNc du génome viral. Il a pour séquence XiX2REAQRSAEAL (SEQ ID NO : 1), dans laquelle Xi représente T ou N, et X2 représente S ou P. A titre d'exemple, la séquence de cette région de la protéine N chez la souche vaccinale Nigéria 75/1 (GenBank, X74443) est NPREAQRSAEAL (SEQ ID NO : 14 ). Pour la même région, les séquences TSREAQRSAEAL (SEQ ID NO: 15) ou TPREAQRSAEAL (SEQ ID NO: 16) ont été trouvées dans d'autres souches du virus de la PPR.
Selon une version avantageuse de l'invention, l'épitope exogène est choisi parmi le peptide EQKLISEEDL SEQ ID NO. : 2 dérivé de la protéine c-myc, le peptide EDQVDPRLIDGK SEQ ID NO. : 3 dérivé de la protéine C, et le peptide DPISIQKSAEAL SEQ ID NO. : 4 dérivé de la protéine N du morbillivirus de dauphin, ledit peptide étant homologue au peptide E du virus de la PPR.
De préférence, il s'agit du peptide SEQ ID
NO. : 4.
Le choix de modifier le gène N est particulièrement avantageux du fait que les anticorps anti-N sont les premiers synthétisés et sont majoritaires lors de la réponse immunitaire produite par des animaux infectés ou vaccinés par le virus de la PPR.
L'invention a aussi pour objet un virus recombinant marqué de la peste des petits ruminants, susceptible d'être obtenu par ce mode de réalisation particulier du procédé de l'invention. Par exemple, ledit virus comprend la souche vaccinale Nigéria 75/1, dans laquelle les acides aminés 484 à 495 de la nucléoprotéine N (GenBank CAA52454.1), correspondant au peptide E, sont remplacés par un épitope marqueur choisi parmi le peptide SEQ ID NO : 2 dérivé de la protéine c-myc, le peptide SEQ ID NO : 3 dérivé de la protéine C, et le peptide SEQ ID NO : 4 dérivé de la protéine N du morbillivirus de dauphin.
Un autre objet de l'invention est un procédé de marquage d'un clone infectieux du virus de la peste des petits ruminants, comprenant la substitution d'un fragment de l'ADNc dudit virus codant pour un épitope endogène de séquence SEQ ID NO: 1, par un fragment codant pour un épitope exogène choisi parmi le peptide SEQ ID NO. : 2 dérivé de la protéine c-myc, le peptide SEQ ID NO. : 3 dérivé de la protéine C, et le peptide SEQ ID NO. : 4 dérivé de la protéine N du morbillivirus de dauphin.
L'invention concerne également une molécule d'ADNc codant pour le virus recombinant marqué de la peste des petits ruminants tel qu'il vient d'être défini.
Un autre objet de l'invention est tout plasmide contenant une molécule d'ADNc codant pour le virus recombinant marqué de la peste des petits ruminants.
Un objet de l'invention est également une cellule-hôte transformée avec un plasmide contenant une molécule d'ADNc codant pour le virus recombinant marqué de la peste des petits ruminants.
L'invention a encore pour objet le virus recombinant marqué de la PPR selon l'invention pour son utilisation comme vaccin prophylactique ou thérapeutique contre la peste des petits ruminants. Un autre objet de l'invention est un vaccin marqué contre la peste des petits ruminants, ou une composition immunogène, comprenant le virus recombinant marqué selon l'invention. Un tel vaccin constitue un vaccin DIVA, permettant la distinction entre animaux vaccinés et animaux infectés naturellement.
L' invention concerne aussi un kit de diagnostic sérologique de la peste des petits ruminants, ce kit contenant des anticorps monoclonaux dirigés spécifiquement contre un épitope dans la partie C-terminale de la protéine N du virus de la peste des petits ruminants, ayant pour séquence SEQ ID NO. 1, et des anticorps monoclonaux antimarqueur dirigés spécifiquement contre un épitope marqueur tel que le peptide SEQ ID NO. : 2 dérivé de la protéine c-myc, le peptide SEQ ID NO. : 3 dérivé de la protéine C, et le peptide homologue SEQ ID NO. : 4 dérivé de la protéine N du morbillivirus de dauphin. Les anticorps monoclonaux qui ne sont pas déjà disponibles peuvent être obtenus par des méthodes classiques de biologie. Un tel kit pourra être utilisé en C-ELISA.
Le vaccin DIVA selon l'invention pourra être utilisé en particulier dans une campagne d' éradication de la PPR et permet d'envisager, en association avec un diagnostic en C-ELISA à l'aide d'un kit selon l'invention, de faire la distinction entre les animaux infectés naturellement par le virus et les animaux vaccinés dans le cadre de cette campagne.
EXEMPLE 1 : ASSEMBLAGE DU GENOME COMPLET DU VIRUS DE LA PPR DE LA SOUCHE VACCINALE NIGERIA 75/1.
La souche vaccinale Nigeria 75/1 est issue de la souche virulente Nigeria 75/1 atténuée par passages successifs sur cellules (Diallo et al., 1989, précité). Le génome complet du virus de la souche vaccinale Nigeria 75/1 est accessible dans GenBank sous le numéro X74443.
Ce génome complet était disponible sous la forme de 4 fragments chevauchants d'ADNc (Figure 1) obtenus i l
à partir d'un extrait d'ARN viral. Le point de départ de l'assemblage a donc été les 4 clones suivants contenant chacun un des 4 fragments d'ADNc :
- le clone 1 (pT7hhLNP) , contenant le promoteur de la polymérase T7 (pT7), la séquence du ribozyme en tête de marteau (Hammerhead ribozyme, HamRz), la région 3' -extracistronique (le « leader ») , le gène N en entier, la séquence intergénique N-P et le début du gène P ;
- le clone 2 (pPMintpCRII) , contenant les gènes P et M en entier, un morceau des séquences intergéniques N-P et M-F, et la séquence entre les gènes P et M ;
- le clone 3 (17MLmut), contenant une partie de la séquence intergénique M-F, le gène F en entier, la séquence intergénique F-H, le gène H en entier, la séquence intergénique H-L, et le début du gène L ; et
- le clone 4 (pL-BKS-IREST7 ) , contenant la fin de la séquence H, la partie intergénique H-L, le gène L en entier et la région 5 ' -extracistronique (le « trailer ») , ainsi que la séquence interne d'entrée du ribosome (1RES, de l'anglais « internai ribosome entry site ») , le ribozyme delta du virus de l'hépatite C et le terminateur de la polymérase T7 (riboT7ter) .
Ces clones incluent en outre chacun des sites uniques de restriction permettant leur assemblage dans le plasmide de clonage pBKSmodifMCS qui a été obtenu en remplaçant le site multiple de clonage (MCS) du plasmide pBluescriptKSII (Stratagène, France) par un MCS regroupant les sites de restriction adaptés à la stratégie de clonage (Bss HII (620), Bgl I (633), Rsr II (639), Age I (645), Sac II (655) , Swa I (661) ) .
Les quatre fragments du génome entier du virus de la souche vaccinale Nigeria 75/1 ont alors pu être assemblés selon la stratégie schématisée aux Figures 2 et 3. Le clone 17MLmut a été inséré dans le plasmide pBKSmodifMCS pour obtenir le plasmide passemblagel . Le i 2
clone 3, contenant le promoteur de la polymérase T7, est ensuite inséré dans passemblagel pour générer le plasmide intermédiaire passemblage2 (Figure 2). Le plasmide pPMintpCRII est inséré dans passemblage2 pour obtenir passemblage3 dans lequel on clone pL-BKS-IREST7 pour générer le plasmide final passemblage4term compatible avec le système de reconstitution utilisé dans l'Exemple 2, qui contient le génome viral complet de PPRV 75/1, encadré en 3' par le promoteur pT7 et le HamRz, et en 5' par le ribozyme delta et le terminateur T7ter (Figure 3) .
Le clone obtenu a été séquencé en totalité et a pour séquence la SEQ ID NO. : 5. Vingt-huit différences de séquence ont été notées par rapport au virus parental (souche vaccinale PPRV Nigéria 75/1) . Huit de ces erreurs (Figure 4) modifient les codons : deux sur le gène H, aux positions 7961 et 8829, et six sur le gène L, aux positions 9585, 11551, 13212, 13924, 13939 et 14543. Ces différences de séquence n'ont pas été un obstacle à l'obtention d'un clone infectieux du virus de la PPR.
EXEMPLE 2 : OBTENTION D'UN CLONE INFECTIEUX DU VIRUS VACCINAL PPRV 75/1.
La manipulation du virus de la PPR, en tant que virus à ARN négatif, a nécessité la mise au point d'un système de reconstitution (ou « rescue ») , similaire à celui décrit par Bailey et al. {Virus Res . , 126(1-2) : 250- 255, 2007), et testé et validé à l'aide d'un minigénome exprimant la protéine fluorescente eGFP (pour « enhanced green fluorescent protein ») (Minet et al, Virus Research, 145: 9-17, 2009) .
Le système consiste à produire, dans le cytoplasme de cellules hôtes, à partir d'ADN plasmidiques , l'ARN correspondant au génome viral et les ARNm des protéines N, P et L. Ces 3 protéines sont alors synthétisées par la cellule et s ' auto-assemblent avec l'ARN génomique viral pour former la ribonucléoprotéine (RNP) qui va générer un virus infectieux. Le principe du système de reconstitution du virus de la PPR est schématisé à la Figure 5.
Ce système de reconstitution a été appliqué pour obtenir un clone infectieux à partir de l'ADNc du génome entier de PPRV 75/1 en remplaçant le minigénome eGFP par cet ADNC. Autrement dit, le plasmide passemblage term, contenant le génome entier incluant les erreurs observées par rapport à la séquence initiale, a été utilisé. En effet, les erreurs dans la séquence L dans le plasmide passemblage4term sont également présentes dans le plasmide contenant le gène L sous pT7. Or, celui-ci a été utilisé avec succès en essai fonctionnel du minigénome eGFP sur des cellules 293-T7 (résultats non montrés) .
A/ Essais sur cellules 293-T7 et sur cellules Vero
Les deux premiers essais de reconstitution du virus PPRV 75/1 ont été réalisés par transfection soit sur des cellules 293-T7 exprimant de façon stable l'ARN polymérase T7, soit sur des cellules Vero préalablement infectées avec le virus recombinant Fowlpox-T7 (FP-T7).
Les cellules Vero (cultivées en milieu Eagle modifié (MEM, Eurobio, France) + 1 % L-glutamine + 10 % de sérum de foetus de bovin (SVF) ) et les cellules 293-T7 (cultivées en milieu de Dulbecco D EM + 10 % SVF) sont préparées en plaque 6 puits et incubées à 37 °C sous 5 % de C02 de façon à être à 60-80 % de confluence à 24 heures, au moment de la transfection.
Les cellules Vero n'expriment pas l'ARN polymérase T7. Il faut donc leur apporter cette enzyme par le biais d'un virus recombinant, en l'occurrence ici le virus recombinant FP-T7. Pour cela, des cellules Vero ont été infectées avec FP-T7 à une multiplicité d' infection (MOI) de 0,1 par cellule. Après 2 heures d'infection, l'inoculum a été retiré et la co-transfection réalisée.
Pour chacun des types cellulaires, le plasmide passemblage4term a été co-transfecté avec les plasmides contenant les gènes N, P et L de PPRV placés soit sous ι4
contrôle de pT7 (plasmides pN-BKS-IREST7 , pP-BKS-IREST7 , et pLBKS-IREST7) soit de pCMV (plasmides pNPC, pPPC, et pLPC) . Dans chacun des cas, le ratio N : P : L était de 20 : 20 : 1.
Deux protocoles de transfection ont été testés en parallèle, l'un utilisant un agent de transfection du commerce, la lipofectamine 2000 (Invitrogen, France), l'autre reprenant la méthode classique par précipitation au chlorure de calcium.
Soixante douze heures après la transfection, les cellules 293-T7 ont été mises en co-culture sur des cellules Vero pour augmenter les chances d' amplifier le virus. Après trois passages successifs sur les cellules Vero, aucun effet cytopathique (ECP) n'est apparu. Il en a été de même pour les cellules Vero infectées par le FP-T7 puis transfectées . En effet, après quatre passages successifs réalisés à 7 jours d'intervalle chacun, le premier ayant eu lieu 72 heures après la transfection, aucun ECP n'est apparu dans les flacons de culture, quel qu'ait été la méthode de transfection ( lipofectamine ou chlorure de calcium) .
Un troisième essai de reconstitution du virus PPRV 75/1 a alors été réalisé sur des cellules Vero . DogSLA tag, qui sont des cellules Vero exprimant un récepteur au morbillivirus de la maladie de Carré (CDV) , le récepteur CD150 (ou SLAM, pour « signalling lymphocyte activation molécule ») de chien (Takeda et al., J. Virol., 80(9): 4242-8, 2006). Les Inventeurs ont constaté que ces cellules étaient plus sensibles que les cellules Vero à l'infection par le virus de la souche vaccinale PPRV 75/1. En effet, une production de la souche virale vaccinale 75/1 sur ces cellules a permis d'obtenir un titre plus élevé d' un Log que celle produite dans les mêmes conditions sur les cellules Vero. De plus, l'évolution de l'infection des cellules par le virus peut s'observer par la formation de syncytia en nombre, ce qui n'est pas le cas sur les cellules Vero classiques, et l'apparition d'un ECP franc. l 5
Préparées la veille, des cellules Vero . DogSLAMtag ont été préalablement infectées avec FP-T7 à 0,1 MOI par cellule, puis co-transfectées avec les plasmides N, P, L et passemblage4term, en présence de lipofectamine 2000, comme décrit précédemment pour les cellules Vero.
L'évolution des cellules a été observée quotidiennement au microscope. Ces observations sont illustrées par la Figure 6. Après trois passages sur les cellules Vero . DogSLAMtag, un ECP ténu est apparu. Le surnageant a été récolté et a servi d' inoculum pour infecter de nouvelles cellules Vero . DogSLAMtag . Huit à neuf jours après cette infection, des foyers similaires à des foyers de PPRV sur des cellules en culture sont apparus à trois endroits différents dans la boite de culture. L' aspect des cellules était le même que celui observé lors du précédent passage.
En parallèle, les surnageants des différents passages ont été analysés par RT-PCR, sur cinq passages successifs. A chaque fois, l'ARN total a été extrait avec le « RNeasy mini kit » (Qiagen, France) et une partie de cet ARN, avant d'être utilisé en RT-PCR, a été traité à la DNase (Ambion, France) afin d'éliminer toute trace éventuelle de plasmides utilisés pour la transfection . La réaction de RT-PCR a été réalisée en une seule étape avec le « One-step RT-PCR kit » (Qiagen, France) , les amorces du gène de ménage β-actine, pactl et act2, et les amorces spécifiques de PPRV 75/1, NP3 et NP4 spécifiques du gène N et HP46 et HP47 spécifiques du gène H. Le contrôle de la synthèse d'ADNc a été fait par PCR spécifique du gène de ménage β-actine. Tous les échantillons ont été amplifiés
(résultats non montrés). Par ailleurs, ces mêmes PCR ont été menées directement sur les ARN extraits des surnageants, afin d'en vérifier la qualité.
Les produits de PCR et RT-PCR ont été analysés sur gel d' agarose (Figure 7). La Figure 7a montre les résultats de la RT-PCR spécifique de N-PPRV, obtenus avec les amorces NP3 et NP4. La Figure 7b montre les résultats J.6
de la RT-PCR spécifique de H-PPRV, obtenus avec les amorces HP46 et HP47. Dans les Figures 7a et 7b, la partie du haut correspond à la PCR directe sur ARN et la partie du bas à la RT-PCR. Les différentes pistes sont les suivantes : « + » : contrôle positif de PCR ; « - » : contrôle négatif de PCR ; 1 : surnageant du passage 3 ; 2 : surnageant du passage 4 ; 3 : surnageant du passage 5 ; D : ARN traité à la DNase ; d : ARN dilué afin d'être dans les mêmes conditions que l'ARN traité à la DNase.
Aucune amplification n'a été observée après PCR directe sur les ARN, ce qui indique qu'il n'y a pas de traces d'ADN plasmidiques dans les surnageants testés. Tous les échantillons ont été amplifiés après réaction de RT-PCR spécifique de la N-PPRV. Seul le passage 5 n'a pas été amplifié dans le cas de la RT-PCR spécifique de la H-PPRV. Cette dernière observation peut s'expliquer par une quantité d'ARN trop faible pour être détectée ou par une dilution de l'échantillon trop importante pour pouvoir détecter la H-PPRV par RT-PCR. B/ Obtention du clone infectieux sur cellules CHS-20
Le clone infectieux selon l'invention a pu être généré sur des cellules CHS-20 pour lesquelles il a été démontré qu' elles étaient réceptives au virus de la PPR (Adombi et al, J. Virol. Methods, 173 : 306-313, 2011) . Les cellules CHS-20 sont des cellules de la lignée cellulaire CV-1 (ATCC n° CCL-70) modifiées pour exprimer la protéine SLAM de la chèvre (GenBank n° DQ228869) .
Des cellules CHS-20 ont été préparées et transfectées de la même manière que décrit plus haut pour les cellules Vero . DogSLAMtag : préparation des cellules 24h à l'avance pour être à 60-80 % de confluence, infection avec le FP-T7 à 0,1 MOI par cellule pendant 2h, puis transfection avec les 4 plasmides pNPC, pPPC, pLPC et passemblage4term en présence de lipofectamine 2000. Ί 7
Soixante-douze heures après la transfection, les tapis cellulaires ont été photographiés (Figure 8). Les deux photographies supérieures montrent les cellules infectées par la souche vaccinale de PPRV 75/1 à la dilution 10~2 (avec un objectif grossissant respectivement 4 et 10 fois) , le tapis à la dilution 10-1 ayant été complètement détruit. Les trois photographies du bas montrent les cellules infectées par le clone infectieux obtenu selon l'invention, à la dilution 1CT1 (avec un objectif grossissant respectivement 4, 10 et 20 fois) . L'effet cytopathique du clone infectieux est donc considérablement réduit in vitro par rapport à celui du virus parental.
En parallèle, 72 heures après transfection, une RT-PCR quantitative (RT-qPCR) a été réalisée sur le gène N, selon le protocole établi par Kwiatek et al. (J. Vir. Methods, 165 : 168-177, 2010), afin de déterminer le titre viral pour le virus parental (Tableau 1) et pour le clone infectieux (Tableau 2) sur cellules CHS-20. Dans les deux tableaux ci-dessous, le signe « + » indique qu'une amplification a pu être obtenue et le signe « - » indique qu'aucune amplification n'a été obtenue ; les colonnes 1 à 10 correspondent à 10 répétitions de la même dilution ; des cellules non infectées ont servi de témoin.
Figure imgf000018_0001
Tableau 2:
Figure imgf000019_0001
Afin de confirmer les résultats de RT-PCR, les surnageants récoltés ont été titrés par immunofluorescence indirecte en comparaison avec la souche vaccinale PPRV 75/1 d'origine. Des cellules Vero . DogSLAMtag, à raison de 2.104 cellules par puits d'une plaque 96 puits, ont été infectées avec des dilutions de 10 en 10 des surnageants récoltés aux différents passages du clone infectieux PPRV 75/1. Après cinq jours d'incubation à 37 °C et 5 % CO2, les cellules ont été fixées à l'acétone 80 %. La révélation a été faite à l'aide de l'anticorps monoclonal anti-N-PPRV 38-4 dilué au 1/400 et le conjugué anti-souris FITC (Biorad, France) dilué au 1/80. Les plaques ont été lues au microscope à fluorescence. Le titre T est donné en DICTso/ml et a été calculé selon la formule :
T = 10 f-t,
dans laquelle t = X0-d*(P-0,5) ; f = log 20 = 1,3 (50 μΐ de suspension virale par puits) ; X0 = log de la dernière dilution où 100 % des puits de cette dilution présentent un ECP ; P = somme des puits présentant un ecp à partir de la dilution présentant 100 % d'ECP; d = log du facteur de dilution (ici d = 1 car dilution de 10 en 10) .
Le titre viral obtenu pour le virus parental est T = 10~5,7 DICT50/mL alors que celui pour le clone infectieux est T = 10~2'2 DICT50/mL. Le titre viral pour le clone infectieux est donc plus faible d'environ 3 logarithmes en base 10 (logio) par rapport au virus parental PPRV 75/1. Cette différence peut être directement τ 9
imputée aux mutations portées par le clone infectieux par rapport à la souche virale parentale.
EXEMPLE 3 : IDENTIFICATION DE MARQUEURS POUR LE VACCIN CONTRE LA PPR.
La stratégie de marquage choisie repose sur la substitution d'un épitope fortement immunogène par une autre séquence immunogène, n'entraînant pas de réaction immunitaire croisée avec l' épitope d'origine pour permettre la distinction par tests immuno-sérologiques entre animaux vaccinés et animaux infectés. Un épitope hautement immunogène et spécifique de la peste des petits ruminants, le peptide E, a pu être identifié dans la partie
C-terminale de la protéine N-PPRV 75/1, entre les acides aminés 484 et 495, en suivant la procédure PEPSCAN (Geysen et al., PNAS, 81(13) :3998-4002, 1984).
Dans un premier temps, il a été envisagé de marquer le gène N avec la séquence d'un Tag commercial, déjà utilisé pour des marquages en biologie moléculaire et pour lesquels il existe des réactifs de diagnostic en ELISA compétitive ou un anticorps monoclonal commercial. Après un inventaire des différents Tag disponibles sur le marché (Guy et al., Ann Neurol, 52(5): 534-42, 2002 ; Lee et al., J. Immunol Methods, 307(1-2) : 62-72, 2005 ; Roche, Epitope Tagging Basic Laboratory Methods, chap . 1, 2000 ; Terpe, Appl Microbiol Biotechnol, 60(5): p. 523-33, 2003), trois candidats ont été testés : les peptides FLAG et c-myc et la protéine C, dont les séquences respectives en acides aminés sont indiquées dans le Tableau 3 ci-dessous. Tableau 3 :
Figure imgf000021_0001
Dans un second temps, il a été envisagé de remplacer la séquence codant pour le peptide E par une séquence homologue dérivée d'un autre morbillivirus que la PPR. La Figure 9 montre un alignement des séquences protéiques de différents morbillivirus dans la zone homologue du peptide E. Le remplacement du peptide E de PPRV 75/1 par la séquence correspondante d'un autre morbillivirus doit permettre de marquer le vaccin tout en restant le plus proche possible d'un fond génétique morbillivirus afin de limiter les conséquences fonctionnelles de la modification du génome. Cependant, la modification doit aussi être suffisante pour qu'elle ait une incidence sur l'antigène utilisé dans le diagnostic. Dans ce but, il est important de choisir un morbillivirus suffisamment éloigné de PPRV afin d'éviter les réactions croisées. Ainsi, le choix s'est porté sur les séquences du virus de la maladie de Carré (CDV, peptide 2), du virus du phoque (PDV, peptide 3) , et du morbillivirus du dauphin (peptide 4) . En outre, une séquence chimère (peptide 1) reprenant les acides aminés les plus fréquemment trouvés à chaque position sur les différents morbillivirus a été définie et synthétisée. Les séquences des différents peptides testés sont récapitulées dans le Tableau 4 ci-dessous . Tableau 4
Figure imgf000022_0001
Les différents peptides Tag et morbillivirus ont été évalués sur leur pouvoir immunogène chez le lapin et la chèvre. Pour cela, les peptides Tag sont injectés chez la chèvre par voie intramusculaire, à raison de 1 ml à 1 mg/ml mélangé à 1 ml d'adjuvant complet de Freund. Une injection de rappel est faite dans les mêmes conditions trois semaines plus tard. Les prélèvements sanguins sont réalisés toutes les semaines et les sérums sont récoltés et testés en ELISA. En parallèle, des lapins ont été immunisés afin de générer des sérums polyclonaux contre les différents peptides morbillivirus pour leur utilisation comme sérum de contrôle positif dans les tests de sérologie associés au vaccin. Le lapin est l'espèce idéale pour produire une quantité importante de sérums polyclonaux. Une première injection de 1 ml de peptide (à une concentration de 1 mg/ml) mélangé à 1 ml d'adjuvant complet de Freund est faite aux lapins par voie sous-cutanée. Deux injections de rappel sont réalisées à 15 jours d'intervalle. Les lapins sont anesthésiés (Imalgen, Sanofi, France) , puis saignés pour récolter le maximum de sang. Les sérums sont récoltés et testés en ELISA, en comparaison avec le peptide E. Les résultats des tests ELISA ont montré que, parmi les peptides testés, seuls le peptide c-myc, la protéine C, et le peptide 4 (dérivé de morbillivirus de dauphin) sont suffisamment immunogènes (Figure 10).
La séquence codant pour le peptide E dans la nucléoprotéine du PPRV 75/1 a été substituée par celle du peptide 4 du morbillivirus de dauphin. L'expression et la fonctionnalité de cette nucléoprotéine modifiée ont été λ2
vérifiées à l'aide du système de reconstitution du minigénome eGFP.
Dans un premier temps, afin de s'assurer que les mutations, réalisées sur le gène N-PPR, n'affectent pas la production de la protéine, l'expression des gènes N mutés ou non mutés a été vérifiée par immunofluorescence, directe ou indirecte. Pour cela, les plasmides NPC, correspondant au plasmide incluant le gène codant la protéine N non mutée, et NPCmutdauph, correspondant au plasmide incluant le gène codant la protéine N intégrant le peptide de dauphin, ont été utilisés pour transfecter des cellules Vero.
La transfection a été réalisée avec la lipofectamine 2000 sur des cellules Vero de 24h, confluentes à 70-80 %. Les cellules ont été mises en culture, la veille, à raison de 2.104 cellules par puits, dans une plaque P96. Les différentes dilutions d'ADN et de lipofectamine 2000 ont été réalisées dans le milieu OptiMEM® (Invitrogen, France) pour une optimisation de la transfection. Après 24h, 48h ou 72h d'incubation à 37°C et 5 % de C02, les cellules ont été fixées au paraformaldéhyde (PFA) . Après trois lavages en PBS IX, 50 iL de PFA 3 % a été laissé au contact des cellules pendant 30 minutes, à température ambiante. Après trois nouveaux lavages en PBS IX, les cellules ont été recouvertes avec 50 μL de NH4C1 à 50 mM et incubées pendant 20 minutes à température ambiante .
L'anticorps anti-peptide E est un polyclonal de lapin, spécifique du peptide E. Ce peptide est présent uniquement chez les nucléoprotéines de PPRV et employé à une dilution au 1/10. Un anticorps conjugué FITC, spécifique des IgG de lapin et dilué au 1/80, a ensuite été ajouté. L'anticorps anti-peptide 4 est un polyclonal de lapin, spécifique du peptide 4. Ce peptide est présent uniquement chez les nucléoprotéines de DMV et a été employé à une dilution au 1/10. L'anticorps monoclonal 38-4 (reconnaissant le motif constitué des acides aminés 116 à y.3
150 de la nucléoprotéine de PPRV) de souris utilisé est directement couplé au fluorochrome TRITC. Son utilisation dans les kits de diagnostic peut permettre la différenciation entre la fluorescence rouge, due aux nucléoprotéines de morbillivirus, et la fluorescence verte, induite par la présence de nucléoprotéines mutées spécifiques du marqueur (peptide 4). Pour cet anticorps, la dilution optimale a été établie à l'aide d'une gamme de dilutions du 1/25 au 1/400.
La Figure 11 montre les résultats d'expression in vitro de la protéine N modifiée mesurée par immunofluorescence (grossissement x20). La révélation de la plaque P96 où l'on a transfecté les plasmides NPC et NPCmutdauph permet de détecter la présence de nucléoprotéines. La fluorescence rouge relative à l'anticorps 38-4 conjugué TRITC met en évidence l'ensemble des protéines N-PPR qu'elles soient mutées ou non (Figure 11 a et b) . La fluorescence verte est induite par la détection du peptide 4 par l'anticorps anti-peptide 4 et l'anticorps anti-IgG de lapin conjugué FITC. Elle permet ainsi de différencier les nucléoprotéines mutées de celles qui ne le sont pas (Figure 11 c et d) . De même, la fluorescence verte, observée à la Figure 11 e et f, permet de mettre en évidence la présence du peptide E, c'est-à- dire la présence de nucléoprotéines non mutées.
Le gène N-PPR du plasmide NPC a induit la production de nucléoprotéines (Figure 11 a) présentant le peptide E (Figure 11 e) . L'absence de fluorescence observée lors de la révélation avec l'anticorps anti-peptide 4 sur ces mêmes cellules (Figure 11 c) confirme qu'il n'y a pas de réaction croisée entre l'anticorps anti-peptide 4 et le peptide E. De la même façon, le gène N-PPR muté du plasmide NPCmutdauph a permis la production de nucléoprotéines (Figure 11 b) présentant le peptide 4 (Figure 11 d) . Le site du peptide E ayant disparu, aucune fluorescence n'est observée lors de la révélation avec l'anticorps spécifique du peptide E (Figure 11 f ) . Ceci confirme bien l'absence de réaction croisée entre l'anticorps anti-peptide E et le peptide 4.
Dans un deuxième temps, la fonctionnalité de la protéine N modifiée a été vérifiée à l'aide du mini-génome eGFP.
Pour cela, les plasmides du mini-génome et ceux codant respectivement la protéine N (N modifiée ou non) , la protéine P, et la protéine L, ont été transfectés selon le ratio 20 : 20 : 20 : 1 comme précédemment, à l'aide de lipofectamine 2000, sur des cellules Vero de 24h et à 60-70 % de confluence réparties en plaque 12 puits. Le ratio ADN : transfectant utilisé a été de 1:3.
Le contrôle positif a consisté à transfecter les cellules possédant l'ARN T7 polymérase avec le mini- génome puis à les infecter avec la souche vaccinale PPRV75/1, à une concentration de 1 DITC50. Le contrôle négatif, quant à lui, a été obtenu en l'absence de plasmide codant la polymérase L.
48h après la transfection, les plaques ont d'abord été observées au microscope à fluorescence. La Figure 12 montre les résultats de la détection de la fluorescence eGFP dans les cellules. Les photographies de la ligne supérieure sont celles dans l'UV, la ligne inférieure montrant les mêmes photographies dans le visible. Des cellules fluorescentes ont été observées pour les témoins positifs (Fig. 12 b et d) et l'essai avec la protéine N modifiée (Fig. 12 c) . Aucune fluorescence n'a été obtenue avec le témoin négatif (Fig. 12 a).
Pour confirmer ces résultats, la présence d'ARNm correspondant à la protéine N modifiée a été recherchée. Les ARNt ont été extraits des cellules 48h après la transfection à l'aide du kit « RNeasy Mini Kit » (Qiagen, France) . Les ARNt ont ensuite été dosés au nanodrop . Une PCR suivie d'une électrophorèse sur gel d' agarose 1 % a été réalisée afin de vérifier la pureté des ARNt. Quand ils étaient purs, une extraction d'ARNm avait lieu. Sinon, les échantillons d'ARN étaient traités à la z5
DNase à l'aide du kit « TURBO DNA-free » (Ambion) . Une PCR suivie d'une électrophorèse sur gel d' agarose des ARNt traités à la DNase a alors été réalisée afin de s'assurer de leur pureté. L'ARNm a ensuite été extrait des ARNt à l'aide du kit « Oligotex mRNA spin column » (Qiagen, France) . Après plusieurs lavages, l'ARNm a été élué. La pureté de ces échantillons a été contrôlée par RT-PCR avec les amorces internes de l'eGFP puis analysée par migration sur gel d' agarose.
Les ARN totaux et ARNm extraits ont donc été soumis à une réaction de transcriptase inverse (RT) à l'aide du kit « First strand cDNA synthesis » (GE Healthcare) . Le contrôle de la synthèse d'ADNc a été réalisé par PCR sur gène de ménage Pactine avec les amorces actl et pact2. Les amorces eGFP-Cl F et eGFP-Cl R, spécifiques du gène eGFP, ont été utilisées pour amplifier ce gène eGFP présent dans l'ADNc. Le fragment amplifié a une taille d'environ 600 paires de bases (pb) . Les séquences des différentes amorces utilisées sont indiquées dans le Tableau 5 ci-dessous.
Tableau 5 :
Figure imgf000026_0001
La réaction de PCR a été réalisée selon les instructions du fournisseur de l'enzyme Taq DNA polymérase (Qiagen, France) ainsi que selon le programme décrit dans le Tableau 6 ci-dessous. 50-100 ng d'ADN ou ARN ont été ajoutés dans chaque tube. Le témoin négatif a consisté en de l'eau et le témoin positif en un plasmide peGFP-Cl contenant le gène d'intérêt codant pour l'eGFP. z6
Tableau 6 :
Figure imgf000027_0001
Les produits de PCR ont ensuite été analysés sur un gel d' agarose 1 % en tampon Tris acétique EDTA (TAE) IX, auquel a été ajouté 5μL de REDGEL® (Interchim, France) . 2,5 yL de bleu de charge ont été ajoutés à chaque produit de PCR, et 12 yL de chaque échantillon ont été déposés dans les puits. Après environ 1 heure de migration à 120V, la visualisation du résultat a été faite sous UV à l'aide d'un gel imageur (Biorad) .
La Figure 13 montre les résultats de RT-PCR pour les ADNC obtenus à partir des ARNm (1 : Témoin négatif PCR ; 2 : Témoin positif PCR ; 3 : Marqueur 100 pb ; 4 : Cellules seules ; 5 : Cellules + minigénome ; 6 : Cellules + minigénome + N + P + L ; 7 : Cellules + minigénome + N modifiée + P + L ; 8 : Cellules + minigénome + PPR) . Alors que pour les ADNC issus des ARNt, il y a amplification du gène eGFP pour tous les échantillons et le témoin positif PCR, pour les ADNC obtenus à partir des ARNra, l'amplification du gène eGFP n'est présente que pour les échantillons 6, 7 et 8. Le résultat de PCR confirme bien celui observé par la lecture au microscope à fluorescence. La nucléoprotéine N-PPRV 75/1 modifiée par substitution et clonée sous pCMV est bien fonctionnelle.

Claims

λΊ REVENDICATIONS
1. Procédé d'obtention d'un clone infectieux du virus de la peste des petits ruminants, comprenant des étapes de : a) obtention d'un plasmide de clonage incluant l'ADNc du génome complet du virus de la peste des petits ruminants, sous contrôle du promoteur de la polymérase T7 ; b) transfection de cellules CV-1 ou Vero, transformées pour exprimer le récepteur SLAM de la chèvre, et exprimant la polymérase T7, avec le plasmide de clonage et avec des plasmides incluant respectivement l'ADNc des gènes N, P et L du virus ;
c) mise en culture des cellules transfectées et amplification du clone infectieux.
2. Procédé selon la revendication 1, dans lequel le génome viral est celui du virus de la peste des petits ruminants de la souche vaccinale Nigéria 75/1.
3. Procédé selon la revendication 1 ou 2, dans lequel l'étape a) comprend en outre le marquage de l'ADNc du génome complet.
4. Procédé selon la revendication 3, dans lequel le marquage de l'ADNc du génome complet est fait par substitution d'un fragment de cet ADNC codant pour un épitope endogène dudit virus par un fragment codant pour un épitope exogène.
5. Procédé selon la revendication 4, dans lequel le l' épitope endogène est choisi dans la partie C-terminale de la protéine N et a pour séquence XiX2REAQRSAEAL (SEQ ID NO : 1) , dans laquelle Xi représente T ou N, et X2 représente S ou P.
6. Procédé selon la revendication 5, dans lequel l' épitope exogène est choisi parmi le peptide SEQ ID NO. : 2 dérivé de la protéine c-myc, le peptide SEQ ID NO. : 3 dérivé de la protéine C, et le peptide SEQ ID NO. : 4 dérivé de la protéine N du morbillivirus de dauphin. z8
7. Clone infectieux du virus de la peste des petits ruminants, obtenu par le procédé selon l'une des revendications 1 ou 2.
8. Virus recombinant marqué de la peste des petits ruminants, obtenu par le procédé selon l'une quelconque des revendications 3 à 6.
9. Molécule d'ADNc codant pour le virus selon la revendication 8.
10. Plasmide contenant une molécule d'ADNc selon la revendication 9.
11. Cellule-hôte transformée avec un plasmide selon la revendication 10.
12. Virus recombinant selon la revendication 8, pour son utilisation comme vaccin prophylactique ou thérapeutique contre la peste des petits ruminants.
13. Vaccin marqué contre la peste des petits ruminants, caractérisé en ce qu'il comprend le virus recombinant selon la revendication 8.
14. Kit de diagnostic sérologique de la peste des petits ruminants, caractérisé en ce qu'il contient a moins un anticorps dirigé spécifiquement contre un épitope dans la partie C-terminale de la protéine N du virus de la peste des petits ruminants, ayant pour séquence SEQ ID NO. 1, et au moins un anticorps anti-marqueur dirigé spécifiquement contre un épitope marqueur choisi parmi le peptide SEQ ID NO. : 2 dérivé de la protéine c-myc, le peptide SEQ ID NO. : 3 dérivé de la protéine C, et le peptide SEQ ID NO. : 4 dérivé de la protéine N du morbillivirus de dauphin.
15. Procédé de marquage d'un clone infectieux du virus de la peste des petits ruminants, comprenant la substitution d'un fragment de l'ADNc dudit virus codant pour un épitope de séquence SEQ ID NO. 1, par un fragment codant pour un second épitope choisi parmi le peptide SEQ ID NO. : 2 dérivé de la protéine c-myc, le peptide SEQ ID NO. : 3 dérivé de la protéine C, et le peptide SEQ ID NO. : 4 dérivé de la protéine N du morbillivirus de dauphin.
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