WO2014019966A1 - Procedes de fonctionnalisation et reactifs utilises dans de tels procedes utilisant un anhydride aza-isatoïque ou un de ses derives, molecules biologiques ainsi traitees et kits - Google Patents

Procedes de fonctionnalisation et reactifs utilises dans de tels procedes utilisant un anhydride aza-isatoïque ou un de ses derives, molecules biologiques ainsi traitees et kits Download PDF

Info

Publication number
WO2014019966A1
WO2014019966A1 PCT/EP2013/065854 EP2013065854W WO2014019966A1 WO 2014019966 A1 WO2014019966 A1 WO 2014019966A1 EP 2013065854 W EP2013065854 W EP 2013065854W WO 2014019966 A1 WO2014019966 A1 WO 2014019966A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
rna
interest
group
molecule
binding molecule
Prior art date
Application number
PCT/EP2013/065854
Other languages
English (en)
Inventor
Thomas CAILLY
Frédéric FABIS
Ali Laayoun
Alain Laurent
Sylvain URSUEGUI
Original Assignee
bioMérieux
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by bioMérieux filed Critical bioMérieux
Priority to US14/416,996 priority Critical patent/US10174068B2/en
Priority to JP2015524746A priority patent/JP6407151B2/ja
Priority to EP13744493.1A priority patent/EP2880016A1/fr
Publication of WO2014019966A1 publication Critical patent/WO2014019966A1/fr
Priority to US16/217,483 priority patent/US20190112329A1/en

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
    • C07H21/02—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids with ribosyl as saccharide radical
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D213/00—Heterocyclic compounds containing six-membered rings, not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom and three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
    • C07D213/02—Heterocyclic compounds containing six-membered rings, not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom and three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
    • C07D213/04—Heterocyclic compounds containing six-membered rings, not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom and three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having no bond between the ring nitrogen atom and a non-ring member or having only hydrogen or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom
    • C07D213/60—Heterocyclic compounds containing six-membered rings, not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom and three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having no bond between the ring nitrogen atom and a non-ring member or having only hydrogen or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom with hetero atoms or with carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. ester or nitrile radicals, directly attached to ring carbon atoms
    • C07D213/78—Carbon atoms having three bonds to hetero atoms, with at the most one bond to halogen, e.g. ester or nitrile radicals
    • C07D213/79—Acids; Esters
    • C07D213/80—Acids; Esters in position 3
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D405/00—Heterocyclic compounds containing both one or more hetero rings having oxygen atoms as the only ring hetero atoms, and one or more rings having nitrogen as the only ring hetero atom
    • C07D405/02—Heterocyclic compounds containing both one or more hetero rings having oxygen atoms as the only ring hetero atoms, and one or more rings having nitrogen as the only ring hetero atom containing two hetero rings
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D495/00—Heterocyclic compounds containing in the condensed system at least one hetero ring having sulfur atoms as the only ring hetero atoms
    • C07D495/02—Heterocyclic compounds containing in the condensed system at least one hetero ring having sulfur atoms as the only ring hetero atoms in which the condensed system contains two hetero rings
    • C07D495/04—Ortho-condensed systems
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D519/00—Heterocyclic compounds containing more than one system of two or more relevant hetero rings condensed among themselves or condensed with a common carbocyclic ring system not provided for in groups C07D453/00 or C07D455/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H1/00—Processes for the preparation of sugar derivatives
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
    • C12Q1/6825—Nucleic acid detection involving sensors

Definitions

  • the present invention relates to novel methods including functionalization, labeling, capture or separation of biological molecules, and more specifically natural or synthetic ribonucleic acids (RNA) or synthetic chimeric DNA / RNA nucleic acids.
  • RNA ribonucleic acids
  • the term "functionalization” or the related terms (“functionalize” for example) will be used and may mean both labeling by a detectable molecule, addition of an adduct allowing capture, separation or separation. inhibition of biological molecules. It also relates to biological molecules thus treated or labeled, as well as kits that can be used in the field of diagnosis, in particular molecular diagnosis, using the detection and analysis of nucleic acids.
  • a first method is to set the interest group on the basis, whether natural or modified.
  • a second method proposes to set the interest group on sugar, again whether it is natural or modified.
  • a third method is for fixing the interest group on phosphate.
  • the group of interest on the basis was particularly used in the approach of labeling nucleic acids by incorporation of directly labeled nucleotides. In general, the functionalisation at the sugar level is much more neutral than that carried out on the phosphate or on the base, which impacts the specificity and the sensitivity.
  • diazo - based interest groups are not chemo - specific for RNA nor regio - specific for a particular position. They thus functionally undifferentiated DNA or RNA.
  • the diazo function is hardly compatible with conjugation with certain cyanines, such as Cy5 for example.
  • the regiospecific functionalization of the 3 'ends of the RNA can be obtained only from extremely specific enzymatic techniques.
  • Such techniques are used, for example, by Affymetrix (Santa Clara, USA) or Agilent Technologies (Santa Clara, USA) with the specific labeling of 3 'RNAs with the T4 RNA Ligase and a pCp-tagging substrate or by other enzymatic techniques described in some references:
  • RNAs or miRNAs short-chain non-coding RNAs, specific to eukaryotic cells
  • RNAs and in particular the 3 'end to minimize the effects of steric hindrance particularly marked on small duplexes are very poorly labeled by enzymatic techniques precisely because of their size as described by F. Natt in the reference: Nucleic Acids Research, 2007, Vol. 35, No. 7 e52.
  • diazo labeling technology is an excellent technique, the nature of the synthesis steps leading to these molecules is not compatible with the chemical nature of certain fluorophores (for example Cy5 which is unstable in the presence of hydrazine).
  • the diazo technology is therefore preferably used with biotin as a group of interest.
  • RNA vis-à-vis the DNA can also have applications in sample preparation also called “sample prep", such as the selection of the RNAs without using a DNAase, the selective capture of RNA in a medium containing DNA, decontamination, selective inhibition of amplification, etc.
  • Hiratsuka Hiratsuka BBA 1983 742 496-508 published one of the first articles on the reactivity of isatoic anhydride or isatoic anhydride methylated on free ribonucleosides (5 'triphosphate or 5'-OH). This is to synthesize fluorescent enzyme substrates for the study of these. Indeed, the isatoic anhydride, once opened, becomes fluorescent. However, to avoid any confusion, it is necessary to differentiate between the intrinsic fluorescence of the open isatoic anhydride, which becomes an anthranylate molecule (excitation: 335-350 nm and emission: 427-446 nm), and the fluorescence that it is provided by conjugation with a fluorophore.
  • RNA labeling with isatoic anhydride does not react on the exocyclic amines of bases, despite a nucleophilia usually described to be much higher than that of
  • isatoic anhydride is not known to react on the 5'-OH, isatoic anhydride reacts preferentially
  • Ovodov 1990 (Ovodov, FEBS 1990 270 111-114), by research based on work of Khorana 1963 (Stnark, Journal of the American Chemical Society 1963 75 2546 and Knorre Biokhimiya 1965 1218-1224), describes the acylation of messenger RNAs in an aqueous medium with acetic anhydride (5% DMF, 1M sodium acetate, pH 7, 2 to 3 hours at room temperature) to protect the RNA against the action of the RNases. It describes a level of acylation of 70-75% sufficient to inhibit the action of RNases.
  • Servillo (Servillo Eur J.
  • RNA SHAPE chemistry reveals non-hierarchical interactions dominate equilibrium structural transitions in tRNA Asp transcripts. J. Am. Chem. Soc. 127, 4659-4667 (2005). EJ Merino, KA Wilkinson, JL Coughlan and KM Weeks, RNA structure analysis at single nucleotide resolution by Selective 2 '-Hydroxyl Acylation and Primer Extension (SHAPE). J. Am. Chem. Soc. 127, 4223-4231 (2005). SI Chamberlin and KM Weeks, local Mapping nucleotide flexibility by selective acylation of 2'-amine substituted RNA. J. Am. Chem. Soc. 122, 216-224 (2000) .e
  • the author uses derivatives of isatoic anhydride (N-methylated isatoic anhydride, isatoic anhydride, N-methylated nitro isatoic anhydride, nitro isatoic anhydride) which is reacted on transfer RNA or short model oligoribonucleotides (aqueous medium). pH 8, room temperature or 37 ° C for a few hours). Only the 2 '-OH which are not very constrained, that is to say they are not very involved in secondary or tertiary structures, are acylated because they are more accessible and less close to a diester phosphate skeleton. They become more reactive.
  • this partially acylated RNA is subjected to an in vitro transcription which generates DNA fragments more or less long, the elongation stopping each time a voluminous 2'-O-anthranylate, that is to say ie, an open isatoic anhydride molecule which is attached to the 2'-OH of the sugar, is encountered.
  • a voluminous 2'-O-anthranylate that is to say ie, an open isatoic anhydride molecule which is attached to the 2'-OH of the sugar
  • US-B-7, 244, 568 relates to the selective acylation, more or less partial, 2'-OH RNA with hydrophobic groups (butyryl or pentanoyl from the corresponding anhydrides).
  • the RNA thus becomes sufficiently hydrophobic to be selectively extracted with an organic solvent, or to be selectively immobilized (for example on a reverse phase, silica, a membrane, etc.).
  • a solid phase activated by an acid chloride or an anhydride which selectively immobilizes the RNA molecules relative to the DNA molecules. This phase can be carried out with immobilized isatoic anhydride or BCPB (immobilized benzyl chloride on polystyrene).
  • EP-B-1 966 631 proposes acylating agents compatible with a regiospecific acylation of RNA in an aqueous medium. These acylating agents must not bring a too much steric hindrance to maintain the hybridization properties of the RNA thus modified. These are mainly acylating agents allowing the introduction of an acetyl or formyl group which are used.
  • the thus partially modified RNA then serves as a template for a polymerization reaction, it can also serve as a probe in a Northern blot reaction.
  • the idea is to maintain the hybridization properties (the modified RNA remains the substrate of an elongation reaction), while destroying the secondary structures by the presence of the 2 'group and making the RNA thus modified. resistant to nucleases.
  • Example 22 indicates that the fluorescent labeling of the RNA is envisaged, but only by addition of the methylated isatoic anhydride, it is therefore an intrinsic fluorescence.
  • Patent EP-B-1.196.631 proposes a polynucleotide comprising mRNA, rRNA or viral RNA, for which more than 25% of the riboses are covalently modified at the 2 '-OH positions.
  • it relates to a method for producing double-stranded oligonucleotides and polynucleotides from a starting nucleic acid strand, from a plurality of mononucleotides (UTP, dTTP and / or dUTP, ATP and / or dATP). , GTP and / or dGTP, and CTP and / or dCTP), in the presence of polymerase and optionally primers allowing the formation of a nucleic acid strand complementary to the starting nucleic acid.
  • Patent application WO-A-2004/013155 describes the chemical modification of RNA in a mixture of feces, blood, etc., in order to differentiate DNA from RNA. It is acetic anhydride which is the reagent capable of doing this differentiation. The ester function is then hydrolyzed to regenerate the biologically active RNA.
  • this application proposes to protect the use of organic bases "Little" aggressive for RNA (lysine, diamines, etc.), in combination with a deprotection protocol.
  • isatoic anhydride In the state of the art, there are generally four different uses of isatoic anhydride. First, it is to exploit the intrinsic fluorescence properties of anthranyl esters to study the mechanism of certain enzymes. Secondly, the use of the acylating properties of isatoic anhydride to regioselectively inhibit the polymerization of the nucleic acids, it is therefore only necessary to introduce a bulky substituent at 2 'under the mildest possible conditions. and this in a more or less gentle way. Thirdly, the state of the art uses isatoic anhydride to prevent their degradation during an extraction step. Finally, and fourthly, it involves selectively extracting the acylated RNA relative to the non-acylated DNA. There is then an idea of the reversibility of the ester function so as to regenerate a free 2 'OH function and thus a functional RNA.
  • the conjugation of the isatoic anhydride to the group of interest must be done through atoms and bonds which can cause a very strong destabilization of the structure, a very great difficulty in the synthesis, a bad solubility in water, a loss of the physicochemical properties of the interest group by attenuation of the fluorescence, a very bad reactivity with regard to the RNA, a very great instability of the duplexes formed between the labeled RNA and the DNA (capture probes, for example, by a steric gene that is too important or because the functionalized RNA / DNA hybrids are no longer polymerase substrates).
  • RNAs by isatoic anhydride compounds in order to allow their capture by recognition molecules carried or not by a solid support.
  • WO-A-2012/076794 to use non-isatoic anhydride not for its intrinsic fluorescence but for its ability to bind specifically to the RNA and to allow binding with a group of interest, as defined below.
  • BOOM technology a technique of adsorption on silica in the presence of chaotropic salts
  • the technology is based on the particular affinity that is created between nucleic acids, silica and cations that would make the link between the phosphate groups and the silanol residues present on the surface of the silica as described in "Sample Preparation Techniques in Analytical Chemistry. Vol 162 Edited by S. Mitra Wiley-Interscience 2003 ".
  • EP-B-1.367.137 describes the improvement of BOOM technology by using magnetic silica particles for the extraction of nucleic acids, allowing much easier automation.
  • EP-B-1.476.550 discloses a method for purifying nucleic acids using a solid phase modified with thioethers and eluents consisting of lyotropic salts.
  • Patent EP-B-1,266,385 proposes ferromagnetic or ferrimagnetic silica particles for the purification of nucleic acids.
  • EP-B-1.762.618 discloses a solution for extracting nucleic acids from blood consisting of 15 to 35% guanidine and a detergent.
  • EP-B-1,771,562 discloses a novel method for extracting nucleic acids based on silica in the presence of organic adjuvants.
  • patent EP-B-1.589.105 proposes the extraction of nucleic acid at acidic pH on magnetic particles not covered with silica.
  • EP-B-1448799 discloses the more or less selective purification of nucleic acids on silica at alkaline pH and in the presence of various anions.
  • EP-A-1,510,577 attempts to protect the use of a mixture of chaotropic salts and hydrophilic additives to optimize DNA separation over RNA.
  • EP-B-1,479,769 describes and claims a selective separation between RNA and DNA. This is based on changes in temperature, ionic strength and chemical composition of some buffered solutions.
  • EP-B-1.869.179 proposes the use of ligands specific for RNA or DNA for the specific extraction of RNA with respect to DNA.
  • US-A-2007/0148651 discloses the specific extraction of RNA from a mixture of DNA and RNA by adsorbing RNA on magnetite particles in the presence of phosphate anions.
  • Patent application WO-A-2009/040444 describes the selective precipitation of genomic DNA on chitosan-coated magnetite particles from a DNA / RNA mixture. The RNA is then recovered in the supernatant by precipitation with alcohol. Finally, mention may be made of US-A-2005/0106576 and US-A-
  • NABP nucleic acid binding fragment
  • nucleic acids RNA or DNA
  • solid phase in the presence of various additives, which will modulate the adsorption more or less selectively.
  • the interactions involved during the adsorption of the nucleic acids are of a weak nature (electrostatic, ionic, hydrophobic, hydrogen bonds, etc.) in comparison with a covalent bond.
  • WO-A-2012/076794 The corresponding patent application, WO-A-2012/076794, is incorporated herein by reference.
  • the Applicant brought an early solution to the problem of separation between RNA and DNA from a complex medium. It was proposed to discriminate RNA from DNA on the basis of their chemical composition. Indeed, the only difference between RNA and DNA lies in the presence of a 2 'hydroxyl group of ribose.
  • the objective was therefore to take advantage of this function to specifically couple a binding molecule (an isatoic anhydride derivative) provided with a group of interest making it possible to perform a molecular sorting between the two macromolecules, based on the recognition specific to the interest group.
  • the reactive binding molecule had to be able to react under mild conditions (65 ° C., duration less than 1 hour and in an aqueous medium).
  • RNA captured and DNA-free can then be separated from its interest group directly on the solid phase so that it can in turn be specifically eluted and amplified. This method therefore makes it possible to sort and separate the RNA from the DNA with a very high selectivity, and consists of:
  • RNA 1-Making a covalent bond between the RNA and a binding molecule (isatoic anhydride derivative) bearing a group of interest.
  • the present invention allows:
  • RNA and aza-anthranylate groups have, after reaction of the binding molecule and cleavage of the linker, a "naked" RNA and without aza-anthranylate groups (in order to avoid any inhibition that would come from aza-anthranylate),
  • RNA an absolute resistance to nucleases by unscheduled functionalisation of the RNA
  • a group of interest is a molecule that:
  • electrophilic molecule / nucleophilic molecule polynucleotide / polynucleotide complement, hydrophobic ligand / hydrophobic solid phase, or
  • aza-isatoic anhydride By binding molecule, it is necessary to understand aza-isatoic anhydride or its derivatives. Note that when aza-isatoic anhydride is opened after reaction with a nucleophile, it is then called aza-anthranylate.
  • azo-isatoic anhydride By derivatives of azo-isatoic anhydride, it is necessary to include any organic compounds comprising a part corresponding to azo-isatoic anhydride and bearing on the aromatic part or on the heterocyclic part of the latter at least one radical, such as a chemical or organic group.
  • ribonucleic acid By “functionalization of at least one molecule of ribonucleic acid” is meant the action of grafting a group of interest - by covalent or non-covalent bonding - on said ribonucleic acid molecule.
  • the term “functionalization” or the terms Related (“functionalize”, for example) means the direct or indirect labeling of said ribonucleic acid molecule by a detectable molecule, the addition of a moiety to said ribonucleic acid molecule for capture, separation or isolation. inhibition of the latter etc.
  • connecting arm is defined a spacer arm of organic nature, such as a single covalent bond, for connecting the binding molecule and the group of interest. It may have a function that can be cleaved by a physicochemical, photochemical, enzymatic, chemical, thermal, etc.
  • RNA is a natural or synthetic polymer consisting of at least two successive modified or unmodified ribonucleotide units.
  • DNA is defined by a natural or synthetic polymer consisting of at least two successive modified or unmodified deoxyribonucleotide units.
  • RNA segment consisting of at least one DNA segment and at least one RNA segment.
  • inhibition is meant the inability of the RNA excessively functionalized by an isatoic anhydride derivative to be amplified by genetic material amplification technology (NASBA, PCR, etc.)
  • NASBA genetic material amplification technology
  • PCR PCR
  • sugar is a compound ribose or deoxyribose.
  • the solution is said to be heterogeneous, for example when it contains a solid support optionally having RNAs fixed on its surface.
  • the pyridinyl group is selected based on the fact that, in addition to solubility, its ability to attract electrons increases the reactivity of the carbonyl function making it more suitable for nucleophilic attack of RNA hydroxyl groups. .
  • the present invention relates to a method of functionalizing at least one ribonucleic acid (RNA) molecule contained in a liquid sample, which comprises the following steps:
  • binding molecule constituted by an azoisatoic anhydride or a derivative thereof
  • a linking arm connecting the binding molecule with the group of interest, b) reacting the anhydride function of the binding molecule with at least one hydroxyl group carried: at the 2 'position of the ribose of one of the nucleotides of the RNA, and / or
  • the present invention also relates to a method for labeling at least one ribonucleic acid (RNA) molecule contained in a liquid sample, which comprises the following steps:
  • binding molecule consisting of an aza-isatoic anhydride or a derivative thereof, having an intrinsic fluorescence
  • the present invention also relates to a method for capturing or separating at least one ribonucleic acid (RNA) molecule which comprises the following steps:
  • binding molecule constituted by an azoisatoic anhydride or a derivative thereof
  • a group of interest consisting of a ligand complementary to an anti-ligand
  • RNA molecules thus captured or separated and use the remainder of the sample enriched in DNA.
  • the linker is associated with the linker molecule before said linker is associated with the group of interest.
  • the arm The binding molecule is associated with the binding molecule after said linker is associated with the group of interest.
  • the binding molecule is previously associated with the RNA.
  • the present invention still relates to a method of selective capture of at least one RNA molecule using at least one binding molecule, a group of interest consisting of a ligand complementary to an anti-ligand, and a linker arm connecting the binding molecule with the group of interest, the binding molecule being constituted by an aza-isatoic anhydride or a derivative thereof, which is covalently attached at the level of a hydroxyl group carried:
  • the present invention finally relates to a method for separating RNA molecules from other biological constituents, in particular DNA molecules consisting of:
  • RNA and DNA undifferentiated nucleic acids
  • the present invention also provides a functionalization reagent, of formula 1):
  • R 1 and R 2 represent, independently of one another, H or a group of interest, knowing that at least one of the radicals R 1 and R 2 is represented by a group of interest, and
  • the grouping of interest can be:
  • a marking marker or precursor at. a marking marker or precursor, or b. a ligand recognizable by a recognition molecule or surface, or particle, etc., to form a stable complex
  • X 1 and X 2 each represent, independently of one another, a linking arm which links the group of interest to the binding molecule
  • radicals Z 1 , Z 2 , Z 3 and Z 4 are constituted by a nitrogen atom (N), the other radicals consist of a carbon atom (C).
  • the invention provides a functionalization reagent of formula (2):
  • R 1 , R 2 and R 3 represent, independently of one another, H or a group of interest, given that at least one of the radicals R 1 , R 2 and R 3 is represented by a group of interest , and
  • a marking marker or precursor at. a marking marker or precursor, or b. a ligand recognizable by a recognition molecule or surface, or particle, etc., to form a stable complex
  • X 1 , X 2 and X 3 each represent, independently of one another, linking arms which connect the group of interest to the binding molecule
  • radicals Z 1 , Z 2 and Z 3 are constituted by a nitrogen atom (N), the other radicals consist of a carbon atom (C).
  • Y represents Z 4 or the group CX 3 -R 3 ,
  • the interest group is selected from:
  • a marking marker or precursor or d. a ligand recognizable by a recognition molecule or surface, or particle, etc., to form a stable complex
  • the capture or separation means is constituted by a solid support, such as particles of polymer or silica, magnetic or not, or a filter or by the inner wall of a container.
  • the link arm X is an arm organic spacer for connecting the binding molecule and the group of interest, such as a simple covalent bond between the binding molecule and the group of interest or a single carbon atom, optionally substituted, a sequence of at least two carbon atoms, optionally containing aromatic structures and / or hetero atoms (oxygen, sulfur, nitrogen, etc.).
  • the linker X comprises a function or a linkage capable of being cleaved by a physico ⁇ chemical , photochemical, thermal, enzymatic and / or chemical means allowing the separation of the molecule from binding with respect to the RNA under particular light, temperature, enzymatic or chemical conditions.
  • the invention also provides a functionalized RNA biological molecule obtainable by one of the methods mentioned above.
  • the invention proposes to also cover a kit for detecting a target RNA molecule comprising a reagent, as described above.
  • the invention relates to a method of functionalization, which comprises the following additional step between steps a) and b) of hydrolyzing the terminal monophosphate group at the 3 'position of each strand of ARN to be functionalized.
  • a linking arm substitutes the pyridynyl group.
  • the cleavable function is designed and positioned so that it can form after cleavage a cyclic heterocycle of 5 to 8 members with the carbonyl function of the RNA aza-anthranylate and thus release a naked RNA, having its 2 '- OH free (2), usable in any mode of amplification, detection or protection of the RNA and where it is necessary to absolutely avoid any potential inhibition that would be due to aza-anthranylate.
  • This last embodiment is preferably based on the formation of a spontaneously forming aza-thi-lactone during the cleavage of the cleavable disulfide function (-SS-) of the linker arm carried by the position 5.
  • a spontaneously forming aza-thi-lactone during the cleavage of the cleavable disulfide function (-SS-) of the linker arm carried by the position 5.
  • Such self-immolatable systems have never been described in aza-isatoic series and for the purpose of releasing an RNA.
  • This latter embodiment also makes it possible to avoid the release of by-products during hydrolysis with DTT, the thiolactone remaining on the support.
  • Figure 1 shows the principle of sorting RNA using aza-isatoic anhydride according to a first embodiment.
  • FIG. 2 presents the principle of sorting RNA in the presence of an azoisatoic anhydride with a group inducing the release of the "naked" RNA molecule in a second embodiment, called aza-isatoic anhydride. -immolable.
  • Figure 3 describes the synthesis of an aza-isatoic derivative with a biotinylated group of interest.
  • Figure 4 presents a graph on the study of the stability in solution of an aza-isatoic compound compared to that of an isatoic compound.
  • Figure 5 shows a graph on functionalization tests of a 27-sea ORN with derivatives of isatoic anhydride and aza-isatoic anhydride.
  • Figure 6 proposes to highlight the chemoselectivity of the aza-isatoic series for RNA over that of AD.
  • RNA ribonucleic acid
  • Biot-peg 4 -COPFP 3- (2- (2- (3-biotin-dPEG 3 -propanamido) ethyl) disulfanyl) propanoic acid ester and pentafluoro phenol
  • Biot-peg 4 -SS-azaIAMe Molecule A of the present application (1- ⁇ 5- [(3aS, 6aR) -2-oxo-hexahydro-1H-thieno [3,4-d] imidazolidin-4- yl] pentanamido ⁇ -N- (2 - ⁇ [2- (3- ⁇ 1-methyl-2,4-dioxo-1H, 2H, 4H-pyrido [2,3-d] [1,3] oxazin-6 ⁇ yl ⁇
  • Biot-peg 4 -SS-IAMe 5- (3- (2- (2- (biotin-dPEG 3 -propanamido) ethyl) disulfanyl)) propanamido) isatoic anhydride, as described in Example 1-10 of WO-A-2012/076794, ⁇ TLC: thin layer chromatography,
  • MilliQ water ultrapure water (Millipore, Molsheim, France)
  • EDC 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide
  • NP1 PI nuclease
  • ODN Oligo-deoxyribonucleotide
  • TEAAc Triethyl ammonium acetate
  • the LC-MS analyzes were performed with a WATERS Alliance 2795 HPLC chain equipped with a PDA 996 diode array detector (Waters), a ZQ 2000 mass spectrometry detector (Waters), an Empower version software 2 and a WATERS XTerra MS C18 column (4.6 x 2.5 ⁇ m) used at a flow rate of 1 ml / min at 30 ° C (detection at 260 nm or max plot).
  • the ZQ 2000 mass spectrometer has an Electrospray ionization source. Ionizations were performed in positive mode with a cone voltage of 20V and a voltage at the level of the capillary of 3.5kV.
  • condition 1 The conditions used for the HPLC analyzes are as follows (conditions 1):
  • Example 1 Synthesis of a Derivative of Aza-Isatoic Anhydride Conjugated to a Group of Interest Introduction: A general description of the synthesis of the compounds which will be described in Example 1.
  • the conjugation of the azo-isatoic anhydride or its derivatives to a group of interest presupposes a chemical reaction between the aza-isatoic anhydride, equipped with a reactive function, and the molecule of interest, also being provided with a reactive function. It should be noted that it is particularly important to preserve the integrity of the aza-isatoic anhydride portion during this coupling. Those skilled in the art know a multitude of ways to conjugate two molecules together to obtain a new molecule with properties common to both.
  • the strategy chosen for this synthesis is based on the iodination in position 6 of chloro nicotinic acid, protected in the form of terbutyl ester 2, to obtain the compound
  • This then allows the introduction into position 6 of a precursor of a carboxylic acid function (compound 5), said function will be the point of attachment for the introduction of a linker and then a group of interest via pseudo-peptide couplings.
  • the formation of azosatoid anhydride is by intromolecular cyclization of the tert-butyl amino ester 11 or 12 in the presence of phosgene, as is well represented in FIG. work on stable precursors throughout the synthesis.
  • the reaction mixture is evaporated to dryness, taken up in 200 mL of a 5% aqueous K 2 CO 3 solution and then extracted with dichloromethane (3 ⁇ 150 mL). The organic phases are then combined, dried over anhydrous sodium sulphate, filtered and finally evaporated. The final product is obtained as an oil with a yield of 88% (5.97 g, 27.94 mmol).
  • the reaction mixture is evaporated to dryness, taken up in 75 ml of water and then extracted with dichloromethane (3 ⁇ 75 ml). The organic phases are then combined, dried over anhydrous sodium sulphate, filtered and finally evaporated.
  • the oil obtained is then purified on a column of silica gel using an eluent gradient (EP then EP / Et 2 ⁇ 0.95: 0.5). The final product is obtained as an oil with a yield of 85% (2.35 g, 11.28 mmol).
  • tert-butyl 2- (methylamino) nicotinate 3 (21.61 mmol, 1 eq) are dissolved in 30 ml of a dichloromethane / acetic acid mixture (6: 1). 5.83 g of N-iodosuccinimide (25.93 mmol, 1.2 eq) are added to the reaction medium at room temperature. The reaction is stirred magnetically at room temperature for 30 minutes.
  • the reaction mixture is then neutralized with 7 ml of a saturated aqueous solution of sodium thiosulphate, taken up in 100 ml of a 5% aqueous K 2 CO 3 solution and then extracted with dichloromethane (3 ⁇ 100 ml).
  • the organic phases are then combined, dried over anhydrous sodium sulphate, filtered and finally evaporated.
  • the solid obtained is then purified on a column of silica gel using an eluent gradient (EP then EP / Et 2 ⁇ 0 9: 1).
  • the final product is obtained in the form of a yellow powder with a yield of 96% (6.92 g, 20.71 mmol).
  • the reaction mixture is evaporated to dryness, taken up in 50 ml of dichloromethane and then filtered through Celite. The volume of 200 mL of water is added and the mixture is extracted with dichloromethane (3x150 mL). The organic phases are then combined, dried over anhydrous sodium sulphate, filtered, and finally evaporated. The resulting solid is then purified on a silica gel column using an eluent gradient (EP at EP / Et 2 ⁇ 0 7: 3). The final product is obtained in the form of a yellow powder with a yield of 76% (3.33 g, 11.39 mmol).
  • the reaction mixture is evaporated to remove tetrahydrofuran.
  • the pH of the aqueous solution obtained is adjusted to 6 with acetic acid.
  • This solution is then extracted with ethyl acetate (4x50 mL).
  • the organic phases are then combined, dried over anhydrous sodium sulphate, filtered and finally co-evaporated with toluene.
  • the final product is obtained in the form of a yellow powder with a yield of 92% (4.25 g, 15.16 mmol).
  • cystamine 26.64 mmol, 1 eq
  • cystamine 26.64 mmol, 1 eq
  • a solution of 5.814 g of Boc 2 0 (26, 64 mmol; 1 eq) and 11.14 mL of TEA (79.12 mmol; 3 eq) in 40 mL of methanol is then added dropwise to the cystamine solution for 45 minutes, with magnetic stirring at room temperature.
  • the reaction medium is then evaporated to dryness until a white solid is obtained.
  • the solid obtained is taken up in 70 ml of a 1M Na3 ⁇ 4PO 4 solution.
  • the mixture is then extracted with diethyl ether (3 x 90 mL).
  • the aqueous phase is alkalized at pH 9 using a 1M NaOH solution.
  • the mixture is then extracted with ethyl acetate (6 x 50 mL).
  • the organic phases are combined, dried over MgSO 4 and then evaporated under vacuum.
  • the product is obtained as an oil with a yield of 42% (2.82 g, 11.19 mmol).
  • the reaction mixture is evaporated to dryness, taken up in 75 mL of saturated aqueous sodium bicarbonate solution and then extracted with ethyl acetate (4x75 mL). The organic phases are then combined, dried over anhydrous sodium sulphate and filtered. The solid obtained is then purified on a silica gel column using an eluent gradient (DCM / AcOEt 8/2 with DCM / AcOEt 2/8). The final product is obtained in the form of a white powder with a yield of 94% (5.2 g, 10.10 mmol).
  • reaction mixture is evaporated to dryness, taken up in 50 ml of saturated aqueous sodium bicarbonate solution and then extracted with ethyl acetate (4x50 ml). The organic phases are then combined, washed with water (2 ⁇ 50 mL), dried over anhydrous sodium sulphate and filtered. The final product is obtained as an oil with a quantitative yield (1.6 g, 3.86 mmol).
  • IR (KBr): ⁇ 3378 (NH), 2977, 2931, 1682 (CO), 1612, 1578, 1520, 1368, 1304, 1228, 1160, 1131, 1095, 910, 732 cm -1 .
  • Example 1.10 Synthesis of 5- [2- ( ⁇ 2 - [(2- ⁇ 5 - [(3aS, 6aR) -2-oxo-hexahydro-1H-thieno [3,4-d] imidazolidin-4-yl] tert-Butyl [ ⁇ ] -benzoyl (ethyl) disulfanyl] ethyl] carbamoyl) ethyl] -2- (methylamino) nicotinate
  • the reaction mixture was evaporated to dryness and directly purified on a C18 grafted silica gel column, using an eluent gradient (3 ⁇ 40 to 3 ⁇ 40 / ACN 3/7).
  • the final product is obtained in the form of a white powder with a yield of 70% (545 mg, 0.85 mmol).
  • Example 1.11 Synthesis of 5- [(3aS, 6aR) -2-oxo-hexahydro-1H-thieno [3,4-d] imidazolidin-4-yl] -N- (2- ⁇ [2- (3- ⁇ 1-methyl-2,4-dloxo-1H, 2H, 4H-pyrido [2,3-d] [1,3] oxazin-6-yl ⁇ propanamido) ethyl] disulfanyl ⁇ ethyl) entanamide:
  • reaction mixture is evaporated to dryness and directly purified on a C18 grafted silica gel column, using an eluent gradient (3 ⁇ 40 to 3 ⁇ 40 / ACN 4/6).
  • the final product is obtained in the form of a white powder with a yield of 42% (200 mg, 0.33 mmol). Mp: 125 ° C.
  • IR (KBr): ⁇ 3299 (NH), 2927, 1785 (CO), 1735 (CO), 1704 (CO), 1641 (CO), 1612, 1488, 1326, 1232, 1179, 1069, 1045, 979, 787 , 745, 674 cm -1 .
  • the reaction mixture is evaporated to dryness and directly purified on a C18 grafted silica gel column, using an eluent gradient (3 ⁇ 40 to 3 ⁇ 40 / ACN 4/6).
  • the final product is obtained in the form of a white powder with a yield of 85% (730 mg, 0.822 mmol).
  • Example 1.13 Synthesis of 1- ⁇ 5- [(3aS, 6aR) -2-oxohexahydro-1H-thieno [3,4-d] imidazolidin-4-yl] entanamido ⁇ -N- (2- ⁇ [2 - (3- ⁇ 1-methyl-2,4-dioxo-1H, 2H, 4H-pyrido [2,3-d] [1,3] oxazin-6-yl ⁇ propanamido) ethyl] disulfanyl ⁇ ethyl) -3 , 6,9, 12-tetraoxapentadecan-15-amide:
  • IR (KBr): ⁇ , 3426 (NH), 2926, 2875, 1782 (CO), 1729 (CO), 1641 (CO), 1550, 1490, 1369, 1330, 1093, 788, 746, 677 cm -1 .
  • the precipitate obtained is then filtered on sintered, then washed with MeOH (3x30 mL) and diethyl ether (3x90 mL).
  • the product is obtained in the form of a white powder with a yield of 70% (2.46 g, 7.21 mmol).
  • Example 3 Demonstration of the Reactivity at Room Temperature of an Aza-Isatoic Compound with respect to a Model 27-Basin Oligonibonucleotide (ORN) - Measurement of the Functionalization Ratio: Objective: In order to demonstrate the increase in the aza-isatoic series reactivity of the 27-position ORN functionalization tests at room temperature and at 65 ° C were carried out for the reference isatoic derivative, Biot-peg 4 -SS-IAMe and for the aza-isatoic derivative Biot-peg 4 - SS-azaIAMe (14).
  • the ORN population (labeled and unlabeled) is separated from the excess label by acetone / lithium perchlorate precipitation. Then, the ORNs thus obtained are subjected to hydrolysis with PI nuclease (Aldrich, Saint Louis, USA) and with alkaline phosphatase (Aldrich, Saint Louis, USA) in order to hydrolyze the diester phosphate bonds of the ORN.
  • PI nuclease Aldrich, Saint Louis, USA
  • alkaline phosphatase Aldrich, Saint Louis, USA
  • the rate of functionalization of the ORN is evaluated by measuring: the area corresponding to the mono-nucleoside terminal adducts (functionalized at 2 'and 3') and the area corresponding to the acylated di-nucleotides
  • the pellet is dried with acetone and evaporated at the centrifugal evaporator (RCT 60, Jouan, St Herblain, France).
  • the residue is then taken up in 20 ⁇ l of a H 2 O / DMSO 85/15 solution and an HPLC injection (conditions 1) is performed to verify the absence of functionalization reagent.
  • 2 ⁇ l of PI nuclease (ref .: N8630 Sigma-Aldrich, St.
  • the degree of functionalization is evaluated in UV at 260 nm, by integration of the corresponding mass of acylated dinucleotides and acylated nucleosides, relative to the masses corresponding to the four ribonucleosides.
  • the functionalization rate values presented in the context of this invention do not take into account the correction factor that must be applied as a function of the molar extinction coefficient at 260 nm of each of the nucleosides. act of nucleosides or dinucleotides.
  • FIG. 5 shows the results obtained during functionalization tests on 27-mer ORNs with the BiotEGg 4 -SS-IAMe derivatives, as described in FR 1060102 and Biot-peg 4 -SS-azalAMe 1, at room temperature and at 65 ° C.
  • the uncorrected functionalization rate was evaluated at 13.5% for the aza-isatoic derivative 1 against 7.5% for the reference compound, Biot-peg 4 -SS-IAMe.
  • the reactivity towards an oligoribonucleotide was therefore increased by a factor of 1.8 in aza-isatoic series at 65 ° C.
  • This example demonstrates a conservation of the chemo-selectivity in aza-isatoic series for an ORN compared to an ODN.
  • the presence of 2 '-OH groups specific for ORN, is at the origin of the chemo-specific reaction on the ORN.
  • EXAMPLE 5 Selective Extraction of HIV RNA Transcripts from a Solution Containing a Mixture of HIV RNA Transcripts and Genomic DNA: Objective: The aim is to demonstrate that the concept of RNA enrichment of a biological solution, containing a mixture of RNA and DNA using as functionalizing reagent the azasatoic derivative 1 at room temperature is possible. For this, two biological models of nucleic acids were chosen, transcribed HIV for RNA and genomic calf DNA. In order to compare the efficacy of the azasatoic derivative 1, these tests were also performed on the reference compound Biot-peg 4 -SS-IAMe at 65 ° C. and at room temperature. Procedure: The nucleic acids used in this example are as follows:
  • the final concentrations of TEAAc and functionalizing reagent are respectively 250 mM and 1.5 mM.
  • the three tubes are incubated for 1 hour at room temperature or at 65 ° C in a heated rack.
  • a volume of 900 ⁇ L of lysis buffer (Easy Mag buffer, 280134, bioMérieux, Marcy l'Etoile, France) and 50 ⁇ L of magnetic silica particles (EasyMAG silica, ref 280133, bioMérieux, Marcy l'Etoile, France ) are added to each tube.
  • the latter are immediately stirred by vortex effect after adding the silica, and then incubated for 10 minutes at room temperature.
  • the supernatants are removed by aspiration using a pipette.
  • the tubes are still vortexed and magnetized to remove the supernatant.
  • a first wash is carried out with 500 ⁇ l of washing buffer 1 (Easy Mag buffer, reference 280130, bioMérieux, Marcy l'Etoile, France). Two washes are then carried out with 900 ⁇ L and then 500 ⁇ L of washing buffer 2 (Easy Mag buffer, reference 280131, bioMérieux, Marcy l'Etoile, France). Finally, a final washing step is carried out with 500 ⁇ l of elution buffer 3 (Easy Mag buffer, reference 280132, bioMérieux, Marcy l'Etoile, France) at room temperature.
  • Elution of the nucleic acids is carried out with 20 ⁇ l of elution buffer 3 stirred in a heating stirrer (1400 rpm) at 70 ° C. After 5 minutes, the tubes are vortexed and magnetized to recover the supernatants. These are dosed with the Qubit® Fluorometer instrument, ref. Q32857, Invitrogen (Carlsbad, California, United States of America), and using the Quant-iT RNA Assay Kit Kit 5-100 ng (ref Q32855, Invitrogen, Carlsbad, California, United States of America), and Quant-iT dsDNA HS Assay Kit 0.2-100 ng (Ref Q32854, Invitrogen, Carlsbad, California, USA) of America). These assay kits make it possible to determine an RNA / DNA ratio in a mixture.
  • step 2 15 ⁇ l of nucleic acids purified in step 2 and then 5 ⁇ l of 4% PBS + 0.4% SDS are added to each pellet.
  • the tubes are incubated for 10 minutes with gentle agitation (vortex stirrer at the minimum speed) at room temperature. After magnetic separation, the supernatants are recovered using tapered tips. This supernatant is dosed as before with the Qubit® Fluorometer.
  • Each pellet is suspended in 8 ⁇ l of a 100 mM DTT solution in PBS IX. Each test is then vortexed and incubated for 1 hour at 40 ° C, 300 RPM. After magnetic separation, the supernatant is recovered using tapered tips. This supernatant is assayed with the Qubit® Fluorometer instrument (Invitrogen, Carlsbad, California, USA) as previously (about 100 ng RNA is collected).
  • RNA extraction extraction [ purified flml / [RNA] RNA at V stapel.
  • RNA enrichment process from a selective functionalization of RNA with the aza-isatoic derivative 1 and at room temperature, is demonstrated.
  • the DNA / RNA ratio thus passes from 90/10 at the end of the purification step, to a ratio of 4/96 after the complete process (test 3). This result demonstrates the efficacy of the azasatoic derivative 1 at room temperature for the selective extraction of RNA.
  • this derivative makes it possible to enrich the mixture with RNA by performing the functionalization step at room temperature.
  • the intermediate selectivity is increased by a factor of 5 to ambient temperature relative to the reference compound under the same conditions at 65 ° C.
  • the aza-isatoic derivative 1 4 makes it possible to functionalize the ribonucleic acids at room temperature, and consequently to increase the selectivity of the extraction process with respect to the RNA.
  • Example 6 Demonstration of the concept of self-immolatable group associated with a biotinylated aza-isatoic anhydride. Synthesis of an aza-isatoic derivative with a disulfide group on the aromatic part

Abstract

La présente invention concerne un procédé de fonctionnalisation d'au moins une molécule d'acide ribonucléique (ARN), contenu dans un échantillon liquide, qui comprend les étapes suivantes: a) disposer d'au moins: - une molécule de liaison constituée par un anhydride aza-isatoïque ou un de ses dérivés, - un groupement d'intérêt, et - un bras de liaison reliant la molécule de liaison avec le groupement d'intérêt, b) faire réagir la fonction anhydride de la molécule de liaison avec au moins un groupement hydroxyle porté: - en position 2' du ribose d'un des nucléotides de l'ARN, et/ou - en position(s) 2' et/ou 3' du ribose du nucléotide à l'extrémité 3' terminal de l'ARN, et c) obtenir un aza-anthranylate reliant, à l'aide du bras de liaison, l'ARN au groupement d'intérêt.

Description

PROCEDES DE FONC IONNALISA ION ET REACTIFS UTILISES DANS DE TELS PROCEDES UTILISANT UN ANHYDRIDE AZA-ISATOÏQUE OU UN DE SES DERIVES, MOLECULES BIOLOGIQUES AINSI TRAITEES ET KITS
La présente invention concerne de nouveaux procédés notamment de fonctionnalisation, de marquage, de capture ou de séparation de molécules biologiques, et plus précisément d'acides ribonucléiques (ARN) naturels ou synthétiques ou d'acides nucléiques chimériques ADN/ARN synthétiques. Dans la suite du texte, le terme « fonctionnalisation » ou les termes apparentés (« fonctionnaliser » par exemple) seront utilisés et pourront vouloir dire aussi bien marquage par une molécule détectable, addition d'un adduit permettant la capture, la séparation ou l'inhibition de molécules biologiques. Elle concerne également des molécules biologiques ainsi traitées ou marquées, ainsi que des kits utilisables dans le domaine du diagnostic, notamment le diagnostic moléculaire, utilisant la détection et l'analyse des acides nucléiques.
L'état de la technique montre que de nombreuses méthodes existent pour fonctionnaliser avec des groupements d'intérêt, des nucléotides, des oligonucléotides ou des acides nucléiques naturels ou produits par des techniques d'amplification.
Une première méthode consiste à fixer le groupement d'intérêt sur la base, que celle-ci soit naturelle ou modifiée. Une deuxième méthode propose de fixer le groupement d'intérêt sur le sucre, là encore qu'il soit naturel ou modifié. Une troisième méthode a pour objet la fixation du groupement d'intérêt sur le phosphate. Le groupement d' intérêt sur la base a été notamment utilisé dans l'approche de marquage des acides nucléiques par incorporation de nucléotides directement marqués. De manière générale, la fonctionnalisation au niveau du sucre est bien plus neutre que celle réalisée sur le phosphate ou sur la base, ce qui impacte la spécificité et la sensibilité .
En fait l'homme du métier, qui doit effectuer une fonctionnalisation d'un nucléotide ou d'un analogue de nucléotide ou d'un acide nucléique, est enclin à effectuer cette fixation sur la base ou sur le sucre qui lui offrent plus de commodité et d'alternatives. C'est d'ailleurs ce qui ressort de l'étude de nombreux documents sur le marquage notamment, tels que EP-A-0.063.879, EP-A-0.097.373, EP-A- 0.302.175, EP-A-0.329.198, EP-A- 0.567.841 , US-A-5 , 449 , 767 , US- A-5,328,824, WO-A- 93 / 16094 ou DE-A-3.910.151 pour la base ou EP-B-0.063.879 ou EP-B- 0.286.898 pour le sucre. De manière plus spécifique, la fonctionnalisation sur le sucre est souvent utilisée dans le cas des sondes nucléiques préparées par synthèse chimique. Il existe toutefois un besoin pour des groupements d' intérêt qui soient spécifiques au niveau de la position de fixation, et en particulier qui n'affectent pas les propriétés d'hybridation des bases impliquées dans la formation de la double hélice, par l'intermédiaire des liaisons hydrogènes, et qui soient également spécifiques des ARN, afin de fonctionnaliser indifféremment les ribonucléotides , les oligoribonucléotides , des acides nucléiques ARN naturels ou préparés par transcription, les acides nucléiques comprenant à la fois au moins une partie ARN et au moins une partie ADN, par transcription inversée ou par amplification enzymatique. Dans le cas du marquage et afin de rendre les cibles détectables sur les puces à ADN, il est nécessaire d'y fixer préalablement un marqueur. Il s'agit d'une étape importante, car elle seule permet de détecter la présence des acides nucléiques et d'établir un diagnostic. Il importe donc que la technologie de marquage soit extrêmement reproductible, robuste et sensible. Ceci est directement corrélé à la qualité et à l'efficacité du réactif chimique de marquage. De plus, dans les technologies de fonctionnalisâtion chimique, le groupement d'intérêt ne doit pas affecter les propriétés d'hybridation des acides nucléiques.
La Demanderesse a, par le passé, déposé un certain nombre de demandes de brevet sur des molécules comprenant un composé diazo :
brevet EP-B-1.383.732 déposé le 3 mai 2002, et délivré le 17 février 2010,
- demande EP05/739660.8 déposée le 24 mars 2005,
- demande EP08/805961.3 déposée le 9 juin 2008, et
- demande FR08/55190 déposée le 29 juillet 2008.
A titre d' information, les groupements d' intérêt à base de fonction diazo ne sont pas chémo-spécifiques de l'ARN ni régio-spécifiques d'une position particulière. Ils fonctionnalisent donc de façon indifférenciée l'ADN ou l'ARN. De plus, la fonction diazo est difficilement compatible avec une conjugaison avec certaines cyanines, comme le Cy5 par exemple .
Or il est important de pouvoir être plus spécifique dans le mécanisme de fonctionnalisation, par exemple pour le marquage : A) Dans le cas de puces à ADN mesurant les niveaux d'expression d'ARNm, l'ARN et lui seul doit être marqué. Or, dans un échantillon biologique complexe, ADN et ARNm peuvent être présents et donc marqués concomitamment . En utilisant un marqueur non chémo-spécifique de l'ARN, cela peut conduire à l'augmentation du bruit de fond, lors de l'hybridation.
B) Le marqueur, utilisé généralement en large excès, doit être détruit ou éliminé avant de mettre en contact les acides nucléiques marqués avec les sondes immobilisées sur la puce. En effet, dans le cas contraire, on risquerait alors de marquer les sondes, ce qui conduirait à un résultat impossible à interpréter. Le fait d'avoir un marqueur spécifique de l'ARN permettrait donc d'éviter ce problème de marquage des sondes du à un excès de marqueur non hydrolysé. C) En raison des effets stériques, il est moins perturbant pour l'hybridation entre une sonde oligonuclétidique et une cible constituée d'acides nucléiques de marquer sur les extrémités du brin d'ARN cible (5' ou 3') plutôt qu'en interne. Or les techniques de marquage commerciales ne permettent pas une telle régio-spécifité du marquage. A notre connaissance, seules les techniques chimiques d'oxydation au périodate apportent ce degré de spécificité mais elles sont sévèrement impactées par la complexité du protocole de marquage (plus de trois à quatre réactifs et deux à trois purifications avant de disposer d'ARN marqué) ; voir à ce sujet :
- « An oligonucleotide microarray for microRNA expression analysis based on labeling RNA with quantum dot and nanogold probe » par Ru-Qiang Liang Nucleic Acids Research, 2005, Vol. 33, No. 2 el7 dans Nucleic Acids
Research, 1996, Vol. 24, No. 22 4535-4532, ou bien - « Chemical methods of DNA and RNA fluorescent Labeling » Nucleic Acids Research, 1996, Vol. 24, o. 22 4535-4532. par Dmitri Proudnikov.
En fait, la fonctionnalisation régio-spécifique des extrémités 3' de l'ARN ne peut être obtenue qu'à partir de techniques enzymatiques extrêmement spécifiques. De telles techniques sont utilisées par exemple par Affymetrix (Santa Clara, USA) ou par Agilent Technologies (Santa Clara, USA) avec le marquage spécifique d'ARNs en 3' avec la T4 RNA Ligase et un substrat de type pCp-Marqueur ou par d' autres techniques enzymatiques décrites dans certaines références :
Huang Z. "Sélective labeling and détection of spécifie RNAs in an RNA mixture" Analytical Biochemistry 2003 129- 133,
- Martin G. "Tailing and 3' -end labeling of RNA with yeast polys (A) polymerase and various nucleotides RNA 1998 22— 230, ou
Huang Z. "A simple method for 3' -labeling of RNA" Nucleic Acids Research 1996 4360-4361. Le problème des techniques enzymatiques est leur sensibilité au type de substrat (taille et séquence de l'ARN à marquer) et bien sûr leur coût associé à la fois au substrat mais surtout à l'enzyme.
De plus, le développement récent de la détection des microARNs ou miARNs (ARNs non-codants de courte taille, propres aux cellules eucaryotes) qui peuvent être des marqueurs de pathologies nécessite des technologies de marquage par voie chimique, pratiques et surtout régio- spécifiques des ARNs et notamment de l'extrémité 3' pour limiter au maximum les effets d'encombrement stérique particulièrement marqués sur des duplex de petite taille. De plus, ces petits oligomères se marquent très mal par les techniques enzymatiques justement en raison de leur taille comme décrit par F. Natt dans la référence : Nucleic Acids Research, 2007, Vol. 35, No. 7 e52. II y a donc un grand intérêt à disposer de technologies de fonctionnalisation chimique de faible coût qui en plus d'être spécifiques de l'ARN le seraient également de l'extrémité 3', et cela en toute indépendance de la taille et de la séquence du substrat à marquer. D) Bien que la technologie de marquage diazo soit une excellente technique, la nature des étapes de synthèse conduisant à ces molécules n'est pas compatible avec la nature chimique de certains fluorophores (Cy5 par exemple qui est instable en présence d'hydrazine) . La technologie diazo est donc préférentiellement utilisée avec de la biotine en tant que groupement d'intérêt. Or il y a un réel besoin de disposer de groupements d'intérêt directs portant un fluorophore, afin de s'affranchir d'étapes supplémentaires, telles que l'étape de détection des composés biotinylés par une molécule de streptavidine fluorescente. Il importe donc de disposer d'une technologie versatile ou le groupement réagissant avec les acides nucléiques (l'anhydride isatoïque par exemple) est chimiquement compatible avec une conjugaison avec divers groupements comme le Cy3 ou le Cy5 par exemple. E) Enfin, la chémo-sélectivité de l'ARN vis-à-vis de l'ADN peut aussi avoir des applications en préparation d'échantillon également appelée « sample prep », telles que la sélection des ARNs sans utiliser une ADNase, la capture sélective d'ARN dans un milieu contenant de l'ADN, la décontamination, l'inhibition sélective de l'amplification, etc. En 1982, Moorman (Moorman JACS 1982 104 6785-6786) a publié l'utilisation de l'anhydride isatoïque pour sa réactivité sélective avec les sérines de la chymotrypsine, ce qui conduit à 1 ' inactivation de la protéine. Cette publication est l'une des premières qui démontre la réactivité de l'anhydride isatoïque sur les groupements hydroxyles d'une biomolécule, en milieu aqueux. Toutefois et curieusement alors que l'on s'attendrait à avoir une réactivité préférentielle avec les fonctions aminés présentes sur la protéine, ces dernières étant plus nucléophiles , il est apparu que les fonctions alcool réagissent d'abord.
En 1983, Hiratsuka (Hiratsuka BBA 1983 742 496-508) publie l'un des premiers articles sur la réactivité de l'anhydride isatoïque ou de l'anhydride isatoïque méthylé sur des ribonucléosides libres (5' triphosphate ou 5' -OH) . Ceci afin de synthétiser des substrats fluorescents d'enzymes pour l'étude de ces dernières. En effet, l'anhydride isatoïque, une fois ouvert, devient fluorescent. Il faut cependant, pour éviter toute confusion, faire la différence entre la fluorescence intrinsèque de l'anhydride isatoïque ouvert, qui devient une molécule d' anthranylate (Excitation : 335-350 nm et Emission : 427-446 nm) , et la fluorescence que l'on apporte par conjugaison avec un fluorophore. On trouve en effet une multitude d'articles citant le marquage d'ARN par l'anhydride isatoïque, mais utilisant la fluorescence intrinsèque de 1 ' antranylate pour le détecter. Leurs conclusions sont les suivantes : l'anhydride isatoïque ne réagit pas sur les aminés exocycliques des bases, malgré une nucléophilie décrite habituellement pour être bien supérieure à celle des
2' -OH,
l'anhydride isatoïque n'est pas connu pour réagir sur les 5' -OH, l'anhydride isatoïque réagit préférentiellement
(cinétiquement ) sur le 2' -OH par rapport au 3' -OH ( thermiquement favorisé) . Cependant, en raison de la migration entre les positions 2' et 3' des groupements acyle, un mélange de l'ordre de 90% d'ester en 3' est obtenu.
Ovodov en 1990 (Ovodov, FEBS 1990 270 111-114), par des recherches basées sur des travaux de Khorana de 1963 (Stnark, Journal of the American Chemical Society 1963 75 2546 et Knorre Biokhimiya 1965 1218-1224), décrit l'acylation d'ARNs messager en milieu aqueux avec de l'anhydride acétique (DMF 5%, acétate de sodium à 1M, pH 7, 2 à 3 heures à température ambiante) pour protéger l'ARN vis-à-vis de l'action des ARNases. Il décrit un niveau d' acylation de 70-75% suffisant pour inhiber l'action des ARNases. En 1993, Servillo (Servillo Eur. J.Biochem. 1993 583-589) publie un article démontrant le « marquage » spécifique en 3' , d'ARN de transfert, après incubation avec de l'anhydride isatoïque (Molecular Probes, Eugène, USA) en milieu aqueux et à un pH de 8,8 pendant 3 heures et à température ambiante. Il démontre, par diverses techniques, une fonctionnalisation absolument régio-spécifique en 3' . Par hydrolyse totale avec de l'ARNase A et de l'ARNase T2, il montre la présence d'un seul nucléoside fluorescent. Avec l'inhibition de la phosphodiestérase, il démontre un marquage total en position 3' , correspondant à un marquage régio-spécifique sans mentionner de marquage en 5' .
En 2000 paraît le premier article, d'une série en cours, de K. M. Weeks sur l'acylation sélective des hydroxyles en 2' de l'ARN. Cette série d'articles pondère les résultats de Servillo en termes de la régio-spécificité de l'acylation puisque Weeks décrit cette fois une acylation sélective de la position 2' OH de l'ARN. Elle couvre la littérature sur la technique SHAPE (Sélective 2 ' -Hydroxyl Acylation and Primer Extension) et comporte notamment les articles :
K.A. Wilkinson, S. M. Vasa, K.E. Deigan, S.A. Mortimer, M.C. Giddings and K.M. Weeks, Influence of nucleotide identity on ribose 2 ' -hydroxyl reactivity in RNA. RNA
15, 1314-1321 (2009) .
- K.E. Deigan, T.W. Li, D.H. Mathews and K.M. Weeks, Accurate SHAPE-directed RNA structure détermination. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 106, 97-102 (2009).
- S.A. Mortimer and K.M. Weeks, Time-resolved RNA SHAPE chemistry. J. Am. Chem. Soc. 130, 16178-16180 (2008) .
- CM. Gherghe, S.A. Mortimer, J.M. Krahn, N.L. Thompson and K.M. Weeks, Slow conformational dynamics at C2 ' - endo nucleotides in RNA. J. Am. Chem. Soc. 130, 8884- 8885 (2008) .
S.A. Mortimer and K.M. Weeks, A fast acting reagent for accurate analysis of RNA secondary and tertiary structure by SHAPE chemistry. J. Am. Chem. Soc. 129, 4144-4145 (2007) .
- K.A. Wilkinson, E.J. Merino and K.M. Weeks, Sélective
2 ' -hydroxyl acylation analyzed by primer extension
(SHAPE) : quantitative RNA structure analysis at single nucleotide resolution. Nature Protocols 1, 1610-1616
(2006) .
- K.A. Wilkinson, E.J. Merino and K.M. Weeks, RNA SHAPE chemistry reveals non-hierarchical interactions dominate equilibrium structural transitions in tRNAAsp transcripts. J. Am. Chem. Soc. 127, 4659-4667 (2005). E.J. Merino, K.A. Wilkinson, J.L. Coughlan and K.M. Weeks, RNA structure analysis at single nucleotide resolution by Sélective 2 ' -Hydroxyl Acylation and Primer Extension (SHAPE) . J. Am. Chem. Soc. 127, 4223- 4231 (2005) . S.I. Chamberlin and K.M. Weeks, Mapping local nucleotide flexibility by sélective acylation of 2'- amine substituted RNA. J. Am. Chem. Soc. 122, 216-224 (2000) .e
- K.M. Weeks, The mechanism of RNA SHAPE chemistry, J.
Am. Chem. Soc. 134, 6617-24 (2012) .
L'auteur utilise des dérivés de l'anhydride isatoïque (anhydride isatoïque N-méthylé, anhydride isatoïque, anhydride nitro isatoïque N-méthylé, anhydride nitro isatoïque) qu'il fait réagir sur des ARN de transfert ou de courts oligoribonucléotides modèles (milieu aqueux, pH 8, température ambiante ou 37°C, durant quelques heures) . Seuls les 2' -OH peu contraints, c'est-à-dire peu engagés dans des structures secondaires ou tertiaires, sont acylés, car ils sont plus accessibles et moins près d'un squelette phosphate diester. Ils deviennent donc plus réactifs. Ensuite, cet ARN partiellement acylé est soumis à une transcription in vitro qui génère des fragments d'ADN plus ou moins longs, l'élongation s' arrêtant à chaque fois qu'un volumineux 2'-0- anthranylate, c'est-à-dire une molécule d'anhydride isatoïque ouverte qui s'est fixée sur le 2' -OH du sucre, est rencontré. Après séquençage ou analyse de ces fragments par électrophorèse capillaire, on peut établir une cartographie de la structure tertiaire des ARN messagers ainsi soumis à cette technique. Il s'agit du principe de la technique SHAPE (Sélective 2'-Hydroxyl Acylation analyzed by Primer Extension) .
En 2008, un article de Li, « Aptamers that recognize drug- resistant HIV-1 reverse transcriptase » Na Li, Nucleic Acids Research, 2008, Vol. 36, No. 21 6739-6751, cite les travaux de Weeks pour marquer spécifiquement les 2' -OH en interne qui seraient les plus accessibles et décrire ainsi une cartographie structurale de l'ARN en question. En 2007, Thomas Cech (Cech T. R. RNA 2007 536-548) utilise également cette technique pour étudier la structure d'ARNs cristallisés .
L'état de la technique comporte également d'autres brevets sur la capture.
Le brevet US-B-7, 244, 568 porte sur l'acylation sélective, plus ou moins partielle, des 2' -OH de l'ARN avec des groupements hydrophobes (butyryle ou pentanoyle à partir des anhydrides correspondants). L'ARN devient ainsi suffisamment hydrophobe pour être extrait sélectivement par un solvant organique, ou être sélectivement immobilisé (par exemple sur une phase inverse, de la silice, une membrane, etc.) . Il est décrit également une phase solide activée par un chlorure d' acide ou un anhydride qui permet de sélectivement immobiliser les molécules d'ARN par rapport aux molécules d'ADN. Cette phase peut être réalisée par de l'anhydride isatoïque immobilisé ou le BCPB (Benzyl chloride immobilisé sur polystyrène) . Enfin, il est également décrit une technique pour doser des ARN adsorbés sur une phase solide : les 2' -OH des ARN immobilisés sont mis en réaction avec de l'anhydride isatoïque, la fluorescence intrinsèque générée permet de doser l'ARN immobilisé.
Des études plus poussées démontrent que dans les conditions prônées par ce brevet, l'ADN est fonctionnalisé de la même manière car les anhydrides, qui sont utilisés, ne sont pas chémo-spécifiques et attaquent aussi bien les aminés exocycliques des bases que les groupements hydroxyles du sucre .
Le brevet EP-B-1.196.631 , propose des agents acylants compatibles avec une acylation régiospécifique de l'ARN en milieu aqueux. Ces agents acylants ne doivent pas apporter une trop grosse gêne stérique afin de maintenir les propriétés d'hybridation de l'ARN ainsi modifié. Ce sont principalement des agents acylants permettant l'introduction d'un groupement acétyle ou formyle qui sont utilisés. L'ARN ainsi modifié partiellement sert ensuite de matrice pour une réaction de polymérisation, il peut servir également de sonde dans une réaction de Northern blot. L'idée est de maintenir les propriétés d'hybridation (l'ARN modifié reste le substrat d'une réaction d' élongation) , tout en détruisant les structures secondaires par la présence du groupe en 2' et en rendant l'ARN ainsi modifié résistant vis-à-vis des nucléases. De plus, l'exemple 22 indique que le marquage fluorescent de l'ARN est envisagé, mais uniquement par adjonction de l'anhydride isatoïque méthylé, il s'agit donc d'une fluorescence intrinsèque.
Le brevet EP-B-1.196.631 propose un polynucléotide comprenant ARNm, ARNr ou ARN viral, pour lequel plus de 25 % des riboses sont modifiés de manière covalente au niveau des positions 2' -OH. De plus, il concerne une méthode pour produire des oligonucléotides et polynucléotides double brin à partir d'un brin d'acide nucléique de départ, à partir d'une pluralité de mononucléotides (UTP, dTTP et/ou dUTP, ATP et/ou dATP, GTP et/ou dGTP, et CTP et/ou dCTP) , en présence de polymérase et éventuellement d'amorces permettant la formation d'un brin d'acide nucléique complémentaire à l'acide nucléique de départ .
La demande de brevet WO-A-2004/013155 décrit la modification chimique de l'ARN dans un mélange de type fèces, sang, etc., afin de différencier l'ADN de l'ARN. C'est l'anhydride acétique qui est le réactif capable de faire cette différenciation. On hydrolyse ensuite la fonction ester afin de régénérer l'ARN biologiquement actif. Pour cela, cette demande propose de protéger l'utilisation de bases organiques « peu » agressives pour l'ARN (lysine, diamines etc.), en association avec un protocole de déprotection.
De l'ensemble de ces documents, on note que seule la fluorescence intrinsèque de l'anhydride isatoïque une fois ouvert est utilisée. De plus l'utilisation de cette molécule et de ses dérivés pour d'autres applications n'est pas décrite comme le propose la présente invention.
En ce qui concerne la fluorescence de l'anhydride isatoïque, il est peu intéressant de n'avoir que la fluorescence de l'anhydride isatoïque pour pouvoir détecter les AR s . Ainsi cette fluorescence est faible comparée à d' autres composés fluorescents et pas forcément compatible avec la longueur d'onde des lasers utilisés de façon courante dans les automates de détection. De plus, avec la fluorescence intrinsèque de l'anhydride isatoïque ouvert, les applications sont limitées à de la détection monoplex et non multiplex comme c'est de plus en plus le cas en biologie moléculaire. Par exemple, le marquage pour des applications dans le domaine des puces à ADN n'est pas possible avec ces brevets car l'utilisateur ne pourra pas différencier une détection d'un premier type d'acides nucléiques de celle d'un second type d'acides nucléiques, tous les deux marqués avec l'anhydride isatoïque .
Dans l'état de la technique, il y a globalement quatre utilisations différentes de l'anhydride isatoïque. Tout d'abord, il s'agit d'exploiter les propriétés de fluorescence intrinsèques d'esters de l'acide anthranylique pour étudier le mécanisme de certaines enzymes. Deuxièmement, l'utilisation des propriétés acylantes de l'anhydride isatoïque pour inhiber de manière régio-sélective la polymérisation des acides nucléiques, il ne s'agit donc que d'introduire un substituant volumineux en 2' dans des conditions les plus douces possibles et cela de façon plus ou moins ménagée. Troisièmement, l'état de la technique utilise l'anhydride isatoïque pour empêcher leur dégradation lors d'une étape d'extraction. Finalement et quatrièmement, il s'agit d'extraire sélectivement l'ARN acylé par rapport à l'ADN non acylé. Il y alors une idée de réversibilité de la fonction ester de manière à régénérer une fonction 2' OH libre et donc un ARN fonctionnel.
L'idée de conjuguer la molécule d'anhydride isatoïque à de la biotine ou à un Cy3 pour des applications dans le marquage des ARNm pour hybridation sur au moins deux spots différents ou sur puce à ADN n'est donc pas évidente car la conjugaison avec un groupement d' intérêt peut entraîner une modification des propriétés acylantes et même de la stabilité de l'anhydride isatoïque, propriétés qui sont difficilement prévisibles. En particulier, la conjugaison de l'anhydride isatoïque au groupement d' intérêt doit se faire par le biais d'atomes et de liaisons qui peuvent entraîner une très forte déstabilisation de la structure, une très grande difficulté dans la synthèse, une mauvaise solubilité dans l'eau, une perte des propriétés physico-chimiques du groupement d' intérêt par atténuation de la fluorescence, une très mauvaise réactivité vis-à-vis de l'ARN, une très grande instabilité des duplex formés entre l'ARN marqué et l'ADN (sondes de capture notamment par gène stérique trop importante ou par le fait que les hybrides ARN fonctionnalisés / ADN ne soient plus des substrats de polymérase) .
Les inventeurs ont par ailleurs compris l'intérêt de la fonctionnalisation d'ARNs par les composés d'anhydride isatoïque afin de permettre leur capture par des molécules de reconnaissance portées ou non par un support solide.
De plus, ils ont proposé une précédente invention, WO-A- 2012/076794, consistant à utiliser l'anhydride isatoïque non pas pour sa fluorescence intrinsèque mais pour sa capacité à se fixer spécifiquement sur l'ARN et à permettre la liaison avec un groupement d'intérêt, tel que défini plus loin.
Comme indiqué précédemment, une des techniques les plus répandues pour l'extraction des acides nucléiques est une technique d' adsorption sur de la silice en présence de sels chaotropiques (technologie dite BOOM) , qui malgré son efficacité et sa grande capacité à être automatisée présente l'inconvénient d'être générique et peu spécifique de l'ARN, sinon par l'utilisation de tampons d'élution de formulation complexe dont la composition reste empirique.
Brièvement, la technologie est basée sur l'affinité particulière qui se crée entre les acides nucléiques, la silice et des cations qui feraient le lien entre les groupements phosphates et les résidus silanols présents à la surface de la silice comme il est décrit dans « Sample Préparation Techniques in Analytical Chemistry. Vol 162 Edited by S. Mitra Wiley-Interscience 2003 ».
De nombreuses variantes de la technologie BOOM ont été protégées pour améliorer le rendement d'extraction, éviter la co-purification d'inhibiteurs de l'amplification.
On citera à ce sujet quelques brevets décrivant des améliorations de la chimie BOOM.
Le brevet EP-B-1.367.137 décrit l'amélioration de la technologie BOOM en utilisant des particules de silice magnétiques pour l'extraction des acides nucléiques, permettant une automatisation bien plus facile. Le brevet EP-B-1.476.550 présente une méthode de purification des acides nucléiques utilisant une phase solide modifiée avec des thioéthers et des éluants constitués de sels lyotropiques . Le brevet EP-B-1.266.385 propose des particules de silice ferromagnétiques ou ferrimagnétiques pour la purification des acides nucléiques.
Le brevet EP-B-1.762.618 expose une solution pour extraire des acides nucléiques du sang, constituée de 15 à 35% de guanidine et d'un détergent.
Le brevet EP-B-1.771.562 décrit une nouvelle méthode d'extraction des acides nucléiques basée sur la silice en présence d'adjuvants organiques.
Enfin, le brevet EP-B-1.589.105 propose l'extraction d' acides nucléiques à pH acide sur des particules magnétiques non recouvertes de silice.
Cependant si ces techniques, basées sur des interactions non covalentes entre des acides nucléiques et un support solide, sont à ce jour majoritairement utilisées dans les automates d'extraction des acides nucléiques utilisés, aucune ne permet de discriminer de façon spécifique l'ARN de l'ADN. Il y a donc un besoin à développer des techniques sélectives.
Il a été également proposé des techniques d'extraction un peu plus sélectives des acides nucléiques par interaction non covalente avec un support solide. Il y a peu de documents décrivant expressément l'extraction sélective et automatisée, à partir d'un mélange biologique complexe, soit uniquement de l'ARN soit uniquement de l'ADN. Toutefois, le brevet EP-B-1.448.799 présente la purification plus ou moins sélective d'acides nucléiques sur de la silice à pH alcalin et en présence de divers anions. La demande de brevet EP-A-1.510.577 tente de protéger l'utilisation d'un mélange de sels chaotropiques et d'additifs hydrophiles pour optimiser la séparation ADN par rapport à ARN. Le brevet EP-B-1.479.769 décrit et revendique une séparation sélective entre ARN et ADN. Celle-ci est basée sur des changements de température, de force ionique et de composition chimique de certaines solutions tamponnées. Le brevet EP-B-1.869.179 propose l'utilisation de ligands spécifiques de l'ARN ou de l'ADN pour l'extraction spécifique de l'ARN par rapport à l'ADN.
La demande de brevet US-A-2007/0148651 présente l'extraction spécifique de l'ARN, à partir d'un mélange d'ADN et d'ARN, par adsorption de l'ARN sur des particules de magnétite en présence d' anions phosphates.
La demande de brevet WO-A-2009/040444 décrit la précipitation sélective d'ADN génomique sur des particules de magnétite recouvertes de chitosane, à partir d'un mélange ADN/ARN. L'ARN étant ensuite récupéré dans le surnageant par précipitation à l'alcool. Enfin, on citera les brevets US-A-2005/0106576 et US-A-
2005/0106577 qui protègent : un fragment de liaison d'acide nucléique, dite NABP ou « nucleic acid binding portion », reliée à un support solide par le biais d'un linker clivable. La NABP est une molécule chargée ayant une affinité pour les acides nucléiques mais aucune sélectivité de l'ARN par rapport à l'ADN. De plus, la NABP est portée par un support solide avec tous les inconvénients que cela comporte comparativement à notre invention, tels que l'adsorption non spécifique, la gêne stérique, etc.
On notera que toutes ces techniques sont aussi basées sur une interaction non covalente entre les acides nucléiques (ARN ou ADN) et une phase solide, en présence de différents additifs, qui vont en moduler l'adsorption plus ou moins sélectivement. Les interactions mises en jeu lors de l'adsorption des acides nucléiques sont de nature faible (électrostatiques, ioniques, hydrophobes, liaisons hydrogène, etc..) en comparaison à un lien covalent.
On voit donc que malgré des tentatives d'amélioration aucune technique n'est réellement satisfaisante et ne permet une sélectivité absolue entre ARN et ADN. Il y a donc une réelle nécessité à proposer de nouvelles techniques innovantes.
Il a ensuite été proposé des techniques d'extraction sélective de l'ARN vis-à-vis de l'ADN. Les seules techniques pour extraire de l'ARN de façon relativement sélective avec un minimum de contamination par de l'ADN sont basées :
- sur des techniques chimiques comme l'extraction au phénol/chloroforme (Trizol®) , qui bien qu'étant efficaces, nécessitent l'utilisation de solvants organiques et présentent donc des inconvénients en termes de toxicité, d'automatisation difficile, etc.,
- sur des techniques enzymatiques avec l'ajout d'une ADNase ou d'une ARNase, avec toutefois l'inconvénient du coût et de la dénaturation nécessaire de ces enzymes après leur action, - sur des techniques physico-chimiques comme la centrifugation différentielle sur gradient de sels de Chlorure de Césium extrêmement complexes à automatiser et qui sont basées sur la densité relative des biomolécules,
- sur des techniques de capture spécifique utilisant des particules magnétiques recouvertes d' oligonucléotides poly-dT afin de reconnaître spécifiquement les séquences polyA des ARN messagers avec l'inconvénient que seuls les ARNm sont capturés sans que les ARN ribosomaux, les yRNA et autres « petits » ARN ne soient reconnus.
La demande de brevet correspondante, WO-A-2012/076794, est incorporée ici par référence. Dans cette demande, la Demanderesse apportait un début de solution à la problématique de séparation entre ARN et ADN à partir d'un milieu complexe. II était proposé de discriminer l'ARN de l'ADN sur la base de leur composition chimique. En effet la seule différence entre l'ARN et l'ADN réside dans la présence d'un groupement hydroxyle en 2' du ribose. L'objectif était donc de tirer parti de cette fonction pour y coupler spécifiquement une molécule de liaison (un dérivé d'anhydride isatoïque) munie d'un groupement d'intérêt permettant de réaliser un tri moléculaire entre les deux macromolécules, basé sur le reconnaissance spécifique du groupement d'intérêt. La molécule réactive de liaison devait pouvoir réagir en conditions douces (65°C, durée inférieure à 1 heure et en milieu aqueux) .
Par un choix approprié des groupements d' intérêt apportés sur l'ARN, comme par exemple certain groupements ayant une affinité particulière pour une phase solide, il est donc possible d'extraire l'ARN spécifiquement d'un milieu complexe. Après fonctionnalisation spécifique de l'ARN, ce dernier peut être immobilisé sur la phase solide alors que l'ADN purifié était élué (tout en pouvant être récupéré pour être amplifié spécifiquement) . L'ARN capturé et exempt d'ADN peut alors être séparé de son groupement d' intérêt directement sur la phase solide pour pouvoir à son tour être spécifiquement élué et amp1ifié . Cette méthode permet donc de trier et séparer l'ARN de l'ADN avec une très grande sélectivité, et consiste à :
1- Réaliser une liaison covalente entre l'ARN et une molécule de liaison (dérivé d'anhydride isatoïque) portant un groupement d'intérêt.
2- Trier l'acide nucléique ainsi fonctionnalisé, par l'intermédiaire du groupement d'intérêt, par rapport à celui qui ne l'a pas été.
3- Cliver la liaison entre l'ARN et le groupement d'intérêt afin de libérer un ARN biologiquement actif (anthranylate ou nu) et totalement exempt d'ADN. Cependant si la Demanderesse a démontré parfaitement la réalité du tri ARN versus ADN, notamment dans l'exemple 14, il y a toujours une volonté d'améliorer l'efficacité de ce protocole, essentiellement par la conception d'une nouvelle famille de molécules à base de composés aza-isatoïques plus à même de répondre à cette problématique .
Ainsi, la présente invention permet :
d'augmenter encore plus la réactivité de l'anhydride isatoïque pour :
· pouvoir fonctionnaliser à température ambiante, et non à 65°C, de manière à faciliter l'intégration de ce procédé dans un automate de diagnostic industrialisable,
• minimiser la consommation de réactif d'anhydride aza- isatoïque acylant dans la perspective d'une application industrielle de ce procédé (abaissement du coût en réactif) , • faciliter l'élimination de l'excès de réactif pour améliorer l'intégration de ce protocole dans une plateforme de diagnostic,
• augmenter encore plus l'enrichissement en ARN par rapport à l'ADN.
d'augmenter encore plus la solubilité en milieu aqueux toujours dans le but de faciliter l'élimination de l'excès de réactif et augmenter sa réactivité,
disposer, après réaction de la molécule de liaison et clivage du bras de liaison, d'un ARN « nu » et sans groupements aza-anthranylates (dans le but d'éviter toute inhibition qui proviendrait de l' aza-anthranylate) ,
appliquer le concept à d'autres utilisations, comme :
• conférer à l'ARN une résistance absolue aux nucléases par fonctionnalisation non ménagée de l'ARN,
• l'inhibition de l'amplification sélective de l'ARN dans un mélange ARN/ADN,
• le marquage d' acides ribonucléiques pour une application puce à ADN ou autres.
Dans le cadre de cette demande de brevet nous apportons une solution nouvelle au tri de l'ARN versus d'autres molécules par le biais d'une nouvelle molécule :
plus réactive et donc plus efficace car capable de pouvoir fonctionnaliser à température ambiante de l'ARN,
plus économique car nécessitant une plus faible concentration pour le même effet et par corollaire plus facile à éliminer,
plus soluble du fait que l'introduction d'un groupement pyridynyle augmente la solubilité en milieu aqueux, plus sélective et donc plus à même de résoudre le problème de l'extraction sélective, dotée éventuellement d'une fonctionnalité supplémentaire avec un bras méthyl disulfure substitué qui par clivage permet de régénérer un ARN nu qui évite tout problème d'inhibition d'amplification ultérieur,
applicable à d'autres utilisations.
Par définition, un groupement d' intérêt est une molécule qui :
· est une molécule réactive ou un groupement réactif capable de réagir avec une autre molécule réactive ou un autre groupement réactif dans certaines conditions (exemple d'un nucléophile et d'un électrophile, d'un alcyne avec un azide, d'un maléimide avec un thiol, d'un diène avec un alcène, etc.), et/ou
• possède une fluorescence qui lui est propre et qui est différente de celle de l'anhydride isatoïque ouvert (ester anthranilique) , et/ou
• est un ligand pouvant être reconnu par une molécule de reconnaissance ou une surface, ou une particule, etc., afin de former un complexe stable et éventuellement réversible, du type biotine/streptavidine, molécule hydrophobe ou hydrophile/support hydrophobe ou hydrophile, antigène/anticorps, saccharide ou polysaccharide/lectine, etc., et/ou
• est une molécule de marquage pour une réaction indirecte constituée par un couple ligand/récepteur du type :
biotine/streptavidine,
haptène/anticorps ,
- antigène/anticorps,
peptide/anticorps ,
saccharide ou poly-saccharide /lectine,
molécule électrophile/molécule nucléophile, polynucléotide/complémentaire du polynucléotide, ligand hydrophobe/phase solide hydrophobe, ou
ligand/métal de coordination.
Par molécule de liaison, il faut comprendre un anhydride aza-isatoïque ou ses dérivés. A noter que lorsque l'anhydride aza-isatoïque est ouvert après réaction avec un nucléophile, il porte alors le nom d' aza-anthranylate .
Par dérivés de l'anhydride aza-isatoïque, il faut comprendre tous composés organiques comportant une partie correspondant à l'anhydride aza-isatoïque et portant sur la partie aromatique ou sur la partie hétérocyclique de ce dernier au moins un radical, tel qu'un groupement chimique ou organique .
Par « fonctionnalisation d'au moins une molécule d'acide ribonucléique », l'on entend l'action de greffer un groupement d' intérêt - par liaison covalente ou non - sur ladite molécule d'acide ribonucléique. En fonction du type de groupement d'intérêt greffé (marqueur, précurseur de marquage, groupement permettant la capture par au moins un moyen de capture, la séparation ou l'inhibition de molécules biologiques etc.), le terme « fonctionnalisation » ou les termes apparentés (« fonctionnaliser » par exemple) désignent le marquage - direct ou indirect - de ladite molécule d' acide ribonucléique par une molécule détectable, l'addition d'un groupement sur ladite molécule d'acide ribonucléique permettant la capture, la séparation ou l'inhibition de cette dernière etc.
Par bras de liaison, on définit un bras espaceur de nature organique, tel qu'une simple liaison covalente, permettant de relier la molécule de liaison et le groupement d'intérêt. Il peut comporter une fonction susceptible d'être clivée par un moyen physico-chimique, photochimique, enzymatique, chimique, thermique, etc.
Par moyen ou molécule de reconnaissance ou de capture, on définit une molécule immobilisée ou non sur un support solide ayant une forte affinité pour le groupement d'intérêt.
La définition d'un ARN est un polymère naturel ou synthétique constitué d' au moins deux unités ribonucléotidiques successives modifiées ou non.
Le terme ADN est défini par un polymère naturel ou synthétique constitué d' au moins deux unités désoxyribonucléotidiques successives modifiées ou non.
Il est également possible d'utiliser des simples brins chimériques constitués d'au moins un segment d'ADN et au moins un segment d'ARN. Par inhibition, on entend l'incapacité de l'ARN excessivement fonctionnalisé par un dérivé de l'anhydride isatoïque à être amplifié par une technologie d'amplification de matériel génétique (NASBA, PCR, etc.) Par définition le mot sucre est un composé ribose ou désoxyribose .
Par échantillon liquide, il faut comprendre une solution aqueuse homogène ou hétérogène dans laquelle les acides nucléiques sont totalement solubles. La solution est dite hétérogène, par exemple lorsqu'elle contient un support solide ayant éventuellement des ARNs fixés sur sa surface. Le groupement pyridinyle est choisi en se basant sur le fait qu'outre la solubilité, sa capacité à attirer les électrons fait qu' il augmente la réactivité de la fonction carbonyle en la rendant plus apte à une attaque nucléophile des groupements hydroxyles de l'ARN.
Le choix par la Demanderesse de la position de substitution du noyau pyridinyle en position 6, 7 ou 8 peut également avoir un impact sur la stabilité de la molécule finale. Bien que pour l'homme du métier, il est techniquement plus aisé de substituer la position 6 dans le cas de la molécule BiotPEG4SS Pyr IA Me (14) , il peut également mettre en œuvre des solutions techniques pour substituer les positions 7 ou 8.
Dans le cas de l'introduction de deux bras de liaison, éventuellement liés à un groupement d'intérêt, la difficulté de synthèse est encore augmentée car un bras de liaison permettant l'auto-immolation de 1 ' anthranylate doit obligatoirement être incorporé en position 5 (cf. formule (2) infra et figure 2) . Il n'a jamais été décrit de molécules aza- isatoïques substituées deux fois avec des bras de liaison pour des applications de tri de biomolécules. La présente invention concerne un procédé de fonctionnalisation d'au moins une molécule d'acide ribonucléique (ARN) , contenu dans un échantillon liquide, qui comprend les étapes suivantes :
a) disposer d'au moins :
- une molécule de liaison constituée par un anhydride aza-isatoïque ou un de ses dérivés,
un groupement d'intérêt, et
un bras de liaison reliant la molécule de liaison avec le groupement d'intérêt, b) faire réagir la fonction anhydride de la molécule de liaison avec au moins un groupement hydroxyle porté : en position 2' du ribose d'un des nucléotides de l'ARN, et/ou
en position (s) 2' et/ou 3' du ribose du nucléotide à l'extrémité 3' terminal de l'ARN, et
c) obtenir un aza-anthranylate reliant, à l'aide du bras de liaison, l'ARN au groupement d'intérêt.
La présente invention concerne également un procédé de marquage d' au moins une molécule d' acide ribonucléique (ARN) , contenu dans un échantillon liquide, qui comprend les étapes suivantes :
a) disposer d'au moins :
une molécule de liaison constituée par un anhydride aza-isatoïque ou un de ses dérivés, ayant une fluorescence intrinsèque,
un groupement d'intérêt, ayant un signal de fluorescence intrinsèque, mais différent du signal émis par la molécule de liaison, ou n'ayant pas de signal de fluorescence intrinsèque, et
un bras de liaison reliant la molécule de liaison avec le groupement d'intérêt,
b) faire réagir la fonction anhydride de la molécule de liaison avec au moins un groupement hydroxyle porté :
en position 2' du ribose d'un des nucléotides de l'ARN, et/ou
en positions 2' et/ou 3' du ribose du nucléotide terminal en position 3' de l'ARN, et
obtenir un aza-anthranylate reliant, à l'aide du bras de liaison, l'ARN au groupement d'intérêt. La présente invention concerne aussi un procédé de capture ou de séparation d' au moins une molécule d' acide ribonucléique (ARN) qui comprend les étapes suivantes :
a) disposer d'au moins :
- une molécule de liaison constituée par un anhydride aza-isatoïque ou un de ses dérivés,
un groupement d' intérêt constitué par un ligand complémentaire d'un anti ligand, et
un bras de liaison reliant la molécule de liaison avec le groupement d'intérêt,
b) faire réagir la fonction anhydride de la molécule de liaison avec au moins un groupement hydroxyle porté :
en position 2' du ribose d'un des nucléotides de l'ARN, et/ou
- en positions 2' et/ou 3' du ribose du nucléotide terminal en position 3' de l'ARN, et
c) obtenir un aza-anthranylate, reliant à l'aide du bras de liaison, l'ARN au groupement d'intérêt,
d) capturer ou séparer l'ARN par l'intermédiaire d'une réaction entre un ligand et un anti-ligand.
Dans le cadre du procédé de capture ou de séparation, il peut y avoir une étape supplémentaire consistant à :
e) réserver ou éliminer les molécules d'ARN ainsi capturées ou séparées et utiliser le reste de l'échantillon enrichi en ADN.
Dans tous les cas de figure des procédés précédemment cités, et selon une première variante de réalisation, le bras de liaison est associé à la molécule de liaison avant que ledit bras de liaison soit associé au groupement d'intérêt.
Dans tous les cas de figure des procédés précédemment cités, et selon une seconde variante de réalisation, le bras de liaison est associé à la molécule de liaison après que ledit bras de liaison est associé au groupement d'intérêt.
Quelle que soit la variante de réalisation, la molécule de liaison est préalablement associée à l'ARN.
La présente invention concerne toujours un procédé de capture sélectif d'au moins une molécule d'ARN utilisant au moins une molécule de liaison, un groupement d'intérêt, constitué par un ligand complémentaire d'un anti-ligand, et un bras de liaison reliant la molécule de liaison avec le groupement d'intérêt, la molécule de liaison étant constituée par un anhydride aza-isatoïque ou un de ses dérivés, qui se fixe par liaison covalente au niveau d'un groupement hydroxyle porté :
en position 2' du ribose d'un des nucléotides de l'ARN, et/ou
en positions 2' et 3' du ribose du nucléotide terminal en position 3' de l'ARN, et/ou
- en position 3' du ribose dudit nucléotide terminal en position 3' de l'ARN.
La présente invention concerne enfin un procédé de séparation de molécules d'ARN par rapport à d'autres constituants biologiques, notamment des molécules d'ADN consistant à :
• appliquer le procédé de capture susvisé à un échantillon biologique contenant des acides nucléiques indifférenciés (ARN et ADN), les groupements d'intérêt étant associés à au moins un support solide facilement séparable du reste de l'échantillon biologique, et
• séparer les molécules de liaison portant les molécules d'ARN du reste de l'échantillon biologique. La présente invention propose également un réactif fonctionnalisation, de formule 1) :
Figure imgf000031_0001
dans lequel :
• R1 et R2 représentent, indépendamment l'un de l'autre, H ou un groupement d'intérêt, sachant qu'au moins un parmi les radicaux R1 et R2 est représenté par un groupement d'intérêt, et
· le groupement d' intérêt peut être :
a. un marqueur ou un précurseur de marquage, ou b. un ligand pouvant être reconnu par une molécule de reconnaissance ou une surface, ou une particule, etc., afin de former un complexe stable,
· X1 et X2 représentent chacun, indépendamment l'un de l'autre, un bras de liaison qui relie le groupement d' intérêt à la molécule de liaison,
• un seul des radicaux Z1, Z2, Z3 et Z4 est constitué par un atome d' azote (N) , les autres radicaux sont constitués par un atome de carbone (C) .
Plus précisément, l'invention propose un réactif de fonctionnalisation, de formule (2) :
Figure imgf000032_0001
dans lequel :
• R1, R2 et R3 représentent, indépendamment les uns des autres, H ou un groupement d'intérêt, sachant qu'au moins un parmi les radicaux R1, R2 et R3 est représenté par un groupement d' intérêt, et
• le groupement d' intérêt peut être :
a. un marqueur ou un précurseur de marquage, ou b . un ligand pouvant être reconnu par une molécule de reconnaissance ou une surface, ou une particule, etc., afin de former un complexe stable,
• X1, X2 et X3 représentent chacun, indépendamment l'un de l'autre, des bras de liaison qui relient le groupement d' intérêt à la molécule de liaison,
• un seul des radicaux Z1, Z2 et Z3 est constitué par un atome d' azote (N) , les autres radicaux sont constitués par un atome de carbone (C) .
L'ensemble constitué par les réactifs de fonctionnalisation de formule (1) et ceux de formule (2) peut également être représenté par la formule (I) suivante :
Figure imgf000033_0001
dans lequel :
· Y représente Z4 ou le groupement C-X3-R3,
• R1, R2 et R3 (lorsque Y = C-X3-R3) représentent, indépendamment les uns des autres, H ou un groupement d'intérêt, sachant qu'au moins un des radicaux R1, R2 et R3 (lorsque Y = C-X3-R3) représente un groupement d'intérêt, et
· le groupement d' intérêt est sélectionné parmi :
c. un marqueur ou un précurseur de marquage, ou d. un ligand pouvant être reconnu par une molécule de reconnaissance ou une surface, ou une particule, etc., afin de former un complexe stable,
· X1, X2 et X3 (lorsque Y = C-X3-R3) représentent chacun, indépendamment l'un de l'autre, des bras de liaison qui relient le groupement d' intérêt à la molécule de liaison,
• un seul des radicaux Z1, Z2, Z3 et Z4 (lorsque Y = Z4) est constitué par un atome d'azote (N) , les autres radicaux sont constitués par un atome de carbone (C) .
Quel que soit le réactif utilisé, si celui-ci est utilisé pour la capture ou la séparation, le moyen de capture ou de séparation est constitué par un support solide, tel que particules de polymère ou de silice, magnétiques ou non, ou un filtre ou bien par la paroi interne d'un récipient.
Quel que soit le réactif utilisé, si celui-ci est utilisé pour la fonctionnalisation, le bras de liaison X est un bras espaceur organique permettant de relier la molécule de liaison et le groupement d'intérêt, tel qu'une simple liaison covalente entre la molécule de liaison et le groupement d'intérêt ou un simple atome de carbone, éventuellement substitué, un enchaînement d'au moins deux atomes de carbone, contenant éventuellement des structures aromatiques et/ou des hétéro-atomes (oxygène, soufre, azote, etc.).
Selon cette dernière variante de réalisation du réactif de fonctionnalisation, le bras de liaison X comporte une fonction ou une liaison capable d'être clivée par un moyen physico¬ chimique, photochimique, thermique, enzymatique et/ou chimique permettant la séparation de la molécule de liaison par rapport à l'ARN dans des conditions de lumière, de température, enzymatiques ou chimiques particulières.
L' invention présente également une molécule biologique d'ARN fonctionnalisée susceptible d'être obtenue par l'un des procédés mentionnés plus haut.
L' invention se propose de couvrir aussi un kit de détection d'une molécule d'ARN cible comprenant un réactif, tel que décrit ci-dessus. Enfin, quel que soit le procédé, l'invention a trait à un procédé de fonctionnalisation, qui comprend l'étape supplémentaire suivante entre les étapes a) et b) consistant à hydrolyser le groupement monophosphate terminal en position 3' de chaque brin d'ARN à fonctionaliser .
Dans un mode de réalisation, un bras de liaison, lié ou non à un groupement d'intérêt, substitue le groupement pyridynyle. De plus, la fonction clivable est conçue et est positionnée de telle sorte qu'elle puisse former après clivage un hétérocycle cyclique de 5 à 8 chaînons avec la fonction carbonyle de l'ARN aza-anthranylate et libérer ainsi un ARN nu, possédant ses 2' -OH libres (2), utilisable dans tout mode d'amplification, détection ou protection de l'ARN et où il est nécessaire d'éviter absolument toute inhibition potentielle qui serait due à 1 ' aza-anthranylate .
Ce dernier mode de réalisation repose préférentiellement sur la formation d'une aza thio-lactone se formant spontanément lors du clivage de la fonction clivable disulfure (-SS-) du bras de liaison porté par la position 5. De tels systèmes auto-immolables n'ont jamais été décrits en série aza-isatoïque et dans le but de libérer un ARN. Ce dernier mode de réalisation permet en outre d'éviter la libération de sous produits lors de l'hydrolyse avec le DTT, la thiolactone restant sur le support. On peut également concevoir des systèmes similaires avec une fonction clivable du type -OR, -NR permettant, après élimination du groupement R, de libérer respectivement une fonction alcool ou aminé permettant une cyclisation avec la fonction carbonyle de 1 ' ARN-anthranylate pour libérer également un ARN « nu ».
L'invention sera mieux comprise à l'aide de la description détaillée qui est exposée ci-dessous au regard des figures annexées, à savoir :
La Figure 1 montre le principe du tri d'ARN utilisant un anhydride aza-isatoïque selon un premier mode de réalisation.
La Figure 2 présente le principe du tri d'ARN en présence d'un anhydride aza-isatoïque doté d'un groupement induisant la libération de la molécule d'ARN « nu » dans un second mode de réalisation, dit anhydride aza-isatoïque auto-immolable .
La Figure 3 décrit la synthèse d'un dérivé aza-isatoïque doté d'un groupement d'intérêt biotinylé. La Figure 4 présente un graphe sur l'étude de la stabilité en solution d'un composé aza-isatoïque comparée à celle d'un composé isatoïque.
La Figure 5 montre un graphe sur des tests de fonctionnalisation d'un ORN 27 mers avec des dérivés d'anhydride isatoïque et aza-isatoïque.
La Figure 6 propose de mettre en exergue la chémo- sélectivité de la série aza-isatoïque pour l'ARN par rapport à celle de 1 ' AD .
Dans les exemples décrits ci-après, les abréviations suivantes seront utilisées :
• ACN : Acétonitrile,
• AcOEt : acétate d'éthyle,
· B0C2O : dicarbonate de di- tert-butyle ,
• ADN : acide désoxyribonucléique,
• ARN : acide ribonucléique,
• Biot-peg4-COPFP : ester de l'acide 3- (2- (2- (3-biotine-dPEG3- propanamido) éthyl) disulfanyl) propanoïque et du pentafluoro phénol
• Biot-peg4-SS-azaIAMe : molécule \A_ de la présente demande (1- { 5- [ (3aS, 6aR) -2-oxo-hexahydro-lH-thiéno [3,4- d] imidazolidin-4-yl ] pentanamido }-N- (2- { [2- ( 3- { l-méthyl-2 , 4- dioxo-lfi, 2H, 4H-pyrido [2,3-d] [l,3]oxazin-6-yl}
propanamido) éthyl] disulfanyl } éthyl) -3, 6, 9, 12- tétraoxapentadécan-15-amide) ,
• Biot-peg4-SS-IAMe : anhydride 5- (3- (2- (2- (biotine-dPEG3- propanamido) éthyl) disulfanyl) ) propanamido) isatoïque, tel que décrit dans l'exemple 1-10 de la demande WO-A-2012/076794, · CCM : chromatographie sur couche mince,
• CDCI3 : Chloroforme deutéré,
• d : doublet,
• DCM : dichlorométhane,
• dd : doublet dédoublé, • DMF : diméthylformamide,
• DMSO : diméthylsulfoxide,
• DMSO-d6 : diméthylsulfoxide deutéré,
• Eau MilliQ : Eau ultrapure (Millipore, Molsheim, France) , · EDC : l-Ethyl-3- ( 3-diméthylaminopropyl ) carbodiimide,
• Eq : équivalents,
• EP : éther de pétrole,
• Et2<0 : éther diéthylique,
• HPLC : chromatographie liquide haute performance,
· HOBt : hydroxybenzotriazole,
• IA : anhydride isatoïque,
• IVT : transcrits in vitro
• m : multiplet,
• Me : méthyl,
· MeOH : méthanol,
• Nb exp : Nombre de répétition de l'expérience,
• nd : non déterminé,
• NHS : N-hydroxysuccinimide,
• NIS : N-iodosuccinimide,
· NMO : N-méthylmorpholine,
• NP1 : Nucléase PI,
• ODN : Oligo-désoxyribonucléotide,
• ORN : Oligo-ribonucléotide,
• PA : Phosphatase alcaline,
· PBS lx : Phosphate Buffered Saline = (0.01 M P04 ", 0.0027 M KC1, 0.137 M NaCl, pH=7.4 à 25°C ref SIGMA 4417, Saint Louis, USA) ,
• PFP : pentafluorophénol ,
• q : quadruplet,
· Rdt : rendement,
• Rf ou TR : temps de rétention,
• RMN : résonance magnétique nucléaire,
• rpm : tours par minute,
• s : singulet, • SS : lien disulfure,
• t : triplet,
• Ta or TA : Température ambiante,
• TEAAc : Triéthyl ammonium acétate,
• Tf : taux de fonctionnalisation,
• TFA : acide trifluoroacétique,
• THF : tétrahydrofurane,
• UV : ultraviolet.
Les conditions générales pour l'analyse et la synthèse des composés chimiques utilisées dans les exemples ci-après sont décrites ci-dessous:
Les analyses LC-MS ont été effectuées avec une chaîne HPLC WATERS Alliance 2795 équipée d'un détecteur à barrette de diodes PDA 996 (Waters) , d'un détecteur par spectrométrie de masse ZQ 2000 (Waters), d'un logiciel Empower version 2 et d'une colonne WATERS XTerra MS C18 (4,6 x 30 2,5 ym) utilisée avec un débit de 1 ml/minute à 30°C (détection à 260 nm ou en max plot) . Le spectromètre de masse ZQ 2000 possède une source d'ionisation Electrospray . Les ionisations ont été réalisées en mode positif avec une tension de cône de 20V et une tension au niveau du capillaire de 3,5kV.
Les conditions utilisées pour les analyses HPLC sont les suivantes (conditions 1) :
Figure imgf000038_0001
Tableau 1 : Conditions utilisées pour les analyses HPLC Les spectres RMN ont été enregistrés sur un spectromètre Jeol Lambda 400 MHz ou un spectromètre Bruker Avance 500 MHz. Les déplacements chimiques (δ) sont donnés en ppm par rapport au pic du solvant pris comme référence interne (CDCI3 : 7,26 ppm ; DMSO-d6 : 2,49 ppm) . Les spectres sont décrits avec les abréviations ci-dessus : s, d, t, q, qu et m. Les constantes de couplage (J) sont exprimées en hertz (Hz) .
Les chromatographies sur colonne ont été réalisées sur gel de silice Macherey-Nagel Kieselgel 60, 0,063-0,2 mm / 70-230 mesh ou Merck LiChroprep® RP-18 40-63 ym.
Les analyses par chromatographie sur couche mince ont été effectuées sur des plaques Macherey-Nagel POLYGRAM® SIL G/UV254, 0,20 mm ou ALUGRAM® RP-18 W/UV254 0,15 mm.
Exemple 1 : Synthèse d'un dérivé de l'anhydride aza-isatoïque conjugué à un groupement d'intérêt Introduction : Descriptif général de la synthèse des composés qui seront décrits dans l'exemple 1.
La conjugaison de l'anhydride aza-isatoïque ou de ses dérivés à un groupement d' intérêt suppose une réaction chimique entre l'anhydride aza-isatoïque, muni d'une fonction réactive, et la molécule d'intérêt, elle également étant munie d'une fonction réactive. A noter qu'il est particulièrement important de préserver l'intégrité de la partie anhydride aza-isatoïque durant ce couplage. L'homme du métier connaît une multitude de façon de conjuguer ainsi deux molécules entre elles afin d'obtenir une nouvelle molécule ayant des propriétés communes aux deux .
La stratégie choisie pour cette synthèse repose sur l'iodination en position 6 de l'acide chloro nicotinique, protégé sous forme d'ester terbutylique 2, pour obtenir le composé Cela permet ensuite l'introduction en position 6 d'un précurseur d'une fonction acide carboxylique (composé 5) , ladite fonction sera le point d' accroche pour l'introduction d'un bras de liaison et ensuite d'un groupement d'intérêt par le biais de couplages de type pseudo-peptidique. Dans une dernière étape, la formation de l'anhydride aza- isatoïque se fait par cyclisation intra moléculaire de l'amino ester tert-butylique 11 ou 12 en présence de phosgène, comme cela est bien représenté sur la Figure 3. Cette stratégie permet de travailler sur des précurseurs stables tout au long de la synthèse. L'anhydride aza-isatoïque, plus fragile, est synthétisé et purifié seulement à la fin. Dans le protocole permettant d'accéder directement à l'anhydride aza-isatoïque à partir de l'amino ester tert-butylique, généralement, la formation de l'anhydride était réalisée à partir de l'aza- anthranylate convenablement substitué. Enfin cette voie de synthèse est versatile et peut s'adapter à un très grand nombre de bras de liaison et de groupements d' intérêt ; le principal avantage résidant dans la possibilité d'utiliser un groupement d' intérêt ou un bras de liaison ou un de leurs précurseurs baso-labiles.
Exemple 1.1 : Synthèse du 2-Chloronicotinate de tert-butyle
Figure imgf000040_0001
2
Figure imgf000040_0002
M=213,66 g/mole Dans un ballon de 250 mL, 5 g d'acide 2-chloronicotinique (31,73 mmoles ; 1 éq) sont mis en solution dans 100 mL de THF anhydre. Un volume de 5,37 mL de chlorure d' oxalyle (63,47 mmoles ; 2 éq) , et cinq gouttes de DMF sont ajoutées successivement au milieu réactionnel à 0°C. Ce mélange est laissé sous agitation magnétique à température ambiante pendant 2 heures. Le milieu réactionnel est ensuite évaporé à sec et l'huile ainsi obtenue est alors dissoute dans 100 mL de THF anhydre. Une quantité de 4,27 g de tBuOK (38, 08 mmoles, 1,2 éq) est alors ajoutée à -10°C, et le milieu réactionnel est laissé sous agitation magnétique pendant 2h à température ambiante .
Le mélange réactionnel est évaporé à sec, repris dans 200 mL d'une solution aqueuse de K2CO3 à 5%, puis extrait avec du dichlorométhane (3x150 mL) . Les phases organiques sont alors rassemblées, séchées sur du sulfate de sodium anhydre, filtrées, et enfin évaporées. Le produit final est obtenu sous forme d'huile avec un rendement de 88% (5,97 g ; 27,94 mmoles) .
IR (KBr) : v 1732 (C=0) , 1579, 1403, 1370, 1315, 1288, 1173, 1144, 1065, 1056 cm"1.
RM ΧΗ (400MHz, CDCI3) : δ 1,62 (s, 9H) ; 7,31 (dd, 1H, 3J = 7,8 Hz, 3J = 4,4 Hz); 8,07 (dd, 1H, 3J = 7,8 Hz, 4J = 1,9 Hz); 7,31 (dd, 1H, 3J = 4, 4 Hz, 4J = 1, 9 Hz) .
RMN 13C (100 MHz, CDCI3) : δ 28,0 (3C) ; 83,3; 122,0; 128,8; 139,8; 149,4; 151,2; 163,9.
HRMS (ESI) théorique Ci0H12NO2Cl [M+H]+ 214, 0635; expérimentale 214,0638.
Exemple 1.2 : Synthèse du 2- (Méthylamino) nicotinate de tert- butyle :
Figure imgf000042_0001
3
C11H16 2O2
M=208,26 g/mole
Dans un tube scellé de 30 mL, 2,82 g de 2-chloronicotinate de tert-butyle 2 (13,20 mmoles ; 1 éq) sont mis en solution dans 4,6 mL de méthanol. Les 4,6 mL d'une solution aqueuse de méthylamine à 40% (53,26 mmoles ; 4 éq) sont ajoutés au milieu réactionnel à température ambiante. La réaction est laissée sous agitation magnétique à 100°C pendant 2 heures.
Le mélange réactionnel est évaporé à sec, repris dans 75 mL d'eau, puis extrait avec du dichlorométhane (3x75 mL) . Les phases organiques sont alors rassemblées, séchées sur du sulfate de sodium anhydre, filtrées, et enfin évaporées. L'huile obtenue est ensuite purifiée sur une colonne de gel de silice en utilisant un gradient d'éluant (EP puis EP/Et2<0 9,5:0,5) . Le produit final est obtenu sous forme d'huile avec un rendement de 85% (2,35 g ; 11,28 mmoles) .
IR (KBr) : v 3380 (NH) , 1684 (C=0) , 1595, 1583, 1520, 1392, 1305, 1262, 1250, 1172, 1126 cm"1.
RM ΧΗ (400 MHz, CDCI3) : δ 1,57 (s, 9H) ; 3,05 (d, 3H, 3J = 4,9 Hz); 6,49 (dd, 1H, 3J = 7,5 Hz, 3J = 4,4 Hz); 7,98 (si, 1H) ; 8,04 (dd, 1H, 3J = 7,5 Hz, 4J = 2,0 Hz); 8,28 (dd, 1H, 3J = 4,4 Hz, 4J = 2, 0 Hz) .
RMN 13C (100 MHz, CDCI3) : δ 27,8; 28,2 (3C) ; 81,2; 107,5; 110,4; 139,9; 153,0; 159,3; 167,1.
HRMS (IE) théorique ΟιιΗ16Ν202 [M]+ 208, 1212; expérimentale
208, 1213. Synthèse du 5-Iodo-2- (méthylamino) nicotinate de
Figure imgf000043_0001
4
CiiH15IN202
M=334,15 g/mole
Dans un ballon de 100 mL, 4,5 g de 2- (méthylamino) nicotinate de tert-butyle 3 (21,61 mmoles ; 1 éq) sont mis en solution dans 30 mL d'un mélange dichlorométhane / acide acétique (6:1) . 5,83 g de N-iodosuccinimide (25, 93 mmoles ; 1,2 éq) sont ajoutés au milieu réactionnel à température ambiante. La réaction est laissée sous agitation magnétique à température ambiante pendant 30 minutes.
Le mélange réactionnel est ensuite neutralisé avec 7 mL d'une solution aqueuse saturée de thiosulfate de sodium, repris dans 100 mL d'une solution aqueuse de K2CO3 à 5%, puis extrait avec du dichlorométhane (3x100 mL) . Les phases organiques sont alors rassemblées, séchées sur du sulfate de sodium anhydre, filtrées, et enfin évaporées. Le solide obtenu est ensuite purifié sur une colonne de gel de silice en utilisant un gradient d'éluant (EP puis EP/Et2<0 9:1) . Le produit final est obtenu sous forme de poudre jaune avec un rendement de 96% (6,92 g ; 20,71 mmoles) .
Pf: 101°C.
IR (KBr) : v 3371 (NH) , 1679 (C=0) , 1588, 1569, 1505, 1367, 1307, 1243, 1167, 1140, 1107, 796 cm"1. R ΧΗ (400 MHz, CDCI3) : δ 1,57 (s, 9Η) ; 3,01 (d, 3H, 3J = 4,9
Hz); 7,97 (si, 1H) ; 8,21 (d, 1H, 4J = 2,0 Hz); 8,40 (d, 1H, 4J = 2,0 Hz) .
RMN 13C (100 MHz , CDC13) : δ 27,8; 28,2 (3C); 73,1; 82,0; 109,8; 146,8; 157,9; 158,3; 166,0.
HRMS (IE) théorique ΟιιΗ15Ν202Ι [M]+ 334, 0179; expérimentale 334, 0167.
Exemple 1.4 : Synthèse du 5- [ (1E) -3-méthoxy-3-oxoprop-l-èn-l- lyl] -2- (méthylamino) nicotinate de tert-butyle :
Figure imgf000044_0001
5
C15H20 2O4
M=292,33 g/mole
Dans un ballon de 250 mL, 394 mg de triphénylphosphine (1,50 mmoles ; 0,1 éq) , 168 mg d'acétate de palladium (0,75 mmoles ; 0,05 éq) et 2,08 mL de triéthylamine (14,96 mmoles, 1 éq) sont mis en solution dans 50 mL de dioxane préalablement dégazé sous azote. Le mélange est laissé sous agitation magnétique à 100°C pendant 5 minutes. Les 5 g du dérivé iodé 4_ (14,96 mmoles ; 1 éq) et 6,74 mL d' acrylate de méthyle (74,82 mmoles ; 5 éq) sont alors ajoutés et la réaction est laissée sous agitation magnétique à 100°C pendant 4 heures.
Le mélange réactionnel est évaporé à sec, repris dans 50 mL de dichlorométhane puis filtré sur célite. Le volume de 200 mL d'eau est ajouté et le mélange est extrait avec du dichlorométhane (3x150 mL) . Les phases organiques sont alors rassemblées, séchées sur du sulfate de sodium anhydre, filtrées, et enfin évaporées. Le solide obtenu est ensuite purifié sur une colonne de gel de silice en utilisant un gradient d'éluant (EP à EP/Et2<0 7:3) . Le produit final est obtenu sous forme de poudre jaune avec un rendement de 76% (3,33 g ; 11,39 mmoles) .
Pf : 114 °C.
IR (KBr) : v 3373 (NH) , 1720 (C=0) , 1693 (C=0) , 1634, 1604, 1585, 1526, 1317, 1266, 1253, 1203, 1188, 1161, 1134 cm"1.
RM ΧΗ (400 MHz, CDC13) : δ 1,59 (s, 9H) ; 3,09 (d, 3H, 3J = 4,9
Hz); 3,80 (s, 3H) ; 6,27 (d, 1H, 3J = 15,8 Hz); 7,59 (d, 1H, 3J = 15,8 Hz); 8,22 (d, 1H, 4J = 2,4 Hz); 8,30 (si, 1H) ; 8,41 (d, 1H, 4J = 2, 4 Hz) .
RMN 13C (100 MHz, CDCI3) : δ 28,0; 28,2 (3C) ; 51,5; 82,1; 107,7; 113,7; 117,6; 138,2; 141,2; 153,9; 159,6; 166,5; 167,6.
HRMS (IE) théorique C15H20 2O4 [M]+ 292, 1423; expérimentale
292, 1413.
Exemple 1.5 : Synthèse du 5- (3-méthoxy-3-oxopropyl) -2- (méthylamino) nicotinate de tert-butyle :
Figure imgf000045_0001
6
C15H22 2O4
M=294,35 g/mole
Dans un ballon de 500 mL, 6 g du dérivé vinylique 5 (20,52 mmoles ; léq) sont mis en solution dans 250 mL d'acétate d'éthyle. 2,1 g de Pd/C sont ajoutés et la réaction est laissée sous agitation magnétique à température ambiante sous un flux d'hydrogène pendant 24 heures. Le mélange réactionnel est filtré sur Buchner puis sur célite, et enfin évaporé à sec. Le solide obtenu est ensuite purifié sur une colonne de gel de silice en utilisant un gradient d'éluant (EP à EP/Et2<0 7:3) . Le produit final est obtenu sous forme de poudre jaune avec un rendement de 81% (4,88 g ; 16,58 mmoles) .
Pf : 69°C.
IR (KBr) : v 3392 (NH) , 1736 (C=0) , 1690 (C=0) , 1574, 1520, 1371, 1227, 1194, 1173, 1156, 1127, 1090, 802 cm"1.
RM ΧΗ (400MHz, CDCI3) : δ 1,57 (s, 9H) ; 2,58 (t, 2H, 3J = 7,8 Hz); 2,82 (t, 2H, 3J = 7,8 Hz); 3,03 (d, 3H, 3J = 4,9Hz); 3,68 (s, 3H) ; 7,85 (si, 1H) ; 7,87 (s, 1H) ; 8,14 (s, 1H) .
RMN 13C (100 MHz, CDCI3) : δ 27,1; 27,9; 28,2 (3C) ; 35,8; 51,7; 81,4; 107,3; 122,0; 139,7; 152,7; 158,2; 167,0; 173,1.
HRMS (ESI) théorique C10H22 2O4 [M+H]+ 295, 1658; expérimentale 295, 1655.
Exemple 1.6 : Synthèse de l'Acide 3- {5- [ ( tert- butoxy) carbonyl] -6- (méthylamino) pyridin-3-yl}propanoïque
Figure imgf000046_0001
C14H20 2O4
M=280,32 g/mole
Dans un ballon de 250 mL, 4,87 g du dérivé (5 (16,54 mmoles ; léq) sont mis en solution dans 50 mL de tétrahydrofurane . Les 50 mL d'une solution aqueuse d'hydroxyde de lithium 1M (50 mmoles ; 3 éq) sont ajoutés et la réaction est laissée sous agitation magnétique à température ambiante pendant 45 minutes .
Le mélange réactionnel est évaporé afin d'éliminer le tétrahydrofurane . Le pH de la solution aqueuse obtenue est ajusté à 6 avec de l'acide acétique. Cette solution est ensuite extraite avec de l'acétate d' éthyle (4x50 mL) . Les phases organiques sont alors rassemblées, séchées sur du sulfate de sodium anhydre, filtrées, et enfin co-évaporées avec du toluène. Le produit final est obtenu sous forme de poudre jaune avec un rendement de 92% (4,25 g ; 15,16 mmoles) .
Pf: 106°C.
IR (KBr) : v 3374 (NH) , 1713 (C=0) , 1683 (C=0) , 1584, 1538,
1367, 1342, 1304, 1282, 1245, 1192, 1169, 1139, 1101, 801 cm"1. RM ΧΗ (400MHz, CDC13) : δ 1,57 (s, 9H) ; 2,62 (d, 2H, 3J = 7,8
Hz); 2,85 (t, 2H, 3J = 7,8 Hz); 3,02 (t, 3H, 3J = 4,9 Hz); 7,92
(d, 1H, V= 2,0 Hz); 7,95 (si, 1H) ; 8,20 (s, 1H) .
RMN 13C (100 MHz, CDCI3) : δ 27,0; 28,1; 28,2 (3C) ; 35,9; 81,6;
107,8; 122,2; 140,5; 152,6;157,9; 166,8; 177,0.
HRMS (ESI) théorique C14H20 2O4 [M+H]+ 281, 1501; expérimentale
281,1500.
Exemple 1.7 : Synthèse du N- {2- [ (2-Aminoéthyl) disulfanyl] éthyl}carbamate de tert-butyle :
Figure imgf000047_0001
8
C9H20N2O2S2
M=252,40 g/mole
Dans un ballon de 250 mL, 6 g de cystamine (26,64 mmoles ; 1 éq) sont mis en solution dans 50 mL de méthanol. Une solution de 5,814 g de Boc20 (26, 64 mmoles ; 1 éq) et 11,14 mL de TEA (79,12 mmoles ; 3 éq) dans 40 mL de méthanol, est alors ajoutée goutte à goutte à la solution de cystamine pendant 45 minutes, sous agitation magnétique à température ambiante.
Le milieu réactionnel est ensuite évaporé à sec jusqu'à l'obtention d'un solide blanc. Le solide obtenu est repris dans 70 mL d'une solution de Na¾P04 1M. Le mélange est ensuite extrait avec de l'éther diéthylique (3 x 90 mL) . La phase aqueuse est alcalanisée à pH 9 à l'aide d'une solution de NaOH 1M. Le mélange est alors extrait avec de l'acétate d' éthyle (6 x 50 mL) . Les phases organiques sont rassemblées, séchées sur MgS04 puis évaporées sous vide.
Le produit est obtenu sous forme d'huile avec un rendement de 42% (2,82 g ; 11,19 mmoles).
IR (KBr) : v 3356 (NH) , 2976, 2930, 1694 (CO) , 1517, 1392, 1366, 1275, 1253, 1170 cm"1.
RM ΧΗ (400 MHz, CDCI3) : δ 1,45 (s, 9H) ; 1,75 (s, 2H) ; 2,78 (m, 4H) ; 3,03 (m, 2H, J=5Hz); 3,46 (m, 2H) ; 5,01 (s, 1H) .
RMN 13C (100 MHz, CDCI3) : δ 38,1; 39,2; 40,1; 41,3; 79,4; 155,7.
Exemple 1.8 : Synthèse du 5- [2- ( {2- [ (2- { [ ( tert-Butoxy) carbonyl] amino}éthyl) disulfanyl] éthyl}carbamoyl) éthyl] -2- (méthylamino) nicotinate de tert-butyle :
Figure imgf000048_0001
9
C23H38 4O5S2
M=514,7 g/mole Dans un ballon de 250 mL, 3 g du dérivé acide 1_ (10,70 mmoles ; 1 éq) ; 3,08 g d'EDC (16,06 mmoles ; 1,5 éq) et 2,17 g d' HOBt (16,06 mmoles ; 1,5 éq) sont mis en solution dans 50 mL de dichlorométhane . Après 10 minutes à température ambiante, 2,97 g du dérivé aminé 8 sont alors ajoutés, et la réaction est laissée sous agitation à température ambiante pendant 2 heures.
Le mélange réactionnel est évaporé à sec, repris dans 75 mL d'une solution aqueuse saturée en bicarbonate de sodium puis extrait avec de l'acétate d' éthyle (4x75 mL) . Les phases organiques sont alors rassemblées, séchées sur du sulfate de sodium anhydre et filtrées. Le solide obtenu est ensuite purifié sur une colonne de gel de silice en utilisant un gradient d'éluant (DCM/AcOEt 8/2 à DCM/AcOEt 2/8). Le produit final est obtenu sous forme de poudre blanche avec un rendement de 94% (5,2 g ; 10,10 mmoles) .
Pf : 106°C.
IR (KBr) : v 3385 (NH) , 3338 (NH) , 3275 (NH) , 1682 (C=0) , 1654 (C=0) , 1569, 1547, 1538, 1511, 1389, 1366, 1303, 1289, 1253, 1229, 1165, 1126 cm"1.
RM ΧΗ (400MHz, CDCI3) : δ 1,43 (s, 9H) ; 1,57 (s, 9H) ; 2,47 (t, 2H, 3J = 7,5 Hz); 2,74 (t, 2H, 3J = 6,8 Hz); 2,83 (m, 4H) ; 3,03 (d, 3H, 3J = 4,9Hz); 3,42 (q, 2H, 3J = 6,4 Hz); 3,55 (q, 2H, 3J = 5,8 Hz); 5,03 (si, 1H) ; 6,51 (si, 1H) ; 7,84 (si, 1H) ; 7,87 (d, 1H, 4J = 1, 3 Hz) ; 8,14 (d, 1H, 4J = 1, 3 Hz) .
RMN 13C (100 MHz, CDCI3) : δ 27,9 (2C) ; 28,2 (3C) ; 28,3 (3C) ; 37,4; 38,0; 38,3; 38,5; 39,5; 79,7; 81,3; 107,2; 122,4; 139,8; 152,8; 155,9; 158,2; 167,0; 172,2.
HRMS (ESI) théorique C23H38 4O5 S 2 [M+H]+ 515, 2362; expérimentale 515, 2342. Exemple 1.9 : Synthèse du 5-[2-({2-[(2-
Aminoéthyl) disulfanyl] éthyl}carbamoyl) éthyl] -2 (méthylamino) nicotinate de tert-butyle
Figure imgf000050_0001
10
C18H30N4O3S2
M=414,59 g/mole
Dans un ballon de 100 mL sous azote, 2 g du dérivé 9_ (3,89 mmoles ; 1 éq) sont mis en solution dans 15 mL de dichlorométhane . 5 mL d'acide trifluoroacétique (65,29 ; 16,8 éq) sont ajoutés, et la réaction est laissée sous agitation magnétique à température ambiante pendant 30 minutes.
Le mélange réactionnel est évaporé à sec, repris dans 50 mL d'une solution aqueuse saturée en bicarbonate de sodium, puis extrait avec de l'acétate d' éthyle (4x50 mL) . Les phases organiques sont alors rassemblées, lavées avec de l'eau (2x50 mL) , séchées sur du sulfate de sodium anhydre et filtrées. Le produit final est obtenu sous forme d'huile avec un rendement quantitatif (1,6 g ; 3,86 mmoles).
IR (KBr) : v 3378 (NH) , 2977, 2931, 1682 (CO) , 1612, 1578, 1520, 1368, 1304, 1228, 1160, 1131, 1095, 910, 732 cm"1.
RM ΧΗ (400MHz, CDCI3) : δ 1,58 (s, 9H) ; 1,64 (si, 2H) ; 2,42 (t, 2H, 3J = 7,6 Hz); 2,76 (t, 4H, 3J = 6,1 Hz); 2,84 (t, 4H, 3J = 7,6 Hz); 3,03 (d, 3H, 3J = 4,9 Hz); 3,03 (m, 2H) ; 3,58 (q, 2H, 3J = 6,1 Hz); 6,00 (si, 1H) ; 7,84 (si, 1H) ; 7,87 (d, 1H, 4J = 2, 4 Hz) ; 8,14 (d, 1H, 4J = 2, 4 Hz) .
RMN 13C (100 MHz, CDCI3) : δ 27,7; 27,8; 28,1 (3C) ; 37,4; 37,9; 38,3; 40,3; 41,9; 81,3; 107,1; 122,2; 139,7; 152,5; 158,0; 166,8; 171,9.
HRMS (ESI) théorique C18H30 4O3 S 2 [M+H]+ 415, 1838; expérimentale 415, 1821.
Exemple 1.10 : Synthèse du 5- [2- ( {2- [ (2- {5- [ (3aS , 6aR) -2-oxo- Hexahydro-lH-thieno [3 , 4-d] imidazolidin-4-yl] entanamido}éthyl) disulfanyl] éthyl}carbamoyl) éthyl] -2- (méthylamino) nicotinate de tert-butyle :
Figure imgf000051_0001
11
C28H44 6O5S3
M=640,88 g/mole
Dans un ballon de 100 mL, 500 mg du dérivé amino 10 (1,21 mmoles, 1 éq) sont mis en solution dans 20 mL de diméthylformamide anhydre. 412 mg de Biot-CONHS (15, 1,21 mmoles ; 1 éq) et 168 yL de triéthylamine (1,21 mmoles ; 1 éq) sont ajoutés, et la réaction est laissée sous agitation magnétique à température ambiante pendant 1 heure.
Le mélange réactionnel est évaporé à sec et directement purifié sur une colonne de gel de silice greffée C18, en utilisant un gradient d'éluant (¾0 à ¾0/ACN 3/7) . Le produit final est obtenu sous forme de poudre blanche avec un rendement de 70% (545 mg ; 0,85 mmoles) .
Pf: 108°C. IR (KBr) : v 3297 (NH) , 3074, 2928, 2853, 1704 (CO) , 1683 (CO) , 1642 (CO) , 1613, 1578, 1520, 1226, 1159, 1094, 803, 727, 597 cm-1.
R ΧΗ (500 MHz, DMSO-d6) : δ 1,42 (m, 2H) ; 1,57 (s, 9H) ; 1,60- 1,73 (m, 4H) ; 2,23 (td, 2H, 4J = 2,9 Hz, 3J = 7,2 Hz,); 2,47
(t, 2H, 3J = 7,5 Hz); 2,71 (d, 1H, 2J = 12,8 Hz); 2,78-2,88 (m,
6H) ; 2,89 (dd, 1H, 3J = 4,9 Hz, 2J = 12,8 Hz); 3,01 (d, 3H, 3J
= 4,9 Hz); 3,10-3,15 (m, 1H) ; 3, 50-3, 54 (m, 4H) ; 4,30 (dd, 1H,
3J = 4,5 Hz, 3J = 7,5 Hz); 4,50 (dd, 1H, 3J = 4,9 Hz, 3J = 7,5 Hz); 5,71 (si, 1H) ; 6,58 (si, 1H) ; 6,85 (t, 1H, 3J = 5,8 Hz);
7,09 (t, 1H, 3J = 5,8 Hz); 7,83 (q, 1H, 3J = 4,9 Hz); 7,88 (d,
, 1H J = 2,4 Hz); 8,14 (d, 1H, 4J = 2,4 Hz).
RMN 13C (125 MHz, DMSO-d6) : δ 25,6; 27,9; 27,9; 28,0; 28,1;
28,3 (3C); 35,7; 37,6; 38,0; 38,2; 38,4; 38,5; 40,6; 55,7;
60,2; 61,7; 81,5; 107,4; 122,6; 140,0; 152,6; 158,2; 164,1;
167,0 ; 172,6; 173,8.
HRMS (ESI) théorique C28H44 6O5 S 3 [M+H]+ 641, 2614; expérimentale 641, 2626.
Exemple 1.11 : Synthèse du 5- [ (3aS , 6aR) -2-oxo-Hexahydro-lH- thiéno[3,4-d] imidazolidin-4-yl] -N- (2-{ [2- (3- { l-méthyl-2 , 4- dLoxo-lH,2H, 4H-pyrido [2 , 3-d] [1,3] oxazin-6-yl}propanamido) éthyl] disulfanyl}éthyl) entanamide :
Figure imgf000052_0001
12
C25H34 6O6S3
M=610,77 g/mole Dans un tube scellé de 30 mL, 500 mg du dérivé 11 (0,78 mmoles ; léq) sont mis en solution dans 20 mL d' éther diéthylique. 1,23 mL d'une solution de phosgène à 20% dans le toluène (2,34 mmoles ; léq) et 325 yL de triéthylamine (2,34 mmoles ; 3éq) sont ajoutés, et la réaction est laissée sous agitation magnétique à température ambiante pendant 30 minutes .
Le mélange réactionnel est évaporé à sec et directement purifié sur une colonne de gel de silice greffée C18, en utilisant un gradient d'éluant (¾0 à ¾0/ACN 4/6) . Le produit final est obtenu sous forme de poudre blanche avec un rendement de 42% (200 mg ; 0,33 mmoles) . Pf : 125°C.
IR (KBr) : v 3299 (NH) , 2927, 1785 (CO) , 1735 (CO) , 1704 (CO) , 1641 (CO) , 1612, 1488, 1326, 1232, 1179, 1069, 1045, 979, 787, 745, 674 cm"1.
RMN ΧΗ (500 MHz, DMSO-d6) : δ 1, 24-1, 34 (m, 2H) ; 1,41-1,59 (m, 4H) ; 2,05 (t, 3J = 7,4 Hz, 2H) ; 2,44 (t, 2H, 3J = 7,4 Hz); 2.56
(d, 1H, 2J = 12,4 Hz); 2,68-2,73 (m, 4H) ; 2,80 (dd, 1H, 3J =
5,0 Hz, 2J = 12,4 Hz); 2,90 (t, 2H, 3J = 7,4 Hz); 3,26-3,29 (m,
4H) ; 3,47 (s, 3H) ; 4,11 (m, 1H) ; 4,28 (m, 1H) ; 6,35 (si, 1H) ;
6,41 (si, 1H) ; 7,97 (t, 1H, 3J = 5,5 Hz); 8,06 (t, 1H, 3J = 5,5 Hz); 8,21 (d, 1H, 4J = 2,2 Hz); 8,62 (d, 1H, 4J = 2,2 Hz).
RMN 13C (125 MHz, DMSO-d6) : δ 25,2; 26,9; 27,9; 28,1; 29,9;
35,1; 36,0; 37,2 (2C) ; 37,8; 37,8; 39,8; 55,4; 59,2; 61,0;
107,2; 132,7; 137,8; 147,7; 150,9; 155,4; 158,4; 162,7; 170,9;
172,2.
HRMS (ESI) théorique C25H34 6O6 S 3 [M+H]+ 611, 1780; expérimentale 611, 1777. Exemple 1.12 : Synthèse du 5- {2- [ (2- { [2- (1- {5- [ (3aS , 6aR) oxo-Hexahydro-lH-thiéno [3 , 4-d] imidazolidin-4-yl] entanamido} 3,6,9, 12-tétraoxapentadécan-15-amido) éthyl] disulfanyl}éthyl) carbamoyl] ethyl} -2- (méthylamino) nicotinate de tert-butyle :
Figure imgf000054_0001
M =888, 17 g/mole
Dans un ballon de 100 mL, 400 mg du dérivé amino 10 (0,965 mmoles ; léq) sont mis en solution dans 15 mL de dichlorométhane . 635 mg de Biot-peg4-COPFP (0,965 mmoles ; léq, QuantaBioDesign, Powell, USA) et 134 yL de triéthylamine (0,965 mmoles ; léq) sont ajoutés, et la réaction est laissée sous agitation magnétique à température ambiante pendant 45 minutes .
Le mélange réactionnel est évaporé à sec et directement purifié sur une colonne de gel de silice greffée C18, en utilisant un gradient d'éluant (¾0 à ¾0/ACN 4/6) . Le produit final est obtenu sous forme de poudre blanche avec un rendement de 85% (730 mg ; 0,822 mmoles) . IR (KBr) : v 3400 (NH) , 2925, 1681 (CO) , 1644 (CO) , 1579, 1525, 1157, 1124, 804, 618 cm"1.
RM ΧΗ (500 MHz, DMSO-d6) : δ 1, 40-1, 46 (m, 2H) ; 1,57 (s, 9H) ; 1,61-1,78 (m, 4H) ; 2,22 (t, 2H, 3J = 7,1 Hz); 2,46-2,49 (m, 4H) ; 2,73 (d, 1H, 2J = 12,7 Hz); 2,77-2,83 (m, 6H) ; 2,90 (dd, 3J = 5,0 Hz, 1H, 2J = 12,7 Hz); 3,02 (d, 3H, 3J = 4,9 Hz); 3,13 (m, 1H) ; 3, 39-3, 44 (m, 2H) ; 3, 52-3, 55 (m, 6H) ; 3, 62-3, 63 (m, 12H) ; 3,72 (t, 2H, JJ = 5,9 Hz); 4,31 (m, 1H) ; 4,50 (m, 1H) ; 5,41 (si, 1H) ; 6,33 (si, 1H) ; 6,85 (t, 1H, 3J = 5,5 Hz); 6,95 (t, 1H, 3J = 5,6 Hz); 7,28 (t, 1H, 3J = 5,8 Hz); 7,82 (q, 1H, 3J = 4,9 Hz); 7,88 (d, 1H, 4J = 2,5 Hz); 8,14 (d, 1H, 4J = 2,5 Hz) .
R 13C (125 MHz, DMSO-d6) : δ 24,6; 26,9; 26,9; 27,1; 27,1;
27,3 (3C); 34,8; 35,8; 36,2; 37,2; 37,3; 37,4; 37,5; 38,2;
39,5; 54,5; 59,1; 60,8; 66,2; 68,9; 69,0; 69,2; 69,3; 69,5 (3C); 80,4; 106,3; 121,7; 138,9; 151,8; 157,2; 162,7; 166,1; 171,0; 171,5; 172,3.
HRMS (ESI) théorique C39H65 7O10 S 3 [M+H]+ 888, 4033; expérimentale 888, 4020.
Exemple 1.13 : Synthèse du 1- {5- [ (3aS , 6aR) -2-oxo-hexahydro-lH- thiéno [3 , 4-d] imidazolidin-4-yl] entanamido} -N- (2-{ [2- (3- { 1- méthyl-2 , 4-dioxo-lH,2H, 4ff-pyrido [2 , 3-d] [1,3] oxazin-6-yl} propanamido) éthyl] disulfanyl}éthyl) -3,6,9, 12- tétraoxapentadécan-15-amide :
Figure imgf000055_0001
14
C36H55 7OnS3
M=858,06 g/mole
Dans un tube scellé de 30 mL, 200 mg du dérivé 13 (225 ymoles ; 1 éq) préalablement adsorbé sur 500 mg de silice greffée C18, sont mis en solution dans 20 mL d' éther diéthylique. 355 yL d'une solution de phosgène à 20% dans le toluène (675 ymoles ; 1 éq) et 94 yL de triéthylamine (675 ymoles ; 3 éq) sont ajoutés, et la réaction est laissée sous agitation magnétique à température ambiante pendant 30 minutes . Le mélange réactionnel est évaporé à sec et directement purifié sur une colonne de gel de silice greffée C18, en utilisant un gradient d'éluant (¾0 à ¾0/ACN 4/6) . Le produit final est obtenu sous forme de poudre blanche avec un rendement de 26% (50 mg ; 58,2 ymoles) .
IR (KBr) : v, 3426 (NH) , 2926, 2875, 1782 (CO) , 1729 (CO) , 1641 (CO) , 1550, 1490, 1369, 1330, 1093, 788, 746, 677 cm"1.
RMN ΧΗ (500 MHz, DMSO-d6) : δ 1,41-1,47 (m, 2H) ; 1, 58-1, 78 (m, 4H) ; 2,23 (t, 2H, 3J = 7,4 Hz); 2,49 (t, 2H, 3J = 5,7 Hz); 2,64 (t, 2H, 3J = 7,2 Hz); 2,75 (m, 3H) ; 2,78 (t, 2H, 3J = 5,9 Hz); 2,91 (dd, 1H, 3J = 4,9 Hz, 2J = 12,5 Hz); 3,05 (t, 2H, 3J = 7,2 Hz); 3,15 (m, 1H) ; 3, 39-3, 45 (m, 2H) ; 3,46-3,51 (m, 4H) ; 3,56 (t, 2H, 3J = 5,0 Hz); 3, 63-3, 64 (m, 12H) ; 3,66 (s, 3H) ; 3,74 (t, 2H, 3J = 5,7 Hz); 4,33 (m, 1H) ; 4,52 (m, 1H) ; 5,51 (si, 1H) ; 6,37 (si, 1H) ; 6,90 (t, 1H, 3J = 5,4 Hz); 7,38 (t, 1H, 3J = 5,7 Hz); 7,49 (t, 1H, 3J = 5,7 Hz); 8,29 (d, 1H, 4J = 2,2 Hz); 8,60 (d, 1H, 4J = 2,2 Hz).
RMN 13C (125 MHz, DMSO-d6) : δ 24,6; 26,7; 27,0; 27,1; 29,4;
34,8; 35,6; 35,7; 35,8; 37,1; 37,6; 37,7; 38,2; 39,5; 54,5; 59, 2; 60,8; 64,8; 66,2; 68,9; 69,0; 69,1; 69,2; 69,4 (2C) ;
105,8; 132,3; 137,7; 146,8; 150,1; 155,5; 157,1; 162,8; 170,8; 171,2; 172,4.
HRMS (ESI) théorique C35H56 7O11 S 3 [M+H]+ 858, 3200; expérimentale 858, 3185.
Exemple 1.14 : Synthèse de Biot-CONHS :
Figure imgf000057_0001
15
C14H19N3O5S
M=341,38 g/mole
Dans un ballon de 100 mL, 2,5 g de D-Biotine (10,23 mmoles ; léq) et 1,18 g de N-hydroxysuccinimide (10,23 mmoles ; 1 éq) sont mis en solution dans 40 mL de diméthylformamide anhydre. La réaction est laissée sous agitation magnétique à 70°C jusqu'à solubilisation complète des réactifs. 2,55 g d'EDC (13,30 mmoles ; 1,3 éq) sont ensuite ajoutés, et le milieu réactionnel est laissé sous agitation à température ambiante pendant 12h. Le mélange est évaporé à sec puis repris dans 30 mL de méthanol. Le précipité obtenu est alors filtré sur fritté, puis lavé avec du MeOH (3x30 mL) et de l'éther diéthylique (3x90 mL) . Le produit est obtenu sous forme de poudre blanche avec un rendement de 70% (2,46 g ; 7,21 mmoles) .
Pf : 210°C.
IR (KBr) : v 3234; 1820; 1789; 1747 (CO) ; 1730 (CO) ; 1705 (CO) ; 1216; 1072 cm"1.
RM ΧΗ (400 MHz, DMSO-d6) : δ 1, 39-1, 67 (m, 6H) ; 2,57 (m, 1H) ;
2,66 (t, 2H, 3J=7,3Hz); 2,68 (s, 4H) ; 2,84 (m, 1H) ; 3,09 (m,
1H) ; 4,14 (m, 1H) ; 4,29 (m, 1H) ; 6,37 (s, 1H) ; 6,43 (s, 1H) .
RMN 13C (100 MHz, DMSO-d6) : δ 24,3; 25,5 (2C) ; 27,6; 27,9; 30,0; 39, 9; 55,3; 59,1; 61,0; 162,8; 169,0; 174,4 (2C) . Résultats et conclusion : On démontre dans cet exemple que la synthèse d'un dérivé aza-isatoïque doté d'un groupement
d'intérêt est réalisable.
Exemple 2 : Démonstration de la stabilité en solution d'un composé aza-isatoïque doté d'un groupement d'intérêt :
Objectif : Plusieurs tests destinés à vérifier et démontrer la stabilité chimique du dérivé aza-isatoïque 14_ par rapport au composé de référence Biot-peg4-SS-IAMe tel que décrit dans la demande FR 1060102, ont été effectués. Ces tests comparatifs ont été réalisés en solution dans le DMSO à température ambiante et à 4°C.
Mode opératoire : Pour chaque dérivé isatoïque, deux solutions à 120 mM dans le DMSO ont été préparées et stockées respectivement, à température ambiante et à +4°C pendant deux semaines. Pour chacune des solutions, trois analyses LC-MS (condition 1) ont été effectuées à t = 0, t = 4 jours et t = 7 jours. Pour chaque analyse, la pureté du composé est déterminée en UV PDA Max Plot, par intégration du pic correspondant au dérivé isatoïque ainsi que les éventuels pics correspondants aux produits de dégradation. La Figure 4 présente les résultats obtenus.
Résultats et conclusion : Les résultats obtenus montrent que les deux dérivés isatoïques ne se dégradent pas dans le temps. Aucun produit de dégradation n'a été mis en évidence au cours de ces expériences. Ils sont donc stables en solution dans le DMSO, non seulement à 4°C mais aussi à température ambiante, pendant au moins 7 jours. Nous avons ainsi démontré le maintien de la stabilité chimique en série aza-isatoïque. L'homme du métier aurait pu penser que la molécule aza- isatoïque en étant plus réactive serait donc moins stable. Or de façon surprenante, l'exemple 2 démontre qu'il n'en est rien, bien au contraire la molécule reste parfaitement stable dans le temps à température ambiante tout en étant plus réactive (voir également l'exemple 3 qui traite du marquage) .
Exemple 3 : Démonstration de la réactivité à température ambiante d'un composé aza-isatoïque , vis-à-vis d'un oligoribonucléotide (ORN) modèle de 27 bases - Mesure du taux de fonctionnalisation : Objectif : Afin de démontrer l'augmentation de la réactivité en série aza-isatoïque des tests comparatifs de fonctionnalisation d' ORN 27 mers à température ambiante et à 65°C ont été menés pour le dérivé isatoïque de référence, Biot-peg4-SS-IAMe et pour le dérivé aza-isatoïque, Biot-peg4- SS-azaIAMe (14) .
Une comparaison de la réactivité du dérivé anhydride aza- isatoïque 14_ par rapport au dérivé isatoïque de référence, Biot-peg4-SS-IAMe tel que décrit dans WO-A-2012/076794, vis-à- vis d'un ORN modèle de 27 bases (seq : 5 ' -AAC-CGC-AGU-GAC-ACC- CUC-AUC-AUU-ACA-3' , Eurogentec, Liège Science Park, Belgique) est effectuée. Pour cela une quantité fixe d' ORN est mise en réaction avec un dérivé anhydride isatoïque conjugué à une molécule d'intérêt, à 65°C et à température ambiante. Un suivi de la réaction par HPLC à 260 nm est réalisé comme cela a été décrit auparavant dans la demande de brevet WO-A-2012/076794 dans l'exemple 3. Cette analyse permet de détecter la disparition du pic correspondant à l'ORN initial et l'apparition de pics correspondants à l'ORN acylé. Ces produits possèdent un temps de rétention supérieur, et un spectre d'absorption correspondant à la fois à celui de l'ORN, et à celui du réactif de fonctionnalisation .
Pour évaluer précisément le taux de fonctionnalisation (Tf) , la population d' ORN (marquée et non marquée) est séparée de l'excès de marqueur par précipitation à l' acétone/perchlorate de lithium. Puis, les ORN ainsi obtenus sont soumis à une hydrolyse à la nucléase PI (Aldrich, Saint Louis, USA) et à la phosphatase alcaline (Aldrich, Saint Louis, USA) afin d' hydrolyser les liaisons phosphate diester de l'ORN.
Une analyse LC-MS de ce mélange permet alors de caractériser et d' identifier plusieurs populations : les ribonucleosides non marqués
les adduits mono-nucléosidiques marqués qui se différencient très nettement par un temps de rétention plus élevé, et par un spectre UV caractéristique des acides nucléiques et du réactif de fonctionnalisation . des dinucléotides acylés en 2' qui en raison du groupement antranylate substitué par le groupement d'intérêt en 2', ne peuvent être clivés par la nucléase
PI .
des trinucléotides ou quadrinucléotides 2' OH per-acylés qui peuvent théoriquement se former mais qui sont statistiquement très peu représentés (car il faudrait alors qu'il y ait deux ou trois acylations du 2' OH consécutives), ne sont pas recherchés.
A noter que le dérivé 5'-0-acylé n'est que très peu représenté et n'est pas visible, comme décrit par Servillo (Eur. J.Biochem. 1993 583-589) . Le taux de fonctionnalisation de l'ORN (Tf) est évalué par la mesure : de l'aire correspondant aux adduits mono-nucléosidiques terminaux (fonctionnalisés en 2' et en 3') et de l'aire correspondant aux di-nucléotides acylés
(fonctionnalisés en interne sur le 2' OH)
comparée à l'aire des pics correspondant aux quatre ribonucléosides .
Mode opératoire : Dans une expérience type, l'équivalent de 8 nmoles d'un ORN de 27 bases ( 5 ' -AAC-CGC-AGU-GAC-ACC-CUC-AUC- AUU-ACA-3' , Eurogentec, Liège Science Park, Belgique) en solution dans l'eau sont préalablement séchés à 1 ' évaporateur centrifuge (RCT 60, Jouan, St Herblain, France) dans un tube Eppendorf en plastique de 2 mL . Le résidu sec obtenu est d'abord solubilisé dans 40 yL d'eau, puis 20 μΐ d'une solution tamponnée sont ajoutés (dans l'exemple une solution tampon de Triéthyl ammonium d'acétate, pH 7, 1M Aldrich, St Louis, USA réf : 09748-lOOml) . Enfin, 20 μΐ d'une solution d'un dérivé de l'anhydride isatoïque à 120 mM dans le DMSO sont incorporée dans la solution précédente (soit la molécule de référence Biot-peg4-SS-IAMe tel que décrit dans FR 1060102 ou le dérivé azaisatoïque Biot-peg4-SS-azaIAMe (1 ) dans cet exemple) . Le mélange est incubé 60 minutes à température ambiante ou à 65°C dans une étuve sur un portoir pré-équilibré en température. Pour éliminer les sels et l'excès de marqueur, le mélange est ensuite purifié par triple précipitation dans 1,2 mL d'un mélange Acétone/LiClC^ 180 mM 75/25. Pour finir, le culot est séché à l'acétone et évaporé à 1 ' évaporateur centrifuge (RCT 60, Jouan, St Herblain, France) . Le résidu est alors repris dans 20 μΐ d'une solution H20/DMSO 85/15 et une injection HPLC (conditions 1) est pratiquée afin de vérifier l'absence de réactif de fonctionnalisation . 2 μΐ de nucléase PI (réf. : N8630 Sigma-Aldrich, St Louis, USA) en solution à 1 U/μΙ dans son tampon : acétate de sodium 20 mM pH 5,5; ZnCl2 1 mM; NaCl 50 mM, et 1 μΐ de phosphatase alcaline à 7 u/μΐ dans l'eau (Réf. P7923-2KU Sigma-Aldrich, St Louis, USA) sont introduits dans le mélange. Le milieu est laissé à température ambiante pendant 4 à 6 heures. Une injection est alors réalisée en HPLC (conditions 1) afin de vérifier l'hydrolyse totale de l'ORN et d'analyser la nature des fragments.
Le taux de fonctionnalisation est évalué en UV à 260 nm, par intégration des massifs correspondants aux dinucléotides acylés et aux nucléosides-acylés , par rapport aux massifs correspondant aux quatre ribonucléosides .
Remarque : Les valeurs de taux de fonctionnalisation, présentées dans le cadre de cette invention, ne tiennent pas compte du facteur de correction qu' il faut apporter en fonction du coefficient d'extinction molaire à 260 nm de chacun des nucléosides, qu'il s'agisse de nucléosides ou de dinucléotides .
La Figure 5 présente les résultats obtenus lors des tests de fonctionnalisation sur des ORN 27 mers avec les dérivés Biot- peg4-SS-IAMe, tel que décrit dans FR 1060102 et Biot-peg4-SS- azalAMe 1 , à température ambiante et à 65 °C.
Discussion et conclusion : A 65 °C, le taux de fonctionnalisation non corrigé a été évalué à 13,5% pour le dérivé aza-isatoïque 1 contre 7,5% pour le composé de référence, Biot-peg4-SS-IAMe . La réactivité vis-à-vis d'un oligoribonucléotide a donc été augmentée d'un facteur 1,8 en série aza-isatoïque à 65°C. De façon plus intéressante, le dérivé aza 1 permet de fonctionnaliser l'ARN à température ambiante (Tf non corrigé = 7,8%), alors que le composé de référence est très peu réactif dans ces conditions (Tf non corrigé = 1%) . Avec cet exemple, nous démontrons l'augmentation de la réactivité vis-à-vis d'un ORN avec le dérivé aza-isatoïque 14 , ainsi que sa capacité à fonctionnaliser un ORN à température ambiante. On démontre aussi que pour une même concentration en réactif, on fonctionnalise un ORN avec le même Tf à température ambiante avec le dérivé aza-isatoïque qu'à 65°C avec le dérivé isatoïque.
Exemple 4 : Démonstration de la chémo-sélectivité de l'ARN par rapport à l'ADN en série aza-isatoïque :
Objectif : Afin de démontrer la sélectivité de fonctionnalisation de l'ARN vis-à-vis de l'ADN en série aza- isatoïque, un test comparatif a été effectué entre un ODN de 27 bases et un ORN de 27 bases mis en réaction avec un dérivé azaisatoïque, Biot-peg4-SS-azaIAMe (14_) .
Mode opératoire : 8 nmoles d' ODN de 27 bases, Seq : 5'-AAC- CGC-AGT-GAC-ACC-CTC-ATC-ATT-ACA-3' (Eurogentec, Liège Science Park, Belgique) ou 8 nmoles d'un ORN de 27 bases, Seq : 5'- AAC-CGC-AGU-GAC-ACC-CUC-AUC-AUU-ACA-3' (Eurogentec, Liège
Science Park, Belgique) sont mis en réaction avec le dérivé anhydride aza-isatoïque (14_) à 30 mM dans un mélange DMSO/tampon TEAAc (250 mM pH 7) 25/75, pendant 1 heure à température ambiante. Après précipitation à l'acétone et hydrolyse avec la nucléase PI et la phosphatase alcaline, les fragments hydrolysés sont analysés par LC-MS, comme décrit dans l'exemple 3. Un exemple des chromatogrammes de suivi de la réaction de l'ODN ou de l'ORN avec le composé 14_, est représenté sur la Figure 6 où les tracés A, B et C correspondent respectivement à l'ORN initial, l'ORN fonctionnalisé avec le composé 14_ et précipité, et l'ORN fonctionnalisé avec 14_, précipité et hydrolysé. Les tracés D, E et F représentent les mêmes résultats obtenus avec l'ODN. Résultats et conclusion : Le taux de fonctionnalisation non corrigé de l'ORN est évalué à 7,8% avec le composé 1 , alors que celui de l'ODN est évalué à 0,5%. Dans ces conditions expérimentales, l'ODN est très peu fonctionnalisé. Ces résultats confirment la sélectivité de fonctionnalisation du dérivé de l'anhydride aza-isatoïque 1 pour l'ARN et l'absence de réactivité sur les bases. En effet, si les bases réagissaient sur le composé 1 , des adduits nucléosidiques anthranylates issus d'une réaction avec l'ODN seraient observés. A noter que les 0,5 % de fonctionnalisation de l'ODN proviennent d'une très faible réactivité des extrémités 5' -OH et 3' -OH de l'ADN (voir à ce propos Nawrot Nucleosides and Nucleotides 1998 815-829) .
Cet exemple démontre une conservation de la chémo-sélectivi té en série aza-isatoïque pour un ORN par rapport à un ODN. La présence de groupements 2' -OH spécifiques de l'ORN, est à l'origine de la réaction chémo-spécifique sur l'ORN.
Exemple 5 : Extraction sélective de transcrits ARN HIV à partir d'une solution contenant un mélange de transcrits ARN HIV et d'ADN génomique : Objectif : Le but est de démontrer que le concept de l'enrichissement en ARN d'une solution biologique, contenant un mélange d'ARN et d'ADN en utilisant comme réactif de fonctionnalisation le dérivé azaisatoïque 1 à température ambiante est possible. Pour cela, deux modèles biologiques d'acides nucléiques ont été choisis, transcrits HIV pour l'ARN et ADN génomique de veau. Afin de comparer l'efficacité du dérivé azaisatoïque 1 , ces tests ont également été réalisés sur le composé de référence Biot-peg4-SS-IAMe à 65°C et à température ambiante. Mode opératoire : Les acides nucléiques utilisés dans cet exemple sont les suivants :
- Transcrits HIV WT 1500 bases, à 1,94 yg/yL.
- gDNA calf thymus, SIGMA (Saint Louis, USA), réf.
D4764-5UN, à 1,92 yg/yL.
1 - Fonctionnalisation :
Dans trois tubes en plastique de 0,2 ml, les réactifs suivants sont introduits (Tableau 2 ci-dessous) :
Figure imgf000065_0001
Tableau 2 : Récapitulatif des conditions expérimentales
décrites dans l'exemple 5
Dans chaque cas, les concentrations finales en TEAAc et en réactif de fonctionnalisation sont respectivement de 250 mM et 1,5 mM .
Les trois tubes sont incubés pendant 1 heure à température ambiante ou à 65°C sur un portoir chauffant.
2 - Elimination de l'excès de réactif de fonctionnalisation par purification sur silice magnétique : La purification des acides nucléiques pour chaque test a été réalisée dans 5 tubes différents de volume équivalent, afin de respecter les conditions optimales pour cette étape (soit 1 mg de silice magnétique pour 2 yg d'acides nucléiques) . Ainsi, chaque essai est réparti dans cinq tubes Eppendorf de 1,5 mL soit 5 fois 2,1 yL (2 yg d'AN) . Un volume de 900 yL de lysis buffer (tampon Easy Mag, réf. 280134, bioMérieux, Marcy l'Etoile, France) et 50 yL de particules de silice magnétique (silice EasyMAG, réf. 280133, bioMérieux, Marcy l'Etoile, France) sont ajoutés dans chaque tube. Ces derniers sont immédiatement agités par effet vortex après ajout de la silice, puis incubés 10 minutes à température ambiante. Après magnétisation sur aimant DYNAL, les surnageants sont éliminés par aspiration au moyen d'une pipette. Pour les étapes de lavage qui suivent, les tubes sont toujours agités par effet vortex et magnétisés pour enlever ensuite le surnageant. Un premier lavage est réalisé avec 500 yL de tampon de lavage 1 (tampon Easy Mag, réf. 280130, bioMérieux, Marcy l'Etoile, France) . Deux lavages sont ensuite effectués avec 900 yL puis 500 yL de tampon de lavage 2 (tampon Easy Mag, réf. 280131, bioMérieux, Marcy l'Etoile, France). Enfin, une dernière étape de lavage est réalisée avec 500 yL de tampon d'élution 3 (tampon Easy Mag, réf. 280132, bioMérieux, Marcy l'Etoile, France) à température ambiante. L'élution des acides nucléiques est effectuée avec 20 yL de tampon d'élution 3 mis sous agitation dans un agitateur chauffant (1400 rpm) à 70°C. Après 5 minutes, les tubes sont agités par effet vortex puis magnétisés pour récupérer les surnageants. Ces derniers sont dosés avec l'instrument Qubit® Fluorometer, réf. Q32857, Invitrogen (Carlsbad, California, Etats-Unis d'Amérique), et en utilisant les kits Quant-iT RNA Assay Kit 5-100 ng (réf. Q32855, Invitrogen, Carlsbad, California, Etats-Unis d'Amérique), et Quant-iT dsDNA HS Assay Kit 0,2-100 ng (réf. Q32854, Invitrogen, Carlsbad, California, Etats-Unis d'Amérique) . Ces kits de dosage permettent de déterminer un ratio ARN/ADN dans un mélange.
3 - Capture des acides nucléiques sur les particules magnétiques recouvertes de streptavidine :
Pour effectuer cette capture sur particules magnétiques, il est nécessaire de conserver chacun des essais divisés en 5 tubes dans l'étape de purification précédente. Les conditions optimales pour cette étape, c'est-à-dire l'emploi de 40 yg de particules magnétiques pour capturer totalement 2 yg d'acides nucléiques, sont ainsi respectées. Pour chaque essai, 8 yL (équivalent à 40 yg) de MagPrep P-25 Streptavidin, MERCK (Darmstadt, Allemagne) sont introduits au préalable dans 5 tubes en plastique de 0,2 ml. Ces particules sont lavées à deux reprises avec 80 yL de PBS IX + SDS 0.1%, en utilisant des pointes effilées et l'aimant MPC 9600 Dynal Invitrogen (Carlsbad, California, Etats-Unis d'Amérique) pour les séparations magnétiques. Une fois les particules lavées, 15 yL d'acides nucléiques purifiés à l'étape 2 puis 5 yL de PBS 4X + SDS 0,4% sont ajoutés sur chaque culot. Les tubes sont incubés 10 minutes avec une agitation douce (agitateur par vortex à la vitesse minimum) à température ambiante. Après séparation magnétique, les surnageants sont récupérés à l'aide de pointes effilées. Ce surnageant est dosé comme précédemment avec le Qubit® Fluorometer.
4 - Elution des ARN fonctionnalisés : Les culots de particules magnétiques de streptavidine, sur lesquels sont immobilisés les acides nucléiques fonctionnalisés, sont lavés avec 80 yL de PBS IX + SDS 0,1% pendant 5 minutes à 65°C (portoir chauffant) . Les différents essais sont agités par effet vortex et après 5 minutes, le tampon de lavage est éliminé après séparation magnétique à l'aide de pointes effilées. Cette opération est répétée 2 fois. Un dernier lavage des culots est réalisé avec 20 yL de PBS IX. Les 5 culots correspondant à chaque essai sont alors mélangés dans un seul tube. Le volume est alors de 100 yL de PBS IX pour chaque essai. Ces derniers sont agités par effet vortex, puis le surnageant est éliminé après séparation magnétique à l'aide de pointes effilées. Chaque culot est mis en suspension dans 8 yL d'une solution de DTT à 100 mM dans le PBS IX. Chaque essai est alors agité par effet vortex, puis incubé pendant 1 heure à 40°C, 300 RPM. Après séparation magnétique, le surnageant est récupéré à l'aide de pointes effilées. Ce surnageant est dosé avec l'instrument Qubit® Fluorometer (Invitrogen, Carlsbad, California, Etats-Unis d'Amérique) comme précédemment (environ 100 ng d'ARN sont recueillis) .
Résultats et conclusions :
1 - Résultats :
Les dosages avec le Qubit® Fluorometer des éluats permettent de quantifier les acides nucléiques présents à chaque étape du processus comme décrit précédemment.
A partir des mesures obtenues, il est possible de calculer d'une part les rendements d'extraction d'ARN et d'ADN, et d'autre part un indice de sélectivité intermédiaire appelé S*. Cet indice nous permettra de comparer plusieurs essais réalisés avec différents dérivés isatoïques :
Rdt extraction ARN [ARN flml /[ARN] purifiéàV étapel.
Rdt extraction ADN [ADN]final /[ADN]p.
Remarque : L'évaluation de la sélectivité intermédiaire permet de ne pas tenir compte du biais qui serait apporté par l'étape de purification n° 2. A partir des mesures obtenues et calculs réalisés, le Tableau 3 suivant est établi :
Figure imgf000069_0001
Tableau 3 : Récapitulatif des ratios ADN/ARN mesurés aux étapes 2 et 4 du processus de fonctionnalisation/capture/ clivage/élution de l'ARN
2 - Conclusion :
Le processus d'enrichissement en ARN, à partir d'une fonctionnalisation sélective de l'ARN avec le dérivé aza- isatoïque 1_4 et à température ambiante, est démontré. Le ratio ADN/ARN passe ainsi de 90/10 à l'issue de l'étape de purification, à un ratio de 4/96 après le processus complet (essai 3) . Ce résultat démontre l'efficacité du dérivé azaisatoïque 1_4 à température ambiante pour l'extraction sélective d'ARN.
De plus, par rapport au composé de référence Biot-peg4-SS-IAMe, ce dérivé permet d'enrichir le mélange en ARN en réalisant l'étape de fonctionnalisation à température ambiante. Enfin, la sélectivité intermédiaire est augmentée d'un facteur 5 à température ambiante par rapport au composé de référence dans les mêmes conditions à 65°C.
Le dérivé aza-isatoïque 1_4 permet de fonctionnaliser les acides ribonucléiques à température ambiante, et par conséquent d'augmenter la sélectivité du processus d'extraction vis-à-vis de l'ARN.
Exemple 6 : Démonstration du concept de groupement auto immolable associé à un anhydride aza-isatoïque biotinylé. Synthèse d'un dérivé aza-isatoïque doté d'un groupement disulfure sur la partie aromatique
La synthèse d'un dérivé d'anhydride aza-isatoïque dont un exemple est décrit sur la Figure 2 a été réalisée (BiotPE4 (SSMe) PyrIAMe) . Il est doté:
d'un bras de liaison pourvu d'un lien dimethyle disulfure en position benzylique et en ortho de la fonction carbonyle
d'un dérivé biotinylé en position benzylique.
Après réaction de ce dérivé avec un acide ribonucléique, le conjugué acide ribonucléique-aza-anthranylate qui se forme est soumis à un traitement au DDT, ce qui hydrolyse la liaison disulfure, le thiol généré réagit alors intra-moléculairement sur la fonction ester de 1 ' aza-anthranylate par formation d'une aza-thiolactone très stable. Un acide ribonucléique nu exempt d' aza-anthranylate est alors libéré (Figure 2) .

Claims

REVENDICATIONS
1. Procédé de fonctionnalisation d'au moins une molécule d'acide ribonucléique (ARN) , contenu dans un échantillon liquide, qui comprend les étapes suivantes :
a) disposer d'au moins :
une molécule de liaison constituée par un anhydride aza-isatoïque ou un de ses dérivés,
un groupement d'intérêt, et
- un bras de liaison reliant la molécule de liaison avec le groupement d'intérêt,
b) faire réagir la fonction anhydride de la molécule de liaison avec au moins un groupement hydroxyle porté : en position 2' du ribose d'un des nucléotides de l'ARN, et/ou
en position (s) 2' et/ou 3' du ribose du nucléotide à l'extrémité 3' terminal de l'ARN, et
c) obtenir un aza-anthranylate reliant, à l'aide du bras de liaison, l'ARN au groupement d'intérêt.
2. Procédé de fonctionnalisation d'au moins une molécule d'acide ribonucléique (ARN) selon la revendication 1, ledit procédé étant un procédé de marquage d' au moins une molécule d'acide ribonucléique (ARN), contenu dans un échantillon liquide, dans lequel ladite molécule de liaison est constituée par un anhydride aza-isatoïque ou un de ses dérivés possédant une fluorescence intrinsèque, et dans lequel ledit groupement d' intérêt possède un signal de fluorescence intrinsèque mais différent du signal émis par la molécule de liaison, ou n'ayant pas de signal de fluorescence intrinsèque.
3. Procédé de fonctionnalisation d'au moins une molécule d'acide ribonucléique (ARN) selon la revendication 1, ledit procédé étant un procédé de capture ou de séparation d' au moins une molécule d' acide ribonucléique (ARN) , dans lequel lequel ledit groupement d' intérêt est constitué par un ligand complémentaire d'un anti ligand,
ledit procédé comprenant, postérieurement à l'étape c) , l'étape suivante : d) capturer ou séparer l'ARN par l'intermédiaire d'une réaction entre un ligand et un anti-ligand.
4. Procédé, selon la revendication 3, dans lequel il y a une étape supplémentaire consistant à :
e) réserver ou éliminer les molécules d'ARN ainsi capturées ou séparées et utiliser le reste de l'échantillon enrichi en ADN.
5. Procédé, selon l'une des revendications 1 à 4, dans lequel le bras de liaison est associé à la molécule de liaison avant que ledit bras de liaison soit associé au groupement d' intérêt .
6. Procédé, selon l'une des revendications 1 à 4, dans lequel le bras de liaison est associé à la molécule de liaison après que ledit bras de liaison est associé au groupement d'intérêt.
7. Procédé, selon l'une des revendications 5 ou 6, dans lequel la molécule de liaison est préalablement associée à 1 ' AR .
8. Procédé selon la revendication 3 ou 4, ou selon l'une des revendications 5 à 7 lorsqu'elles dépendent de la revendication 3 ou 4, ledit procédé étant un procédé de capture sélectif d'au moins une molécule d'acide ribonucléique (ARN) , dans lequel ladite molécule de liaison se fixe par liaison covalente au niveau d'un groupement hydroxyle porté : en position 2' du ribose d'un des nucléotides de l'ARN, et/ou
en position (s) 2' et/ou 3' du ribose du nucléotide terminal en position 3' de l'ARN.
9. Procédé de séparation de molécules d'ARN par rapport à d'autres constituants biologiques, notamment des molécules d'ADN consistant à :
• appliquer le procédé de capture, selon la revendication 8, à un échantillon biologique contenant des acides nucléiques indifférenciés (ARN et ADN) , les groupements d' intérêt étant associés à au moins un support solide facilement séparable du reste de l'échantillon biologique, et
• séparer les molécules de liaison portant les molécules d'ARN du reste de l'échantillon biologique.
10. Réactif de fonctionnalisation, de formule (I) :
Figure imgf000073_0001
dans lequel :
• Y représente Z4 ou le groupement C-X3-R3,
• R1, R2 et R3 représentent, indépendamment les uns des autres, H ou un groupement d'intérêt, sachant qu'au moins un des radicaux R1, R2 et R3 représente un groupement d'intérêt, et
• le groupement d' intérêt est sélectionné parmi : un marqueur ou un précurseur de marquage, ou un ligand pouvant être reconnu par une molécule de reconnaissance ou une surface, ou une particule, etc., afin de former un complexe stable,
· X1, X2 et X3 représentent chacun, indépendamment l'un de l'autre, des bras de liaison qui relient le groupement d' intérêt à la molécule de liaison,
• un seul des radicaux Z1, Z2, Z3 et Z4 est constitué par un atome d' azote (N) , les autres radicaux sont constitués par un atome de carbone (C) .
11. Réactif de fonctionnalisation selon la revendication 10, dans lequel Y représente le groupement C-X3-R3, ledit réactif répondant ainsi à la formule (2) suivante :
Figure imgf000074_0001
dans lequel :
• R1, R2 et R3 représentent, indépendamment les uns des autres, H ou un groupement d'intérêt, sachant qu'au moins un des radicaux R1, R2 et R3 représente un groupement d'intérêt, et
• le groupement d' intérêt est sélectionné parmi :
- un marqueur ou un précurseur de marquage, ou
- un ligand pouvant être reconnu par une molécule de reconnaissance ou une surface, ou une particule, etc., afin de former un complexe stable, • X , X et X représentent chacun, indépendamment l'un de l'autre, des bras de liaison qui relient le groupement d' intérêt à la molécule de liaison,
• un seul des radicaux Z1, Z2 et Z3 est constitué par un atome d' azote (N) , les autres radicaux sont constitués par un atome de carbone (C) .
12. Réactif de fonctionnalisation selon la revendication 10 ou 11, ledit réactif étant un réactif de capture ou de séparation pour lequel le moyen de capture ou de séparation est constitué par un support solide, tel que particules de polymère ou de silice, magnétiques ou non, ou un filtre ou bien par la paroi interne d'un récipient.
13. Réactif de fonctionnalisation, selon la revendication 10 ou 11, dans lequel le bras de liaison X est un bras espaceur organique permettant de relier la molécule de liaison et le groupement d'intérêt, tel qu'une simple liaison covalente entre la molécule de liaison et le groupement d' intérêt ou un simple atome de carbone, éventuellement substitué, un enchaînement d'au moins deux atomes de carbone, contenant éventuellement des structures aromatiques et/ou des hétéro- atomes (oxygène, soufre, azote, etc.).
14. Réactif de fonctionnalisation, selon la revendication 13, dans lequel le bras de liaison X comporte une fonction ou une liaison capable d'être clivée par un moyen physico-chimique, photo-chimique, thermique, enzymatique et/ou chimique permettant la séparation de la molécule de liaison par rapport à l'ARN dans des conditions de lumière, de température, enzymatiques ou chimiques particulières.
15. Réactif de fonctionnalisation selon l'une des revendications 10 à 14, dans lequel le groupement d'intérêt est un marqueur ou un précurseur de marquage.
16. Réactif de fonctionnalisation selon la revendication 15, dans lequel le groupement d' intérêt est un marqueur, ledit marqueur ayant un signal de fluorescence intrinsèque mais différent du signal émis par la molécule de liaison, ou n'ayant pas de signal de fluorescence intrinsèque.
17. Utilisation d'un réactif selon l'une des revendications 10 à 16 pour fonctionnaliser au moins une molécule d'acide ribonucléique (ARN) .
18. Molécule biologique d'ARN fonctionnalisée susceptible d'être obtenue par le procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 9.
19. Kit de détection d'une molécule d'ARN cible, ledit kit comprenant un réactif selon l'une des revendications 10 à 16.
20. Utilisation d'un kit selon la revendication 19 pour détecter au moins une molécule d'ARN cible.
21. Procédé de fonctionnalisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, qui comprend, entre les étapes a) et b) , une étape supplémentaire consistant à hydrolyser le groupement monophosphate terminal en position 3' de chaque brin d'ARN à fonctionaliser.
PCT/EP2013/065854 2012-08-02 2013-07-26 Procedes de fonctionnalisation et reactifs utilises dans de tels procedes utilisant un anhydride aza-isatoïque ou un de ses derives, molecules biologiques ainsi traitees et kits WO2014019966A1 (fr)

Priority Applications (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US14/416,996 US10174068B2 (en) 2012-08-02 2013-07-26 Methods of functionalization and reagents used in such methods using an aza-isatoic anhydride or a derivative thereof, biological molecules thus treated and kits
JP2015524746A JP6407151B2 (ja) 2012-08-02 2013-07-26 アザイサト酸無水物又はその誘導体の一つを用いた官能化の方法及びこの方法において使用される試薬、このように処置された生物学的分子及びキット
EP13744493.1A EP2880016A1 (fr) 2012-08-02 2013-07-26 Procedes de fonctionnalisation et reactifs utilises dans de tels procedes utilisant un anhydride aza-isatoïque ou un de ses derives, molecules biologiques ainsi traitees et kits
US16/217,483 US20190112329A1 (en) 2012-08-02 2018-12-12 Methods of functionalization and reagents used in such methods using an aza-isatoic anhydride or a derivative thereof, biological molecules thus treated and kits

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FR1257526 2012-08-02
FR1257526A FR2994184B1 (fr) 2012-08-02 2012-08-02 Procedes de fonctionalisation et reactifs utilises dans de tels procedes utilisant un anhydride aza-isatoique ou un de ses derives, molecules biologiques ainsi traitees et kits

Related Child Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
US14/416,996 A-371-Of-International US10174068B2 (en) 2012-08-02 2013-07-26 Methods of functionalization and reagents used in such methods using an aza-isatoic anhydride or a derivative thereof, biological molecules thus treated and kits
US16/217,483 Division US20190112329A1 (en) 2012-08-02 2018-12-12 Methods of functionalization and reagents used in such methods using an aza-isatoic anhydride or a derivative thereof, biological molecules thus treated and kits

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2014019966A1 true WO2014019966A1 (fr) 2014-02-06

Family

ID=46963941

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/EP2013/065854 WO2014019966A1 (fr) 2012-08-02 2013-07-26 Procedes de fonctionnalisation et reactifs utilises dans de tels procedes utilisant un anhydride aza-isatoïque ou un de ses derives, molecules biologiques ainsi traitees et kits

Country Status (5)

Country Link
US (2) US10174068B2 (fr)
EP (1) EP2880016A1 (fr)
JP (1) JP6407151B2 (fr)
FR (1) FR2994184B1 (fr)
WO (1) WO2014019966A1 (fr)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2018011527A1 (fr) * 2016-07-13 2018-01-18 bioMérieux Réactifs pour la protection réversible de molécules biologiques

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA3078540A1 (fr) 2017-11-30 2019-06-06 Arrakis Therapeutics, Inc. Photosondes de liaison a un acide nucleique et leurs utilisations

Citations (32)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR1060102A (fr) 1951-12-08 1954-03-30 Sawyer S Inc Support de vues stéréoscopiques dispositives et son procédé de labrication
EP0063879A2 (fr) 1981-04-17 1982-11-03 Yale University Nucléotides modifiés et méthode pour leur préparation et leur utilisation
EP0097373A2 (fr) 1982-06-23 1984-01-04 Enzo Biochem, Inc. Nucléotides modifiés marqués et polynucléotides ainsi que leurs méthodes de préparation, d'utilisation et de détection
EP0329198A2 (fr) 1981-04-17 1989-08-23 Yale University Composés de ribose et 2-désoxyribose
DE3910151A1 (de) 1989-03-29 1990-10-04 Toni Dr Lindl 5'-bromo-2'-desoxyuridinmarkierte dna- oder rna- sonden
WO1993016094A2 (fr) 1992-02-12 1993-08-19 Chromagen, Inc. Utilisation de n-nucleosides fluorescents et de leurs analogues structurels fluorescents
EP0567841A2 (fr) 1992-04-25 1993-11-03 MERCK PATENT GmbH Composés marqués avec un fluorophore, leur préparation et utilisation
US5328824A (en) 1981-04-17 1994-07-12 Yale University Methods of using labeled nucleotides
WO2002030911A1 (fr) * 2000-10-10 2002-04-18 Smithkline Beecham P.L.C. Derives de pyrimidinone et leur utilisation dans le traitement de l'atherosclerose
WO2004013155A2 (fr) 2002-08-02 2004-02-12 Cyclops Genome Sciences Limited Stabilisation d'acides nucleiques
WO2004064759A2 (fr) * 2003-01-21 2004-08-05 Chiron Corporation Utilisation de composes de tryptanthrine dans la potentialisation immunologique
US20040167123A1 (en) * 2002-11-01 2004-08-26 Pratt John K Anti-infective agents
EP1510577A1 (fr) 2003-08-29 2005-03-02 Qiagen GmbH Méthode pour l'isolation des acides nucléiques en utilisant des particules magnétiques
US20050106576A1 (en) 2003-11-17 2005-05-19 Hashem Akhavan-Tafti Methods of using cleavable solid phases for isolating nucleic acids
US20050106577A1 (en) 2003-11-17 2005-05-19 Hashem Akhavan-Tafti Cleavable solid phases for isolating nucleic acids
EP1196631B1 (fr) 1999-04-30 2006-12-06 Cyclops Genome Sciences Limited Modifications des acides ribonucleiques
US20070148651A1 (en) 2003-12-12 2007-06-28 Uwe Michelsen Method and kit for the isolation of rna
WO2007145940A2 (fr) * 2006-06-05 2007-12-21 The University Of North Carolina At Chapel Hill Analyse de structure d'arn à rendement élevé
EP1771562B1 (fr) 2004-07-15 2008-05-21 Qiagen GmbH Procede pour purifier et isoler des acides nucleiques par utilisation de detergents cationiques
EP1762618B1 (fr) 2005-09-07 2008-10-08 Roche Diagnostics GmbH Procédé de préparation d'acides nucléiques à partir du sang total et son utilisation dans le diagnostic d'EST par PCT temps réel
WO2008130600A2 (fr) * 2007-04-18 2008-10-30 Amgen Inc. Quinolones et azaquinolones inhibant la prolyl hydroxylase
EP1479769B1 (fr) 2003-05-19 2008-11-12 Hitachi High-Technologies Corporation Procédé d'isolement séparé d'ADN et d'ARN et kit pour l'isolement d'acides nucléiques
EP1266385B1 (fr) 2000-03-24 2008-12-31 QIAGEN GmbH Particules de verre ferro- ou ferrimagnetiques poreuses servant a isoler des molecules
WO2009040444A1 (fr) 2007-09-28 2009-04-02 Mole Genetics As Procédé d'isolement d'arn
EP1476550B1 (fr) 2002-02-21 2009-05-13 GE Healthcare Bio-Sciences AB Procede de separation au moyen de ligands de thioether aromatiques
EP1869179B1 (fr) 2005-04-01 2009-10-28 Qiagen GmbH Procédé pour traiter un échantillon contenant des biomolécules
EP1589105B1 (fr) 2004-04-23 2009-11-18 Becton Dickinson and Company Extraction d'acides nucléiques au moyen de particules magnétiques de faible diamètre
EP1448799B1 (fr) 2001-11-28 2009-11-18 Applied Biosystems, LLC Compositions et procédés d'isolation selective d'acides nucleiques
EP1383732B1 (fr) 2001-05-04 2010-02-17 Bio Merieux Reactifs de marquage, procedes de synthese de tels reactifs et procedes de detection de molecules biologiques
EP1367137B1 (fr) 1997-01-21 2010-03-10 Promega Corporation Procédés destinés à l'isolement de matières biologiques cibles au moyen de particules magnétiques de silice
WO2011047432A1 (fr) * 2009-10-22 2011-04-28 Fibrotech Therapeutics Pty Ltd Analogues à cycles condensés d'agents anti-fibrotiques
WO2012076794A1 (fr) 2010-12-06 2012-06-14 Biomerieux Procedes de fonctionalisation et reactifs utilises dans de tels procedes utilisant un anhydride isatoïque ou un de ses derives, molecules biologiques ainsi traitees et kits

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3838120A (en) * 1972-12-07 1974-09-24 Sterling Drug Inc 1-alkyl-1h,4h-pyrido(2,3-d)(1,3)oxazine-2,4-diones and their conversion to 1-alkyl-1,4-dihydro-4-oxo-1,8-naphthyridine-3-carboxylic acids
FR2868071B1 (fr) 2004-03-26 2006-06-09 Biomerieux Sa Reactifs de marquage, procedes de synthese de tels reactifs et procedes de detection de molecules biologiques
FR2917090B1 (fr) 2007-06-11 2012-06-15 Biomerieux Sa Reactifs de marquage portant des fonctions diazo et nitro, procedes de synthese de tels reactifs et procedes de detection de molecules biologiques
FR2934595B1 (fr) 2008-07-29 2013-04-05 Biomerieux Sa Reactifs de marquage ayant un noyau pyridine portant une fonction diazomethyle, procedes de synthese de tels reactifs et procedes de detection de molecules biologiques

Patent Citations (37)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR1060102A (fr) 1951-12-08 1954-03-30 Sawyer S Inc Support de vues stéréoscopiques dispositives et son procédé de labrication
US5328824A (en) 1981-04-17 1994-07-12 Yale University Methods of using labeled nucleotides
EP0063879A2 (fr) 1981-04-17 1982-11-03 Yale University Nucléotides modifiés et méthode pour leur préparation et leur utilisation
US5449767A (en) 1981-04-17 1995-09-12 Yale University Modified polynucleotides and methods of preparing same
EP0329198A2 (fr) 1981-04-17 1989-08-23 Yale University Composés de ribose et 2-désoxyribose
EP0063879B1 (fr) 1981-04-17 1989-11-23 Yale University Nucléotides modifiés et méthode pour leur préparation et leur utilisation
EP0302175A2 (fr) 1982-06-23 1989-02-08 Enzo Biochem, Inc. Nucléotides et polynucléotides modifiés marqués et méthodes pour leur préparation, utilisation et détection
EP0286898B1 (fr) 1982-06-23 1998-04-29 Enzo Biochem, Inc. Nucléotides et polynucléotides modifiées marquées et méthodes pour leur préparation, utilisation et détection
EP0097373A2 (fr) 1982-06-23 1984-01-04 Enzo Biochem, Inc. Nucléotides modifiés marqués et polynucléotides ainsi que leurs méthodes de préparation, d'utilisation et de détection
DE3910151A1 (de) 1989-03-29 1990-10-04 Toni Dr Lindl 5'-bromo-2'-desoxyuridinmarkierte dna- oder rna- sonden
WO1993016094A2 (fr) 1992-02-12 1993-08-19 Chromagen, Inc. Utilisation de n-nucleosides fluorescents et de leurs analogues structurels fluorescents
EP0567841A2 (fr) 1992-04-25 1993-11-03 MERCK PATENT GmbH Composés marqués avec un fluorophore, leur préparation et utilisation
EP1367137B1 (fr) 1997-01-21 2010-03-10 Promega Corporation Procédés destinés à l'isolement de matières biologiques cibles au moyen de particules magnétiques de silice
EP1196631B1 (fr) 1999-04-30 2006-12-06 Cyclops Genome Sciences Limited Modifications des acides ribonucleiques
US7244568B2 (en) 1999-04-30 2007-07-17 Cyclops Genome Sciences Limited Isolation of nucleic acid
EP1266385B1 (fr) 2000-03-24 2008-12-31 QIAGEN GmbH Particules de verre ferro- ou ferrimagnetiques poreuses servant a isoler des molecules
WO2002030911A1 (fr) * 2000-10-10 2002-04-18 Smithkline Beecham P.L.C. Derives de pyrimidinone et leur utilisation dans le traitement de l'atherosclerose
EP1383732B1 (fr) 2001-05-04 2010-02-17 Bio Merieux Reactifs de marquage, procedes de synthese de tels reactifs et procedes de detection de molecules biologiques
EP1448799B1 (fr) 2001-11-28 2009-11-18 Applied Biosystems, LLC Compositions et procédés d'isolation selective d'acides nucleiques
EP1476550B1 (fr) 2002-02-21 2009-05-13 GE Healthcare Bio-Sciences AB Procede de separation au moyen de ligands de thioether aromatiques
WO2004013155A2 (fr) 2002-08-02 2004-02-12 Cyclops Genome Sciences Limited Stabilisation d'acides nucleiques
US20040167123A1 (en) * 2002-11-01 2004-08-26 Pratt John K Anti-infective agents
WO2004064759A2 (fr) * 2003-01-21 2004-08-05 Chiron Corporation Utilisation de composes de tryptanthrine dans la potentialisation immunologique
EP1479769B1 (fr) 2003-05-19 2008-11-12 Hitachi High-Technologies Corporation Procédé d'isolement séparé d'ADN et d'ARN et kit pour l'isolement d'acides nucléiques
EP1510577A1 (fr) 2003-08-29 2005-03-02 Qiagen GmbH Méthode pour l'isolation des acides nucléiques en utilisant des particules magnétiques
US20050106576A1 (en) 2003-11-17 2005-05-19 Hashem Akhavan-Tafti Methods of using cleavable solid phases for isolating nucleic acids
US20050106577A1 (en) 2003-11-17 2005-05-19 Hashem Akhavan-Tafti Cleavable solid phases for isolating nucleic acids
US20070148651A1 (en) 2003-12-12 2007-06-28 Uwe Michelsen Method and kit for the isolation of rna
EP1589105B1 (fr) 2004-04-23 2009-11-18 Becton Dickinson and Company Extraction d'acides nucléiques au moyen de particules magnétiques de faible diamètre
EP1771562B1 (fr) 2004-07-15 2008-05-21 Qiagen GmbH Procede pour purifier et isoler des acides nucleiques par utilisation de detergents cationiques
EP1869179B1 (fr) 2005-04-01 2009-10-28 Qiagen GmbH Procédé pour traiter un échantillon contenant des biomolécules
EP1762618B1 (fr) 2005-09-07 2008-10-08 Roche Diagnostics GmbH Procédé de préparation d'acides nucléiques à partir du sang total et son utilisation dans le diagnostic d'EST par PCT temps réel
WO2007145940A2 (fr) * 2006-06-05 2007-12-21 The University Of North Carolina At Chapel Hill Analyse de structure d'arn à rendement élevé
WO2008130600A2 (fr) * 2007-04-18 2008-10-30 Amgen Inc. Quinolones et azaquinolones inhibant la prolyl hydroxylase
WO2009040444A1 (fr) 2007-09-28 2009-04-02 Mole Genetics As Procédé d'isolement d'arn
WO2011047432A1 (fr) * 2009-10-22 2011-04-28 Fibrotech Therapeutics Pty Ltd Analogues à cycles condensés d'agents anti-fibrotiques
WO2012076794A1 (fr) 2010-12-06 2012-06-14 Biomerieux Procedes de fonctionalisation et reactifs utilises dans de tels procedes utilisant un anhydride isatoïque ou un de ses derives, molecules biologiques ainsi traitees et kits

Non-Patent Citations (30)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
"Sample Préparation Techniques in Analytical Chemistry", vol. 162, 2003, WILEY-INTERSCIENCE
C.M. GHERGHE; S.A. MORTIMER; J.M. KRAHN; N.L. THOMPSON; K.M. WEEKS: "Slow conformational dynamics at C2'- endo nucleotides in RNA", J. AM. CHEM. SOC., vol. 130, 2008, pages 8884 - 8885
CECH T. R., RNA, 2007, pages 536 - 548
COPPOLA G M ET AL: "THE CHEMISTRY OF 3-AZAISOTOIC ANHYDRIDES. SYNTHESIS AND REACTIONS OF POLYAZA HETEROCYCLES", JOURNAL OF HETEROCYCLIC CHEMISTRY, WILEY-BLACKWELL PUBLISHING, INC, US, vol. 22, no. 1, 1985, pages 193 - 206, XP000918416, ISSN: 0022-152X, DOI: 10.1002/JHET.5570220147 *
DMITRI PROUDNIKOV: "Chemical methods of DNA and RNA fluorescent Labeling", NUCLEIC ACIDS RESEARCH, vol. 24, no. 22, 1996, pages 4535 - 4532
E.J. MERINO; K.A. WILKINSON; J.L. COUGHLAN; K.M. WEEKS: "RNA structure analysis at single nucleotide resolution by Selective 2'-Hydroxyl Acylation and Primer Extension (SHAPE", J. AM. CHEM. SOC., vol. 127, 2005, pages 4223 - 4231
EUR. J.BIOCHEM., 1993, pages 583 - 589
F. NATT, NUCLEIC ACIDS RESEARCH, vol. 35, no. 7, 2007, pages E52
HIRATSUKA, BBA, vol. 742, 1983, pages 496 - 508
HUANG Z.: "A simple method for 3'-labeling of RNA", NUCLEIC ACIDS RESEARCH, 1996, pages 4360 - 4361
HUANG Z.: "Selective labeling and detection of specific RNAs in an RNA mixture", ANALYTICAL BIOCHEMISTRY, 2003, pages 129 - 133
K. M. WEEKS: "l'acylation sélective des hydroxyles", 2000, ARN
K.A. WILKINSON; E.J. MERINO; K.M. WEEKS: "RNA SHAPE chemistry reveals non-hierarchical interactions dominate equilibrium structural transitions in tRNAAsP transcripts", J. AM. CHEM. SOC., vol. 127, 2005, pages 4659 - 4667
K.A. WILKINSON; E.J. MERINO; K.M. WEEKS: "Selective 2'-hydroxyl acylation analyzed by primer extension (SHAPE): quantitative RNA structure analysis at single nucleotide resolution", NATURE PROTOCOLS, vol. 1, 2006, pages 1610 - 1616
K.A. WILKINSON; S.M. VASA; K.E. DEIGAN; S.A. MORTIMER; M.C. GIDDINGS; K.M. WEEKS: "Influence of nucleotide identity on ribose 2'-hydroxyl reactivity in RNA", RNA, vol. 15, 2009, pages 1314 - 1321
K.E. DEIGAN; T.W. LI, D.H: "Mathews and K.M. Weeks, Accurate SHAPE-directed RNA structure determination", PROC. NATL. ACAD. SCI. USA, vol. 106, 2009, pages 97 - 102
K.M. WEEKS: "The mechanism of RNA SHAPE chemistry", J. AM. CHEM. SOC., vol. 134, 2012, pages 6617 - 24
KNORRE, BIOKHIMIYA, 1965, pages 1218 - 1224
MARTIN G: "Tailing and 3'-end labeling of RNA with yeast polys (A) polymerase and various nucleotides", RNA, vol. 22, 1998, pages 230
MOORMAN, JACS, vol. 104, 1982, pages 6785 - 6786
NA LI: "Aptamers that recognize drug- resistant HIV-1 reverse transcriptase", NUCLEIC ACIDS RESEARCH, vol. 36, no. 21, 2008, pages 6739 - 6751
NUCLEIC ACIDS RESEARCH, vol. 24, no. 22, 1996, pages 4535 - 4532
OVODOV, FEBS, vol. 270, 1990, pages 111 - 114
RU-QIANG LIANG: "An oligonucleotide microarray for microRNA expression analysis based on labeling RNA with quantum dot and nanogold probe", NUCLEIC ACIDS RESEARCH, vol. 33, no. 2, 2005, pages E17
S.A. MORTIMER; K.M. WEEKS: "A fast acting reagent for accurate analysis of RNA secondary and tertiary structure by SHAPE chemistry", J. AM. CHEM. SOC., vol. 129, 2007, pages 4144 - 4145
S.A. MORTIMER; K.M. WEEKS: "Time-resolved RNA SHAPE chemistry", J. AM. CHEM. SOC., vol. 130, 2008, pages 16178 - 16180
S.I. CHAMBERLIN; K.M. WEEKS: "Mapping local nucleotide flexibility by selective acylation of 2'- amine substituted RNA", J. AM. CHEM. SOC., vol. 122, 2000, pages 216 - 224
SERVILLO, EUR. J.BIOCHEM., 1993, pages 583 - 589
STEFANIE A MORTIMER AND KEVIN M WEEKS: "A Fast-Acting Reagent for Accurate Analysis of RNA Secondary and Tertiary Structure by SHAPE Chemistry", JOURNAL OF THE AMERICAN CHEMICAL SOCIETY, ACS PUBLICATIONS, US, vol. 129, no. 14, 11 April 2007 (2007-04-11), pages 4144 - 4145, XP002631927, ISSN: 0002-7863, [retrieved on 20070317], DOI: 10.1021/JA0704028 *
STNARK, JOURNAL OF THE AMERICAN CHEMICAL SOCIETY, vol. 75, 1963, pages 2546

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2018011527A1 (fr) * 2016-07-13 2018-01-18 bioMérieux Réactifs pour la protection réversible de molécules biologiques
FR3053968A1 (fr) * 2016-07-13 2018-01-19 Biomerieux Reactifs pour la protection reversible de molecules biologiques
US11708375B2 (en) 2016-07-13 2023-07-25 bioMérieux Reagents for reversibly protecting biological molecules

Also Published As

Publication number Publication date
JP2015526076A (ja) 2015-09-10
FR2994184A1 (fr) 2014-02-07
FR2994184B1 (fr) 2017-12-08
US20150210732A1 (en) 2015-07-30
US10174068B2 (en) 2019-01-08
EP2880016A1 (fr) 2015-06-10
US20190112329A1 (en) 2019-04-18
JP6407151B2 (ja) 2018-10-17

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN110088299B (zh) 通过纳米孔指导的核酸检测方法
Masud et al. Sialyllactose-binding modified DNA aptamer bearing additional functionality by SELEX
EP1383925B1 (fr) Procede de marquage et de fragmentation d&#39;adn
CA3057218A1 (fr) Nucleotides modifies pour la synthese d&#39;acides nucleiques, un kit renfermant de tels nucleotides et leur utilisation pour la production de genes ou sequences d&#39;acides nucleiques synthetiques
KR20140091750A (ko) 표적 단백질에 결합하는 핵산 단편
WO1999065926A1 (fr) Procede de marquage d&#39;un acide ribonucleique et fragments d&#39;arn marques ainsi obtenus
AU2003214031A1 (en) An improved method for synthesising templated molecules
FR2679255A1 (fr) Procede d&#39;immobilisation d&#39;un fragment nucleique par fixation passive sur un support solide, support solide ainsi obtenu et son utilisation.
WO2012076794A1 (fr) Procedes de fonctionalisation et reactifs utilises dans de tels procedes utilisant un anhydride isatoïque ou un de ses derives, molecules biologiques ainsi traitees et kits
CA2444918C (fr) Reactifs de marquage, procedes de synthese de tels reactifs et procedes de detection de molecules biologiques
CN110114476A (zh) 一种基于单荧光染料的测序方法
EP1140963B1 (fr) Compose fonctionnalise, polynucleotide eventuellement marque et procede de detection d&#39;un acide nucleique cible
WO2005092910A1 (fr) Réactifs de marquage, procédés de synthèse de tels réactifs et procédés de détection de molécules biologiques
US20190112329A1 (en) Methods of functionalization and reagents used in such methods using an aza-isatoic anhydride or a derivative thereof, biological molecules thus treated and kits
JP2015526076A5 (fr)
EP1886141B1 (fr) Procédé de marquage ou de traitement d&#39;un échantillon biologique contenant des acides nucléiques
EP2185565B1 (fr) Réactifs de marquage portant des fonctions diazo et nitro, procédés de synthèse de tels reactifs et procédés de détection de molécules biologiques
EP1778713B1 (fr) Procede de marquage et de purification d&#39;acides nucleiques d&#39;interet presents dans un echantillon biologique a traiter dans un unique recipient reactionnel
JP4738741B2 (ja) テンプレートされた分子を合成するための改良法
Kahn Exploring alternative bioconjugation methods for covalent linkage of DNA and peptides
Paredes Triazole linkages and backbone branches in nucleic acids for biological and extra-biological applications
Nadal et al. Aptamers for Analysis: Nucleic Acids Ligands in the Post‐Genomic Era

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 13744493

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 14416996

Country of ref document: US

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2015524746

Country of ref document: JP

Kind code of ref document: A

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2013744493

Country of ref document: EP