WO2014010923A1 - 일정한 온도에서 생성된 이온들의 질량 스펙트럼을 측정하는 방법 - Google Patents

일정한 온도에서 생성된 이온들의 질량 스펙트럼을 측정하는 방법 Download PDF

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배용진
박경만
안성희
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    • H01J49/161—Ion sources; Ion guns using surface ionisation, e.g. field-, thermionic- or photo-emission using photoionisation, e.g. by laser
    • H01J49/164—Laser desorption/ionisation, e.g. matrix-assisted laser desorption/ionisation [MALDI]

Definitions

  • the present invention relates to a method for measuring the mass spectrum of ions produced at a constant temperature. More specifically, the present invention is the sample ion or the plurality of mass spectra obtained from the ions formed by applying energy to the sample mixed with the matrix and the sample, or the sample mixed with the matrix and the sample and the third material,
  • the method for measuring the mass spectrum of ions generated at a constant temperature characterized in that it comprises the step of selecting only the spectra of the matrix ion, or the decomposition pattern of the third material ion is the same.
  • MALDI Matrix-assisted laser desorption / ionization
  • TOF time-of-flight
  • MALDI-TOF is widely used for various solid materials, especially biomolecular structure analysis because of its high sensitivity, wide application range and short analysis time.
  • the disadvantage of MALDI is that the pattern reproducibility of the spectrum is very bad.
  • the pattern of the spectrum continues to vary even when the spectrum is obtained by repeatedly irradiating the same position of the specimen with a laser. Because of the poor reproducibility of the MALDI mass spectral pattern, the industrial or scientific application of the MALDI spectrum is very limited. Accordingly, the present invention aims at improving the reproducibility of MALDI mass spectral patterns.
  • the MALDI mass spectrum shows analyte sample (analyte, AH + ) and its degradation product, and matrix ion (matrix, MH + ) and its decomposition product. Therefore, the pattern of the MALDI spectrum is determined by the intensity ratio of the AH + and MH + decomposition pattern with AH + and MH + of.
  • Ions formed by MALDI may be broken inside or outside the ion source (post-source decay, PSD). ISD reacts fast and terminates quickly, while PSD reacts slowly. The decomposition reaction rate and yield of the sample ions are determined by the reaction rate constant and the internal energy of the ion. Therefore, knowing the effective temperature of the plume generated by the laser pulse in MALDI, the internal energy can be known, and the reaction rate can be obtained using this.
  • PSD post-source decay
  • MALDI has done a lot of scientific research to determine the temperature of plume, a gas containing ions generated when lasers are irradiated onto specimens.
  • Mowry et al. Estimated temperature by photoionization of neutral molecules desorbed by laser ( J. Phys. Chem. 1994 , 98 , 1904-1909), and Yergey et al. ( J. Am. Soc. Mass Spectrom. 2007 , 18 , 607-616), and Zenobi et al. Estimated temperature by measuring the light emitted by a sample that absorbed a laser pulse ( J Phys. Chem. A 2004 , 108 , 2405-2410).
  • the present inventors have tried various methods to achieve the reproducibility of the ion decomposition pattern of the MALDI mass spectrum and found that the reproducibility of the ion decomposition pattern is improved by keeping the temperature of the ion generating reaction constant. For example, by maintaining a relatively constant temperature of a plume containing ions generated by irradiating a laser beam having a relatively low pulse energy, the decomposition pattern of ions generated from materials contained in the specimen is reproduced relatively uniformly. The mass spectra could be measured.
  • the inventors maintain a relatively constant temperature of the reaction in which the ions are generated by reducing the number of irradiation of the laser beam, whereby the mass spectrum in which the decomposition pattern of ions generated from the materials present in the specimen is relatively constant is shown.
  • the mass spectrum in which the decomposition pattern of ions generated from the materials present in the specimen is relatively constant is shown.
  • the inventors have found that maintaining the temperature of a plum containing ions produced by minimizing temperature change by insulating the specimen from the surroundings, the reproducibility of the pattern of the MALDI mass spectrum is greatly improved.
  • the reproducibility of the pattern of the MALDI mass spectrum is greatly improved.
  • the present inventors have obtained the rate constants of the decomposition reactions of these ions through prior studies of the photolysis reactions on the peptide ions, and by using the initial temperature of the gas (so-called plum) containing various ions produced by MALDI, there are in fact proposed a way to get the T early) (Yong Jin Bae, Jeong Hee Moon, and Myung Soo Kim, Expansion Cooling in the Matrix Plume is Under-Recognized in MALDI Mass Spectrometry, Journal of the American Society for Mass Spectrometry, vol. 22, pp 1070-1078, 2011).
  • the present inventors obtained MALDI mass spectra under various conditions, and conducted a study to measure the temperature (T early ) at the time when ions appearing in the MALDI mass spectrum were produced using the method of Kim et al.
  • the inventors found that changing the various conditions of the ion generation reaction in MALDI results in a different temperature (T early ) at the time of ion generation, but the mass of the ion production reaction temperature in the spectrum obtained under various experimental conditions is the same. Selecting only the spectrum, the present invention has been devised by discovering the surprising fact that the decomposition patterns of the respective ions are identical to each other.
  • the inventors have measured the MALDI mass spectrometry several times while varying the MALDI ionization reaction conditions, comparing the decomposition patterns of each of the matrix ions or sample ions or added substance ions contained in the MALDI mass spectrometry specimens to each other, By selecting only those spectra with the same ion decomposition pattern, the method of the present invention was completed, i.e., a method for measuring reproducible mass spectrometry of ionized materials under the same temperature conditions.
  • the basic object of the present invention comprises the step of selecting only those spectra having the same decomposition pattern of the sample ions among a plurality of mass spectra obtained from ions formed by applying energy to a sample mixed with a matrix and a sample. Characterized in that, it provides a method for measuring the mass spectrum of ions produced at a constant temperature.
  • Still another object of the present invention is a spectrum in which the decomposition pattern of the third material ion is the same among a plurality of mass spectra obtained from ions formed by applying energy (laser) to a sample mixed with a matrix, a sample, and a third material. It is to provide a method for measuring the mass spectrum of ions generated at a constant temperature, characterized in that it comprises the step of screening only.
  • a basic object of the present invention includes selecting only those spectra having the same decomposition pattern of the sample ions among a plurality of mass spectra obtained from ions formed by applying energy to a sample mixed with a matrix and a sample. It can be achieved by providing a method for measuring the mass spectrum of ions generated at a constant temperature.
  • a "matrix” is a material that absorbs energy from an energy source such as a laser and transfers the energy to the analyte, thereby heating and ionizing the analyte.
  • an energy source such as a laser
  • matrices used in MALDI mass spectrometry ⁇ -cyano-4-hydroxycinnamic acid (CHCA), 2,5-dihydroxybenzoic acid (DHB), and sinapinic acid (3,5-dimethoxy-4-hydroxycinnamic acid), 4
  • CHCA ⁇ -cyano-4-hydroxycinnamic acid
  • DVB 2,5-dihydroxybenzoic acid
  • sinapinic acid 3,5-dimethoxy-4-hydroxycinnamic acid
  • the "constant temperature” means a case in which the initial temperatures (T early ) of the plume generated by applying energy to the specimen are the same, that is, the ion production reaction temperature is the same.
  • the ions appearing in the MALDI mass spectrum are protonated analytes (AH + ), protonated matrices (MH + ), and their fragmented products generated inside the ion source.
  • the pattern of the MALDI mass spectrum is determined by the fragmentation pattern of AH + and MH + and the sample to matrix ion ratio.
  • the MALDI mass spectrometry spectra are measured several times while varying the MALDI ionization reaction conditions, and the decomposition patterns of the matrix ions or sample ions or the added third material ions contained in the MALDI mass spectrometry specimens in each spectra are compared with each other, Reproducibility of the ion decomposition pattern in the MALDI mass spectrometry spectrum was ensured by selecting only mass spectra in which the decomposition patterns of the material ions were the same, that is, the production temperatures of these ionized materials were constant.
  • the means for applying energy to the specimen may be a laser.
  • the laser may be a nitrogen laser or Nd: YAG laser.
  • Nd: YAG laser when irradiating the laser on the specimen, it is preferable to obtain a plurality of sample ion spectra by irradiating one point of the specimen multiple times.
  • the means for applying energy to the specimen may be a laser.
  • the laser may be a nitrogen laser or Nd: YAG laser.
  • Still another object of the present invention is a spectrum in which the decomposition pattern of the third material ion is the same among a plurality of mass spectra obtained from ions formed by applying energy (laser) to a sample mixed with a matrix, a sample, and a third material. It can be achieved by a method of measuring the mass spectrum of ions generated at a constant temperature, characterized in that it comprises the step of selecting only them.
  • the means for applying energy to the specimen may be a laser.
  • the laser may be a nitrogen laser or Nd: YAG laser.
  • Example 1 is a conceptual diagram for a method for obtaining the temperature (T early ) of the initial plume of the peptide ion [Y 6 + H] + of Example 1 of the present invention.
  • Example 2 of the present invention repeats a laser pulse of 337 nm at a point on a solid specimen containing 3 pmol of Y 5 R in 25 nmol of ⁇ -cyano-4-hydroxycinnamic acid (CHCA) MALDI spectrum obtained by irradiation with.
  • CHCA ⁇ -cyano-4-hydroxycinnamic acid
  • FIG. 3 is a MALDI spectrum obtained by repeatedly irradiating 337 nm laser pulses to a point on a solid specimen containing 3 pmol of Y 5 K in 25 nmol of CHCA in Example 2 of the present invention.
  • FIG. 4 is a MALDI spectrum obtained by repeatedly irradiating 337 nm laser pulses to a point on a solid specimen containing 3 pmol of angiotensin II (DRVYIHPF) in 25 nmol of CHCA in Example 2 of the present invention. to be.
  • DUVYIHPF angiotensin II
  • FIG. 5 is a graph showing a change in temperature T early of the initial plume according to the specimen thickness in Example 3 of the present invention.
  • Example 6 is a PSD spectrum of [CHCA + H] + of Example 4 of the present invention.
  • the inventors used a self-made MALDI-TOF instrument (Bae, YJ; Shin, YS; Moon, JH; Kim. MS J. Am. Soc. Mass Spectrom. In press; Bae, YJ; Yoon, SH; Moon , JH; Kim, MS Bull.Korean Chem. Soc. 2010 , 31 , 92-99; Yoon, SH; Moon, JH; Choi, KM; Kim, MS Rapid Commun. Mass Spectrom. 2006 , 20 , 2201-2208) .
  • One of the important aspects of the device is that it is equipped with a reflectron having primary and secondary components in the internal voltage (Oh, JY; Moon, JH; Kim, MS J. Am. Soc.
  • the 337 nm output of a nitrogen laser (MNL100, Lasertechnik Berlin, Berlin, Germany) was used for MALDI with a lens with a focal length of 100 mm.
  • 355 nm output of Nd: YAG laser (SL III-10, Continuum, Santa Clara, Calif., USA) was also used in the same lens.
  • the threshold laser pulse energy ie threshold value
  • the threshold value at 355 nm was 0.40 ⁇ J / pulse.
  • the effective temperature (T early ) of the initial plume was determined by making S in the internal energy distribution function smaller than 13.157 eV. Late plume temperature was determined in a similar manner, using 5.4 ⁇ 10 4 s ⁇ 1 as the threshold value for the rate constant. Since the used laser fluence was larger than that in Document 1, the T early value determined at this time was 881 K (Bae, YJ; Moon, JH; Kim, MS J. Am. Soc. Mass Spectrom. 2011 , vol 22, 1070-1078).
  • the intensity of peptide related ions appearing in the MALDI spectrum is measured and the probability of peptide ions surviving in the ion source is obtained therefrom.
  • the highest rate constant at which the peptide ion can survive is determined.
  • the internal energy distribution of the peptide ions is determined while changing the temperature, and the temperature at which the probability of the region smaller than the maximum velocity constant is equal to the survival probability is taken.
  • One set of MALDI spectra was obtained by collecting data while repeatedly irradiating a spot on the specimen with a 337 nm nitrogen laser pulse.
  • a portion of the spectrum obtained by irradiating 200 nm CHCH containing 3 pmol of Y 5 R at 200 times the pulse energy six times the threshold value is shown in FIG. 2.
  • Each spectrum in FIG. 2 is (a) 1 to 20 times, (b) 41 to 60 times, (c) 81 to 100 times, (d) 141 to 160 times, and (e) 181 to 200 times. It is the sum of the spectra over the shot number.
  • FIG. 3 shows the MALDI spectrum obtained by repeatedly irradiating 337 nm laser pulses at a point on a solid specimen containing 3 pmol of Y 5 K in 25 nmol CHCA. And each spectrum was (a) 1 to 20 times, (b) 41 to 60 times, (c) 81 to 100 times, (d) 141 to 160 times, and (e) 181 to 200 times It is the sum of the spectrum over the number of surveys.
  • FIG. 4 shows the MALDI spectrum obtained by repeatedly irradiating 337 nm laser pulses at a point on a solid specimen containing 3 pmol of angiotensin II (DRVYIHPF) in 25 nmol CHCA.
  • DUVYIHPF angiotensin II
  • T early was calculated from S in measured in each spectrum.
  • the variation of T early with the thickness of the specimen is shown in FIG. 5 (stainless steel surface:; fluorocarbon layer: ⁇ ), which means that the thinner the specimen, the more efficient the thermal conductivity.
  • the T early values for the specimens on the fluorocarbon layer were higher than those obtained from the specimens on the exposed metal plate, indicating that the fluorocarbon layer acts as a nonconductor to the heat flow. In conclusion, T early can be determined from the decomposition yield of peptide ions, and the temperature decreases as the irradiation continues.
  • FIG. 8 shows four conditions for specimens with a Y 5 K: CHCA (peptide-to-matrix ratio) of 1: 8300, namely (a) (3, 25, ⁇ 6, 337) (61-80 irradiated water). Range), (b) (3, 25, ⁇ 4, 337) (41-60 irradiation range), (c) (4.2, 35, ⁇ 6, 337) (71-90 irradiation range), and (d In the MALDI spectrum set obtained from (3, 25, ⁇ 6, 355) (21-40 irradiation number range), spectra with T early near 968 K are shown.
  • CHCA peptide-to-matrix ratio

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Description

일정한 온도에서 생성된 이온들의 질량 스펙트럼을 측정하는 방법
본 발명은 일정한 온도에서 생성된 이온들의 질량 스펙트럼을 측정하는 방법에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명은 매트릭스와 시료가 혼합된 시편, 또는 매트릭스와 시료 및 제3물질이 혼합된 시편에 에너지를 가하여 형성되는 이온들로부터 얻어지는 다수의 질량 스펙트럼들 중에서, 상기 시료 이온이나 상기 매트릭스 이온, 또는 상기 제3물질 이온의 분해 패턴이 서로 동일한 스펙트럼들만을 선별하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 일정한 온도에서 생성된 이온들의 질량 스펙트럼을 측정하는 방법에 대한 것이다.
매트릭스-보조 레이저 탈착 이온화(matrix-assisted laser desorption/ionization (MALDI))는 다양한 고체 시료를 이온화시킬 수 있는 방법이다. 대개 비행시간형(time-of-flight (TOF)) 질량 분석관에 연결되어 MALDI-TOF 형태로 사용된다. MALDI-TOF는 감도가 좋고, 적용 범위가 넓으며, 분석 시간이 짧아 여러 가지 고체 물질, 특히 생물 분자 구조 분석에 널리 사용된다.
그러나 MALDI의 단점은 스펙트럼의 패턴의 재현성이 매우 나쁘다는 점이다. 시편의 동일한 위치를 레이저로 반복적으로 조사하여 스펙트럼을 얻는 경우에도 스펙트럼의 패턴은 계속 달라진다. 이렇게 MALDI 질량 스펙트럼 패턴의 재현성이 나쁘기 때문에, MALDI 스펙트럼의 산업적 또는 과학적 응용범위가 매우 제한을 받고 있다. 따라서 본 발명은 MALDI 질량 스펙트럼 패턴의 재현성을 개선하기 위한 것을 기본적인 목적으로 한다.
동일한 MALDI 질량분석기를 사용하여 동일한 시편에 대한 질량 스펙트럼을 얻는다 하더라도, 시편을 준비하는 방법, 시편에 레이저가 도달하는 위치, 사용된 레이저의 파장, 레이저의 펄스 에너지, 레이저가 도달하는 지점(spot) 크기, 동일한 지점에 레이저를 조사한 횟수, 등에 따라 얻어지는 질량 스펙트럼 패턴이 동일하지 아니함이 널리 알려져 있다.
이러한 스펙트럼 패턴의 재현성의 결여는 MALDI 질량분석법을 이용한 기초 연구, 정밀 분석, 표준화 등에 있어서 심각한 문제가 되고 있다. MALDI 질량분석법이 감도가 매우 감도가 높고, 사용이 편리하며, 다양한 분석시료에 대해 신속히 적용할 수 있는 기술이라는 점을 감안할 때, MALDI의 스펙트럼 패턴의 재현성을 개선할 수 있다면 그 응용성은 대폭 확대될 것으로 예상된다.
MALDI의 시편은 통상 시료와 매트릭스의 혼합물이므로, MALDI 질량 스펙트럼에는 분석시료 이온(analyte, AH+)과 그 분해 생성물, 그리고 매트릭스 이온(matrix, MH+)과 그 분해 생성물이 나타난다. 따라서 MALDI 스펙트럼의 패턴은 AH+와 MH+의 분해 패턴과 AH+와 MH+의 세기 비율에 의해 결정된다.
MALDI에 의해 형성된 이온은 이온원 내부(in-source decay, ISD) 또는 외부에서 깨질 수 있다(post-source decay, PSD). ISD는 반응속도가 빠르며 빨리 종결되는 반면 PSD는 반응속도가 느리다. 이러한 분석시료 이온의 분해 반응속도와 수율은 반응속도 상수와 이온의 내부 에너지에 의해 결정된다. 따라서 MALDI에서 레이저 펄스에 의해 생성되는 플룸(plume)의 유효 온도를 알면 내부 에너지를 알 수 있게 되고, 이것을 사용해 반응 속도를 구할 수 있다.
MALDI에서 시편에 레이저를 조사할 때 생성되는 이온들을 포함하고 있는 기체인 플룸(plume)의 온도를 알아내기 위한 많은 과학적 연구가 이루어진 바 있다. Mowry 등은 레이저에 의해 탈착된 중성 분자의 광이온화에 의해 온도를 추정해보았으며(J. Phys. Chem. 1994, 98, 1904-1909), Yergey 등은 in-source decay (ISD) 수율로부터 온도를 추정해보았고(J. Am. Soc. Mass Spectrom. 2007, 18, 607-616), Zenobi 등은 레이저 펄스를 흡수한 시료가 방출하는 빛을 측정하여 온도를 추정하였다(J Phys. Chem. A 2004, 108, 2405-2410).
그러나 플룸의 온도를 측정하는 가장 체계적인 방법은 본 발명자들의 연구에 의하여 최초로 제시되었다(J. Phys. Chem. B 2009, 113. 2071-2076). 본 발명자들은 시간 분별 광분해 스펙트럼과 PSD 스펙트럼을 반응속도론적으로 분석하여, 이온의 분해 반응 속도와 유효 온도를 얻는 데 성공하였다. 또한, 이렇게 얻어지는 온도는 말기 플룸의 온도(Tlate)임을 인지하였다. 본 발명자들은 이렇게 얻은 반응 속도 함수를 사용하여 ISD 수율을 분석함으로써 초기 플룸 온도(Tearly)도 결정할 수 있었다(도 1).
본 발명자들은, 우선 MALDI 질량 스펙트럼에서 펩타이드 이온의 ISD, PSD 등에 의해 만들어지는 분해 이온 생성물들의 세기를 측정한다. 이 자료로부터 이온원 출구에서 펩타이드 이온의 생존 확률(Sin)을 계산한다. 실험 조건을 고려하여 펩타이드 이온이 이온원 출구에서 생존할 수 있는 최고 속도상수를 구하고, 펩타이드 이온의 분해 속도상수로부터 그에 해당하는 최고 내부 에너지를 결정한다. 온도를 바꾸어 가면서 펩타이드 이온의 내부 에너지 분포를 구하고 최고 내부 에너지보다 작은 영역의 확률이 Sin과 같아지는 온도를 취함으로써 Tearly를 결정한다.
본 발명자들이 고안한 방법에 의해 결정된 이온 함유 기체(플룸)의 초기 및 말기의 온도는 선행 연구자들이 보고한 결과와 대체로 일치하였다. 그러나 다른 연구자들에 의해 고안된 방법들에 비해 방법론적으로 훨씬 더 체계적이며 임의성이 없어서 보편적 적용이 가능하다는 장점이 있다(Journal of The American Society for Mass Spectrometry, 2011, vol. 22, pp1070-1078).
본 발명자들은, MALDI 질량 스펙트럼의 이온 분해 패턴의 재현성을 달성하기 위하여 다양한 방법을 시도한 결과, 이온 생성 반응의 온도를 일정하게 유지함으로써 이온 분해 패턴의 재현성이 향상된다는 사실을 발견하였다. 예를 들면, 펄스 에너지가 비교적 낮은 레이저 광선을 조사하여 생성되는 이온들을 포함한 플룸(plume)의 온도를 비교적 일정하게 유지함으로써, 시편에 함유된 물질들로부터 생성되는 이온들의 분해 패턴이 비교적 일정하게 재현되는 질량 스펙트럼을 측정할 수 있었다.
또 다른 방법으로서, 본 발명자들은 레이저 광선의 조사 횟수를 적게 하여 이온들이 생성되는 반응의 온도를 비교적 일정하게 유지함으로써, 시편에 존재하는 물질들로부터 생성되는 이온들의 분해 패턴이 비교적 일정하게 나타나는 질량 스펙트럼을 측정할 수도 있었다.
본 발명자들은, 또 다른 방법으로서, 시편을 주변과 단열하여 온도 변화를 최소화함으로써 생성되는 이온들이 함유된 플룸의 온도를 비교적 일정하게 유지하면, MALDI 질량 스펙트럼의 패턴의 재현성이 크게 향상된다는 사실을 확인할 수 있었다.
본 발명자들은 펩타이드 이온에 대한 광분해 반응의 선행 연구를 통하여, 이들 이온의 분해 반응의 속도 상수를 구했으며, 이를 이용하여 MALDI에 의해 생성되는 각종 이온을 포함하는 기체(소위, 플룸)의 초기 온도(Tearly)를 구할 수 있는 방법을 제시한 사실이 있다(Yong Jin Bae, Jeong Hee Moon, and Myung Soo Kim, Expansion Cooling in the Matrix Plume is Under-Recognized in MALDI Mass Spectrometry, Journal of The American Society for Mass Spectrometry, vol. 22, pp1070-1078, 2011). 또한, 본 발명자들은 다양한 조건에서 MALDI 질량 스펙트럼들을 얻고, 상기 Kim 등의 방법을 사용하여 MALDI 질량 스펙트럼에 나타나는 이온들이 생성될 당시의 온도(Tearly)를 측정하는 연구를 진행하였다.
이러한 연구를 통하여, 본 발명자들은, MALDI에서 이온 생성 반응의 여러 가지 조건을 변화시키면 이온들이 생성될 당시의 온도(Tearly)가 달라지지만, 다양한 실험 조건 하에서 얻은 스펙트럼 중 이온 생성 반응 온도가 동일한 질량 스펙트럼 만을 선택하여 살펴보면, 각 이온들의 분해 패턴이 각각 서로 동일하다는 놀라운 사실을 발견함으로써 본 발명을 착안하게 되었다.
특히, 펩타이드에 대한 MALDI 연구에서, 본 발명자들은 MALDI 스펙트럼 패턴의 재현성 문제의 큰 원인이 이온 생성 반응의 온도의 변화 때문임에 주목하여, 매트릭스와 펩타이드를 포함하는 시편으로부터 다양한 이온화 반응 조건에서 얻어낸 다수의 스펙트럼들 중 이온 생성 반응 온도가 일정한 것들만을 선별함으로써, MALDI 질량 분석 스펙트럼의 재현성을 확보할 수 있었다.
본 발명자들은 MALDI 이온화 반응 조건을 바꾸면서 MALDI 질량 분석 스펙트럼을 수차례 측정하여, 각 스펙트럼에서 MALDI 질량 분석 시편에 함유된 매트릭스 이온 또는 시료 이온 또는 첨가된 물질 이온 각각의 분해 패턴을 서로 비교하고, 이들 물질의 이온 분해 패턴이 동일한 스펙트럼만을 선별함으로써, 본 발명의 방법, 즉 동일한 온도 조건에서 이온화된 물질들의 재현성 있는 질량 분석 스펙트럼을 측정하는 방법을 완성하였다.
따라서 본 발명의 기본적인 목적은 매트릭스와 시료가 혼합된 시편에 에너지를 가하여 형성되는 이온들로부터 얻어지는 다수의 질량 스펙트럼들 중에서, 상기 시료 이온의 분해 패턴이 서로 동일한 스펙트럼들만을 선별하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 일정한 온도에서 생성된 이온들의 질량 스펙트럼을 측정하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 매트릭스와 시료가 혼합된 시편에 에너지를 가하여 형성되는 이온들로부터 얻어지는 다수의 질량 스펙트럼들 중에서, 상기 매트릭스 이온의 분해 패턴이 서로 동일한 스펙트럼들만을 선별하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 일정한 온도에서 생성된 이온들의 질량 스펙트럼을 측정하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 매트릭스와 시료와 제3물질이 혼합된 시편에 에너지(레이저)를 가하여 형성되는 이온들로부터 얻어지는 다수의 질량 스펙트럼들 중에서, 상기 제3물질 이온의 분해 패턴이 서로 동일한 스펙트럼들만을 선별하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 일정한 온도에서 생성된 이온들의 질량 스펙트럼을 측정하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 기본적인 목적은 매트릭스와 시료가 혼합된 시편에 에너지를 가하여 형성되는 이온들로부터 얻어지는 다수의 질량 스펙트럼들 중에서, 상기 시료 이온의 분해 패턴이 서로 동일한 스펙트럼들만을 선별하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 일정한 온도에서 생성된 이온들의 질량 스펙트럼을 측정하는 방법을 제공함으로써 달성될 수 있다.
본 명세서에서 "매트릭스"란 레이저와 같은 에너지원으로부터 에너지를 흡수하여 그 에너지를 분석시료에 전달함으로써, 분석시료를 가열하고 이온화시키는 물질이다. MALDI 질량분석에서 사용되는 매트릭스로서 CHCA(α-cyano-4-hydroxycinnamic acid), DHB(2,5-dihydroxybenzoic acid), 시나핀산(sinapinic acid (3,5-dimethoxy-4-hydroxycinnamic acid)), 4-하이드록시-3-메톡시시나민산(4-hydroxy-3-methoxycinnamic acid), 피콜린산(picolinic acid), 3-하이드록시피콜린산(3-hydroxy picolinic acid) 외에 다양한 물질들이 알려져 있다.
전형적인 MALDI 질량분석에서는, 매트릭스(M)와 극미량의 분석시료(A)로 이루어진 고체 시편에 레이저 펄스를 조사한다. 매트릭스는 상기 레이저를 흡수하여 상기 분석할 시료를 가열하고 이온화하는 것을 돕는다. MALDI 질량 스펙트럼은 매트릭스 이온과 시료 이온의 분해 혼합물의 스펙트럼이다.
본 명세서에서 "일정한 온도"란 시편에 에너지를 가하여 생성되는 플룸의 초기 온도(Tearly)가 서로 동일한 경우, 즉 이온 생성 반응 온도가 동일한 경우를 의미한다.
대개, MALDI 질량 스펙트럼에 나타나는 이온들은 양성자화된 분석시료(AH+), 양성자화된 매트릭스(MH+), 및 이온원 내부에서 생성된 이들의 토막(fragmented) 생성물들이다. 따라서 MALDI 질량 스펙트럼의 패턴은 AH+와 MH+의 토막 패턴(fragmentation pattern) 및 시료 대 매트릭스 이온 비율에 의해 결정된다.
본 발명자들은 MALDI의 초기 단계에서 Tearly가 특정되면 상기 세 가지 인자 모두가 결정된다는 점을 밝혔다(Bae, Y. J.; Moon, J. H.; Kim, M. S. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 2011, 22, 1070-1078; Yoon, S. H.; Moon, J. H.; Kim, M. S. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 2010, 21, 1876-1883). 보다 상세하게는, 상기 매트릭스와 분석시료 간의 양성자 교환 반응인 MH+ + A → M + AH+이 거의 열적 평형에 있다는 사실을 발견하였다.
더욱이, MALDI에서 이온 생성 반응의 여러 가지 조건을 변화시키면 이온들이 생성될 당시의 온도(Tearly)가 달라지지만, 다양한 실험 조건 하에서 얻은 스펙트럼 중 이온 생성 반응 온도가 동일한 질량 스펙트럼 만을 선택하여 살펴보면, 각 이온들의 분해 패턴이 각각 서로 동일하다. 이러한 현상은 분석시료는 물론, 매트릭스와 제3물질을 포함하는 경우에도 동일하게 나타난다.
따라서, MALDI 이온화 반응 조건을 바꾸면서 MALDI 질량 분석 스펙트럼을 수차례 측정하고, 각 스펙트럼에서 MALDI 질량 분석 시편에 함유된 매트릭스 이온 또는 시료 이온 또는 첨가된 제3물질 이온 각각의 분해 패턴을 서로 비교하여, 이들 물질 이온들 각각의 분해 패턴이 동일한, 즉 이들 이온화된 물질들의 생성온도가 일정한 질량 스펙트럼만을 선별함으로써, MALDI 질량 분석 스펙트럼에서의 이온 분해 패턴의 재현성을 확보하였다.
일정한 온도에서 생성된 이온들의 질량 스펙트럼을 측정하는 본 발명의 방법에 있어서, 상기 시편에 에너지를 가하는 수단이 레이저일 수 있다. 또한, 상기 레이저는 질소 레이저 또는 Nd:YAG 레이저일 수 있다. 더욱이, 상기 레이저를 시편에 조사함에 있어서, 상기 시편의 한 지점에 다수회 조사하여 다수개의 시료 이온 스펙트럼을 얻는 것이 바람직하다.
본 발명의 또 다른 목적은 매트릭스와 시료가 혼합된 시편에 에너지를 가하여 형성되는 이온들로부터 얻어지는 다수의 질량 스펙트럼들 중에서, 상기 매트릭스 이온의 분해 패턴이 서로 동일한 스펙트럼들만을 선별하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 일정한 온도에서 생성된 이온들의 질량 스펙트럼을 측정하는 방법을 제공함으로써 달성될 수 있다.
본 발명의 일정한 온도에서 생성된 이온들의 질량 스펙트럼을 측정하는 방법에 있어서, 상기 시편에 에너지를 가하는 수단이 레이저일 수 있다. 또한, 상기 레이저는 질소 레이저 또는 Nd:YAG 레이저일 수 있다.
더욱이, 상기 레이저를 시편에 조사함에 있어서, 상기 시편의 한 지점에 다수회 조사하여 다수개의 매트릭스 이온 스펙트럼을 얻는 것이 바람직하다.
본 발명의 또 다른 목적은 매트릭스와 시료와 제3물질이 혼합된 시편에 에너지(레이저)를 가하여 형성되는 이온들로부터 얻어지는 다수의 질량 스펙트럼들 중에서, 상기 제3물질 이온의 분해 패턴이 서로 동일한 스펙트럼들만을 선별하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 일정한 온도에서 생성된 이온들의 질량 스펙트럼을 측정하는 방법함으로써 달성될 수 있다.
본 발명의 일정한 온도에서 생성된 이온들의 질량 스펙트럼을 측정하는 방법에 있어서, 상기 시편에 에너지를 가하는 수단이 레이저일 수 있다. 또한, 상기 레이저는 질소 레이저 또는 Nd:YAG 레이저일 수 있다.
더욱이, 상기 레이저를 시편에 조사함에 있어서, 상기 시편의 한 지점에 다수회 조사하여 다수개의 제3물질 이온 스펙트럼을 얻는 것이 바람직하다.
본 발명의 방법에 따라 일정한 온도에서 생성된 이온들의 MALDI 스펙트럼만을 선택함으로써, 종래의 MALDI 질량분석법의 단점인 재현성이 좋지 않다는 점을 극복할 수 있다.
도 1은 본 발명의 실시예 1의 펩타이드 이온 [Y6 + H]+의 초기 플룸의 온도(Tearly)를 구하는 방법에 대한 개념도이다.
도 2는, 본 발명의 실시예 2에서, 25 nmol의 CHCA(α-cyano-4-hydroxycinnamic acid)에 3 pmol의 Y5R이 함유된 고체 시편 위의 한 점에 337 nm의 레이저 펄스를 반복적으로 조사하여 얻은 MALDI 스펙트럼이다.
도 3은, 본 발명의 실시예 2에서, 25 nmol의 CHCA에 3 pmol의 Y5K가 함유된 고체 시편 위의 한 점에 337 nm의 레이저 펄스를 반복적으로 조사하여 얻은 MALDI 스펙트럼이다.
도 4는, 본 발명의 실시예 2에서, 25 nmol의 CHCA에 3 pmol의 앤지오텐신 II(DRVYIHPF)가 함유된 고체 시편 위의 한 점에 337 nm의 레이저 펄스를 반복적으로 조사하여 얻은 MALDI 스펙트럼이다.
도 5는, 본 발명의 실시예 3에서, 시편 두께에 따른 초기 플룸의 온도(Tearly)의 변화를 보여주는 그래프이다.
도 6은 본 발명의 실시예 4의 [CHCA + H]+의 PSD 스펙트럼이다.
도 7은 본 발명의 실시예 5의 Y5R:CHCA = 1:8300인 시편으로부터 얻은 MALDI 스펙트럼들 중 Tearly가 968 K 근처인 스펙트럼들이다.
도 8은 본 발명의 실시예 5의 Y5K:CHCA = 1:8300인 시편으로부터 얻은 MALDI 스펙트럼들 중 Tearly가 968 K 근처인 스펙트럼들이다.
도 9는 본 발명의 실시예 5의 앤지오텐신 II(DRVYIHPF):CHCA = 1:8300인 시편으로부터 얻은 MALDI 스펙트럼들 중 Tearly가 968 K 근처인 스펙트럼들이다.
이하, 다음의 실시예 또는 도면을 들어 본 발명을 보다 구체적으로 설명하고자 한다. 그러나 다음의 실시예 또는 도면에 대한 설명은 본 발명의 구체적인 실시 태양을 특정하여 설명하고자 하는 것일 뿐이며, 본 발명의 권리 범위를 이들에 기재된 내용으로 한정하거나 제한 해석하고자 의도하는 것은 아니다.
실험
본 발명자들이 자체 제작한 MALDI-TOF 기기를 사용하였다(Bae, Y. J.; Shin, Y. S.; Moon, J. H.; Kim. M. S. J. Am. Soc. Mass Spectrom. in press; Bae, Y. J.; Yoon, S. H.; Moon, J. H.; Kim, M. S. Bull. Korean Chem. Soc. 2010, 31, 92-99; Yoon, S. H.; Moon, J. H.; Choi, K. M.; Kim, M. S. Rapid Commun. Mass Spectrom. 2006, 20, 2201-2208). 상기 기기의 중요한 측면 중 하나는 내부 전압에 일차와 이차 성분이 있는 리플렉트론(reflectron)을 장착하고 있다는 점이다(Oh, J. Y.; Moon, J. H.; Kim, M. S. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 2004, 15, 1248-1259; Bae, Y. J.; Yoon, S. H.; Moon, J. H.; Kim, M. S. Bull. Korean Chem. Soc. 2010, 31, 92-99). 따라서 프롬프트 이온(prompt ion)과 이들의 ISD와 PSD 생성물을 동시에 검출할 수 있다(Bae, Y. J.; Moon, J. H.; Kim, M. S. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 2011, 22, 1070-1078).
별도의 언급이 없으면, 질소 레이저(MNL100, Lasertechnik Berlin, Berlin, Germany)의 337 nm 출력을 초점 거리가 100 mm인 렌즈로 모아 MALDI에 사용하였다. 또한, Nd:YAG 레이저(SL III-10, Continuum, Santa Clara, CA, USA)의 355 nm 출력도 같은 렌즈로 모아 사용하였다.
신호 대 잡음 비를 개선하기 위하여, 20회의 레이저 조사로 얻은 스펙트럼을 합하였다. 그리고 20 개의 다른 지점들에서 얻은 스펙트럼 중 조사수가 같은 것들을 합하였다. 따라서 최종 스펙트럼의 각 점은 400회의 레이저 조사로 얻은 결과를 합한 것이다. 각 봉우리를 이루는 이온의 개수를 계산하는 방법은 문헌에 보고된 바를 따른다(Bae, Y. J.; Shin, Y. S.; Moon, J. H.; Kim. M. S. J. Am. Soc. Mass Spectrom. in press; Moon, J. H.; Shin, Y. S.; Bae, Y. J.; Kim, M. S. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 2012, 23, 162-170).
337 nm를 사용한 펩타이드 CHCA-MALDI에 있어서 역치 레이저 펄스 에너지, 즉 역치값은 0.50 μJ/pulse였다. 레이저 빔의 모습이 개선되었기 때문에, 이 값은 종래 문헌에 보고된 값인 0.75 μJ/pulse(Bae, Y. J.; Shin, Y. S.; Moon, J. H.; Kim. M. S. J. Am. Soc. Mass Spectrom. in press; Moon, J. H.; Shin, Y. S.; Bae, Y. J.; Kim, M. S. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 2012, 23, 162-170) 보다 작았다. 355 nm에서 역치값은 0.40 μJ/pulse였다.
시료로서 펩타이드 Y5X(Y = 티로신, X = K(리신) 또는 R(아르기닌); Peptron, 대전, 대한민국), 앤지오텐신 II(DRVYIHPF; Sigma, St. Louis, MO, USA) 및 CHCA(Sigma, St. Louis, MO, USA)를 사용하였다. 각 펩타이드의 저장 수용액을 희석하여 필요한 농도를 만든 후, 물과 아세토니트릴을 용매로 사용하여 만든 CHCA 용액과 혼합하였다. 각 혼합물 1 μL를 타겟에 올린 후 진공 건조하였다. 시편은 25 nmol의 CHCA와 1 또는 3 pmol의 펩타이드로 구성되었다.
실시예 1. Tearly 를 구하는 방법
본 발명자들의 초기 플룸(early plume)의 온도를 구하는 반응속도론적 방법을 따른다(Bae, Y. J.; Moon, J. H.; Kim, M. S. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 2011, vol 22, 1070-1078; Yoon, S. H.; Moon, J. H.; Kim, M. S. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 2010, vol 21, 1876-1883).
먼저 ISD, PSD, 그리고 ISD의 PSD에 의해 만들어지는 생성물의 상대적 세기를 MALDI-TOF 스펙트럼에서 측정하였다. 이 자료로부터 이온원 출구에서 펩타이드 이온의 생존 확률(Sin)과 검출기에서의 생존 확률을(Spost) 계산하였다. [Y6 + H]+의 분해의 경우, 상기 이온의 총 분해 속도상수는, k(E), 시간 분별 광분해 연구(Yoon, S. H.; Moon, J. H.; Kim, M. S. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 2009, 20, 1522-1529)에서 이미 결정하였다. 반응속도론적 분석에서 50 ns를 ISD의 역치수명(threshold lifetime)으로 잡았으며, 이것은 반응속도상수로는 1.4×107 s-1에 해당하고 내부 에너지로는 13.157 eV에 해당한다. 그 다음에, 내부에너지 분포 함수에서 13.157 eV보다 작은 부분이 Sin이 되도록 함으로써 초기 플룸의 유효 온도를(Tearly) 결정하였다. 말기 플룸(late plume) 온도 역시 유사한 방법으로 결정하였는데, 이때는 5.4×104 s-1를 속도상수의 역치값으로 사용하였다. 사용한 레이저 플루엔스(fluence)가 문헌 1에서보다 컸으므로 이번에 결정한 Tearly 값은 본 발명자들이 종래에 보고한 881 K(Bae, Y. J.; Moon, J. H.; Kim, M. S. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 2011, vol 22, 1070-1078)보다 다소 높았다.
앞서 설명한 방법에서, 반응속도론적 방법에 의해 펩타이드의 온도를 구하려면 그것의 분해 반응 속도상수 k(E)를 알아야 한다. 본 발명자들의 방법을 역으로 사용함으로써 k(E)를 구할 수 있음을 보였으며, [Y5R + H]+의 분해 반응에 대해 파라미터 E0 = 0.660 eV와 ΔS‡ = -27.2 eu(1 eu = 4.184 J mol-1 K-1), 그리고 [Y5K + H]+의 분해 반응에 대해 파라미터 E0 = 0.630 eV와 ΔS‡ = -27.6 eu를 보고하였다. 이 파라미터들을 사용하여 각 펩타이드 이온의 RRKM(Rice-Ramsperger-Kassel-Marcus) 속도 함수(k(E))를 계산하였으며, 그 결과를 사용하여 다양한 실험 조건하에서의 Tearly를 구할 수 있다.
펩타이드 이온 [Y6 + H]+에 대한 도 1을 참조하면, MALDI 스펙트럼에 나타나는 펩타이드 관련 이온들의 세기를 측정하고, 이로부터 이온원 내에서 펩타이드 이온이 생존할 확률을 구한다. MALDI 측정 조건을 고려하여 펩타이드 이온이 생존할 수 있는 최고 속도상수를 구한다. 이후, 온도를 변화시키면서 펩타이드 이온의 내부에너지 분포를 구하고 최고 속도상수보다 작은 영역의 확률이 생존 확률과 같아지는 온도를 취한다.
실시예 2. 조사수(shot number)에 따른 전체 스펙트럼 패턴의 변화
시편 위의 한 지점(spot)을 337 nm 질소 레이저 펄스로 반복적으로 조사하면서 데이터를 수집함으로써 한 세트의 MALDI 스펙트럼을 얻었다. 25 nmol의 CHCA에 3 pmol의 Y5R이 함유된 시편을 역치값의 여섯배 펄스 에너지로 200회 조사하여 얻은 스펙트럼의 일부가 도 2에 나타나 있다. 도 2의 각 스펙트럼은 (a) 1회 내지 20회, (b) 41회 내지 60회, (c) 81회 내지 100회, (d) 141회 내지 160회 및 (e) 181회 내지 200회의 조사수(shot number)에 걸친 스펙트럼을 합한 것이다. 펩타이드([Y5R + H]+)와 매트릭스([CHCA + H]+) 이온들뿐 아니라, 이들의 ISD 생성물들, 예를 들면, 펩타이드 이온에서 만들어지는 임모니움 이온 Y와 매트릭스 이온에서 만들어지는 [CHCA + H - H2O]+와 [CHCA + H - CO2]+뿐만 아니라, 매트릭스 이량체 이온([2CHCA + H]+)도 상기 스펙트럼에 나타나 있다(PSD 피크들은 *로 표시하였다). 상기 스펙트럼에는 펩타이드 이온의 분해 생성물인 b, y, 그리고 이들의 분해 생성물도 나타나 있는데, 그 세기는 임모니움 Y보다 매우 작다. 펩타이드 이온의 PSD 생성물 봉우리도 매우 작게 나타나 있다. 작지만 분명히 나타나는 봉우리들의 대부분은 매트릭스로부터 만들어진 것들이다. 도 2에 나타나는 이온들의 종류는 조사수와 관계없이 같지만, 조사수가 변함에 따라 그들의 상대 세기는 변함을 볼 수 있다. 놀랍게도, 조사수에 따른 스펙트럼 패턴의 변화 양상이 재현성 있음을 관측하였으며, 그 오차는 10-20 조사(shot)에 불과하였다.
전술한 바와 같이, MALDI 스펙트럼의 전체 패턴을 특징 지우는 세 가지 요소는 펩타이드 이온과 매트릭스 이온의 상대적 세기, 그리고 펩타이드 이온과 매트릭스 이온의 분해 패턴이다. 도 2에서 볼 수 있는 바와 같이, 조사(shot)가 계속됨에 따라 이 세 가지 요소가 모두 변화하였다. 첫째, 펩타이드 이온에 대한 임모니움 이온 Y의 상대 세기는 서서히 감소하였다(다른 ISD 생성물도 역시 감소하였음). 둘째, 매트릭스의 질량 스펙트럼 패턴 역시 서서히 변화하였는데, 특히 [CHCA + H - CO2]+ 이온이 약해졌다. 셋째, 펩타이드에서 유래한 이온들이 CHCA에서 유래한 이온들에 대해 상대적으로 더 많아졌다.
Y5K(도 3)와 앤지오텐신(angiotensin) II(도 4)에 대해서도 비슷한 경향이 관찰되었다. 도 3에는 25 nmol의 CHCA에 3 pmol의 Y5K가 함유된 고체 시편 위의 한 점에 337 nm의 레이저 펄스를 반복적으로 조사하여 얻은 MALDI 스펙트럼이 나타나 있는데, 사용된 레이저 펄스 에너지는 역치의 6배이었고, 각 스펙트럼은 (a) 1회 내지 20회, (b) 41회 내지 60회, (c) 81회 내지 100회, (d) 141회 내지 160회 및 (e) 181회 내지 200회의 조사수에 걸친 스펙트럼을 합한 것이다. 임모니움 Y 이온이 [Y5K + H]+의 주된 ISD 생성물이고, [CHCA + H - H2O]+와 [CHCA + H - CO2]+가 [CHCA + H]+의 ISD 생성물이다(PSD 피크들은 *로 표시하였다). 도 4에는 25 nmol의 CHCA에 3 pmol의 앤지오텐신 II(DRVYIHPF)가 함유된 고체 시편 위의 한 점에 337 nm의 레이저 펄스를 반복적으로 조사하여 얻은 MALDI 스펙트럼이 나타나 있는데, 사용된 레이저 펄스 에너지는 역치의 6배이었고, 각 스펙트럼은 (a) 1회 내지 20회, (b) 41회 내지 60회, (c) 81회 내지 100회, (d) 141회 내지 160회 및 (e) 181회 내지 200회의 조사수에 걸친 스펙트럼을 합한 것이다. 임모니움 이온, P, V, H, Y가 [DRVYIHPF + H]+의 주된 ISD 생성물이고, [CHCA + H - H2O]+와 [CHCA + H - CO2]+가 [CHCA + H]+의 ISD 생성물이다(PSD 피크들은 *로 표시하였다).
실시예 3. 조사수에 따른 유효 온도의 변화
조사가 계속됨에 따라 생성물의 상대 세기가 감소한다는 것은 펩타이드의 평균 내부 에너지가 감소한다는 것을 의미한다. 초기 플룸에서 열평형이 이루어진다고 가정하면, 이것은 Tearly가 점점 낮아짐을 의미한다. 레이저를 계속 조사할 때 일어나는 일들 중의 하나는 레이저를 조사한 지점의 두께가 점점 얇아지는 것이다. 따라서 시편이 얇아짐에 따라 Tearly가 점점 낮아지게 된다. 시편이 얇아질수록 Tearly가 감소하는 것이 열전도 효율이 좋아지기 때문인지를 확인하기 위하여, 조성이 같고(Y5R:CHCA = 1:25000) 두께가 다른(0.9-2.1 μm) 시편들을 준비하였다. 또한, 50 nm 두께의 플루오로카본(fluorocarbon) 층을 입힌 앵커 칩 플레이트(anchor chip plate)의 소수성 부분 위에 시편을 준비하였다. 레이저 펄스 에너지는 역치의 6 배를 사용했으며, 처음 20회 조사에서 얻은 스펙트럼을 더하였다. 각 스펙트럼에서 측정한 Sin으로부터 Tearly를 계산하였다. 시편의 두께에 따른 Tearly의 변화가 도 5(스테인레스 스틸 표면: ●; 플루오로카본 층: ○)에 나타나 있으며, 이것은 시편이 얇을수록 열전도가 효율적임을 의미한다. 플루오로카본 층 위의 시편에 대해 구한 Tearly는 노출된 금속판 위의 시편으로부터 얻은 값보다 높았으며, 이것은 플루오로카본 층이 열흐름에 대해 부도체로 작용하고 있음을 의미한다. 결론적으로, 펩타이드 이온의 분해 수율로부터 Tearly를 결정할 수 있고, 조사가 계속됨에 따라 온도가 내려간다.
실시예 4. 조사수에 따른 [CHCA + H]+ 분해 패턴의 변화
PSD가 일어나는 시간 영역(대략 10 μs)은 ISD가 일어나는 시간 영역(수십 nanosecond)보다 훨씬 길므로, 즉 PSD의 반응속도가 훨씬 느리므로, 저에너지 반응은 ISD에서보다는 PSD에서 더 유리하다. [CHCA + H]+의 PSD 스펙트럼(도 6)에서, [CHCA + H - H2O]+ 이온이 가장 큰 생성물이었으며, [CHCA + H - CO2]+ 이온은 [CHCA + H - H2O]+의 10%에 불과하였다. 이것은 물의 손실 반응이 이산화탄소의 손실 반응보다 더 저에너지 반응임을 의미한다. 도 2에 있는 MALDI 스펙트럼에서, 조사가 계속됨에 따라, [CHCA + H - H2O]+에 비하여 ISD에 의해 생성된 [CHCA + H - CO2]+ 이온이 감소하였다. 이는 조사가 계속됨에 따라 Tearly가 낮아진다는 의미이다. 즉, CHCA 질량 스펙트럼의 패턴 역시 온도에 의해 결정된다.
실시예 5. 펩타이드-대-매트릭스의 이온 세기 비율
Y5R:CHCA(펩타이드-대-매트릭스의 비율)가 1:8300인 시편들에 대해 네 가지 조건하에서 실험을 수행하였다. 실험 조건을 (Y5R의 # pmol, CHCA의 # nmol, 역치값을 단위로 하는 레이저 펄스 에너지, 레이저 파장)로 표시할 때, 사용한 실험 조건은 (a) (3, 25, ×6, 337)(71-90 조사수 범위), (b) (3, 25, ×4, 337)(51-70 조사수 범위), (c) (4.2, 35, ×6, 337)(101-120 조사수 범위), 그리고 (d) (3, 25, ×6, 355)(31-50 조사수 범위) 이었다. 각 세트로부터 Tearly가 968 K인 스펙트럼을 하나씩 골라내어 네 개의 스펙트럼을 도 7(a)-(d)에 나타냈다. 상기 네 개의 스펙트럼은 사실상 같다. 다른 온도에서도 이러한 유사성이 관측되었다.
또한, Y5K(도 8)와 앤지오텐신 II(도 9)에서도 이러한 유사성이 관측되었다. 도 8에는 Y5K:CHCA(펩타이드-대-매트릭스의 비율)가 1:8300인 시편들에 대해 네 가지 조건, 즉 (a) (3, 25, ×6, 337)(61-80 조사수 범위), (b) (3, 25, ×4, 337)(41-60 조사수 범위), (c) (4.2, 35, ×6, 337)(71-90 조사수 범위), 그리고 (d) (3, 25, ×6, 355)(21-40 조사수 범위)에서 얻은 MALDI 스펙트럼 세트 중 Tearly가 968 K 근처인 스펙트럼들이 나타나 있다. 도 9에는 앤지오텐신 II(DRVYIHPF):CHCA(펩타이드-대-매트릭스의 비율)가 1:8300인 시편들에 대해 네 가지 조건, 즉 (a) (3, 25, ×6, 337)(71-90 조사수 범위), (b) (3, 25, ×4, 337)(31-50 조사수 범위), (c) (4.2, 35, ×6, 337)(81-100 조사수 범위), 그리고 (d) (3, 25, ×6, 355)(21-40 조사수 범위)에서 얻은 MALDI 스펙트럼 세트 중 Tearly가 968 K 근처인 스펙트럼들이 나타나 있다.
즉, Tearly가 같은 스펙트럼들만을 비교한다면, 펩타이드의 MALDI 스펙트럼은 재현될 수 있다. 펩타이드-대-매트릭스 비율이 다른 시편들의 경우에 Tearly가 같은 스펙트럼을 선택하면 펩타이드 이온과 매트릭스 이온의 분해 패턴은 각각 같게 나타났고, 다만 펩타이드-대-매트릭스 이온 세기 비율만이 달랐다.

Claims (12)

  1. 매트릭스와 시료가 혼합된 시편에 에너지를 가하여 형성되는 이온들로부터 얻어지는 다수의 질량 스펙트럼들 중에서, 상기 시료 이온의 분해 패턴이 서로 동일한 스펙트럼들만을 선별하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는,
    일정한 온도에서 생성된 이온들의 질량 스펙트럼을 측정하는 방법.
  2. 제1항의 방법에 있어서, 상기 시편에 에너지를 가하는 수단이 레이저인 것을 특징으로 하는, 일정한 온도에서 생성된 이온들의 질량 스펙트럼을 측정하는 방법.
  3. 제2항의 방법에 있어서, 상기 레이저가 질소 레이저 또는 Nd:YAG 레이저인 것을 특징으로 하는, 일정한 온도에서 생성된 이온들의 질량 스펙트럼을 측정하는 방법.
  4. 제3항의 방법에 있어서, 상기 레이저를 시편에 조사함에 있어서 한 지점에 다수회 조사하는 것을 특징으로 하는, 일정한 온도에서 생성된 이온들의 질량 스펙트럼을 측정하는 방법.
  5. 매트릭스와 시료가 혼합된 시편에 에너지를 가하여 형성되는 이온들로부터 얻어지는 다수의 질량 스펙트럼들 중에서, 상기 매트릭스 이온의 분해 패턴이 서로 동일한 스펙트럼들만을 선별하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는,
    일정한 온도에서 생성된 이온들의 질량 스펙트럼을 측정하는 방법.
  6. 제5항의 방법에 있어서, 상기 시편에 에너지를 가하는 수단이 레이저인 것을 특징으로 하는, 일정한 온도에서 생성된 이온들의 질량 스펙트럼을 측정하는 방법.
  7. 제6항의 방법에 있어서, 상기 레이저가 질소 레이저 또는 Nd:YAG 레이저인 것을 특징으로 하는, 일정한 온도에서 생성된 이온들의 질량 스펙트럼을 측정하는 방법.
  8. 제7항의 방법에 있어서, 상기 레이저를 시편에 조사함에 있어서 한 지점에 다수회 조사하는 것을 특징으로 하는, 일정한 온도에서 생성된 이온들의 질량 스펙트럼을 측정하는 방법.
  9. 매트릭스와 시료와 제3물질이 혼합된 시편에 에너지(레이저)를 가하여 형성되는 이온들로부터 얻어지는 다수의 질량 스펙트럼들 중에서, 상기 제3물질 이온의 분해 패턴이 서로 동일한 스펙트럼들만을 선별하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는,
    일정한 온도에서 생성된 이온들의 질량 스펙트럼을 측정하는 방법.
  10. 제9항의 방법에 있어서, 상기 시편에 에너지를 가하는 수단이 레이저인 것을 특징으로 하는, 일정한 온도에서 생성된 이온들의 질량 스펙트럼을 측정하는 방법.
  11. 제10항의 방법에 있어서, 상기 레이저가 질소 레이저 또는 Nd:YAG 레이저인 것을 특징으로 하는, 일정한 온도에서 생성된 이온들의 질량 스펙트럼을 측정하는 방법.
  12. 제11항의 방법에 있어서, 상기 레이저를 시편에 조사함에 있어서 한 지점에 다수회 조사하는 것을 특징으로 하는, 일정한 온도에서 생성된 이온들의 질량 스펙트럼을 측정하는 방법.
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