WO2014009589A2 - Utilización de señales de localización nuclear de proteínas de bacteriófagos como vehículo para transferencia de genes - Google Patents

Utilización de señales de localización nuclear de proteínas de bacteriófagos como vehículo para transferencia de genes Download PDF

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    • C12N2810/6009—Vectors comprising as targeting moiety peptide derived from defined protein from viruses dsDNA viruses

Definitions

  • the present invention is part of the chemistry and pharmacy sector, specifically in the biotechnology sector, for the introduction of DNA in a directed and controlled way into the cell nucleus.
  • the present invention refers to the identification of prokaryotic protein sequences, which function as nuclear localization signals (NLSs) in eukaryotic cells, and which covalently bind to the DNAs to be transported to the cell nucleus.
  • NLSs nuclear localization signals
  • nucleus cover constitutes a segregation barrier that facilitates the compartmentalization of complex processes such as genome replication, gene expression, signal transduction and cell cycle.
  • compartmentalization involves the specific transport of proteins and nucleic acids that must be carried out by the cellular machinery with which proteins from both the cells themselves and from viruses and endosymbiotic microorganisms interact.
  • transport occurs through large membrane structures that are called nuclear pore complexes ("Nuclear Pore Complex", NPC), which comprise approximately 50 proteins called “nucleoporins" as a whole.
  • NPC nuclear pore complexes
  • Molecules of up to 40-50 kDa can passively diffuse through nuclear pores, while most proteins with functions inside the nucleus require an energy-dependent transport process, mediated by a series of proteins transporters or "carioferinas" (Xu D. et al. 2010).
  • the best known protein transport pathway is mediated by the so-called “classical nuclear localization signal” (cNLS), which is recognized by the importin- ⁇ .
  • cNLS classical nuclear localization signal
  • Importin- ⁇ is an adapter protein, because it in turn requires binding to ⁇ -carioferin, with the importin-a-carioferin-p-charge trimeric complex that can enter the nucleus.
  • Classic NLS can be divided into monopartite and bipartite. The monopartite NLS comprise a single group
  • cluster of basic residues, while bipartite sequences comprise two groups of basic residues separated by a 10-12 amino acid spacer (Xu D. et al. 2010).
  • other import signals and routes have been characterized, such as PY-NLS, which can be directly linked to ⁇ -carioferin.
  • PY-NLS which can be directly linked to ⁇ -carioferin.
  • NLS for some proteins a classical NLS has not been identified, or its region responsible for importing into the nucleus does not fall within any of the classes already defined.
  • DNA binding regions A common feature in many nuclear proteins is the presence of nucleic acid binding regions. Since positively charged amino acids are abundant in these regions, it is common that the eukaryotic DNA binding domains also comprise NLSs (Turlure F. et al. 2006; Silver P.A. et al. 1986); however, many NLSs that have been predicted do not overlap with DNA binding domains. The requirement of transport to the nucleus would have been preceded by protein-DNA interactions. Therefore, it has been proposed that DNA binding regions can be the origin of the signals used to compartmentalize all the processes in which DNA participates (LaCasse E.C. & Lefebvre Y. A. 1995; Cokol M. et al. 2000).
  • prokaryotic proteins comprising sequences that function as NLSs when expressed or released in eukaryotic cells have also been described in the state of the art. In some cases, these prokaryotic proteins are produced by pathogenic or symbiotic bacteria to perform or influence some functions within the host cell. However, in other cases, The biological function of an NLS in prokaryotic proteins is unclear, as is the case of the NLSs found in the terminal proteins (TP) of the chromosomes and linear plasmids of Streptomyces bacteria (Tsai HH et al. 2008). These TPs are covalently linked to the 5 'ends of linear DNAs and are necessary for the replication and stability of telomere-like ends.
  • TP terminal proteins
  • the predicted NLS may be hidden or in a non-functional conformation due to protein folding.
  • the NLStradamus and cNLS mapper programs find up to 5 different NLSs with significance 4 over 7 or higher and it is known that said RNA polymerase is not able to go to the nucleus by itself. Due to this and taking into account only the information of the Streptomyces TPs, there is currently no clear evidence indicating the presence of functional NLSs in bacteriophage terminal proteins.
  • TP DNA replication
  • viruses and plasmids with very diverse hosts, such as bacteriophages that infect Gram positive bacteria ( ⁇ 29, Cp-1) and Gram negative bacteria (PRD1), bacterial plasmids and Adenovirus (Rooms M. 1991).
  • the method used to determine the identity of a sequence of a terminal protein covalently linked to the 5 'ends of a DNA genome is carried out in several steps.
  • an amount of the phage genome is obtained by proteolytic treatment (with proteinase K or trypsin) of the purified virion and extraction with organic solvents of the DNA of said virion.
  • the DNA ends are then identified by restriction enzyme analysis.
  • the DNA of the ends or of the entire genome can be degraded by nuclease treatment.
  • the peptide obtained can be determined by mass spectrometry or Edman degradation.
  • the other method for recording terminal proteins is based on the fact that in the database there is a protein with a similarity equal to or greater than 58% to a terminal protein whose DNA covalent binding sequence is known (as an example, similarity of GA-1 regarding ⁇ 29).
  • TP-based DNA replication is that of phage ⁇ 29 from Bacillus subtilis (Salas M. 1991). Unlike Streptomyces plasmids and chromosomes, all ⁇ 29 DNA replication depends on TP, not just telomere replication, because the mode of DNA replication is symmetric. To initiate genome replication, TP forms a heterodimer with DNA polymerase that is the enzyme responsible for the 19Kb DNA synthesis of the bacteriophage.
  • the TP of ⁇ 29 is divided into three structural domains ( Figure 1A), i) the C-terminal domain (Ct), which comprises the serine primer residue 232, ii) the intermediate domain (I) that contributes to the TP interaction surface -DNA polymerase and iii) the N-terminal domain (Nt) whose tertiary structure is still unknown.
  • the importance of the N-terminal domain (Nt) for the localization of TP in the nucleotide of prokaryotic cells has now been demonstrated.
  • the Nt domain of the TP of ⁇ 29 is essential for the location of the TP in the nucleoid of its natural host B. subtilis and also of E. coli, and that in addition in the nucleotide of prokaryotic cells it binds to DNA in vitro in a non-sequence specific way (Mu ⁇ oz-Espin D. et al. 2010).
  • TP terminal proteins
  • NLSs nuclear localization
  • the present invention refers to terminal proteins (TP) of bacteriophage genomes that replicate by initiator proteins that comprise a sequence that functions as an NLS, providing a stable and defined nuclear localization signal, and which also covalently binds to the ends of the DNA, obtaining both an improved vehicle for the transport of DNA into the cell nucleus, as well as a platform to fuse other types of signals of interest, such as, for example, antibodies for the recognition of specific cell types, peptides for transport through the plasma membrane, proteins for endosome escapement and / or binding domains to specific DNA sequences.
  • TP terminal proteins
  • the transport agent represents only a small fraction (for example, at least 0.478% in the case from Example 7) of the mass of the DNA to be transported, because it is covalently attached to the ends. This means that the chances of generating toxicity and immunogenicity are lower. In addition, having only two copies of the signal per DNA molecule, sending to the nucleus is much more controlled.
  • a preferred embodiment of the present invention applies to those cases in which an exogenous DNA is introduced into the nucleus of cells of a living organism, preferably mammalian, more preferably human, in order for said DNA to carry out a therapeutic effect
  • Another of the preferred embodiments of the present invention is for the introduction of DNA fragments into human cells to carry out the expression of heterologous genes for use in gene therapies.
  • bacteriophage TPs as transport agents or DNA vehicle within the mammalian cell nucleus is specific and efficient due to the covalent binding of the TP protein to the ends of the DNA.
  • bacteriophage TPs as transport agents or DNA vehicle inside the mammalian cell nucleus generates less toxicity and immunogenicity because the TP protein represents a small fraction (of at least 0.478%) of the mass of the DNA that is transported inside the mammalian cell nucleus, at be covalently bound to the ends of the DNA.
  • the terminal proteins (TP) of the genomes of bacteriophages ⁇ 29, Nf, PRD1, Bam35 and Cp-1, comprise sequences identified as nuclear localization signals (NLSs) in eukaryotic cells (Table 1), although the biological function of these NLSs is still unknown.
  • the listed bacteriophages replicate using said terminal proteins as initiators of DNA synthesis.
  • the TP of ⁇ 29 is located in the nucleus of the eukaryotic cell by an energy-dependent process by means of an NLS motif that lies between residue 1 and 37 of the TP.
  • the Nt subdomain (l-37) of ⁇ 29 itself has DNA binding capacity and comprises two groups of positively charged residues that are essential not only for the NLS function but also for DNA binding. That is, in the present invention it is demonstrated that fragment 1-37 can bind DNA alone and two groups of positive residues are important both for DNA binding, and for the NLS function.
  • TP-based DNA replication has been found in elements of different origins and its extension has been proposed along the evolutionary tree. A possible common function for TP NLSs as facilitators of horizontal gene transfer is being discussed.
  • representative bacteriophage TP sequences dependent on replication of primed DNA with proteins comprise supposed NLS motifs, with the sole exception of phage GA-1.
  • the present invention demonstrates that the TP of phage GA-1 related to ⁇ 29 does not have an NLS, while the phage TP of E. coli PRD1 also locates in the eukaryotic nucleus.
  • the TPs of bacteriophages Nf, Bam35 and Cp-1 are also located in the nucleus when they are expressed in eukaryotic cells.
  • the TP of bacteriophage ⁇ 29 has an elongated structure with three domains: a priming domain in C-terminal (Ct), an intermediate domain (I) that comes into contact with phage DNA polymerase and an N domain -terminal (Nt) with DNA binding capacity independent of the sequence.
  • the Nt domain of ⁇ 29 interacts with the bacteria's DNA (Mu ⁇ oz-Esp ⁇ n D. et al. 2010).
  • the present invention demonstrates that, in addition, the Nt domain of the TP also comprises an NLS that is functional in mammalian cells.
  • the N-terminal domain of ⁇ 29 comprises an accumulation of positively charged residues.
  • 25 KAK 27 and 32 KKK 34 which constitute a possible cNLS, as predicted by one of the servers used in the test (Table 1).
  • the results obtained with the mutants in these motifs showed a very important role of the lysine groups in the nuclear location of the TP.
  • the Nt fragment (14-37) which comprises the two groups and other basic residues, showed a poor NLS function. From the examples of the present invention it is shown that residues 1-37 in the N-terminal domain of ⁇ 29 constitute the minimum fragment that shows NLS function.
  • this fragment is longer than the classic monopartite NLS and, on the other, the linker between the two groups is too short to be a classic bipartite NLS. In addition, it does not comprise prolines and the arginine at position 19 is expendable for the NLS function, which also downplays a possible classic bipartite NLS.
  • the fragment comprising both groups could be responsible for the main interaction with the transporter protein, while amino acids 1-14 may constitute a necessary protein context, as proposed for the specificity of the isoforms of importin- ⁇ (Friedrich B. et al. 2006).
  • viral proteins such as the human cytomegalovirus UL84 protein, the BorO Disease Virus plO protein or the African Swine Fever virus plO protein, comprise a computer-predicted cNLS that, although necessary , is not fully functional on its own (Lischka P. et al. 2003; Nunes-Correia I. et al. 2008; Wolff T. et al. 2002). Together, our experiments show that the Nt motif (l-37) of ⁇ 29 constitutes de facto a new minimum unit for the NLS function.
  • the present invention demonstrates that TP mutants in each group of lysines that were not located in the Cell nucleus also presented the function of binding to affected DNA, although to a different degree.
  • the Nt fragment (1-37) which constitutes the minimum NLS fragment, showed a DNA binding capacity similar to that of the complete protein, while the Nt fragment (14-37) exhibited a binding activity. much lower and the binding activity of Nt (l-24) was canceled. Together, these results showed that Nt (1-37) is the minimum fragment with NLS function and DNA binding capacity. Therefore, the present invention relates to a ⁇ 29 which is the first case described in which an NLS of prokaryotic origin coincides with a DNA binding domain.
  • Adenovirus TP the paradigm of mammalian viruses with protein-primed DNA replication, directs the nuclear localization of the DNA polymerase of the virus, which is otherwise cytoplasmic (Zhao LJ & Padmanabhan R. 1988) .
  • ⁇ 29 and Adenovirus The similarity of the biological role of ⁇ 29 and Adenovirus is also noteworthy, and especially the fact that both comprise functional NLS in mammalian cells, which would suggest that the presence of an NLS could be a characteristic common to viral TP.
  • TP-primed systems were analyzed using programs to predict NLS. It is interesting that, with the exception of the case of phage GA-1, one or more possible NLS motifs could be identified in all the TPs analyzed (Table 1). According to the predictions, the present invention demonstrates that the TP of PRD1, but not the TP of GA1, locates in the nucleus. The fact that the TP of phage GA1, closely related to ⁇ 29, does not show a nuclear localization pattern can be explained by the loss of two of the three lysines from positions 32-34 and, in fact, has been observed here. invention that behaves similarly to the ⁇ 29 triple lysine mutant.
  • PRD1 nuclear location of the PRD1 TP suggests the presence of NLS in distant viruses, since PRD1 infects the E. coli Gram negative bacteria while ⁇ 29 infects B. subtilis
  • PRD1 infects the E. coli Gram negative bacteria while ⁇ 29 infects B. subtilis
  • the present invention refers to the use in medicine of a terminal protein of a bacteriophage virus, with replication of barley DNA by proteins, in the preparation of a medicament or pharmaceutical composition useful in medicine, characterized in that said protein comprises: a) at least an amino acid sequence of localization to the cell nucleus (NLS function), when said protein is expressed or released in mammalian cells, which responds to one of the following consensus sequences: i) Kx (0, 2) -Rx (0, 1) - K, ii) Kx (1, 2) -Kx (1, 2) -R, or iii) KKx (0, 1) -K; and where "x" is any amino acid known to one skilled in the art, and "0", “1", and “2” (numbers in brackets) is the position that said amino acid occupies in the sequence; Y. b) at least one amino acid sequence of covalent binding to the ends of the DNA, determined by functional biochemical assays, as explained in the state of the art.
  • the present invention also refers to the use of a terminal protein described above, characterized in that the bacteriophage virus is from the family Podov ⁇ r ⁇ dae or Tect ⁇ v ⁇ r ⁇ dae.
  • the present invention also refers to the use of a terminal protein described above, characterized in that said terminal protein comprises in the N-terminal third a proportion of basic amino acid residues at least between 21.8 to 34.5%, often grouped in positively charged groups, which are predominant with respect to negative charges.
  • the present invention also refers to the use of a terminal protein described above, characterized in that the terminal protein has an identity in its amino acid sequence equal to or greater than 78% with respect to the terminal protein of the bacteriophage virus O29 with SEQ ID No: 1.
  • a percentage of identity equal to or greater than 78% means that in the amino acid sequence there are at least 78% amino acids identical to the amino acids of the sequence of the bacteriophage virus O29 with SEQ ID No: 1 This interpretation is valid for all the percentages of identity indicated in the present invention.
  • the present invention also refers to the use of a terminal protein described above, characterized in that the terminal protein is the prote29 bacteriophage virus terminal protein with SEQ ID No: 1.
  • the present invention also refers to the use of a terminal protein described above, characterized in that the terminal protein is the terminal protein of bacteriophage Nf virus with SEQ ID No:.
  • the present invention also refers to the use of a terminal protein described above, characterized in that the terminal protein is the Cp-1 bacteriophage virus terminal protein with SEQ ID No: 5.
  • the present invention also refers to the use of a terminal protein described above, characterized in that the terminal protein is the Bam35 bacteriophage virus terminal protein with SEQ ID No: 6.
  • the present invention also refers to the use of a terminal protein described above, characterized in that the terminal protein is the terminal protein of the bacteriophage PRD1 virus with SEQ ID No: 7.
  • the present invention also refers to the use of a terminus protein1 described above, characterized in that it comprises an N-terminal domain with SEQ ID No: 2.
  • the present invention also refers to the use of a terminal protein described above, characterized in that the N-terminal domain comprises amino acid sequence 1-37 with SEQ ID No: 3.
  • the present invention also refers to the use of a terminal protein described above, characterized in that it comprises the groups of Usinas , 25 KAK 27 'and , 32 KKK 34 '.
  • the present invention also refers to the use of a terminal protein described above, characterized in that said protein is used as a DNA transport vehicle inside a mammalian cell nucleus for gene transfer in gene therapy.
  • the present invention also refers to the use of a terminal protein described above, characterized in that said terminal protein is covalently linked to the ends of the DNA to be transported.
  • the present invention also refers to the use of a terminal protein described above, characterized in that the TP protein represents a fraction of at least 0.478% of the mass of the DNA to be transported.
  • the present invention also refers to the use of a terminal protein described above, characterized in that the DNA to be transported is bound to at least one molecule of interest.
  • said molecule of interest is selected from: an antibody for the recognition of specific cell types, a peptide for transport across the plasma membrane, a protein for endosome escapement, a binding domain to specific DNA sequences and a homologous recombination stimulator domain.
  • the present invention also refers to the use of a terminal protein described above, characterized in that said protein is used as a tool in a biotechnological process.
  • the present invention also refers to the use of a terminal protein described above, characterized in that said protein is used to enhance gene insertion.
  • the present invention also refers to the use of a terminal protein described above, characterized in that said protein is used to increase the performance of a transfection experiment.
  • the present invention also refers to a method of treating a patient based on the transfer of genes to a mammalian cell nucleus, for gene therapy, said method characterized by comprising any of the uses of a terminal protein described above.
  • FIGURE 1 Nuclear location of TP of ⁇ 29.
  • A Schematic representation of the YFP protein fused to the ⁇ 29 domains.
  • B Images of confocal microscopy of COS-7 cells expressing YFP and YFP fused to the complete TP or to its different domains. YFP and DAPI images are displayed.
  • FIGURE 2 Inhibition of active transport prevents nuclear localization of the TP of TP29.
  • FIGURE 3 Identification of a minimum functional NLS in TP of ⁇ 29.
  • A Schematic representation of TP fragments as fusion proteins to double YFP.
  • B Confocal microscopy images of COS-7 cells expressing the indicated fusion proteins. YFP images, YFP mergers, and DAPI are displayed.
  • FIGURE 4 Role of positively charged residues of TP of ⁇ 29 in nuclear localization. Confocal microscopy images of COS-7 cells expressing the 2YFP and 2YFP fusion with wild-type and full-length TP mutants. YFP images, YFP mergers, and DAPI are displayed. The above scheme represents the double fusion YFPs and the sequence fragment that includes the mutated residues (in bold).
  • FIGURE 5 DNA binding capacity of ⁇ 29 TP mutants.
  • FIGURE 6 The TPs of ⁇ 29, Nf, PRD1, Bam35 and Cp-1 locate in the nucleus of eukaryotic cells. Confocal microscopy images of COS-7 cells expressing the 2YFP fusions with TPs ⁇ 29, GA1, Nf, PRD1, Bam35, Cp-1 and ABV. YFP and DAPI images are displayed.
  • FIGURE 7 Effect of TP of TP29 covalently bound to DNA on transfection performance.
  • A Scheme of the pEYFPORBAE plasmid map (SEQ ID. 29) that includes the origins of or29 genome replication. Said plasmid was amplified by conventional PCR or by the media29 TP-mediated amplification system.
  • B Agarose gel showing the result of successive treatments with proteinase K and ⁇ .
  • FIGURE 8 Different constru29 TP constructs are located inside the cell nucleus.
  • A Confocal images of COS-7 cells expressing fusion YFP-TP and TP-YFP with the ⁇ 29 TP.
  • B Immunofluorescence confocal microscopy images of COS-7 cells subjected to simulated transfection and transfected with a plasmid expressing TP. Immunofluorescences were carried out as described in Redrej o-Rodr ⁇ guez M. et al. 2006, using antibodies against TP of ⁇ 29 and visualization with alexa 488 secondary.
  • C Fluorescent images of HeLa and COS-7 cells expressing fusion YFP and YFP-TP proteins.
  • FIGURE 9 Expression and stability of YFP fusion proteins in COS-7 cells.
  • Western blot analysis of cell extracts from transfected cells performed with an anti-GFP antibody that cross-reacts with YFP (Invitrogen A-6455). The immuno- blotting was carried out with extracts of approximately 10,000 cells per lane.
  • FIGURE 10 Purified YFP fusion proteins. SDS-PAGE (12%) of purified proteins, labeled with "strep-tag" for DNA binding assays. Electrophoretic migration of molecular size markers is indicated on the left. The quantification of the bands was carried out by densitometry (ImageJ) of complementary gels and the different levels were compared with the known amounts of the control proteins. For YFP-Nt (1-2), YFP-Nt (14-37) and YFP-Nt (1-37), which have more than one band, only the upper band, of size, was taken into account for quantification expected
  • FIGURE 11 DNA binding capacity of TP domains. Displacement test of electrophoretic mobility of fusion YFP proteins (5, 10 or 50 nM). After electrophoresis in non-denaturing polyacrylamide gel, the mobility of the nucleo-protein complexes was detected by autoradiography. Lane numbers are indicated below the gel.
  • EXAMPLE 1 The TPs of phages ⁇ 29, Nf, PRD1, Bam35 and CP1 possess predicted NLS and also locate in the cell nucleus
  • All NLS predicted for TPs comprise any of the following consensus sequences: Kx (0.2) -R- x (0, l) -K, Kx (1, 2) -Kx (1, 2) -R or KKx (0, 1) -K, where ⁇ ⁇ ' refer to any amino acid known to a person skilled in the art, and the numbers in parentheses to the number of positions occupied in the sequence.
  • Table 1 summarizes the predictions and determinations of NLS in TP from diverse sources. Monopartite (+) and bipartite (2+) NLS detected with PSORT (Reinhardt A. & Hubbard T. 1998) and NLS predicted with NLStradamus (Nguyen Ba AN et al. 2009) are indicated, using a threshold value of 0 , 45 (+) or 0.75 (++).
  • the sequences of the TPs of ⁇ 29, GA1, Nf, CP-1, OCP24R, AV-1, ascc028, Bam35, PRD1, ABV and OYS40 were used.
  • EXAMPLE 2 The TP of bacteriophage ⁇ 29 comprises an NLS
  • COS-7 cells were transfected with a vector expressing a fusion protein comprising the yellow fluorescent protein (Yellow Fluorescent Protein, YFP) and the de29 TP, called YFP-TP (see details in Example 8).
  • YFP yellow fluorescent protein
  • the YFP signal was analyzed by confocal fluorescence microscopy.
  • the YFP-TP fusion protein signal is located exclusively in the nucleus, marked by DAPI staining of the nuclear DNA, while the YFP control protein appeared uniformly dispersed in the cell ( Figure IB, panels i vs. ii). A similar distribution pattern was found in human HeLa cells ( Figure 8C).
  • the mass of the YFP-TP fusion (60 kDa) is greater than the mass that is normally identified as a limit for passive transport to the nucleus (approximately 45 kDa), some higher mass fusion proteins have been identified, moving to the core passively in the absence of an NLS, probably due to its elongated shape.
  • NLS-mediated nuclear transport of proteins requires Ran-GTP hydrolysis and is specifically inhibited by ATP depletion (Xu D. et al., 2010).
  • ATP depletion Xu D. et al., 2010
  • three double YFP fusion proteins were constructed comprising the following fragments of the TP's Nt domain: (1) the first 1-37 residues comprising the majority (76%) of the basic amino acids of Nt, (2) fragment 14-37 comprising a predicted cNLS (Table 1) and (3) fragment 1-24, excluding the basic residue groups and the predicted NLS.
  • the subcellular localization of these constructs showed that the first 1-37 amino acids confer a clear nuclear location to the 2YFP fusion protein, as is the case with full-length TP ( Figure 3B, panels ii and iii).
  • Nt fragment (l-24) does not modify the location of a double YFP construct ( Figure 3B, panels iv), while the Nt fusion protein (14-37) produces a clear increase in the nuclear signal, although the cytoplasm too It comprises a YFP signal ( Figure 3B, panels v).
  • the possible degradation of the protein that could release the YFP alone was ruled out by Western blot analysis ( Figure 9), indicating that the 2YFP-Nt construct (14-37) has a partial alteration of the NLS transport mechanism.
  • a TP mutant lacking the first 1-37 amino acids of the N-terminal end does not accumulate in the nucleus, which highlights the essential role of that region (Figure 3B, panels vi). Therefore, it is concluded that the sequence corresponding to the first 1-37 amino acids of the ⁇ 29 TP behaves bona. Fide as an NLS.
  • EXAMPLE 4 The Usina groups play an essential role in the location of the TP nucleus.
  • Nt fragment (l-24) does not direct to the nucleus and the Nt (14-37) partially causes nuclear localization
  • mutants were designed in this region of the full length TP for more detailed mapping of the NLS function .
  • most NLSs comprise basic amino acid groups; therefore, alanine substitutions of the lysine groups K25-K27 and K32-K33-K34 were made.
  • Simple K27A and R19A mutants were also constructed because classical bipartite NLSs typically comprise a single R / K that precedes the main basic group in 4-10 residues. The R19A mutation did not change the phenotype of the wild TP ( Figure 4, panels ii vs.
  • EXAMPLE 5 Subdomain Nt (1-37) of the TP of ⁇ 29 has both DNA binding and nucleus localization function. Since many NLSs are co-located in DNA binding domains, it has been proposed that DNA binding motifs may be at the evolutionary origin of nuclear transport mechanisms (LaCasse EC & Lefebvre YA 1995; Cokol M. et al 2000). Since the Nt domain of ⁇ 29 can be linked to in vitro DNA (Mu ⁇ oz-Espin D. et al. 2010), the DNA binding properties of the motifs and residues studied in the subcellular localization experiments of ⁇ 29 were evaluated .
  • YFP fusion proteins were purified using the purification strep-tag system (see Example 8) and their dsDNA binding capacity was compared with that of the wild TP by gel lag tests.
  • Figure 11 shows that all YFP mergers comprising the Nt domain (YFP-TP, YFP-Nt and YFP-NtI) can displace substrate mobility DNA similar to purified TP alone, used as a positive control, while the YFP-ICt fusion protein, like the YFP protein of the negative control, did not exhibit DNA binding capacity.
  • the Nt fragment (1-37) of the TP gave the YFP fusion protein a DNA binding capacity almost comparable to that of the full length TP (compare lanes 2 vs. 7 ).
  • fragment 14-37 of the TP also resulted in a delayed band, although the amount of displaced DNA was much smaller than that of fragment 1-37 (lanes 5 and 6 vs. 7 and 8).
  • fragment 1-24 of the Nt domain did not displace the dsDNA fragment ( Figure 5, lanes 3-4), even at the highest concentration analyzed.
  • the DNA binding capacity of the YFP-TP R19A, K27A, K25A / K27A and K32A / K33A / K34A mutant proteins was also evaluated.
  • the substitution of a single amino acid R19A essentially did not reduce the DNA binding capacity with respect to wild TP ( Figure 5, lanes 9 and 10 vs. 1 and 2), while mutants K27A and K25A / K27A showed a decrease and a strong reduction, respectively, of the amount of delayed DNA ( Figure 5, streets 11-12 and 13-14).
  • the triple mutant K32A / K33A / K34A also showed poor DNA binding, compared to wild TP (lanes 15-16 vs. 1-2), although less intense than that of the K25A / K27A mutant. Therefore, the lysine group mimics showed reduced DNA binding and poor NLS function, which reaffirms the correlation between both functions.
  • Figure 7 shows that, as expected, the transfection reagent is necessary to obtain DNA internalization and subsequent protein expression of all forms of DNA, so that internalization in the mediated DNA cell is ruled out.
  • TP DNA internalization
  • ADNlin linear DNA
  • scDNA circular supercoiled DNA
  • YFP expression of YFP in cells transfected with the TP-DNA form was higher than in linear DNA (multiplied by approximately 4) and very similar to that of the cDNA, indicating stimulation in the presence of the ⁇ 29 protein covalently bound to the 5 'end of the DNA.
  • ⁇ 29 can enhance gene insertion and suggests a direct involvement in the transport of DNA through the nuclear pore complex. Therefore, the DNA amplification system primed by the TP of ⁇ 29 is a useful tool for biotechnological purposes, not only for DNA amplification but also to enhance gene insertion and, therefore, to increase the performance of the experiments of transfection in order to carry out gene therapy.
  • COS-7 cells were obtained from the American Type Culture Collection (ATCC) and were grown in Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM) comprising 10% fetal bovine serum (FCS).
  • DMEM Dulbecco's modified Eagle medium
  • FCS fetal bovine serum
  • plasmids expressing phage terminal proteins were transfected as YFP fusion proteins, as detailed in the sequence list (SEQ ID No. 8, SEQ ID No. 9, SEQ ID No. 10, SEQ ID No. 11, SEQ ID No. 12, SEQ ID No. 13, SEQ ID No. 14, SEQ ID No. 15, SEQ ID No. 16, SEQ ID No. 17, SEQ ID No. 18, SEQ ID No. 19, SEQ ID No. 20, SEQ ID No. 21, SEQ ID No. 22, SEQ ID No. 23, SEQ ID No. 24, SEQ ID No.
  • SEQ ID No. 26 SEQ ID No. 27, and SEQ ID No. 28.
  • the cells were grown on glass coverslips in 24 wells at 20,000 cells / cm 2 . Transfections were performed with Lipofectamine and Reagent Plus (Invitrogen) following the manufacturer's instructions.
  • the wild TP was purified as described in the prior art (Menc ⁇ a M. et al. 2011). Fusion YFP-TPs labeled with "strep-tag" were purified as described in the prior art (Schmidt TG & Skerra A. 2007) with minor modifications. Simply put, overnight cultures were inoculated at 1: 500 in fresh self-induction medium with 150 Dg ampicillin / ml medium (Studier FW 2005), grown for 2 hours at 30 ° C and then during night at room temperature.
  • the proteins YFP, YFP-TP, YFP-Nt, YFP-NtI, YFP-Nt (1- 24), YFP-Nt (14-37), YFP -Nt (1-37), YFP-TP_R19A and YFP-TP-K32 / 33 / 34A are quantitatively recovered from the soluble fraction, while YFP-ICt, YFP-TP_K27A and YFP-K25 / 27A were recovered from the precipitates.
  • Soluble proteins were purified by single stage affinity chromatography with Strep-Tactin resin columns (IBA), according to the manufacturer's instructions.
  • the proteins of the insoluble fraction were solubilized with buffer A comprising 4M guanidine hydrochloride and, after dialysis against buffer A supplemented to 25% glycerol, were purified by the same method. Finally, the eluted fractions containing the proteins were mixed, dialyzed against 50 mM Tris-HCl, at pH 8, 300 mM NaCl, 1 mM EDTA, 7 mM 2-mercaptoethanol, 50% glycerol and stored at -20 ° C.
  • Figure 10 shows an SDS-PAGE of the final protein preparations.
  • This DNA substrate (0.5nM) was incubated in a final volume of 20 ⁇ 1 with a reaction mixture containing 50 mM Tris-HCl, at pH 7.5, 1 mM EDTA, 4% glycerol, 0.1 mg / ml of bovine serum albumin, 1 mM dithiothreitol, 0.05% Tween20 and the indicated concentrations of the corresponding protein.
  • the samples were electrophoresed in 4% polyacrylamide gels (weight / volume) (80 1, bis monomer), comprising 12 mM Tris acetate, at pH 7.5 and 1 mM EDTA , running at 4 ° C in the same buffer at 8 V / cm.
  • the gels underwent autoradiography at -80 ° C. BIBLIOGRAPHY Coal S, Ireland A, Mungall CJ, Shu S, Marshall B, et al.
  • Nuclear localization means overlap DNA- or RNA-binding domains in nucleic acid-binding proteins. Nucleic Acids Res 23: 1647-1656.
  • African swine fever virus protein pE296R is a DNA repair apurinic / apyrimidinic endonuclease required for virus growth in swine macrophages. J Virol 80: 4847-4857.
  • Terminal proteins of Streptomyces chromosome can target DNA into eukaryotic nuclei. Nucleic Acids Res 36: e62.

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Description

UTILIZACION DE SEÑALES DE LOCALIZACION NUCLEAR DE PROTEINAS DE BACTERIÓFAGOS COMO VEHÍCULO PARA TRANSFERENCIA DE GENES.
DESCRIPCION
SECTOR DE LA TÉCNICA
La presente invención forma parte del sector de la química y la farmacia, concretamente en el sector de la biotecnología, para la introducción de ADN de forma dirigida y controlada en el núcleo celular .
ESTADO DE LA TÉCNICA ANTERIOR
La presente invención hace referencia a la identificación de secuencias de proteínas procariotas, que funcionan como señales de localización nuclear (NLSs) en células eucariotas, y que se unen de forma covalente a los ADNs que se van a transportar al núcleo celular .
En el estado de la técnica se ha descrito que la cubierta del núcleo constituye una barrera de segregación que facilita la compartimentalización de procesos complejos como la replicación del genoma, la expresión génica, la transducción de señales y el ciclo celular. No obstante, dicha compartimentalización implica el transporte específico de proteínas y ácidos nucleicos que debe ser llevado a cabo por la maquinaria celular con la que interaccionan proteínas tanto de las propias células como de virus y de microorganismos endosimbióticos . Dicho transporte se produce a través de grandes estructuras de membrana que se denominan complejos de poros nucleares ("Nuclear Pore Complex", NPC) , que comprenden aproximadamente 50 proteínas denominadas en su conjunto "nucleoporinas" . Las moléculas de hasta 40-50 kDa pueden difundir de forma pasiva a través de los poros nucleares, mientras que la mayoría de las proteínas con funciones en el interior del núcleo, requieren un proceso de transporte dependiente de energía, mediado por una serie de proteínas transportadoras o "carioferinas" (Xu D. et al . 2010) . La vía de transporte de proteínas mejor conocida está mediada por la denominada "señal de localización nuclear clásica" (" classical nuclear localization signal" , cNLS), que es reconocida por la importina-α . La importina-α es una proteína adaptadora, porque a su vez requiere la unión a la carioferina-β, siendo el complejo trimérico importina-a-carioferina-p-cargo el que puede entrar en el núcleo. Las NLS clásicas se pueden dividir en monopartitas y bipartitas. Las NLS monopartitas comprenden un único grupo
(" cluster" ) de residuos básicos, mientras que las secuencias bipartitas comprenden dos grupos de residuos básicos separados por un espaciador de 10-12 aminoácidos (Xu D. et al. 2010) . Como alternativa, se han caracterizado otras señales y vías de importación, como las PY-NLS, que se pueden unir directamente a la carioferina-β . Más aún, para algunas proteínas no se ha identificado una NLS clásica, o bien su región responsable de la importación al núcleo no entra dentro de ninguna de las clases ya definidas
(Lischka P. et al. 2003) .
Una característica común en muchas proteínas nucleares es la presencia de regiones de unión a ácido nucleico. Dado que los aminoácidos con carga positiva son abundantes en dichas regiones, es frecuente el caso en el que los dominios de unión a ADN eucariótico comprendan también NLSs (Turlure F. et al. 2006; Silver P.A. et al. 1986); no obstante, muchas NLSs que se han predicho no solapan con dominios de unión a ADN. Al requisito de transporte al núcleo, le habrían precedido las interacciones proteína-ADN . Por tanto, se ha propuesto que las regiones de unión a ADN pueden constituir el origen de las señales usadas para compartimentalizar todos los procesos en los que participa el ADN (LaCasse E.C. & Lefebvre Y. A. 1995; Cokol M. et al. 2000) .
En el estado de la técnica se han descrito también una serie de proteínas procarióticas que comprenden secuencias que funcionan como NLSs cuando se expresan o liberan en células eucariotas . En algunos casos, estas proteínas procarióticas son producidas por bacterias patogénicas o simbióticas para realizar o influir sobre algunas funciones dentro de la célula huésped. No obstante, en otros casos, la función biológica de una NLS en proteínas procarióticas no está clara, como el caso de las NLSs que se encuentran en las proteínas terminales (TP) de los cromosomas y plásmidos lineales de bacterias del género Streptomyces (Tsai H.H. et al. 2008) . Estas TP están unidas covalentemente a los extremos 5' de los ADN lineales y son necesarias para la replicación y estabilidad de los extremos similares a telómeros. A este respecto cabe decir que los dos tipos de TPs de Streptomyces en los que se han encontrado NLSs son distintas entre sí y se consideran producto de convergencia evolutiva. Además la función propuesta para estas NLSs es por el momento totalmente hipotética. Por otra parte las TPs de Streptomyces son a su vez completamente distintas y no alineables con las proteínas terminales de bacteriófagos. Debido a esto no es posible encontrar en las proteínas de bacteriófagos las secuencias predichas como NLS para las proteínas de Streptomyces . Por otra parte las predicciones de NLSs en proteínas procarióticas no se pueden considerar válidas a no ser que se verifique experimentalmente que dichas proteínas migran al núcleo cuando se expresan en células eucarióticas . Esto es debido a que las NLS predichas pueden estar ocultas o en una conformación no funcional debido al plegamiento de la proteína. Así, en la secuencia de la ARN polimerasa del fago T7 los programas NLStradamus y cNLS mapper encuentran hasta 5 NLSs distintas con significación 4 sobre 7 o superior y se sabe que dicha ARN polimerasa no es capaz de ir al núcleo por sí misma. Debido a esto y teniendo en cuenta sólo la información de las TPs de Streptomyces , actualmente no hay evidencias claras que indiquen la presencia de NLSs funcionales en proteínas terminales de bacteriófagos .
El uso de TP para la replicación del ADN se ha identificado en virus y plásmidos con huéspedes muy diversos, tales como bacteriófagos que infectan bacterias Gram positivas (Φ29, Cp-1) y bacterias Gram negativas (PRD1), plásmidos bacterianos y Adenovirus (Salas M. 1991) . En muchos otros casos, la existencia de ADN polimerasas cebadas por proteínas ha permitido sugerir la presencia de replicación mediada por TP en una serie de organismos, tales como plásmidos lineales eucarióticos , bacteriófagos de arqueobacterias , elementos transponibles Maveri ck o Polyton y el Mavirus recientemente descrito ( Cafetería roenbergensis Virus -CroV- vírófago) (Mencia et al. 2011) .
El método utilizado para determinar la identidad de una secuencia de una proteina terminal unida covalentemente a los extremos 5 ' de un genoma de ADN se lleva a cabo en varios pasos. Primero se obtiene una cantidad del genoma del fago mediante tratamiento proteolitico (con proteinasa K o tripsina) del virión purificado y extracción con solventes orgánicos del ADN de dicho virión. Después se identifican los extremos de ADN mediante análisis con enzimas de restricción. Entonces se puede degradar el DNA de los extremos o de todo el genoma mediante tratamiento con nucleasa. El péptido que se obtenga se puede determinar mediante espectrometría de masas o degradación de Edman. El otro método para anotar proteínas terminales se basa en que en la base de datos haya una proteína con una similitud igual o mayor del 58% a una proteína terminal cuya secuencia de unión covalente al DNA es conocida (como ejemplo, similitud de GA-1 respecto a Φ29) .
Uno de los ejemplos mejor estudiados de replicación de ADN basada en TP es el del fago Φ29 de Bacillus subtilis (Salas M. 1991) . Al contrario que los plásmidos y cromosomas de Streptomyces , toda la replicación del ADN de Φ29 depende de la TP, no sólo la replicación de los telómeros, porque el modo de replicación del ADN es simétrico. Para iniciar la replicación del genoma, la TP forma un heterodímero con la ADN polimerasa que es la enzima responsable de la síntesis del ADN de 19Kb del bacteriófago. La TP de Φ29 está dividida en tres dominios estructurales (Figura 1A) , i) el dominio C-terminal (Ct) , que comprende el residuo cebador serina 232, ii) el dominio intermedio (I) que contribuye a la superficie de interacción TP-ADN polimerasa y iii) el dominio N-terminal (Nt) cuya estructura terciaria todavía se desconoce. Actualmente se ha demostrado la importancia del dominio N-terminal (Nt) para la localización de TP en el nucleoide de células procariotas. Por ejemplo, se conoce que el dominio Nt de la TP de Φ29 es esencial para la localización de la TP en el nucleoide de su huésped natural B. subtilis y también de E. coli, y que además en el nucleoide de células procariotas se une al ADN in vítro de modo no especifico de secuencia (Muñoz-Espin D. et al. 2010) .
A diferencia de lo que ocurre en el nucleoide de células procariotas, el proceso de introducción de genes exógenos de forma dirigida y controlada en el interior del núcleo de células de eucariotas es más complejo. En el mercado actualmente hay productos que sirven como vehículo para la introducción de genes dentro del núcleo de células de mamífero: se basan en reactivos que actúan en combinación con lipofectaminas , liposomas catiónicos, péptidos con señales de localización nuclear, y complejos formados por combinaciones de los anteriores. Sin embargo, los métodos utilizados actualmente se basan en la formación de complejos no covalentes entre distintos compuestos y el ADN a transportar; o se basan en el entrecruzamiento covalente generalizado del ADN con péptidos señal. La principal desventaja de estos métodos es que son muy poco específicos y poco eficientes puesto que generalmente sólo una pequeña fracción del ADN de interés termina realmente en el núcleo celular. Por otra parte, estos métodos pueden provocar problemas de toxicidad y/o inmunogenicidad en el organismo.
Por tanto, una de las principales necesidades que actualmente existen en este sector de la técnica, es la identificación de secuencias en proteínas terminales (TP) de genomas de bacteriófagos que replican mediante proteínas iniciadoras, que funcionen como señales estables y definidas de localización nuclear (NLSs) cuando se expresan o liberan en células de mamíferos, y que además se asocien de forma estable al ADN para la obtención de un vehículo mejorado para el transporte de ADN al interior del núcleo celular.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN
La presente invención hace referencia a proteínas terminales (TP) de genomas de bacteriófagos que replican mediante proteínas iniciadoras que comprenden una secuencia que funciona como una NLS, proporcionando una señal de localización nuclear estable y definida, y que además se une covalentemente a los extremos del ADN, obteniendo tanto un vehículo mejorado para el transporte de ADN al interior del núcleo celular, como también una plataforma para fusionar otro tipo de señales de interés, como por ejemplo, anticuerpos para el reconocimiento de tipos celulares específicos, péptidos para el transporte a través de la membrana plasmática, proteínas para escape del endosoma y/o dominios de unión a secuencias específicas de ADN.
Las principales ventajas técnicas de la presente invención frente a otros vehículos para la introducción de genes dentro del núcleo celular, es que en la presente invención, el agente de transporte representa sólo una pequeña fracción (por ejemplo, de al menos 0,478 % en el caso del Ejemplo 7) de la masa del ADN que se va a transportar, porque va unido covalentemente a los extremos. Esto hace que las posibilidades de que genere toxicidad e inmunogenicidad sean menores. Además, al haber solo dos copias de la señal por molécula de ADN, el envío al núcleo es mucho más controlado.
Así mismo, una realización preferente de la presente invención se aplica a aquellos casos en los que un ADN exógeno se introduce en el núcleo de células de un organismo vivo, preferentemente mamífero, más preferentemente humano, con objeto de que dicho ADN lleve a cabo un efecto terapéutico.
Otra de las realizaciones preferentes de la presente invención es para la introducción de fragmentos de ADN en células humanas para llevar a cabo la expresión de genes heterólogos para su uso en terapias génicas.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
En la presente invención se demuestra lo siguiente:
El uso de las TP de bacteriófagos como agentes de transporte o vehículo de ADN al interior del núcleo de células de mamífero, es específico y eficiente debido a la unión covalente de la proteína TP a los extremos del ADN.
El uso de las TP de bacteriófagos como agentes de transporte o vehículo de ADN al interior del núcleo de células de mamífero genera menos toxicidad e inmunogenicidad porque la proteína TP representa una fracción pequeña (de al menos 0,478%) de la masa del ADN que se transporta al interior del núcleo de la célula de mamífero, al encontrarse unida covalentemente a los extremos del ADN.
Las proteínas terminales (TP) de los genomas de los bacteriófagos Φ29, Nf, PRD1, Bam35 y Cp-1, comprenden secuencias identificadas como señales de localización nuclear (NLSs) en células eucariotas (Tabla 1), a pesar de que la función biológica de dichas NLSs es aún desconocida. Los bacteriófagos listados replican utilizando dichas proteínas terminales como iniciadores de la síntesis de ADN.
La TP de Φ29 se localiza en el núcleo de la célula eucariota mediante un proceso dependiente de energía por medio de un motivo NLS que se encuentra entre el residuo 1 y el 37 de la TP.
El subdominio Nt(l-37) de la ΤΡΦ29, tiene por si mismo capacidad de unión al ADN y comprende dos grupos de residuos de carga positiva que son esenciales no sólo para la función NLS sino también para la unión a ADN. Es decir, en la presente invención se demuestra que el fragmento 1-37 puede unirse a ADN por sí solo y dos grupos de residuos positivos son importantes tanto para la unión al ADN, como para la función NLS.
Existe una posible relación evolutiva entre la NLS y la unión a ADN en la ΤΡΦ29. Otras TP de bacteriófagos también poseen potenciales secuencias NLS, como la TP del bacteriófago PRD1 (relacionado de forma lejana con el Φ29), que también es responsable de la localización al interior del núcleo celular. La replicación de ADN basada en las TP (" TP-based DNA replication" ) se ha encontrado en elementos de orígenes diferentes y se ha propuesto su extensión a lo largo del árbol evolutivo. Se está debatiendo una posible función común para las NLSs de las TP como facilitadoras de la transferencia horizontal de genes. Además, mediante servidores web bioinformáticos se ha demostrado que las secuencias TPs de bacteriófagos representativos dependientes de la replicación del ADN cebado con proteínas, comprenden supuestos motivos NLS, con la única excepción del fago GA-1. De acuerdo con las predicciones, en la presente invención se demuestra que la TP del fago GA-1 relacionado con Φ29 no tiene una NLS, mientras que la TP del fago PRD1 de E. coli también localiza en el núcleo eucariótico. Las TPs de los bacteriófagos Nf, Bam35 y Cp-1 también se localizan en el núcleo cuándo se expresan en células eucarióticas .
La TP del bacteriófago Φ29 tiene una estructura de forma elongada con tres dominios: un dominio de cebado en C-terminal (Ct), un dominio intermedio (I) que es el que entra en contacto con la ADN polimerasa del fago y un dominio N-terminal (Nt) con capacidad de unión a ADN independiente de la secuencia. El dominio Nt de la ΤΡΦ29 interacciona con el ADN de la bacteria (Muñoz-Espín D. et al. 2010) . En la presente invención se demuestra que, además, el dominio Nt de la TP también comprende una NLS que es funcional en las células de mamífero .
El dominio N-terminal de la ΤΡΦ29, abarcando los residuos 1-73, comprende una acumulación de residuos con carga positiva. En concreto, se podrían sugerir dos motivos, 25KAK27 y 32KKK34, los cuales constituyen una posible cNLS, tal y como predijo uno de los servidores empleados en el ensayo (Tabla 1) . Los resultados obtenidos con los mutantes en estos motivos mostraron un papel muy importante de los grupos de lisina en la localización nuclear de la TP. No obstante, el fragmento Nt (14-37), que comprende los dos grupos y otros residuos básicos, mostró una función NLS deficiente. A partir de los ejemplos de la presente invención se demuestra que los residuos 1-37 en el dominio N-terminal de la ΤΡΦ29 constituyen el fragmento mínimo que muestra función NLS. Por un lado, este fragmento es más largo que las NLS monopartitas clásicas y, por otro, el elemento de unión (linker) entre los dos grupos es demasiado corto para ser una NLS bipartita clásica. Además, no comprende prolinas y la arginina en la posición 19 es prescindible para la función NLS, lo que también resta importancia a una posible NLS bipartita clásica. Sobre esta base, se puede sugerir que el fragmento que comprende ambos grupos podría ser responsable de la principal interacción con la proteina transportadora, mientras que los aminoácidos 1-14 pueden constituir un contexto proteico necesario, como se ha propuesto para la especificidad de las isoformas de la importina-α (Friedrich B. et al. 2006) . De acuerdo con esto, otras proteínas víricas, como la proteína UL84 del citomegalovirus humano, la proteína plO del Virus de la Enfermedad de Borna o la proteína plO del virus de la Fiebre Porcina Africana, comprenden una cNLS predicha por ordenador que, aunque es necesaria, no es completamente funcional por sí sola (Lischka P. et al. 2003; Nunes-Correia I. et al. 2008; Wolff T. et al. 2002). En conjunto, nuestros experimentos muestran que el motivo Nt(l-37) de la ΤΡΦ29 constituye de facto una nueva unidad mínima para la función NLS.
Como se ha mencionado anteriormente, existen una serie de NLSs que coinciden con los dominios de unión a ADN (Turlure F. et al. 2006; LaCasse E.C. & Lefebvre Y. A. 1995). A este respecto, existe la hipótesis de que la evolución puede haber utilizado parte de los patrones de unión a ADN existentes al compartimentalizar las proteínas de unión al ADN en el núcleo, aunque NLSs diferentes tienen orígenes alternativos (Cokol M. et al. 2000) . No obstante, el número de NLSs predichas en procariotas (1-2% frente a 8-10% en eucariotas) (Cokol M. et al. 2000) es mucho menor que el número de dominios de unión al ADN (aproximadamente el 10% de las proteínas totales para ambos, de acuerdo con las anotaciones de ontologías génicas (GO: 0003677) (Carbón S. et al. 2009; http://amigo.geneontology.org). De hecho, algunas proteínas de unión a ADN procarióticas , tales como LexA de E. coli o la RNA polimerasa de T7, no tienen capacidad de localización nuclear por sí solas cuando se expresan en células eucariotas (Silver P.A. et al. 1986). Además, las referencias existentes sobre la coexistencia del dominio de unión a ADN y los motivos NLS en las proteínas procarióticas son poco claras: como la proteína Tus de E. coli (Kaczmarczyk S.J. et al. 2010) que comprende una cNLS dentro de un dominio de unión a ADN muy grande o las NLS de las TP de Streptomyces (Tsai H.H. et al. 2008), que están próximas pero no se solapan con los dominios de unión a HTH ADN. Cabe destacar que la presente invención demuestra que TP mutantes en cada grupo de lisinas que no localizaban en el núcleo celular, también presentaban la función de unión a ADN afectada, aunque en diferente grado. Por el contrario, el fragmento Nt(l-37), que constituye el fragmento NLS mínimo, mostró una capacidad de unión a ADN similar a la de la proteína completa, mientras que el fragmento Nt (14-37) presentó una actividad de unión muy inferior y la actividad de unión de Nt(l-24) estaba anulada. En conjunto, estos resultados mostraron que el Nt(l-37) es el fragmento mínimo con función NLS y capacidad de unión a ADN. Por tanto, la presente invención se refiere a una ΤΡΦ29 que es el primer caso descrito en el que una NLS de origen procariótico coincide con un dominio de unión a ADN.
Aunque anteriormente ya se han identificado varias proteínas procarióticas que comprenden motivos NLS, la presente invención describe por primera vez una NLS en TPs de bacteriófago. Cabe destacar que la TP de Adenovirus, el paradigma de los virus de mamíferos con replicación de ADN cebada por proteínas, dirige la localización nuclear de la ADN polimerasa del virus que, por lo demás, es citoplasmática (Zhao L.J. & Padmanabhan R. 1988). Es también reseñable la similitud del papel biológico de las ΤΡΦ29 y de Adenovirus y, especialmente el hecho de que ambas comprenden NLS funcionales en células de mamífero, lo que sugeriría que la presencia de una NLS podría ser una característica común a las TP víricas. Para comprobar esta hipótesis, se analizaron otros sistemas cebados por TP (TP-primed systems) mediante programas para predecir NLS. Es interesante el hecho de que, a excepción del caso del fago GA-1, se pudieron identificar uno o más posibles motivos NLS en todas las TP analizadas (Tabla 1) . De acuerdo con las predicciones, en la presente invención se demuestra que la TP de PRD1, pero no la TP de GA1, localiza en el núcleo. El hecho de que la TP del fago GA1, estrechamente relacionado con Φ29, no muestre un patrón de localización nuclear puede explicarse por la pérdida de dos de las tres lisinas de las posiciones 32-34 y, de hecho, se ha observado en la presente invención que se comporta de forma similar a la ΤΡΦ29 triple mutante de lisina. La localización nuclear de la TP de PRD1 sugiere la presencia de NLS en virus distantes, ya que PRD1 infecta a la bacteria Gram negativa E. coli mientras que Φ29 infecta a B. subtilis . También cabe mencionar que se ha propuesto una relación evolutiva entre PRD1 y Adenovirus, en base a la elevada similitud estructural de la proteina principal de la cápside de ambos virus, a pesar de la ausencia de homología de secuencia. Basándose en ello, se propuso un nuevo linaje vírico de tipo PRDl-Adenovirus al que más adelante se añadieron más miembros entre los que se incluyeron Bam35, PBCV o Mimivirus, cuyos mecanismos de replicación del genoma pueden ser diferentes .
El hecho de que las secuencias de las TP de Φ29, de PRD1 y de Adenovirus no sean similares, aunque sí poseen una función biológica parecida y están dirigidas al núcleo eucariota, apoya la hipótesis de que pueden tener un ancestro común en el origen del linaje de los sistemas de replicación dependientes de TP, que pueden haber sido adquiridos por virus con diferentes tipos de viriones y otros replicones independientes, al tiempo que, sorprendentemente, mantienen la capacidad de localización nuclear, incluso en el caso de los virus procariotas. De hecho, se ha propuesto que los mecanismos de replicación del ADN basados en TP están extendidos en el árbol evolutivo y que este tipo de replicación habría estado presente en la deriva genética (Mencía et al. 2011) y, además, se han encontrado posibles motivos de NLS en casi todas las secuencias de TP analizadas de diferentes bacteriófagos y de Streptomyces . Teniendo también en cuenta la relación anteriormente sugerida entre la unión a ADN y las NLSs, verificada para la TP de Φ29, es tentador especular que las TPs pueden haber adquirido durante la evolución la capacidad de localización nuclear eucariota como vehículos de transporte de ADN. El hecho de que las TPs de Streptomyces pueden participar de forma eficaz en el transporte del ADN al núcleo eucariota supone un respaldo adicional de esta hipótesis (Tsai H.H. et al. 2008) . Por tanto, las NLS de las TP pueden haber facilitado la transferencia génica entre organismos alejados en la evolución. La realización de estudios genómicos y metagenómicos enfocados a la identificación de sistemas de replicación de ADN cebada por proteínas en otros ecosistemas, ayudaría a entender el origen evolutivo y los papeles funcionales de las TP y de los genomas que contienen TPs . Para generar ADNs de cualquier tipo unidos a una proteina terminal de un bacteriófago, se aplica el método descrito en PCT/ES2012/070121.
La presente invención hace referencia al uso en medicina de una proteina terminal de un virus bacteriófago, con replicación de ADN cebada por proteínas, en la preparación de un medicamento o composición farmacéutica útil en medicina, caracterizado por que dicha proteína comprende: a) al menos una secuencia aminoacídica de localización al núcleo celular (función NLS), cuando dicha proteína se expresa o libera en células de mamífero, que responde un de las siguientes secuencias consenso: i) K-x (0, 2 ) -R-x (0, 1) -K, ii) K-x (1, 2) -K-x (1, 2 ) -R, o iii) K-K-x (0, 1) -K; y donde "x" es un amino ácido cualquiera conocido por un experto en la materia, y "0","1", y "2" (números entre paréntesis) es la posición que ocupa en la secuencia dicho amino ácido; y. b) al menos una secuencia aminoacídica de unión covalente a los extremos del ADN, determinada mediante ensayos bioquímicos funcionales, tal y como se explica en el estado de la técnica.
La presente invención también hace referencia al uso de una proteína terminal descrita anteriormente, caracterizada por que el virus bacteriófago es de la familia Podovírídae o Tectívírídae .
La presente invención también hace referencia al uso de una proteína terminal descrita anteriormente, caracterizada por que dicha proteína terminal comprende en el tercio N-terminal una proporción de residuos aminoacídicos básicos deal menos entre el 21,8 al 34,5%, a menudo agrupados en grupos cargados positivamente, que son predominantes respecto a las cargas negativas . La presente invención también hace referencia al uso de una proteina terminal descrita anteriormente, caracterizada por que la proteina terminal tiene una identidad en su secuencia de aminoácidos igual o mayor del 78% respecto a la proteina terminal del virus bacteriófago O29con SEQ ID No: 1. Un experto en la materia entiende que un porcentaje de identidad igual o mayor del 78% significa que en la secuencia de aminoácidos se encuentran al menos un 78% de amino ácidos idénticos a los aminoácidos de la secuencia del virus bacteriófago O29con SEQ ID No: 1. Esta interpretación es válida para todos los porcentajes de identidad indicados en la presente invención .
La presente invención también hace referencia al uso de una proteina terminal descrita anteriormente, caracterizada por que la proteina terminal es la proteina terminal del virus bacteriófago Φ29 con SEQ ID No : 1.
La presente invención también hace referencia al uso de una proteina terminal descrita anteriormente, caracterizada por que la proteina terminal es la proteina terminal del virus bacteriófago Nf con SEQ ID No : .
La presente invención también hace referencia al uso de una proteina terminal descrita anteriormente, caracterizada por que la proteina terminal es la proteina terminal del virus bacteriófago Cp-1 con SEQ ID No : 5.
La presente invención también hace referencia al uso de una proteina terminal descrita anteriormente, caracterizada por que la proteina terminal es la proteina terminal del virus bacteriófago Bam35 con SEQ ID No: 6.
La presente invención también hace referencia al uso de una proteina terminal descrita anteriormente, caracterizada por que la proteina terminal es la proteina terminal del virus bacteriófago PRD1 con SEQ ID No : 7. La presente invención también hace referencia al uso de una proteina termina1 descrita anteriormente, caracterizada por que comprende un dominio N-terminal con SEQ ID No: 2.
La presente invención también hace referencia al uso de una proteina terminal descrita anteriormente, caracterizada por que el dominio N- terminal comprende la secuencia de aminoácidos 1-37 con SEQ ID No: 3.
La presente invención también hace referencia al uso de una proteina terminal descrita anteriormente, caracterizada por que comprende los grupos de Usinas ,25KAK27' y ,32KKK34' .
La presente invención también hace referencia al uso de una proteina terminal descrita anteriormente, caracterizada por que dicha proteina se emplea como vehículo de transporte de ADN al interior del núcleo celular de un mamífero para la trasferencia de genes en terapia génica.
La presente invención también hace referencia al uso de una proteína terminal descrita anteriormente, caracterizada por que dicha proteína terminal se encuentra unida covalentemente a los extremos del ADN a transportar.
La presente invención también hace referencia al uso de una proteína terminal descrita anteriormente, caracterizada por que la proteína TP representa una fracción de al menos 0, 478% de la masa del ADN a transportar .
La presente invención también hace referencia al uso de una proteína terminal descrita anteriormente, caracterizada por que el ADN a transportar se encuentra unido al menos a una molécula de interés. Preferentemente, dicha molécula de interés se seleccionada entre: un anticuerpo para el reconocimiento de tipos celulares específicos, un péptido para el transporte a través de la membrana plasmática, una proteína para escape del endosoma, un dominio de unión a secuencias específicas de ADN y un dominio estimulador de la recombinación homologa . La presente invención también hace referencia al uso de una proteina terminal descrita anteriormente, caracterizada por que dicha proteina se emplea como herramienta en un procedimiento biotecnológico .
La presente invención también hace referencia al uso de una proteina terminal descrita anteriormente, caracterizada por que dicha proteina se emplea para potenciar la inserción génica.
La presente invención también hace referencia al uso de una proteina terminal descrita anteriormente, caracterizada por que dicha proteina se emplea para aumentar el rendimiento de un experimento de transfección .
La presente invención también hace referencia a un método de tratamiento de un paciente basado en la transferencia de genes al núcleo celular de un mamífero, para terapia génica, dicho método caracterizado por comprender cualquiera de los usos de una proteína terminal descritos anteriormente.
A lo largo de la descripción y las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Las siguientes figuras y ejemplos se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la presente invención.
DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
FIGURA 1. Localización nuclear de TP de Φ29. (A) Representación esquemática de la proteína YFP fusionada a los dominios de la ΤΡΦ29. (B) Imágenes de microscopía confocal de células COS-7 que expresan YFP e YFP fusionada a la TP completa o a sus distintos dominios. Se muestran imágenes de YFP y DAPI .
FIGURA 2. La inhibición del transporte activo evita la localización nuclear de la TP de Φ29. Localización de la TP de Φ29 como proteína de fusión a YFP, simple (YFP-TP) y doble (2YFP-TP) en células COS-7 tratadas o no con 2-desoxiglucosa y azida (2dG+Az) para depleción de la energía celular de acuerdo al procedimiento indicado en el Ejemplo 2. Se muestran imágenes de YFP y DAPI .
FIGURA 3 . Identificación de una NLS funcional mínima en TP de Φ29. (A) Representación esquemática de fragmentos de TP como proteínas de fusión a dobles YFP. (B) Imágenes de microscopía confocal de células COS-7 que expresan las proteínas de fusión indicadas. Se muestran imágenes de YFP, fusiones a YFP, y DAPI.
FIGURA 4 . Papel de los residuos cargados positivamente de TP de Φ29 en la localización nuclear. Imágenes de microscopía confocal de células COS-7 que expresan las 2YFP y 2YFP de fusión con mutantes de TP silvestre y de longitud completa. Se muestran imágenes de YFP, fusiones a YFP, y DAPI. El esquema anterior representa las YFP de fusión dobles y el fragmento de la secuencia que incluye los residuos mutados (en negrita) .
FIGURA 5 . Capacidad de unión a ADN de los mutantes de la TP de Φ29.
Ensayo de desplazamiento de la movilidad electroforética de las proteínas YFP de fusión (5, 10 o 50 nM) usando un fragmento de ADN de 216 pb generado por PCR. Después de una electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE) no desnaturalizante, la movilidad de los complejos núcleo-proteicos se detectó mediante autorradiografía . Los números del carril se indican debajo del gel.
FIGURA 6 . Las TPs de Φ29, Nf, PRD1 , Bam35 y Cp-1 localizan en el núcleo de células eucarióticas . Imágenes de microscopía confocal de células COS-7 que expresan las fusiones de 2YFP con las TPs Φ29, GA1, Nf, PRD1, Bam35, Cp-1 y ABV. Se muestran imágenes de YFP y DAPI .
FIGURA 7 . Efecto de la TP de Φ29 covalentemente unida al ADN sobre el rendimiento de la transfección. (A) Esquema del mapa del plásmido pEYFPORBAE (SEQ ID. 29) que incluye los orígenes de replicación del genoma de Φ29. Dicho plásmido fue amplificado por PCR convencional o mediante el sistema de amplificación mediado por la TP de Φ29. (B) Gel de agarosa en el que se muestra el resultado de tratamientos sucesivos con proteinasa K y □ . exonucleasa sobre ADN del plásmido pEYFPORBAE amplificado por PCR (canales 1 y 2) o mediante el sistema mínimo de amplificación mediado por la TP Φ29 (canales 9 y 10), utilizando el pEYFPORBAE amplificado por PCR como molde (canales 7 y 8) . El genoma de Φ29 purificado de bacteria infectada (canales 3 y 4) y amplificado in vítro (canales del 11 al 14) se utilizó como control en estos tratamientos. A la izquierda se indican, en pares de bases, los tamaños del pEYFPORBAE, el genoma de Φ29 y los fragmentos de digestión con la enzima de restricción HindIII del genoma de Φ29 (canal 5) . (C) Western blot de extractos celulares COS-7 transfectados con diferentes formas del pEYFPORBAE, con o sin TP: plásmido superenrollado (canales 2 al 4), lineal (canales 5 al 7) y TP-ADN (canales 8 al 10) . Como control se utilizó también un TP-ADN tratado con proteinasa K y □ . exonucleasa (canal 11) (D) señal de YFP normalizada obtenida de la densitometría de bandas de tres experimentos independientes Western blot.
FIGURA 8 . Diferentes construcciones de TP de Φ29 se localizan en el interior del núcleo celular. (A) Imágenes confocales de células COS- 7 que expresan las YFP-TP y TP-YFP de fusión con la TP de Φ29. (B) Imágenes de microscopía confocal de inmunofluorescencia de células COS-7 sometidas a transfección simulada y transfectadas con un plásmido que expresa la TP. Las inmunofluorescencias se llevaron a cabo tal y como se ha descrito en Redrej o-Rodríguez M. et al. 2006, utilizando anticuerpos contra la TP de Φ29 y visualizacion con alexa 488 secundaria. (C) Imágenes fluorescentes de células HeLa y COS-7 que expresan las YFP de fusión y las proteínas YFP-TP. La fluorescencia se detectó con un filtro CFP/YFP-ET doble (89002; Chroma) y las imágenes se adquirieron como se ha descrito usando una cámara Sony CoolSnap HQ cooled CCD (Roper Scientific) acoplada a un microscopio Zeiss Axiovert 200M.
FIGURA 9 . Expresión y estabilidad de las proteínas de fusión de YFP en células COS-7. Análisis por Western blot de extractos celulares de células transfectadas realizados con un anticuerpo anti-GFP que efectúa una reacción cruzada con YFP (Invitrogen A-6455) . El inmuno- blot se llevó a cabo con extractos de aproximadamente 10.000 células por carril .
FIGURA 10. Proteínas YFP de fusión purificadas. SDS-PAGE (12%) de proteínas purificadas, marcadas con "strep-tag" para ensayos de unión a ADN. La migración electroforética de los marcadores del tamaño molecular se indica a la izquierda. La cuantificación de las bandas se llevó a cabo mediante densitometría (ImageJ) de geles complementarios y se compararon los diferentes niveles con las cantidades conocidas de las proteínas control. Para YFP-Nt ( 1-2 ) , YFP-Nt ( 14-37 ) y YFP-Nt ( 1-37 ) , que tienen más de una sola banda, sólo se tuvo en cuenta para la cuantificación la banda superior, del tamaño esperado .
FIGURA 11. Capacidad de unión a ADN de los dominios de TP. Ensayo de desplazamiento de la movilidad electroforética de las proteínas YFP de fusión (5, 10 o 50 nM) . Tras una electroforesis en gel de poliacrilamida no desnaturalizante, la movilidad de los complejos núcleo-proteicos se detectó mediante autorradiografía . Los números de carril se indican debajo del gel.
EJEMPLOS
Los siguientes ejemplos específicos que se proporcionan en este documento de patente sirven para ilustrar la naturaleza de la presente invención. Estos ejemplos se incluyen solamente con fines ilustrativos y no han de ser interpretados como limitaciones a la invención que aquí se reivindica. Por tanto, los ejemplos descritos más adelante ilustran la invención sin limitar el campo de aplicación de la misma.
EJEMPLO 1. Las TPs de los fagos Φ29, Nf, PRD1, Bam35 y CP1 poseen NLS predichas y además localizan en el núcleo celular
Se analizaron las secuencias de TPs anotadas de todos los tipos representativos de bacteriófagos para los que se ha propuesto un mecanismo de replicación mediado por TP (Tabla 1) . Excepto para el caso de Φ29, GA1 y Nf, que pertenecen al mismo género de virus, las TP de fagos no muestran ninguna similitud de secuencia clara, aunque comparten una proporción de 21,8 a 34,5% de residuos básicos, a menudo agrupados en grupos cargados positivamente, que son predominantes respecto a las cargas negativas en el tercio N- terminal de la proteina. Buscamos NLS putativas utilizando los programas PSORT y NLStradamus (www.psort.org y www.moseslab.csb.utoronto.ca/NLStradamus; Nakai y Horton 1999; Nguyen Ba A.N. et al. 2009, Nunes-Correia I et al. 2008). NLSs predichas (pNLSs) fueron encontradas con ambos métodos en seis de las once secuencias de TP examinadas. Además, NLStradamus fue capaz de detectar NLSs en la TP de Φ29 y de NF. Es interesante destacar que los fagos OYS40 y ABV existen en hábitats extremos en los que generalmente se encuentran menos biomasa eucariota, lo que podría explicar la falta de NLS en sus plataformas tecnológicas. De este modo, una o más NLSs se detectaron en las TPs de todos menos uno (GA1) de los fagos mesófilos analizados. Por lo tanto, puede deducirse que la presencia de motivos NLS es una característica muy extendida en TP de fagos. Todas las NLS predichas para las TPs comprenden alguna de las siguientes secuencias consenso: K-x(0,2)-R- x(0,l)-K, K-x (1, 2 ) -K-x (1, 2) -R o K-K-x ( 0 , 1 ) -K, donde Λχ' hace referencia a cualquier amino ácido conocido por un experto en la materia, y los número entre paréntesis al número de posiciones ocupadas en la secuencia.
Las predicciones se confirmaron posteriormente mediante experimentos de expresión transitoria de las TPs de Φ29, GA1, NF, PRD1, Bam35, Cp-1 y TP ABV en células COS-7 de mamíferos (Figura 6) . Salvo GA1 y ABV, la expresión de todos las TP analizadas confirió localización exclusivamente nuclear a proteínas de fusión a una doble YFP. Puesto que todas estas fusiones 2YFP-TP (75-85 kDa) están en gran parte por encima del límite aceptado para exclusión de los poros nucleares (alrededor de 50 kDa, ver ref. Górlich y Mattaj 1996), la localización nuclear de las TPs de fagos debe estar mediada por la vía de importación nuclear.
En conjunto, las predicciones in silico y los resultados experimentales sugieren que la presencia de un motivo NLS puede ser una característica evolutiva común en diferentes TP procarióticas . Tabla 1.
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En la Tabla 1 se resumen las predicciones y determinaciones de NLS en TP de orígenes diversos. Se indican las NLS monopartitas ( + ) y bipartitas (2+) detectadas con PSORT (Reinhardt A. & Hubbard T. 1998) y las NLS predichas con NLStradamus (Nguyen Ba A.N. et al. 2009), usando un valor de umbral de 0,45 (+) o 0,75 (++) . Se utilizaron las secuencias de las TPs de Φ29, GA1, Nf, CP-1, OCP24R, AV-1, ascc028, Bam35, PRD1, ABV y OYS40.
EJEMPLO 2 : La TP del bacteriófago Φ29 comprende una NLS
Para determinar la localización subcelular de la TP de Φ29 en células eucariotas, se transfectaron células COS-7 con un vector que expresaba una proteína de fusión que comprendía la proteína amarilla fluorescente (Yellow Fluorescent Protein, YFP) y la TP de Φ29, denominada YFP-TP (ver los detalles en el Ejemplo 8) . La señal YFP se analizó mediante microscopía de fluorescencia confocal. La señal de proteína de fusión YFP-TP se localiza exclusivamente en el núcleo, marcado por tinción con DAPI del ADN nuclear, mientras que la proteína control YFP apareció dispersa de forma uniforme en la célula (Figura IB, paneles i vs . ii) . Se encontró un patrón de distribución similar en células HeLa humanas (Figura 8C) . Esta localización subcelular es intrínseca de la secuencia P, ya que la TP-YFP de fusión orientada alternativamente y la TP sola, detectada con anticuerpos específicos contra la TP, también dirigió al núcleo celular (Figura 8). En algunas células, también se detectaron pequeños focos de señal fuerte en regiones perinucleares (Figura IB, flechas en los paneles ii-a) que podrían corresponder a la formación de agregosomas, descrita en proteínas quiméricas de fusión similares (Garcia-Mata R. et al. 1999) .
Después, se analizó la localización subcelular de las proteínas YFP de fusión con los dominios funcionales de la TP (proteínas de fusión YFP-Ct, YFP-ICt, YFP-I, YFP-Nt e YFP-NtI) (Figura IB) . Las señales YFP-Ct, YFP-ICt e YFP-I se localizaron dispersas por la célula (Figura IB, paneles iii, iv y v) , pero las señales de las YFP-Nt e YFP-NtI de fusión (paneles vi y vii) mostraron localización nuclear. El análisis por Western blot de las células transfectadas mostró bandas únicas de proteínas de fusión, descartando la posibilidad de una degradación parcial que podría justificar la localización dispersa de YFP-Ct, YFP-ICt e YFP-I (Figura 9) . Los resultados sugieren que el dominio Nt de la TP comprende una secuencia que actúa como una NSL cuando se expresa en células eucariotas de mamífero .
Aunque la masa de la YFP-TP de fusión (60 kDa) es superior a la masa que normalmente se identifica como límite para el transporte pasivo al núcleo (aproximadamente 45 kDa) , se han identificado algunas proteínas de fusión de mayor masa, moviéndose al núcleo de forma pasiva en ausencia de una NLS, probablemente debido a su forma alargada. El transporte nuclear mediado por NLS de las proteínas requiere hidrólisis Ran-GTP y es inhibido específicamente por depleción de ATP (Xu D. et al., 2010) . Para confirmar de manera adicional la presencia de una NLS en la TP de Φ29, se analizó la localización de la proteina de fusión sencilla (YFP-TP) y doble
(2YFP-TP, 85.8 kDa), expresadas en las mismas condiciones y tratadas o no con 2-desoxiglucosa (2-dG) y azida, para bloquear el transporte activo a través del NPC (ver el Ejemplo 8) . La Figura 2 muestra la localización de YFP-TP y 2YFP-TP en condiciones de control y depleción de energía. En las células control, la señal YFP-TP se detectó completamente en el núcleo (paneles i), mientras que la señal se diseminó a lo largo de las células con depleción de energía
(paneles iii), lo que implica que un mecanismo activo dirige su localización nuclear en condiciones de control. La 2YFP-TP de fusión también presentó localización nuclear en células control (paneles ii) , pero no se difundió en el citosol, permaneciendo en el núcleo tras el tratamiento con 2dG+azida (paneles iv) , lo que indica que el tamaño de esta proteína doble YFP de fusión está por encima del límite superior para el transporte por difusión pasiva en células COS-7. Estos resultados demuestran que la TP del fago Φ29 comprende una NLS funcional .
EJEMPLO 3: El fragmento 1-37 N-terminal en la TP constituye la NLS mínima
Para definir la NLS responsable de la importación nuclear de la TP, se construyeron tres proteínas dobles YFP de fusión comprendiendo los siguientes fragmentos del dominio Nt de la TP: (1) los primeros 1-37 residuos comprendiendo la mayoría (76%) de los aminoácidos básicos de Nt, (2) el fragmento 14-37 comprendiendo una cNLS predicha (Tabla 1) y (3) el fragmento 1-24, excluyendo los grupos de residuos básicos y la NLS predicha. La localización subcelular de estas construcciones mostró que los primeros 1-37 aminoácidos confieren una clara localización nuclear a la proteína de fusión 2YFP, como ocurre con la TP de longitud completa (Figura 3B, paneles ii y iii) . Sin embargo, el fragmento Nt(l-24) no modifica la localización de una construcción YFP doble (Figura 3B, paneles iv) , mientras que la proteína de fusión Nt (14-37) produce un claro incremento de la señal nuclear, aunque el citoplasma también comprende una señal YFP (Figura 3B, paneles v) . La posible degradación de la proteina que podría liberar la YFP sola se descartó mediante análisis por Western blot (Figura 9), lo que indica que la construcción 2YFP-Nt ( 14-37 ) tiene una alteración parcial del mecanismo de transporte NLS. Además, un mutante de TP carente de los primeros 1-37 aminoácidos del extremo N-terminal, no se acumula en el núcleo, lo que destaca el papel esencial de dicha región (Figura 3B, paneles vi) . Por tanto, se concluye que la secuencia correspondiente a los primeros 1-37 aminoácidos de la TP de Φ29 se comporta bona. fide como una NLS.
EJEMPLO 4: Los grupos de Usina desempeñan un papel esencial en la localización al núcleo de la TP.
Dado que el fragmento Nt(l-24) no dirige al núcleo y el Nt (14-37) provoca parcialmente la localización nuclear, se diseñaron mutantes en esta región de la TP de longitud total para el mapeo con mayor detalle de la función NLS. Como se ha mencionado, la mayoría de las NLSs comprenden grupos de aminoácidos básicos; por tanto, se realizaron sustituciones de alanina de los grupos de lisina K25-K27 y K32-K33-K34. También se construyeron mutantes K27A y R19A sencillos porque las NLSs bipartitas clásicas normalmente comprenden un único R/K que precede al principal grupo básico en 4-10 residuos. La mutación R19A no cambió el fenotipo de la TP silvestre (Figura 4, paneles ii vs . iii), que descarta el papel de este residuo en la localización nuclear de la TP. Por otro lado, el mutante sencillo K27A mostró un fenotipo intermedio con la señal YFP en toda la célula, aunque con alguna acumulación nuclear (Figura 4, iv) . La disminución de la función NLS fue más intensa en el doble mutante K25A/K27A que mostró una señal de diseminación uniforme dentro de la célula (Figura 4, v) . La mutación triple K32A/K33A/K34A condujo también a una deficiencia en la función NLS (Figura 4, vi), con la proteína distribuida principalmente en el citoplasma. Estos resultados indican que los motivos ,25KAK27' y ,32KKK34' son importantes para la función NLS .
EJEMPLO 5: El subdominio Nt(l-37) de la TP de Φ29 tiene tanto función de unión a ADN como de localización al núcleo. Dado que muchas NLSs se co-localizan en dominios de unión a ADN, se ha propuesto que los motivos de unión a ADN pueden estar en el origen evolutivo de los mecanismos de transporte nuclear (LaCasse E.C. & Lefebvre Y. A. 1995; Cokol M. et al. 2000). Dado que el dominio Nt de la ΤΡΦ29 se puede unir al ADN in vítro (Muñoz-Espin D. et al. 2010), se evaluaron las propiedades de unión a ADN de los motivos y residuos estudiados en los experimentos de localización subcelular de la ΤΡΦ29. Para este fin se purificaron las proteínas de fusión YFP usando el sistema "strep-tag" de purificación (ver el Ejemplo 8) y se comparó su capacidad de unión a dsADN con la de la TP silvestre mediante ensayos de retraso en gel. De acuerdo con un trabajo previo (Muñoz-Espin D. et al. 2010), la Figura 11 muestra que todas las fusiones YFP comprendiendo el dominio Nt (YFP-TP, YFP- Nt e YFP-NtI) pueden desplazar la movilidad del sustrato de ADN de forma similar a la TP purificada sola, usada como control positivo, mientras que la proteína de fusión YFP-ICt, al igual que la proteína YFP del control negativo, no presentó capacidad de unión a ADN. Como se muestra en la Figura 5, el fragmento Nt(l-37) de la TP confirió a la proteína de fusión YFP una capacidad de unión a ADN casi comparable con la de la TP de longitud total (comparar los carriles 2 vs . 7) . Por otro lado, el fragmento 14-37 de la TP también dio lugar a una banda retrasada, aunque la cantidad de ADN desplazado fue mucho menor que la del fragmento 1-37 (carriles 5 y 6 vs . 7 y 8) . Por último, el fragmento 1-24 del dominio Nt no desplazó el fragmento de dsADN (Figura 5, carriles 3-4), ni siquiera a la concentración más alta analizada. Estos resultados indican que todo el fragmento Nt(l-37) es necesario para su función de unión a ADN, sugiriendo una correlación entre la función de unión a ADN y la función NLS .
También se evaluó la capacidad de unión a ADN de las proteínas mutantes YFP-TP R19A, K27A, K25A/K27A y K32A/K33A/K34A. La sustitución de un solo aminoácido R19A esencialmente no redujo la capacidad de unión a ADN respecto a la TP silvestre (Figura 5, carriles 9 y 10 vs . 1 y 2), mientras que los mutantes K27A y K25A/K27A mostraron una disminución y una fuerte reducción, respectivamente, de la cantidad de ADN retrasado (Figura 5, calles 11-12 y 13-14) . El mutante triple K32A/K33A/K34A también mostró una unión al ADN deficiente, en comparación con la TP silvestre (carriles 15-16 vs . 1-2), aunque menos intensa que la del mutante K25A/K27A. Por tanto, los imitantes del grupo lisina mostraron una unión al ADN reducida y una función NLS deficiente, lo que reafirma la correlación entre ambas funciones .
EJEMPLO 6: Internalización de genes en el núcleo facilitada por TP
Tras demostrar que las proteínas terminales (TP) de varios bacteriófagos comprenden al menos una NLS, nos preguntamos si esta señal podría desempeñar un papel en la translocación de ADN heterólogo en el núcleo de las células eucariotas . Para evaluar el efecto de las TP unidas al ADN, transfectamos células COS-7 con un ADN lineal basado en el plásmido pEYFP-Nl (pEYFPORBAE, SEQ ID. 29), pero con los orígenes del bacteriófago Φ29 y se amplificó in vítro con el sistema de amplificación de ADN mínimo de Φ29 (Mencía M. et al. 2011) con el fin de incorporar la TP unida covalentemente a ambos extremos 5' (ver Figura 7A) . Se comprobó que el ADN amplificado, incluso tras eliminar la mayor parte de la TP con proteinasa K, es resistente a actividades 5' exonucleasa (Figura 7B) . Para la comparación se transfectaron también la forma lineal del mismo plásmido, amplificado mediante PCR convencional y el plásmido circular superenrollado y purificado del cultivo bacteriano ( PromegaWizard® Minipreps ADN Purification System). Las transfecciones se realizaron con Lipofectamine ( Invitrogen) , siguiendo las instrucciones del fabricante y usando cantidades diferentes de reactivo. Para monitorizar la expresión de proteínas, las células se recogieron a las 24 horas de la transfección directamente en tampón de muestra SDS-PAGE y los extractos celulares se analizaron con Western blot con un anticuerpo anti-GFP que sufre reacción cruzada con YFP (Invitrogen A-6455).
La figura 7 muestra que, tal y como se esperaba, el reactivo de transfección es necesario para obtener la internalización del ADN y la posterior expresión de proteínas de todas las formas de ADN, de modo que se descarta una internalización en la célula del ADN mediada por las TP. En presencia de reactivo lipofectamina, la transfeccion del ADN lineal (ADNlin) proporcionó menos eficiencia de transfeccion que el ADN superenrollado circular (scADN) , probablemente a causa de una mayor resistencia a la degradación y a su forma más compacta . Cabe destacar que la expresión de YFP en las células transfectadas con la forma TP-ADN, fue superior que en el ADN lineal (se multiplica por aproximadamente 4) y muy similar a la del ADNsc, lo que indica estimulación en presencia de la proteina ΤΡΦ29 unida covalentemente al extremo 5' del ADN. Además, el TP-ADN tratado con proteinasa K y exonucleasa □, que ha perdido casi por completo la TP (y por lo tanto la NLS) , pero es más resistente a degradación, resultó muy poco eficaz (Figura 7C, canal 11) . En conjunto estos resultados indican potenciación de la translocación nuclear por medio de la NLS de la TP.
Este resultado proporciona pruebas de que la ΤΡΦ29 puede potenciar la inserción de genes y sugiere una participación directa en el transporte de ADN a través del complejo del poro nuclear. Por tanto, el sistema de amplificación de ADN cebado por la TP de Φ29 es una herramienta útil con fines biotecnológicos , no solo para amplificación del ADN sino también para potenciar la inserción de genes y, por tanto, para incrementar el rendimiento de los experimentos de transfeccion con el objeto de llevar a cabo terapia génica .
EJEMPLO 7 : Material y métodos
7.2 Expresión transitoria y análisis confocal de las YFP-TP de fusión
Las células COS-7 se obtuvieron de la Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC) y se cultivaron en medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) comprendiendo un 10% de suero bovino fetal (FCS) . Para los experimentos de expresión transitoria, se transfectaron plásmidos que expresan proteínas terminales de fagos como proteínas de fusión a YFP, tal y como se detalla en la lista de secuencias (SEQ ID No. 8, SEQ ID No. 9, SEQ ID No. 10, SEQ ID No. 11, SEQ ID No. 12, SEQ ID No. 13, SEQ ID No. 14, SEQ ID No. 15, SEQ ID No. 16, SEQ ID No. 17, SEQ ID No. 18, SEQ ID No. 19, SEQ ID No. 20, SEQ ID No. 21, SEQ ID No. 22, SEQ ID No. 23, SEQ ID No. 24, SEQ ID No. 25, SEQ ID No. 26, SEQ ID No. 27, y SEQ ID No. 28) . Las células se cultivaron sobre cubreobjetos de cristal en 24 pocilios a 20.000 células/cm2. Las transfecciones se realizaron con Lipofectamina y Reactivo Plus (Invitrogen) siguiendo las instrucciones del fabricante. En los experimentos para bloquear el transporte activo, las células que expresaban las proteínas de fusión (16 horas tras la transfección) fueron deplecionadas de energía mediante incubación a 4°C durante 2 horas con azida sódica 10 mM y 2-desoxiglucosa 10 mM en DMEM sin glucosa. Por último, las células se lavaron con PBS y se fijaron doblemente con paraformaldehído al 4% (15 minutos a temperatura ambiente) más metanol (5 minutos a -20°C) , y se montaron con el medio de montaje Mowiol-DABCO (que comprende DAPI lDg/ml) en portaobjetos de cristal. Las preparaciones se analizaron con un microscopio de láser confocal Multifotón LSM510 (Zeiss). Las imágenes se procesaron usando el software "ImageJ" (Rasband W.S. 1997-2011; http://rsbweb.nih.gov/ij/). Para monitorizar la expresión proteica mediante Western blot se produjo la transfección de las células en las mismas condiciones, y se lavaron directamente en el tampón para muestras SDS-PAGE (Figura 9) .
7.2 Purificación de las proteínas YFP-TP de fusión
La TP silvestre se purificó tal y como se ha descrito en el estado de la técnica (Mencía M. et al. 2011) . Las YFP-TP de fusión marcadas con "strep-tag" se purificaron como se ha descrito en el estado de la técnica (Schmidt T.G. & Skerra A. 2007) con pequeñas modificaciones. En pocas palabras, los cultivos mantenidos durante la noche se inocularon a 1:500 en medio de autoinducción fresco con 150 Dg ampicilina/ml de medio (Studier F.W. 2005), se cultivaron durante 2 horas a 30 °C y, después, durante la noche a temperatura ambiente. Las células se recogieron y lisaron con alúmina en 4 volúmenes de tampón A (Tris-HCl 50 mM, a pH 8, Tween 20 al 0,1%, glicerol al 5%, EDTA lmM, 2-mercaptoetanol 7mM y mezcla completa de inhibidores de proteasas (Roche)) suplementado con NaCl 1 M. Tras centrifugar, las proteínas YFP, YFP-TP, YFP-Nt, YFP-NtI, YFP-Nt (1- 24), YFP-Nt (14-37 ) , YFP-Nt ( 1-37 ) , YFP-TP_R19A y YFP-TP-K32/33/34A se recuperaron cuantitativamente de la fracción soluble, mientras que YFP-ICt, YFP-TP_K27A y YFP-K25/27A se recuperaron de los precipitados. Las proteínas solubles se purificaron mediante cromatografía de afinidad de una sola etapa con columnas de resina Strep-Tactin (IBA), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las proteínas de la fracción insoluble se solubilizaron con tampón A que comprende guanidina clorhidrato 4M y, tras la diálisis contra el tampón A suplementado hasta glicerol al 25 %, se purificaron mediante el mismo método. Por último, las fracciones eluidas que contenían las proteínas se mezclaron, se dializaron contra Tris-HCl 50 mM, a pH 8, NaCl 300 mM, EDTA 1 mM, 2-mercaptoetanol 7 mM, glicerol al 50% y se almacenaron a -20°C. La Figura 10 muestra un SDS-PAGE de las preparaciones proteicas finales .
7.3. Ensayos de desplazamiento de la movilidad electroforática del ADN
Se efectuaron ensayos de retraso en gel tal como se describe en el estado de la técnica (Muñoz-Espín D. et al. 2010) con algunas pequeñas modificaciones. En pocas palabras, un fragmento de ADN de 216pb correspondiente al gen yshC de B. subtilis se amplificó mediante PCR, se purificó en gel de agarosa (Gel Extraction Kit, Qiagen) y, después, se marcó en 5' con [γ-32Ρ] -ATP y polinucleótido quinasa de T4. Este sustrato de ADN (0,5nM) se incubó en un volumen final de 20μ1 con una mezcla de reacción que contenía Tris-HCl 50 mM, a pH 7,5, EDTA 1 mM, glicerol al 4%, 0,1 mg/ml de seroalbúmina bovina, ditiotreitol 1 mM, Tween20 al 0,05% y las concentraciones indicadas de la proteína correspondiente. Tras incubación en hielo durante 5 minutos, las muestras se sometieron a electroforesis en geles de poliacrilamida al 4% (peso/volumen) (80 1, monómero bis), que comprende Tris acetato 12 mM, a pH 7,5 y EDTA 1 mM, corriendo a 4°C en el mismo tampón a 8 V/cm. Los geles se sometieron directamente a autorradiografía a -80°C. BIBLIOGRAFÍA Carbón S, Ireland A, Mungall CJ, Shu S, Marshall B, et al.
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Claims

REIVINDICACIONES
1. Uso de una proteina terminal de un virus bacteriófago en la preparación de un medicamento o composición farmacéutica útil en medicina, caracterizado por que dicha proteina comprende: a) al menos una secuencia aminoacidica de localización al núcleo celular en células de mamífero, con una secuencia consenso seleccionada de entre el siguiente grupo: i) K-x (0, 2 ) -R-x (0, 1) -K, ii) K-x (1, 2) -K-x (1, 2 ) -R, y iii) K-K-x (0, 1) -K, donde "x" es un amino ácido, y "0","1", y "2" es la posición que ocupa en la secuencia dicho amino ácido; y b) al menos una secuencia aminoacidica de unión covalente a los extremos del ADN, determinada mediante ensayos bioquímicos funcionales .
2. Uso de una proteína terminal según la reivindicación 1, caracterizada por que el virus bacteriófago es de la familia Podovírídae o Tectívírídae .
3. Uso de una proteína terminal según cualquiera de las reivindicaciones 1-2, caracterizada por que dicha proteína terminal comprende en el tercio N-terminal una proporción de residuos aminoacídicos básicos del 21,8 al 34,5%, agrupados en grupos cargados positivamente predominantes respecto a las cargas negativas .
4. Uso de una proteína terminal según cualquiera de las reivindicaciones 1-3, caracterizada por que la proteína terminal tiene una identidad en su secuencia de aminoácidos igual o mayor del 78% respecto a la proteína terminal del virus bacteriófago Φ29 con SEQ ID No: 1.
5. Uso de una proteina terminal según cualquiera de las reivindicaciones 1-4, caracterizada por que la proteina terminal es la proteina terminal del virus bacteriófago Φ29 con SEQ ID No: 1.
6. Uso de una proteina terminal según cualquiera de las reivindicaciones 1-4, caracterizada por que la proteina terminal es la proteina terminal del virus bacteriófago Nf con SEQ ID No: 4.
7. Uso de una proteina terminal según cualquiera de las reivindicaciones 1-4, caracterizada por que la proteina terminal es la proteina terminal del virus bacteriófago Cp-1 con SEQ ID No: 5.
8. Uso de una proteina terminal según cualquiera de las reivindicaciones 1-4, caracterizada por que la proteina terminal es la proteina terminal del virus bacteriófago Bam35 con SEQ ID No: 6.
9. Uso de una proteina terminal según cualquiera de las reivindicaciones 1-4, caracterizada por que la proteina terminal es la proteina terminal del virus bacteriófago PRD1 con SEQ ID No: 7.
10. Uso de una proteina terminal según la reivindicación 5, caracterizada por que comprende un dominio N-terminal con SEQ ID No: 2.
11. Uso de una proteina terminal según la reivindicación 10, caracterizada por que el dominio N-terminal comprende la secuencia de aminoácidos 1-37 con SEQ ID No: 3.
12. Uso de una proteina terminal según cualquiera de las reivindicaciones 10-11, caracterizada por que comprende los grupos de Usinas ,25KAK27' y ,32KKK34' .
13. Uso de una proteina terminal según cualquiera de las reivindicaciones 1-12, caracterizada por que dicha proteina se emplea como vehículo de transporte de ADN al interior del núcleo celular de un mamífero para la trasferencia de genes en terapia génica .
HOJA DE REEMPLAZO (Regla 26)
14. Uso de una proteina terminal según la reivindicación 13, caracterizado por que dicha proteina terminal se encuentra unida covalentemente a los extremos del ADN a transportar.
15. Uso de una proteina terminal según la reivindicación 14, caracterizado por que la proteina TP representa una fracción de al menos 0,478% de la masa del ADN a transportar.
16. Uso de una proteina terminal según cualquiera de las reivindicaciones 13-15, caracterizado por que el ADN a transportar se encuentra unido al menos a una molécula de interés .
17. Uso de una proteina terminal según la reivindicación 16, caracterizado por que la molécula de interés se seleccionada entre: un anticuerpo para el reconocimiento de tipos celulares específicos, un péptido para el transporte a través de la membrana plasmática, una proteína para escape del endosoma, un dominio de unión a secuencias específicas de ADN y un dominio estimulador de la recombinación homologa.
18. Uso de una proteína terminal según cualquiera de las reivindicaciones 1-17, caracterizada por que dicha proteína se emplea como herramienta en un procedimiento biotecnológico .
19. Uso de una proteína terminal según cualquiera de las reivindicaciones 1-18, caracterizada por que dicha proteína se emplea para potenciar la inserción génica.
20. Uso de una proteína terminal según cualquiera de las reivindicaciones 1-19, caracterizada por que dicha proteína se emplea para aumentar el rendimiento de un experimento de transfección.
21. Método de tratamiento de un paciente basado en la transferencia de genes al núcleo celular para terapia génica, caracterizado por comprender el uso de una proteína terminal según cualquiera de las reivindicaciones 1-20.
HOJA DE REEMPLAZO (Regla 26)
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