WO2014007667A1 - Autologous vaccine for treating pulmonary tuberculosis and method for producing same - Google Patents
Autologous vaccine for treating pulmonary tuberculosis and method for producing same Download PDFInfo
- Publication number
- WO2014007667A1 WO2014007667A1 PCT/RU2012/000498 RU2012000498W WO2014007667A1 WO 2014007667 A1 WO2014007667 A1 WO 2014007667A1 RU 2012000498 W RU2012000498 W RU 2012000498W WO 2014007667 A1 WO2014007667 A1 WO 2014007667A1
- Authority
- WO
- WIPO (PCT)
- Prior art keywords
- rhil
- cells
- medium
- mdc
- recombinant human
- Prior art date
Links
- 208000008128 pulmonary tuberculosis Diseases 0.000 title claims abstract description 25
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title abstract description 26
- 229940037642 autologous vaccine Drugs 0.000 title abstract description 7
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 53
- 210000004443 dendritic cell Anatomy 0.000 claims abstract description 49
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims abstract description 45
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims abstract description 45
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims abstract description 45
- 230000035800 maturation Effects 0.000 claims abstract description 43
- 230000028993 immune response Effects 0.000 claims abstract description 33
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 claims abstract description 31
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 claims abstract description 27
- 210000005087 mononuclear cell Anatomy 0.000 claims description 96
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 63
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 52
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 claims description 34
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 27
- 229960001005 tuberculin Drugs 0.000 claims description 23
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 claims description 21
- 229930182566 Gentamicin Natural products 0.000 claims description 20
- 229960002518 gentamicin Drugs 0.000 claims description 20
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 20
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 19
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 claims description 19
- CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N Gentamicin Chemical compound O1[C@H](C(C)NC)CC[C@@H](N)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](NC)[C@@](C)(O)CO2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N 0.000 claims description 19
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 claims description 19
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims description 19
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 18
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims description 16
- 229940030156 cell vaccine Drugs 0.000 claims description 15
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 12
- 229940040731 human interleukin-12 Drugs 0.000 claims description 11
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims description 10
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims description 10
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 claims description 10
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 claims description 10
- 241000187479 Mycobacterium tuberculosis Species 0.000 claims description 9
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 8
- 108010029961 Filgrastim Proteins 0.000 claims description 7
- 229940029345 neupogen Drugs 0.000 claims description 7
- 108010017213 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 claims description 5
- 102100039620 Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor Human genes 0.000 claims description 5
- 101000960954 Homo sapiens Interleukin-18 Proteins 0.000 claims description 5
- 102000043959 human IL18 Human genes 0.000 claims description 5
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims description 5
- 101001002657 Homo sapiens Interleukin-2 Proteins 0.000 claims description 4
- 101000611183 Homo sapiens Tumor necrosis factor Proteins 0.000 claims description 4
- 206010057249 Phagocytosis Diseases 0.000 claims description 4
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 4
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 claims description 4
- 102000055277 human IL2 Human genes 0.000 claims description 4
- 102000057041 human TNF Human genes 0.000 claims description 4
- 230000008782 phagocytosis Effects 0.000 claims description 4
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 claims description 4
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 claims description 4
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 claims description 4
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 claims description 4
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 claims description 4
- GNFTZDOKVXKIBK-UHFFFAOYSA-N 3-(2-methoxyethoxy)benzohydrazide Chemical compound COCCOC1=CC=CC(C(=O)NN)=C1 GNFTZDOKVXKIBK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 101001002709 Homo sapiens Interleukin-4 Proteins 0.000 claims description 3
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 claims description 3
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 claims description 3
- 102000055229 human IL4 Human genes 0.000 claims description 3
- 230000034701 macropinocytosis Effects 0.000 claims description 3
- 101000746373 Homo sapiens Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor Proteins 0.000 claims description 2
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 claims description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims description 2
- 230000035899 viability Effects 0.000 claims description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 abstract description 10
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 abstract description 3
- 230000003044 adaptive effect Effects 0.000 abstract 1
- 201000008827 tuberculosis Diseases 0.000 description 35
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 32
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 32
- 102100035793 CD83 antigen Human genes 0.000 description 24
- 101000946856 Homo sapiens CD83 antigen Proteins 0.000 description 24
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 17
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 17
- 102000006354 HLA-DR Antigens Human genes 0.000 description 14
- 108010058597 HLA-DR Antigens Proteins 0.000 description 14
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 14
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 12
- 238000011161 development Methods 0.000 description 12
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 12
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 10
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 10
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 10
- 102100037850 Interferon gamma Human genes 0.000 description 9
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 9
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 9
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 9
- 102000004503 Perforin Human genes 0.000 description 8
- 108010056995 Perforin Proteins 0.000 description 8
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 8
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 8
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 8
- 230000004044 response Effects 0.000 description 8
- KHGNFPUMBJSZSM-UHFFFAOYSA-N Perforine Natural products COC1=C2CCC(O)C(CCC(C)(C)O)(OC)C2=NC2=C1C=CO2 KHGNFPUMBJSZSM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 229930192851 perforin Natural products 0.000 description 7
- 101100390735 Mus musculus Figla gene Proteins 0.000 description 6
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 6
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 6
- 230000002365 anti-tubercular Effects 0.000 description 5
- 210000001151 cytotoxic T lymphocyte Anatomy 0.000 description 5
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 5
- 230000009696 proliferative response Effects 0.000 description 5
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 5
- 108010004729 Phycoerythrin Proteins 0.000 description 4
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 4
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 4
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 4
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 3
- 102000000588 Interleukin-2 Human genes 0.000 description 3
- 102000004388 Interleukin-4 Human genes 0.000 description 3
- 108090000978 Interleukin-4 Proteins 0.000 description 3
- 241000186359 Mycobacterium Species 0.000 description 3
- 230000030741 antigen processing and presentation Effects 0.000 description 3
- 210000000612 antigen-presenting cell Anatomy 0.000 description 3
- 230000008859 change Effects 0.000 description 3
- 230000005714 functional activity Effects 0.000 description 3
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 3
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 3
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 3
- 230000005070 ripening Effects 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 2
- 108010065805 Interleukin-12 Proteins 0.000 description 2
- 102000013462 Interleukin-12 Human genes 0.000 description 2
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 2
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-M Pyruvate Chemical compound CC(=O)C([O-])=O LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 2
- 230000004721 adaptive immunity Effects 0.000 description 2
- 230000002187 allostimulatory effect Effects 0.000 description 2
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 2
- 230000002924 anti-infective effect Effects 0.000 description 2
- 230000007503 antigenic stimulation Effects 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 2
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 238000003501 co-culture Methods 0.000 description 2
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 2
- 230000034994 death Effects 0.000 description 2
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N ether Substances CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 2
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 2
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 2
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 2
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 2
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 2
- 230000002688 persistence Effects 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- HIXDQWDOVZUNNA-UHFFFAOYSA-N 2-(3,4-dimethoxyphenyl)-5-hydroxy-7-methoxychromen-4-one Chemical compound C=1C(OC)=CC(O)=C(C(C=2)=O)C=1OC=2C1=CC=C(OC)C(OC)=C1 HIXDQWDOVZUNNA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010067484 Adverse reaction Diseases 0.000 description 1
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 1
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 1
- 206010002091 Anaesthesia Diseases 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 206010006049 Bovine Tuberculosis Diseases 0.000 description 1
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 108091029865 Exogenous DNA Proteins 0.000 description 1
- 102100037008 Factor in the germline alpha Human genes 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 206010019851 Hepatotoxicity Diseases 0.000 description 1
- 101000878291 Homo sapiens Factor in the germline alpha Proteins 0.000 description 1
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 1
- 238000012404 In vitro experiment Methods 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- 102000003810 Interleukin-18 Human genes 0.000 description 1
- 108090000171 Interleukin-18 Proteins 0.000 description 1
- 108010002386 Interleukin-3 Proteins 0.000 description 1
- 102100039064 Interleukin-3 Human genes 0.000 description 1
- 102000015696 Interleukins Human genes 0.000 description 1
- 108010063738 Interleukins Proteins 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 101100438949 Mus musculus Cd83 gene Proteins 0.000 description 1
- 241001646725 Mycobacterium tuberculosis H37Rv Species 0.000 description 1
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 1
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 230000024932 T cell mediated immunity Effects 0.000 description 1
- 102000004338 Transferrin Human genes 0.000 description 1
- 108090000901 Transferrin Proteins 0.000 description 1
- 102000000852 Tumor Necrosis Factor-alpha Human genes 0.000 description 1
- 102100040247 Tumor necrosis factor Human genes 0.000 description 1
- 206010053613 Type IV hypersensitivity reaction Diseases 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 1
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 1
- 230000006838 adverse reaction Effects 0.000 description 1
- 229940050528 albumin Drugs 0.000 description 1
- 208000030961 allergic reaction Diseases 0.000 description 1
- 230000000735 allogeneic effect Effects 0.000 description 1
- 230000037005 anaesthesia Effects 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 1
- 230000003078 antioxidant effect Effects 0.000 description 1
- 230000001640 apoptogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 1
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 230000031018 biological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 230000011712 cell development Effects 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 1
- 230000004640 cellular pathway Effects 0.000 description 1
- 230000036755 cellular response Effects 0.000 description 1
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 1
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000016396 cytokine production Effects 0.000 description 1
- 231100000050 cytotoxic potential Toxicity 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 230000008260 defense mechanism Effects 0.000 description 1
- 229940029030 dendritic cell vaccine Drugs 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 1
- 210000001163 endosome Anatomy 0.000 description 1
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 239000003797 essential amino acid Substances 0.000 description 1
- 235000020776 essential amino acid Nutrition 0.000 description 1
- 235000019441 ethanol Nutrition 0.000 description 1
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 210000003714 granulocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000003394 haemopoietic effect Effects 0.000 description 1
- 210000002443 helper t lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000003958 hematopoietic stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 231100000334 hepatotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003082 hepatotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 230000028996 humoral immune response Effects 0.000 description 1
- 230000002519 immonomodulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 230000001506 immunosuppresive effect Effects 0.000 description 1
- -1 includes: trasferrin Natural products 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 229940028885 interleukin-4 Drugs 0.000 description 1
- 229940047122 interleukins Drugs 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 229960003350 isoniazid Drugs 0.000 description 1
- QRXWMOHMRWLFEY-UHFFFAOYSA-N isoniazide Chemical compound NNC(=O)C1=CC=NC=C1 QRXWMOHMRWLFEY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920006008 lipopolysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 238000004020 luminiscence type Methods 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 210000000822 natural killer cell Anatomy 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 210000001539 phagocyte Anatomy 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000000770 proinflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 1
- 230000007420 reactivation Effects 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000002594 sorbent Substances 0.000 description 1
- 238000011301 standard therapy Methods 0.000 description 1
- 238000011272 standard treatment Methods 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 239000012581 transferrin Substances 0.000 description 1
- YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N trichloroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(Cl)(Cl)Cl YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000005951 type IV hypersensitivity Effects 0.000 description 1
- 208000027930 type IV hypersensitivity disease Diseases 0.000 description 1
- 210000003934 vacuole Anatomy 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/02—Bacterial antigens
- A61K39/04—Mycobacterium, e.g. Mycobacterium tuberculosis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/46—Cellular immunotherapy
- A61K39/461—Cellular immunotherapy characterised by the cell type used
- A61K39/4615—Dendritic cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/46—Cellular immunotherapy
- A61K39/462—Cellular immunotherapy characterized by the effect or the function of the cells
- A61K39/4622—Antigen presenting cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/46—Cellular immunotherapy
- A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
- A61K39/4648—Bacterial antigens
- A61K39/464817—Mycobacterium, e.g. Mycobacterium tuberculosis
Definitions
- the invention relates to medicine, in particular to vaccines that provide the formation of an immune response against M. tuberculosis mycobacterium tuberculosis and are intended for use in the treatment of pulmonary tuberculosis at various stages of the disease, and to methods for producing vaccines.
- tuberculosis is based on a violation of the interaction of immunocompetent cells as a result of prolonged persistence of mycobacteria inside antigen-presenting cells.
- tuberculosis The standard treatment for tuberculosis is based on the use of antibiotics that inhibit the development of mycobacteria at various stages of their life cycle.
- drug chemotherapy often leads to the development of drug-resistant strains of pathogens and therefore becomes ineffective and at the same time has a pronounced hepatotoxic effect.
- type 1 T-helpers An effective immune response to Mycobacterium tuberculosis mycobacteria is associated with the induction of the cellular component of the immune response, which in this case is realized by type 1 T-helpers.
- the activity of type 1 T-helpers directly depends on the presentation of antigen and their directed differentiation, which is carried out by dendritic cells (hereinafter DC), which are the main antigen-presenting cellular elements.
- DC dendritic cells
- DCs possess unique mechanisms of antigen capture and presentation to the naive T cells, determining the direction and activity of immune responses.
- DC derived from monocytes in contrast to macrophages derived from the same monocytes do not support intracellular replication of the virulent strain M.
- tuberculosis H37Rv due to reduced access of mycobacterial vacuoles to their endosome circuits and limited access to nutrients (Tailleux L, Neyrolles O, Honore-Bouakline S, Perret E, Sanchez F, Abastado JP, Lagrange PH Gluckman JC, Rosenzwajg M, Herrmann J. Constrained intracellular survival of Mycobacterium tuberculosis in human dendritic cells. J Immunol, 2003, V.15, N ° 170 (4). P.1939-1948).
- a known method of obtaining a cell vaccine for the treatment of tuberculosis (RU, 2262950, C1), in which allo and xenogenic macrophages and cells of macrophage cell lines are infected with a pathogenic strain of M. tuberculosis, after which the macrophages are treated with drugs that cause the death of mycobacteria, for example isoniazid, and then the cells are exposed to gamma radiation, leading to their death by apoptosis.
- Resistant and tuberculosis-sensitive animal lines are immunized with the obtained vaccine, and post-vaccination monitoring of indicators indicative of activation of the immune response is carried out: ⁇ -irradiated macrophages infected with mycobacteria are absorbed by dendritic cells; apoptotic cells absorbed by dendritic cells induce activation of CD4 + THY and CD8 + cytotoxic T cells, which are responsible for killing macrophages infected with mycobacteria.
- Target lysis is significant in the case of tuberculosis diseases, in which the pathogen is located and multiplies in macrophages. Lysis of these cells releases pathogens and enables activated macrophages to absorb bacteria and eliminate them.
- DC cells express high levels of B7-1 and secrete IL-12 and are the only powerful antigen presenting cells (APCs) that can activate naive T cells.
- APCs antigen presenting cells
- DCs can contribute to the differentiation of naive T cells into YO and CD8 + cytotoxic T cells. YOU and cytotoxic T cells are essential for the induction of protective immunity against M. tuberculosis. Vaccination leads to the activation of the immune response.
- the vaccine obtained by this method contains cells that are foreign to the body, which may cause the development of a post-vaccination allergic reaction.
- a known method of obtaining stimulated DC for the induction of immune response against human tuberculosis (RU, 2401664, C1), based on the collection of immature dendritic cells (hereinafter referred to as iDC) from the patient, their cultivation ex vivo for maturation and the formation of allostimulatory activity for subsequent additional antigen treatment and re-introduction of mature dendritic cells (iriDC) for the purpose of forming adaptive immunity, in which, upon ex vivo cultivation of immature DC (iDC), fragmented allogeneic double-stranded genomic DNA is introduced into the culture medium containing iDC of tuberculosis patients with fragments of 200-6000 bp in size, making up the complete gene of a physiologically and genetically healthy donor.
- iDC immature dendritic cells
- MNCs mononuclear cells
- IL-18 human interleukin-18
- IFN- ⁇ Interferon-y
- the method described above has less clinical efficacy due to the absence of rhIL-2 and rhIL-12 in the medium at the stage of co-cultivation.
- the task was to create a method for producing an autologous cell vaccine for the treatment of tuberculosis, containing two parts of the vaccine, obtained on the basis of autologous mononuclear blood cells: one part containing mature dendritic cells antigenactivated during maturation, and the other part containing T-lymphocytes specifically activated by these mature DCs antigenactivated during maturation for subsequent administration of the resulting vaccine to the body for the purpose of in vivo formation immune response against mycobacterium tuberculosis M. tuberculosis.
- the task was solved by creating an autologous cell vaccine for the treatment of pulmonary tuberculosis by forming an immune response against M. tuberculosis tuberculosis mycobacterium, containing one part containing mature dendritic cells antigenactivated during maturation (hereinafter AA mDC) and another part containing T-lymphocytes specifically activated by these mature dendritic cells antigenactivated during maturation (AA mDC).
- AA mDC mature dendritic cells antigenactivated during maturation
- AA mDC mature dendritic cells antigenactivated during maturation in one part
- T-lymphocytes specifically activated by the indicated mature dendritic cells antigen-activated during maturation
- MNCs mononuclear cells
- the base medium includes transferrin, leucine, glucose, pyruvate and a number of other substances, and has high biological stability, provides normal vital activity of many types and cell lines, including lymphoid cells;
- step b) separation of the mononuclear cells obtained in step b) into an adherent fraction of monocytes and an adherent fraction of lymphocytes;
- step d) culturing the monocytes of the adherent fraction obtained in step c) in vitro in a medium similar in composition to that used in step b) with the addition of 2-Mercaptoethanol, a recombinant analogue of granulocyte-macrophage colony stimulating factor (rhGM-CSF) and Interleukin - 4 (rhIl-4), to produce immature dendritic cells (iDC) that are capable of actively capturing antigen by phagocytosis and macropinocytosis;
- rhGM-CSF granulocyte-macrophage colony stimulating factor
- rhIl-4 Interleukin - 4
- step d) culturing the fraction obtained in step d) containing immature dendritic cells in an environment similar in composition to that used in step b) with the addition of 2-Mercaptoethanol, tuberculin to obtain antigen-activated immature dendritic cells (AA iDC); f) culturing the fraction obtained in step e) containing antigen-activated immature dendritic cells in vitro in the medium used in step e) with the addition of recombinant human tumor necrosis factor alpha (rhTNF- ⁇ ) to obtain mature dendritic cells antigen-activated in the ripening process (AA mDC);
- step c) exposure of the lymphocytes of the non-adherent fraction obtained in step c) in a fresh medium similar to that used in step b) for a time sufficient to maintain the viability of the lymphocyte fraction;
- step j) co-culturing the fraction obtained in step e) and part of the non-adherent fraction obtained in step i) in vitro in a ratio of 1: 10 in fresh medium, similar in composition to the medium used in step b), and supplemented with recombinant human Interleukin-2 (Roncoleukin, rhIL-2) and recombinant human Interleukin-12 (rhIL-12) or supplemented with recombinant human Interleukin-12 (rhIL-12) and recombinant human Interleukin-18 (rhIL-18), to produce T lymphocytes specifically activated by ripening dendritic cells antigen-activated during maturation (AA mDC);
- Roncoleukin, rhIL-2 Noncoleukin, rhIL-2
- rhIL-12 recombinant human Interleukin-12
- rhIL-18 recombinant human Interleukin-18
- step k selection from the cell fractions obtained in step k) that did not adhere specifically activated T-lymphocytes and washing them to obtain another part of the vaccine.
- step b) it is advisable to cultivate in step b) for 1.0 hour at a temperature of 37 ° C in an atmosphere of 5% C0 2 in a base medium supplemented with 100 ml of a base medium: FCS - 1%, HEPES -5 mm, Glutamine - 2mM, Gentamicin -1000 ⁇ g / ml.
- step g) it is advisable to cultivate in step g) for 24 hours in a base medium supplemented with 100 ml of base medium: FCS - 10%, HEPES -5 mm, Glutamine - 2 mm, 2-Mercaptoethanol - 5x10 "5 M, Gentamicin - 1000 ⁇ g / ml, and supplemented with 1 ml of medium containing 1.0 million cells, recombinant human granulocyte-macrophage colony stimulating factor Neupogen (rhGM-CSF) - 50 ng / ml and recombinant human Interleukin-4 ( rhIL-4) - 100 ng / ml.
- base medium FCS - 10%, HEPES -5 mm, Glutamine - 2 mm, 2-Mercaptoethanol - 5x10 "5 M, Gentamicin - 1000 ⁇ g / ml, and supplemented with 1 ml of medium containing 1.0 million cells
- step e) it is advisable to cultivate in step e) for 12 to 24 hours in a basic medium supplemented with 100 ml of a basic medium: FCS -10%, HEPES-5mM, Glutamine-2mM, 2-Mercaptoethanol-5x10 "5 M, Gentamicin - 1000 ⁇ g / ml, with the addition of tuberculin at the rate of 500 TE per 1 ml of base medium.
- step e) it is advisable to cultivate in step e) for 24 hours in a basic medium supplemented with 100 ml of a basic medium: FCS -10%, HEPES -5 mM, Glutamine-2 mM, 2-Mercaptoethanol-5x10 "5 M, Gentamicin - 1000 ⁇ g / ml, with the addition of tuberculin at the rate of 500 TE per 1 ml of base medium and rhTNF- ⁇ at the rate of 25 ng per 1 ml of base medium.
- step i) it is advisable at step i) to hold the non-adherent fraction in the base medium supplemented with 100 ml of the base medium: FCS -10%, HEPES -5 mM, Glutamine - 2 mM, Gentamicin - 1000 ⁇ g / ml for 60- 72 hours.
- step k it is advisable to cultivate in step k) for 48 hours in a base medium additionally containing 100 ml of base medium: FCS -10%, HEPES -5 mm, Glutamine-2 mm, Gentamicin-1000 ⁇ g / ml, supplemented based on 1 ml of medium containing 2.5 million cells, recombinant human Interleukin-2 (Roncoleukin, rhIL-2) -100 IU / ml and recombinant human Interleukin-12 (rhIL-12) - 10 ng / ml or recombinant human Interleukin-12 (rhIL-12) - 10 ng / ml; and recombinant human Interleukin-12 (rhIL-18) - 100 ng / ml.
- base medium additionally containing 100 ml of base medium: FCS -10%, HEPES -5 mm, Glutamine-2 mm, Gentamicin-1000
- DMEM DMEM
- FIG. 2A, Fig. 2B shows the change in the expression of CD83 + and HLA-DR on cells in a monocytic pool at different stages of DC maturation cultured from monocytes of the adherent fraction of blood MNCs from patients with pulmonary tuberculosis in steps d), e). and e) a method for producing an autologous cell vaccine according to the invention: FIG. 2A - for immature DC (iDC), Figv - for mature DC (mDC);
- Fig.Z indicators of phenotypic markers at different stages of DC maturation, cultivated by the method of obtaining the vaccine according to the invention from monocytes adhering fraction of blood MNCs of patients with pulmonary tuberculosis;
- Figure 4 the results of tests to determine the proliferative response of MNCs cultures when cytokines (rhIL-12 + rhIL-18 or rhIL-12 and rhIL-2) were added to the medium and tests to determine the proliferative response of MNCs cultures co-incubated with mature DC antigenactivated in maturation process (AA mDC) with the addition of cytokines (rhIL-12 + rhIL-18 or rhIL-12 and rhIL-2), with spontaneous and tuberculinactivated production;
- AA mDC mature DC antigenactivated in maturation process
- Figure 5 the results of tests to determine the number of perforin expressing MNCs after the addition of cytokines (rhIL-12 and rhIL-18, rhIL-12 and rhIL-2) and after co-cultivation of MNCs with mature DC antigenactivated during maturation (AA mDC), and the addition of cytokines (rhIL-12 and rhIL-18 or rhlL-12 and rhIL-2), with spontaneous and tuberculin-activated expression;
- Fig.6 the results of tests to determine the amount of IFN- ⁇ - producing MNCs after the addition of cytokines (rhIL-12 and rhIL-18, rhIL-12 and rhIL-2) and after co-cultivation of MNCs with mature DC antigenactivated during maturation (AA mDC ), and the addition of cytokines (rhIL-12 and rhIL-18 or rhIL-12 and rhlL-2), with spontaneous and tuberculinactivated production;
- Fig.7 the results of tests to determine the content of IFN- ⁇ in the culture of MNCs with the addition of cytokines (rhIL-12 and rhIL-18, rhIL-12 and rhIL-2) and after co-cultivation of MNCs with mature DC antigenactivated during maturation (AA mDC ), and the addition of cytokines (rhIL-12 and rhIL-18 or rhIL-12 and rhlL-2), with spontaneous and tuberculinactivated production.
- cytokines rhIL-12 and rhIL-18, rhIL-12 and rhIL-2
- AA mDC mature DC antigenactivated during maturation
- cytokines rhIL-12 and rhIL-18 or rhIL-12 and rhlL-2
- a method of obtaining an autologous cell vaccine for the treatment of pulmonary tuberculosis according to the invention can be carried out using known means and known technologies.
- For cultivation can be used various well-known basic environment, traditionally used for cell cultivation and characterized by a high content of amino acids and vitamins and life-supporting cells, including lymphoid cells, for example, DMEM or RPMI-1640 medium.
- a method for producing an autologous vaccine according to the invention was implemented by the authors using DMEM as a base medium and known components:
- DMEM the basic environment with a high content of amino acids and vitamins, includes: trasferrin, leucine, glucose, pyruvate and a number of other substances, and has high biological stability, provides normal vital activity of many types and cell lines, including lymphoid cells;
- 2-Mercaptoethanol an antioxidant that causes the reactivation of many enzymes and is used as an additive in the cultivation of mononuclear cells, increases the output of granulocyte-macrophage cells;
- - Glutamine is an essential amino acid needed to nourish growing cells
- Gentamicin is an antibiotic that suppresses the growth of the bacterial flora, added in a concentration non-toxic to the growing cell culture.
- rhGM-CSF a recombinant human analogue of GM-CSF, which is a glycoprotein, a hematopoietic growth factor that regulates the formation and functioning of immunocompetent cells: dendritic cells, macrophages and granulocytes. Since only about 1% DC is contained in human peripheral blood, the production of a sufficient amount of DC in vitro from peripheral blood monocytes can be carried out by culturing in the presence of growth factors, the main of which is GM-CSF.
- rhIL-4 a differentiation factor for T and B lymphocytes.
- IL-4 The most powerful effect of IL-4 has on the regulation of the formation of other cytokines through participation in numerous biological processes, such as the immune response and inflammatory reactions.
- tuberculin in standard dilution is a purified mixture of filtrates of heat-killed cultures of human and bovine tuberculosis mycobacteria cultures precipitated with trichloroacetic acid, treated with ethyl alcohol and ether for anesthesia, the drug has the form of a white powder with an activity of 500,000 tuberculin units (TE) in a vial;
- rhTNF-a - recombinant human tumor necrosis factor alpha
- rhTNF-a a polypeptide.
- TNF-a is a pro-inflammatory cytokine that causes accelerated maturation of dendritic cells;
- IL-2 is a complete structural and functional analogue of endogenous IL-2, promotes the proliferation and differentiation of T-lymphocytes, causes polyclonal activation of T-lymphocytes, increases the functional activity of phagocytes and natural killer cells ( ⁇ cells).
- This cytokine is involved in the regulation of the immune response and directs it along the T-helper 1 - cell development pathway.
- the introduction of roncoleukin into the culture medium promotes the launch and deployment of a cellular immune response, which is most effective in the fight against tuberculosis mycobacterium;
- rhIL-12 recombinant human Interleukin-12
- rhIL-12 a cytokine that activates the differentiation of T-lymphocytes, increases their cytotoxic activity, enhances the proliferation of DC and T-lymphocytes and the production of other cytokines.
- IL-12 One of the most important effects of IL-12 is the ability to rotate the differentiation of T-helpers towards T-helpers of 1 way;
- rhIL-18 recombinant human Interleukin-18 - is involved in the activation of cytotoxic T-lymphocytes, ⁇ cells, macrophages, dendritic cells and contributes to the formation of an effective anti-infection immune response.
- a method of obtaining an autologous cell vaccine for the treatment of tuberculosis lungs according to the invention was carried out in stages as follows:
- MNCs mononuclear cells
- a) mononuclear cells (hereinafter MNCs) were isolated from autologous peripheral blood of a tuberculosis patient in a known manner on a ficol-urographin gradient with a density of 1.077 g / cm 3 with a blood and gradient ratio of 2: 1; b) to obtain populations of monocytes and lymphocytes, MNCs obtained in step a) were cultured in an amount of 2 ⁇ 10 6 in vitro in culture bottles by incubation for 1.0 hour at 37 ° C in an atmosphere of 5% ⁇ 0 2 in DMEM medium supplemented with 100 ml of DMEM: FCS -1%, HEPES -5 mM, Glutamine - 2 mM, Gentamicin -1000 ⁇ g / ml;
- step b) the MNCs obtained in step b) were separated into an adherent fraction of monocytes and an adherent fraction of lymphocytes by selection of an adherent fraction from the walls of the vials after culturing in step b);
- monocytes of the adherent fraction obtained in step c) were cultured in vitro for 24 hours in DMEM supplemented with 100 ml DMEM: FCS -10% , HEPES -5 mM, Glutamine - 2 mM, 2-Mercaptoethanol - 5x10 '5 M, Gentamicin - 1000 ⁇ g / ml, and supplemented with 1 ml of medium containing 1 million cells, Neupogen - 50 ng / ml and rhIL- 4 - 100 ng / ml.
- step d) to obtain antigen-activated immature DC (AA iDC)
- the fraction obtained in step d) containing iDC was cultured in the medium used in step b) with the addition of 2-Mercaptoethanol and tuberculin.
- the cultivation was carried out for 12-24 hours in DMEM supplemented with 100 ml of DMEM: FCS -10%, HEPES -5 mM, Glutamine - 2 mM, 2-Mercaptoethanol - 5x10 " 5 M, Gentamicin - 1000 ⁇ g / ml , with the addition of tuberculin at the rate of 500 TE per 1 ml of DMEM;
- step e) in order to obtain mature DC antigenactivated during maturation (AA mDC), the fraction obtained in step e) was cultured in vitro in the medium used in step e) using rhTNF- ⁇ .
- cultivation was carried out for 24 hours in DMEM supplemented with 100 ml of DMEM: FCS -10%, HEPES -5 mM, Glutamine - 2 mM, 2-Mercaptoethanol - 5x10 "5 M, Gentamicin - 1000 ⁇ g / ml, with the addition of tuberculin at the rate of 500 TE per 1 ml of DMEM and rhTNF-a at the rate of 25 ng per 1 ml of DMEM;
- step c) the parallel non-adherent fraction obtained in step c) was kept in DMEM supplemented with 100 ml of DMEM: FCS -10%, HEPES -5 mM, Glutamine - 2 mM, Gentamicin - 1000 ⁇ g / ml for a time sufficient to maintain cell viability, which was 60-72 hours;
- step j) to obtain T-lymphocytes specifically activated by AA mDC, the adherent fraction obtained in step e) and part of the non-adherent mononuclear fraction obtained in step i) were co-cultured in vitro in a ratio of 1: 10 for 48 hours fresh DMEM medium, additionally containing per 100 ml of medium: FCS -10%, HEPES -5 mM, Glutamine - 2 mM, Gentamicin - 1000 ⁇ g / ml, supplemented with 1 ml of medium containing 2.5 million cells, Roncoleukin -100 IU ml and rhIL-12 - 10 ng / ml or rhIL-18 - 100 ng / ml and rhIL-12 - 10 ng / ml.
- step k) selection was made from the fraction of cells obtained in step k) that adhered AA mDC and were washed twice by centrifugation in physiological saline for 10 minutes at 1500 rpm./min to obtain one part of the vaccine;
- step k) selection was made from the fraction of cells obtained in step k) of non-adhering T-lymphocytes specifically activated by AA mDC, and they were washed twice by centrifugation in physiological saline for 10 minutes at 1500 rpm to obtain another part of the vaccine.
- step d immature dendritic cells
- step e antigen-activated immature DCs
- step e it helps to produce mature DCs antigenactivated in maturation process (AA mDC) (step e), which effectively present antigens and activate T-lymphocytes (step k), which leads to the production of T-lymphocytes specifically activated by AA mDC.
- cytotoxic T-killers CD8 +
- delayed-type hypersensitivity T-lymphocytes T-HRT - CD4 +
- AA mDC autologous antigen-activated DC
- MNCs in step b) in a medium supplemented with inactivated fetal calf serum eliminates the possibility of suppressive exposure to vaccine cells of factors formed under the influence of M. tuberculosis mycobacteria contained in the autologous serum of a patient with tuberculosis.
- FCS inactivated fetal calf serum
- heparinized venous blood of patients with tuberculosis receiving standard therapy was used (on the basis of the Clinical Tuberculosis Dispensary GUZOO, Omsk, the Regional Clinical Tuberculosis Hospital OGUZ, Tomsk).
- FIGLA, 1B and FIGS. 2A, 2B illustrate the induction processes of DC maturation cultured according to steps d), e) and e) of a method for producing a vaccine according to the invention from adherent monocytes of the blood MNCs fraction of pulmonary tuberculosis patients:
- FigLA for iDC and FigLV for mDC shows the change in the expression of CD83 + and CD86 + on cells at different stages of DC maturation
- CD83 + -PE is the luminosity of the CD83 + marker labeled with phycoerythrin (phycoerythrin, PE)
- CD86 + -FITC is the luminosity of the CD86 + marker labeled with fluorescein isothiocyanate (fluorescein isothiocyanate, FITC)
- CD86 + - mononuclear cells carrying the marker CD86 +
- CD83 + CD86 + are mononuclear cells that simultaneously carry markers for CD83 + and CD86 +. From FigLA and 1B it follows that for iDC the maximum number of CD83 + / CD86 + was 19.6% (FigLA), and for mDC the maximum number of CD83 + / CD86 + amounted to
- Fig.2A for iDC and Fig.2B for mDC shows the change in the expression of CD83 + and HLA-DR + on cells at different stages of DC maturation, while; "CD83 + - PE” - the intensity of the glow of the marker CD 83, labeled with phycoerythrin (phycoerythrin, PE); "HLA-DR + -FITC” is the luminescence intensity of the HLA-DR + marker labeled with fluorescein isothiocyanate (fluorescein isothiocyanate, FITC); "Cd83 +" - mononuclear cells bearing a marker of CD 83+; "HLA-DR +” - mononuclear cells carrying the marker HLA-DR +; “CD83 + HLA-DR +” are mononuclear cells that simultaneously carry markers for CD83 + and HLA-DR +.
- Fig. 3 shows the phenotypic markers at different stages of DC maturation cultivated by the method for producing the vaccine according to the invention from adherent blood MNCs fraction of blood pulmonary tuberculosis patients, in axial coordinates in percent (M ⁇ t), moreover: for iDC obtained from monocytes MNCs in step d) of the method in the presence of Neupogen and rhIL-4, the expression of CD83 + / CD86 + was 18.59 ⁇ 1.05 (the left column in region a is shown), the expression of CD83 + / HLA-DR + was 7.67 ⁇ 0.45 ( the left column in region b) is shown, and for AA mDC obtained in step e) of the method from AA iDC by subsequent cultivation in the presence of rhTNF- ⁇ , the expression of CD83 + / CD86 + was 31.33 ⁇ 1.56 (the right column in region a is shown), the expression of CD83 + / HLA-DR + was 22.26 ⁇ 1.12 (
- Table 4 shows the phenotypic characteristics of DC at different stages of DC maturation cultivated by the method for preparing the vaccine according to the invention from an adherent fraction of MNCs of patients with pulmonary tuberculosis, immature iDCs obtained from MNCs in step d) of the method in the presence of Neupogen and rhIL-4, and mature AA mDC were obtained in step e) of the method from AA iDC by subsequent cultivation in the presence of rhTNF-a.
- the proliferative activity of MNCs mononuclear cells was evaluated using the APO-BRDUFlowKit system on a FACSCalibur flow cytometer (BD Biosciense).
- AA mDC obtained in step e) of the method for preparing the vaccine according to the invention which were subjected to co-cultivation in step k) of the method for 72 hours with non-adherent fraction MNCs in response to a specific M. tuberculosis antigen - tuberculin.
- Figure 4 and table 2 presents the results of testing the proliferative activity of mononuclear cells MNCs (group 1), MNCs when rhIL-12 + rhIL-18 cytokines were added to the medium (group 2), MNCs when rhIL-12 + cytokines were added to the medium rhIL-2 (group 3), MNCs when AA mDC is added to the medium (group 4), MNCs when AA mDC and cytokines are added to AA rhIL-12 + rhIL-18 (group 5), MNCs when AA mDC and cytokines are added to AA rhIL-12 + rhIL-2 (group 6).
- Figure 5 and table 3 presents the results of tests to determine the number of perforin expressing MNCs (group 7) and after adding the cytokines rhIL-12 and rhIL-18 (group 8) or rhIL-12 and rhIL-2 (group 9), and after co-cultivation of MNCs with mature DC antigen-activated during maturation (AA mDC) (group 10), with the addition of rhIL-12 and rhIL-18 cytokines (group 11) or rhIL-12 and rhIL-2 (group 12).
- cytokines rhIL-18 and rhIL-12 or rhIL-2 and rhIL-12
- rhIL-18 and rhIL-12 or rhIL-2 and rhIL-12 and rhIL-12 cytokines significantly increases the number of perforin-producing MNCs in response to additional antigenic stimulation compared to the group of MNCs and AA mDC without the addition of cytokines.
- the increase in the number of perforin-positive cells is an indication of the activation of cytotoxic cells necessary for the destruction of M. tuberculosis in vivo.
- the number of IFN- ⁇ producing cells was estimated using the BDFastlmmuneCytokine system on a FACSCalibur flow cytometer (BD Biosciense). Moreover, using the enzyme immunoassay (Vector-Best), the IFN- ⁇ content in the culture supernatants of MNCs was determined after 72 hours of cultivation of MNCs + AA mDC in the presence of tuberculin.
- MNCs group 13
- MNCs when rhIL-12 + rhIL-18 cytokines were added to the medium group 14
- MNCs when added to medium of rhIL-12 + rhIL-2 cytokines group 15
- MNCs when AA mDC group 16
- MNCs when AA mDC and rhIL-12 + rhIL-18 cytokines group 17
- MNCs when added on Wednesday AA mDC and rhIL-12 + rhIL-2 cytokines group 18
- the number of 1PK-producing cells and the content of IFN- ⁇ in a culture of MNCs co-cultured with cytokines rhIL-18 and rhIL-12 or rhIL-2 and rhIL-12
- Spontaneous Tuberculin- Spontaneous Tuberculin is produced by stimulated
- rhIL-18 and rhIL-12 or rhIL-2 and rhIL-2 and rhlL-12 cytokines significantly increased the number of IFN- ⁇ -secreting cells and the level of cytokine production by mononuclear cells in response to tuberculin in tuberculosis patients lung compared with the group of MNCs and AA mDC without the addition of cytokines. This indicates a stimulating effect of cytokines on the modulation of the immune response according to the T-helper type 1.
- an autologous cell vaccine was obtained having an immunomodulatory effect aimed at the formation of a specific anti-tuberculosis immune response in pulmonary tuberculosis.
- the advantages of the vaccine according to the invention is the use of autologous (own) patient cells, which provides an individual approach to the treatment of the disease and eliminates the development of adverse reactions to vaccination.
- the resulting vaccine eliminates defects in the immune response that occur during prolonged persistence of tuberculosis mycobacteria in the body both at the stage of antigen presentation and differentiation of antigen-presenting dendritic cells, and at the stage of activation of the main cellular variant of the development of the immune response, as well as an additional humoral immune response.
- the present invention provides a method for generating cytotoxic cells using antigen-activated autologous dendritic cells and rhIL-12 and rhIL-18 or rhIL-12 and rhIL-2 in vitro to produce immature and mature dendritic cells from mononuclear cells of patients with pulmonary tuberculosis that characterized by appropriate functional activity and phenotype.
- an increase in the expression of co-stimulatory molecules on the surface of antigen-activated dendritic cells was achieved, which indicates an increase in the effective process of antigen presentation.
- Co-cultivation of DC antigen-activated during maturation and MNCs in combination with rhIL-12 and rhIL-18 or with rhIL-12 and rhIL-2 is an effective way to generate specific cytotoxic cells of mononuclear origin, which manifests itself in an increase in their cytotoxic anti-tuberculosis response compared with the vaccine prototype.
- Using a combination of rhIL-12 and rhIL-18 or rhIL-12 and rhIL-2 to enhance the induction of response allows a statistically significant increase in the cytotoxic potential of mononuclear cells and IFN- ⁇ production in vitro.
- the method for producing an autologous vaccine according to the invention allows, at the method steps, to increase the yield of immature DC, to increase the efficiency of capture and presentation of the antigen, and in a shorter time to obtain a higher percentage yield of specifically activated T-lymphocytes.
- the vaccine according to the invention for the treatment of pulmonary tuberculosis, obtained by the method according to the invention, in comparison with known vaccines has a higher efficiency, eliminates defects of the immune response that occur under the influence of mycobacterium tuberculosis, activating the cellular variant of the development of the immune response.
- a method of obtaining an autologous cell vaccine according to the invention for the treatment of pulmonary tuberculosis by simultaneously acting on a specific and non-specific link of the immune response can be implemented using known techniques and materials.
- the autologous cell vaccine obtained by the method according to the invention is highly effective and can be used to treat tuberculosis patients by intravenous drip in saline.
Abstract
The invention comprises an autologous vaccine for treating pulmonary tuberculosis by means of simultaneously acting upon the adaptive and innate aspects of immune response, one part of said vaccine containing mature dendritic cells, antigen-activated in the process of maturation (AA mDC), the other part containing T-lymphocytes specifically activated by said mature dendritic cells, antigen-activated in the process of maturation (AA mDC), and also a method for producing a vaccine based on autologous mononuclear blood cells from patients suffering from pulmonary tuberculosis.
Description
Аутологичная вакцина для лечения туберкулеза легких Autologous vaccine for the treatment of pulmonary tuberculosis
и способ ее получения and method for its preparation
Область техники Technical field
Изобретение относится к области медицины, в частности, к вакцинам, обеспечивающим формирование иммунного ответа против микобактерии туберкулеза М. tuberculosis и предназначенным для использования при лечении туберкулеза легких в различных стадиях заболевания, и к способам получения вакцин. The invention relates to medicine, in particular to vaccines that provide the formation of an immune response against M. tuberculosis mycobacterium tuberculosis and are intended for use in the treatment of pulmonary tuberculosis at various stages of the disease, and to methods for producing vaccines.
Предшествующий уровень техники State of the art
Известно, что в основе патогенеза туберкулеза лежит нарушение взаимодействия иммунокомпетентных клеток в результате длительного персистирования микобактерий внутри антиген-презентирующих клеток. It is known that the pathogenesis of tuberculosis is based on a violation of the interaction of immunocompetent cells as a result of prolonged persistence of mycobacteria inside antigen-presenting cells.
Стандартное лечение туберкулеза основано на применении антибиотиков, подавляющих развитие микобактерий на различных этапах их жизненного цикла. Однако лекарственная химиотерапия часто приводит к развитию лекарственно- устойчивых штаммов возбудителей инфекции и поэтому становится неэффективной и при этом обладает выраженным гепатотоксическим действием. The standard treatment for tuberculosis is based on the use of antibiotics that inhibit the development of mycobacteria at various stages of their life cycle. However, drug chemotherapy often leads to the development of drug-resistant strains of pathogens and therefore becomes ineffective and at the same time has a pronounced hepatotoxic effect.
В настоящее время развитие новых эффективных подходов к лечению инфекционных заболеваний связано с использованием собственных механизмов защиты организма и их возможной модуляции. Эффективный иммунный ответ на микобактерии Mycobacterium tuberculosis связан с индукцией клеточного звена иммунного ответа, который в данном случае реализуется посредством Т-хелперов 1 типа. Активность Т-хелперов 1 типа напрямую зависит от представления им антигена и их направленной дифференцировки, что осуществляется дендритными клетками (далее DC), являющимися основными антиген-презентирующими клеточными элементами. Currently, the development of new effective approaches to the treatment of infectious diseases is associated with the use of the body's own defense mechanisms and their possible modulation. An effective immune response to Mycobacterium tuberculosis mycobacteria is associated with the induction of the cellular component of the immune response, which in this case is realized by type 1 T-helpers. The activity of type 1 T-helpers directly depends on the presentation of antigen and their directed differentiation, which is carried out by dendritic cells (hereinafter DC), which are the main antigen-presenting cellular elements.
При этом активно исследуется возможность применения DC для модуляции специфического иммунного ответа и развития новых методов иммунокоррекции. Это связано, прежде всего, с той ролью, которую DC играют в организме в развитии иммунного ответа. В частности, DC обладают уникальными механизмами захвата антигена и представления его наивньм Т-клеткам, определяя направленность и активность иммунных реакций. Кроме того, в эксперименте in vitro было показано, что DC, полученные из моноцитов, в отличие от макрофагов, полученных из тех же самых
моноцитов, не поддерживают внутриклеточную репликацию вирулентного штамма М. tuberculosis H37Rv благодаря снижению доступа микобактериальных вакуолей к циркулиру им эндосомам и ограничению доступа питательньгх веществ (Tailleux L, Neyrolles О, Honore-Bouakline S, Perret E, Sanchez F, Abastado JP, Lagrange PH, Gluckman JC, Rosenzwajg M, Herrmann JL. Constrained intracellular survival of Mycobacterium tuberculosis in human dendritic cells. J Immunol, 2003, V.15, N° 170(4). P.1939-1948). At the same time, the possibility of using DC to modulate a specific immune response and the development of new methods of immunocorrection is being actively studied. This is primarily due to the role that DC plays in the body in the development of the immune response. In particular, DCs possess unique mechanisms of antigen capture and presentation to the naive T cells, determining the direction and activity of immune responses. In addition, in an in vitro experiment, it was shown that DC derived from monocytes, in contrast to macrophages derived from the same monocytes do not support intracellular replication of the virulent strain M. tuberculosis H37Rv due to reduced access of mycobacterial vacuoles to their endosome circuits and limited access to nutrients (Tailleux L, Neyrolles O, Honore-Bouakline S, Perret E, Sanchez F, Abastado JP, Lagrange PH Gluckman JC, Rosenzwajg M, Herrmann J. Constrained intracellular survival of Mycobacterium tuberculosis in human dendritic cells. J Immunol, 2003, V.15, N ° 170 (4). P.1939-1948).
Известен способ получения клеточной вакцины для лечения туберкулеза (RU, 2262950, С1), в котором инфицируют алло- и ксеногенные макрофаги и клетки макрофагальных клеточных линий патогенным штаммом M.tuberculosis, после чего макрофаги обрабатывают лекарственными средствами, вызывающими гибель микобактерий, например изониазидом, и затем клетки подвергают воздействию гамма- облучения, приводящего к их гибели путем апоптоза. Полученной вакциной иммунизируют резистентные и чувствительные к туберкулезу линии животных, и осуществляют поствакцинальный контроль над показателями, свидетельствующими об активации иммунного ответа: γ-облученные макрофаги, инфицированные микобактериями, поглощаются дендритными клетками; апоптотические клетки, поглощенные дендритными клетками, индуцируют активацию CD4+ ТЫ и CD8+ цитотоксических Т-клеток, которые являются ответственными за уничтожение макрофагов, инфицированных микобактериями. A known method of obtaining a cell vaccine for the treatment of tuberculosis (RU, 2262950, C1), in which allo and xenogenic macrophages and cells of macrophage cell lines are infected with a pathogenic strain of M. tuberculosis, after which the macrophages are treated with drugs that cause the death of mycobacteria, for example isoniazid, and then the cells are exposed to gamma radiation, leading to their death by apoptosis. Resistant and tuberculosis-sensitive animal lines are immunized with the obtained vaccine, and post-vaccination monitoring of indicators indicative of activation of the immune response is carried out: γ-irradiated macrophages infected with mycobacteria are absorbed by dendritic cells; apoptotic cells absorbed by dendritic cells induce activation of CD4 + THY and CD8 + cytotoxic T cells, which are responsible for killing macrophages infected with mycobacteria.
Лизис мишени оказывается существенным в случае заболеваний туберкулезом, при котором возбудитель находится и размножается в макрофагах. Лизис этих клеток высвобождает возбудителей и дает возможность активированным макрофагам поглощать бактерии и элиминировать их. DC клетки экспрессируют высокие уровни В7-1 и секретируют IL-12 и являются единственными мощными антигенпрезентирующими клетками (АРС), которые могут активировать наивные Т- клетки. Кроме того, DC могут способствовать дифференцировке наивных Т-клеток в ТЫ и CD8+ цитотоксические Т-клетки. ТЫ и цитотоксические Т-клетки являются существенными для индукции защитного иммунитета против M.tuberculosis. Вакцинация приводит к активации иммунного ответа. Однако вакцина, полученная данным способом, содержит чужеродные организму клетки, что может послужить причиной развития поствакцинальной аллергической реакции. Target lysis is significant in the case of tuberculosis diseases, in which the pathogen is located and multiplies in macrophages. Lysis of these cells releases pathogens and enables activated macrophages to absorb bacteria and eliminate them. DC cells express high levels of B7-1 and secrete IL-12 and are the only powerful antigen presenting cells (APCs) that can activate naive T cells. In addition, DCs can contribute to the differentiation of naive T cells into YO and CD8 + cytotoxic T cells. YOU and cytotoxic T cells are essential for the induction of protective immunity against M. tuberculosis. Vaccination leads to the activation of the immune response. However, the vaccine obtained by this method contains cells that are foreign to the body, which may cause the development of a post-vaccination allergic reaction.
Известен способ получения стимулированных DC для индукции иммунного
ответа против туберкулеза человека (RU, 2401664, С1), основанный на заборе у пациента незрелых дендритных клеток (далее iDC), их культивировании ex vivo для созревания и формирования аллостимуляторной активности для последующей дополнительной обработки антигеном и обратном введении созревших дендритных клеток (iriDC) тому же пациенту с целью формирования адаптивного иммунитета, в котором при культивировании ex vivo незрелых DC (iDC) в культуральную среду, содержащую iDC больных туберкулезом, вводят фрагментированную аллогенную двуцепочечную геномную ДНК с фрагментами размером 200-6000 п. о., составляющими полный геном физиологически и генетически здорового донора. В результате воздействия экзогенной ДНК на DC происходит их созревание и индуцируется их аллостиммуляторная активность. После добавления антигена и последующего введения этих зрелых антигенактивированных DC обратно в организм того же пациента происходит развитие у этого больного специфического адаптивного иммунитета, связанного с активированной дендритными клетками пролиферацией обученных против этих антигенов цитотоксических CD8+ Т-лимфоцитов, то есть происходит специфическая вакцинация пациента. Однако при непосредственном введении зрелых антигенактивированных дендритных клеток не исключена вероятность их повторного взаимодействия с компонентами клеточной стенки М. tuberculosis, стимулирующими секрецию иммуносупрессорных факторов, которые могут ингибировать развитие клеточного ответа на микобактерии. A known method of obtaining stimulated DC for the induction of immune response against human tuberculosis (RU, 2401664, C1), based on the collection of immature dendritic cells (hereinafter referred to as iDC) from the patient, their cultivation ex vivo for maturation and the formation of allostimulatory activity for subsequent additional antigen treatment and re-introduction of mature dendritic cells (iriDC) for the purpose of forming adaptive immunity, in which, upon ex vivo cultivation of immature DC (iDC), fragmented allogeneic double-stranded genomic DNA is introduced into the culture medium containing iDC of tuberculosis patients with fragments of 200-6000 bp in size, making up the complete gene of a physiologically and genetically healthy donor. As a result of the action of exogenous DNA on DC, their maturation occurs and their allostimulatory activity is induced. After adding the antigen and subsequent introduction of these mature antigen-activated DCs back into the body of the same patient, this patient develops a specific adaptive immunity associated with dendritic cell activated proliferation of cytotoxic CD8 + T-lymphocytes trained against these antigens, i.e. a specific vaccination of the patient occurs. However, the direct introduction of mature antigen-activated dendritic cells does not exclude the possibility of their repeated interaction with the components of the cell wall of M. tuberculosis, which stimulate the secretion of immunosuppressive factors, which can inhibit the development of the cellular response to mycobacteria.
Известен способ генерации антиген-специфических клеток, обладающих противотуберкулезной активностью (RU, 2378373, С2), в котором проводят совместное культивирование лимфоцитов не прилипающей фракции мононуклеаров (далее MNCs), которые выделяют из периферической крови пациентов больных туберкулезом легких, с обработанными антигеном Mycobacterium tuberculosis дендритными клетками, полученными из моноцитов прилипшей фракции MNCs, при этом используют зрелые DC, полученные добавлением к антигенактивированным незрелым DC индуктора созревания - липополисахарида E.coli, а совместное культивирование не прилипшей фракции MNCs и зрелых антигенактивированных DC проводят в присутствии рекомбинатнтного человеческого интерлейкина-18 (далее IL-18). Способ обеспечивает усиление пролиферативного потенциала специфических цитотоксических клеток мононуклеарного происхождения, стимуляцию уровня продукции Интерферона-^у (далее IFN-γ), формирование цитотоксических клеток в
ответ на специфический антиген М. tuberculosis. Однако описанный выше способ обладает меньшей клинической эффективностью вследствие отсутствия в составе среды на этапе совместного культивирования rhIL-2 и rhIL-12. There is a method of generating antigen-specific cells with anti-tuberculosis activity (RU, 2378373, C2), in which the lymphocytes of the non-adherent fraction of mononuclear cells (hereinafter MNCs), which are isolated from the peripheral blood of patients with pulmonary tuberculosis treated with Mycobacterium tuberculosis dendritic antigen, are co-cultured. cells obtained from monocytes of the adherent fraction of MNCs, using mature DC obtained by adding a maturation inducer, lipopolysaccharide, to antigen-activated immature DC E. coli, and the co-cultivation of the non-adherent fraction of MNCs and mature antigen-activated DC is carried out in the presence of recombinant human interleukin-18 (hereinafter IL-18). The method provides increased proliferative potential of specific cytotoxic cells of mononuclear origin, stimulation of the level of production of Interferon-y (hereinafter IFN-γ), the formation of cytotoxic cells in response to a specific antigen of M. tuberculosis. However, the method described above has less clinical efficacy due to the absence of rhIL-2 and rhIL-12 in the medium at the stage of co-cultivation.
Раскрытие изобретения Disclosure of invention
При создании изобретения была поставлена задача создания способа получения аутологичной клеточной вакцины для лечения туберкулеза, содержащей две части вакцины, полученные на основе аутологичных мононуклеарных клеток крови: одну часть, содержащую зрелые дендритные клетки, антигенактивированные в процессе созревания, и другую часть, содержащую Т-лимфоциты, специфически активированные указанными зрелыми ДК, антигенактивированными в процессе созревания, для последующего введения полученной вакцины в организм с целью формирования in vivo иммунного ответа против микобактерии туберкулеза М. tuberculosis. When creating the invention, the task was to create a method for producing an autologous cell vaccine for the treatment of tuberculosis, containing two parts of the vaccine, obtained on the basis of autologous mononuclear blood cells: one part containing mature dendritic cells antigenactivated during maturation, and the other part containing T-lymphocytes specifically activated by these mature DCs antigenactivated during maturation for subsequent administration of the resulting vaccine to the body for the purpose of in vivo formation immune response against mycobacterium tuberculosis M. tuberculosis.
Поставленная задача была решена созданием аутологичной клеточной вакцины для лечения туберкулеза легких путем формирования иммунного ответа против микобактерии туберкулеза M.tuberculosis, содержащей одну часть, содержащую зрелые дендритные клетки, антигенактивированные в процессе созревания (далее АА mDC), и другую часть, содержащую Т-лимфоциты, специфически активированные указанными зрелыми дендритными клетками, антигенактивированными в процессе созревания (АА mDC). The task was solved by creating an autologous cell vaccine for the treatment of pulmonary tuberculosis by forming an immune response against M. tuberculosis tuberculosis mycobacterium, containing one part containing mature dendritic cells antigenactivated during maturation (hereinafter AA mDC) and another part containing T-lymphocytes specifically activated by these mature dendritic cells antigenactivated during maturation (AA mDC).
Поставленная задача была также решена созданием способа получения аутологичной клеточной вакцины для лечения туберкулеза легких путем одновременного воздействия на специфическое и неспецифическое звено иммунного ответа против микобактерии Mycobacterium tuberculosis, содержащей в одной ее части зрелые дендритные клетки, антигенактивированные в процессе созревания (далее АА mDC), и содержащей в другой ее части Т-лимфоциты, специфически активированные указанными зрелыми дендритными клетками, антигенактивированными в процессе созревания (АА mDC): The problem was also solved by creating a method for producing an autologous cell vaccine for the treatment of pulmonary tuberculosis by simultaneously acting on a specific and non-specific link of the immune response against mycobacterium Mycobacterium tuberculosis, which contains mature dendritic cells antigenactivated during maturation in one part (hereinafter AA mDC), and containing in its other part T-lymphocytes specifically activated by the indicated mature dendritic cells antigen-activated during maturation (AA mDC):
а) выделение мононуклеаров (MNCs) из периферической крови больного туберкулезом легких; a) the allocation of mononuclear cells (MNCs) from the peripheral blood of a patient with pulmonary tuberculosis;
б) культивирование полученных на этапе а) мононуклеаров in vitro в базовой среде с высоким содержанием аминокислот и витаминов, обеспечивающей жизнедеятельность клеток, включая лимфоидные клетки,
дополненной FCS, HEPES, Глутамином, Гентамицином, для получения популяций моноцитов и лимфоцитов базовая среда, включает в свой состав: трасферрин, лейцин, глюкозу, пируват и ряд других веществ, и обладает высокой биологической стабильностью, обеспечивает нормальную жизнедеятельность многих типов и линий клеток, в том числе и лимфоидных клеток; b) culturing the mononuclear cells obtained in step a) in vitro in a base medium with a high content of amino acids and vitamins, which ensures cell viability, including lymphoid cells, supplemented with FCS, HEPES, Glutamine, Gentamicin, to obtain populations of monocytes and lymphocytes, the base medium includes transferrin, leucine, glucose, pyruvate and a number of other substances, and has high biological stability, provides normal vital activity of many types and cell lines, including lymphoid cells;
в) разделение мононуклеаров, полученных на этапе б), на прилипшую фракцию моноцитов и не прилипшую фракцию лимфоцитов; c) separation of the mononuclear cells obtained in step b) into an adherent fraction of monocytes and an adherent fraction of lymphocytes;
г) культивирование моноцитов прилипшей фракции, полученной на этапе в), in vitro в среде, по составу аналогичной среде, используемой на этапе б) , с добавлением 2-Меркаптоэтанола, рекомбинантного аналога гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора (rhGM- CSF) и Интерлейкина -4 (rhIl-4), с получением незрелых дендритных клеток (iDC), которые способны к активному захвату антигена путем фагоцитоза и макропиноцитоза; d) culturing the monocytes of the adherent fraction obtained in step c) in vitro in a medium similar in composition to that used in step b) with the addition of 2-Mercaptoethanol, a recombinant analogue of granulocyte-macrophage colony stimulating factor (rhGM-CSF) and Interleukin - 4 (rhIl-4), to produce immature dendritic cells (iDC) that are capable of actively capturing antigen by phagocytosis and macropinocytosis;
д) культивирование полученной на этапе г) фракции, содержащей незрелые дендритные клетки, в среде, по составу аналогичной среде, используемой на этапе б), с добавлением 2-Меркаптоэтанола, туберкулина с получением антигенактивированных незрелых дендритных клеток (АА iDC); е) культивирование полученной на этапе д) фракции, содержащей антиген-активированные незрелые дендритные клетки, in vitro в среде, используемой на этапе д), с добавлением рекомбинантного человеческого Фактора некроза опухоли альфа (rhTNF-α), с получением зрелых дендритных клеток, антигенактивированных в процессе созревания (АА mDC); d) culturing the fraction obtained in step d) containing immature dendritic cells in an environment similar in composition to that used in step b) with the addition of 2-Mercaptoethanol, tuberculin to obtain antigen-activated immature dendritic cells (AA iDC); f) culturing the fraction obtained in step e) containing antigen-activated immature dendritic cells in vitro in the medium used in step e) with the addition of recombinant human tumor necrosis factor alpha (rhTNF-α) to obtain mature dendritic cells antigen-activated in the ripening process (AA mDC);
и) выдержку лимфоцитов не прилипшей фракции, полученной на этапе в) , в свежей среде, аналогичной среде, используемой на этапе б), в течение времени, достаточного для поддержания жизнеспособности фракции лимфоцитов; i) exposure of the lymphocytes of the non-adherent fraction obtained in step c) in a fresh medium similar to that used in step b) for a time sufficient to maintain the viability of the lymphocyte fraction;
к) совместное культивирование фракции, полученной на этапе е), и части не прилипшей фракции, полученной на этапе и), in vitro в соотношении 1 :10 в свежей среде, по составу аналогичной среде, используемой на этапе б), и дополненной рекомбинантным человеческим Интерлейкином-2 (Ронколейкин, rhIL-2) и рекомбинантным человеческим Интерлейкином-12 (rhIL-12) или
дополненной рекомбинантным человеческим Интерлейкином-12 (rhIL-12) и рекомбинантным человеческим Интерлейкином-18 (rhIL-18), с получением Т- лимфоцитов, специфически активированных зрельми дендритными клетками, антигенактивированными в процессе созревания (АА mDC); j) co-culturing the fraction obtained in step e) and part of the non-adherent fraction obtained in step i) in vitro in a ratio of 1: 10 in fresh medium, similar in composition to the medium used in step b), and supplemented with recombinant human Interleukin-2 (Roncoleukin, rhIL-2) and recombinant human Interleukin-12 (rhIL-12) or supplemented with recombinant human Interleukin-12 (rhIL-12) and recombinant human Interleukin-18 (rhIL-18), to produce T lymphocytes specifically activated by ripening dendritic cells antigen-activated during maturation (AA mDC);
л) отбор из фракции, полученной на этапе к), прилипших зрелых дендритных клеток, антигенактивированных в процессе созревания (АА mDC), и их отмывка с получением одной части вакцины; k) selection from the fraction obtained in step k) of adherent mature dendritic cells antigen-activated during maturation (AA mDC) and their washing to obtain one part of the vaccine;
м) отбор из фракций клеток, полученных на этапе к), не прилипших специфически активированных Т-лимфоцитов и их отмывка с получением другой части вакцины. m) selection from the cell fractions obtained in step k) that did not adhere specifically activated T-lymphocytes and washing them to obtain another part of the vaccine.
При этом, согласно изобретению, целесообразно выделение мононуклеаров из периферической крови больного проводить на градиенте фикол-урографина с плотностью 1,077 г/смЗ при соотношении крови и градиента 2:1. Moreover, according to the invention, it is advisable to isolate mononuclear cells from the patient’s peripheral blood on a gradient of ficol-urographin with a density of 1.077 g / cm3 with a blood to gradient ratio of 2: 1.
При этом, согласно изобретению, целесообразно культивирование на этапе б) проводить в течение 1,0 часа при температуре 37°С в атмосфере 5% С02 в базовой среде, дополненной на 100 мл базовой среды: FCS - 1%, HEPES -5мМ, Глутамин - 2мМ, Гентамицин -1000 мкг/мл. Moreover, according to the invention, it is advisable to cultivate in step b) for 1.0 hour at a temperature of 37 ° C in an atmosphere of 5% C0 2 in a base medium supplemented with 100 ml of a base medium: FCS - 1%, HEPES -5 mm, Glutamine - 2mM, Gentamicin -1000 μg / ml.
При этом, согласно изобретению, целесообразно культивирование на этапе г) проводить в течение 24 часов в базовой среде, дополненной на 100 мл базовой среды: FCS - 10%, HEPES -5 мМ, Глутамин - 2 мМ, 2-Меркаптоэтанол - 5х10"5М, Гентамицин - 1000 мкг/мл, и дополненной из расчета на 1 мл среды, содержащей 1,0 млн клеток, рекомбинантным человеческим гранулоцитарно-макрофагальным колониестимулирующим фактором Нейпогеном (rhGM-CSF) - 50 нг/мл и рекомбинантным человеческим Интерлейкином-4 (rhIL-4) - 100 нг/мл. Moreover, according to the invention, it is advisable to cultivate in step g) for 24 hours in a base medium supplemented with 100 ml of base medium: FCS - 10%, HEPES -5 mm, Glutamine - 2 mm, 2-Mercaptoethanol - 5x10 "5 M, Gentamicin - 1000 μg / ml, and supplemented with 1 ml of medium containing 1.0 million cells, recombinant human granulocyte-macrophage colony stimulating factor Neupogen (rhGM-CSF) - 50 ng / ml and recombinant human Interleukin-4 ( rhIL-4) - 100 ng / ml.
Кроме того, согласно изобретению, целесообразно культивирование на этапе д) проводить в течение 12 - 24 часов в базовой среде, дополненной на 100 мл базовой среды: FCS -10%, HEPES -5мМ, Глутамин - 2мМ, 2-Меркаптоэтанол - 5х10"5М, Гентамицин - 1000 мкг/мл, с добавлением туберкулина из расчета 500 ТЕ на 1 мл базовой среды. In addition, according to the invention, it is advisable to cultivate in step e) for 12 to 24 hours in a basic medium supplemented with 100 ml of a basic medium: FCS -10%, HEPES-5mM, Glutamine-2mM, 2-Mercaptoethanol-5x10 "5 M, Gentamicin - 1000 μg / ml, with the addition of tuberculin at the rate of 500 TE per 1 ml of base medium.
Кроме того, согласно изобретению, целесообразно культивирование на этапе е) проводить в течение 24 часов в базовой среде, дополненной на 100 мл базовой среды: FCS -10%, HEPES -5мМ, Глутамин - 2мМ, 2-Меркаптоэтанол - 5х10"5М, Гентамицин - 1000 мкг/мл, с добавлением туберкулина из расчета 500 ТЕ на 1 мл базовой среды и
rhTNF-α из расчета 25 нг на 1 мл базовой среды. In addition, according to the invention, it is advisable to cultivate in step e) for 24 hours in a basic medium supplemented with 100 ml of a basic medium: FCS -10%, HEPES -5 mM, Glutamine-2 mM, 2-Mercaptoethanol-5x10 "5 M, Gentamicin - 1000 μg / ml, with the addition of tuberculin at the rate of 500 TE per 1 ml of base medium and rhTNF-α at the rate of 25 ng per 1 ml of base medium.
Кроме того, согласно изобретению, целесообразно на этапе и) проводить выдержку неприлипшей фракции в базовой среде, дополненной на 100 мл базовой среды: FCS -10%, HEPES -5 мМ, Глутамин - 2мМ, Гентамицин - 1000 мкг/мл в течение 60- 72 часов. In addition, according to the invention, it is advisable at step i) to hold the non-adherent fraction in the base medium supplemented with 100 ml of the base medium: FCS -10%, HEPES -5 mM, Glutamine - 2 mM, Gentamicin - 1000 μg / ml for 60- 72 hours.
Кроме того, согласно изобретению, целесообразно культивирование на этапе к) проводить в течение 48 часов в базовой среде, дополнительно содержащей на 100 мл базовой среды: FCS -10%, HEPES -5мМ, Глутамин - 2мМ, Гентамицин - 1000 мкг/мл, дополненной из расчета на 1 мл среды, содержащей 2,5 млн. клеток, рекомбинантным человеческим Интерлейкином-2 (Ронколейкин, rhIL-2) -100 ЕД/мл и рекомбинантным человеческим Интерлейкином-12 (rhIL-12) - 10 нг/мл или рекомбинантным человеческим Интерлейкином-12 (rhIL-12) - 10 нг/мл и рекомбинантным человеческим Интерлейкином-18 (rhIL-18) - 100 нг/мл. In addition, according to the invention, it is advisable to cultivate in step k) for 48 hours in a base medium additionally containing 100 ml of base medium: FCS -10%, HEPES -5 mm, Glutamine-2 mm, Gentamicin-1000 μg / ml, supplemented based on 1 ml of medium containing 2.5 million cells, recombinant human Interleukin-2 (Roncoleukin, rhIL-2) -100 IU / ml and recombinant human Interleukin-12 (rhIL-12) - 10 ng / ml or recombinant human Interleukin-12 (rhIL-12) - 10 ng / ml; and recombinant human Interleukin-12 (rhIL-18) - 100 ng / ml.
При этом, согласно изобретению, целесообразно в качестве базовой среды использовать среду DMEM. Moreover, according to the invention, it is advisable to use DMEM as the base medium.
При этом, согласно изобретению, целесообразно отмывку фракций клеток на этапах л) и м) проводить дважды в физиологическом растворе по 10 минут при 1500 об./мин. Moreover, according to the invention, it is advisable to wash the fractions of the cells in steps l) and m) twice in physiological saline for 10 minutes at 1500 rpm.
Краткое описание чертежей Brief Description of the Drawings
В дальнейшем способ получения аутологичной клеточной вакцины согласно изобретению для лечения туберкулеза легких поясняется на примерах его осуществления, примерах тестирования активности аутологичной вакцины согласно изобретению, полученной с его помощью, и иллюстрируется на прилагаемых чертежах, на которых: In the future, the method of obtaining an autologous cell vaccine according to the invention for the treatment of pulmonary tuberculosis is illustrated by examples of its implementation, examples of testing the activity of an autologous vaccine according to the invention obtained with its help, and is illustrated in the accompanying drawings, in which:
ФигЛА, ФигЛВ - изменение экспрессии CD83+ и CD86+ на клетках в моноцитарном пуле на разных этапах созревания DC, культивируемых из моноцитов прилипшей фракции MNCs крови больных туберкулезом легких на этапах г), д). и е) способа получения аутологичной клеточной вакцины согласно изобретению: ФигЛА - для незрелых DC (iDC), ФигЛВ - для зрелых DC (mDC); Figla, FigLV - changes in the expression of CD83 + and CD86 + on cells in a monocytic pool at different stages of DC maturation cultured from monocytes of adherent fraction of blood MNCs in patients with pulmonary tuberculosis in stages d), e). and e) a method for producing an autologous cell vaccine according to the invention: FigLA for immature DC (iDC), FigLV for mature DC (mDC);
Фиг.2А, Фиг.2В - изменение экспрессии CD83+ и HLA-DR на клетках в моноцитарном пуле на разных этапах созревания DC, культивируемых из моноцитов прилипшей фракции MNCs крови больных туберкулезом легких на этапах г), д). и е) способа получения аутологичной клеточной вакцины согласно изобретению: Фиг.2А -
для незрелых DC (iDC), Фиг.2В - для зрелых DC (mDC); Fig. 2A, Fig. 2B shows the change in the expression of CD83 + and HLA-DR on cells in a monocytic pool at different stages of DC maturation cultured from monocytes of the adherent fraction of blood MNCs from patients with pulmonary tuberculosis in steps d), e). and e) a method for producing an autologous cell vaccine according to the invention: FIG. 2A - for immature DC (iDC), Figv - for mature DC (mDC);
Фиг.З- показатели фенотипических маркеров на разных этапах созревания DC, культивируемых способом получения вакцины согласно изобретению из моноцитов прилипшей фракции MNCs крови больных туберкулезом легких; Fig.Z - indicators of phenotypic markers at different stages of DC maturation, cultivated by the method of obtaining the vaccine according to the invention from monocytes adhering fraction of blood MNCs of patients with pulmonary tuberculosis;
Фиг.4 - результаты тестов по определению пролиферативного ответа культур MNCs при добавлении в среду цитокинов (rhIL-12+rhIL-18 или rhIL-12 и rhIL-2) и тестов по определению пролиферативного ответа культур MNCs, соинкубированных со зрелыми DC, антигенактивированными в процессе созревания (АА mDC) с добавлением цитокинов (rhIL- 12+rhIL- 18 или rhIL-12 и rhIL-2), при спонтанном и при туберкулинактивированном продуцировании ; Figure 4 - the results of tests to determine the proliferative response of MNCs cultures when cytokines (rhIL-12 + rhIL-18 or rhIL-12 and rhIL-2) were added to the medium and tests to determine the proliferative response of MNCs cultures co-incubated with mature DC antigenactivated in maturation process (AA mDC) with the addition of cytokines (rhIL-12 + rhIL-18 or rhIL-12 and rhIL-2), with spontaneous and tuberculinactivated production;
Фиг.5 - результаты тестов по определению количества перфорин экспрессирующих MNCs после добавления цитокинов (rhIL-12 и rhIL-18, rhIL-12 и rhIL-2) и после сокультивирования MNCs со зрелыми DC, антигенактивированными в процессе созревания (АА mDC), и добавлением цитокинов (rhIL-12 и rhIL-18 или rhlL- 12 и rhIL-2), при спонтанной и при туберкулинактивированной экспрессии; Figure 5 - the results of tests to determine the number of perforin expressing MNCs after the addition of cytokines (rhIL-12 and rhIL-18, rhIL-12 and rhIL-2) and after co-cultivation of MNCs with mature DC antigenactivated during maturation (AA mDC), and the addition of cytokines (rhIL-12 and rhIL-18 or rhlL-12 and rhIL-2), with spontaneous and tuberculin-activated expression;
Фиг.6 - результаты тестов по определению количества IFN-γ - продуцирующих MNCs после добавления цитокинов (rhIL-12 и rhIL-18, rhIL-12 и rhIL-2) и после сокультивирования MNCs со зрелыми DC, антигенактивированными в процессе созревания (АА mDC), и добавлением цитокинов (rhIL-12 и rhIL-18 или rhIL-12 и rhlL- 2), при спонтанном и при туберкулинактивированном продуцировании; Fig.6 - the results of tests to determine the amount of IFN-γ - producing MNCs after the addition of cytokines (rhIL-12 and rhIL-18, rhIL-12 and rhIL-2) and after co-cultivation of MNCs with mature DC antigenactivated during maturation (AA mDC ), and the addition of cytokines (rhIL-12 and rhIL-18 or rhIL-12 and rhlL-2), with spontaneous and tuberculinactivated production;
Фиг.7 - результаты тестов по определению содержания IFN-γ в культуре MNCs с добавлением цитокинов (rhIL-12 и rhIL-18, rhIL-12 и rhIL-2) и после сокультивирования MNCs со зрелыми DC, антигенактивированными в процессе созревания (АА mDC), и добавлением цитокинов (rhIL-12 и rhIL-18 или rhIL-12 и rhlL- 2), при спонтанном и при туберкулинактивированном продуцировании. Fig.7 - the results of tests to determine the content of IFN-γ in the culture of MNCs with the addition of cytokines (rhIL-12 and rhIL-18, rhIL-12 and rhIL-2) and after co-cultivation of MNCs with mature DC antigenactivated during maturation (AA mDC ), and the addition of cytokines (rhIL-12 and rhIL-18 or rhIL-12 and rhlL-2), with spontaneous and tuberculinactivated production.
При этом приведенные примеры и чертежи не ограничивают изобретения и не выходят за рамки патентных притяханий. Moreover, the above examples and drawings do not limit the invention and do not go beyond the scope of patent claims.
Наилучший вариант осуществления изобретения Best Mode for Carrying Out the Invention
Способ получения аутологичной клеточной вакцины для лечения туберкулеза легких согласно изобретению может быть осуществлен с помощью известных средств и известных технологий. Для культивирования могут быть использованы различные известные базовые среды, традиционно используемые для культивирования клеток и характеризующиеся высоким содержанием аминокислот и витаминов и
обеспечивающих жизнедеятельность клеток, включая лимфоидные клетки, например, среда DMEM или среда RPMI-1640. A method of obtaining an autologous cell vaccine for the treatment of pulmonary tuberculosis according to the invention can be carried out using known means and known technologies. For cultivation can be used various well-known basic environment, traditionally used for cell cultivation and characterized by a high content of amino acids and vitamins and life-supporting cells, including lymphoid cells, for example, DMEM or RPMI-1640 medium.
Способ получения аутологичной вакцины согласно изобретению был реализован авторами с использованием DMEM в качестве базовой среды и известных компонентов: A method for producing an autologous vaccine according to the invention was implemented by the authors using DMEM as a base medium and known components:
- базовая среда DMEM - базовая среда с высоким содержанием аминокислот и витаминов, включает в свой состав: трасферрин, лейцин, глюкозу, пируват и ряд других веществ, и обладает высокой биологической стабильностью, обеспечивает нормальную жизнедеятельность многих типов и линий клеток, в том числе и лимфоидных клеток; - the basic environment DMEM - the basic environment with a high content of amino acids and vitamins, includes: trasferrin, leucine, glucose, pyruvate and a number of other substances, and has high biological stability, provides normal vital activity of many types and cell lines, including lymphoid cells;
- FCS - эмбриональная телячья сыворотка, инактивированная в течении 30 минут при температуре 60°С для снижения вероятности неспецифической антигенной стимуляции, поддерживает рост клеток за счет содержащихся в ней факторов роста, интерлейкинов, гормонов, альбумина и других биологически активных веществ, используется при выращивании различных типов гемопоэтических и лимфоидных клеток; - FCS - fetal calf serum inactivated for 30 minutes at a temperature of 60 ° C to reduce the likelihood of nonspecific antigenic stimulation, supports cell growth due to the growth factors, interleukins, hormones, albumin and other biologically active substances contained in it; it is used in the cultivation of various types of hematopoietic and lymphoid cells;
- HEPES - буфер, нетоксичный для клеток, широко применяемый для поддержания рН среды от 6,8-8,2 в культуральных исследованиях по выращиванию лимфоидных клеток; - HEPES - buffer, non-toxic to cells, widely used to maintain a pH of 6.8-8.2 in culture studies on the growth of lymphoid cells;
- 2-Меркаптоэтанол - антиоксидант, вызывающий реактивацию многих ферментов и используемый в качестве добавки при культивировании мононуклеарных клеток, увеличивает выход клеток гранулоцит-макрофагального ряда; - 2-Mercaptoethanol - an antioxidant that causes the reactivation of many enzymes and is used as an additive in the cultivation of mononuclear cells, increases the output of granulocyte-macrophage cells;
- Глутамин - незаменимая аминокислота, необходимая для питания растущих клеток; - Glutamine is an essential amino acid needed to nourish growing cells;
- Гентамицин - антибиотик, подавляющий рост бактериальной флоры, добавляемый в концентрации, нетоксичной для растущей культуры клеток. - Gentamicin is an antibiotic that suppresses the growth of the bacterial flora, added in a concentration non-toxic to the growing cell culture.
- Нейпоген (rhGM-CSF) - рекомбинантный человеческий аналог GM-CSF, являющийся гликопротеином, гемопоэтическим ростовым фактором, регулирующим образование и функционирование иммунокомпетентных клеток: дендритных клеток, макрофагов и гранулоцитов. Так как в периферической крови человека содержится всего лишь около 1% DC, получение достаточного количества DC in vitro из моноцитов периферической крови может быть осуществлено путем культивирования в присутствии ростовых факторов, основным из которых является GM-CSF.
- рекомбинантный человеческий Интерлейкин— 4 (rhIL-4) -является фактором дифференцировки для Т- и В-лимфоцитов. Наиболее сильный эффект IL -4 оказывает на регуляцию образования других цитокинов посредством участия в многочисленных биологических процессах, таких, как иммунный ответ и воспалительные реакции. Моноциты in vitro под действием GM-CSF и IL -4 теряют способность к фагоцитозу, приобретают морфологию дендритных клеток. - Neupogen (rhGM-CSF) is a recombinant human analogue of GM-CSF, which is a glycoprotein, a hematopoietic growth factor that regulates the formation and functioning of immunocompetent cells: dendritic cells, macrophages and granulocytes. Since only about 1% DC is contained in human peripheral blood, the production of a sufficient amount of DC in vitro from peripheral blood monocytes can be carried out by culturing in the presence of growth factors, the main of which is GM-CSF. - recombinant human Interleukin-4 (rhIL-4) is a differentiation factor for T and B lymphocytes. The most powerful effect of IL-4 has on the regulation of the formation of other cytokines through participation in numerous biological processes, such as the immune response and inflammatory reactions. Monocytes in vitro under the influence of GM-CSF and IL-4 lose their ability to phagocytosis, acquire the morphology of dendritic cells.
- туберкулин в стандартном разведении представляет собой очищенную смесь фильтратов убитых нагреванием культур микобактерий туберкулеза человеческого и бычьего видов, осажденных трихлоруксусной кислотой, обработанных этиловым спиртом и эфиром для наркоза, препарат имеет вид порошка белого цвета с активностью 500 000 туберкулиновые единицы (ТЕ) во флаконе; - tuberculin in standard dilution is a purified mixture of filtrates of heat-killed cultures of human and bovine tuberculosis mycobacteria cultures precipitated with trichloroacetic acid, treated with ethyl alcohol and ether for anesthesia, the drug has the form of a white powder with an activity of 500,000 tuberculin units (TE) in a vial;
- рекомбинантный человеческий Фактор некроза опухоли альфа (rhTNF-a) представляет собой полипептид. TNF-a является провоспалительным цитокином, вызывает ускоренное созревание дендритных клеток; - recombinant human tumor necrosis factor alpha (rhTNF-a) is a polypeptide. TNF-a is a pro-inflammatory cytokine that causes accelerated maturation of dendritic cells;
- Ронколейкин (rhIL-2) - препарат рекомбинантного человеческого цитокина IL- 2. IL-2 является полным структурным и функциональным аналогом эндогенного ИЛ-2, способствует пролиферации и дифференцировке Т-лимфоцитов, вызывает поликлональную активацию Т- лимфоцитов, увеличивает функциональную активность фагоцитов и клеток натуральных киллеров (ΝΚ-клеток). Этот цитокин участвует в регуляции иммунного ответа и направляет его по Т-хелпер 1 - клеточному пути развития. Введение ронколейкина в среду для культивирования способствует запуску и развертыванию клеточного иммунного ответа, который является наиболее эффективным в борьбе с микобактерией туберкулеза; - Roncoleukin (rhIL-2) - a preparation of the recombinant human cytokine IL-2. IL-2 is a complete structural and functional analogue of endogenous IL-2, promotes the proliferation and differentiation of T-lymphocytes, causes polyclonal activation of T-lymphocytes, increases the functional activity of phagocytes and natural killer cells (ΝΚ cells). This cytokine is involved in the regulation of the immune response and directs it along the T-helper 1 - cell development pathway. The introduction of roncoleukin into the culture medium promotes the launch and deployment of a cellular immune response, which is most effective in the fight against tuberculosis mycobacterium;
- рекомбинантный человеческий Интерлейкин- 12 (rhIL-12) - цитокин, активирует дифференцировку Т-лимфоцитов, повышает их цитотоксическую активность, усиливает пролиферацию DC и Т-лимфоцитов и продукцию других цитокинов. Один из важнейших эффектов IL-12 - способность поворачивать дифференцировку Т-хелперов в сторону Т-хелперов 1 пути; - recombinant human Interleukin-12 (rhIL-12) - a cytokine that activates the differentiation of T-lymphocytes, increases their cytotoxic activity, enhances the proliferation of DC and T-lymphocytes and the production of other cytokines. One of the most important effects of IL-12 is the ability to rotate the differentiation of T-helpers towards T-helpers of 1 way;
- рекомбинантный человеческий Интерлейкин- 18 (rhIL-18) - участвует в активации цитотоксических Т-лимфоцитов, ΝΚ-клеток, макрофагов, дендритных клеток и способствует формированию эффективного противоинфекционного иммунного ответа. - recombinant human Interleukin-18 (rhIL-18) - is involved in the activation of cytotoxic T-lymphocytes, ΝΚ cells, macrophages, dendritic cells and contributes to the formation of an effective anti-infection immune response.
Способ получения аутологичной клеточной вакцины для лечения туберкулеза
легких согласно изобретению осуществляли поэтапно следующим образом: A method of obtaining an autologous cell vaccine for the treatment of tuberculosis lungs according to the invention was carried out in stages as follows:
а) проводили выделение мононуклеаров (далее MNCs) из аутологичной периферической крови туберкулезного больного известным способом на градиенте фикол-урографина с плотностью 1,077 г/см3 при соотношении крови и градиента 2: 1; б) для получения популяций моноцитов и лимфоцитов проводили культивирование MNCs, полученных на этапе а), в количестве 2 х 106 in vitro во флаконах для культивирования путем инкубирования в течение 1,0 часа при температуре 37°С в атмосфере 5% С02 в среде DMEM, дополненной на 100 мл DMEM: FCS -1%, HEPES -5мМ, Глутамин - 2мМ , Гентамицин -1000 мкг/мл; a) mononuclear cells (hereinafter MNCs) were isolated from autologous peripheral blood of a tuberculosis patient in a known manner on a ficol-urographin gradient with a density of 1.077 g / cm 3 with a blood and gradient ratio of 2: 1; b) to obtain populations of monocytes and lymphocytes, MNCs obtained in step a) were cultured in an amount of 2 × 10 6 in vitro in culture bottles by incubation for 1.0 hour at 37 ° C in an atmosphere of 5% С0 2 in DMEM medium supplemented with 100 ml of DMEM: FCS -1%, HEPES -5 mM, Glutamine - 2 mM, Gentamicin -1000 μg / ml;
в) проводили разделение MNCs, полученных на этапе б), на прилипшую фракцию моноцитов и не прилипшую фракцию лимфоцитов путем отбора прилившей фракции со стенок флаконов после проведения культивирования на этапе б); c) the MNCs obtained in step b) were separated into an adherent fraction of monocytes and an adherent fraction of lymphocytes by selection of an adherent fraction from the walls of the vials after culturing in step b);
г) для получения незрелых iDC, которые способны к активному захвату антигена путем фагоцитоза и макропиноцитоза, проводили культивирование моноцитов прилипшей фракции, полученной на этапе в), in vitro в течение 24 часов в среде DMEM, дополненной на 100 мл DMEM: FCS -10%, HEPES -5 мМ, Глутамин - 2 мМ, 2-Меркаптоэтанол - 5х10'5М, Гентамицин - 1000 мкг/мл, и дополненной из расчета на 1 мл среды, содержащей 1 млн клеток, Нейпогеном - 50 нг/мл и rhIL-4 - 100 нг/мл. Указанные время культивации и концентрации выбирали экспериментально с учетом максимального выхода незрелых iDC, при этом фенотип определяли по основным маркерам CD83+ и CD 86+. При этом было установлено, что добавление Нейпогена в концентрации 50 нг/мл в сочетании с rhIL— 4 к прилипшей фракции на этапе г) приводит к повышению процента выхода незрелых DC; d) to obtain immature iDCs that are capable of actively capturing antigen by phagocytosis and macropinocytosis, monocytes of the adherent fraction obtained in step c) were cultured in vitro for 24 hours in DMEM supplemented with 100 ml DMEM: FCS -10% , HEPES -5 mM, Glutamine - 2 mM, 2-Mercaptoethanol - 5x10 '5 M, Gentamicin - 1000 μg / ml, and supplemented with 1 ml of medium containing 1 million cells, Neupogen - 50 ng / ml and rhIL- 4 - 100 ng / ml. The indicated cultivation time and concentration were chosen experimentally taking into account the maximum yield of immature iDC, while the phenotype was determined by the main markers CD83 + and CD 86+. Moreover, it was found that the addition of Neupogen at a concentration of 50 ng / ml in combination with rhIL-4 to the adherent fraction in step g) leads to an increase in the yield of immature DCs;
д) для получения антигенактивированных незрелых DC (АА iDC) проводили культивирование полученной на этапе г) фракции, содержащей iDC, в среде, используемой на этапе б), с добавлением 2-Меркаптоэтанола, туберкулина. При этом культивирование проводили в течение 12 - 24 часов в среде DMEM, дополненной на 100 мл DMEM: FCS -10%, HEPES -5 мМ, Глутамин - 2 мМ, 2-Меркаптоэтанол - 5x10" 5М, Гентамицин - 1000 мкг/мл, с добавлением туберкулина из расчета 500 ТЕ на 1 мл DMEM; d) to obtain antigen-activated immature DC (AA iDC), the fraction obtained in step d) containing iDC was cultured in the medium used in step b) with the addition of 2-Mercaptoethanol and tuberculin. The cultivation was carried out for 12-24 hours in DMEM supplemented with 100 ml of DMEM: FCS -10%, HEPES -5 mM, Glutamine - 2 mM, 2-Mercaptoethanol - 5x10 " 5 M, Gentamicin - 1000 μg / ml , with the addition of tuberculin at the rate of 500 TE per 1 ml of DMEM;
е) для получения зрелых DC, антигенактивированных в процессе созревания (АА mDC), проводили культивирование полученной на этапе д) фракции, содержащей АА iDC, in vitro в среде, используемой на этапе д), с добавлением rhTNF-α. При этом
культивирование проводили в течение 24 часов в среде DMEM, дополненной на 100 мл DMEM: FCS -10%, HEPES -5мМ, Глутамин - 2мМ, 2-Меркаптоэтанол - 5х10"5М, Гентамицин - 1000 мкг/мл, с добавлением туберкулина из расчета 500 ТЕ на 1 мл DMEM и rhTNF-a из расчета 25 нг на 1 мл DMEM; f) in order to obtain mature DC antigenactivated during maturation (AA mDC), the fraction obtained in step e) was cultured in vitro in the medium used in step e) using rhTNF-α. Wherein cultivation was carried out for 24 hours in DMEM supplemented with 100 ml of DMEM: FCS -10%, HEPES -5 mM, Glutamine - 2 mM, 2-Mercaptoethanol - 5x10 "5 M, Gentamicin - 1000 μg / ml, with the addition of tuberculin at the rate of 500 TE per 1 ml of DMEM and rhTNF-a at the rate of 25 ng per 1 ml of DMEM;
и) параллельно не прилипшую фракцию, полученную на этапе в), выдерживали в среде DMEM, дополненной на 100 мл DMEM: FCS -10%, HEPES -5мМ, Глутамин - 2мМ, Гентамицин - 1000 мкг/мл в течение времени, достаточного для поддержания жизнеспособности клеток, которое составило 60-72 часа; i) the parallel non-adherent fraction obtained in step c) was kept in DMEM supplemented with 100 ml of DMEM: FCS -10%, HEPES -5 mM, Glutamine - 2 mM, Gentamicin - 1000 μg / ml for a time sufficient to maintain cell viability, which was 60-72 hours;
к) для получения Т-лимфоцитов, специфически активированных АА mDC, проводили совместное культивирование прилипшей фракции, полученной на этапе е), и части не прилипшей фракции мононуклеаров, полученной на этапе и), in vitro в соотношении 1 :10 в течение 48 часов в свежей среде DMEM, дополнительно содержащей на 100 мл среды: FCS -10%, HEPES -5мМ, Глутамин - 2мМ, Гентамицин - 1000 мкг/мл, дополненной из расчета на 1 мл среды, содержащей 2,5 млн. клеток, Ронколейкином -100 ЕД мл и rhIL-12 - 10 нг/мл или rhIL-18 - 100 нг/мл и rhIL-12 - 10 нг/мл. При этом было установлено, что добавление Ронколейкина и rhIL-12 или rhlL- 12 и rhIL-18 на стадии совместного культивирования с увеличением срока совместного культивирования до 48 часов приводит к повышению процентного выхода специфически активированных киллеров. По мнению авторов, добавление на стадии совместного культивирования не прилипающей фракции MNCs и зрелых антигенактивированных DC рекомбинантного человеческого интерлейкина-12 повышает процентный выход специфически активированных Т-лимфоцитов; j) to obtain T-lymphocytes specifically activated by AA mDC, the adherent fraction obtained in step e) and part of the non-adherent mononuclear fraction obtained in step i) were co-cultured in vitro in a ratio of 1: 10 for 48 hours fresh DMEM medium, additionally containing per 100 ml of medium: FCS -10%, HEPES -5 mM, Glutamine - 2 mM, Gentamicin - 1000 μg / ml, supplemented with 1 ml of medium containing 2.5 million cells, Roncoleukin -100 IU ml and rhIL-12 - 10 ng / ml or rhIL-18 - 100 ng / ml and rhIL-12 - 10 ng / ml. It was found that the addition of Roncoleukin and rhIL-12 or rhlL-12 and rhIL-18 at the stage of co-cultivation with an increase in the co-cultivation period up to 48 hours leads to an increase in the percentage yield of specifically activated killers. According to the authors, the addition of non-adherent fraction of MNCs and mature antigen-activated DC of recombinant human interleukin-12 at the stage of co-cultivation increases the percentage yield of specifically activated T-lymphocytes;
л) затем производили отбор из фракции клеток, полученной на этапе к), прилипших АА mDC и дважды их отмывали центрифугированием в физиологическом растворе 10 минут при 1500 об./мин с получением одной части вакцины; k) then, selection was made from the fraction of cells obtained in step k) that adhered AA mDC and were washed twice by centrifugation in physiological saline for 10 minutes at 1500 rpm./min to obtain one part of the vaccine;
м) производили отбор из фракции клеток, полученной на этапе к), не прилипших Т-лимфоцитов, специфически активированных АА mDC, и дважды их отмывали центрифугированием в физиологическом растворе 10 минут при 1500 об./мин с получением другой части вакцины. m) selection was made from the fraction of cells obtained in step k) of non-adhering T-lymphocytes specifically activated by AA mDC, and they were washed twice by centrifugation in physiological saline for 10 minutes at 1500 rpm to obtain another part of the vaccine.
В процессе исследований авторы установили, что описанное выше в способе согласно изобретению поэтапное культивирование моноцитов прилипающей фракции MNCs, выделенных из периферической крови больного туберкулезом, способствует получению сначала незрелых дендритных клеток (iDC) с выраженной способностью
только поглощать антиген (этап г), а затем, после добавления сначала туберкулина (этап д) для получения антигенактивированных незрелых DC (АА iDC) и последующего добавления компонентов, стимулирующих созревание этих АА iDC (этап е), способствует получению зрелых DC, антигенактивированных в процессе созревания (АА mDC) (этап е), которые эффективно презентируют антигены и активируют Т-лимфоциты (этап к), что приводит к получению Т-лимфоцитов, специфически активированных АА mDC. In the process of research, the authors found that the step-by-step cultivation of monocytes of the adherent fraction of MNCs isolated from the peripheral blood of a patient with tuberculosis described above in the method according to the invention promotes the production of initially immature dendritic cells (iDC) with a pronounced ability only absorb the antigen (step d), and then, after adding tuberculin first (step e) to obtain antigen-activated immature DCs (AA iDC) and then adding components that stimulate the maturation of these AA iDCs (step e), it helps to produce mature DCs antigenactivated in maturation process (AA mDC) (step e), which effectively present antigens and activate T-lymphocytes (step k), which leads to the production of T-lymphocytes specifically activated by AA mDC.
При этом установлено, что разнесение во времени стадий добавления туберкулина в среду к незрелым iDC и внесения с интервалом 24 часа острофазного цитокина TNF-α, необходимого для их созревания, исключает возможность досрочного созревания iDC при незавершенном процессе презентации антигена, повышает эффективность захвата и презентации антигена, повышает эффективность созревания и процентный выход зрелых АА mDC. It was found that the time diversity of the stages of adding tuberculin to the immature iDC and introducing the acute phase TNF-α cytokine necessary for their maturation at intervals of 24 hours excludes the possibility of early iDC maturation with incomplete antigen presentation process, increases the efficiency of antigen capture and presentation , increases the ripening efficiency and the percentage yield of mature AA mDC.
Согласно изобретению, совместное культивирование на этапе к) фракции, полученной на этапе е), и части не прилипшей фракции, полученной на этапе и), с получением Т-лимфоцитов, специфически активированных зрелыми DC, антигенактивированными в процессе созревания (АА mDC), проводили в присутствии Ронколейкина или rhIL-18, при этом процесс дифференцировки Т-хелперов направляется по Т-хелпер 1 пути (ТЫ клеточному варианту иммунного ответа), что при введении обеих частей вакцины больному приводит к развертыванию специфического иммунного ответа против микобактерии М. tuberculosis, образуются активированные цитотоксические Т-киллеры (CD8+) и Т-лимфоциты гиперчувствительности замедленного типа (Т-ГЗТ - CD4+), которые являются основными эффекторами клеточного пути иммунного ответа. Таким образом запускается презентация антигена в составе аутологичных антигенактивированных DC (АА mDC) наивным Т-лимфоцитам-хелперам. Добавление в среду Ронколейкина и rhIL-12 на этапе к) способа согласно изобретению активизирует генерацию цитотоксических Т-лимфоцитов, усиливает их активность. According to the invention, the co-cultivation in step k) of the fraction obtained in step e) and part of the non-adherent fraction obtained in step i), with the production of T-lymphocytes specifically activated by mature DCs antigenactivated during maturation (AA mDC), was carried out in the presence of Roncoleukin or rhIL-18, while the process of differentiation of T-helpers is directed along the 1-way T-helper (YOU cell variant of the immune response), which, when both parts of the vaccine are administered to the patient, leads to the development of a specific immune response against m Mycobacterium M. tuberculosis, activated cytotoxic T-killers (CD8 + ) and delayed-type hypersensitivity T-lymphocytes (T-HRT - CD4 + ) are formed, which are the main effectors of the cellular pathway of the immune response. Thus, the presentation of the antigen in the composition of autologous antigen-activated DC (AA mDC) naive helper T-lymphocytes is launched. The addition of Roncoleukin and rhIL-12 to the medium at step k) of the method according to the invention activates the generation of cytotoxic T lymphocytes, enhances their activity.
Время, необходимое и достаточное для эффективной поэтапной культивации незрелых DC и зрелых DC, определено авторами экспериментально и является оптимальным. The time necessary and sufficient for the effective phased cultivation of immature DC and mature DC was determined experimentally by the authors and is optimal.
Культивирование MNCs на этапе б) в среде с добавлением инактивированной эмбриональной телячьей сыворотки (FCS) исключает возможность супрессивного
воздействия на клетки вакцины факторов, образующихся под влиянием микобактерии М. tuberculosis , содержащихся в аутологичной сыворотке больного туберкулезом. The cultivation of MNCs in step b) in a medium supplemented with inactivated fetal calf serum (FCS) eliminates the possibility of suppressive exposure to vaccine cells of factors formed under the influence of M. tuberculosis mycobacteria contained in the autologous serum of a patient with tuberculosis.
Ниже приведены результаты тестов, выполненных in vitro для определения эффективности аутологичной клеточной вакцины, полученной способом согласно изобретению. Статистическую обработку результатов производили с применением непараметрического критерия Манна-Уитни, различия считали достоверными при р<0,05. The following are the results of tests performed in vitro to determine the effectiveness of an autologous cell vaccine obtained by the method according to the invention. Statistical processing of the results was performed using the nonparametric Mann-Whitney test, the differences were considered significant at p <0.05.
Для тестирования использовали гепаринизированную венозную кровь пациентов, больных туберкулезом, получающих стандартную терапию (на базе ГУЗОО «Клинический противотуберкулезный диспансер», г. Омск, ОГУЗ «Областная туберкулезная клиническая больница», г. Томск). For testing, heparinized venous blood of patients with tuberculosis receiving standard therapy was used (on the basis of the Clinical Tuberculosis Dispensary GUZOO, Omsk, the Regional Clinical Tuberculosis Hospital OGUZ, Tomsk).
1. Определение эффективности дендритных клеток вакцины, полученной способом согласно изобретению. 1. Determination of the effectiveness of dendritic cells of the vaccine obtained by the method according to the invention.
Для тестирования фенотипических характеристик DC вакцины использовали моноклональные антитела anti-CD83-PE (BD Pharmingen), anti-CD86-FITC (BD Pharmingen), anti-HLA-DR-FITC («Сорбент», Москва) с последующим анализом на проточном питометре FACSCalibur (BDBiosciense). Признаком функциональной зрелости дендритных клеток считалось повышение уровня экспрессии вышеперечисленных маркеров по сравнению с незрелыми DC (iDC). To test the phenotypic characteristics of the DC vaccine, anti-CD83-PE monoclonal antibodies (BD Pharmingen), anti-CD86-FITC (BD Pharmingen), anti-HLA-DR-FITC monoclonal antibodies (Sorbent, Moscow) were used, followed by analysis on a FACSCalibur flowmeter (BDBiosciense). A sign of functional maturity of dendritic cells was considered to be an increase in the expression level of the above markers compared with immature DC (iDC).
ФигЛА, 1В и Фиг.2А, 2В иллюстрируют процессы индукции созревания DC, культивируемых согласно этапам г), д) и е) способа получения вакцины согласно изобретению из моноцитов прилипшей фракции MNCs крови больных туберкулезом легких: FIGLA, 1B and FIGS. 2A, 2B illustrate the induction processes of DC maturation cultured according to steps d), e) and e) of a method for producing a vaccine according to the invention from adherent monocytes of the blood MNCs fraction of pulmonary tuberculosis patients:
- на ФигЛА для iDC и на ФигЛВ для mDC показано изменение экспрессии CD83+ и CD86+ на клетках на разных этапах созревания DC, при этом; «CD83+-PE» - интенсивность свечения маркера CD83+, мечнного фикоэритрином (phycoerythrin, РЕ); «CD86+-FITC» - интенсивность свечения маркера CD86+, меченного флуоресцеина изотиоцианатом (fluorescein isothiocyanate, FITC); «CD83+» - мононуклеарные клетки несущие маркер CD83+; «CD86+» - мононуклеарные клетки несущие маркер CD86+; «CD83+CD86+» - мононуклеары, одновременно несущие маркеры к CD83+ и CD86+. Из ФигЛА и 1В следует, что для iDC максимальное количество CD83+/CD86+ составило 19,6% (ФигЛА), а для mDC максимальное количество CD83+/CD86+
составило 33% (Фиг. IB); - FigLA for iDC and FigLV for mDC shows the change in the expression of CD83 + and CD86 + on cells at different stages of DC maturation, while; "CD83 + -PE" is the luminosity of the CD83 + marker labeled with phycoerythrin (phycoerythrin, PE); "CD86 + -FITC" is the luminosity of the CD86 + marker labeled with fluorescein isothiocyanate (fluorescein isothiocyanate, FITC); "CD83 +" - mononuclear cells carrying the marker CD83 +; "CD86 +" - mononuclear cells carrying the marker CD86 +; “CD83 + CD86 +” are mononuclear cells that simultaneously carry markers for CD83 + and CD86 +. From FigLA and 1B it follows that for iDC the maximum number of CD83 + / CD86 + was 19.6% (FigLA), and for mDC the maximum number of CD83 + / CD86 + amounted to 33% (Fig. IB);
- на Фиг.2А для iDC и на Фиг.2В для mDC показано изменение экспрессии CD83+ и HLA-DR+ на клетках на разных этапах созревания DC, при этом; «CD83+- РЕ» - интенсивность свечения маркера CD 83, меченного фикоэритрином (phycoerythrin, РЕ); «HLA-DR+-FITC» - интенсивность свечения маркера HLA-DR+, меченного флуоресцеина изотиоцианатом (fluorescein isothiocyanate, FITC); «cd83+» - мононуклеарные клетки несущие маркер CD 83+; «HLA-DR+» - мононуклеарные клетки несущие маркер HLA-DR+; «CD83+HLA-DR+» - мононуклеары, одновременно несущие маркеры к CD83+ и HLA-DR+. Из Фиг.2А и 2В следует, что для iDC максимальное количество CD83+/ HLA-DR+ составило 8% (ФигЛА), а для mDC максимальное количество CD83+/ HLA-DR+ составило 22,5% (ФигЛВ); - Fig.2A for iDC and Fig.2B for mDC shows the change in the expression of CD83 + and HLA-DR + on cells at different stages of DC maturation, while; "CD83 + - PE" - the intensity of the glow of the marker CD 83, labeled with phycoerythrin (phycoerythrin, PE); "HLA-DR + -FITC" is the luminescence intensity of the HLA-DR + marker labeled with fluorescein isothiocyanate (fluorescein isothiocyanate, FITC); "Cd83 +" - mononuclear cells bearing a marker of CD 83+; "HLA-DR +" - mononuclear cells carrying the marker HLA-DR +; “CD83 + HLA-DR +” are mononuclear cells that simultaneously carry markers for CD83 + and HLA-DR +. From Figs. 2A and 2B, it follows that for iDC the maximum number of CD83 + / HLA-DR + was 8% (FigLA), and for mDC the maximum number of CD83 + / HLA-DR + was 22.5% (FigLV);
На Фиг.З представлены показатели фенотипических маркеров на разных этапах созревания DC, культивируемых способом получения вакцины согласно изобретению из моноцитов прилипшей фракции MNCs крови больных туберкулезом легких, в координатах по оси в процентах (М±т), причем: для iDC, полученных из моноцитов MNCs на этапе г) способа в присутствии Нейпогена и rhIL-4, экспрессия CD83+/CD86+ составила 18,59±1,05 (показан левый столбец в области а), экспрессия CD83+/ HLA- DR+ составила 7,67±0,45 (показан левый столбец в области Ь), а для АА mDC, полученных на этапе е) способа из АА iDC последующим культивированием в присутствии rhTNF-α, экспрессия CD83+/CD86+ составила 31,33±1,56 (показан правый столбец в области а), экспрессия CD83+/ HLA-DR+ составила 22,26±1,12 (показан правый столбец в области Ь). Стрелками показаны достоверные различия между группами (р<0,05); Fig. 3 shows the phenotypic markers at different stages of DC maturation cultivated by the method for producing the vaccine according to the invention from adherent blood MNCs fraction of blood pulmonary tuberculosis patients, in axial coordinates in percent (M ± t), moreover: for iDC obtained from monocytes MNCs in step d) of the method in the presence of Neupogen and rhIL-4, the expression of CD83 + / CD86 + was 18.59 ± 1.05 (the left column in region a is shown), the expression of CD83 + / HLA-DR + was 7.67 ± 0.45 ( the left column in region b) is shown, and for AA mDC obtained in step e) of the method from AA iDC by subsequent cultivation in the presence of rhTNF-α, the expression of CD83 + / CD86 + was 31.33 ± 1.56 (the right column in region a is shown), the expression of CD83 + / HLA-DR + was 22.26 ± 1.12 (the right column in region b was shown ) Arrows indicate significant differences between groups (p <0.05);
В таблЛ представлены фенотипические характеристики DC на разных этапах созревания DC , культивируемых способом получения вакцины согласно изобретению из прилипшей фракции MNCs больных туберкулезом легких, причем незрелые iDC были получены из MNCs на этапе г) способа в присутствии Нейпогена и rhIL-4, а зрелые АА mDC были получены на этапе е) способа из АА iDC последующим культивированием в присутствии rhTNF-a. Table 4 shows the phenotypic characteristics of DC at different stages of DC maturation cultivated by the method for preparing the vaccine according to the invention from an adherent fraction of MNCs of patients with pulmonary tuberculosis, immature iDCs obtained from MNCs in step d) of the method in the presence of Neupogen and rhIL-4, and mature AA mDC were obtained in step e) of the method from AA iDC by subsequent cultivation in the presence of rhTNF-a.
Таблица I Table I
Фенотипические характеристики дендритных клеток, полученных из моноцитов периферической крови пациентов, Phenotypic characteristics of dendritic cells derived from patients peripheral blood monocytes,
больных туберкулезом.
Уровень экспрессии маркеров tuberculosis patients. Marker Expression Level
на стадиях развития DC at the stages of DC development
Маркеры Markers
(% позитивных клеток) iDC, % АА mDC, % (% positive cells) iDC,% AA mDC,%
CD 83+/CD 86+ 18,59±1,05 31,33±1,56*CD 83 + / CD 86+ 18.59 ± 1.05 31.33 ± 1.56 *
CD 83+/HLA-DR+ 7,67±0,45 22,26±1,12*CD 83 + / HLA-DR + 7.67 ± 0.45 22.26 ± 1.12 *
*- различия достоверны (р<0.05) по сравнению с незрелыми дендритными клетками. * - the differences are significant (p <0.05) compared with immature dendritic cells.
Было установлено, что в результате осуществления способа получения аутологической вакцины согласно изобретению iDC приобретают фенотип АА mDC, увеличивая экспрессию CD83+/CD86+ и CD83+/HLA-DR+ через 72 часа созревания. It was found that as a result of implementing the method for producing an autologous vaccine according to the invention, iDCs acquire the AA mDC phenotype, increasing the expression of CD83 + / CD86 + and CD83 + / HLA-DR + after 72 hours of maturation.
2. Определение эффективности модуляции противотуберкулезного иммунного ответа с использованием вакцины, полученной способом согласно изобретению. 2. Determining the effectiveness of modulation of the anti-tuberculosis immune response using a vaccine obtained by the method according to the invention.
2а. Пролиферативная активность. 2a. Proliferative activity.
Для определения эффективности модуляции противотуберкулезного иммунного ответа оценивали пролиферативную активность мононуклеарных клеток MNCs с использованием системы APO-BRDUFlowKit на проточном цитометре FACSCalibur (BD Biosciense). Для тестирования использовали полученные на этапе е) способа получения вакцины согласно изобретению АА mDC, которые подвергали на этапе к) способа совместному культивированию в течение 72 часов с MNCs не прилипшей фракции, в ответ на специфический антиген М. tuberculosis - туберкулин. На Фиг.4 и в табл.2 представлены результаты тестирования пролиферативной активности мононуклеарных клеток MNCs (группа 1), MNCs при добавлении в среду цитокинов rhIL-12 +rhIL-18 (группа 2), MNCs при добавлении в среду цитокинов rhIL-12 +rhIL-2 (группа 3), MNCs при добавлении в среду АА mDC (группа 4), MNCs при добавлении в среду АА mDC и цитокинов rhIL-12 +rhIL-18 (группа 5), MNCs при добавлении в среду АА mDC и цитокинов rhIL-12 +rhIL-2 (группа 6). To determine the modulation efficiency of the anti-tuberculosis immune response, the proliferative activity of MNCs mononuclear cells was evaluated using the APO-BRDUFlowKit system on a FACSCalibur flow cytometer (BD Biosciense). For testing, we used the AA mDC obtained in step e) of the method for preparing the vaccine according to the invention, which were subjected to co-cultivation in step k) of the method for 72 hours with non-adherent fraction MNCs in response to a specific M. tuberculosis antigen - tuberculin. Figure 4 and table 2 presents the results of testing the proliferative activity of mononuclear cells MNCs (group 1), MNCs when rhIL-12 + rhIL-18 cytokines were added to the medium (group 2), MNCs when rhIL-12 + cytokines were added to the medium rhIL-2 (group 3), MNCs when AA mDC is added to the medium (group 4), MNCs when AA mDC and cytokines are added to AA rhIL-12 + rhIL-18 (group 5), MNCs when AA mDC and cytokines are added to AA rhIL-12 + rhIL-2 (group 6).
Таблица 2 table 2
Пролиферативный ответ мононуклеарных клеток крови больных туберкулезом, сокультивированных с цитокинами (rhIL-12 и rhIL-18 или rhIL-12 и rhIL-2 ), (M±m) и/или с АА mDC в условиях спонтанного
и туберкулинактивированного продуцирования, Proliferative response of mononuclear blood cells of tuberculosis patients co-cultivated with cytokines (rhIL-12 and rhIL-18 or rhIL-12 and rhIL-2), (M ± m) and / or with AA mDC in spontaneous conditions and tuberculinactivated production,
Группы Спонтанный Туберкулин- пролиферативный ответ, стимулированный Groups Spontaneous Tuberculin - Proliferative Response Stimulated
% пролиферативный ответ, % proliferative response,
% %
MNCs 10,09± 0,65 13,03± 0,71 MNCs 10.09 ± 0.65 13.03 ± 0.71
p4 р4 p4 p4
p5 р5 p5 p5
P6 рб P 6 rb
14,21±0,23 16,99±0,29 14.21 ± 0.23 16.99 ± 0.29
MNCs + rhIL-12 p4 р4 MNCs + rhIL-12 p4 p4
+rhIL-18 p5 р5 + rhIL-18 p5 p5
p6 рб p6 rb
16,06±0,25 18,65±0,74 16.06 ± 0.25 18.65 ± 0.74
MNCs + rhIL-12 p4 р4 MNCs + rhIL-12 p4 p4
+rhIL-2 p5 р5 + rhIL-2 p5 p5
P6 рб P 6 rb
MNCs+AA mDC 27,41± 1,45 36,75± 2,3 MNCs + AA mDC 27.41 ± 1.45 36.75 ± 2.3
Pi pi Pi pi
p2 р2 p2 p2
p3 рЗ p3 rz
p5 р5 p5 p5
p6 рб p6 rb
MNCs+ AA mDC 48,93±2,66 52±1,53 MNCs + AA mDC 48.93 ± 2.66 52 ± 1.53
+ rhIL-12 + pi pi + rhIL-12 + pi pi
rhIL-18 p2 р2 rhIL-18 p2 p2
P3 рЗ P3 rz
P4 р4
6 MNCs+ AA mDC 49,36±2,01 54±1,98 P 4 p4 6 MNCs + AA mDC 49.36 ± 2.01 54 ± 1.98
+ rhIL-12 + pi Pi + rhIL-12 + pi Pi
rhIL-2 P2 P2 rhIL-2 P 2 P 2
p3 p3 p3 p3
p4 p4 p4 p4
Примечание: Note:
PI - различия достоверны (p<0,05) по сравнению с группой 1, PI - differences are significant (p <0.05) compared with group 1,
p2- различия достоверны (р<0,05) по сравнению с группой 2, p2- differences are significant (p <0.05) compared with group 2,
рЗ- различия достоверны (р<0,05) по сравнению с группой 3, p3 differences are significant (p <0.05) compared with group 3,
р4- различия достоверны (р<0,05) по сравнению с группой 4, p4- differences are significant (p <0.05) compared with group 4,
р5- различия достоверны (р<0,05) по сравнению с группой 5, p5- differences are significant (p <0.05) compared with group 5,
рб- различия достоверны (р<0,05) по сравнению с группой 6. rb- differences are significant (p <0.05) compared with group 6.
Из представленных на Фиг.4 и в табл.2 данных следует, что дендритные клетки АА mDC в сочетании с цитокинами rhIL-12 и rhIL-18 или rhIL-12 и rhIL-2 повышают пролиферативную активность мононуклеарных клеток больных туберкулезом in vitro. From the data presented in FIG. 4 and Table 2, it follows that AA mDC dendritic cells in combination with rhIL-12 and rhIL-18 or rhIL-12 and rhIL-2 cytokines increase the proliferative activity of mononuclear cells of tuberculosis patients in vitro.
2b. Потенциальная цитотоксическая активность лимфоцитов вакцины Для определения потенциальной цитотоксической активности лимфоцитов определяли содержание клеток, экспрессирующих внутриклеточный белок перфорин, с помощью соответствующих моноклональных антител anti-perforin-PE (BD Pharmingen) через 72 часа культивирования MNCs, активированных АА mDC, в ответ на туберкулин. На Фиг.5 и в табл.3 представлены результаты тестов по определению количества перфорин экспрессирующих MNCs (группа 7) и после добавления цитокинов rhIL-12 и rhIL-18 (группа 8) или rhIL-12 и rhIL-2 (группа 9), и после сокультивирования MNCs со зрелыми DC, антигенактивированными в процессе созревания (АА mDC) (группа 10), с добавлением цитокинов rhIL-12 и rhIL-18 (группа 11) или rhIL-12 и rhIL-2 (группа 12). 2b. Potential cytotoxic activity of vaccine lymphocytes To determine the potential cytotoxic activity of lymphocytes, the content of cells expressing the intracellular protein perforin was determined using the corresponding anti-perforin-PE monoclonal antibodies (BD Pharmingen) after 72 hours of cultivation of AA mDC activated MNCs in response to tuberculin. Figure 5 and table 3 presents the results of tests to determine the number of perforin expressing MNCs (group 7) and after adding the cytokines rhIL-12 and rhIL-18 (group 8) or rhIL-12 and rhIL-2 (group 9), and after co-cultivation of MNCs with mature DC antigen-activated during maturation (AA mDC) (group 10), with the addition of rhIL-12 and rhIL-18 cytokines (group 11) or rhIL-12 and rhIL-2 (group 12).
Таблица 3 Table 3
Количество перфорин экспрессирующих мононуклеарных клеток, сокультивированных с цитокинами (rhIL-18 и rhIL-12 или rhIL-2 и rhIL-12) The number of perforin expressing mononuclear cells co-cultured with cytokines (rhIL-18 and rhIL-12 or rhIL-2 and rhIL-12)
и/или с АА mDC в ответ на туберкулин, (М±т) and / or with AA mDC in response to tuberculin, (M ± t)
Группы Спонтанная Туберкулин- экспрессия перфорина стимулированная
(% позитавных экспрессия перфорина клеток) (% позитивных клеток)Spontaneous Tuberculin groups - stimulated perforin expression (% positive expression of perforin cells) (% positive cells)
7 MNCs 16,14±1,75 18,21±1,9 7 MNCs 16.14 ± 1.75 18.21 ± 1.9
p4 р4 p5 р5 рб рб p4 p4 p5 p5 rb rb
19,84±2,02 20,65±1,96 19.84 ± 2.02 20.65 ± 1.96
8 MNCs + rhIL-12+ p4 р4 8 MNCs + rhIL-12 + p4 p4
rhIL-18 P5 р5 rhIL-18 P5 p5
P6 рб P 6 rb
20,02±1,23 21,15±1,11 20.02 ± 1.23 21.15 ± 1.11
9 MNCs + rhIL-12+ p4 р4 9 MNCs + rhIL-12 + p4 p4
rhIL-2 p5 р5 рб рб rhIL-2 p5 p5 rb rb
10 MNCs + AA mDC 27,43±1,15 37,37± 1,83 10 MNCs + AA mDC 27.43 ± 1.15 37.37 ± 1.83
pi pl pi pl
p2 р2 p3 рЗ p2 p2 p3 p3
p5 р5 рб рб p5 p5 rb rb
11 MNCs + AA mDC 43,51±2,0 46,36±3,14 11 MNCs + AA mDC 43.51 ± 2.0 46.36 ± 3.14
+ rhIL-12 +rhIL-18 Pi pl + rhIL-12 + rhIL-18 Pi pl
P2 р2 P 2 p2
P3 рЗ P3 rz
p4 р4 p4 p4
12 MNCs + AA mDC 42,98±1,32 45,64±2,1 12 MNCs + AA mDC 42.98 ± 1.32 45.64 ± 2.1
+ rhIL-12 +rhIL-2 pi pi + rhIL-12 + rhIL-2 pi pi
P2 Р2 P 2 P 2
p3 рз p3 rz
p4 р4 p4 p4
Примечание: Note:
P1- различия достоверны (р<0,05) по сравнению с группой 7, P1- differences are significant (p <0.05) compared with group 7,
P2- различия достоверны (р<0,05) по сравнению с группой 8,
РЗ- различия достоверны (р<0,05) по сравнению с группой 9, P2 differences are significant (p <0.05) compared with group 8, RZ differences are significant (p <0.05) compared with group 9,
Р4- различия достоверны (р<0,05) по сравнению с группой 10, P4- differences are significant (p <0.05) compared with group 10,
Р5- различия достоверны (р<0,05) по сравнению с группой 11, P5- significant differences (p <0.05) compared with group 11,
Р6 - различия достоверны (р<0,05) по сравнению с группой 12. P6 - significant differences (p <0.05) compared with group 12.
Было установлено, что добавление цитокинов rhIL-18 и rhIL-12 или rhIL-2 и rhIL-12 в совместную культуру MNCs и АА mDC достоверно увеличивает количество перфорин-продуцирующих MNCs в ответ на дополнительную антигенную стимуляцию, по сравнению с группой MNCs и АА mDC без добавления цитокинов. Повьппение количества перфорин-позитивных клеток служит показателем активации цитотоксических клеток, необходимых для уничтожения M.tuberculosis in vivo. It was found that the addition of rhIL-18 and rhIL-12 or rhIL-2 and rhIL-12 and rhIL-12 cytokines to the co-culture of MNCs and AA mDC significantly increases the number of perforin-producing MNCs in response to additional antigenic stimulation compared to the group of MNCs and AA mDC without the addition of cytokines. The increase in the number of perforin-positive cells is an indication of the activation of cytotoxic cells necessary for the destruction of M. tuberculosis in vivo.
3. Определение антиген-специфической стимуляции иммунного ответа с применением вакцины, полученной способом согласно изобретению. 3. Determination of antigen-specific stimulation of the immune response using a vaccine obtained by the method according to the invention.
Для анализа антиген-специфической стимуляции иммунного ответа на специфический антиген M.tuberculosis (туберкулин) оценивали количество клеток, продуцирующих IFN-γ, с использованием системы BDFastlmmuneCytokine на проточном цитометре FACSCalibur (BD Biosciense). При этом с помощью иммуноферментного анализа («Вектор-Бест») определяли содержание IFN-γ в культуральных супернатантах MNCs через 72 часа культивирования MNCs+AA mDC, в присутствии туберкулина. Результаты тестирования показаны на Фиг.6, Фиг.7 и в табл.3 для групп 13-18: MNCs (группа 13), MNCs при добавлении в среду цитокинов rhIL-12 +rhIL-18 (группа 14), MNCs при добавлении в среду цитокинов rhIL-12 +rhIL-2 (группа 15), MNCs при добавлении в среду АА mDC (группа 16), MNCs при добавлении в среду АА mDC и цитокинов rhIL-12 +rhIL-18 (группа 17), MNCs при добавлении в среду АА mDC и цитокинов rhIL-12 +rhIL-2 (группа 18). To analyze the antigen-specific stimulation of the immune response to the specific M. tuberculosis antigen (tuberculin), the number of IFN-γ producing cells was estimated using the BDFastlmmuneCytokine system on a FACSCalibur flow cytometer (BD Biosciense). Moreover, using the enzyme immunoassay (Vector-Best), the IFN-γ content in the culture supernatants of MNCs was determined after 72 hours of cultivation of MNCs + AA mDC in the presence of tuberculin. The test results are shown in Fig.6, Fig.7 and in Table 3 for groups 13-18: MNCs (group 13), MNCs when rhIL-12 + rhIL-18 cytokines were added to the medium (group 14), MNCs when added to medium of rhIL-12 + rhIL-2 cytokines (group 15), MNCs when AA mDC (group 16) is added to the medium, MNCs when AA mDC and rhIL-12 + rhIL-18 cytokines (group 17) are added, MNCs when added on Wednesday AA mDC and rhIL-12 + rhIL-2 cytokines (group 18).
Таблица 3 Table 3
Количество 1РК-у-продуцирующих клеток и содержание IFN-γ в культуре MNCs, сокультивированных с цитокинами (rhIL-18 и rhIL-12 или rhIL-2 и rhIL-12) The number of 1PK-producing cells and the content of IFN-γ in a culture of MNCs co-cultured with cytokines (rhIL-18 and rhIL-12 or rhIL-2 and rhIL-12)
и/или с АА mDC в условиях спонтанного and / or with AA mDC in spontaneous
и туберкулинактивированного продуцирования, (М±т). and tuberculinactivated production, (M ± t).
Группы Количество Q IFN-γ- Содержание IFN-γ продуцирующих клеток, в супернатантах
(на 100 тыс. MNCs) MNCs , Groups Number Q IFN-γ- Content of IFN-γ producing cells in supernatants (per 100 thousand MNCs) MNCs,
pkg/ml pkg / ml
Спонтанное Туберкулин- Спонтанн Туберкул продуцирова стимулиро- ое ин-Spontaneous Tuberculin- Spontaneous Tuberculin is produced by stimulated
- ние ванное продуцир стимулир продуцирова ова ованное ние ние продуцир ование - bath production stimulation production production
MNCs 64±11,2 MNCs 64 ± 11.2
Р2 P 2
32±9,3 65±3,25 165±9,75 рЗ 32 ± 9.3 65 ± 3.25 165 ± 9.75 rZ
р4 р4 р4 р4 p4 p4 p4 p4
р5 р5 р5 р5 p5 p5 p5 p5
рб рб рб рб rb rb rb rb
90±10,3 90 ± 10.3
48±7,8 pi 73±4,23 180±8,1 48 ± 7.8 pi 73 ± 4.23 180 ± 8.1
MNCs +rhIL-12 р4 рз р4 р4MNCs + rhIL-12 p4 pz p4 p4
+ rhIL-18 р5 р4 р5 р5 рб р5 рб рб рб + rhIL-18 p5 p4 p5 p5 rb r5 rb rb rb
113±9,2 113 ± 9.2
50±6,12 pi 76±5,3 190±9,25 50 ± 6.12 pi 76 ± 5.3 190 ± 9.25
MNCs +rhIL-12 р4 р2 р4 р4MNCs + rhIL-12 p4 p2 p4 p4
+ rhIL-2 р5 Р4 Р5 Р5 рб Р5 рб рб рб + rhIL-2 p5 P 4 P 5 P 5 rb R 5 rb rb rb
MNCs+ 84±4,8 161±8,15 618±30,91 885±44,2 MNCs + 84 ± 4.8 161 ± 8.15 618 ± 30.91 885 ± 44.2
AA mDC Pi pl pl 5 р2 Р2 Р2 pl рз рЗ рЗ Р2 р5 р5 Р5 рЗ
AA mDC Pi 5 pl pl p2 P 2 P 2 pl RH RH RH P2 P5 P5 P5 RH
Pl - различия достоверны (p<0,05) по сравнению с группой 13, Pl - significant differences (p <0.05) compared with group 13,
p2- различия достоверны (р<0,05) по сравнению с группой 14, p2- differences are significant (p <0.05) compared with group 14,
рЗ- различия достоверны (р<0,05) по сравнению с группой 15, p3 differences are significant (p <0.05) compared with group 15,
р4- различия достоверны (р<0,05) по сравнению с группой 16, p4- differences are significant (p <0.05) compared with group 16,
р5- различия достоверны (р<0,05) по сравнению с группой 17, p5- differences are significant (p <0.05) compared with group 17,
рб- различия достоверны (р<0,05) по сравнению с группой 18. rb- differences are significant (p <0.05) compared with group 18.
Было установлено, что добавление цитокинов rhIL-18 и rhIL-12 или rhIL-2 и rhlL- 12 в совместную культуру MNCs и AA mDC достоверно повышает количество IFN-γ- секретирующих клеток и уровень продуцирования цитокина мононуклеарными клетками в ответ на туберкулин у больных туберкулезом легких по сравнению с группой MNCs и AA mDC без добавления цитокинов. Это указывает на стимулирующее действие цитокинов на модуляцию иммунного ответа по Т-хелпер 1 типу. The addition of rhIL-18 and rhIL-12 or rhIL-2 and rhIL-2 and rhlL-12 cytokines to the co-culture of MNCs and AA mDC significantly increased the number of IFN-γ-secreting cells and the level of cytokine production by mononuclear cells in response to tuberculin in tuberculosis patients lung compared with the group of MNCs and AA mDC without the addition of cytokines. This indicates a stimulating effect of cytokines on the modulation of the immune response according to the T-helper type 1.
Таким образом, способом согласно изобретению была получена аутологичная клеточная вакцина, обладающая иммуномодулирующим действием, направленным на формирование специфического противотуберкулезного иммунного ответа при туберкулезе легких. Thus, by the method according to the invention, an autologous cell vaccine was obtained having an immunomodulatory effect aimed at the formation of a specific anti-tuberculosis immune response in pulmonary tuberculosis.
В результате проведенных исследований показана возможность индукции
специфического противоинфекционного иммунного ответа при туберкулезе с помощью аутологичных антиген-активированных дендритных клеток и «обученных» мононуклеарных клеток in vitro. Совместное культивирование специфических аутологичных зрелых дендритных клеток, антигенактивированных в процессе созревания, и мононуклеарных клеток больных туберкулезом легких приводит к активации мононуклеарных клеток, что проявляется в усилении их пролиферативного потенциала, увеличение количества цитотоксических клеток и повышении их функциональной активности. As a result of the studies shown the possibility of induction a specific anti-infectious immune response in tuberculosis using autologous antigen-activated dendritic cells and "trained" mononuclear cells in vitro. Co-cultivation of specific autologous mature dendritic cells antigenactivated during maturation and mononuclear cells of patients with pulmonary tuberculosis leads to activation of mononuclear cells, which manifests itself in an increase in their proliferative potential, an increase in the number of cytotoxic cells and an increase in their functional activity.
Преимуществами вакцины согласно изобретению является использование аутологичных (собственных) клеток пациента, что обеспечивает индивидуальный подход к лечению заболевания и нивелирует развитие побочных реакций на вакцинацию. Полученная вакцина устраняет дефекты иммунного ответа, возникающие при длительной персистенции микобактерий туберкулеза в организме как на стадии презентации антигена и дифференцировки антиген-представляющих дендритных клеток, так и на стадии активации основного клеточного варианта развития иммунного ответа, а также дополнительного гуморального иммунного ответа. The advantages of the vaccine according to the invention is the use of autologous (own) patient cells, which provides an individual approach to the treatment of the disease and eliminates the development of adverse reactions to vaccination. The resulting vaccine eliminates defects in the immune response that occur during prolonged persistence of tuberculosis mycobacteria in the body both at the stage of antigen presentation and differentiation of antigen-presenting dendritic cells, and at the stage of activation of the main cellular variant of the development of the immune response, as well as an additional humoral immune response.
Согласно изобретению, в настоящем изобретении разработан способ генерации цитотоксических клеток с помощью антигенактивированных аутологичных дендритных клеток и rhIL-12 и rhIL-18 либо rhIL-12 и rhIL-2 in vitro с получением незрелых и зрелых дендритных клеток из мононуклеарных клеток больных туберкулезом легких, которые характеризуются соответствующей функциональной активностью и фенотипом. При этом, по сравнению с вакциной прототипа, было достигнуто увеличение экспрессии костимуляторных молекул на поверхности антигенактивированных дендритных клеток, что свидетельствует о повышении эффективного процесса презентации антигена. According to the invention, the present invention provides a method for generating cytotoxic cells using antigen-activated autologous dendritic cells and rhIL-12 and rhIL-18 or rhIL-12 and rhIL-2 in vitro to produce immature and mature dendritic cells from mononuclear cells of patients with pulmonary tuberculosis that characterized by appropriate functional activity and phenotype. Moreover, in comparison with the vaccine of the prototype, an increase in the expression of co-stimulatory molecules on the surface of antigen-activated dendritic cells was achieved, which indicates an increase in the effective process of antigen presentation.
Совместное культивирование DC, антигенактивированных в процессе созревания, и MNCs в сочетании с rhIL-12 и rhIL-18 или с rhIL-12 и rhIL-2 является эффективным способом генерации специфических цитотоксических клеток мононуклеарного происхождения, что проявляется в усилении их цитотоксического противотуберкулезного ответа по сравнению с вакциной прототипа. Использование комбинации rhIL-12 и rhIL-18 или rhIL-12 и rhIL-2 для усиления индукции ответа позволяет статистически достоверно увеличить цитотоксический потенциал мононуклеарных клеток и продукцию IFN-γ in vitro.
При этом способ получения аутологичной вакцины согласно изобретению позволяет на этапах способа повысить выход незрелых DC, повысить эффективность захвата и презентации антигена, позволяет в более короткий срок получить более высокий процентный выход специфически активированных Т-лимфоцитов. Вакцина согласно изобретению для лечения туберкулеза легких, полученная способом согласно изобретению, по сравнению с известными вакцинами обладает более высокой эффективностью, устраняет дефекты иммунного ответа, возникающие под влиянием микобактерий туберкулеза, активируя клеточный вариант развития иммунного ответа. Co-cultivation of DC antigen-activated during maturation and MNCs in combination with rhIL-12 and rhIL-18 or with rhIL-12 and rhIL-2 is an effective way to generate specific cytotoxic cells of mononuclear origin, which manifests itself in an increase in their cytotoxic anti-tuberculosis response compared with the vaccine prototype. Using a combination of rhIL-12 and rhIL-18 or rhIL-12 and rhIL-2 to enhance the induction of response allows a statistically significant increase in the cytotoxic potential of mononuclear cells and IFN-γ production in vitro. Moreover, the method for producing an autologous vaccine according to the invention allows, at the method steps, to increase the yield of immature DC, to increase the efficiency of capture and presentation of the antigen, and in a shorter time to obtain a higher percentage yield of specifically activated T-lymphocytes. The vaccine according to the invention for the treatment of pulmonary tuberculosis, obtained by the method according to the invention, in comparison with known vaccines has a higher efficiency, eliminates defects of the immune response that occur under the influence of mycobacterium tuberculosis, activating the cellular variant of the development of the immune response.
Промышленная применимость Industrial applicability
Способ получения аутологичной клеточной вакцины согласно изобретению для лечения туберкулеза легких путем одновременного воздействия на специфическое и неспецифическое звено иммунного ответа может быть реализован с использованием известных технологических приемов и материалов. Аутологичная клеточная вакцина, полученная способом согласно изобретению, обладает высокой эффективностью и может быть использована для лечения больных туберкулезом путем внутривенного капельного введения в физрастворе.
A method of obtaining an autologous cell vaccine according to the invention for the treatment of pulmonary tuberculosis by simultaneously acting on a specific and non-specific link of the immune response can be implemented using known techniques and materials. The autologous cell vaccine obtained by the method according to the invention is highly effective and can be used to treat tuberculosis patients by intravenous drip in saline.
Claims
1. Аутологичная клеточная вакцина для лечения туберкулеза легких путем формирования иммунного ответа против микобактерии Mycobacterium tuberculosis, содержащая в одной ее части зрелые дендритные клетки, антигенактивированные в процессе созревания (АА mDC), и содержащей в другой ее части Т-лимфоциты, специфически активированные указанными зрелыми дендритными клетками, антигенактивированными в процессе созревания (АА mDC). 1. Autologous cell vaccine for the treatment of pulmonary tuberculosis by forming an immune response against mycobacterium Mycobacterium tuberculosis, containing in one part mature dendritic cells antigen-activated during maturation (AA mDC) and containing in another part T-lymphocytes specifically activated by these mature dendritic cells antigenactivated during maturation (AA mDC).
2. Способ получения аутологичной клеточной вакцины для лечения туберкулеза легких путем одновременного воздействия на специфическое и неспецифическое звено иммунного ответа против микобактерии Mycobacterium tuberculosis, содержащей в одной ее части зрелые дендритные клетки, антигенактивированные в процессе созревания (АА mDC), и содержащей в другой ее части Т-лимфоциты, специфически активированные указанными зрелыми дендритными клетками, антигенактивированными в процессе созревания (АА mDC), включающий следующие этапы: 2. A method of obtaining an autologous cell vaccine for the treatment of pulmonary tuberculosis by simultaneously acting on a specific and non-specific link in the immune response against Mycobacterium tuberculosis mycobacterium, which contains mature dendritic cells antigenactivated during maturation (AA mDC) in one part and containing in another part T-lymphocytes specifically activated by these mature dendritic cells antigen-activated during maturation (AA mDC), comprising the following steps:
а) выделение мононуклеаров (MNCs) из периферической крови больного туберкулезом легких; a) the allocation of mononuclear cells (MNCs) from the peripheral blood of a patient with pulmonary tuberculosis;
б) культивирование полученных на этапе а) мононуклеаров in vitro в базовой среде с высоким содержанием аминокислот и витаминов, обеспечивающей жизнедеятельность клеток, включая лимфоидные клетки, дополненной FCS, HEPES, Глутамином, Гентамицином, для получения популяций моноцитов и лимфоцитов; b) culturing the mononuclear cells obtained in step a) in vitro in a base medium with a high content of amino acids and vitamins, which provides cell viability, including lymphoid cells, supplemented with FCS, HEPES, Glutamine, Gentamicin, to obtain populations of monocytes and lymphocytes;
в) разделение мононуклеаров, полученных на этапе б), на прилипшую фракцию моноцитов и не прилипшую фракцию лимфоцитов; c) separation of the mononuclear cells obtained in step b) into an adherent fraction of monocytes and an adherent fraction of lymphocytes;
г) культивирование моноцитов прилипшей фракции, полученной на этапе в), in vitro в среде, по составу аналогичной среде, используемой на этапе б), с добавлением 2-Меркаптоэтанола, рекомбинантного аналога гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора (rhGM- CSF) и ростового фактора, с получением незрелых дендритных клеток (iDC), которые способны к активному захвату антигена путем фагоцитоза и макропиноцитоза; d) culturing the monocytes of the adherent fraction obtained in step c) in vitro in a medium similar in composition to that used in step b) with the addition of 2-Mercaptoethanol, a recombinant analog of granulocyte-macrophage colony stimulating factor (rhGM-CSF) and growth factor to produce immature dendritic cells (iDC) that are capable of actively capturing antigen by phagocytosis and macropinocytosis;
д) культивирование полученной на этапе г) фракции, содержащей
незрелые дендритные клетки, в среде, по составу аналогичной среде, используемой на этапе б), с добавлением 2-Меркаптоэтанола и туберкулина с получением антигенактивированных незрелых дендритных клеток (АА iDC); е) культивирование полученной на этапе д) фракции, содержащей антигенактивированные незрелые дендритные клетки, in vitro в среде, используемой на этапе д), с добавлением 2-Меркаптоэтанола, рекомбинантного человеческого Фактора некроза опухоли альфа (rhTNF-α), с получением зрелых дендритных клеток, антигенактивированных в процессе созревания (АА mDC); и) выдержку лимфоцитов не прилипшей фракции, полученной на этапе в), в свежей среде, аналогичной среде, используемой на этапе б), в течение времени, достаточного для поддержания жизнеспособности фракции лимфоцитов; d) culturing the fraction obtained in step d) containing immature dendritic cells, in an environment similar in composition to that used in step b), with the addition of 2-Mercaptoethanol and tuberculin to produce antigen-activated immature dendritic cells (AA iDC); f) culturing the fraction obtained in step e) containing antigenactivated immature dendritic cells in vitro in the medium used in step e) with the addition of 2-Mercaptoethanol, recombinant human tumor necrosis factor alpha (rhTNF-α), to obtain mature dendritic cells antigenactivated during maturation (AA mDC); i) exposure of the lymphocytes of the non-adherent fraction obtained in step c) in a fresh medium similar to that used in step b) for a time sufficient to maintain the viability of the lymphocyte fraction;
к) совместное культивирование фракции, полученной на этапе е), и части не прилипшей фракции, полученной на этапе и), in vitro в соотношении 1 : 10 в свежей среде, по составу аналогичной среде, используемой на этапе б), и дополненной рекомбинантным человеческим Интерлейкином-2 (Ронколейкином, rhIL-2) и рекомбинантным человеческим Интерлейкином-12 (rhIL-12) или дополненной рекомбинантным человеческим Интерлейкином-12 (rhIL-12) и рекомбинантным человеческим Интерлейкином-18 (rhIL-18), с получением Т-лимфоцитов, специфически активированных зрелыми дендритными клетками, антигенактивированными в процессе созревания (АА mDC); j) co-culturing the fraction obtained in step e) and part of the non-adherent fraction obtained in step i) in vitro in a ratio of 1: 10 in fresh medium, similar in composition to the medium used in step b), and supplemented with recombinant human Interleukin-2 (Roncoleukin, rhIL-2) and recombinant human Interleukin-12 (rhIL-12) or supplemented with recombinant human Interleukin-12 (rhIL-12) and recombinant human Interleukin-18 (rhIL-18), to produce T-lymphocytes specifically activated by mature dendritic cell and antigen-during maturation (AA mDC);
л) отбор из фракции, полученной на этапе к), прилипших зрелых дендритных клеток, антигенактивированных в процессе созревания (АА mDC), и их отмывка с получением одной части вакцины; k) selection from the fraction obtained in step k) of adherent mature dendritic cells antigen-activated during maturation (AA mDC) and their washing to obtain one part of the vaccine;
м) отбор из фракции клеток, полученных на этапе к) и на этапе л), не прилипших специфически активированных Т-лимфоцитов и их отмывка с получением другой части вакцины. l) selection from the fraction of cells obtained in step k) and in step k) that did not adhere specifically activated T-lymphocytes and their washing to obtain another part of the vaccine.
3. Способ по п.2, в котором выделение мононуклеаров из периферической крови больного проводят на градиенте фикол-урографина с плотностью 1,077 г/смЗ при соотношении крови и градиента 2: 1. 3. The method according to claim 2, in which the selection of mononuclear cells from the peripheral blood of the patient is carried out on a gradient of ficol-urographin with a density of 1.077 g / cm3 at a ratio of blood and gradient of 2: 1.
4. Способ по п.2, в котором культивирование на этапе б) проводят в течение 1,0 часа при температуре 37°С в атмосфере 5% С02. в базовой среде, дополненной на 100 мл
базовой среды: FCS -1%, HEPES -5 мМ, Глутамином - 2 мМ, Гентамицином -1000 мкг/мл. 4. The method according to claim 2, in which the cultivation in step b) is carried out for 1.0 hour at a temperature of 37 ° C in an atmosphere of 5% C0 2 . in basic medium supplemented with 100 ml base medium: FCS -1%, HEPES -5 mM, Glutamine - 2 mM, Gentamicin -1000 μg / ml.
5. Способ по п.2, в котором культивирование на этапе г) проводят в течение 24 часов в базовой среде, дополненной на 100 мл базовой среды: FCS -10%, HEPES -5 мМ, Глутамин - 2 мМ, 2-Меркаптоэтанол - 5х10'5М, Гентамицин - 1000 мкг/мл, и дополненной из расчета на 1 мл среды, содержащей 1,0 млн клеток, рекомбинантным человеческим гранулоцитарно-макрофагальным колониестимулирующим фактором (Нейпогеном, rhGM-CSF) - 50 нг/мл и рекомбинантным человеческим Интерлейкином-4 (rhIL-4) - 100 нг/мл. 5. The method according to claim 2, in which the cultivation in step g) is carried out for 24 hours in a basic medium supplemented with 100 ml of a basic medium: FCS -10%, HEPES -5 mm, Glutamine - 2 mm, 2-Mercaptoethanol - 5x10 '5 M, Gentamicin - 1000 μg / ml, and supplemented with 1 ml of medium containing 1.0 million cells, recombinant human granulocyte-macrophage colony stimulating factor (Neupogen, rhGM-CSF) - 50 ng / ml and recombinant human Interleukin-4 (rhIL-4) - 100 ng / ml.
6. Способ по п.2, в котором культивирование на этапе д) проводят в течение 12 - 24 часов в базовой среде, дополненной на 100 мл базовой среды: FCS - 10%, HEPES -5 мМ, Глутамин - 2 мМ, 2-Меркаптоэтанол - 5х10"5М, Гентамицин - 1000 мкг/мл, с добавлением туберкулина из расчета 500 ТЕ на 1 мл базовой среды. 6. The method according to claim 2, in which the cultivation in step d) is carried out for 12 to 24 hours in a base medium supplemented with 100 ml of a base medium: FCS - 10%, HEPES -5 mm, Glutamine - 2 mm, 2- Mercaptoethanol - 5x10 "5 M, Gentamicin - 1000 μg / ml, with the addition of tuberculin at the rate of 500 TE per 1 ml of base medium.
7. Способ по п.2, в котором культивирование на этапе е) проводят в течение 24 часов в базовой среде, дополненной на 100 мл базовой среды: FCS - 10%, HEPES -5мМ, Глутамин - 2мМ, 2-Меркаптоэтанол - 5х10"5М, Гентамицин - 1000 мкг/мл, с добавлением туберкулина из расчета 500 ТЕ на 1 мл базовой среды и рекомбинантного человеческого Фактора некроза опухоли альфа (rhTNF-α) из расчета 25 нг на 1 мл базовой среды. 7. The method according to claim 2, in which the cultivation in step e) is carried out for 24 hours in a basic medium supplemented with 100 ml of a basic medium: FCS - 10%, HEPES -5 mm, Glutamine - 2 mm, 2-Mercaptoethanol - 5x10 " 5 M, Gentamicin - 1000 μg / ml, with the addition of tuberculin at a rate of 500 TE per 1 ml of base medium and recombinant human tumor necrosis factor alpha (rhTNF-α) at a rate of 25 ng per 1 ml of base medium.
8. Способ по п.2, в котором на этапе и) проводят выдержку не прилипшей фракции в базовой среде, дополненной на 100 мл базовой среды: FCS - 10%, HEPES - 5мМ, Глутамин - 2мМ, Гентамицин - 1000 мкг/мл в течение 60 -72 часов. 8. The method according to claim 2, in which, at step i), the non-adherent fraction is held in the base medium supplemented with 100 ml of the base medium: FCS - 10%, HEPES - 5 mM, Glutamine - 2 mM, Gentamicin - 1000 μg / ml within 60 -72 hours.
9. Способ по п.2, в котором культивирование на этапе к) проводят в течение 48 часов в базовой среде, дополнительно содержащей на 100 мл базовой среды: FCS - 10%, HEPES - 5мМ, Глутамин - 2мМ, Гентамицин - 1000 мкг/мл, дополненной из расчета на 1 мл среды, содержащей 2,5 млн. клеток, рекомбинантным человеческим Интерлейкином-2 (Ронколейкином, rhIL-2) -100 ЕД/мл и рекомбинантным человеческим Интерлейкином-12 (rhIL-12) - 10 нг/мл или рекомбинантным человеческим Интерлейкином-12 (rhIL-12) - 10 нг/мл и рекомбинантным человеческим Интерлейкином-18 (rhIL-18) - 100 нг/мл. 9. The method according to claim 2, in which the cultivation in step k) is carried out for 48 hours in the base medium, additionally containing 100 ml of the base medium: FCS - 10%, HEPES - 5 mm, Glutamine - 2 mm, Gentamicin - 1000 μg / ml, supplemented per 1 ml of medium containing 2.5 million cells, with recombinant human Interleukin-2 (Roncoleukin, rhIL-2) -100 IU / ml and recombinant human Interleukin-12 (rhIL-12) - 10 ng / ml or recombinant human Interleukin-12 (rhIL-12) - 10 ng / ml and recombinant human Interleukin-18 (rhIL-18) - 100 ng / ml.
10. Способ по п.2, в котором в качестве базовой среды используют среду DMEM. 10. The method according to claim 2, in which DMEM is used as the base medium.
11. Способ по п.2, в котором отмывку фракций клеток на этапах л) и м) проводят дважды в физиологическом растворе по 10 минут при 1500 об ./мин.
11. The method according to claim 2, in which the washing of the cell fractions in steps l) and m) is carried out twice in physiological saline for 10 minutes at 1500 rpm./min.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PCT/RU2012/000498 WO2014007667A1 (en) | 2012-06-25 | 2012-06-25 | Autologous vaccine for treating pulmonary tuberculosis and method for producing same |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PCT/RU2012/000498 WO2014007667A1 (en) | 2012-06-25 | 2012-06-25 | Autologous vaccine for treating pulmonary tuberculosis and method for producing same |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| WO2014007667A1 true WO2014007667A1 (en) | 2014-01-09 |
Family
ID=49882304
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PCT/RU2012/000498 WO2014007667A1 (en) | 2012-06-25 | 2012-06-25 | Autologous vaccine for treating pulmonary tuberculosis and method for producing same |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| WO (1) | WO2014007667A1 (en) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2771843C2 (en) * | 2020-11-09 | 2022-05-12 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт фтизиопульмонологии" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБУ "СПб НИИФ" Минздрава России) | Autologous composition and method for treating pulmonary tuberculosis with drug resistance of the pathogen and absence of effect against the background of polychemotherapy |
Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2192263C2 (en) * | 2000-08-17 | 2002-11-10 | Российский научно-исследовательский нейрохирургический институт им. проф. А.Л.Поленова | Method for treating malignant brain tumors |
| US20030060442A1 (en) * | 1998-09-15 | 2003-03-27 | University Of Pittsburgh Of The Commonwealth System Of Higher Education | In situ injection of antigen-presenting cells with genetically enhanced cytokine expression |
| RU2372936C1 (en) * | 2008-05-19 | 2009-11-20 | Закрытое акционерное общество "Томские клеточные технологии" (ЗАО "Томские клеточные технологии") | Method for preparing autologous tuberculosis vaccine |
| RU2378373C2 (en) * | 2008-02-04 | 2010-01-10 | Государственное учреждение Научно-исследовательский институт клинической иммунологии СО РАМН | Method for generation of antigen-specific antituberculous cells |
| RU2392946C2 (en) * | 2008-07-30 | 2010-06-27 | Закрытое акционерное общество "Томские клеточные технологии" (ЗАО "Клеточные технологии") | Autologous vaccine for oncotherapy and method for preparing thereof |
-
2012
- 2012-06-25 WO PCT/RU2012/000498 patent/WO2014007667A1/en active Application Filing
Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20030060442A1 (en) * | 1998-09-15 | 2003-03-27 | University Of Pittsburgh Of The Commonwealth System Of Higher Education | In situ injection of antigen-presenting cells with genetically enhanced cytokine expression |
| RU2192263C2 (en) * | 2000-08-17 | 2002-11-10 | Российский научно-исследовательский нейрохирургический институт им. проф. А.Л.Поленова | Method for treating malignant brain tumors |
| RU2378373C2 (en) * | 2008-02-04 | 2010-01-10 | Государственное учреждение Научно-исследовательский институт клинической иммунологии СО РАМН | Method for generation of antigen-specific antituberculous cells |
| RU2372936C1 (en) * | 2008-05-19 | 2009-11-20 | Закрытое акционерное общество "Томские клеточные технологии" (ЗАО "Томские клеточные технологии") | Method for preparing autologous tuberculosis vaccine |
| RU2392946C2 (en) * | 2008-07-30 | 2010-06-27 | Закрытое акционерное общество "Томские клеточные технологии" (ЗАО "Клеточные технологии") | Autologous vaccine for oncotherapy and method for preparing thereof |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2771843C2 (en) * | 2020-11-09 | 2022-05-12 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт фтизиопульмонологии" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБУ "СПб НИИФ" Минздрава России) | Autologous composition and method for treating pulmonary tuberculosis with drug resistance of the pathogen and absence of effect against the background of polychemotherapy |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP7054418B2 (en) | Compositions and Methods for Producing T Cells | |
| CN1636229B (en) | Compositions and methods for priming monocytic dendritic cells and T cells for TH-1 response | |
| US8298587B2 (en) | Method for stimulating a therapeutic immune effect in a patient | |
| US20020155108A1 (en) | Method for ex vivo loading of antigen presenting cells with antigen, and a vaccine comprising the loaded cells | |
| US20030134415A1 (en) | Th1 cell adoptive immunotherapy | |
| US20150166955A1 (en) | Method for loading of dendritic cells with class i antigens | |
| JP5856025B2 (en) | Methods for obtaining monocytes or NK cells | |
| US20030134341A1 (en) | Th1 cell adoptive immunotherapy | |
| AU2011291477B2 (en) | Cells expressing Th1 characteristics and cytolytic properties | |
| WO2004027052A1 (en) | Th1 cell adoptive immunotherapy | |
| RU2378373C2 (en) | Method for generation of antigen-specific antituberculous cells | |
| RU2392946C2 (en) | Autologous vaccine for oncotherapy and method for preparing thereof | |
| RU2521506C1 (en) | Method of generating antigen-specific cytotoxic cells with antitumour activity in breast cancer | |
| EP1959007A1 (en) | Method for providing mature dendritic cells | |
| WO2014007669A1 (en) | Autologous cell vaccine for treating oncological diseases and method for producing same | |
| US20240122975A1 (en) | In vitro methods and compositions for enhancing the activation of dendritic cells and t cells, and for inducing a th-1 immune response | |
| WO2014007667A1 (en) | Autologous vaccine for treating pulmonary tuberculosis and method for producing same | |
| US10443040B2 (en) | Method for preparing antigen-specific cytotoxic T-cells by using activated B-cells and use thereof | |
| RU2372936C1 (en) | Method for preparing autologous tuberculosis vaccine | |
| CN112779216B (en) | Method for amplifying and activating natural killer cells in vitro and pharmaceutical composition thereof | |
| AU782196B2 (en) | Activation of antigen-specific T cells by virus/antigen-treated dendritic cells | |
| US10030227B2 (en) | Canine autologous immunotherapy using dendritic cell induced cancer killing immunocytes | |
| CN116785416A (en) | Preparation method of dendritic cell exosome liver cancer vaccine | |
| RU2012116602A (en) | METHOD FOR PROLIFERATION OF ANTIGEN SPECIFIC T-CELLS | |
| van den Ancker et al. | R848 enhances uptake of leukemic cells by DC but |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| 121 | Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application |
Ref document number: 12880613 Country of ref document: EP Kind code of ref document: A1 |
|
| NENP | Non-entry into the national phase |
Ref country code: DE |
|
| 32PN | Ep: public notification in the ep bulletin as address of the adressee cannot be established |
Free format text: NOTING OF LOSS OF RIGHTS PURSUANT TO RULE 112(1) EPC (EPO FORM 1205A DATED 01/06/2015) |
|
| 122 | Ep: pct application non-entry in european phase |
Ref document number: 12880613 Country of ref document: EP Kind code of ref document: A1 |