RU2192263C2

RU2192263C2 - Method for treating malignant brain tumors

Info

Publication number: RU2192263C2
Application number: RU2000122041A
Authority: RU
Inventors: Г.С. Тиглиев; В.Е. Олюшин; О.В. Острейко; М.В. Филатов; Е.И. Иванов
Original assignee: Российский научно-исследовательский нейрохирургический институт им. проф. А.Л.Поленова
Priority date: 2000-08-17
Filing date: 2000-08-17
Publication date: 2002-11-10

Abstract

FIELD: medicine. SUBSTANCE: the method includes isolation of monocytes out of patient's blood, their cultivation with growth factors, addition of antigenic material cells out of patient's tumor to monocyte-obtained dendritic cells and inside, and intracutaneous injection of dendritic cells. Additionally, one should carry out immunomodulation by using patient's activated lymphocytes. The method enables to activate specific antitumor immunity. EFFECT: higher efficiency of therapy. 1 cl, 1 ex

Description

Изобретение относится к медицине, а именно к нейрохирургии и иммунологии, и может быть использовано при лечении злокачественных опухолей головного мозга. The invention relates to medicine, namely to neurosurgery and immunology, and can be used in the treatment of malignant brain tumors.

Известен способ лечения злокачественных опухолей головного мозга включающий химиолучевую терапию (патент РФ 2125871, А 61 К 31/17, A 61 N 5/10, 1999), в котором в качестве химиотерапевтического препарата используют белустин в ежедневной дозе 40 мг до суммарной дозы 200-280 мг в сочетании с лучевой терапией. Для повышения эффективности лечения дополнительно вводят альфа-2-интерферон. Недостатки способа - развитие панцитопении и иммуносупрессии. A known method of treating malignant brain tumors comprising chemoradiotherapy (RF patent 2125871, A 61 K 31/17, A 61 N 5/10, 1999), in which Belustin is used as a chemotherapeutic drug in a daily dose of 40 mg to a total dose of 200- 280 mg in combination with radiation therapy. To increase the effectiveness of treatment, alpha-2-interferon is additionally administered. The disadvantages of the method is the development of pancytopenia and immunosuppression.

Известен способ лечения злокачественных опухолей головного мозга с использованием цитокиновой терапии (патент РФ 2133624, А 61 К 38/20, А 61 К 38/21, А 61 В 17/00, 1999), принятый нами за прототип. При этом осуществляют внутривенное введение дрожжевого рекомбинантного интерлейкина-2 в дозе до 20 ME. Затем проводят курс внутривенного введения лимфокин-активированных киллерных клеток вместе с дрожжевым рекомбинантным интерлейкином-2. Недостатки прототипа - неспецифичность способа, имеет осложнения, связанные с введением интерлейкина-2 (например - отеки), при этом интерлейкин-2 быстро разрушается в организме. A known method of treating malignant brain tumors using cytokine therapy (RF patent 2133624, A 61 K 38/20, A 61 K 38/21, A 61 B 17/00, 1999), adopted by us for the prototype. In this case, intravenous administration of yeast recombinant interleukin-2 at a dose of up to 20 ME is carried out. Then a course of intravenous administration of lymphokine-activated killer cells is carried out together with the yeast recombinant interleukin-2. The disadvantages of the prototype is the non-specificity of the method, it has complications associated with the introduction of interleukin-2 (for example, edema), while interleukin-2 is rapidly destroyed in the body.

Изобретение направлено на создание способа лечения злокачественных опухолей головного мозга, позволяющего сократить побочные эффекты и осложнения, увеличить при этом продолжительность жизни пациентов, сохранить качество жизни. Это достигается за счет предложения Т-лимфоцитам опухолевого антигена "профессиональными" антиген-представляющими клетками организма - дендритными клетками, которые содержат опухолевый антиген, введенный им in vitro, обеспечивая, таким образом, специфичность способа. Дополнительно вводят активированные аутологичные лимфоциты, обеспечивающие продукцию интерлейкинов (в том числе и интерлейкин-2), что позволяет катализировать иммунологический противоопухолевый ответ. The invention is aimed at creating a method for the treatment of malignant brain tumors, which allows to reduce side effects and complications, at the same time increase the life expectancy of patients, maintain the quality of life. This is achieved by offering the tumor antigen T-cells the "professional" antigen-presenting cells of the body - dendritic cells that contain the tumor antigen introduced by him in vitro, thus ensuring the specificity of the method. In addition, activated autologous lymphocytes are introduced to ensure the production of interleukins (including interleukin-2), which allows you to catalyze an immunological antitumor response.

Сущность способа заключается в следующем: фрагмент опухоли, взятый во время операции, диссоциируют на экстракт белков, используемый в дальнейшем как антиген. Из периферической крови, взятой у пациента, выделяют моноциты и культивируют с ростовыми факторами. Вначале к моноцитам, а затем к полученным из них дендритным клеткам добавляют антигенный материал. Далее дендритные клетки вводят внутрикожно больному. Параллельно проводят иммуномодуляцию с использованием активированных лимфоцитов, которые получают из мононуклеарных лейкоцитов больного, активированных с помощью фитогемагглютинина. Активированные лимфоциты также вводят внутрикожно. The essence of the method is as follows: a tumor fragment taken during surgery is dissociated into a protein extract, which is used hereinafter as an antigen. Monocytes are isolated from peripheral blood taken from a patient and cultured with growth factors. First, antigenic material is added to monocytes, and then to dendritic cells obtained from them. Next, dendritic cells are administered intradermally to the patient. In parallel, immunomodulation is carried out using activated lymphocytes, which are obtained from the patient's mononuclear white blood cells activated with phytohemagglutinin. Activated lymphocytes are also administered intradermally.

Таким образом, адекватно показанный иммунокомпетентным клеткам опухолевый антиген в сочетании с неспецифическим иммуностимулирующим эффектом (за счет активированных лимфоцитов) позволяет активизировать специфический противоопухолевый иммунитет и дает возможность использования данного способа в качестве адъювантного лечения в составе комплексного противоопухолевого лечения. Thus, a tumor antigen adequately shown to immunocompetent cells in combination with a non-specific immunostimulating effect (due to activated lymphocytes) allows you to activate specific antitumor immunity and makes it possible to use this method as an adjuvant treatment as part of a comprehensive antitumor treatment.

Заявляемый способ отличается от прототипа тем, что из периферической крови больного выделяют моноциты и культивируют с ростовыми факторами, далее в среду к полученным из моноцитов дендритным клеткам, а также путем электропорации внутрь клеток добавляют антигенный материал, приготовленный из опухоли больного, затем дендритные клетки вводят внутрикожно, дополнительно проводят иммуномодуляцию, используя активированные с помощью фитогемагглютинина лимфоциты больного. The inventive method differs from the prototype in that monocytes are isolated from the patient’s peripheral blood and cultured with growth factors, then dendritic cells obtained from monocytes are added to the medium on the medium, as well as antigenic material prepared from the patient’s tumor by electroporation, then dendritic cells are injected intradermally additionally carry out immunomodulation using the patient’s lymphocytes activated with phytohemagglutinin.

Способ осуществляется следующим образом. Во время хирургической операции забирают фрагмент опухоли не менее 3 см³, содержащий живые опухолевые клетки и по возможности не содержащий нормальные и некротизированные ткани. Фрагмент опухоли помещают в стерильный раствор и передают для изготовления антигенного материала в течение 1 суток. Для приготовления антигена фрагмент опухоли облучают в дозе 200 Гр, диссоциируют на клетки. Полученные опухолевые клетки отмывают и разрушают путем повышения РН среды, в которой находятся клетки до РН 11,5, с последующим понижением РН до 6,5. Полученный из них экстракт белков используют как антиген для предоставления дендритным клеткам. Перед каждым раундом лечения производят забор 40-60 мл периферической крови больного в шприц, содержащий раствор гепарина. Конечная концентрация гепарина 30 единиц на 1 мл. Кровь поступает на обработку не позднее 6 часов после забора. Из взятой крови выделяют моноциты, которые культивируются в течение 7 дней с ростовыми факторами (гранулоцит-макрофаг колониестимулирующий фактор и интерлейкин-4 в количестве 1000 ед/мл) с постоянным контролем и сменой среды. На 6 день к дендритным клеткам добавляют приготовленный из опухоли данного больного антигенный материал и в этот же день антигенный материал вводят внутрь полученных дендритных клеток с помощью электрического разряда (электропорация).The method is as follows. During a surgical operation, a tumor fragment of at least 3 cm ³ containing live tumor cells and, if possible, containing normal and necrotic tissue is taken. The tumor fragment is placed in a sterile solution and transferred to produce antigenic material for 1 day. To prepare the antigen, a tumor fragment is irradiated at a dose of 200 Gy, dissociated into cells. The resulting tumor cells are washed and destroyed by increasing the pH of the medium in which the cells are located to pH 11.5, followed by lowering the pH to 6.5. The protein extract obtained from them is used as an antigen to provide dendritic cells. Before each round of treatment, 40-60 ml of the patient’s peripheral blood are sampled into a syringe containing a heparin solution. The final concentration of heparin is 30 units per 1 ml. Blood arrives for processing no later than 6 hours after collection. Monocytes are isolated from the taken blood, which are cultured for 7 days with growth factors (granulocyte macrophage colony stimulating factor and interleukin-4 in the amount of 1000 units / ml) with constant monitoring and change of medium. On day 6, antigenic material prepared from a tumor of a given patient is added to dendritic cells, and on the same day antigenic material is introduced into the obtained dendritic cells by electric discharge (electroporation).

Забор периферической крови для приготовления активированных лимфоцитов производят, как и для дендритных клеток, но в количестве 15-20 мл. Для приготовления активированных лимфоцитов из крови выделяют мононуклеарные лейкоциты, которые активируют к пролиферации с помощью фитогемагглютинина и на 4 сутки вводят внутрикожно. Цель процедур - активация возможно большего числа Т-лимфоцитов при преимущественной стимуляции Th-1 клеточного пути иммунного ответа. Peripheral blood sampling for the preparation of activated lymphocytes is performed, as for dendritic cells, but in an amount of 15-20 ml. To prepare activated lymphocytes, mononuclear leukocytes are isolated from the blood, which are activated to proliferate with phytohemagglutinin and administered intradermally for 4 days. The goal of the procedures is to activate as many T-lymphocytes as possible with primary stimulation of the Th-1 cell pathway of the immune response.

На 8 сутки больному вводят внутрикожно дендритные клетки. Количество вводимых клеток варьирует от 2•10⁵-10⁷ Курс лечения включает 2 лечебных цикла в первый месяц, цикл включает в себя инъекцию активированных лимфоцитов на 4 сутки и дендритных клеток на 8 сутки, и в последующем один лечебный цикл каждые 2 месяца.On the 8th day, the patient is injected intradermally with dendritic cells. The number of introduced cells varies from 2 • 10 ⁵ -10 ⁷ The course of treatment includes 2 treatment cycles in the first month, the cycle includes the injection of activated lymphocytes on the 4th day and dendritic cells on the 8th day, and in the subsequent one treatment cycle every 2 months.

Заявленный способ разработан в РНХИ им. профессора А.Л. Поленова и ПИЯФ им. Б.П. Константинова и прошел клинические испытания при лечении 3 больных со злокачественными опухолями головного мозга. The claimed method is developed in the Russian National Research Institute of Chemical Technology. professors A.L. Polenov and PNPI B.P. Konstantinova and passed clinical trials in the treatment of 3 patients with malignant brain tumors.

Приводим пример - выписку из истории болезни 76/2000. Больной И., 54 лет, диагноз: Глиобластома правых лобной и теменной долей мозга. Продолженный рост опухоли. Операции в 1996, 1998, 1999 гг., 2 курса лучевого лечения, 3 курса полихимиотерапии. We give an example - an extract from the medical history 76/2000. Patient I., 54 years old, diagnosis: Glioblastoma of the right frontal and parietal lobes. Continued tumor growth. Operations in 1996, 1998, 1999, 2 courses of radiation treatment, 3 courses of chemotherapy.

19.01.2000 сделана повторная (4) операция костно-пластическая трепанация черепа в правой лобно-темено-височной области, субтотальное удаление опухоли. Согласно заявляемому способу во время операции у больного был взят фрагмент опухоли объемом 10 см³, а после операции проводились заборы 60 и 20 мл периферической крови. Используя опухоль и мононуклеарные клетки периферической крови больного, а также используя активированные лимфоциты больного, проводилось лечение в виде 2 внутрикожных инъекций (одна инъекция активированных лимфоцитов, через 4 суток инъекция дендритных клеток с опухолевым антигеном) каждые 2 недели в течение 1 месяца, а затем раз в 2 месяца.01/19/2000, repeated (4) surgery was performed on osteoplastic trepanation of the skull in the right frontotemporal temporal region, subtotal removal of the tumor. According to the claimed method, a tumor fragment of 10 cm ³ was taken from the patient during the operation, and after the operation, 60 and 20 ml of peripheral blood were taken. Using a tumor and mononuclear cells of the patient’s peripheral blood, as well as using activated patient’s lymphocytes, 2 intradermal injections (one injection of activated lymphocytes, 4 days later an injection of dendritic cells with tumor antigen) were administered every 2 weeks for 1 month, and then once at 2 months.

В период проведения лечения у больного несколько регрессировал левосторонний гемипарез по сравнению с дооперационным уровнем, показатель социальной адаптации дооперации соответствовал 50 баллам по шкале Карновского, в процессе лечения составил 70 баллов и сохраняется на протяжении всего периода наблюдения после операции. По данным КТ головного мозга спустя 5 месяцев после операции данных за продолженный рост опухоли нет. Сохраняется хорошее самочувствие больного, в основном себя обслуживает самостоятельно, выполняет мелкую домашнюю работу, с интересом читает книги, смотрит телепередачи, жалоб активно не предъявляет. During treatment, the patient regressed slightly left-side hemiparesis compared with the preoperative level, the indicator of social adaptation of preoperation corresponded to 50 points on the Karnowski scale, during treatment amounted to 70 points and remains throughout the observation period after surgery. According to CT scans of the brain 5 months after surgery, there is no data for continued tumor growth. The patient’s well-being is maintained, basically he serves himself independently, performs small homework, reads books with interest, watches TV shows, and does not actively complain.

Использование данного способа позволило
- избежать осложнений, связанных с введением IL-2
- улучшить и стабилизировать состояние больного по шкале социальной адаптации Карновского
- сохранить хорошее самочувствие больного
достичь пятимесячного периода свободного от прогрессии опухоли.Using this method allowed
- to avoid complications associated with the introduction of IL-2
- improve and stabilize the patient’s condition according to the Karnovsky scale of social adaptation
- keep the patient well-being
reach a five-month period free of tumor progression.

Claims

A method of treating malignant brain tumors by immunotherapy, characterized in that monocytes are isolated from the patient’s peripheral blood and cultured with growth factors, then dendritic cells obtained from monocytes are added to the medium on the medium, as well as by electrocorporation inside the cells, antigenic material prepared from the patient’s tumor is added, then dendritic cells are injected intradermally, immunomodulation is additionally carried out using the patient’s lymphocytes activated with phytohemagglutinin.