WO2014006952A1 - 慢性閉塞性肺疾患の増悪指標の検出方法 - Google Patents

慢性閉塞性肺疾患の増悪指標の検出方法 Download PDF

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exacerbation
protein
copd
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expression level
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高志 安形
谷口　直之
健男 石井
厚瑞 木田
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RIKEN
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    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
    • G01N33/6896—Neurological disorders, e.g. Alzheimer's disease
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/54—Interleukins [IL]

Definitions

  • the present invention relates to a method for detecting an exacerbation index that can be used in diagnosis of exacerbation of chronic obstructive pulmonary disease.
  • COPD chronic obstructive pulmonary disease
  • Non-Patent Documents 1 and 2 The search for plasma / serum markers and the like, which are indicators of COPD exacerbation, is ongoing (Non-Patent Documents 1 and 2), but no definitive one has been found yet.
  • C-reactive protein (CRP) is also used as an auxiliary marker for COPD exacerbation (Non-Patent Documents 2 and 3), but this is an acute phase protein whose concentration increases rapidly with inflammation, It is a marker of infection / inflammation that triggers exacerbation rather than a marker, and has low disease specificity.
  • a technique for detecting whether or not a COPD patient is aggravated by detecting rhinovirus infection using PCR has also been reported (Patent Document 1), but this method indirectly examines the aggravation from the presence or absence of infection.
  • Patent Document 2 A test method for exacerbation susceptibility of COPD patients using prolactin is known (Patent Document 2), but this does not provide an index of exacerbation itself.
  • An object of the present invention is to provide a method for detecting an exacerbation index of a COPD patient.
  • the present invention includes the following.
  • a COPD patient comprising measuring an expression level of IL-27 protein or a gene encoding the same in a biological sample derived from a COPD patient, and detecting an increase compared to the non-exacerbated expression level of the patient To detect the exacerbation index.
  • the biological sample is a blood-derived sample.
  • a kit for detecting a COPD exacerbation index comprising an antibody that specifically binds to IL-27 protein.
  • Siglec-14 is a membrane protein belonging to the immunoglobulin superfamily expressed in innate immune cells (granulocytes, monocytes, etc.) (Angata (T., Et al., Discovery of Siglec-14, a) novel sialic acid receptor undergoing concerted evolution with Siglec-5 in primates., (2006) FASEB J., 20: 1964-1973; (Patent No. 4423394). It is clear that siglec 14 is involved in immune cell activation, and that there are polymorphisms in human siglec 14 gene, and there are humans and non-humans that express siglec 14 protein due to the genetic polymorphism.
  • Siglec 14 recognizes non-typeable Haemophilus influenzae (NTHi) and activates immune cells
  • NTHi stimulation we express Siglec 14 and are activated by NTHi stimulation.
  • the present invention provides a method for detecting an exacerbation index (exacerbation test) for COPD patients by measuring changes in the expression level of IL-27 as an exacerbation index.
  • the expression level of IL-27 protein or a gene encoding the same in a biological sample derived from a COPD patient may be measured.
  • a patient (COPD patient) diagnosed as a chronic obstructive pulmonary disease (COPD) by a doctor is a suitable test subject in the method of the present invention.
  • Patients with current or past smoking history, cough, sputum, and dyspnea are likely to have COPD.
  • a pulmonary function test is performed using the pulmonary function test system CHESTAC (Chest Co., Ltd.), etc., and the 1-second rate (FEV1 / FVC) after bronchodilator administration is 0.7 (70%)
  • the following patients can be diagnosed as patients with chronic obstructive pulmonary disease (COPD).
  • FEV1 is a one-second amount, that is, an exhaled amount that can be exhaled in one second when exhaling as fast as possible.
  • FVC is the vital capacity when forced breathing, that is, when breathing in and breathing out as fast as possible.
  • the COPD patient is a mammal, preferably a human.
  • the biological sample used for the measurement in the method of the present invention is collected from a COPD patient who performs an exacerbation test.
  • the biological sample is not limited to, for example, blood (eg, peripheral blood), serum, blood-derived sample such as plasma, oral or nasopharyngeal mucosa, nasal or bronchial aspirate, saliva, breath sample, Sputum etc. are preferred, and blood-derived samples are more preferred.
  • the method of the present invention includes, but is not limited to, a biological sample derived from a COPD patient who is in a stable period but whose follow-up is desired, a COPD patient suspected of exacerbation, or a COPD patient diagnosed as exacerbated from symptoms. It is also preferable to carry out as an inspection object.
  • the method of the present invention can be suitably performed, for example, using a biological sample derived from a COPD patient who has passed one week or more from the start of exacerbation as a test target. When testing biological samples derived from COPD patients one week after the start of exacerbation, it is more likely that the expression level of IL-27 has increased during exacerbation, so a more reliable index can be obtained. .
  • IL-27 is useful as a marker that reflects the presence of exacerbations. “Start of exacerbation” is usually determined as the first date on which exacerbation symptoms appear based on the judgment of a doctor.
  • exacerbation of chronic obstructive pulmonary disease means that the symptoms of COPD, such as dyspnea, cough, and sputum, suddenly worsen beyond normal physiological fluctuations, and the treatment during non-exacerbation (stable period) The condition that requires change (Japanese Respiratory Society Guidelines, 2009).
  • COPD exacerbations are defined by Anthonisen et al. (Anthonisen NR et al., Ann Intern Med.
  • the “non-exacerbation” of a COPD patient refers to a time when COPD symptoms such as dyspnea, cough, and sputum in the COPD patient are within the range of daily physiological fluctuations.
  • a biological sample at the time of non-exacerbation in advance and store it for future measurement, and measure the biological sample collected at the time of examination and the biological sample at the time of non-exacerbation at the same time.
  • the biological sample at the time of non-exacerbation may be measured in advance, and the measured value may be compared with the measured value of the biological sample at the time of examination.
  • the expression level of IL-27 protein in a biological sample at the time of examination of a COPD patient and in a non-exacerbated biological sample can be measured.
  • IL-27 protein is a heterodimeric protein in which IL-27 ⁇ subunit (also known as EBI3) and IL-27 ⁇ subunit (also known as p28 or IL-30) are non-covalently bound.
  • the sequence of the gene and amino acid sequence of human IL-27 ⁇ subunit is known (GenBank accession number NM — 005755.2) and is shown in SEQ ID NO: 1 (cDNA sequence corresponding to mRNA) and SEQ ID NO: 2, respectively.
  • the gene and amino acid sequence of the human IL-27 ⁇ subunit is known (GenBank accession number NM — 145659.3) and is shown in SEQ ID NO: 3 (cDNA sequence corresponding to mRNA) and SEQ ID NO: 4, respectively.
  • the IL-27 ⁇ subunit which is a cytokine constituting the human IL-27 protein to be measured by the method of the present invention, may be composed of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, but is shown in SEQ ID NO: 2.
  • It may be a protein comprising a sequence obtained by removing a signal peptide (1-20 residues at the N-terminus of SEQ ID NO: 2) from the amino acid sequence.
  • the IL-27 ⁇ subunit which is a cytokine constituting the human IL-27 protein to be measured in the method of the present invention, may be composed of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4 or shown in SEQ ID NO: 4.
  • a protein having a cytokine activity such as shown in SEQ ID NO: 4, comprising a sequence comprising deletion, substitution or addition of 1 to 100 (eg, 1 to 50 or 1 to 10) amino acid residues in the amino acid sequence
  • It may be a protein comprising a sequence obtained by removing a signal peptide (N-terminal residues 1 to 28 of SEQ ID NO: 4) from the amino acid sequence obtained.
  • the expression level of IL-27 protein can be measured by quantifying IL-27 protein in a biological sample using a known protein measurement method based on ELISA, flow cytometry, or the like.
  • IL-27 protein in a biological sample is measured based on ELISA using an antibody that specifically binds to IL-27 protein, IL-27 ⁇ subunit, or IL-27 ⁇ subunit. can do.
  • the antibody that specifically binds to IL-27 protein, IL-27 ⁇ subunit, or IL-27 ⁇ subunit used for the measurement in the present invention may be a monoclonal antibody or a polyclonal antibody.
  • various commercially available anti-IL-27 antibodies and human or mouse IL-27 ELISA assay kits can also be used.
  • Kits can be purchased.
  • An antibody that specifically binds to IL-27 protein, IL-27 ⁇ subunit, or IL-27 ⁇ subunit uses IL-27 protein, IL-27 ⁇ subunit, IL-27 ⁇ subunit, or a fragment thereof as an antigen. It can also be prepared by known immunological techniques or genetic engineering techniques.
  • polyclonal antibodies against IL-27 protein, IL-27 ⁇ subunit, or IL-27 ⁇ subunit immunize animals such as mice, rats, rabbits, goats, sheep, donkeys using them as antigens, It can be obtained by collecting serum after a certain period of time and purifying it with a column or the like on which protein A, protein G, antigen protein, antigen peptide, etc. are immobilized.
  • a monoclonal antibody against IL-27 protein, IL-27 ⁇ subunit, or IL-27 ⁇ subunit is immunized in the same manner as the above polyclonal antibody, and after a certain period of time, for example, spleen cells are collected and Cell fusion with myeloma cells, screening of the obtained hybridoma, selecting a hybridoma producing an antibody exhibiting specific binding to the antigen protein used, and preparing from the culture or culture supernatant be able to.
  • antigen-binding fragments (Fab, F (ab ′) 2, etc.) of these antibodies can be used for measurement in the same manner as for all antibodies.
  • the quantification of IL-27 protein in a biological sample can also be performed by a multiplex bead array method (Procarta Cytokine Assay Kit, Affymetrix) using a cytokine assay kit.
  • the measured value of IL-27 protein in the biological sample thus obtained can be used as the expression level of IL-27 protein.
  • the expression level of IL-27 protein may be expressed as a measured value such as a concentration, or may be expressed as a relative value.
  • the expression level of IL-27 protein in a biological sample at the time of examination of a COPD patient obtained as described above was compared with the expression level of IL-27 protein measured in the same manner for a biological sample at the time of non-exacerbation of the same patient. Compare.
  • the expression level of a gene encoding IL-27 protein in a biological sample at the time of exacerbation test for COPD patients and a biological sample at the time of non-exacerbation may be measured.
  • gene encoding IL-27 protein means a gene encoding IL-27 ⁇ subunit or IL-27 ⁇ subunit constituting IL-27 protein.
  • the gene encoding the IL-27 ⁇ subunit to be measured may consist of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1, or 1 to 10 (for example, 1 to 1) in the base sequence shown in SEQ ID NO: 1.
  • the gene encoding the IL-27 ⁇ subunit may be a nucleic acid having the base sequence shown in SEQ ID NO: 3, or 1 to 10 (eg, 1 to 5) in the base sequence shown in SEQ ID NO: 3. Or a nucleic acid encoding a protein having cytokine activity.
  • the gene encoding the IL-27 ⁇ subunit may also be a nucleic acid that hybridizes with the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 3 under stringent conditions and encodes a protein having cytokine activity.
  • a protein comprising a nucleotide sequence having the identity of 70% or more, preferably 80% or more, more preferably 90% or more, particularly preferably 95% or more with respect to the base sequence shown in 3, and having cytokine activity It may be a nucleic acid.
  • stringent conditions refers to conditions under which a so-called specific hybrid is formed.
  • highly homologous nucleic acids that is, DNA having 90% or more, preferably 95% or more homology. Examples include conditions in which nucleic acids hybridize with each other and nucleic acids with lower homology do not hybridize with each other.
  • the sodium salt concentration is 15 to 750 mM, preferably 50 to 750 mM, more preferably 300 to 750 mM
  • the temperature is 25 to 70 ° C., preferably 50 to 70 ° C., more preferably 55 to 65 ° C.
  • the washing conditions of the filter after hybridization are usually such that the sodium salt concentration is 15 to 600 mM, preferably 50 to 600 mM, more preferably 300 to 600 mM, and the temperature is 50 to 70 ° C., preferably It is 55 to 70 ° C, more preferably 60 to 65 ° C.
  • the “nucleic acid” may be DNA or RNA, and may contain a modified base in part.
  • Measurement of the expression level of a gene encoding IL-27 protein can be performed by measuring the amount of mRNA expressed from the gene of a nucleic acid sample extracted from a biological sample, preferably total RNA.
  • Total RNA can be extracted by a conventional method using a commercially available RNA extraction kit or the like.
  • Measurement of the amount of mRNA derived from a gene encoding IL-27 ⁇ subunit or IL-27 ⁇ subunit can specifically amplify mRNA transcribed from the gene encoding IL-27 ⁇ subunit or IL-27 ⁇ subunit It can be performed by quantitative PCR using PCR primer pairs.
  • such mRNA amount can be measured based on Northern blotting using a probe specific for a gene encoding IL-27 ⁇ subunit or IL-27 ⁇ subunit.
  • a person skilled in the art appropriately designs an appropriate primer or probe based on the nucleotide sequence of a gene encoding IL-27 ⁇ subunit or IL-27 ⁇ subunit, for example, the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 or 3. be able to.
  • the amount of mRNA expressed from the gene encoding IL-27 ⁇ subunit or IL-27 ⁇ subunit in the biological sample measured as described above is used as the expression level of the gene encoding IL-27 protein. Can do.
  • the expression level may be expressed as a measured value such as a concentration, or may be expressed as a relative value.
  • the expression level of the gene encoding IL-27 protein in the biological sample at the time of exacerbation test of COPD patient is compared with the expression level of the gene encoding IL-27 protein in the biological sample at the time of non-exacerbation of the same patient. .
  • the expression level of IL-27 protein or a gene encoding IL-27 protein in a biological sample at the time of exacerbation test of a COPD patient is expressed as the corresponding expression level in the biological sample at the time of non-exacerbation of the same patient. It is determined whether the expression level in the biological sample at the time of the exacerbation test is higher than the expression level in the biological sample at the time of the non-exacerbation. As a result, if the expression level in the biological sample at the time of the test is higher than the expression level in the non-exacerbated biological sample, it is highly likely that the COPD patient is exacerbated in COPD.
  • COPD exacerbation when the expression level in the biological sample at the time of the test is increased by 5% or more, preferably 10% or more, more preferably 20% or more compared to the expression level in the biological sample at the time of non-exacerbation, COPD exacerbation It can be said that the possibility of occurrence is particularly high.
  • the present invention provides a method for detecting an exacerbation index of such a COPD patient.
  • an objective index indicating aggravation can be detected in a patient who cannot be determined to be COPD based on symptoms, thereby supporting the diagnosis of COPD.
  • the exacerbation index according to the present invention can be obtained as an index that can be used to determine the effectiveness of the exacerbation suppression / amelioration treatment for COPD patients being treated.
  • an increase in IL-27 can be a more reliable indicator of exacerbation, particularly when examining COPD patients from one week after the exacerbation start date. Therefore, the method of the present invention is particularly advantageous when monitoring the progress of COPD exacerbation over a long period of time (preferably for a week or more) for purposes such as determining the effectiveness of treatment.
  • the present invention also provides a COPD exacerbation index detection kit comprising an antibody that specifically binds to IL-27 protein.
  • the antibody that specifically binds to IL-27 protein may be a monoclonal antibody or a polyclonal antibody, and is the same as that described above for measuring IL-27 protein.
  • the kit includes other reagents, for example, ELISA assay reagents such as secondary antibodies for antibody detection, buffers, solid phases (for example, beads), COPD It may further include an instruction manual for detecting an exacerbation index.
  • Example 1 Selection of serum marker candidates for exacerbation (1) Preparation of NTHi dead bacteria, stimulation of THP-1 cells and preparation of RNA Non-typeable Haemophilus influenzae (NTHi) 2019 strain And cultured in a minimal medium supplemented with 0.5 mM N-acetylneuraminic acid as described in the literature (Greiner LL et al., Infect Immun. 2004, 72: 4249-60; Taylor RE, et al., J Exp Med. 2010, 207: 1637-46), and then sterilized by heating at 60 ° C. for 30 minutes.
  • Cells into which the Siglec 14 gene has been introduced and expresses are models of human monocytes that are homozygous for the Siglec 14 wild type allele.
  • Cells in which the Siglec 5 gene has been introduced and expressed are models of human monocytes that are homozygous for the Siglec 14 null allele.
  • RNA extracted from the cells in (1) above was analyzed using 2100 Bioanalyzer (Agilent) to confirm the quality of RNA (less degradation). The concentration and purity were measured with a spectrophotometer NanoDrop.
  • Sample A Siglec 14 gene transfer / THP-1 cells, NTHi (+)
  • Sample B Siglec 14 gene transfer / THP-1 cells, NTHi (-)
  • Sample C Siglec 5 gene transfer / THP-1 cells, NTHi (+)
  • Sample D Siglec 5 gene transfer / THP-1 cells, NTHi (-)
  • comparing the gene expression patterns of sample A and sample B, A shows more than twice the expression of B
  • comparing the gene expression patterns of sample A and sample C A Genes that expressed more than about 2 times C were extracted.
  • the gene expression level is above a certain level, the protein that is the gene product is secreted, the protein is not synthesized in the liver, and the protein measurement method is established.
  • Multiple cleared genes were selected and designated as “COPD exacerbation serum marker candidates”.
  • the selected “serum marker candidate for COPD exacerbation” gene group included the gene EBI3 (also referred to as IL-27 ⁇ ) encoding the ⁇ subunit of the heterodimeric protein IL-27.
  • Example 2 Quantitative analysis of marker candidates using patient-derived exacerbated / non-exacerbated paired serum samples (1) Recruitment of patients and preparation of serum Among the outpatients who visited Nippon Medical University Respiratory Care Clinic, Those who meet the conditions were asked whether they were willing to participate in the study: (a) current or past smoking history, and (b) cough, sputum, and dyspnea. Informed consent was obtained from patients who indicated their intention to participate in the study. Blood was collected from patients who obtained informed consent at the time of stable (non-exacerbation) and at the time of exacerbation, and serum was prepared according to a conventional method.
  • Pulmonary function tests are performed using the pulmonary function test system CHESTAC (Chest Co., Ltd.), and patients with a 1-second rate (FEV1 / FVC) of 0.7 (70%) or less after administration of bronchodilator according to conventional methods are chronic obstructive pulmonary Diagnosed as a patient with COPD.
  • CRP C-reactive protein
  • IL-27 is a marker that reflects the presence of exacerbation of COPD. For this reason, IL-27 was thought to be useful as an index for evaluating drug efficacy during treatment.
  • the method of the present invention enables an objective diagnosis of exacerbation of COPD patients, and is expected to lead to improvement in patient QOL and prognosis, and effective use of medical resources.

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Description

慢性閉塞性肺疾患の増悪指標の検出方法
　本発明は、慢性閉塞性肺疾患の増悪の診断において利用可能な増悪指標の検出方法に関する。
　慢性閉塞性肺疾患（COPD）とは、タバコ煙を主とする有害物質を長期に吸入曝露することで生じる肺の炎症性疾患である。この疾患の患者は、呼吸機能検査で正常に復すことのない気流閉塞を示す。気流閉塞は末梢気道病変と気腫性病変が様々な割合で複合的に作用することにより起こり、進行性である。COPDは2020年には全世界の死亡原因の第三位を占めると予測されている。COPD患者が同疾患により入院治療を必要とする場合、そのほとんどはCOPDの急性増悪が原因であると考えられている。
　COPDの増悪の指標となる血漿・血清マーカー等の探索が進められている（非特許文献１、２）が、決定的なものは未だ見出されていない。C反応性タンパク質（CRP）がCOPD増悪補助マーカーとしても利用されている（非特許文献２及び３）が、これは、炎症に伴い急激に濃度が上昇する急性期タンパク質であって、増悪そのもののマーカーというよりは増悪の引き金となる感染・炎症のマーカーであり、疾患特異性が低い。ライノウイルス感染をPCRを用いて検出してCOPD患者が増悪を起こしているか否かを調べる技術も報告されている（特許文献１）が、この方法では感染の有無から間接的に増悪を調べることしかできず、またライノウイルスを原因とするごく一部の増悪についてのみ適用できる方法となる。現状では呼吸機能の低下や患者の症状などを指標として個々の医師が総合的に判断をしており、COPDの増悪について客観的で精度の高い指標の開発が望まれている。
　プロラクチンなどを用いたCOPD患者の増悪感受性の検査法が知られている（特許文献２）が、これは増悪自体の指標を提供するものではない。
米国特許出願第２００２／０１４２２９４号公報 米国特許出願第２００８／００４４８４３号公報
Barnes P. J., et al., Pulmonary Biomarkers in Chronic Obstructive Pulmonary Disease., (2006) Am. J. Respir. Crit. Care Med., 174:6-14 Hurst J. R., et al., Use of Plasma Biomarkers at Exacerbation of Chronic Obstructive Pulmonary Disease., (2006) Am. J. Respir. Crit. Care Med., 174:867-874 Muller B. and Tamm M., Biomarkers in Acute Exacerbation of Chronic Obstructive Pulmonary Disease., (2006) Am. J. Respir. Crit. Care Med., 174:848-849
　本発明は、COPD患者の増悪指標の検出方法を提供することを課題とする。
　本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意検討を重ねた結果、IL-27の発現増加がCOPD患者の増悪と関連していることを見出し、本発明を完成するに至った。
　すなわち、本発明は以下を包含する。
[1] COPD患者由来の生体試料中のIL-27タンパク質又はそれをコードする遺伝子の発現量を測定し、該患者の非増悪時の発現量と比較した増加を検出することを含む、COPD患者の増悪指標の検出方法。
[2] 生体試料中のIL-27タンパク質の発現量を測定する、上記[1]に記載の方法。
[3] 生体試料が、血液由来試料である、上記[1]又は[2]に記載の方法。
[4] IL-27タンパク質に特異的に結合する抗体を含む、COPD増悪指標の検出用キット。
　本発明の方法を用いれば、COPD患者の増悪の客観的指標を得ることができる。
　本明細書は本願の優先権主張の基礎となる日本国特許出願　特願２０１２－１４８７８７の開示内容を包含する。
　以下、本発明を詳細に説明する。
　シグレック１４（Siglec-14）は自然免疫系の細胞（顆粒球、単球など）に発現する免疫グロブリンスーパーファミリーに属する膜タンパク質である（Angata T., et al., Discovery of Siglec-14, a novel sialic acid receptor undergoing concerted evolution with Siglec-5 in primates., (2006) FASEB J., 20:1964-1973; 特許４４２３３９４号明細書）。シグレック１４は免疫細胞の活性化に関わること、さらに、ヒトシグレック１４遺伝子には多型があり、その遺伝的多型によりシグレック１４タンパク質を発現するヒトとしないヒトが存在することが明らかになっている（Yamanaka M., et al., Deletion polymorphism of SIGLEC14 and its functional implications., (2009) Glycobiology. 19:841-846; 特開２０１０－０３５５５１号公報）。本発明者らは、COPDの増悪を惹起することが知られるインフルエンザ菌（Haemophilus influenza）を用いて免疫細胞を刺激した際、シグレック１４タンパク質を発現する免疫細胞がこれを発現しない免疫細胞と比較してより強いサイトカイン応答を示すこと、また、シグレック１４遺伝子の遺伝的多型がCOPD患者における増悪感受性に強い影響を及ぼすことを見出している（特願２０１１－１７５３５６）。シグレック１４が非莢膜型インフルエンザ菌（Non-typeable Haemophilus influenzae（NTHi）を認識して免疫細胞を活性化することから、本発明者らは、シグレック１４を発現しておりNTHi刺激で活性化された免疫細胞において高発現される遺伝子を選抜し、そこからCOPDの増悪マーカーとなる遺伝子／タンパク質を同定することを試みた。その結果、サイトカインの1種であるIL-27タンパク質及びそれをコードする遺伝子がCOPDの増悪マーカーとなることを見出した。本発明はこの知見に基づき、IL-27の発現量の変化を増悪指標として測定することによるCOPD患者の増悪指標の検出（増悪検査）方法を提供する。
　COPD患者では健常人と比べて喀痰中及び血清中のIL-27濃度が高いという報告がある（Cao J., et al., IL-27 is Elevated in Patients with COPD and Patients with Pulmonary TB and Induces Human Bronchial Epithelial Cells to Produce CXCL10., (2012) Chest., 141:121-130）。しかし、COPD患者におけるIL-27濃度の増悪時変化に関する報告はこれまでになく、IL-27がCOPDの増悪マーカーとなることは本発明者らによって初めて見出された。
　本発明の方法では、COPD患者由来の生体試料中のIL-27タンパク質又はそれをコードする遺伝子の発現量を測定すればよい。
　医師により慢性閉塞性肺疾患（COPD）と診断される患者（COPD患者）が本発明の方法における好適な検査対象である。現在又は過去に喫煙歴があり、咳嗽や喀痰、呼吸困難がある患者はCOPDである可能性が高い。そのような患者について、肺機能検査を、肺機能検査システムCHESTAC（Chest株式会社）等を用いて行い、常法に従って気管支拡張薬投与後の1秒率（FEV1/FVC）が0.7（70％）以下の患者を、慢性閉塞性肺疾患（COPD）患者と診断することができる。ここで、FEV1は、一秒量、すなわち、息をできるだけ速く吐き出したときに１秒間で吐き出すことのできる呼気量である。またFVCは、努力肺活量、すなわち、息を大きく吸い込みできるだけ速く吐き出したときの肺活量である。COPD患者は、哺乳動物、好ましくはヒトである。
　本発明の方法において測定に供する生体試料は、増悪検査を行うCOPD患者から採取する。生体試料は、以下に限定されるものではないが、例えば、血液（例えば、末梢血）、血清、血漿等の血液由来試料、口腔若しくは鼻咽頭粘膜、鼻腔若しくは気管支吸引液、唾液、呼気試料、喀痰等が好ましく、血液由来試料がより好ましい。
　本発明の方法は、限定するものではないが、安定期であるが経過観察が望まれるCOPD患者、増悪の疑いがあるCOPD患者、又は症状から増悪と診断されたCOPD患者に由来する生体試料を検査対象として行うことも好ましい。本発明の方法は、例えば、増悪開始から１週間以上が経過したCOPD患者に由来する生体試料を検査対象として好適に行うことができる。増悪開始から１週間以降のCOPD患者由来の生体試料を検査する場合、増悪時にIL-27の発現量が増加している可能性がさらに高いことから、より信頼性の高い指標を得ることができる。増悪そのものではなく細菌感染等を反映すると考えられ、その発現量が増悪開始から１週間以内に低下するC反応性タンパク質（CRP）の場合とは異なり、IL-27の発現量は増悪開始から１週間以降であっても増悪が存在する限り増加した状態を維持する。従って、IL-27は増悪の存在を反映するマーカーとして有用である。なお「増悪開始」は通常は医師の判断により、増悪症状が出現した最初の日付として決定される。
　本発明では、一人の患者について増悪検査時に採取される生体試料に加えて非増悪時の生体試料についても測定値を得る必要がある。ここで慢性閉塞性肺疾患（COPD）の増悪とは、呼吸困難、咳、喀痰等のCOPDの症状が日常の生理的変動を超えて急激に悪化し、非増悪時（安定期）の治療内容の変更を要する状態をいう（日本呼吸器学会ガイドライン、2009）。COPDの増悪は、Anthonisenらの定義（Anthonisen NR et al., Ann Intern Med. 1987, 106:196-204）や、Rodriguez-Roisinの定義（Rodriguez-Roisin, R. Chest 2000, 117:398S-401S）に従って判別することができる。本発明において、COPD患者の「非増悪時」とは、COPD患者における呼吸困難、咳、喀痰等のCOPDの症状が日常の生理的変動の範囲内に収まっている時期をいう。本発明の方法で検査を行う可能性のあるCOPD患者については、予め非増悪時の生体試料を採取しておくことが好ましい。例えば、非増悪時の生体試料を予め採取して将来の測定用に保存しておき、検査時に採取した生体試料と非増悪時の生体試料を同時期に測定することが好ましい。あるいは非増悪時の生体試料について予め測定を行っておき、その測定値を検査時の生体試料の測定値と比較してもよい。
　本発明の方法の一実施形態では、COPD患者の検査時の生体試料及び非増悪時の生体試料中のIL-27タンパク質の発現量を測定することができる。
　なお、上記基準に従って臨床的に非増悪時と判断されたCOPD患者から採取された生体試料であっても、IL-27の発現量が増加している場合は、非増悪時の生体試料から除外することが好ましい。このような場合は、症状が示されていない初期の増悪、終息していない既存の増悪などを表している可能性がある。
　IL-27タンパク質は、IL-27βサブユニット（EBI3としても知られる）とIL-27αサブユニット（p28又はIL-30としても知られる）が非共有結合したヘテロダイマータンパク質である。ヒトIL-27βサブユニットの遺伝子及びアミノ酸配列の配列は公知であり（GenBankアクセッション番号NM_005755.2）、それぞれ配列番号１（mRNAに対応するcDNA配列）及び配列番号２に示す。ヒトIL-27αサブユニットの遺伝子及びアミノ酸配列の配列は公知であり（GenBankアクセッション番号NM_145659.3）、それぞれ配列番号３（mRNAに対応するcDNA配列）及び配列番号４に示す。
　本発明の方法の測定対象となるヒトIL-27タンパク質を構成するサイトカインであるIL-27βサブユニットは、配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるものであってよいが、配列番号２に示されるアミノ酸配列において１～100個（例えば、1～50個又は1～10個）のアミノ酸残基の欠失、置換又は付加を含む配列からなり、サイトカイン活性を有するタンパク質、例えば配列番号２に示されるアミノ酸配列からシグナルペプチド（配列番号２のN末端の1～20残基）が除去された配列からなるタンパク質等であってもよい。本発明の方法において測定対象となるヒトIL-27タンパク質を構成するサイトカインであるIL-27αサブユニットは、配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるものであってもよいし、配列番号４に示されるアミノ酸配列において１～100個（例えば、1～50個又は1～10個）のアミノ酸残基の欠失、置換又は付加を含む配列からなり、サイトカイン活性を有するタンパク質、例えば配列番号４に示されるアミノ酸配列からシグナルペプチド（配列番号４のN末端の1～28残基）が除去された配列からなるタンパク質等であってもよい。
　IL-27タンパク質の発現量の測定は、生体試料中のIL-27タンパク質を、ELISA法やフローサイトメトリー等に基づく公知のタンパク質測定法を用いて定量することにより実施することができる。例えば、生体試料中のIL-27タンパク質を、IL-27タンパク質、IL-27βサブユニット、又はIL-27αサブユニットに特異的に結合する抗体を用いて、ELISA法に基づきIL-27タンパク質を測定することができる。本発明における測定に用いる、IL-27タンパク質、IL-27βサブユニット、又はIL-27αサブユニットに特異的に結合する抗体は、モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体であってよい。測定には市販の様々な抗IL-27抗体やヒト又はマウスIL-27 ELISAアッセイキットを利用することもできる。例えば、R&D Systems社からは、IL-27αサブユニットとIL-27βサブユニットをリンカーペプチドでつないだ組換え融合タンパク質を抗原として用いて作製したポリクローナル抗体や、それを用いるIL-27検出用のELISAキットを購入することができる。IL-27タンパク質、IL-27βサブユニット、又はIL-27αサブユニットに特異的に結合する抗体は、IL-27タンパク質、IL-27βサブユニット若しくはIL-27αサブユニット又はそれらの断片を抗原として用いて公知の免疫学的手法又は遺伝子工学的手法により作製することもできる。例えば、IL-27タンパク質、IL-27βサブユニット、又はIL-27αサブユニットに対するポリクローナル抗体は、それらを抗原として用いてマウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、ロバ等の動物を免疫感作し、一定期間経過後血清を採取し、プロテインA、プロテインG、抗原タンパク質、抗原ペプチドなどを固相化したカラム等で精製することにより取得することができる。またIL-27タンパク質、IL-27βサブユニット、又はIL-27αサブユニットに対するモノクローナル抗体は、上記ポリクローナル抗体と同様の免疫感作を行い、一定期間経過後、例えば脾臓細胞を採取し、該細胞とミエローマ細胞とを細胞融合し、得られたハイブリドーマをスクリーニングし、用いた抗原タンパク質に対して特異的な結合性を示す抗体を産生するハイブリドーマを選抜して、その培養物又は培養上清から調製することができる。また、それらの抗体の抗原結合性フラグメント（Fab、F(ab’)2等）も、全抗体と同様に測定に使用することができる。生体試料中のIL-27タンパク質の定量は、サイトカインアッセイキットを用いたマルチプレックスビーズアレイ法（Procarta Cytokine Assay Kit, Affymetrix）によって行うこともできる。
　このようにして得られた生体試料中のIL-27タンパク質の測定値を、IL-27タンパク質の発現量とすることができる。IL-27タンパク質の発現量は、濃度等の計測値で表してもよいし、相対値として表してもよい。
　以上のようにして得られたCOPD患者の検査時の生体試料のIL-27タンパク質の発現量を、同じ患者の非増悪時の生体試料について同様にして測定されたIL-27タンパク質の発現量と比較する。
　本発明の方法の別の一実施形態では、COPD患者の増悪検査時の生体試料及び非増悪時の生体試料中の、IL-27タンパク質をコードする遺伝子の発現量を測定してもよい。ここで「IL-27タンパク質をコードする遺伝子」は、IL-27タンパク質を構成するIL-27βサブユニット又はIL-27αサブユニットをコードする遺伝子を意味する。測定対象のIL-27βサブユニットをコードする遺伝子は、配列番号１に示される塩基配列からなるものであってもよいし、配列番号１に示される塩基配列において１～10個（例えば、1～5個）の塩基の欠失、置換又は付加を含む配列からなり、サイトカイン活性を有するタンパク質をコードするものであってもよい。IL-27αサブユニットをコードする遺伝子は、配列番号３に示される塩基配列からなる核酸であってもよいし、配列番号３に示される塩基配列において１～10個（例えば、1～5個）の塩基の欠失、置換又は付加を含む配列からなり、サイトカイン活性を有するタンパク質をコードする核酸であってもよい。IL-27αサブユニットをコードする遺伝子はまた、配列番号３に示される塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつサイトカイン活性を有するタンパク質をコードする核酸であってもよいし、配列番号３に示される塩基配列に対して70％以上、好ましくは80％以上、より好ましくは90％以上、特に好ましくは95％以上の同一性を有する塩基配列からなり、かつサイトカイン活性を有するタンパク質をコードする核酸であってもよい。本発明において「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成される条件をいい、例えば、相同性が高い核酸同士、すなわち90％以上、好ましくは95％以上の相同性を有するDNA同士がハイブリダイズし、それより相同性が低い核酸同士がハイブリダイズしない条件が挙げられる。より具体的には、ナトリウム塩濃度が15～750mM、好ましくは50～750mM、より好ましくは300～750mM、温度が25～70℃、好ましくは50℃～70℃、より好ましくは55～65℃、ホルムアミド濃度0～50％、好ましくは20～50％、より好ましくは35～45％での条件をいう。さらに、ストリンジェントな条件では、ハイブリダイゼーション後のフィルターの洗浄条件が、通常はナトリウム塩濃度が15～600mM、好ましくは50～600mM、より好ましくは300～600mM、温度が50～70℃、好ましくは55～70℃、より好ましくは60～65℃である。上記「核酸」は、DNA又はRNAであってよく、修飾塩基を一部に含んでいてもよい。
　IL-27タンパク質をコードする遺伝子の発現量の測定は、生体試料から抽出される核酸試料、好ましくはトータルRNAについて、当該遺伝子から発現されたmRNAの量を測定することにより行うことができる。トータルRNAの抽出は、市販のRNA抽出キット等を用いて常法により行うことができる。IL-27βサブユニット又はIL-27αサブユニットをコードする遺伝子由来のmRNA量の測定は、IL-27βサブユニット又はIL-27αサブユニットをコードする遺伝子から転写されたmRNAを特異的に増幅可能なPCRプライマー対を用いて定量的PCRにより実施することができる。あるいはそのようなmRNA量の測定は、IL-27βサブユニット又はIL-27αサブユニットをコードする遺伝子に特異的なプローブを用いて、ノーザンブロット法に基づいて行うことができる。当業者であれば、IL-27βサブユニット又はIL-27αサブユニットをコードする遺伝子の塩基配列、例えば配列番号１又は３に示される塩基配列に基づいて、適切なプライマー又はプローブを適切に設計することができる。
　以上のようにして測定された、生体試料中のIL-27βサブユニット又はIL-27αサブユニットをコードする遺伝子から発現されたmRNA量を、IL-27タンパク質をコードする遺伝子の発現量とすることができる。その発現量は、濃度等の計測値で表してもよいし、相対値として表してもよい。
　次いで、COPD患者の増悪検査時の生体試料のIL-27タンパク質をコードする遺伝子の発現量を、同じ患者の非増悪時の生体試料中のIL-27タンパク質をコードする遺伝子の発現量と比較する。
　本発明の方法では、COPD患者の増悪検査時の生体試料中のIL-27タンパク質又はIL-27タンパク質をコードする遺伝子の発現量を、同じ患者の非増悪時の生体試料中の対応する発現量と比較し、増悪検査時の生体試料での発現量が非増悪時の生体試料での発現量よりも増加したかどうかを判定する。その結果、検査時の生体試料での発現量が非増悪時の生体試料での発現量よりも増加した場合、当該COPD患者においてCOPDの増悪が生じている可能性が高いことが示される。さらに、検査時の生体試料での発現量が非増悪時の生体試料での発現量と比べて5％以上、好ましくは10％以上、さらに好ましくは20％以上増加した場合には、COPDの増悪が生じている可能性が特に高いということができる。
　以上のようにして、COPD患者由来の生体試料中のIL-27タンパク質又はそれをコードする遺伝子の発現量を測定し、該患者の非増悪期の発現量と比較した増加を検出することにより、その検出結果を、COPD患者の増悪の可能性を示す客観的指標とすることができる。本発明は、このようなCOPD患者の増悪指標の検出方法を提供する。
　本発明の方法によれば、例えば、症状からCOPDであると確定判断できない患者において、増悪を示す客観的指標を検出することができ、COPDの診断を裏付けることができる。さらに、本発明の方法を用いれば、治療中のCOPD患者について、増悪抑制／改善治療の有効性を判断するのに利用可能な指標として、本発明に係る増悪指標を得ることができる。本発明の方法では、特に、増悪開始日から１週間以降のCOPD患者について検査する場合に、IL-27の増加は、増悪についてより信頼性の高い指標となりうる。したがって、治療の有効性の判断などの目的でCOPDの増悪の経過を長期にわたり（好ましくは１週間以上）モニタリングする場合、本発明の方法は特に有利である。
　本発明はまた、IL-27タンパク質に特異的に結合する抗体を含む、COPD増悪指標の検出用キットも提供する。IL-27タンパク質に特異的に結合する抗体は、モノクローナル抗体であってもポリクローナル抗体であってもよく、上述のIL-27タンパク質測定用のものと同様である。当該キットは、IL-27タンパク質に特異的に結合する抗体に加えて、他の試薬、例えば抗体検出用の二次抗体等のELISAアッセイ用試薬や、バッファー、固相（例えば、ビーズ）、COPD増悪指標検出用の使用説明書等をさらに含んでもよい。
　以下、実施例を用いて本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明の技術的範囲はこれら実施例に限定されるものではない。
［実施例１］増悪の血清マーカー候補の選定
（1）NTHi死菌の調製、THP-1細胞の刺激とRNAの調製
　非莢膜型インフルエンザ菌（Non-typeable Haemophilus influenzae（NTHi））2019株を、文献の記載に従って0.5 mMのN-アセチルノイラミン酸を添加した最少培地を用いて培養し（Greiner LL et al., Infect Immun. 2004, 72:4249-60; Taylor RE, et al., J Exp Med. 2010, 207:1637-46）、次いで60℃、30分間の加熱により殺菌した。
　ヒト単球細胞株であるヒト単球性白血病細胞THP-1にシグレック１４遺伝子（配列番号５）のcDNAを安定的に導入した株とシグレック５遺伝子（配列番号６）のcDNAを安定的に導入した株をそれぞれ作製した（Yamanaka M., et al., (2009) Glycobiology. 19:841-846）。シグレック１４遺伝子が導入されそれを発現する細胞は、シグレック１４野生型アリルについてホモ接合のヒト単球のモデルである。シグレック５遺伝子が導入されそれを発現する細胞は、シグレック１４ヌル型アリルについてホモ接合のヒト単球のモデルである。
　これらの株の細胞をマクロファージ・単球用無血清培地Macrophage-SFM（Invitrogen）に1 × 106細胞/mlで懸濁し、6ウェルプレートの各ウェルに2.5 mlずつ分注した（2.5 × 105細胞/ウェル）。これらの細胞に、上記で加熱殺菌したNTHi培養物を添加し（2.5 × 108 NTHi/ウェル；コントロールはNTHiを添加せず調製）、炭酸ガスインキュベーター（37℃、5% CO2）中で6時間培養した。培養後に遠心操作により細胞を回収し、RNeasy Mini（Qiagen）を用いてトータルRNAを抽出した。
（2）DNAマイクロアレイを用いた遺伝子発現解析
　DNAマイクロアレイを用いた各細胞における遺伝子発現解析（Affymetrix）を、以下の手順で実施した。
i）RNAの定量と品質の確認
　上記(1)で細胞から抽出したトータルRNAを、2100 Bioanalyzer（Agilent）を用いて解析し、RNAの品質（分解が少ない）を確認した。また分光光度計NanoDropで濃度及び純度を測定した。
ii）ビオチン標識RNAの調製と断片化
　上記のトータルRNA 250 ngをテンプレートに用い、GeneChip（登録商標）3' IVT Express Kit（Affymetrix）を使用して第一鎖cDNA及び第２鎖cDNAを逐次合成し、更にin vitro転写によりビオチン標識RNAを調製し、プロトコルに従って断片化した。
iii）DNAマイクロアレイへのハイブリダイゼーション
　断片化したビオチン標識RNAをDNAマイクロアレイHuman Genome U133 Plus 2.0（Affymetrix）にハイブリダイズ（45℃、16時間）させた。ハイブリダイズにはハイブリダイゼーション用オーブンGeneChip Hybridization Oven 640（Affymetrix）を用いた。
iv）ハイブリダイズしたビオチン標識RNAの検出
　試薬としてGeneChip Hybridization, Wash, and Stain Kit（Affymetrix）を、装置としてGeneChip Fluidics Station 450（Affymetrix）を用いて、ハイブリダイズした断片化ビオチン標識RNAに蛍光標識ストレプトアビジンを結合させ、洗浄し、スキャナーGeneChip Scanner 3000 7G（Affymetrix）を用いて画像をスキャンした。GeneChip Fluidics Station 450及びGeneChip Scanner 3000 7Gの制御にはソフトウェアGeneChip Operating Software（Affymetrix）を使用した。
v）遺伝子発現の定量
　GeneChip Operating Softwareを用いて、スキャンした画像から各スポットの蛍光強度を定量し、定量値を標準化した。
（3）遺伝子発現パターンに基づくマーカー候補の選定
　以上のようにして遺伝子発現を調べた各サンプルは以下のとおりである。
　　サンプルA：　シグレック１４遺伝子導入/THP-1細胞, NTHi(+)
　　サンプルB：　シグレック１４遺伝子導入/THP-1細胞, NTHi(-)
　　サンプルC：　シグレック５遺伝子導入/THP-1細胞, NTHi(+)
　　サンプルD：　シグレック５遺伝子導入/THP-1細胞, NTHi(-)
　ここで、サンプルAとサンプルBの遺伝子発現パターンを比較してAの方がBの約2倍以上の発現を示し、かつ、サンプルAとサンプルCの遺伝子発現パターンを比較してAの方がCの約2倍以上の発現を示す遺伝子を抽出した。更に、遺伝子発現レベルが一定の水準以上であること、遺伝子産物であるタンパク質が分泌されること、タンパク質が肝臓で合成されていないこと、タンパク質の測定法が確立されていること、等の条件をクリアした複数の遺伝子を選択し、「COPD増悪の血清マーカー候補」とした。選択された「COPD増悪の血清マーカー候補」遺伝子群には、ヘテロダイマータンパク質IL-27のβサブユニットをコードする遺伝子EBI3（IL-27βとも称される）が含まれていた。
［実施例２］患者由来増悪時・非増悪時ペア血清サンプルを用いたマーカー候補の定量解析
（1）患者のリクルートメントと血清の調製
　日本医科大学呼吸ケアクリニックに来訪した外来患者のうち、以下の条件を満たす方に研究への参加意思の有無を訊ねた：（a）現在又は過去に喫煙歴があること、及び（b）咳嗽、喀痰、及び呼吸困難があること。研究参加の意志表示をした患者からはインフォームドコンセントを得た。インフォームドコンセントを得た患者から安定時（非増悪時）及び増悪時に採血を行い、常法に従って血清を調製した。肺機能検査を肺機能検査システムCHESTAC（Chest株式会社）を用いて行い、常法に従って気管支拡張薬投与後の1秒率（FEV1/FVC）が0.7（70％）以下の患者を慢性閉塞性肺疾患（COPD）患者と診断した。
　なお増悪開始後一週間以降に採血された血清試料にはその旨を情報として登録した。増悪の開始日は、患者に出現した症状を基に医師が判断した。
（2）マーカー候補の定量
　実施例１で「COPD増悪の血清マーカー候補」として絞り込んだ遺伝子に関して、マルチプレックスビーズアレイ法（Procarta Cytokine Assay Kit, Human By Request; Panomics/Affymetrix）を用いて、以下の手順でそれぞれの発現産物に対応するタンパク質の測定を行った（n = 39）。本法はLuminex社のxMAPテクノロジーの応用により、同一試料中の複数の測定対象を同時に定量する方法である。Panomics/Affymetrix社のプロトコル（Procarta Cytokine Assay Kit, User Manual Specifically for Serum and Plasma Samples; P/N 10483）に従って測定を行った。
i）抗体ビーズの用意
　フィルタープレートをセットしたマルチスクリーンバキュームマニホールド（Millipore）に、キャプチャー抗体を固相化した抗体ビーズ（それぞれ固有の量の蛍光色素でラベルされている）混合物を各ウェル50μlずつ添加して吸引して液を除き、Wash Bufferで洗浄し、吸引して液を除いた。
ii）解析対象の抗体ビーズへの吸着
　各ウェルにAssay Bufferを25μlずつ添加し、さらに25μlの血清又は定量用標準混合物（Standard Buffer、Human Serum with Human Assay Bufferを用いて4倍希釈系列を作成）を添加し、振盪しながら室温で60分インキュベートした。吸引して液を除き、Wash Bufferで洗浄し、吸引して液を除いた。
iii）ビオチン化抗体の結合
　各ウェルに25μlのビオチン標識された検出用抗体の混合物を添加し、振盪しながら室温で30分インキュベートした。吸引して液を除き、Wash Bufferで洗浄し、吸引して液を除いた。
iv）ストレプトアビジン-蛍光色素コンジュゲートとの結合
　各ウェルに50μlのストレプトアビジン-R-フィコエリスリン溶液を加え、振盪しながら室温で30分インキュベートした。吸引して液を除き、Wash Bufferで洗浄し、吸引して液を除いた。
v）蛍光強度の測定、定量化
　各ウェルに120μlのReading Bufferを加え、室温で5分振盪し、各ビーズの蛍光測定に供した。蛍光強度の測定にはBio-Plexワークステーション（BIO-RAD）を使用し、データの解析にはBio-Plexマネージャーソフトウェア6.0（BIO-RAD）を用いて、各試料中の測定対象の濃度を定量した。
（3）統計的解析
　増悪時と非増悪時のペア血清における各測定対象の測定値を比較した。測定値の分布が正規分布に従わないため、ノンパラメトリックな検定法としてWilcoxonの符号順位検定を採用した。有意水準を0.05とした。
　この結果、IL-27タンパク質の血清中タンパク質濃度が、増悪時に有意に増加することが示された（p値：0.0472（< 0.05）、片側検定）。ここで測定した患者集団においては、増悪時のIL-27は、非増悪時と比較して患者毎の値で最大で約148％の増加（非増悪時：397.25、増悪時：988.19）を示した。また非増悪時と比較して増悪時のIL-27測定値が10％以上の増加を示した患者の割合が測定を行ったCOPD増悪患者の45％超に上った。
　更に、既存のCDPD増悪補助マーカーであるC反応性タンパク質（CRP）とIL-27を比較した。高感度CRPの測定は株式会社ビー・エム・エルに委託して行った。CRPの定量にはシーメンスヘルスケア・ダイアグノスティクス株式会社のN-ラテックス CRP IIを使用した。
　CRPもIL-27も、全数測定（CRP: 37例、IL-27: 39例）で増悪時に有意に測定値が高かった（片側検定、p < 0.05）。一方、増悪開始後一週間以降に採血された血清試料に限定して検討したところ、IL-27（25例）は非増悪時と比較して高いが（片側、両側検定とも有意；p値：0.0027（片側）、0.0053（両側）(< 0.01)）、CRP（24例）は高いとはいえない（片側、両側検定とも有意でない；p > 0.05）ことが示された。
　さらに、膿性痰のある症例（細菌感染症の疑い例、8例）についてその他の症例と比較すると、CRPでは有意に測定値が高かったが、IL-27の測定値は有意に高い結果は示されなかった。このことから、IL-27の増悪時の増加は、細菌感染症罹患時に限定されないことが示された。
　以上の結果から、IL-27はCOPDの増悪の存在を反映するマーカーであることが示された。このためIL-27は、治療の際の薬効評価などの指標としても有用であると考えられた。
　本発明の方法により、COPD患者の増悪の客観的な診断が可能となり、患者のQOL並びに予後の改善、並びに医療資源の有効利用につながることが期待される。
　本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願はそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。

Claims (4)

  1. 　COPD患者由来の生体試料中のIL-27タンパク質又はそれをコードする遺伝子の発現量を測定し、該患者の非増悪時のその発現量と比較した増加を検出することを含む、COPD患者の増悪指標の検出方法。
  2. 　生体試料中のIL-27タンパク質の発現量を測定する、請求項１に記載の方法。
  3. 　生体試料が血液由来試料である、請求項１又は２記載の方法。
  4. 　IL-27タンパク質に特異的に結合する抗体を含む、COPD増悪指標の検出用キット。
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