WO2013147439A1 - 청국장 추출물을 유효성분으로 포함하는 전신면역 또는 장관면역 보강제 - Google Patents

청국장 추출물을 유효성분으로 포함하는 전신면역 또는 장관면역 보강제 Download PDF

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WO2013147439A1
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WO
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adjuvant
extract
cheonggukjang
ethanol
immunogen
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PCT/KR2013/001945
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손동화
임성일
최대운
정인식
김원용
시혜정
황인규
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한국식품연구원
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K36/00—Medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicines
    • A61K36/18—Magnoliophyta (angiosperms)
    • A61K36/185—Magnoliopsida (dicotyledons)
    • A61K36/48—Fabaceae or Leguminosae (Pea or Legume family); Caesalpiniaceae; Mimosaceae; Papilionaceae
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P39/00—General protective or antinoxious agents

Definitions

  • the present invention was made by the task number PJ008325 under the support of the Rural Development Administration of Korea, the research and management agency of the project is the Rural Development Administration, the research project name is "next generation Biogreen 21 project,” and the project title "adjuvant for hepatitis A vaccine.” Optimization ”,
  • the host institution is Korea Food Research Institute, and the research period is from Aug. 01, 2011 to Dec. 31, 2012.
  • the present invention was made by the task number E0121501 under the support of the Ministry of Knowledge Economy, the research management specialized organization of the task is the Korea Food Research Institute, the research project name is “Korea Food Research Institute major projects”, the research title is "T-cell of natural materials Research on the development of anti-allergic foods using control activities ", the lead institution is Korea Food Research Institute, and the research period is 2012.01.01-December 31, 2012.
  • This patent application is filed with the Korean Patent Application No. 10—2012-0031749 filed with the Korean Patent Office on March 28, 2012 and the Korean Patent Application No. 10-2013-0018895 filed with the Korean Patent Office on February 21, 2013. Priority is claimed, the disclosures of which are incorporated herein by reference.
  • the present invention relates to a systemic immune or enteroimmune adjuvant comprising the extract as a cheongukjang.
  • Adjuvants known to date include inorganic salts (eg, aluminum hydroxide, aluminum phosphate and calcium phosphate), immunostimulants; Cytokines (eg, IL-2, IL-12, GM-CSF, IFN- ⁇ , IFN-y and IL-18), biomolecules (eg, CD40, CD154, MHC type 1 invariant chain) and Lymphocyte function-associted antigen (LFA) 3, saponins (eg QS21), N-acetyl-muramyl-L-alanine-D-isoglutamine derivatives, CPG-DNA (CpG o 1 i godeoxynuc 1 eot i des) ), Lipopolysacchar ides (LPS), Monophosphoryl Lipid A (MPL), polyphosphasenes, lipid particles (eg Freund, Syntex Adjuvant Formulation (SAF) and MF59); Liposomes, virosomes, iscoms, Immune Stimul
  • the adjuvant should be nontoxic in terms of safety in addition to the adjuvant effect, biodegradable, stable, inexpensive, and convenient to use.
  • Freund's adjuvant is one of the most widely used immunoadjuvant, but it can't be used in human body, and aluminum salt can be used in human body but its effect is lower than Freund's adjuvant ((FVeunds, J. et.al., Soc. Exp. Biol Med. 37, 509 (1937) and Gupta, K. et. Al., Vaccine 11, 293-306 (1993).
  • Intestinal immunity which is classified as a secondary lymphoid system in the primary and secondary lymphoid tissues, is present in the mucosal region of the mucosal lymphoid organs, and is characterized by IgA reaction in the intestinal immune system. It plays an important role in biodefence (Bienestock, J. et. Al., Immunol., 41, 249-270 (1980)).
  • CT Chosterin Toxin
  • ⁇ ⁇ . Coli heat-labile enterotoxin
  • the present inventors have made diligent efforts to develop oral enteroimmune adjuvant having excellent safety and low production cost and ease of use.
  • the Cheonggukjang extract as an adjuvant, by effectively inducing Thl and Th2 immune response, in particular by inducing Th2 immune response, it is possible to induce immunogen-specific immune response and greatly improve vaccine efficacy.
  • the invention has been completed.
  • Another object of the present invention to provide a vaccine composition for oral administration. Another object of the present invention is to provide a method for inducing systemic or enteroimmune reactions. Other objects and advantages of the present invention will become apparent from the following detailed description, claims and drawings. [Task solution]
  • the present invention is a systemic immune or enteroimmune adjuvant (adjuvant) comprising the chungkukjang extract as an active ingredient, the chungkukjang extract is ethanol-soluble (ethanol-soluble) extracted using ethanol
  • systemic or enteroimmune adjuvant comprising the ingredient.
  • the present invention provides a method for inducing systemic or enteroimmune reactions comprising administering to a subject a composition comprising an ethanol-soluble component in ethanol extract of Cheonggukjang. to provide.
  • the present inventors earnestly tried to develop oral enteroimmune adjuvant having excellent safety and low production cost and ease of use.
  • the Chungkookjang extract containing ethanol-soluble components extracted using ethanol was used as an adjuvant, Thl and
  • Th2 immunoreaction in particular Th2 immunoreaction, induction of immunogen-specific immunoreaction was found to significantly improve vaccine efficacy.
  • Cheongggukjang used in the present invention may be used for the preparation of Cheonggukjang, for example, Bacillus (e.g., Bacillus amyloliquipecius, Bacillus methylotrophicus Bacillus Atropheus Bacillus tequilensis, Bacillus subtilis and Bacillus methyl. It is a Korean traditional fermented food prepared by fermentation and fermentation of inoculated with soybean soybeans (rotrophicus) or cokeria (eg, cokeria salshisha).
  • Bacillus e.g., Bacillus amyloliquipecius, Bacillus methylotrophicus Bacillus Atropheus Bacillus tequilensis, Bacillus subtilis and Bacillus methyl.
  • It is a Korean traditional fermented food prepared by fermentation and fermentation of inoculated with soybean soybeans (rotrophicus) or cokeria (eg, cokeria salshisha).
  • Cheonggukjang is similar to other traditional fermented foods in Korea, but in fermenting soybean soybean paste with fermented soybeans, it is fermented for 40-60 days using salt, whereas it is only 2-3 days at about 40 o C without salt. Is prepared through a short fermentation period. Cheonggukjang is a food that is commonly consumed in the Republic of Korea, and has no side effects from stability problems and intake in developing as an adjuvant. It is convenient to use, inexpensive, and has an excellent immune boosting effect, making it suitable for development as an adjuvant. Has characteristics.
  • the active ingredient used in the present invention is an ethanol-soluble component extracted by treating ethane with Cheonggukjang (eg, Cheonggukjang powder). Therefore, the active ingredient used in the present invention will be described as "cheonggukjang ethanol-dissolved extract”.
  • Cheonggukjang ethanol-dissolved extract used in the composition of the present invention is a fraction containing ethanol-soluble components, not precipitation, in the result obtained by treating the solvent with ethane.
  • the ethanol solvent is treated in Cheonggukjang and centrifuged, ethanol-soluble components and precipitates are formed, and the ethane extract from which the precipitate is removed is the most preferred Cheonggukjang ethanol-dissolved extract of the present invention. .
  • the ethanol used to prepare the Cheonggukjang ethanol-dissolving extract is 50-99% ethanol. If the concentration of ethane used is less than 50%, there is a problem that the ethane-dissolving components are not sufficiently dissolved in ethanol. If the concentration of ethane exceeds 99%, the cost of the solvent is too high and the concentration of ethane is too high. There is a problem that the extraction efficiency is almost unchanged with increasing. More preferably the concentration of ethanol used is 50-85%, 50-80%, 50-75%, 50-70%, 50-99%, 60-85%, 60-80%, 60-75% or 60-70%.
  • the term 'extract' has a meaning commonly used as a crude extract in the art as described above, but also broadly includes a fraction additionally extracting the extract.
  • Cheonggukjang ethanol-dissolved extracts include not only those obtained using ethanol solvents, but also those obtained by further applying a purification process.
  • the extract may be fractions obtained by passing an ultrafiltration membrane having a constant molecular weight cut-off value, separation by various chromatography (manufactured for separation according to size, charge, hydrophobicity or affinity), and the like.
  • the fraction obtained through the purification method is also included in the chungkukjang ethanol-dissolved extract of the present invention.
  • chunggukjang ethanol-dissolving extract used as an active ingredient in the present invention is an extract from which PGA (poly-x -glutamic acid) is removed, more preferably PGA (poly-y -glutamic acid) ) And Levan are extracts removed.
  • PGA poly-x -glutamic acid
  • Levan Levan are extracts removed.
  • the term "removal” as used herein referring to poly-Y-glutamic acid (PGA) refers to a condition in which PGA is not detected substantially in the Cheonggukjang ethanol-dissolving extract.
  • Dissolved extracts can be defined as having PGA removed.
  • the immune-enhancing active ingredient of the Chungkookjang extract is known as poly ⁇ ⁇ glutamic acid (PGA) and Levan, and in order to obtain such an active ingredient, 70% ethanol is treated to samples such as Chungkookjang, The precipitate formed is further purified to obtain PGA or Levan.
  • the present invention uses the ethanol dissolved fraction of Chungkookjang as a completely opposite approach.
  • Cheonggukjang used in the present invention may be prepared using various microorganisms, but most preferably, it is prepared using Bacillus amyloliquipeciency. As demonstrated in the following examples, when preparing Cheonggukjang using Bacillus amyloliquipecience, not only the ⁇ -amylase, ⁇ -amylase and protease enzyme activity in the crude enzyme solution of Cheonggukjang is excellent, but also splenocytes. The proliferative activity is very good.
  • the term 'immune adjuvant' is a pharmaceutical or immunological substance that changes the effect of a substance such as a drug or a vaccine, and the adjuvant itself does not have any direct effect.
  • a substance such as a drug or a vaccine
  • the adjuvant itself does not have any direct effect.
  • the adjuvant is added to the vaccine to stimulate the reaction of the immune system targeting the antigen, which itself is not immune.
  • Adjuvants can act in various ways to present antigens to the immune system.
  • the term 'immunogen' refers to a substance that induces an immune response of a recipient.
  • viral pathogen antigens examples include Orthomyxoviruses such as influenza viruses; Retroviruses such as respiratory syncytial virus (RSV), simian immunodeficiency virus (SIV), and HIV; Herpesviruses such as EpVn-Barr Virus (EBV); cytomegalovirus (CMV) or herpes simplex virus (HSV); Lent i viruses; Rhabdovi ruses such as rabies; Picomovi ruses such as poliovirus; Poxviruses such as niathia; Rotavirus; And antigens derived from Parvoviruses.
  • Orthomyxoviruses such as influenza viruses
  • Retroviruses such as respiratory syncytial virus (RSV), simian immunodeficiency virus (SIV), and HIV
  • Herpesviruses such as EpVn-Barr Virus (EBV); cytomegalovirus (CMV) or herpes simplex virus (HSV); Lent
  • examples of viral pathogen antigens include HPV antigens, such as the LI, L2, E6 or E7 proteins of HPV;
  • examples of antigens of HIV include T cell and B cell epitopes of nef, p24, gpl20, gp41, tat, rev, pol, env and g l20 (Palker et al, J. Immunol., 142: 3612-3619 (1989)) It includes.
  • Examples of surface antigens of HBV are described by Wu et al, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 86: 4726-4730 (1989).
  • antigens of rotaviruses are VP4 (Mackow et al, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 87: 518-522 (1990)) and VP7 (Green et al, J. Virol., 62: 1819-1823).
  • Influenza virus antigens include hemagglutinin (HA) and nucleoproteins; HSV antigens include thymidine kinase (Whitley et al, In: New Generation Vaccines, pages 825--854); avian influenza virus antigens include hemagglutidine; swine cholera virus antigens envelope; foot-and-mouth virus antigens envelope; and Newcapsule antigens helia (Hemagglutinin-neuraminidase) It includes.
  • HSV antigens include thymidine kinase (Whitley et al, In: New Generation Vaccines, pages 825--854)
  • avian influenza virus antigens include hemagglutidine; swine cholera virus antigens envelope; foot-and-mouth virus antigens envelope; and Newcapsule antigens helia (Hemagglutinin-neuraminidase) It includes.
  • bacterial pathogen antigens examples include Mycobacterium sp. , Helicobacter pylori, Salmonella spp. , Shigella spp. , E. col /, Rickettsia spp. , Listeria spp. , Legionella pneumoniae, Pseudo onas spp. , Vibrio spp.— / / by Includes antigens.
  • examples of bacterial pathogen antigens examples include Shigella sonnei ⁇ 1 form-1 antigen (Formal et al, Infect. Immun., 34: 746-750 (1981)); V.
  • cholerae antigen Forrest et al, J. Infect. Dis. 159: 145-146 (1989); FA / I cilial anti en from E. coli (Yamamoto et al, Infect. Immun., 50: 925-928 ( 1985)) and non-toxic B-subunits of heat-sensitive toxins (Klipstein et al, Infect. Immun., 40: 888-893 (1983)); Bordetella pertussis ⁇ pertact in (Roberts et al, Vacc) 10:43 1 48 (1992); adenylate cyclase-hemolysine of B. pertussis (Gui so et al, Micro.
  • Examples of parasitic antigens that can be used in the present invention include Plasiwdhun spp. , Trypanosowe spp. , Giardia sp. , Boophilus spp. , Babesia sp. , Entamoeba spp. , Eimeria spp. , Laishmania spp. , Schistosome spp. , Brugia spp. , Fascida spp. , Dirofi laria spp. , uchereria spp. , And antigens derived from Onchocerca spp.
  • examples of parasitic antigens that can be used in the present invention include circumsporozoite antigens of Plasniodhun bergerii and circumsporozoite antigens of Plasmodium spp. Such as circumsporozoite antigens of P. falciparum (Sadoff et al, Sci., 240 ⁇ " 336- “ 337 (1988)); Plasmocjium me ⁇ merozoite surface antigen (Spetzler et al, Int. J. Pept. Prot.
  • cancer antigens examples include prostate specific antigens (Gattuso et al, Human Pathol., 26: 123-126 (1995)), TAG-72 and carcinoembryonic antigens (CEA) (Guadagni et al, Int. J. Biol.Markers, 9: 53-60 (1994)), MAGE-1 and tyrosinase (Coulie et al, J. I nothera., 14: 104-109 (1993)), p53 (W0 94/02167), NY-ES01 (cancer-test is antigen), ⁇ -feto protein (AFP) and cancer antigen 125 CA-125), Early Prostate Cancer (EPCA) Antigen).
  • prostate specific antigens Gaattuso et al, Human Pathol., 26: 123-126 (1995)
  • CEA carcinoembryonic antigens
  • MAGE-1 and tyrosinase Mcelect al, J. I nothera.,
  • Thl immune response means a reaction that induces cellular immune response
  • Th2 immune response means a reaction that promotes humoral immune response
  • the measurement of the immune response in the immunized animal may be performed by, for example, a method of confirming the titer of anti-immunogen antibodies (total IgG, IgGl and IgG2a) by collecting serum from a subject animal to which the immunogen has been administered.
  • Methods for determining the titer of an antibody include, for example, EL ISA (Enzyme—linked i® unosorbent assay), Lateral flow test (MIA), Magnetic ic immunoassay (MIA), and immunoprecipitation (Immunoprecipitation).
  • the present invention is not limited thereto, and may be performed by various immunoassays (i ⁇ unoassay) known in the art, and preferably, an ELISA assay is used.
  • the enteroimmune adjuvant of the present invention promotes the generation of immunogen specific IgG in the blood and immunogen specific IgA in the small intestine when administered orally with an immunogen.
  • the immunogen and chunggukjang ethanol-dissolved extracts were administered to the mice, blood was collected by the orbital vein plexus and the serum was isolated to analyze the IgG levels.
  • the immuno-specific IgG was increased when the -dissolved extracts of the immunogen and the Cheongguk ethane were compared with the administration of only the immunogen (Keyhole Limpet Hemocyanin (KLH) alone (Fig. 6). Production is increased (FIG. 9).
  • Cheonggukjang ethanol-dissolved extract of the present invention has a strong IgA production activity similar to that of CT (cholera toxin), which can effectively induce intestinal immunity against pathogens or viruses, as well as blood IgG production that did not appear in CT. And systemic immune responses are also well induced.
  • CT cholera toxin
  • the enteroimmune adjuvant of the present invention increases the production of IL-12 in the spleen when administered orally with an immunogen. It effectively induces cellular immune responses with activated Thl reactions.
  • the enteroimmune adjuvant of the present invention increases the production of IL-4 and IL-5 in the spleen when administered orally with an immunogen. This effectively induces a humoral immune response that produces immunogen specific antibodies with activated Th2 reactions.
  • the enteroimmune adjuvant of the present invention when orally administered with an immunogen, increases the relative amount of IL-4 / IFN-Y in the spleen by 5-30 times as compared to oral administration of the immunogen alone, more preferably 6 -20 times, most preferably 7-10 times.
  • administering results in increased production of IL-4 that induces Th2 reactions (FIG. 4).
  • the adjuvant of the present invention may be provided in pharmaceutical compositions and food compositions.
  • the pharmaceutical composition of the present invention includes a pharmaceutically acceptable carrier.
  • Pharmaceutically acceptable carriers included in the pharmaceutical composition of the present invention are commonly used in the preparation, lactose, dextrose, sucrose, sorbbi, manny, starch, acacia rubber, calcium phosphate, alginate, Gelatin, silicate, microcrystalline cellulose, polyvinylpyridone, cellulose ,. Water, syrup, methyl cellulose, methyl hydroxybenzoate, propyl hydroxybenzoate, talc, magnesium stearate, mineral oil, and the like.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may further include a lubricant, a humectant, a sweetener, a flavoring agent, an emulsifier, a suspending agent, a preservative, and the like.
  • a lubricant e.g., talc, kaolin, kaolin, kaolin, kaolin, kaolin, kaolin, kaolin, kaolin, kaolin, a kaolin, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, mannitol, mannitol, mannitol, mannitol, mannitol, mannitol, mannitol, mannitol, mannitol, mann
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be administered orally or parenterally, and in the case of parenteral administration, it may be administered by intravenous injection, subcutaneous injection, intramuscular injection, intraperitoneal injection, or transdermal administration.
  • Suitable dosages of the pharmaceutical compositions of the present invention may be prescribed in various ways depending on factors such as the formulation method, mode of administration, age, weight of the patient, pathological condition, food, time of administration, route of administration, rate of excretion and response to reaction. Can be.
  • the dosage of the pharmaceutical composition of the present invention is in the range of 0.00001-100 nig / kg on an adult basis.
  • compositions of the present invention may be prepared in unit dosage form by formulating with a pharmaceutically acceptable carrier and / or excipient according to methods which can be easily carried out by those skilled in the art. Or may be prepared by incorporation into a multi-dose container.
  • the formulation may be in the form of solutions, suspensions, syrups or emulsions in oils or aqueous media, or may be in the form of extracts, powders, powders, granules, tablets or capsules, and may further comprise dispersants or stabilizers.
  • the adjuvant of the present invention When the adjuvant of the present invention is provided as a food composition, the adjuvant of the present invention may be expressed as a "food composition for immune enhancement".
  • composition of the present invention is prepared as a food composition, as an active ingredient, as well as the chunggukjang ethanol-dissolving extract, as well as components commonly added during food production, for example, proteins, carbohydrates, fats, nutrients, seasonings And flavoring agents.
  • carbohydrates include monosaccharides such as glucose, fructose and the like; Disaccharides such as maltose, sucrose, oligosaccharides and the like; And sugars such as conventional sugars such as polysaccharides such as dextrin, cyclodextrin, and xyl, sorbitol, and erythritol.
  • natural flavoring agents [tautin, stevia extract (for example, rebaudioside A, glycyrrhizin, etc.) and synthetic flavoring systems (saccharin, aspartame, etc.) can be used.
  • the present invention when the food composition of the present invention is prepared with a drink, in addition to the ethanol-dissolving extract of the present invention, citric acid, liquid fructose, sugar, glucose, acetic acid, malic acid, fruit juice, tofu extract, jujube extract, licorice extract, etc.
  • the present invention relates to an immunogenic protein and an insoluble extract of Cheonggukjang ethane as an enteroimmune adjuvant. It provides a vaccine composition for oral administration for inducing systemic and intestinal immunity comprising.
  • the present invention provides a method of administering an oral vaccine composition comprising (a) an immunogen protein and (b) an ethanol-soluble component of chungkookjang in an extract. It provides a method for inducing whole body immunity or enteroimmune reaction.
  • the term 'immunogen protein' refers to an epitope, peptide or protein that induces an immune response of a recipient, which is common to that described in the 'immunogen' of the present invention described above, and thus description thereof is omitted to avoid excessive duplication.
  • Suitable dosages of the pharmaceutical compositions of the present invention may vary depending on factors such as the formulation method, mode of administration, age, weight, sex, morbidity, food, time of administration, route of administration, rate of excretion and reaction in response to the patient. It may be prescribed.
  • the oral dosage of the pharmaceutical composition of the present invention is preferably 0.001-10000 mg / kg (body weight) per day.
  • Pharmaceutically acceptable carriers included in the vaccine of the present invention are conventionally used in the preparation, lactose, dextrose, sucrose, sorbbi, manny, starch, acacia rubber, phosphate, alginate gelatin, silicic acid.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may further include a lubricant, a humectant, a sweetener, a flavoring agent, an emulsifier, a suspending agent, a preservative, and the like.
  • Vaccine compositions according to the present invention can be formulated using calcifying agents or excipients, such as laminants, extenders, binders, wetting agents, disintegrating agents, surfactants, etc., which are commonly used pharmaceutically.
  • a formulation for oral administration For example, it is preferable to formulate into solid preparations for oral administration such as tablets, pills, powders, granules and capsules, or liquid preparations such as suspensions, liquid solutions, emulsions and syrups.
  • the vaccine composition according to the invention may contain one or more excipients, for example starch, calcium carbonate: ⁇ —Lc—ium carbonate. Lactose, gelatin and the like can be combined.
  • various excipients such as wetting agents, sweeteners, fragrances, preservatives, etc., in addition to water or liquid paraffin may be mixed in the vaccine composition according to the present invention.
  • the present invention provides a systemic immune and enteroimmune response induction method comprising administering to the subject a systemic immune and enteroimmune adjuvant, a vaccine or the adjuvant or vaccine comprising-solubilizing extract as an active ingredient do.
  • Cheonggukjang ethane of the present invention-immune adjuvant containing a dissolving extract is free of toxicity and side effects by using a stable food material can provide a low production cost and ease of use.
  • the adjuvant of the present invention is effective for inducing Th2 reaction against parenteral infectious pathogenic microorganisms, viruses, cancer antigens and general antigens as well as oral infectious pathogenic microorganisms upon oral administration with antigens (blood IgG and small intestine IgA). ) Can be produced.
  • FIG. 1 is a graph showing IFN- ⁇ production when splenocytes of C3H / He mice orally administered with an immunogen (KLH) and an adjuvant (Cheonggukjang or CT) in the presence of KLH.
  • KLH immunogen
  • CT adjuvant
  • FIG. 2 is a graph showing IL-12 production when splenocytes of C3H / He mice orally administered with an immunogen (KLH) and an adjuvant (Cheonggukjang or CT) in the presence of KLH.
  • a, b and c represent the statistical significance of each experimental group at the PO.05 level.
  • Figure 3 is a graph showing the production of IL ⁇ 4 when splenocytes of C3H / He mice orally administered with an immunogen (KLH) and an adjuvant (Cheonggukjang or CT) in the presence of KLH.
  • a and b represent the statistical significance of each experiment at the PO.05 level.
  • FIG. 5 is a graph of the total IgG antibody in the serum of C3H / He mice orally administered with an immunogen (KLH) and an adjuvant (Cheonggukjang or CT), a and b are statistical significance of each experimental group at the PO.05 level Indicates.
  • FIG. 6 is a graph of serogenous antigen specific IgG antibodies of C3H / He mice orally administered with an immunogen (KLH) and an adjuvant (Cheonggukjang or CT).
  • KLH immunogen
  • CT adjuvant
  • FIG. 8 is a graph of the analysis of antigen-specific IgA antibodies produced in the small intestine of C3H / He mice orally administered with an immunogen (KLH) and an adjuvant (Cheonggukjang or CT). a and b represent the statistical significance of each experiment at the PO.05 level.
  • Figure 9 is a graph of T cell proliferation activity analysis of splenocytes of C3H / He mice orally administered with an immunogen (KLH) and an adjuvant (Cheonggukjang or CT) in the presence of KLH.
  • KLH immunogen
  • CT adjuvant
  • FIG. 10 is a graph showing the results of the ⁇ analysis on the splenocytes of the mouse.
  • a material which is expected to have an immune enhancing effect from 20 kinds of natural products was selected in the Ax vivo test system.
  • the spleens of BALB / c mice (6 weeks old, males) were extracted, and a material for increasing immune activity was searched using the primary culture system of the extracted splenocytes.
  • ConA Concanaval in A, 1 ⁇ g / ⁇
  • LPS Li popo 1 ysacchar i des, 25 ⁇ g / m ⁇
  • natural extract RPMI-1640 medium (10% FBS, 100 units / mi penicillin, 100 / mi streptomycin and 2 mM L-glutamine).
  • 2 m / MTT 3- (4, 5-dimethylthiazolyl-2) -2, 5-diphenyltetrazolium bromide, Sigma
  • Example 4 Isolation and Characteristics of Cheonggukjang Strains Strains as shown in Table 3 were isolated from Cheonggukjang obtained commercially, and each was used to prepare Cheonggukjang.
  • 500 g of selected soybeans were immersed at room temperature for 12 hours, steamed at 114 ° C. for 50 minutes, cooled to 50 ° C., and cultured with TBS (tryptic soy broth) (37 ° C., 24 hours).
  • the culture solution was inoculated with l% (v / w) of soybean and fermented at 37 ° C. for 48 hours, and enzyme activities of ⁇ -amylase, ⁇ -amylase and protease of each strain were measured.
  • Example 4-1 ⁇ -amylase enzyme activity measurement
  • 603 (1954) was modified and measured. 5 mL of 0.04 M potassium phosphate buffer (H 5.9) and 1 mL of crude enzyme solution were added to 5 mL of 0.5% starch solution, followed by reaction at 25 ° C. for 10 min. 1 mL of the reaction solution was added to a test tube containing 10 mL of 0.5% iodine solution, and then the hop intensity (A 660 ) was measured at 660 .
  • the enzyme activity unit was defined as the amount of enzyme required to reduce A 660 in starch-iodine solution by 1% at pH 5.9, 25 ° C. for 1 minute.
  • ⁇ -amylase activity was measured by dinitrosalicylic acid method (Bernfeld, P., Methods in Enzymology 1: 149-158 (1955)). Using 1% soluble starch as a substrate, mix the crude enzyme solution with l: l (v: v) at 20 ° C After reaction for 10 minutes, the same amount of DNS reagent was added, and the mixture was heated in boiling water for 15 minutes. After heating reaction, the mixture was cooled in cold water and distilled water was added to measure absorbance at 540 nm. Maltose was used as a standard. The enzyme activity unit was defined as the amount of enzyme required to produce 1 mg maltose for 3 minutes at pH 4.8, 20 ° C. Example 4-3. Determination of Protease Enzyme Activity
  • Protease activity was measured by some modification of Anson's method (J. General Physiology 22: 79-89 (1938)). 1.5 mL of 0.6% casein and 0.5 mL of crude enzyme solution were added to 1 mL of 0.1 M potassium phosphate buffer (pH6.8) and reacted for 30 minutes at 37 ° C. After reaction, 3 mL of 0.4 M TCA was added, and the reaction reaction was stopped by leaving it for 10 minutes in the silver. The reaction solution was centrifuged (10,000 rpm, 10 minutes), and then, 1 mL of the supernatant was added with 5 mL of CK4 M Na 2 CO 3 and 1 mL of IN phenol, followed by color development at 40 ° C. for 30 minutes. . Tyrosine was used as a standard and the enzyme activity unit was defined as the amount of enzyme required to release 1 ug of tyrosine for 1 minute.
  • Bacillus wethylotrophicus Bacillus wethylotrophicus Bacillus atrophaeus Bacillus tequilensis Bacillus tequilensis Bacillus subtilis subsp. Bacillus wethylotrophicus
  • the cell proliferation activity of the sample was highest in the spleen cell proliferation activity of the Cheonggukjang extract prepared with Bacillus amyloliquipecice ⁇ Bac i 1 his amylol iquefaciens—the most likely to be used as an adjuvant (Table 1). 5).
  • C3H / He (6-week-old male) mice were treated orally with Chonggukjang ethanol-dissolved extracts as an adjuvant.
  • Immunized C3H / He mice were divided into 4 groups of 5 mice each to oral administration of antigen and adjuvant.
  • KLH eyhole Limpet Hemocyanin
  • Group 1 is physiological saline
  • Group 2 is KLH (50 ' g / H) and physiological saline
  • Group 3 is KLH (50 zg / H) and Cheonggukjang ethane-dissolved extract (2.8 mg / H)
  • KLH (50; wg / H) and CT (10 / HK / g / Head) were administered orally twice a week for 4 weeks for 4 weeks, followed by oral intravenous infusion for the next week for 5 days. Blood was collected and its serum was separated and stored at 70 ° C until analysis. Finally, IgG antibodies in the collected blood serum were analyzed by ELISA (Enzyme-l inked immunosorbent assay).
  • the top 10 cm was homogenized for 1 minute with a homogenizer for 10 minutes at 10,000 xg at 4 ° C. Centrifugation. The supernatant was recovered after centrifugation and analyzed by IgA by ELISA.
  • splenocytes were incubated with immunogens (KLH), and the supernatants were recovered and analyzed for cytokines by ELISA. Cytokine Analysis
  • KLH was orally administered with ethanol-dissolving extract of Cheonggukjang, and spleens of mice were collected and collected by treatment groups to culture single cells.
  • the cell culture was incubated at a concentration of 5 10 6 cells per well in a 24 well plate, and the reaction was induced by dividing the medium into the medium without the immunogen and the medium containing the immunogen to observe the difference.
  • Immunogen was given 100 / ⁇ £ per well for KLH.
  • Cells were incubated for 48 hours (Thl cytokines) and 72 hours (Th2 cytokines) for cytokine analysis to obtain cultures free of cells and stored at -70 ° C until analysis.
  • Cytokine analysis was performed according to the kit's protocol using a cytokine assay kit from BD Biosciences (USA).
  • anti-cytokine antibodies were placed in 96-well plates, left overnight at 4 ° C, washed three times with PBST (Phosphate Buffered Saline-Tween20) and PBS (Phosphate) with 10% FBSCFetal Bovine Serum (PBS). Buffered Saline) was blocked for 1 hour. After washing three times with PBST, the cell culture was added and reacted for 2 hours at the silver.
  • PBST Phosphate Buffered Saline-Tween20
  • PBS Phosphate
  • the cells were washed 5 times with PBST and treated with biotin-coupled anti-cytokine and streptavidin-bound HRP (Horse Radish Peroxidase) and reacted for 1 hour.
  • the wells were washed 7 times with PBST, and then absorbance was measured by treating the substrate by the same method as the above ELISA.
  • Thl cytokines IFN- ⁇ and IL-12
  • IFN- ⁇ had little numerical difference in IFN-Y in splenocyte cultures of mice orally administered with adjuvant with KLH.
  • the value of -12 was increased in the treatment group administered orally with the Chungguk ethanol-soluble extract and KLH (Figs. 1 and 2).
  • Th2 cytokines high IL-4 and IL-5 levels were observed in splenocytes of mice treated with Cheongguk ethane-dissolved extract and KLH compared to mice administered orally with KLH (FIGS. 3 and 4). .
  • humoral immunity which is particularly active as a result of particularly active Th2 reaction, increased the production of specific antibodies, and in particular, IgA antibody production in the small intestine by IL-5 was effectively induced. This can be seen from the results, which will be described later (Fig. 8).
  • Anti-mouse IgG (SIGMA, South Korea) was placed in a 96 well plate at a concentration of 2 ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ , left overnight at 4 ° C, and then serum was diluted 1 / 10,000 with PBST. Reaction was carried out for 1 hour.
  • Anti-mouse IgG-HRP conjugate (SIGMA A-2304) was added 1 / 30,000 times with PBST and added to the plate 100 times per well, and then reacted at room temperature for 1 hour. Finally, ⁇ (3, 3 ', 5,5'-Tetramethylbenzidine) and 3% 3 ⁇ 40 2 were treated to react for 30 minutes, the reaction was stopped with 2 MH 2 S0 4 and absorbance was measured at 450 nm.
  • Immunogen was added to a 96 well plate at a concentration of 2 // g / m and reacted overnight at 4 ° C., and then serum of 1 / 3,000 dilution with PBST was added at 100 ⁇ per well, followed by reaction at room temperature for 1 hour. After reaction, the anti-mouse IgG-HRP conjugate (SIGMA, USA) was diluted 1 / 10,000 with PBST, added 100 per well, and reacted at room temperature for 1 hour. Finally, the reaction was stopped for 30 minutes by adding TMB and 3% 3 ⁇ 40 2 in the light shielding state, and the reaction was stopped by adding 2 MH 2 SO 4 and the absorbance was measured at 450 nm.
  • SIGMA anti-mouse IgG-HRP conjugate
  • this activity means that even if the pathogens or even cancer-associated antigens, which are not orally infected, or even cancer-related antigens, are administered orally with the Chungkookjang ethanol-dissolving extract, it is possible to induce the production of specific IgG antibodies in the blood. It is expected. # Analysis of IgA
  • Anti-mouse IgA (BD biosciences, USA) was added to a 96 well plate at a concentration of 2 ⁇ g
  • Small intestine samples (supernatant after centrifugation of homogenized small intestine) were added 1 / 1,000 times with PBST containing 10% FBS, added 100 ⁇ per well, and reacted at room temperature for 1 hour.
  • anti-mouse IgA-biotin conjugates (BD biosciences, USA) were added to PBST at a concentration of 0.5 l ⁇ i, added 100 per well, and reacted at room temperature for 1 hour.
  • avidin-peroxidase (avidin-peroxidase, SIGMA, USA) was added to 100B per well at 200 ng / iiii concentration, and reacted at room temperature for 1 hour. TMB and 3% 3 ⁇ 40 2 were treated in a shaded state and reacted at room temperature for 30 minutes, and 2 MH 2 SO 4 was added 50 ⁇ per well to stop reaction. The results were analyzed by measuring absorbance at 450 nm.
  • mice orally administered KLH and Cheonggukjang ethane-dissolved extracts did not differ from the experimental group orally administered with KLH alone. But there was a significant increase (FIG. 7). Immunogen Specific IgA Analysis
  • Immunized immunogen (KLH) in 96 well plates was added at a concentration of 2 g
  • mice For cell proliferation activity experiments, spleens of mice were collected, collected by treatment groups, unicellularized, and cultured splenocytes followed by ⁇ analysis. Seeds in 96 well plates were 5 ⁇ 10 6 cells / mi per well. At this time, OVA, ConA or natural product extracts were added to RPMI-1640 medium (10% FBS, 100 units / m ⁇ penicillin, 100 / zg / m ⁇ strapomycin and 2 mM L-glutamine). After 44 hours of incubation, 2 nig / m of MTT was treated with 20 ⁇ per well and allowed to stand for 4 hours in a C0 2 incubator at 37 ° C. 0.01 M HC1 containing 10% SDS was added to 100 ⁇ per well, and then reacted overnight at 37 ° C. C0 2 incubator and absorbance was measured at 570 nm.
  • RPMI-1640 medium 10% FBS, 100 units / m ⁇ penicillin, 100 / zg /
  • Cheonggukjang prepared in Bacillus amyloliquipeciency ⁇ was found to be the most excellent immune enhancing efficacy in the above Example.
  • 1000 ml of distilled water or 70% ethane was added and extracted by microwave treatment at 90 W for 5 minutes, followed by centrifugation for 20 minutes at 10 ° C and 8000 rpm for 12 hours. Recovered. The recovered supernatant was lyophilized and used as a sample.
  • Cheonggukjang ethanol-dissolving extract referred to throughout this specification is an extract from which components such as polyglutamic acid (PGA) and Levan are removed because they are soluble in ethanol.
  • PGA polyglutamic acid
  • Levan Levan
  • ethanol is treated to a sample, and the precipitate formed therefrom is further purified by PGMBioscience, Biotechnology, and Biochemistry, Vol 65, 516-521, 2001) or Levan (Clinical & Experimental allergy). Vol 36, 94-101).
  • the immune enhancing efficacy of the extract of Chunggukjang was measured using ⁇ assay similar to Example 2 above.
  • the spleens of the mice were extracted and unicellularized, and the splenocytes were cultured.
  • Cell culture was adjusted to a concentration of IX 10 6 cells / ml, cells were divided into 200 u 1 cells in 96 well plates, and cultured by dividing the medium with or without the Cheonggukjang extract.
  • Cheonggukjang extract was incubated in 100 ⁇ g / ml per well. After 72 hours of incubation, 2 ⁇ / MTT was added to 20 ⁇ per well and placed at 37 ° C, CO 2 incubator for 4 hours. After 4 hours, 0.01 M HC1 containing 10% SDS was added to 100 ⁇ per well, and then left overnight in a 37T :, C0 2 incubator and the absorbance was measured at 595 nm.

Abstract

본 발명은 청국장 에탄올 용해(ethanol-soluble) 추출물을 유효성분으로 포함하는 전신면역 및 장관면역 보강제에 관한 것으로, 본 발명의 청국장 에탄올 용해(ethanol-soluble) 추출물을 포함하는 면역보강제는 안전성이 확보된 식품소재를 사용함으로써 독성 및 부작용이 없으며, 저렴한 생산비용과 사용의 편이성을 제공할 수 있다. 또한, 본 발명의 면역보강제는 면역원과 경구투여 시 경구감염성 병원성 미생물은 물론 비경구감염성 병원성 미생물이나 바이러스, 암 항원, 일반 항원 등에 대하여도 Th1 및 Th2 반응을 유도하며 효과적인 특이항체 (혈중 IgG 및 소장 IgA)를 생산할 수 있다.

Description

【명세서]
【발명의 명칭】
청국장 추출물을 유효성분으로 포함하는 전신껸역 또는 장관면역 보강제
【기술분야】
본 발명은 대한민국 농촌진흥청의 지원 하에서 과제번호 PJ008325 에 의해 이루어진 것으로서, 상기 과제의 연구관리전문기관은 농촌진흥청， 연구사업명은 "차세대바이오그린 21 사업" ， 연구과제명은 "A 형 간염 백신용 adjuvant 의 최적화" ， 주관기관은 한국식품연구원, 연구기간은 2011. 08. 01 ~ 2012. 12. 31 이다.
또한 본 발명은 대한민국 지식경제부의 지원 하에서 과제번호 E0121501 에 의해 이루어진 것으로서， 상기 과제의 연구관리전문기관은 한국식품연구원， 연구사업명은 "한국식품연구원 주요사업" ， 연구과제명은 "천연물소재의 T 세포제어활성을 이용한 항알레르기 식품개발 연구" , 주관기관은 한국식품연구원, 연구기간은 2012.01.01 - 2012. 12. 31이다. 본 특허출원은 2012 년 3 월 28 일에 대한민국 특허청에 제출된 대한민국 특허출원 제 10—2012-0031749호 및 2013년 2월 21일에 대한민국 특허청에 제출된 대한민국 특허출원 제 10-2013-0018895 호에 대하여 우선권을 주장하며， 상기 특허출원의 개시 사항은 본 명세서에 참조로서 삽밉된다.
본 발명은 청국장 추출물을 유효성분으로 포함하는 전신면역 또는 장관면역 보강제에 관한 것이다. 【배경기술】
안정성을 고려하여 백신의 개발 시 면역 효과가 줄어드는 문제점이 나타나며， 면역반웅의 효과를 증진시키는 백신의 제조에 문제점을 발생시킨다. 이와 같은 문제의 해결책으로 적은 양의 면역원에 신속하고 강력하게, 그리고 장시간 유지시켜주어 항원에 대한 면역반웅을 증진시키는 면역보강제 (adjuvant)의 개발이 이루어지고 있다. 현재 까지 알려진 면역보강제로는 무기물 염 (예컨대 , 알루미늄 히드록사이드， 알루미늄 포스페이트 및 칼슘 포스페이트)， 면역자극제 ; 사이토카인 (예컨대， IL-2, IL-12, GM-CSF, IFN- α , IFN-y 및 IL-18), 생체분자 (예컨대, CD40, CD154, MHC 타입 1 불변부 고리 (invariant chain) 및 LFA( lymphocyte function-associ ted antigen)3), 사포닌 (예컨대， QS21), MDP(N-acetyl-muramyl-L-alanine-D-isoglutamine) 유도체 , CPG-DNA(CpG o 1 i godeoxynuc 1 eot i des ) , LPS(Lipopolysacchar ides) , MPL (Monophosphoryl Lipid A), 폴리포스파젠 (polyphosphasenes), 지방질 입자 (예컨대, Freund, SAF(Syntex Adjuvant Formulation) 및 MF59); 리포좀， 비로좀, 이스콤 (iscoms,. Immune Stimulating Com lexes) , 공동—킬레이터; PLG(polylactide-co-glycol ides) 미세입자， 폴리사머 (poloxamers) , 바이러스 (예컨대， HBcAg, HCcAg 및 HBsAg), 표면 활성제 (surface active agents) 및 프로인트 (Freund ' s) 면역보강제 또는 비브리오 콜레라 톡신， 돌연변이 록신 (예컨대, LTK63 y LTR72) 및 대장균 엔테로톡신 (enterotoxins)과 같은 다양한 박테리아 산물을 포함할 수 있으며 이에 한정되지 않는다.
현재 알루미늄염， 칼슘염, CpG-DNAᅳ LPS, MPL 등 많은 면역보강제의 개발 및 연구가 이루어지고 있지만， 다양한 부작용을 유발함으로써 안전성에 문제점이 있다. 즉， 면역보강제는 면역보강효과 이외에도 안전성의 측면에서 독성이 없어야하며， 생체분해성이 좋고 안정적이며, 가격이 저렴하며， 사용하기에 편리하여야 한다. 현재 사용되는 면역보강제 중 Freund 's adjuvant 는 가장 널리 이용되고 있지만 인체에 사용할 수 없으며, 알리미늄염은 인체에 사용할 수 있지만 그 효과가 Freund's adjuvant 보다 떨어진다 ((FVeunds, J. et.al. , Soc. Exp. Biol Med. 37, 509 (1937) 및 Gupta, . K. et . al . , Vaccine 11, 293-306 (1993)).
소장을 중심으로 하는 장관의 면역 기능을 장관면역이라 하며， 초유나 육즙을 '통한 신생아의 면역기능 강화 또는 유산균의 섭취로 장내 면역기능의 증진 등과 같이 간편하게 구강투여로 면역증진을 활성화시킬 수 있기 때문에 근래 많은 각광을 받고 있다. 1 차 및 2 차로 나누어지는 림프조직계에서 2 차 림프조직계로 분류되는 장관면역은 점막림프기관 중 장관의 점막 부위에 존재하며, 장관면역계 내 IgA 반웅을— -비롯하여 생체방어에 대단히 중요한 역할을 담당한다 (Bienestock, J. et . al., Immunol. , 41， 249-270(1980)).
또한 경구 면역보강제로 사용되는 CT(Cholera Toxin), ΙΊ(Ε. coli heat-labile enterotoxin) 등은 자체적으로 독성을 나타내기에 안정성 및 효율성을 갖추고 있는 면역보강제의 개발이 필요하다 (Kim, S. H. et. al., J Plant Biotechnol. , 37, 283-291(2010)). 본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야와 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
【발명의 내용】
【해결하고자 하는 과제】
본 발명자들은 안전성이 우수하면서, 저렴한 생산비용 및 사용의 편의성을 갖는 경구용 장관면역 보강제를 개발하고자 예의 노력하였다. 그 결과， 청국장 추출물을 면역보강제로 이용할 경우, 효과적으로 Thl 및 Th2 면역반웅을 유도， 특히 Th2 면역반웅을 효과적으로 유도하여 면역원 특이적인 면역반웅을 유도하여 백신 효능을 크게 향상시킬 수 있음을 규명함으로써, 본 발명을 완성하였다.
따라서， 본 발명의 목적은 전신면역 또는 장관면역 보강제를 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 경구투여용 백신 조성물을 제공하는데 있다. 본 발명의 또 다른 목적은 전신면역 또는 장관면역 반웅을 유도하는 방법을 제공하는데 있다. 본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다. 【과제 해결 수단】
본 발명의 일 양태에 따르면， 본 발명은 청국장 추출물을 유효성분으로 포함하는 전신면역 또는 장관면역 보강제 (adjuvant)에 있어서, 상기 청국장 추출물은 에탄올을 이용하여 추출된 에탄을 -용해 (ethanol- soluble) 성분을 포함하는 것을 특징으로 하는 전신면역 또는 장관면역 보강제 (adjuvant)를 제공한다.
본 발명의 다른 양태에 따르면， 본 발명은 청국장의 에탄올 추출물 중에서 에탄올 -용해 (ethanol-soluble) 성분을 포함하는 조성물을 대상 (subject)에 투여하는 단계를 포함하는 전신면역 또는 장관면역 반웅 유도 방법올 제공한다. 본 발명자들은 안전성이 우수하면서， 저렴한 생산비용 및 사용의 편의성을 갖는 경구용 장관면역 보강제를 개발하고자 예의 노력하였다. 그 결과， 에탄올을 이용하여 추출된 에탄올 용해 (ethanol-soluble) 성분을 포함하는 청국장 추출물을 면역보강제로 이용할 경우， 효과적으로 Thl 및
Th2 면역반웅을 유도， 특히 Th2 면역반웅을 효과적으로 유도하여 면역원 특이적인 면역반웅을 유도하여 백신 효능을 크게 향상시킬 수 있음을 규명하였다.
본 발명에서 이용되는 청국장 (Cheonggukjang)은 청국장균, 예를 들어, 바실러스 (예컨대， 바실러스 아밀로리퀴페시언스， 바실러스 메틸로트로피커스 바실러스 애트로패우스 바실러스 테퀼렌시스， 바실러스 서브틸리스 및 바실러스 메틸로트로피커스) 또는 코커리아 (예컨대, 코커리아 살시샤)를 증자대두에 접종하여 발효 숙성시켜 제조된 대한민국 전통 발효식품이다. 청국장은 대한민국의 다른 전통 발효식품과 유사하지만， 된장이 증자대두를 발효함에 있어 소금을 사용하여 40-60 일 동안 발효하는데 비하여 , 청국장은 소금을 사용하지 않고 약 40oC 에서 단지 2-3 일의 짧은 발효 기간을 통해 제조한다. 청국장은 대한민국에서 일상적으로 섭취하는 식품으로， 면역보강제로 개발함에 있어서 안정성 문제 및 섭취량에 따르는 부작용이 없으며， 사용이 편리하고， 가격이 저렴할 뿐만 아니라 면역증강 효과가 우수하여 면역보강제로서의 개발에 매우 적합한 특징을 가지고 있다. 본 발명에서 이용되는 유효성분은 청국장 (예컨대, 청국장 분말)에 에탄을을 처리하여 추출된 에탄올 용해 (ethanol-soluble) 성분이다. 따라서, 본 발명에서 이용되는 유효성분을 "청국장 에탄올 -용해 추출물" 로 줄여서 기재한다.
본 발명의 조성물에서 이용되는 청국장 에탄올 -용해 추출물은 에탄을 용매를 처리하여 얻은 결과물에서 침전이 아닌 에탄을 용해 (ethanol- soluble) 성분들을 포함하는 분획이다. 예를 들어, 에탄올 용매를 청국장에 처리하고 원심분리를 하면 에탄올 용해 (ethanol-soluble) 성분들과 침전물이 형성되며， 상기 침전물이 제거된 에탄을 추출물이 본 발명의 가장 바람직한 청국장 에탄올 -용해 추출물이다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 청국장 에탄올 -용해 추출물을 제조하기 위하여 이용되는 에탄올은 50-99% 에탄올이다. 사용되는 에탄을의 농도가 50% 미만이면, 상기 에탄을 -용해 성분들이 에탄올에 층분히 용해되지 못하는 문제가 있고, 에탄을의 농도가 99%를 초과하면 에탄을 용매의 가격이 너무 고가이고 농도의 증가에 따른 추출 효율이 거의 변화가 없는 문제점이 있다. 보다 바람직하게는 이용되는 에탄올의 농도는 50-85%, 50-80%, 50-75%, 50-70%, 50-99%, 60-85%, 60-80%, 60-75% 또는 60-70%이다. 본 명세서에서 사용되는 용어 '추출물' 은 상술한 바와 같이 당업계에서 조추출물 (crude extract)로 통용되는 의미를 갖지만， 광의적으로는 추출물을 추가적으로 분획 (fractionation)한 분획물도 포함한다. 즉, 청국장 에탄올—용해 추출물은 에탄올 용매를 이용하여 얻은 것뿐만 아니라， 여기에 정제과정을 추가적으로 적용하여 얻은 것도 포함한다. 예컨대, 상기 추출물올 일정한 분자량 컷 -오프 값을 갖는 한외 여과막을 통과시켜 얻은 분획， 다양한 크로마토그래피 (크기， 전하， 소수성 또는 친화성에 따른 분리를 위해 제작된 것)에 의한 분리 등， 추가적으로 실시된 다양한 정제 방법을 통해 얻어진 분획도 본 발명의 청국장 에탄올- 용해 추출물에 포함되는 것이다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면， 본 발명에서 유효성분으로 이용되는 청국장 에탄올 -용해 추출물은 PGA(poly-x -glutamic acid)가 제거된 추출물이며， 보다 바람직하게는 PGA(poly-y -glutamic acid) 및 레반 (Levan)이 제거된 추출물이다. 본 명세서에서 PGA(poly-Y -glutamic acid)를 언급하면서 사용되는 용어 "제거 (removal)"는 청국장 에탄올 -용해 추출물에서 PGA 가 실질적으로 (substantially) 검출되지 않는 상태를 의미한다. 예를 들에 청국장 에탄을 -용해 추출물을 젤에서 전기영동 하고， 이 젤을 PGA 염색 다이 (staining dye)인 메틸렌블루로 염색한 경우， 염색되는 띠 (band)가 육안으로 관찰되지 않으면， 청국장 에탄올 -용해 추출물은 PGA 가 제거되었다고 정의 (define) 할 수 있다.
본 명세서에서 레반 (levan)을 언급하면서 사용되는 용어 "제거 (removal)"는 청국장 추출물에서 레반이 실질적으로 (substantial ly) 검출되지 않는 상태를 의미한다. 예를 들어， 청국장 에탄올 -용해 추출물을 과요오드산으로 산화시킨 후, 쉬프 (Schiff) 시약과 반응시켜, 적색 또는 적자색으로 발색되는 것이 육안으로 관찰되지 않으면， 청국장 에탄을 -용해 추출물은 레반이 제거되었다고 정의 (define) 할 수 있다.
본 발명에서 가장 바람직한 유효성분으로서의 청국장 에탄을 -용해 분획의 이용은， 본 발명자들이 아는 한 (to our best knowledge), 기존의 종래기술들과는 반대되는 접근 방식이다. 종래기술에 따르면, 청국장 추출물의 면역 증강 유효성분은 폴리 γᅳ글루탐산 (PGA) 및 레반 (Levan)으로 공지되어 있고 이러한 유효성분을 얻기 위하여， 70% 에탄올을 청국장 등의 시료에 처리하고, 이로부터 형성된 침전물을 추가적으로 정제하여 PGA또는 레반을 얻고 있다. 그러나， 본 발명에서는 이와는 완전히 반대되는 접근 방식으로서 청국장의 에탄올 용해 분획을 이용한다.
본 발명에서 이용되는 청국장은 다양한 미생물을 이용하여 제조될 수 있지만, 가장 바람직하게는 바실러스 아밀로리퀴페시언스^ 이용하여 제조된 것이다. 하기의 실시예에서 입증된 바와 같이, 바실러스 아밀로리퀴페시언스를 이용하여 청국장을 제조하는 경우， 청국장의 조효소액 중 α-아밀라아제, β-아밀라아제 및 프로테아제 효소 활성이 매우 우수할 뿐만 아니라, 비장세포 증식활성이 매우 우수하다.
본 명세서에서, 용어 '면역보강제' 는 의약 (drug) 또는 백신 (vaccine)과 같은 물질의 효과에 변화를 가하는 약제학적 또는 면역학적 물질로써， 면역보강제 자신은 어떠한 직접적인 효과를 갖지 않는다. 대개 백신 조성물에 포함되어 감염된 외부 물질을 최소로 보호하면서 제공된 항원에 대한 수용자 (recipient)의 면역반응을 증가시키는 역할을 한다. 면역보강제는 백신에 첨가되어 항원을 타겟하는 면역계의 반웅을 자극하며， 그 자신은 면역성을 갖지 않는다. 면역보강제는 면역계에 항원을 제시하는데 다양한 방식으로 작용할 수 있다.
본 명세서， 용어 '면역원' 은 수용자의 면역반응을 유도하는 물질로
'항원' 과 동일한 의미를 갖는다. 본 발명에서 이용될 수 있는 바이러스 병원체 항원의 예는 인플루엔자 바이러스와 같은 Orthomyxoviruses; RSV(respiratory syncytial virus) , SIV(simian immunodeficiency virus) 및 HIV 와 같은 레트로바이러스; EBV(Epstein-Barr Virus)와 같은 Herpesviruses； CMV( cytomegalovirus) 또는 HSV(herpes simplex virus)； Lent i viruses; 광견병 (rabies)와 같은 Rhabdovi ruses； 폴리오바이러스와 같은 Picomovi ruses; 백入 ]니아와 같은 Poxviruses; Rotavirus; 및 Parvoviruses 로부터 유래된 항원을 포함한다. 보다 구체적으로, 바이러스 병원체 항원의 예는 HPV 항원의 예는 HPV 의 LI, L2, E6 또는 E7 단백질; HIV 의 항원의 예는 nef, p24, gpl20, gp41, tat, rev, pol, env 및 g l20 의 T 세포와 B 세포 에피토프 (Palker et al, J. Immunol., 142:3612- 3619(1989))을 포함한다. HBV 의 표면 항원의 예는 Wu et al , Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 86 :4726-4730(1989)에 개시되어 있다. 로타바이러스의 항원의 예는 VP4(Mackow et al, Proc. Natl. Acad. Sci. , USA, 87:518- 522(1990)) 및 VP7(Green et al , J. Virol. , 62: 1819- 1823(1988)를 포함하며;， 인플루엔자 바이러스 항원은 헤마글루티딘 (hemagglutinin: HA) 및 뉴클레오단백질을 포함하고; HSV 항원은 티미딘 키나아제를 포함하며 (Whitley et al , In: New Generation Vaccines, pages 825—854); 조류 인플루엔자 바이러스 항원은 헤마글루티딘을 포함하고; 돼지 콜레라 바이러스 항원은 엔벤로프; 구제역 바이러스 항원은 엔벨로프; 그리고 뉴캐술바이러스 항원은 丽 (Hemagglutinin-neuraminidase), F (Fusion protein)을 포함한다.
본 발명에 이용될 수 있는 박테리아 병원체 항원의 예는 Mycobacterium sp . , Helicobacter pylori , Salmonella spp. , Shigella spp. , E. col/, Rickettsia spp. , Listeria spp. , Legionella pneumoniae, Pseudo onas spp. , Vibrio spp.— / / 으로분 항원을 포함한다. 구체적으로， 본 발명에 이용될 수 있는 박테리아 병원체 항원의 예는 Shigella sonnei≤1 form-1 항원 (Formal et al , Infect . Immun. , 34:746-750(1981))； V. cholerae 으항원 (Forrest et al , J. Infect. Dis. 159:145-146(1989)； E. coli 의 FA/I 섬모항원 (f imbrial anti en)(Yamamoto et al, Infect. Immun., 50 :925-928 (1985))과 열민감성 독소의 비독성 B- 서브유니트 (Klipstein et al , Infect. Immun. , 40:888-893 (1983))； Bordetella pertussis ·≥ 퍼택틴 (pertact in)(Roberts et al, Vacc. , 10:43一 48(1992))； B. pertussis 의 아데닐레이트 사이클라아제 -헤모라이신 (Gui so et al, Micro. Path. , 11:423431(1991))； 및 Clostridiun] tetani 의 테타너스 독소의 단편 CXFairweather et al, Infect. Immun. , 58 :1323- 1326(1990))을 포함한다.
본 발명에 이용될 수 있는 기생층 항원의 예는 Plasiwdhun spp. , Trypanosowe spp . , Giardia sp . , Boophilus spp . , Babesia sp . , Entamoeba spp. , Eimeria spp. , Laishmania spp. , Schistosome spp. , Brugia spp. , Fascida spp. , Dirofi laria spp. , uchereria spp. , 및 Onchocerca spp.으로부터 유래된 항원을 포함한다. 보다 구체적으로， 본 발명에 이용될 수 있는 기생층 항원의 예는 Plasniodhun bergerii 의 circumsporozoite 항원 및 P. falciparum의 circumsporozoite 항원과 같은 Plasmodium spp.의 circumsporozoite 항원 (Sadoff et al, Sci . , 240 ·" 336- 337 (1988))； Plasmocjium 쒜^ merozoite 표면 항원 (Spetzler et al, Int. J. Pept. Prot. Res. , 43:351-358 (1994))； Entamoeba histolytica 의 갈락토오스 특이 렉틴 (Mann et al, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 88:3248- 3252 (1991))； Leishmania spp.의 gp63(Russel 1 et al, J . Immunol . , 140:1274-1278 (1988))； Brugia malayi 의 파라마이오신 (Li et al , Mol. Biochem. Paras itol. , 49:315-323 (1991))； 및 Schistosoma mansoni 의 트리오스 -포스페이트 이소머라아제 (Shoemaker et al , Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:1842-1846 (1992))를 포함한다.
본 발명에 이용될 수 있는 암 항원의 예는 전립선 특이 항원 (Gattuso et al, Human Pathol. , 26 :123-126 (1995)), TAG-72 및 CEA(carcinoembryonic antigen) (Guadagni et al , Int. J. Biol . Markers, 9:53-60 (1994)), MAGE-1 및 티로시나아제 (Coulie et al , J. I nothera. , 14:104-109 (1993)), p53(W0 94/02167), NY-ES01(cancer-test is antigen), AFP( α-feto protein) 및 암 항원 125 CA-125)， EPCA( Early Prostate Cancer Antigen)를 포함한다.
생체 내 면역 반웅은 크게 Thl 면역반웅 및 Th2 면역반웅으로 나눌 수 있다. 본 명세서에서 용어 "Thl 면역반응" 은 세포면역반응을 유도하는 반웅을 의미하고， "Th2 면역반응" 은 체액면역반웅을 촉진하는 반웅을 의미한다.
본 발명에서 면역화된 동물에서의 면역반응 측정은 예를 들어， 면역원을 투여한 대상 동물로부터 혈청을 채취하여 항-면역원 항체 (총 IgG, IgGl 및 IgG2a)의 역가를 확인하는 방법을 통해 이루어질 수 있다. 항체의 역가를 확인하는 방법은 예를 들어, EL ISA (Enzyme— linked i誦 unosorbent assay) , 측면이동분석법 (Lateral flow test), MIA(Magnet ic immunoassay) , 면역침강법 (Immunoprecipitation) 등을 이용할 수 있으나， 이에 제한되지 않고 당업계에 알려진 다양한 면역분석 (i薩 unoassay) 방법에 의해 이루어질 수 있으며 , 바람직하게는 ELISA분석법을 이용한다.
바람직하게는, 본 발명의 장관면역 보강제는 면역원과 경구투여되는 경우 혈중에서의 면역원 특이적 IgG 와 소장에서의 면역원 특이적 IgA 의 생성을 촉진한다.
본 발명의 바람직한 구현 예에 따르면， 마우스에 면역원 및 청국장 에탄올 -용해 추출물을 투여하고 안와정맥총으로 채혈하고 이의 혈청을 분리하여 IgG 의 수치를 분석하였으며， 소장을 적출하여 소장세포화하여 IgA 의 수치를 분석한 결과， 면역원 (Keyhole Limpet Hemocyanin; KLH)만 단독 투여한 것과 비교하여 면역원 및 청국장 에탄을 -용해 추출물을 투여한 경우, 면역원 특이적 IgG 가 증가되었으며 (도 6)， 또한 면역원 특이적 IgA 의 생성이 증가된다 (도 9). 본 발명의 청국장 에탄올 -용해 추출물은 CT (콜레라 톡신)과 유사한 정도로 강한 IgA 생산 활성을 가짐으로써 병원균이나 바이러스에 대한 장관면역반웅을 효과적으로 유도할 수 있음은 물론, CT 의 경우에 나타나지 않았던 혈중 IgG 생산과 전신면역반응도 잘 유도함을 보여준다. 바람직하게는， 본 발명의 장관면역 보강제는 면역원과 경구투여 되는 경우 비장 내 IL-12 의 생성을 증가시킨다. 이는 활성화된 Thl 반웅으로 세포성 면역반응을 효과적으로 유도한다.
바람직하게는， 본 발명의 장관면역 보강제는 면역원과 경구투여 되는 경우 비장 내 IL-4 및 IL-5 의 생성을 증가시킨다. 이는 활성화된 Th2 반웅으로 면역원 특이적인 항체를 생산하는 체액성 면역반응을 효과적으로 유도한다.
바람직하게는, 본 발명의 장관면역 보강제는 면역원과 경구투여 되는 경우 면역원의 단독 경구투여와 비교하여 비장 내 IL-4/IFN-Y의 상대적 양이 5-30 배 증가되고, 보다 바람직하게는 6-20 배, 가장 바람직하게는 7- 10배 증가된다.
바람직한 구현예에 따르면， 면역원 및 청국장 에탄을 -용해 추출물을 투여한 경우 면역원만 단독 투여한 것과 비교하여, Th2 반웅을 유도하는 IL-4의 생산이 증가하는 결과는 나타낸다 (도 4).
본 발명의 면역보강제는 약제학적 조성물 및 식품 조성물로 제공될 수 있다.
본 발명의 면역보강제가 약제학적 조성물로 제공되는 경우， 본 발명의 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 본 발명의 약제학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스， 솔비를, 만니를， 전분, 아카시아 고무， 인산 칼슘， 알기네이트， 젤라틴， 규산 칼슴， 미세결정성 샐를로스， 폴리비닐피를리돈， 셀를로스,. 물, 시럽, 메틸 셀를로스， 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드톡시벤조에이트, 활석， 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나， 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제， 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제， 현탁제， 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed. , 1995)에 상세히 기재되어 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구 투여할 수 있으며, 비경구 투여인 경우에는 정맥내 주입, 피하 주입， 근육 주입， 복강 주입, 경피 투여 둥으로 투여할 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식， 환자의 연령, 체중 성, 병적 상태， 음식， 투여 시간, 투여 경로， 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물의 투여량은 성인 기준으로 0.00001-100 nig/kg 범위 내이다.
본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및 /또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액， 현탁액， 시럽제 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 산제, 분말제, 과립제， 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며， 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다. 본 발명의 면역보강제가 식품 조성물로 제공되는 경우, 본 발명의 면역보강제는 "면역증강용 식품 조성물" 로 표현될 수 있다.
본 발명의 조성물이 식품 조성물로 제조되는 경우, 유효성분으로서 청국장 에탄올 -용해 추출물뿐만 아니라, 식품 제조 시에 통상적으로 첨가되는 성분을 포함하며, 예를 들어， 단백질, 탄수화물, 지방， 영양소， 조미제 및 향미제를 포함한다. 상술한 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어， 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스， 슈크로스， 올리고당 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 사이클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당 및 자일리를, 소르비를, 에리트리를 등의 당알콜이다. 향미제로서 천연 향미제 [타우마틴， 스테비아 추출물 (예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등]) 및 합성 향미계 (사카린， 아스파르탐 등)를 사용할 수 있다.
예컨대 본 발명의 식품 조성물이 드링크제로 제조되는 경우에는 본 발명의 청국장 에탄올 -용해 추출물 이외에 구연산， 액상과당, 설탕, 포도당， 초산， 사과산, 과즙， 두충 추출액， 대추 추출액， 감초 추출액 등을 추가로 포함시킬 수 있다, 본 발명의 다른 양태에 따르면， 본 발명은 면역원 단백질 및 장관면역 보강제로서의 청국장 에탄을 -용해 추출물을 유효성분으로 포함하는 전신면역 및 장관면역을 유발하기 위한 경구투여용 백신 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 (a) 면역원 단백질 및 (b) 청국장의 에탄을 추출물 중에서 에탄올 -용해 (ethanol-soluble) 성분을 포함하는 경구투여용 백신 조성물을 대상에 투여하는 단계를 포함하는 전신면역 또는 장관면역 반웅 유도 방법을 제공한다.
본 명세서에서 용어 '면역원 단백질' 은 수용자의 면역반웅을 유도하는 에피토프， 펩타이드 또는 단백질이며, 이는 상술한 본 발명의 '면역원' 에 기재된 내용과 공통되므로, 과도한 중복을 피하기 위해 그 기재를 생략한다.
본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법， 투여 방식， 환자의 연령, 체중， 성， 병적 상태， 음식， 투여 시간, 투여 경로， 배설 속도 및 반웅 감웅성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 한편, 본 발명의 약제학적 조성물의 경구 투여량은 바람직하게는 1 일 당 0.001-10000 mg/kg (체중)이다. 본 발명의 백신에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스， 덱스트로스, 수크로스， 솔비를， 만니를， 전분， 아카시아 고무, 인산 칼슴， 알기네이트 젤라틴， 규산 칼슘， 미세결정성 셀를로스, 폴리비닐피를리돈， 셀를로스， 물， 시럽, 메틸 셀를로스， 메틸히드록시벤조에이트， 프로필히드록시벤조에이트， 활석， 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나， 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제， 유화제, 현탁제， 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 백신 조성물은 약제학적으로 일반적으로 사용되는 층진제, 증량제， 결합제， 습윤제， 붕해제， 계면활성제 등의 회석제 또는 부형제를 사용하여 제제화할 수 있다. 바람직하게는 경구투여용 제제로 제제화하는 것이 바람직하다. 예를 들면, 정제, 환제, 산제， 과립제ᅳ 캡슐제 등의 경구투여용 고형제제 또는 현탁제, 내용액제， 유제ᅳ 시럽제 등의 액상제제로 제제화하는 것이 바람직하다. 고형제제로 제제화하는 경우에는 본 발명에 따른 백신 조성물에 하나 이상의 부형제, 예를 들면， 전분 (starch) , 칼슘 카보네이:튼 (ς— Lc— ium carbonate) 락토스 (lactose), 젤라틴 (gelatin) 등을 흔합할 수 있다. 액상제제로 제제화하는 경우에는 본 발명에 따른 백신 조성물에 물 또는 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제， 예를 들면 습윤제, 감미제， 방향제, 보존제 등을 흔합할 수 있다.
【발명의 효과】
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:
(a) 본 발명은 청국장 에탄을 -용해 추출물을 유효성분으로 포함하는 전신면역 및 장관면역 보강제, 백신 또는 상기 보강제 또는 백신을 대상에 투여하는 단계를 포함하는 전신면역 및 장관면역 반응 유도 방법을 제공한다.
(b) 본 발명의 청국장 에탄을 -용해 추출물을 포함하는 면역보강제는 안정성이 확보된 식품소재를 사용함으로써 독성 및 부작용이 없으며， 저렴한 생산비용과 사용의 편이성을 제공할 수 있다.
(C) 본 발명의 면역보강제는 항원과 경구투여시 경구감염성 병원성 미생물은 물론 비경구감염성 병원성 미생물이나 바이러스， 암 항원， 일반 항원 등에 대하여도 Th2 반웅을 유도하여 효과적인 특이항체 (혈중 IgG 및 소장 IgA)를 생산할 수 있다. 【도면의 간단한 설명】
도 1 은 면역원 (KLH) 및 면역보강제 (청국장 또는 CT)를 경구투여한 C3H/He 마우스의 비장세포를 KLH 의 존재 하에 배양 시 IFN-γ 생성을 나타낸 그래프이다. a, ab 및 b 는 PO.05 수준에서 각 실험구의 통계적 유의성을 나타낸 것이다. a 와 b 처럼 문자가 서로 다르게 표시된 수치는， 통계적으로 P<0.05(오류를 범할 확률이 ¾이하)의 수준에서 서로 다름을 의미한다.
도 2 는 면역원 (KLH) 및 면역보강제 (청국장 또는 CT)를 경구투여한 C3H/He 마우스의 비장세포를 KLH의 존재 하에 배양 시 IL— 12 생성을 나타낸 그래프이다. a, b 및 c 는 PO.05 수준에서 각 실험구의 통계적 유의성을 나타낸다. 도 3 은 면역원 (KLH) 및 면역보강제 (청국장 또는 CT)를 경구투여한 C3H/He 마우스의 비장세포를 KLH 의 존재 하에 배양 시 ILᅳ 4 생성을 나타낸 그래프이다. a 및 b 는 PO.05 수준에서 각 실험구의 통계적 유의성을 나타낸다.
도 4 는 면역원 (KLH) 및 면역보강제 (청국장 또는 CT)를 경구투여한
C3H/He 마우스의 비장세포를 KLH 의 존재 하에 배양 시 IL-5 생성을 나타낸 그래프이다. a, b 및 c 는 PO.05 수준에서 각 실험구의 통계적 유의성을 나타낸다.
도 5 는 면역원 (KLH) 및 면역보강제 (청국장 또는 CT)를 경구투여한 C3H/He 마우스의 혈청 중 총 IgG 항체를 분석한 그래프이다, a 및 b 는 PO.05수준에서 각 실험구의 통계적 유의성을 나타낸다.
도 6 은 면역원 (KLH) 및 면역보강제 (청국장 또는 CT)를 경구투여한 C3H/He 마우스의 혈청 증 항원특이적 IgG 항체를 분석한 그래프이다. a, ab 및 b는 PO.05 수준에서 각 실험구의 통계적 유의성을 나타낸다.
도 7 은 면역원 (KLH) 및 면역보강제 (청국장 또는 CT)를 경구투여한
C3H/He 마우스의 소장에서 생산된 총 IgA 항체를 분석한 그래프이다. a 및 b는 PO.05 수준에서 각 실험구의 통계적 유의성을 나타낸다.
도 8 은 면역원 (KLH) 및 면역보강제 (청국장 또는 CT)를 경구투여한 C3H/He 마우스의 소장에서 생산된 항원특이적 IgA 항체를 분석한 그래프이다. a 및 b 는 PO.05 수준에서 각 실험구의 통계적 유의성올 나타낸다.
도 9 는 면역원 (KLH) 및 면역보강제 (청국장 또는 CT)를 경구투여한 C3H/He 마우스의 비장세포를 KLH 의 존재 하에 배양 시 T 세포증식활성올 분석한 그래프이다. a 및 b 는 PO.05 수준에서 각 실험구의 통계적 유의성을 나타낸다.
도 10 은 마우스의 비장세포에 대한 ΜΊΤ 분석 결과를 나타낸 그래프이다. (a) 증자 된 콩의 물 또는 70% 에탄을 추출물， (b) 청국장의 물 또는 70% 에탄을 추출물을 이용하였다. 【발명을 실시하기 위한 구체적인 내용】
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로， 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다. 실시예
실시예 1. 천연물 사료의 준비
보강제 (Adjuvant)로써의 활용가능성을 검토하기 위하여 식품 및 천연물 20 여점을 확보하고 이들의 분쇄물을 준비하여 각각 1 g 씩에 70% 에탄올을 25 mi 가한 다음 90 W 에서 5 분 동안 마이크로웨이브 처리하여 추출하고, 12시간 후 10°C, 8000 rpm조건 하에서 20분 동안 원심분리하여 상등액을 회수하였다. 이어, 상기 상등액을 증발농축하고, 막여과 한 다음 활성실험에 사용하였다. 실시예 2. 천연물로부터 비장세포 증식활성 소재의 선발
실험방법
보강제로써의 활용가능성을 검토하기 위하여 20 여종의 천연물로부터 면역증강효과가 기대되는 소재를 액스 비보 iex vivo) 실험계에서 선발하였다. BALB/c 마우스 (6 주령， 수컷)의 비장을 적출하고， 적출한 비장세포의 초대배양계를 이용하여 면역활성을 증가시키는 소재를 탐색하였다. 즉 총 22종 소재 (감초, 강황， 검정참깨， 괴화， 구지뽕， 녹차, 대추， 미역， 민들레， 솔잎 씀바귀， 약콩, 유향， 차조기， 청국장, 클로텔라, 들깨， 팔， 호로파, 황금 및 후추)의 70% 에탄을 추출물을 각각 10 βg/ml 및 100 /g/mi의 농도로 96 웰 플레이트에 각 웰 당 1.0X106세포 /웰이 되도록 처리군 별로 세포를 씨딩 (seeding)하였다. 이때 배양배지에 ConA(Concanaval in A, 1 μg/ιιί) 및 LPS(L i popo 1 ysacchar i des , 25 ^g/m^) 또는 천연물추출물 등을 첨가하여 RPMI-1640 배지 (10% FBS, 100 units/mi 페니실린, 100 /mi 스트렙토마이신 및 2 mM L-글루타민)로 배양하였다. 배양 44 시간 후 2 m / MTT(3-(4, 5-dimethylthiazolyl-2)-2, 5- diphenyltetrazolium bromide, Sigma)를 각 웰 당 20 씩 처리하고, 37°C의 C02배양기에서 4 시간동안 정치하였다. 4 시간 후, 10% SDS( Sodium dodecyl sulfate)가 포함된 0.01 M HC1 을 웰 당 100 ^씩 넣은 후 37°C의 C02배양기에 하룻밤 방치하고 570 nm에서 흡광도를 측정하였다.
Μπ 시험 결과, 시료 처리에 의한 비장세포 증식활성은 청국장에서 가장 높게 나타나， 면역보강제로서의 활용가능성이 추측되었다 (표 1).
【표 1]
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실시예 3. 비장세포 증식활성이 우수한 청국장의 선발 실시예
시증에서 구입한 청국장 12 종을 실험예 1 과 동일한 방법으로 추출하여 시료를 준비하였으며, BALB/c 마우스 (6 주령， 수컷)의 비장세포를 이용하여 실험예 2 와 동일한 방법으로 각 시료의 활성을 비교하였다. 실험 결과, 10 번 청국장이 10 zg/i 및 100 /g/m의 농도에서 상대적으로 가장 높은 활성을 나타냈다 (표 2).
【표 2]
Figure imgf000019_0002
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실시예 4. 청국장 균주의 분리 및 특성 시중에서 구입한 10번 청국장에서 표 3과 같은 균주를 분리 동정하고 각각의 균주를 사용하여 청국장을 제조하였다. 제조 방법은 정선한 콩 500 g을 12시간 동안 상온에서 침지시키고 114°C에서 50분간 증자한 후 50°C로 식힌 후， TBS(tryptic soy broth)로 배양 (37°C, 24 시간)한 균주 배양액을 대두량의 l%(v/w)로 접종하여 37°C에서 48 시간 발효하였으며， 각 균주의 α-아밀라아제， β-아밀라아제 및 프로테아제의 효소 활성을 측정하였다ᅳ 효소활성 측정을 위하여 청국장 10g 에 증류수를 10 배량 가한 후 60 분간 교반하며 추출하였다. 이를 3,000 rpm 에서 10 분간 원심분리한 후 상층액을 취하고 Whatman No. 2로 여과하여 한 것을 조효소액으로 사용하였다. 실시예 4-1. α-아밀라아제 효소 활성 측정
α-아밀라아제의 경우 blue value 법 (Fuwa, H. , J Bioche . , 41： 583-
603(1954))을 변형하여 측정하였다. 0.5% 전분용액 5 mL 에 0.04 M potassium phosphate buffer ( H 5.9) 5 mL 과 조효소액 1 mL 를 가한 早 25°C에서 10 분간 반응시켰다. 반웅액 1 mL 을 0.5% 요오드 용액이 10 mL 들어 있는 시험관에 넣어 발색시킨 다음 660 에서 홉광도 (A660)를 측정하였다. 효소활성 단위 (Unit)는 pH 5.9, 25°C에서 1 분간 전분-요오드 용액의 A660을 1% 감소시키는데 필요한 효소량으로 정의하였다. 실시예 4-2. β-아밀라아제 효소 활성 측정
β-아밀라아제 활성측정은 dinitrosalicylic acid 법 (Bernfeld, P., Methods in Enzymology 1: 149-158(1955) )으로 측정하였다. 1% soluble starch 를 기질로 사용하여 조효소액과 l:l(v:v)비율로 섞어 20°C에서 10 분간 반웅 시킨 뒤 DNS 시약 동량을 첨가하여 15 분간 끓는 물에서 가열하였다. 가열 반웅 후 차가운 물에서 식힌 후 증류수를 첨가하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였으며 표준물질로 maltose를 사용하였다. 효소활성 단위 (Unit)는 pH 4.8, 20°C에서 3 분 동안 1 mg maltose 를 생산하는데 필요한 효소량으로 정의하였다. 실시예 4-3. 프로테아제 효소 활성 측정
프로테아제 활성측정은 Anson 의 방법 (J. General Physiology 22： 79- 89(1938))을 일부 변형하여 측정하였다. 0.1 M potassium phosphate buffer (pH6.8) 1 mL 에 0.6% casein 1.5 mL 과 조효소액 0.5 mL 을 넣고 37°C에서 30 분간 반웅시켰다. 반웅 후 0.4 M TCA 를 3 mL 첨가하여 상은에서 10 분간 방치시켜 효소반웅을 정지시켰다. 반웅액은 원심분리 (10,000 rpm, 10 분)한 뒤 상층액 1 mL 에 CK4 M Na2C03 5 mL 과 IN phenol 1 mL 을 첨가하여 40°C에서 30 분간 발색시켜 660 nm 에서 흡광도를 측정하였다. 표준물질로는 tyrosine 을 사용하였으며 효소활성 단위 (Unit)는 1 분간 tyrosine 1 ug 을 유리하는데 필요한 효소량으로 정의하였다.
효소 활성 측정 실험 결과, 바실러스 아밀로리퀴페시언스 (Bacillus amyloliqauefaciens) 균주를 이용하여 제조한 청국장의 조효소액 중 αᅳ 아밀라아제， β—아밀라아제 및 프로테아제 효소 활성이 모두 가장 높게 나타났다 (표 4).
[표 3]
균주명
바실러스 아밀로리퀴페시언스 (Bac i 11 us amylol iquefaciens) 바실러스 메틸로트로피커스 (Bacillus wethylotrophicus) 바실러스 애트로패우스 (Bacillus atrophaeus) 바실러스 테퀼렌시스 (Bacillus tequilensis) 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis subsp. ) 바실러스 메틸로트로피커스 (Bacillus wethylotrophicus)
코커리아 ^l^ Kocuria salsicia) 【표 4】
Figure imgf000022_0001
실시예 5. 분리 균주로 제조한 청국장의 비장세포 증식활성 비교
청국장으로부터 동정된 각각의 균주로 제조한 청국장 7 종올 실험예 1 과 동일한 방법으로 추출하여 시료를 준비하였으며, 실험예 2 와 동일한 방법으로 추출물 시료의 비장세포 증식활성을 비교하였다.
실험 결과， 시료 처리에 의한 세포증식 활성은 바실러스 아밀로리퀴페시언스 ^Bac i 1 his amylol iquefaciens)로— 제조한 청국장 추출물의 비장세포 증식활성이 가장 높게 나타나, 면역보강제로서의 활용 가능성이 높았다 (표 5).
【표 5]
Figure imgf000022_0002
Figure imgf000023_0001
실시예 6. 동물실험에 의한 청국장의 면역보조효과
동물실험
바실러스 아밀로리퀴페시언스로 제조한 청국장 에탄을 -용해 추출물 (7 에탄올 추출물)의 면역증강 효능을 확인하기 위해, C3H/He(6 주령 수컷) 마우스에 면역원과 함께 보강제로써 청국장 에탄올- 용해 추출물을 경구면역하였다, C3H/He 마우스를 5 마리씩 4 그룹으로 나누어 각각의 그룹에 항원과 보강제를 경구투여하였다. 면역원으로는 KLH( eyhole Limpet Hemocyanin)를, 보강제는 청국장 에탄올 -용해 추출물 또는 CT Cholera Toxin)를 사용하였다. 따라서， 1 번 그룹은 생리식염수， 2 번 그룹은 KLH(50' g/H)와 생리식염수, 3 번 그룹은 KLH (50 zg/H)와 청국장 에탄을 -용해 추출물 (2.8 mg/H) , 4 번 그룹에는 KLH (50 ； wg/H)와 CT (10 /HK/g/Head)를 일주일에 2 회씩 4 주 동안 8 차례 경구투여하고， 그 다음 주는 5 일 동안 매일 경구 투여한 다음 안와정맥총으로 채혈하고 이의 혈청을 분리하여 분석 전까지 70°C에 보관하였다. 마지막에 채혈한 혈청 중의 IgG 항체를 ELISA(Enzyme-l inked immunosorbent assay)로 분석하였다. 또한， 소장 (small intestine)에서 총 IgA 및 면역원 특이 IgA 를 분석하기 위해 마우스의 소장을 적출한 후， 상부 10 cm를 균질기 (homogenizer)로 1 분 동안 균질화하여 4°C에서 10,000 xg로 10분 동안 원심분리하였다. 원심분리 후 상층액을 회수하여 ELISA 로 IgA 분석하였다. 또한, Thl 및 Th2 사이토카인의 변화를 확인하기 위하여 비장세포를 면역원 (KLH)과 함께 배양한 후 상층액을 회수하여 ELISA로 사이토카인을 분석하였다. 사이토카인 분석
Thl 및 Th2 사이토카인 분석을 위해， 청국장 에탄올 -용해 추출물과 함께 KLH 를 경구투여한 후 마우스의 비장을 적출하여 처리군 별로 모아 단세포화 한 비장세포를 배양하였다. 세포 배양은 24 웰 플레이트에 웰 당 5 106 세포 농도로 1 씩 배양했으며 이때, 면역원을 첨가하지 않은 배지 및 면역원을 첨가한 배지로 나누어 그 차이를 관찰함으로 면역 반웅을 유도하였는지 분석하였다. 면역원은 KLH 의 경우 웰 당 100 /ΙΙΙ£을 넣어주었다. 사이토카인 분석을 위해 세포를 48 시간 (Thl 사이토카인) 및 72 시간 (Th2 사이토카인) 배양하여 세포를 제거한 배양액을 수득하고 분석 전까지 -70°C에 보관하였다. 사이토카인 분석은 BD 바이오사이언스 (BD Biosciences, 미국)사의 사이토카인 분석 키트를 이용하여 키트의 프로토콜대로 실시하였다. 간단히 설명하면， 항 -사이토카인 항체를 96 웰 플레이트에 넣어주고 4°C에서 하룻밤 방치한 후 PBST(Phosphate Buffered Saline - Tween20 첨가)로 3 희 세척하고 10% FBSCFetal Bovine Serum)가 첨가된 PBS(Phosphate Buffered Saline)로 1 시간 동안 블로킹 하였다. PBST로 3회 세척한 후 세포 배양액을 넣고 상은에서 2시간동안 반웅하였다. 2시간 후， PBST로 5회 세척하고 바이오틴 (biotin)이 결합된 항ᅳ사이토카인 및 스트렙타비딘 (streptavidin)이 결합된 HRP( Horse Radish Peroxidase)를 처리하고 1 시간 동안 반웅하였다. 웰을 PBST 로 7 회 세척한 후 위의 ELISA와 같은 방법으로 기질을 처리하여 흡광도를 측정하였다.
그 결과, Thl 사이토카인인 IFN-γ 및 IL-12 를 분석한 결과, IFN- γ는 KLH 와 함께 면역보강제를 경구투여한 마우스의 비장세포 배양액에서 IFN-Y의 수치적 차이는 거의 없었지만, IL-12 의 수치는 청국장 에탄올- 용해 추출물과 KLH 을 함께 경구투여한 처리군에서 증가하였다 (도 1 및 도 2). Th2 사이토카인의 경우， KLH를 경구 투여한 마우스와 비교하여 청국장 에탄을 -용해 추출물 및 KLH를 함께 처리한 마우스의 비장세포에서 높은 IL- 4 및 IL-5 수치를 나타냈다 (도 3 및 도 4). 이는 Thl 반웅을 유도하는 IFN- y의 생산은 큰 증가가 없지만, Thl 반응을 유도하는 IL-12 의 생산이 증가되고, Th2 반웅을 유도하는 IL-4 및 IL-5 의 생산이 증가된 것을 의미한다. 또한, 대표적인 Th2 및 Thl 사이토카인으로서 각각 IL-4 및 IFN- γ에 주목하여 IL-4/IFN-Y의 상대적인 생산 비율을 산출한 결과, 청국장 에탄올 -용해 추출물 또는 CT를 경구용 면역보강제로 투여한 경우， 대조군에 비하여 8.2 배 높게 나타났다. 이는 본 발명에 있어서, 특히 활발한 Th2 반웅의 결과 특이항체의 생산이 증가되는 체액성 면역이 매우 활발하게 진행되었고， 특히 IL-5 에 의한 소장에서의 IgA 항체생산이 효과적으로 유도되었다는 것을 알 수 있다. 이는 실제로 후술할 결과에서 확인할 수 있다 (도 8).
# IgG분석
항-마우스 IgG(SIGMA, 대한민국)를 2 β Ι\\\ί 농도로 96 웰 플레이트에 넣고 4°C에서 하룻밤 방치한 후 PBST 로 1/10,000 희석한 혈청을 웰 당 100 ^씩 첨가한 후 상온에서 1 시간 반응하였다. 그리고 항-마우스 IgG-HRP 컨쥬게이트 (conjugate, SIGMA A-2304)를 PBST 로 1/30,000 회석하여 플레이트에 웰 당 100 씩 첨가한 후 상온에서 1 시간 반웅하였다。 마지막으로 차광 상태에서 ΤΜΒ(3,3' ,5,5' -Tetramethylbenzidine) 및 3% ¾02를 처리하여 30분 동안 반웅하고 2 M H2S04로 반웅을 중지시킨 다음 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.
결과적으로 청국장 에탄을 -용해 추출물을 면역증강제로 경구 투여한 실험군에서 높은 수치의 총 IgG 항체가 유의적으로 나타났으나, CT 를 면역증강제로 처리한 경우에는 대조군과 비교시 유의성이 없았다 (도 5). 면역원 특이적 IgG분석
면역원을 2 //g/m 농도로 96 웰 플레이트에 넣고 4°C에서 하룻밤동안 반웅한 후 PBST 로 1/3,000 회석한 각 혈청을 웰 당 100 ^씩 첨가한 후 상온에서 1 시간동안 반웅하였다. 반웅 후， 항-마우스 IgG-HRP 컨쥬게이트 (SIGMA, 미국)를 PBST 로 1/10,000 희석 하여 웰 당 100 씩 첨가한 후 상온에서 1 시간 반웅하였다. 마지막으로 차광 상태에서 TMB 및 3% ¾02 를 첨가하여 30 분간 반웅시키고 2 M H2S04 를 첨가하여 반웅을 중지시킨 다음 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.
청국장 에탄을 -용해 추출물올 면역증강제로 경구 투여한 경우에는 대조군에 비하여 면역원특이적 IgG 항체의 수치가 유의적으로 높게 나타났으나， CT 처리군의 경우에는 대조군과 비교시 유의성이 없었다 (도 6). 이는 앞의 총 IgG 항체 분석의 결과와 거의 비슷한 경향을 보임으로써 청국장 추출물올 장관 면역증강제로 면역원과 함께 경구투여하면, 혈액 중에 IgG 항체가 효과적으로 생성되었으며， 이는 청국장 에탄올 -용해 추출물이 CT보다 우수한 면역증강 활성을 가짐을 말한다. 또한， 이 활성은 경구로 감염되지 않고 혈액으로 감염되는 병원균이나 심지어 암 관련 항원 등이라도 청국장 에탄올 -용해 추출물과 함께 경구 투여하면 혈액 중에 특이적인 IgG 항체 생산의 유도가 가능함을 뜻하며， 그 이용가능성이 기대된다. # IgA의 분석
96 웰 플레이트에 항-마우스 IgA(BD biosciences, 미국)를 2 μg|^i 농도로 첨가하고， 4°C에서 하룻밤동안 반응하였다. 여기에 소장 샘플 (균질화한 소장의 원심분리 후 상층액)을 10% FBS 가 포함된 PBST 로 1/1,000 회석하여 웰 당 100 ^씩 첨가하고 상온에서 1 시간 동안 반웅하였다. 반웅 후, 항—마우스 IgA-바이오틴 컨쥬게이트 (BD biosciences, 미국)를 0.5 l^i 농도로 PBST 에 회석하여 웰 당 100 씩 첨가한 후 상온에서 1 시간 반응 하였다. 반웅 후， 아비딘—퍼옥시다아제 (avidin- peroxidase, SIGMA, 미국)를 200 ng/iiii 농도로 PBST 에 회석하여 웰 당 100^씩 첨가하고 상온에서 1 시간 동안 반응하였다. 차광 상태에서 TMB 및 3% ¾02 를 처리하여 상온에서 30 분 동안 반웅하고, 반웅 중지를 위해 2 M H2S04를 웰 당 50 ^씩 첨가하였다. 결과는 450 nm 에서 흡광도를 측정하여 분석하였다.
그 결과, KLH 와 청국장 에탄을 -용해 추출물을 함께 경구 투여한 마우스의 총 IgA의 수치는 KLH만을 경구투여한 실험군과 차이가 없었으나ᅳ CT 를 면역보강제로 경구투여한 처리군에서는 대조군에 비하여 미약하지만 유의적인 증가를 나타내었다 (도 7). 면역원 특이적 IgA 분석
96 웰 플레이트에 면역한 면역원 (KLH)을 2 g|\\\i 농도로 첨가하고 4°C에서 하룻밤 반응하였다. 균질화한 소장의 원심분리 후 상층액인 소장 샘플을 10% FBS 가 포함된 PBST 에 1/1,000 로 희석하고 웰 당 100 씩 첨가하여 상온에서 1 시간 동안 반웅하였다. 반웅 후， 항-마우스 IgA- 바이오틴 컨쥬게이트 (BD biosciences, 미국)를 0.5 μg/mi 농도로 PBST 에 희석하여 웰 당 100 ^씩 첨가한 후에 상온에서 1 시간 동안 반웅하였다. 아비딘-퍼옥시다아제 (SIGM/^ 미국)을 200 ng/ra^ 농도로 PBST에 희석하여 웰 당 100 ^씩 첨가한 후에 상온에서 1시간 동안 반웅 하였다. 차광 상태에서 TMB 및 3% ¾02를 처리하여 상온에서 30 분동안 반웅하고， 반응 중지를위해 2 M H2S04를 웰 당 50 ^씩 첨가해 주었다. 결과는 450 nm 에서 흡광도를 측정하여 분석하였다.
그 결과, KLH 와 함께 청국장 에탄올 -용해 추출물을 함께 경구 투여한 처리군의 면역원특이적 IgA 항체의 수치는 대조군과 비교하여 유의적으로 높은 수치를 나타냈으며， CT 를 면역보강제로 처리한 군에서도 비슷한 경향을 나타내었다 (도 8). 그러므로 청국장 에탄올 -용해 추출물은 CT 와 유사한 정도로 강한 IgA 생산 활성을 가짐으로써 장관으로 침입하는 병원균이나 바이러스에 대웅하는 면역반웅을 효과적으로 유도할 수 있음을 말한다. 세포 증식 활성실험
세포 증식 활성 실험을 위해 마우스의 비장을 적출 한 후 처리군 별로 모아 단세포화하고 비장 세포를 배양한 후 Μπ 분석을 실시하였다. 96 웰 플레이트에 각 웰 당 5X 106 세포 /mi이 되도록 씨딩 (seeding)하였다. 이때 RPMI-1640 배지 (10% FBS, 100 units/m^ 페니실린， 100 /zg/m^ 스트랩토마이신 및 2 mM L-글루타민)에 OVA, ConA 또는 천연물 추출물 등올 첨가하여 배양하였다. 배양 44시간 후, 2 nig/m의 MTT를 각 웰 당 20 ^씩 처리하고 37°C의 C02 배양기에서 4 시간 동안 정치하였다. 10% SDS 를 포함하는 0.01 M HC1 을 웰 당 100 ^씩 넣은 후 37°C의 C02 배양기에 하룻밤 반웅하고 570 nm에서 흡광도를 측정하였다.
그 결과， 도 9 에 나타낸 바와 같이 청국장 에탄올ᅳ용해 추출물을 면역증진제로 사용한 처리군의 비장세포 증식이 유의적으로 가장 높은 수치를 나타냈다. 이는 청국장 에탄올ᅳ용해 추출물이 인 비보 {in ra)에서 항원제시 세포의 항원제시능력을 향상시켰고， 그 결과 항원에 특이적인 T세포가 증식되었으며 그로 인한 면역반웅이 증진되었음을 의미한다. 실시예 7. 면역증강 효능을 갖는 청국장 에탄올 -용해 추출물의 성분 확인 실시예 7-1. 청국장추출물 제조
상기 실시예에서 면역증강 효능이 가장 우수한 것으로 규명된 바실러스 아밀로리퀴페시언스^ 제조한 청국장을 제조하였다. 분말화 한 청국장 100 g 에 증류수 또는 70% 에탄을 1000 ml 을 가한 다음 90 W 에서 5 분 동안 마이크로웨이브 처리하여 추출하고, 12 시간 후 10 °C, 8000 rpm 조건 하에서 20 분 동안 원심분리하여 상등액을 회수하였다. 회수한 상등액을 동결건조하여 시료로 사용하였다.
본 명세서 전체적으로 언급되는 청국장 에탄올 -용해 추출물은 청국장의 성분 중 에탄올에 용해되는 성분들이기 때문에, 폴리 글루탐산 (PGA) 및 레반 (Levan) 등의 성분들이 제거된 추출물이다. 종래 기술에 따르면, PGA 또는 레반을 분리하기 위하여 에탄올을 시료에 처리하고， 이로부터 형성된 침전물을 추가적으로 정제하여 PGMBioscience, Biotechnology, and Biochemistry, Vol 65， 516-521, 2001) 또는 레반 (Clinical & Experimental allergy, Vol 36, 94-101)을 얻는다.
한편 본 발명에서는 상기 종래 기술과는 반대로 청국장의 70% 에탄을 용해 획분을 이용하기 때문에， 본 발명에서 이용되는 청국장 에탄을 추출물은 PGA 및 레반이 실질적으로 제거되었다고 할 수 있다. 실시예 7-2. 면역 증강 효능의 측정
청국장 추출물의 면역 증강 효능은 상기 실시예 2 와 유사하게 Μπ 분석을 이용하여 측정하였다. 이를 위해 마우스의 비장을 적출한 후 단세포화 시키고， 비장세포를 배양하였다. 세포배양은 IX 106 cells/ml 의 농도로 조절하고 96 웰 플레이트에 세포를 200 u 1 씩 분주하였으며 , 청국장 추출물이 있는 배지 또는 없는 배지로 나누어 배양하였다. 청국장 추출물은 웰 당 100 ^g/ml 를 넣어 배양하였다. 배양 72 시간 후 2 mg/ 의 MTT를 각 웰당 20 ^씩 넣고 37°C, CO2 배양기에서 4시간 두었다. 4시간 경과 뒤 10% SDS가 포함된 0.01 M의 HC1 을 웰 당 100 ^씩 넣은 후 37T:, C02 배양기에 하룻밤 방치하고 595 nm에서 흡광도를 측정하였다.
도 10 에서 확인할 수 있듯이， 70% 에탄을 청국장 추출물에서 면역증강 활성 효과를 관찰할 수 있었다. 이는 종래 면역증강 활성을 갖는 것으로 알려진 PGA 또는 레반 등이 실질적으로 제거된 상태의 새로운 청국장 추출물에 의해 발휘된 효과임을 알 수 있다. 실시예 7-3. 젤전기영동에 의한 분자량 측정
분자량 측정은 농도구배 SDS-페이지를 이용한 방법으로 청국장 추출물을 500 βg/m\ 의 용액으로 만들어 시료로 사용하였다. 청국장 추출물 (500 ig/ml) 6.5 μ ΐ 를 4*샘플 버퍼 3.5 μ 1 와 흔합한 후 4~12% 의 농도구배 SDS-젤에서 전기영동하였다. 전기영동 후 젤은 쿠마시 브릴리언트 블루 (G-250)로 표준단백질을 염색한 후 탈색하였고 0.5¾ 메틸렌 블루 /3% 아세트산으로 PGA를 염색하여 분자량을 비교하였다.
실험 결과, 물 추출물에서만 특이적으로 메틸렌블루로 염색이 되는 물질이 검출되고， 이것이 큰 분자량을 갖는 PGA인 것으로 사료되며， 따라서 70% 에탄올 청국장 추출물에서 얻어진 면역 증진 물질들은 상기 PGA 이외의 물질임을 알 수 있었다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며， 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims

【특허청구범위】
【청구항 1]
청국장 추출물을 유효성분으로 포함하는 전신면역 또는 장관면역 보강제 (adjuvant)에 있어서， 상기 청국장 추출물은 에탄올을 이용하여 추출된 에탄올—용해 (ethanol-soluble) 성분을 포함하는 것을 특징으로 하는 전신면역 또는 장관면역 보강제 (adjuvant).
【청구항 2】
제 1 항에 있어서， 상기 에탄을은 50-99% 에탄올인 것을 특징으로 하는 보강제 .
【청구항 3]
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서 , 상기 청국장 추출물은 PGA(poly-Y- glutamic acid)가 제거된 추출물인 것을 특징으로 하는 보강제.
【청구항 4]
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서， 상기 청국장 추출물은 PGA 및 레반 (Levan)이 제거된 추출물인 것을 특징으로 하는 보강제.
【청구항 5】
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서， 상기 청국장은 바실러스 아밀로리퀴페시언스^ 이용하여 제조된 것을 특징으로 하는 보강제. 【청구항 6】
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서， 상기 보강제는 면역원 단백질과 경구투여되는 경우 혈중에서의 면역원 특이적 IgG 및 소장에서의 면역원 특이적 igA의 생성을 촉진하는 것을 특징으로 하는 보강제 . 【청구항 7】
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서， 상기 보강제는 면역원 단백질과 경구투여되는 경우 비장 내 IL— 12의 생성을 증가시키는 것을 특징으로 하는 장관면역 보강제 .
【청구항 8】
계 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 보강제는 면역원 단백질과 경구투여되는 경우 비장 내 IL-4 및 IL— 5 의 생성을 증가시키는 것을 특징으로 하는 장관면역 보강제 . ί청구항 9】
제 8 항에 있어서， 상기 보강제는 면역원 단백질과 경구투여되는 경우 면역원 단백질의 단독 경구투여와 비교하여 비장 내 ILᅳ 4/IFN— γ의 상대적 생산비율이 5-30 배 증가되는 것을 특징으로 하는 장관면역 보강제 .
【청구항 10]
(a) 면역원 단백질 및 (b) 전신면역 또는 장관면역 보강제로서의 청국장 추출물을 유효성분으로 포함하며ᅳ 상기 청국장 추출물은 에탄을을 이용하여 추출된 에탄을 용해 성분을 포함하는 것을 특징으로 하는 전신면역 또는 장관면역을 유발하기 위한 경구투여용 백신 조성물.
【청구항 111
제 10항에 있어서， 상기 에탄을은 50%내지 99%에탄올인 것올 특징으로 하는 경구투여용 백신 조성물.
【청구항 12]
제 10 항 또는 제 11 항에 있어서， 상기 전신면역 또는 장관면역 보강제로서의 청국장 추출물은 PGA 가 제거된 추출물인 것을 특징으로 하는 경구투여용 백신 조성물. 【청구항 13】
제 10 항 또는 제 11 항에 있어서， 상기 전신면역 또는 장관면역 보강제로서의 청국장 추출물은 PGA 및 레반이 제거된 추출물인 것을 특징으로 하는 경구투여용 백신 조성물. ί청구항 14]
제 10 항 또는 제 11 항에 있어서, 상기 보강제는 면역원 단백질과 경구투여되는 경우 혈중에서의 면역원 특이적 IgG 및 소장에서의 면역원 특이적 IgA의 생성을 촉진하는 것을 특징으로 하는 조성물.
【청구항 15】
제 10 항 또는 제 11 항에 있어서, 상기 보강제는 면역원 단백질과 경구투여되는 경우 비장 내 IL— 12의 생성을 증가시키는 것올 특징으로 하는 조성물.
【청구항 16]
제 10 항 또는 제 11 항에 있어서， 상기 보강제는 면역원 단백질과 경구투여되는 경우 비장 내 IL-4 및 IL-5 의 생성을 증가시키는 것을 특징으로 하는 조성물.
【청구항 17]
제 16 항에 있어서， 상기 보강제는 면역원 단백질과 경구투여되는 경우 면역원의 단독 경구투여와 비교하여 비장 내 IL— 4/IFN-Y의 상대적 생산비율이 5-30 배 증가되는 것을 특징으로 하는 조성물.
【청구항 18]
청국장의 에탄을 추출물 중에서 에탄을 -용해 (ethanol-soluble) 성분을 포함하는 조성물을 대상 (subject)에 투여하는 단계를 포함하는 전신면역 또는 장관면역 반웅 유도 방법 . 【청구항 19】
(a) 면역원 단백질 및 (b) 청국장의 에탄올 추출물 중에서 에탄올- 용해 (ethanol— soluble) 성분을 포함하는 경구투여용 백신 조성물을 대상 (subject)에 투여하는 단계를 포함하는 특정 면역원 단백질에 대한 전신면역 또는 장관면역 반웅 유도 방법 .
PCT/KR2013/001945 2012-03-28 2013-03-11 청국장 추출물을 유효성분으로 포함하는 전신면역 또는 장관면역 보강제 WO2013147439A1 (ko)

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