WO2013146555A1 - ステビオール配糖体の製造方法 - Google Patents

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WO2013146555A1 PCT/JP2013/058188 JP2013058188W WO2013146555A1 WO 2013146555 A1 WO2013146555 A1 WO 2013146555A1 JP 2013058188 W JP2013058188 W JP 2013058188W WO 2013146555 A1 WO2013146555 A1 WO 2013146555A1
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小埜栄一郎
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Definitions

  • the present invention relates to a method for producing steviol glycosides, a transformant that highly expresses steviol glycoside, a steviol glycoside produced by the method, and use thereof.
  • Stevia rebaudiana leaves contain a secondary metabolite called Steviol, a diterpenoid, and steviol glycosides are about 300 times sweeter than sugar. It is used in the food industry as a sweetener. Obesity has been developed internationally as a serious social problem, and the demand for calorie-free sweeteners is increasing day by day from the viewpoint of promoting health and reducing medical costs. At present, artificially synthesized amino acid derivatives such aspartame and acesulfame potassium are used as artificial sweeteners, but naturally-occurring calorie-less sweeteners such as steviol glycosides are more It is expected that it will be safe and easy for consumers to understand.
  • Steviol contained in stevia leaves is finally modified with a sugar to a glycoside called Rebaudioside A with four sugars (FIG. 1).
  • the precursor steviol trisaccharide glycoside, stevioside is the most abundant in quantity, and rebaudioside A and stevioside are the main substances of stevia sweetness.
  • glycosides that are considered to be reaction intermediates and analogs with different types of sugars are known. Enzyme genes that lead to biosynthesis of rebaudioside A have been isolated through Stevia's Expressed Sequence Tag (EST) analysis (Non-patent Documents 1 and 2, Patent Document 1).
  • EST Stevia's Expressed Sequence Tag
  • Steviol is hydroxylated at the 13th position of ent-kaurenoic acid, which is a precursor of the plant hormone diterpenoid Gibberellin, by entauurelic acid 13-position hydroxylase (EK13H), which is a cytochrome P450 enzyme.
  • EK13H entauurelic acid 13-position hydroxylase
  • FIG. 2 Non-patent Document 3, Patent Document 1).
  • Steviol is first glycosylated (monoglucosylated) at the 13-position hydroxyl group by UGT85C2 to produce steviolmonoside.
  • Step 2 of steviol monoside is called steviolbioside by further glucosylation of the 13th glucose of steviol monoside, or the 19th carboxyl group of steviol monoside is glucosylated and called rubusoside.
  • a glycoside is produced. It is believed that steviolbioside and rubusoside thus produced are further glycosylated to produce steviol glycosides such as stevioside and rebaudioside A.
  • UGT74G1 and UGT76G1 are known as enzyme genes involved in the production of steviol glycosides. UGT74G1 is known to catalyze glucosylation at position 19 of steviolmonoside (Non-Patent Document 1). UGT74G1 also glucosylates steviolbioside to produce stevioloside, a steviol trisaccharide glycoside. It is known that this stevioside has the highest content in stevia leaves and has a sweetness of about 250 to 300 times that of sugar.
  • This stevioside is further glucosylated by UGT76G1 to produce rebaudioside A, which is a steviol tetrasaccharide glycoside having the highest sweetness (350 to 450 times that of sugar) and good taste.
  • rebaudioside A is a steviol tetrasaccharide glycoside having the highest sweetness (350 to 450 times that of sugar) and good taste.
  • UGT76G1 a steviol tetrasaccharide glycoside having the highest sweetness (350 to 450 times that of sugar) and good taste.
  • UGT76G1 a steviol tetrasaccharide glycoside having the highest sweetness (350 to 450 times that of sugar) and good taste.
  • UGT76G1 a steviol tetrasaccharide glycoside having the highest sweetness (350 to 450 times that of sugar) and good taste.
  • UGT76G1 a steviol tetrasaccharide glycoside having the highest sweetness (350 to
  • Steviol comprising a step of reacting a protein according to any one selected from the group consisting of the following (a) to (c), a UDP-sugar, and a compound represented by the following general formula (I): A method for producing glycosides.
  • a protein having an activity of adding a sugar molecule to the carboxyl group of (C) An amino acid sequence having 90% or more sequence identity with respect to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, and a sugar molecule is added to the carboxyl group at position 19 of the compound represented by the following general formula (I) Protein with active activity
  • R 1 is H, C 1 -C 20 alkyl group, C 2 -C 20 alkenyl group, C 2 -C 20 alkynyl group, C 4 -C 20 alkyl dienyl group, C 6 -C 18 aryl group , C 6 ⁇ C 20 alkylaryl group, C 6 ⁇ C 20 aryl alkyl group
  • A a polynucleotide comprising the base sequence of SEQ ID NO: 1;
  • B a polynucleotide encoding a protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2;
  • C The amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, consisting of an amino acid sequence in which 1 to 48 amino acids are deleted, substituted, inserted and / or added, and the 19th position of the compound represented by the following general formula (I)
  • a sugar molecule is added to the carboxyl group at the 19th position of the compound represented by the following general formula (I) having an amino acid sequence having 90% or more sequence identity to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2.
  • [18] A method for producing steviol glycosides, wherein the non-human transformant according to [9] is used. [19] The method according to [18], wherein the steviol glycoside is steviolbioside, stevioside, rebaudioside A, rebaudioside B, rebaudioside C, rebaudioside D, rebaudioside E, rebaudioside F, or a combination thereof. [20] A protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2. [21] A polynucleotide encoding a protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2. [22] The polynucleotide according to [21], comprising the base sequence of SEQ ID NO: 1.
  • steviol glycosides for example, rubusoside, stevioside, rebaudioside A, etc.
  • the transformant of the present invention has a high content of steviol glycosides (for example, rubusoside, stevioside, rebaudioside A, etc.)
  • steviol glycosides for example, rubusoside, Stevioside and rebaudioside A etc.
  • FIG. 1 The name and structure of steviol glycosides are shown.
  • “Glc-Glc ( ⁇ 2 ⁇ 1)” indicates that “Glc-Glc” is linked by ⁇ 2,1 glycosidic bond
  • “Glc-Glc ( ⁇ 3 ⁇ 1)” is “Glc-Glc”.
  • SDS-PAGE result of stevia UGT protein expressed in E. coli. The left is the pellet fraction and the right is the CBB-stained diagram of the fraction eluted with imidazole solution. An asterisk indicates the expressed recombinant protein.
  • Fig. 5 shows glycosylation activity of UGT85C2 protein against steviol.
  • the chromatogram of a standard steviol glycoside is shown.
  • the CDS sequence and amino acid sequence of UGT85C2 are SEQ ID NOS: 1 and 2, respectively.
  • the polynucleotide and the enzyme can be obtained by the methods described in the examples below, known genetic engineering methods, known synthetic methods, and the like.
  • the present invention provides a protein according to any one selected from the group consisting of the following (a) to (c) (hereinafter referred to as “protein of the present invention”), UDP-sugar, Provided is a method for producing steviol glycosides, which comprises a step of reacting a compound represented by the following general formula (I).
  • A a protein comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2;
  • B in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, consisting of an amino acid sequence in which 1 to 48 amino acids are deleted, substituted, inserted and / or added, and at the 19th position of the compound represented by the general formula (I)
  • C A sugar molecule is added to the carboxyl group at position 19 of the compound represented by the general formula (I), having an amino acid sequence having 90% or more sequence identity with respect to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2.
  • R 1 is H, C 1 -C 20 alkyl group, C 2 -C 20 alkenyl group, C 2 -C 20 alkynyl group, C 4 -C 20 alkyl dienyl group, C 6 -C 18 aryl group , C 6 ⁇ C 20 alkylaryl group, C 6 ⁇ C 20 aryl alkyl group, C 4 ⁇ C 20 cycloalkyl group, C 4 ⁇ C 20 cycloalkenyl group, (C 3 ⁇ C 10 cycloalkyl) C 1 ⁇ C 10 represents an alkyl group or a sugar residue.)
  • the protein described in (b) or (c) above is typically a naturally occurring variant of the polypeptide of SEQ ID NO: 2, for example, “Sambrook & Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual Vol.
  • a compound of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 consisting of an amino acid sequence in which 1 to 48 amino acids are deleted, substituted, inserted and / or added, and represented by the general formula (I)”
  • Examples of the protein having an activity of adding a sugar molecule to the carboxyl group at the 19th position include, for example, 1 to 48, 1 to 47, 1 to 46, 1 to 45, 1 in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2.
  • Such a protein includes the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, 90% or more, 91% or more, 92% or more, 93% or more, 94% or more, 95% or more, 96% or more, 97% or more, 98% 99% or more, 99.1% or more, 99.2% or more, 99.3% or more, 99.4% or more, 99.5% or more, 99.6% or more, 99.7% or more, 99.
  • the activity of adding a sugar molecule to the 19-position carboxyl group of the compound represented by the general formula (I) means that a sugar is added to the 19-position carboxyl group of the compound represented by the following general formula (I). Means activity to be added.
  • R 1 is H, C 1 to C 20 alkyl group, C 2 to C 20 alkenyl group, C 2 to C 20 alkynyl group, C 4 to C 20 alkyl dienyl group, C 6 to C 18. aryl group, C 6 ⁇ C 20 alkylaryl group, C 6 ⁇ C 20 aryl alkyl group, C 4 ⁇ C 20 cycloalkyl group, C 4 ⁇ C 20 cycloalkenyl group, (C 3 ⁇ C 10 cycloalkyl) C 1 ⁇ C 10 alkyl group or a sugar residue.
  • C 1 ⁇ C 20 alkyl group is preferably a C 1 ⁇ C 10 alkyl group, more preferably a C 1 ⁇ C 6 alkyl group.
  • alkyl groups include, but are not limited to, methyl, ethyl, propyl, isopropyl, n-butyl, sec-butyl, tert-butyl, pentyl, hexyl, dodecanyl and the like.
  • C 2 ⁇ C 20 alkenyl group is preferably C 2 ⁇ C 10 alkenyl group, more preferably a C 2 ⁇ C 6 alkenyl group.
  • alkenyl groups include, but are not limited to, vinyl, allyl, propenyl, isopropenyl, 2-methyl-1-propenyl, 2-methylallyl, 2-butenyl and the like.
  • C 2 ⁇ C 20 alkynyl group is preferably C 2 ⁇ C 10 alkynyl groups, more preferably C 2 ⁇ C 6 alkynyl group.
  • alkynyl groups include, but are not limited to, ethynyl, 2-propynyl, 2-butynyl, and the like.
  • C 4 ⁇ C 20 alkyldienyl group is more preferably preferably C 4 ⁇ C 10 alkadienyl group, a C 4 ⁇ C 6 alkyldienyl group.
  • alkyldienyl groups include, but are not limited to, 1,3-butadienyl and the like.
  • the “C 6 -C 18 aryl group” is preferably a C 6 -C 10 aryl group. Examples of the aryl group include, but are not limited to, phenyl, 1-naphthyl, 2-naphthyl, indenyl, biphenylyl, anthryl, phenanthryl and the like.
  • the “C 6 -C 20 alkylaryl group” is preferably a C 6 -C 12 alkylaryl group.
  • alkylaryl groups include, but are not limited to, o-tolyl, m-tolyl, p-tolyl, 2,3-xylyl, 2,4-xylyl, 2,5-xylyl, o-cumenyl, m -Cumenyl, p-cumenyl, mesityl and the like can be mentioned.
  • the “C 6 -C 20 arylalkyl group” is preferably a C 6 -C 12 arylalkyl group.
  • arylalkyl groups include, but are not limited to, benzyl, phenethyl, diphenylmethyl, triphenylmethyl, 1-naphthylmethyl, 2-naphthylmethyl, 2,2-diphenylethyl, 3-phenylpropyl, 4-phenyl Examples include phenylbutyl and 5-phenylpentyl.
  • the “C 4 -C 20 cycloalkyl group” is preferably a C 4 -C 10 cycloalkyl group.
  • Examples of cycloalkyl groups include, but are not limited to, cyclopropyl, cyclobutyl, cyclopentyl, cyclohexyl and the like.
  • C 4 -C 20 cycloalkenyl group is preferably a C 4 -C 10 cycloalkenyl group.
  • Examples of cycloalkenyl groups include, but are not limited to, cyclopropenyl, cyclobutenyl, 2-cyclopenten-1-yl, 2-cyclohexen-1-yl, 3-cyclohexen-1-yl, and the like.
  • examples of “(C 3 -C 10 cycloalkyl) C 1 -C 10 alkyl group” include methylcyclopropyl, ethylcyclopropyl, methylcyclobutyl, ethylcyclopentyl, methylcyclohexyl and the like. it can.
  • the “sugar residue” is not particularly limited, but may be a sugar residue composed of one or more pentoses, hexoses or combinations thereof (excluding xylose, rhamnose or combinations thereof).
  • the “sugar residue” is a sugar residue composed of one or more hexose units, more preferably a glucose monomer (-Glc), a glucose dimer (-Glc-Glc) or a glucose trimer. It is a sugar residue of (-Glc (Glc) -Glc).
  • the glucoses are preferably linked by ⁇ 2, 1 glycosidic bonds.
  • the glucoses are preferably linked by ⁇ 2, 1 glycoside bond and ⁇ 3, 1 glycoside bond.
  • the compound of general formula (I) is steviolmonoside, steviolbioside or steviol.
  • the sugar molecule added to the carboxyl group at the 19th position of the compound represented by the general formula (I) by the protein of the present invention is not particularly limited, but may be a sugar molecule composed of one or more pentoses, hexoses, or a combination thereof. Good (excluding xylose, rhamnose or combinations thereof). Examples of pentose and hexose are as described above.
  • the sugar molecule is a hexose, more preferably a hexose selected from the group consisting of glucose, mannose and galactose. Most preferably, the sugar molecule is glucose.
  • the activity of adding a sugar molecule to the carboxyl group at the 19-position of the compound represented by the general formula (I) is 1 to 500 ng (preferably 50 to 200 ng, most preferably 100 ng) of the test protein, UDP sugar (for example, UDP -Glucose) 1 to 1000 ⁇ M (preferably 100 to 700 ⁇ M, most preferably 500 ⁇ M) and substrate compound (compound of general formula (I)) 1 to 500 ⁇ M (preferably 100 to 500 ⁇ M, most preferably 250 ⁇ M) After incubating at a temperature of 20 to 40 ° C.
  • the substrate compound is Purified and purified monoterpene was subjected to LC-MS analysis (Liquid Chromatography-Ma It can verify by analyzing by well-known methods, such as ss Spectrometry.
  • LC-MS analysis when a compound having a sugar molecule added to the carboxyl group at the 19-position of the compound represented by the general formula (I) is detected, the test protein is the compound represented by the general formula (I). It can be said that it has an activity of adding a sugar molecule to the 19th carboxyl group.
  • the sugar addition reaction is generally completed in about 1 minute to 12 hours.
  • the deletion, substitution, insertion and / or addition of one or more amino acid residues in the amino acid sequence of the protein of the present invention means that one or more amino acid residues in the same sequence are at one or more positions in the amino acid sequence. It means that there are deletion, substitution, insertion and / or addition of a plurality of amino acid residues, and two or more of deletion, substitution, insertion and addition may occur simultaneously. Examples of amino acid residues that can be substituted with each other are shown below. Amino acid residues contained in the same group can be substituted for each other.
  • Group A leucine, isoleucine, norleucine, valine, norvaline, alanine, 2-aminobutanoic acid, methionine, o-methylserine, t-butylglycine, t-butylalanine, cyclohexylalanine;
  • Group B aspartic acid, glutamic acid, isoaspartic acid , Isoglutamic acid, 2-aminoadipic acid, 2-aminosuberic acid;
  • group C asparagine, glutamine;
  • group D lysine, arginine, ornithine, 2,4-diaminobutanoic acid, 2,3-diaminopropionic acid;
  • group E Proline, 3-hydroxyproline, 4-hydroxyproline;
  • Group F serine, threonine, homoserine;
  • Group G phenylalanine, tyrosine.
  • the protein of the present invention can be obtained by expressing a polynucleotide encoding the same (see the “polynucleotide of the present invention” described later) in an appropriate host cell, but the Fmoc method (fluorenylmethyloxy) is used. It can also be produced by a chemical synthesis method such as a carbonyl method) or a tBoc method (t-butyloxycarbonyl method). In addition, Advanced Automation Peptide Protein Technologies, Perkin Elmer, Protein Technologies, PerSeptive, Applied Biosystems, and SHIMADZ synthesis can be used. In the present specification, “UDP-sugar” is a uridine diphosphate (UDP) -linked sugar.
  • the sugar moiety in the UDP-sugar include sugars composed of one or more pentoses, hexoses or combinations thereof (excluding xylose, rhamnose or combinations thereof). Examples of pentose and hexose are as described above.
  • the UDP-sugar is a UDP-hexose, more preferably a hexose selected from the group consisting of glucose, mannose and galactose. Most preferably, the UDP-sugar is UDP-glucose.
  • the method for producing steviol glycosides according to the present invention comprises reacting the protein of the present invention, a UDP sugar, and a compound represented by the general formula (I), to position 19 of the compound represented by the general formula (I).
  • a step of adding a sugar molecule to the carboxyl group, and a step of purifying the steviol glycoside produced in the step may be further included.
  • Examples of steviol glycosides produced by the method of the present invention include steviolbioside, stevioside, rebaudioside A, rebaudioside B, rebaudioside C, rebaudioside D, rebaudioside E, rebaudioside F, or combinations thereof. It is not limited to.
  • the produced steviol glycoside is extracted with an appropriate solvent (aqueous solvent such as water or organic solvent such as alcohol, ether and acetone), ethyl acetate and other organic solvents: water gradient, high performance liquid chromatography (High Performance Liquid). Chromatography (HPLC), gas chromatography, time-of-flight mass spectrometry (Time-of-Flight mass spectrometry: TOF-MS), ultra-high performance liquid chromatography (Ultra (High) Performance Liquid chromatography: UPLC, etc.) Can be purified by. 2.
  • aqueous solvent such as water or organic solvent such as alcohol, ether and acetone
  • ethyl acetate and other organic solvents water gradient, high performance liquid chromatography (High Performance Liquid). Chromatography (HPLC), gas chromatography, time-of-flight mass spectrometry (Time-of-Flight mass spectrometry: TOF-MS), ultra-high performance liquid chromatography (Ultra (High) Performance
  • Steviol glycoside-rich non-human transformant Steviol glycosides can also be produced in cells of bacteria (such as Escherichia coli or yeast), plants, insects, and mammals other than humans using the protein of the present invention. .
  • bacteria such as Escherichia coli or yeast
  • the protein of the present invention is an enzyme derived from stevia or a variant thereof, and is therefore expected to have high activity even in the intracellular environment.
  • the polynucleotide encoding the protein of the present invention is introduced into host cells derived from bacteria, plants, insects, mammals other than humans, etc.
  • Steviol glycosides can be generated by reacting the protein of the present invention with the UDP-sugar present in the cells and the compound represented by the general formula (I). Accordingly, the present invention provides a non-human transformant into which a polynucleotide according to any one selected from the group consisting of the following (a) to (e) (hereinafter referred to as “polynucleotide of the present invention”) is introduced ( Hereinafter, the “transformant of the present invention”) is provided.
  • a polynucleotide comprising the base sequence of SEQ ID NO: 1;
  • B a polynucleotide encoding a protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2;
  • C in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, consisting of an amino acid sequence in which 1 to 48 amino acids are deleted, substituted, inserted and / or added, and at the 19th position of the compound represented by the general formula (I)
  • D A sugar molecule is added to the carboxyl group at the 19th position of the compound having the amino acid sequence having 90% or more sequence identity with respect to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 and represented by the general formula (I)
  • polynucleotide means DNA or RNA.
  • a polynucleotide that hybridizes under highly stringent conditions encodes a polynucleotide comprising a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 or the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2.
  • Examples of hybridization methods include, for example, “Sambrook & Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual Vol. 3, Cold Spring Harbor, Laboratory Press 2001,” and “Ausubel, Current Protocol in Japan. Can be used.
  • “highly stringent conditions” means, for example, (1) 5 ⁇ SSC, 5 ⁇ Denhardt's solution, 0.5% SDS, 50% formamide, 50 ° C., (2) 0.2 ⁇ SSC, 0 1% SDS, 60 ° C., (3) 0.2 ⁇ SSC, 0.1% SDS, 62 ° C., (4) 0.2 ⁇ SSC, 0.1% SDS, 65 ° C., or (5) 0.1 ⁇ SSC,.
  • the conditions are 1% SDS and 65 ° C., but are not limited thereto. Under these conditions, it can be expected that DNA having high sequence identity can be efficiently obtained as the temperature is increased.
  • factors affecting the stringency of hybridization include multiple factors such as temperature, probe concentration, probe length, ionic strength, time, and salt concentration, and those skilled in the art can select these factors as appropriate. By doing so, it is possible to achieve the same stringency.
  • Alkphos Direct Labeling and Detection System GE Healthcare
  • the membrane was subjected to primary washing containing 0.1% (w / v) SDS at 55-60 ° C. After washing with a buffer, the hybridized DNA can be detected.
  • a commercially available reagent when preparing a probe based on a base sequence complementary to the base sequence of SEQ ID NO: 1 or a sequence complementary to all or part of the base sequence encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, a commercially available reagent When the probe is labeled with digoxigenin (DIG) using a PCR labeling mix (Roche Diagnostics, etc.), hybridization is performed using a DIG nucleic acid detection kit (Roche Diagnostics). Can be detected.
  • DIG digoxigenin
  • the hybridizable polynucleotide encodes the DNA of SEQ ID NO: 1 or the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 when calculated using the default parameters by homology search software such as FASTA, BLAST, etc.
  • sequence identity of an amino acid sequence or a base sequence is FASTA (Science 227 (4693): 1435-1441, (1985)), or the algorithm BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) by Carlin and Arthur (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 872264-2268, 1990; Proc Natl Acad Sci USA 90: 5873, 1993).
  • Programs called blastn, blastx, blastp, tblastn and tblastx based on the BLAST algorithm have been developed (Altschul SF, et al: J Mol Biol 215: 403, 1990).
  • polynucleotide of the present invention described above can be obtained by a known genetic engineering technique or a known synthesis technique.
  • the polynucleotide of the present invention is preferably introduced into a host while being inserted into an appropriate expression vector.
  • Suitable expression vectors are usually (I) a promoter capable of transcription in a host cell; (Ii) a polynucleotide of the present invention linked to the promoter; and (iii) an expression cassette comprising, as a component, a signal that functions in a host cell for transcription termination and polyadenylation of an RNA molecule.
  • a method for producing an expression vector a method using a plasmid, phage, cosmid or the like can be mentioned, but it is not particularly limited.
  • the specific type of vector is not particularly limited, and a vector that can be expressed in a host cell can be appropriately selected.
  • a promoter sequence is appropriately selected in order to reliably express the polynucleotide of the present invention, and a vector in which this and the polynucleotide of the present invention are incorporated into various plasmids or the like is used as an expression vector.
  • the expression vector of the present invention contains an expression control region (for example, a promoter, a terminator and / or an origin of replication) depending on the type of host to be introduced.
  • promoters for bacterial expression vectors
  • yeast promoters include GAL1 promoter, GAL10 promoter, glyceraldehyde 3-phosphate.
  • examples include a dehydrogenase promoter and a PH05 promoter.
  • examples of the filamentous fungal promoter include amylase and trpC.
  • promoters for expressing a target gene in plant cells include cauliflower mosaic virus 35S RNA promoter, rd29A gene promoter, rbcS promoter, and the enhancer sequence of the cauliflower mosaic virus 35S RNA promoter derived from Agrobacterium.
  • the mac-1 promoter added to the 5 'side of the mannopine synthase promoter sequence.
  • animal cell host promoters include viral promoters (eg, SV40 early promoter, SV40 late promoter, etc.).
  • the expression vector preferably contains at least one selectable marker.
  • markers include auxotrophic markers (ura5, niaD, TRP1, URA3, HIS3, LEU2), drug resistance markers (hygromycine, zeocin), geneticin resistance gene (G418r), copper resistance gene (CUP1) (Marin et al. al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol.
  • the production method (production method) of the transformant of the present invention is not particularly limited, and examples thereof include a method of transforming by introducing an expression vector containing the polynucleotide of the present invention into a host.
  • the transformant of the present invention is expected to produce steviol glycosides with high efficiency.
  • the host cell used for transformation is not particularly limited, and various known cells can be suitably used.
  • host cells include bacteria such as Escherichia coli, yeast (budding yeast Saccharomyces cerevisiae, fission yeast Schizosaccharomyces pombe), plant cells, and animal cells other than humans.
  • the host cell is a host cell capable of producing a compound represented by general formula (I) (preferably steviolmonoside, steviolbioside or steviol).
  • the host cell is not limited to those capable of producing the compound represented by the general formula (I) in a natural state, and for example, can produce the compound represented by the general formula (I). Those that have been recombined with known genes may also be used.
  • genes encoding an enzyme that contributes to the synthesis of the compound represented by the general formula (I) include EK13H, UGT74G1, UGT76G1 (Non-patent Document 2), and the like, but are not limited thereto.
  • a general formula (as a substrate) is added to the culture system of the transformant obtained by introducing the gene of the present invention into the host cell.
  • a compound of I) preferably steviolmonoside, steviolbioside or steviol
  • a plant extract containing the compound It is possible to produce steviol glycosides without introducing.
  • Appropriate culture media and conditions for the above-described host cells are well known in the art.
  • the organism to be transformed is not particularly limited, and examples thereof include various microorganisms exemplified for the host cells, animals other than plants or animals.
  • a method for transforming a host cell a publicly known method can be used. For example, electroporation method (Mackenxie, DA et al., Appl. Environ.
  • this invention provides the 2nd manufacturing method of a steviol glycoside characterized by using the transformant of this invention. Suitable culture media and conditions are well known in the art. The method for extracting and purifying steviol glycosides is as described above.
  • the steviol glycoside is not particularly limited, but is preferably selected from the group consisting of steviolbioside, stevioside, rebaudioside A, rebaudioside B, rebaudioside C, rebaudioside D, rebaudioside E, rebaudioside F, or combinations thereof. May be.
  • the transformant can be a plant transformant.
  • the plant transformant according to this embodiment is obtained by introducing a recombinant vector containing the polynucleotide according to the present invention into a plant so that the polypeptide encoded by the polynucleotide can be expressed.
  • the recombinant expression vector used for transformation of the plant body is not particularly limited as long as it is a vector capable of expressing the polynucleotide according to the present invention in the plant.
  • a vector include a vector having a promoter that constitutively expresses a polynucleotide in a plant cell or a vector having a promoter that is inducibly activated by an external stimulus.
  • promoters that constitutively express polynucleotides in plant cells include cauliflower mosaic virus 35S RNA promoter, rd29A gene promoter, rbcS promoter, mac-1 promoter, and the like.
  • promoters that are inducibly activated by external stimuli include the mouse mammary tumor virus (MMTV) promoter, tetracycline responsive promoter, metallothionein promoter, heat shock protein promoter, and the like.
  • Plants to be transformed in the present invention include whole plants, plant organs (eg leaves, petals, stems, roots, seeds, etc.), plant tissues (eg epidermis, phloem, soft tissue, xylem, vascular bundle, It means any of a palisade tissue, a spongy tissue, etc.) or a plant culture cell, or various forms of plant cells (eg, suspension culture cells), protoplasts, leaf sections, callus, and the like.
  • MMTV mouse mammary tumor virus
  • metallothionein promoter metallothionein promoter
  • heat shock protein promoter and the like.
  • Plants to be transformed in the present invention include whole plants, plant organs (eg leaves, petals, stems, roots, seeds,
  • the plant used for transformation is not particularly limited, and may be any plant belonging to the monocotyledonous plant class or the dicotyledonous plant class.
  • transformation methods known to those skilled in the art for example, Agrobacterium method, gene gun method, PEG method, electroporation method, etc.
  • Agrobacterium method for example, Agrobacterium method, gene gun method, PEG method, electroporation method, etc.
  • a method using Agrobacterium and a method for directly introducing it into plant cells are well known.
  • the constructed plant expression vector is introduced into an appropriate Agrobacterium (for example, Agrobacterium tumefaciens), and this strain is introduced into the leaf disk method (Hirofumi Uchimiya).
  • the plant genetic manipulation manual (1990), pages 27-31, Kodansha Scientific, Tokyo) can be used to infect sterile cultured leaf pieces to obtain transformed plants.
  • the method of Nagel et al (Micibiol. Lett., 67: 325 (1990)) can be used.
  • an expression vector is first introduced into Agrobacterium, and then the transformed Agrobacterium is introduced into Plant Molecular Biology Manual (Gelvin, SB et al., Academic Press Publishers).
  • plant tissue includes callus obtained by culturing plant cells.
  • a binary vector (such as pBI121 or pPZP202) can be used.
  • an electroporation method or a particle gun method is known.
  • a particle gun a plant body, a plant organ, or a plant tissue itself may be used as it is, or may be used after preparing a section, or a protoplast may be prepared and used.
  • the sample prepared in this manner can be processed using a gene transfer apparatus (for example, PDS-1000 (BIO-RAD)).
  • the treatment conditions vary depending on the plant or sample, but are usually performed at a pressure of about 450 to 2000 psi and a distance of about 4 to 12 cm.
  • a cell or plant tissue into which a gene has been introduced is first selected for drug resistance such as hygromycin resistance, and then regenerated into a plant by a conventional method.
  • Regeneration of a plant body from a transformed cell can be performed by a method known to those skilled in the art depending on the type of plant cell.
  • transformation is carried out by introducing a recombinant vector into the cultured cells using a gene gun, electroporation method or the like. Callus, shoots, hairy roots, etc. obtained as a result of transformation can be used as they are for cell culture, tissue culture or organ culture, and can be used at a suitable concentration using conventionally known plant tissue culture methods.
  • telomere can be regenerated into plants by administration of plant hormones (auxin, cytokinin, gibberellin, abscisic acid, ethylene, brassinolide, etc.).
  • plant hormones auxin, cytokinin, gibberellin, abscisic acid, ethylene, brassinolide, etc.
  • Whether or not the polynucleotide of the present invention has been introduced into a plant can be confirmed by PCR, Southern hybridization, Northern hybridization, or the like.
  • DNA is prepared from a transformed plant, PCR is performed by designing a DNA-specific primer. PCR can be performed under the same conditions as those used for preparing the plasmid.
  • the amplified product is subjected to agarose gel electrophoresis, polyacrylamide gel electrophoresis or capillary electrophoresis, stained with ethidium bromide, SYBR Green solution, etc., and the amplified product is detected as a single band, It can be confirmed that it has been transformed.
  • PCR can be performed using a primer previously labeled with a fluorescent dye or the like to detect an amplification product.
  • the present invention also includes a plant body into which the polynucleotide according to the present invention is introduced so that it can be expressed, or a progeny of the plant body having the same properties as the plant body, or a tissue derived therefrom.
  • transformation methods for various plants have already been reported.
  • transformant plant examples include solanaceous plants (eg, eggplant, tomato, capsicum, potato, tobacco, datura, physalis, petunia, calibracore, nilenbergia, etc.), legumes (eg, soybean, azuki bean, Peanuts, common bean, broad bean, Miyakogusa, etc.), rose family plants (eg, strawberries, ume, cherry, roses, blueberries, blackberries, bilberries, cassis, raspberries, tencha, etc.), dianthus plants (carnations, gypsophila etc.), chrysanthemum Family plants (Chrysanthemum, Gerbera, Sunflower, Daisy, Stevia, etc.), Orchidaceae plants (Orchid, etc.), Primrose plants (Cyclamen, etc.), Gentianaceae plants (Eustoma, Gentian, etc.), Iridaceae plants (Freesia, Ayame, Gladiolus)
  • legumes e
  • the plant to be transformed it is desirable to use a plant known to biosynthesize various glycosides using steviol as an aglycone.
  • examples of such a plant include stevia and tencha ( (Rubus suausissimus).
  • the plant transformed with the polynucleotide of the present invention hereinafter “the plant of the present invention” or “the plant of the present invention”
  • the plant of the present invention has an appropriate substrate, or when an appropriate substrate is added from the outside. More steviol glycosides can be produced compared to the wild type.
  • the plant of the present invention can easily obtain a complete plant body by growing seeds, cuttings, bulbs and the like of the plant of the present invention.
  • the plant of the present invention includes the whole plant body, plant organs (for example, leaves, petals, stems, roots, seeds, bulbs, etc.), plant tissues (for example, epidermis, phloem, soft tissue, xylem, vascular bundle, fences) Tissue, spongy tissue, etc.) or plant culture cells, or various forms of plant cells (eg, suspension culture cells), protoplasts, leaf sections, callus, and the like. 3. Extract of transformant and use thereof In another embodiment, the present invention also provides an extract of the transformant described above. When the transformant of the present invention has an appropriate substrate, or when an appropriate substrate is added from the outside, the extract of steviol glycoside is higher than that of its wild type.
  • the extract of the transformant of the present invention can be obtained by crushing the transformant using glass beads, a homogenizer, a sonicator or the like, centrifuging the crushed material, and collecting the supernatant. it can. Furthermore, you may give the further extraction process by the extraction method of the steviol glycoside mentioned above.
  • the extract of the transformant of the present invention can be used for applications such as production of foods, pharmaceuticals and industrial raw materials according to a conventional method. In another embodiment, the present invention also provides foods, pharmaceuticals, and industrial raw materials (raw materials such as foods) containing the extract of the transformant of the present invention.
  • foods, medicines, industrial raw materials and the like containing the extract of the transformant of the present invention contain steviol glycosides produced using the transformant of the present invention.
  • examples of the food of the present invention include nutritional supplements, health foods, functional foods, infant foods, elderly foods, and the like.
  • food is a generic term for solids, fluids, liquids, and mixtures thereof that can be consumed.
  • Nutritional supplements refer to foods that are enriched with specific nutritional components. Healthy food means food that is considered healthy or healthy, and includes nutritional supplements, natural foods, diet foods, and the like.
  • Functional food means food for replenishing nutritional components that fulfill the body's regulatory functions, and is synonymous with food for specified health use.
  • Infant food refers to food for children up to about 6 years old.
  • the food for the elderly refers to food that has been processed so that it can be easily digested and absorbed as compared to untreated food.
  • the food of the present invention uses a caloric-free steviol glycoside as a sweetener. For this reason, the food of the present invention is low in calories and has the merit of contributing to health promotion or health maintenance.
  • Examples of these food forms include bread, noodles, pasta, rice, confectionery (cake, ice cream, popsicle, donut, baked confectionery, candy, chewing gum, gummi, tablet confectionery, and dumplings and buns ), Agricultural products such as tofu and processed products thereof, refined sake, medicinal liquor, mirin, vinegar, soy sauce, miso, etc. It may be a food, fruit juice drink, soft drink, sports drink, alcoholic drink, tea or the like, or a seasoning.
  • Examples of further food forms include low-calorie beverages, non-sugar beverages, canned fruit, milk beverages, powdered beverages, yogurt, jelly, dressing, noodle soup, pickles, boiled, soy sauce, miso, salted, Vermont vinegar, sweet vinegar Pickles, sweet vinegar ginger, vinegar lotus root, pickles, tempura and hippo grilled sauce, grilled meat sauce, sauce, etc., gum, candy and rice cake, toothpaste, fried sweet potato, dashi roll, yakisoba sauce, chilled Chinese sauce, shimeji mochi, Examples include ice confectionery, sherbet, soft cream, kneaded products, snacks, rice crackers, corn cups, seasoned seaweed, sprinkles and sprinkles.
  • the dosage form of the pharmaceutical product (composition) of the present invention is not particularly limited, and can be any dosage form such as a solution, paste, gel, solid, and powder.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is an oil, lotion, cream, emulsion, gel, shampoo, hair rinse, hair conditioner, enamel, foundation, lipstick, funny, pack, ointment, powder, toothpaste, aerosol, cleansing foam, etc.
  • it can be used for bath preparations, hair nourishing agents, skin cosmetics, sunscreen agents and the like.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may further contain other pharmaceutically active ingredients (for example, anti-inflammatory ingredients) or auxiliary ingredients (for example, lubricating ingredients, carrier ingredients) as necessary. 4).
  • the present invention provides a method for screening for plants with high steviol glycoside content.
  • the method includes the following steps (1) to (3).
  • the step (1) can be carried out by extracting mRNA from the test plant.
  • the site of the test plant from which mRNA is extracted is not particularly limited, but is preferably a petal.
  • cDNA may be prepared from mRNA by reverse transcription.
  • step (2) the mRNA extracted above is hybridized under highly stringent conditions using a polynucleotide or oligonucleotide having a base sequence complementary to the polynucleotide of the present invention as a probe or primer. It can be carried out. High stringency conditions are as already described.
  • the polynucleotide or oligonucleotide is preferably 5 to 500 bp, more preferably 10 to 200 bp, and still more preferably 10 to 100 bp.
  • Polynucleotide or oligonucleotide can be easily synthesized using various automatic synthesizers (for example, AKTA oligopilot plus 10/100 (GE Healthcare)), or a third party (for example, Promega or It can also be entrusted to Takara).
  • AKTA oligopilot plus 10/100 GE Healthcare
  • a third party for example, Promega or It can also be entrusted to Takara.
  • the step (3) is performed by ordinary Southern blotting or Northern blotting (Sambrook, Fritsch and Maniatis, “ Molecular Cloning: A Laboratory Manual "2nd Edition (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press), microarray (Affymetrix; U.S. Patent Nos.
  • step (3) performs a PCR amplification reaction, and the obtained amplification product is electrolyzed.
  • Electrophoresis or sequencing can be used for analysis to detect by hybridization.
  • the plant body in which more hybridization was detected expresses more protein having the activity of adding a sugar molecule to the carboxyl group at the 19th position of the compound represented by the following general formula (I) than other plant bodies. Therefore, it is predicted that the steviol glycoside content is high.
  • Example 1 Isolation of a candidate gene for steviolbioside glucosidase
  • UGT85C2 (GENBANK Accession No. AY345978) transfers a single molecule of glucose to the hydroxyl group at position 13 of steviol. It has been reported that it has activity to produce steviol monoglucoside.
  • PCR was performed using cDNA prepared from stevia leaves as a template with the following primer set (SEQ ID NOs: 3 and 4).
  • Stevia leaf cDNA was obtained by extracting total RNA from stevia leaf using RNeasy Plant Mini kit (QIAGEN), and 0.5 ⁇ g of the RNA was subjected to reverse transcription (RT) reaction with Random Oligo-dT primer.
  • the PCR reaction solution 50 ⁇ l was composed of 1 ⁇ l of stevia leaf-derived cDNA, 1 ⁇ ExTaq buffer (TaKaRaBio), 0.2 mM dNTPs, each primer 0.4 pmol / ⁇ l, and ExTaq polymerase 2.5 U.
  • the PCR reaction was carried out at 94 ° C. for 3 minutes, followed by amplification for a total of 30 cycles of 94 ° C. for 1 minute, 50 ° C.
  • PCR product was electrophoresed on a 0.8% agarose gel and stained with ethidium bromide. As a result, an amplified band having a size of about 1.4 kb estimated from each template DNA was obtained.
  • This PCR product was subcloned into pENTR-TOPO Directional Vector (Invitrogen) by the method recommended by the manufacturer.
  • the DNA sequencer model 3100 (Applied Biosystems) was used, and the sequence was determined by the primer walking method using synthetic oligonucleotide primers.
  • the cultured transformants are collected by centrifugation (5,000 ⁇ g, 10 min), and Buffer S [20 mM HEPES buffer (pH 7.5), 20 mM imidazolol, 14 mM ⁇ -mercaptoethanol] is added at 1 ml / g cell. And suspended. Subsequently, ultrasonic crushing (15 sec ⁇ 8 times) was performed, and centrifugation (15,000 ⁇ g, 15 min) was performed. The obtained supernatant was recovered as a crude enzyme solution. The crude enzyme solution was loaded on His SpinTrap (GE Healthcare) equilibrated with Buffer S and centrifuged (70 ⁇ g, 30 sec).
  • the protein bound to the column was eluted stepwise with 5 ml each of Buffer S containing 100 mM and 500 mM imidazole. Each elution fraction was substituted with 20 mM HEPES buffer (pH 7.5) and 14 mM ⁇ -mercaptoethanol using Microcon YM-30 (Amicon) (dialysis magnification 1000 times).
  • a protein was confirmed in the vicinity of an estimated molecular weight of about 50 kDa of the HisTag-fused UGT85C2 chimeric protein in the fraction eluted with 500 mM imidazole, and this fraction was used for enzyme analysis (FIG. 2).
  • UGT85C2 protein obtained new knowledge that the 13-position hydroxyl group of steviol was glucosylated, and the 19-position carboxyl group of steviol monoside and steviolbioside was also glucosylated. From these enzyme analysis results, in stevia, stevioside (FIG. 4: third panel: peak E) is steviolbioside (FIG. 4: third panel: peak C) and rubusoside (FIG. 4: first panel: peak D). It was suggested that there are two biosynthetic pathways through.
  • steviol monoside and the carboxyl group at position 19 of steviolbioside can be glycosylated using UGT85C2 gene, and the sweetness and taste quality of steviol glycoside can be improved.
  • the present invention reveals the entire biosynthetic pathway to rebaudioside A, and provides a molecular tool for producing rebaudioside A, stevioside, and other related compounds that are caloric-less natural sweeteners not only in plants but also in microorganisms.
  • Sequence number 3 Synthetic DNA Sequence number 4: Synthetic DNA Sequence listing

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Abstract

　本発明は、ステビオール配糖体の製造方法を提供することを目的とする。　本発明は、ステビオール配糖体の製造方法を提供する。本発明は、ステビオール配糖体化酵素遺伝子を導入した形質転換体及び当該形質転換体を用いたステビオール配糖体の製造方法を提供する。

Description

ステビオール配糖体の製造方法
　本発明は、ステビオール配糖体の製造方法、ステビオール配糖体化酵素を高発現する形質転換体並びに前記方法により作製されたステビオール配糖体及びその利用に関する。
　キク科ステビア（Ｓｔｅｖｉａ　ｒｅｂａｕｄｉａｎａ）の葉にはジテルペノイドの一種であるステビオール（Ｓｔｅｖｉｏｌ）とよばれる二次代謝産物が含まれており、ステビオール配糖体は砂糖の約３００倍もの甘味を呈することからカロリーレスの甘味料として食品産業に利用されている。肥満が深刻な社会問題として国際的に発展しており、健康増進および医療費削減の観点からもカロリーレスの甘味料の要望は日々大きくなっている。現在では人工的に合成されたアミノ酸誘導体のアスパルテーム（Ａｓｐａｒｔａｍｅ）やアセスルファムカリウム（Ａｃｅｓｕｌｆａｍｅ　Ｐｏｔａｓｓｉｕｍ）が人工甘味料として利用されているが、ステビオール配糖体のように天然に存在するカロリーレス甘味料がより安全で消費者理解（Ｐｕｂｌｉｃ　Ａｃｃｅｐｔａｎｃｅ）が得られやすいと期待される。
　ステビアの葉に含まれるステビオールは最終的には４つの糖が付いたレバウディオシドＡ（Ｒｅｂａｕｄｉｏｓｉｄｅ　Ａ）と呼ばれる配糖体にまで糖で修飾される（図１）。その前駆体であるステビオール三糖配糖体のステビオシド（Ｓｔｅｖｉｏｓｉｄｅ）が量的に最も多く、レバウディオシドＡとステビオシドがステビアの甘味の中心的な物質である。これら以外に反応中間体と思われる配糖体や糖の種類が異なる類縁体の存在が知られている。
　レバウディオシドＡの生合成に至る酵素遺伝子はステビアのＥｘｐｒｅｓｓｅｄ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　Ｔａｇ（ＥＳＴ）解析を通じて単離されている（非特許文献１及び２、特許文献１）。植物ホルモンであるジテルペノイドのジベレリン（Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌｉｎ）の前駆体であるエントカウレン酸（ｅｎｔ−ｋａｕｒｅｎｏｉｃ　ａｃｉｄ）の１３位がチトクロームＰ４５０酵素であるエントカウレン酸１３位水酸化酵素（ＥＫ１３Ｈ）によって水酸化されることでステビオールが生成する（図２）（非特許文献３、特許文献１）。ステビオールはまず１３位の水酸基がＵＧＴ８５Ｃ２によって配糖体化（モノグルコシル化）されることでステビオールモノシド（Ｓｔｅｖｉｏｌｍｏｎｏｓｉｄｅ）が生成する。ステビオールモノシドの１３位のグルコースの２位が更にグルコシル化されることでステビオールビオシド（Ｓｔｅｖｉｏｌｂｉｏｓｉｄｅ）、あるいはステビオールモノシドの１９位のカルボキシル基がグルコシル化されてルブソシド（Ｒｕｂｕｓｏｓｉｄｅ）と呼ばれるステビオールの二糖配糖体が生じる。このように生成したステビオールビオシドやルブソシドが更に配糖体化され、ステビオシドやレバウディオシドＡ（Ｒｅｂａｕｄｉｏｓｉｄｅ　Ａ）のようなステビオール配糖体を生じると考えられている。ステビオール配糖体の生成に関わる酵素遺伝子としてＵＧＴ７４Ｇ１やＵＧＴ７６Ｇ１が知られている。
　ＵＧＴ７４Ｇ１は、ステビオールモノシドの１９位のグルコシル化を触媒することが知られている（非特許文献１）。ＵＧＴ７４Ｇ１は、また、ステビオールビオシドをグルコシル化し、ステビオール三糖配糖体のステビオシド（Ｓｔｅｖｉｏｓｉｄｅ）を生じる。このステビオシドがステビア葉で最も含有量が多く、砂糖の２５０~３００倍程の甘味を呈することが知られている。このステビオシドがさらにＵＧＴ７６Ｇ１によってグルコシル化されて、最も甘味が高く（砂糖の３５０~４５０倍）、且つ味質が良いとされるステビオール四糖配糖体であるレバウディオシドＡ（Ｒｅｂａｕｄｉｏｓｉｄｅ　Ａ）が生成する。
　先行研究（非特許文献２）ではステビアの葉のＥＳＴ解析から数種類の配糖体化酵素（ＵＧＴ）が報告されているが、それら全ての詳細な酵素活性は十分検討されていない。
ＥＰ１８９７９５１Ｂ１ Ｂｒａｎｄｌｅ　ａｎｄ　Ｔｅｌｍｅｒ（２００７）Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　６８，１８５５−１８６３ Ｒｉｃｈｍａｎ　ｅｔ　ａｌ（２００５）Ｐｌａｎｔ　Ｊ．４１，５６−６７ Ｍｉｚｕｔａｎｉ　ａｎｄ　Ｏｈｔａ（２０１０）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｌａｎｔ　Ｂｉｏｌ．６１，２９１−３１５
　本発明者らは鋭意研究を遂行した結果、ステビアにおいてステビオール配糖体の１９位カルボキシル基への糖付加反応を触媒する酵素及び同酵素をコードする遺伝子配列を同定することに成功した。本発明は、上記知見に基づくものである。
　即ち、本発明は、以下のとおりである。
［１］　以下の（ａ）~（ｃ）よりなる群より選ばれるいずれかに記載のタンパク質と、ＵＤＰ−糖と、下記一般式（Ｉ）で示される化合物とを反応させる工程を含む、ステビオール配糖体の製造方法。
（ａ）配列番号２のアミノ酸配列からなるタンパク質；
（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列において、１~４８個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ下記一般式（Ｉ）で示される化合物の１９位のカルボキシル基に糖分子を付加する活性を有するタンパク質；
（ｃ）配列番号２のアミノ酸配列に対して、９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ下記一般式（Ｉ）で示される化合物の１９位のカルボキシル基に糖分子を付加する活性を有するタンパク質
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000003
（式中、Ｒ１はＨ、Ｃ１~Ｃ２０アルキル基、Ｃ２~Ｃ２０アルケニル基、Ｃ２~Ｃ２０アルキニル基、Ｃ４~Ｃ２０アルキルジエニル基、Ｃ６~Ｃ１８アリール基、Ｃ６~Ｃ２０アルキルアリール基、Ｃ６~Ｃ２０アリールアルキル基、Ｃ４~Ｃ２０シクロアルキル基、Ｃ４~Ｃ２０シクロアルケニル基、（Ｃ３~Ｃ１０シクロアルキル）Ｃ１~Ｃ１０アルキル基又は糖残基を表す。）
［２］　前記ＵＤＰ−糖における糖が、ヘキソースである、前記［１］に記載の方法。
［３］　前記ＵＤＰ−糖における糖が、グルコース、マンノース及びガラクトースからなる群より選択されるものである、前記［１］に記載の方法。
［４］　前記１９位のカルボキシル基に付加される糖が、ヘキソースである、前記［１］に記載の方法。
［５］　前記１９位のカルボキシル基に付加される糖が、グルコース、マンノース及びガラクトースからなる群より選択されるものである、前記［１］に記載の方法。
［６］　前記Ｒ１が、Ｈ又はグルコース単量体、グルコース２量体若しくはグルコース３量体の糖残基である、前記［１］に記載の方法。
［７］　前記化合物が、ステビオールモノシド、ステビオールビオシド又はステビオールである、前記［１］に記載の方法。
［８］　前記ステビオール配糖体が、ステビオールビオシド、ステビオシド、レバウディオシドＡ、レバウディオシドＢ、レバウディオシドＣ、レバウディオシドＤ、レバウディオシドＥ、レバウディオシドＦ又はこれらの組み合わせである、前記［１］に記載の方法。
［９］　以下の（ａ）~（ｅ）よりなる群より選ばれるポリヌクレオチドが導入された非ヒト形質転換体。
（ａ）配列番号１の塩基配列を含有するポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号２のアミノ酸配列において、１~４８個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ下記一般式（Ｉ）で示される化合物の１９位のカルボキシル基に糖分子を付加する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号２のアミノ酸配列に対して、９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ下記一般式（Ｉ）で示される化合物の１９位のカルボキシル基に糖分子を付加する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｅ）配列番号１の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドと高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、下記一般式（Ｉ）で示される化合物の１９位のカルボキシル基に糖分子を付加する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000004
（式中、Ｒ１はＨ、Ｃ１~Ｃ２０アルキル基、Ｃ２~Ｃ２０アルケニル基、Ｃ２~Ｃ２０アルキニル基、Ｃ４~Ｃ２０アルキルジエニル基、Ｃ６~Ｃ１８アリール基、Ｃ６~Ｃ２０アルキルアリール基、Ｃ６~Ｃ２０アリールアルキル基、Ｃ４~Ｃ２０シクロアルキル基、Ｃ４~Ｃ２０シクロアルケニル基、（Ｃ３~Ｃ１０シクロアルキル）Ｃ１~Ｃ１０アルキル基又は糖残基を表す。）
［１０］　前記糖分子が、ヘキソースである、前記［９］に記載の形質転換体。
［１１］　前記糖分子が、グルコース、マンノース及びガラクトースからなる群より選択されるものである、前記［９］に記載の形質転換体。
［１２］　前記Ｒ１が、Ｈ又はグルコース単量体、グルコース２量体若しくはグルコース３量体の糖残基の糖残基である、前記［９］に記載の形質転換体。
［１３］　前記化合物が、ステビオールモノシド、ステビオールビオシド又はステビオールである、前記［９］に記載の形質転換体。
［１４］　前記ポリヌクレオチドが、発現ベクターに挿入されたものである、前記［９］に記載の形質転換体。
［１５］　植物体である、前記［９］に記載の形質転換体。
［１６］　前記［９］に記載の形質転換体の抽出物。
［１７］　前記［１６］に記載の抽出物を含む食品、医薬品又は工業原料。
［１８］　前記［９］に記載の非ヒト形質転換体を用いることを特徴とするステビオール配糖体の製造方法。
［１９］　前記ステビオール配糖体が、ステビオールビオシド、ステビオシド、レバウディオシドＡ、レバウディオシドＢ、レバウディオシドＣ、レバウディオシドＤ、レバウディオシドＥ、レバウディオシドＦ又はこれらの組み合わせである、前記［１８］に記載の方法。
［２０］　配列番号２のアミノ酸配列からなるタンパク質。
［２１］　配列番号２のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
［２２］　配列番号１の塩基配列からなる、前記［２１］に記載のポリヌクレオチド。
　本発明の方法により、高効率にステビオール配糖体（例えば、ルブソシド、ステビオシド及びレバウディオシドＡ等）を製造することができる。また、本発明の形質転換体は、ステビオール配糖体（例えば、ルブソシド、ステビオシド及びレバウディオシドＡ等）の含有量が高いため、これらの形質転換体から、効率よくステビオール配糖体（例えば、ルブソシド、ステビオシド及びレバウディオシドＡ等）を抽出・精製することができる。
ステビオール配糖体群の名称と構造を示す。図１において「Ｇｌｃ−Ｇｌｃ（β２→１）」は「Ｇｌｃ−Ｇｌｃ」がβ２，１グリコシド結合により結合していることを示し、「Ｇｌｃ−Ｇｌｃ（β３→１）」は「Ｇｌｃ−Ｇｌｃ」がβ３，１グリコシド結合により結合していることを示す。 推定されているステビオール配糖体の生合成経路を示す。 大腸菌で発現させたステビアＵＧＴタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ結果。左はペレット画分、右はイミダゾール溶液による溶出画分のＣＢＢ染色図。アステリスクは発現した組換えタンパク質を示す。 ステビオールに対するＵＧＴ８５Ｃ２タンパク質の配糖体化活性を示す。 ステビオール配糖体標準品のクロマトグラムを示す。
　以下、本発明を詳細に説明する。以下の実施の形態は、本発明を説明するための例示であり、本発明をこの実施の形態のみに限定する趣旨ではない。本発明は、その要旨を逸脱しない限り、様々な形態で実施をすることができる。
　なお、本明細書において引用した全ての文献、および公開公報、特許公報その他の特許文献は、参照として本明細書に組み込むものとする。また、本明細書は、２０１２年３月２７日に出願された本願優先権主張の基礎となる日本国特許出願（特願２０１２−０７１９５９号）の明細書及び図面に記載の内容を包含する。
　本発明者らは、ステビオール配糖体の１９位のカルボキシル基への糖付加反応を担う酵素タンパク質が、ＵＧＴ８５Ｃ２であることを初めて解明した。
　ＵＧＴ８５Ｃ２のＣＤＳ配列及びアミノ酸配列は、それぞれ配列番号１及び２である。前記ポリヌクレオチド及び酵素は、後述の実施例に記載した手法、公知の遺伝子工学的手法、公知の合成手法等によって取得することが可能である。
１．ステビオール配糖体の製造方法
　本発明は、以下の（ａ）~（ｃ）よりなる群より選ばれるいずれかに記載のタンパク質（以下、「本発明のタンパク質」という）と、ＵＤＰ−糖と、下記一般式（Ｉ）で示される化合物とを反応させる工程を含む、ステビオール配糖体の製造方法を提供する。
（ａ）配列番号２のアミノ酸配列からなるタンパク質；
（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列において、１~４８個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ一般式（Ｉ）で示される化合物の１９位のカルボキシル基に糖分子を付加する活性を有するタンパク質；
（ｃ）配列番号２のアミノ酸配列に対して、９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ一般式（Ｉ）で示される化合物の１９位のカルボキシル基に糖分子を付加する活性を有するタンパク質
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000005
（式中、Ｒ１はＨ、Ｃ１~Ｃ２０アルキル基、Ｃ２~Ｃ２０アルケニル基、Ｃ２~Ｃ２０アルキニル基、Ｃ４~Ｃ２０アルキルジエニル基、Ｃ６~Ｃ１８アリール基、Ｃ６~Ｃ２０アルキルアリール基、Ｃ６~Ｃ２０アリールアルキル基、Ｃ４~Ｃ２０シクロアルキル基、Ｃ４~Ｃ２０シクロアルケニル基、（Ｃ３~Ｃ１０シクロアルキル）Ｃ１~Ｃ１０アルキル基又は糖残基を表す。）
　上記（ｂ）又は（ｃ）に記載のタンパク質は、代表的には、天然に存在する配列番号２のポリペプチドの変異体であるが、例えば、”Ｓａｍｂｒｏｏｋ　＆　Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ　Ｖｏｌ．３，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ　２００１”、”Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　Ｓｏｎｓ　１９８７−１９９７”、”Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．，１０，６４８７（１９８２）”、”Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７９，６４０９（１９８２）”、”Ｇｅｎｅ，３４，３１５（１９８５）”、”Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．，１３，４４３１（１９８５）”、”Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２，４８８（１９８５）”等に記載の部位特異的変異導入法を用いて、人為的に取得することができるものも含まれる。
　本明細書中、「配列番号２のアミノ酸配列において、１~４８個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ一般式（Ｉ）で示される化合物の１９位のカルボキシル基に糖分子を付加する活性を有するタンパク質」としては、配列番号２のアミノ酸配列において、例えば、１~４８個、１~４７個、１~４６個、１~４５個、１~４４個、１~４３個、１~４２個、１~４１個、１~４０個、１~３９個、１~３８個、１~３７個、１~３６個、１~３５個、１~３４個、１~３３個、１~３２個、１~３１個、１~３０個、１~２９個、１~２８個、１~２７個、１~２６個、１~２５個、１~２４個、１~２３個、１~２２個、１~２１個、１~２０個、１~１９個、１~１８個、１~１７個、１~１６個、１~１５個、１~１４個、１~１３個、１~１２個、１~１１個、１~１０個、１~９個（１~数個）、１~８個、１~７個、１~６個、１~５個、１~４個、１~３個、１~２個、又は１個のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ一般式（Ｉ）で示される化合物の１９位のカルボキシル基に糖分子を付加する活性を有するタンパク質が挙げられる。上記アミノ酸残基の欠失、置換、挿入及び／又は付加の数は、一般的には小さい程好ましい。
　また、このようなタンパク質としては、配列番号２のアミノ酸配列と９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、９９．１％以上、９９．２％以上、９９．３％以上、９９．４％以上、９９．５％以上、９９．６％以上、９９．７％以上、９９．８％以上、又は９９．９％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ一般式（Ｉ）で示される化合物の１９位のカルボキシル基に糖分子を付加する活性を有するタンパク質が挙げられる。上記配列同一性の数値は一般的に大きい程好ましい。
　ここで、「一般式（Ｉ）で示される化合物の１９位のカルボキシル基に糖分子を付加する活性」とは、下記一般式（Ｉ）で示される化合物の１９位のカルボキシル基に、糖を付加する活性を意味する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000006
　一般式（Ｉ）においてＲ１はＨ、Ｃ１~Ｃ２０アルキル基、Ｃ２~Ｃ２０アルケニル基、Ｃ２~Ｃ２０アルキニル基、Ｃ４~Ｃ２０アルキルジエニル基、Ｃ６~Ｃ１８アリール基、Ｃ６~Ｃ２０アルキルアリール基、Ｃ６~Ｃ２０アリールアルキル基、Ｃ４~Ｃ２０シクロアルキル基、Ｃ４~Ｃ２０シクロアルケニル基、（Ｃ３~Ｃ１０シクロアルキル）Ｃ１~Ｃ１０アルキル基又は糖残基を表す。
　本明細書において、「Ｃ１~Ｃ２０アルキル基」は、Ｃ１~Ｃ１０アルキル基であることが好ましく、Ｃ１~Ｃ６アルキル基であることが更に好ましい。アルキル基の例としては、制限するわけではないが、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、ヘキシル、ドデカニル等を挙げることができる。
　本明細書において、「Ｃ２~Ｃ２０アルケニル基」は、Ｃ２~Ｃ１０アルケニル基であることが好ましく、Ｃ２~Ｃ６アルケニル基であることが更に好ましい。アルケニル基の例としては、制限するわけではないが、ビニル、アリル、プロペニル、イソプロペニル、２−メチル−１−プロペニル、２−メチルアリル、２−ブテニル等を挙げることができる。
　本明細書において、「Ｃ２~Ｃ２０アルキニル基」は、Ｃ２~Ｃ１０アルキニル基であることが好ましく、Ｃ２~Ｃ６アルキニル基であることが更に好ましい。アルキニル基の例としては、制限するわけではないが、エチニル、２−プロピニル、２−ブチニル等を挙げることができる。
　本明細書において、「Ｃ４~Ｃ２０アルキルジエニル基」は、Ｃ４~Ｃ１０アルキルジエニル基であることが好ましく、Ｃ４~Ｃ６アルキルジエニル基であることが更に好ましい。アルキルジエニル基の例としては、制限するわけではないが、１，３−ブタジエニル等を挙げることができる。
　本明細書において、「Ｃ６~Ｃ１８アリール基」は、Ｃ６~Ｃ１０アリール基であることが好ましい。アリール基の例としては、制限するわけではないが、フェニル、１−ナフチル、２−ナフチル、インデニル、ビフェニリル、アントリル、フェナントリル等を挙げることができる。
　本明細書において、「Ｃ６~Ｃ２０アルキルアリール基」は、Ｃ６~Ｃ１２アルキルアリール基であることが好ましい。アルキルアリール基の例としては、制限するわけではないが、ｏ−トリル、ｍ−トリル、ｐ−トリル、２，３−キシリル、２，４−キシリル、２，５−キシリル、ｏ−クメニル、ｍ−クメニル、ｐ−クメニル、メシチル等を挙げることができる。
　本明細書において、「Ｃ６~Ｃ２０アリールアルキル基」は、Ｃ６~Ｃ１２アリールアルキル基であることが好ましい。アリールアルキル基の例としては、制限するわけではないが、ベンジル、フェネチル、ジフェニルメチル、トリフェニルメチル、１−ナフチルメチル、２−ナフチルメチル、２，２−ジフェニルエチル、３−フェニルプロピル、４−フェニルブチル、５−フェニルペンチル等を挙げることができる。
　本明細書において、「Ｃ４~Ｃ２０シクロアルキル基」は、Ｃ４~Ｃ１０シクロアルキル基であることが好ましい。シクロアルキル基の例としては、制限するわけではないが、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル等を挙げることができる。
　本明細書において、「Ｃ４~Ｃ２０シクロアルケニル基」は、Ｃ４~Ｃ１０シクロアルケニル基であることが好ましい。シクロアルケニル基の例としては、制限するわけではないが、シクロプロペニル、シクロブテニル、２−シクロペンテン−１−イル、２−シクロヘキセン−１−イル、３−シクロヘキセン−１−イル等を挙げることができる。
　本明細書において、「（Ｃ３~Ｃ１０シクロアルキル）Ｃ１~Ｃ１０アルキル基」の例としては、メチルシクロプロピル、エチルシクロプロピル、メチルシクロブチル、エチルシクロペンチル、メチルシクロヘキシル等を挙げることができる。
　本明細書において、「糖残基」は、特に限定されないが、１以上のペントース、ヘキソース又はその組み合わせからなる糖の残基であってもよい（キシロース、ラムノース又はその組み合わせを除く）。
　ペントースの例としてはリボース、アラビノース及びリキソースが挙げられ、ヘキソースの例としては、アロース、アルトロース、グルコース、マンノース、グロース、イドース、ガラクトース、タロースが挙げられる。
　好ましくは「糖残基」は、１以上のヘキソース単位からなる糖の残基であり、さらに好ましくはグルコース単量体（−Ｇｌｃ）、グルコース２量体（−Ｇｌｃ−Ｇｌｃ）又はグルコース３量体（−Ｇｌｃ（Ｇｌｃ）−Ｇｌｃ）の糖残基である。グルコース２量体の糖残基において、好ましくは、グルコース同士はβ２、１グリコシド結合により結合している。グルコース３量体の糖残基において、好ましくは、グルコース同士はβ２、１グリコシド結合及びβ３、１グリコシド結合により結合している。
　好ましくは、一般式（Ｉ）の化合物は、ステビオールモノシド、ステビオールビオシド又はステビオールである。
　本発明のタンパク質により一般式（Ｉ）で示される化合物の１９位のカルボキシル基に付加される糖分子は、特に限定されないが、１以上のペントース、ヘキソース又はその組み合わせからなる糖分子であってもよい（キシロース、ラムノース又はその組み合わせを除く）。ペントース及びヘキソースの例は上述の通りである。好ましくは前記糖分子は、ヘキソースであり、更に好ましくは、グルコース、マンノース及びガラクトースからなる群より選択されるヘキソースである。最も好ましくは、前記糖分子は、グルコースである。
　一般式（Ｉ）で示される化合物の１９位のカルボキシル基に糖分子を付加する活性は、被検タンパク質１~５００ｎｇ（好ましくは、５０~２００ｎｇ、最も好ましくは１００ｎｇ）、ＵＤＰ糖（例えば、ＵＤＰ−グルコース）１~１０００μＭ（好ましくは、１００~７００μＭ、最も好ましくは５００μＭ）、及び基質化合物（一般式（Ｉ）の化合物）１~５００μＭ（好ましくは、１００~５００μＭ、最も好ましくは２５０μＭ）を含むｐＨ６．０~８．０の中性領域の緩衝液（例えば、リン酸ナトリウムバッファー又はリン酸カリウムバッファー）中において、２０~４０℃の温度で１０分間~２時間インキュベートした後に、前記基質化合物を精製し、精製したモノテルペンをＬＣ−ＭＳ分析（Ｌｉｑｕｉｄ　Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ−Ｍａｓｓ　Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ）等の公知の手法により分析することで検証することができる。
　ＬＣ−ＭＳ分析の結果、一般式（Ｉ）で示される化合物の１９位のカルボキシル基に糖分子が付加した化合物が検出された場合、前記被検タンパク質は一般式（Ｉ）で示される化合物の１９位のカルボキシル基に糖分子を付加する活性を有するものと言える。
　前記糖付加反応は、一般に、１分~１２時間程度で終了する。
　本発明のタンパク質のアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入及び／又は付加されたとは、同一配列中の任意かつ１若しくは複数のアミノ酸配列中の位置において、１若しくは複数個のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入及び／又は付加があることを意味し、欠失、置換、挿入及び付加のうち２種以上が同時に生じてもよい。
　以下に、相互に置換可能なアミノ酸残基の例を示す。同一群に含まれるアミノ酸残基は相互に置換可能である。Ａ群：ロイシン、イソロイシン、ノルロイシン、バリン、ノルバリン、アラニン、２−アミノブタン酸、メチオニン、ｏ−メチルセリン、ｔ−ブチルグリシン、ｔ−ブチルアラニン、シクロヘキシルアラニン；Ｂ群：アスパラギン酸、グルタミン酸、イソアスパラギン酸、イソグルタミン酸、２−アミノアジピン酸、２−アミノスベリン酸；Ｃ群：アスパラギン、グルタミン；Ｄ群：リジン、アルギニン、オルニチン、２，４−ジアミノブタン酸、２，３−ジアミノプロピオン酸；Ｅ群：プロリン、３−ヒドロキシプロリン、４−ヒドロキシプロリン；Ｆ群：セリン、スレオニン、ホモセリン；Ｇ群：フェニルアラニン、チロシン。
　本発明のタンパク質は、これをコードするポリヌクレオチド（後述する「本発明のポリヌクレオチド」を参照）を適切な宿主細胞内で発現させることにより得ることができるが、Ｆｍｏｃ法（フルオレニルメチルオキシカルボニル法）、ｔＢｏｃ法（ｔ−ブチルオキシカルボニル法）等の化学合成法によっても製造することができる。また、Ａｄｖａｎｃｅｄ　Ａｕｔｏｍａｔｉｏｎ　Ｐｅｐｔｉｄｅ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製、Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ社製、、Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製、ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ社製、Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製、ＳＨＩＭＡＤＺＵ社製等のペプチド合成機を利用して化学合成することもできる。
　本明細書において、「ＵＤＰ−糖」とは、ウリジン二リン酸（Ｕｒｉｄｉｎｅ　ＤｉＰｈｏｓｐｈａｔｅ：ＵＤＰ）結合型の糖である。ＵＤＰ−糖における糖部分の好ましい例としては１以上のペントース、ヘキソース又はその組み合わせからなる糖が挙げられる（キシロース、ラムノース又はその組み合わせを除く）。ペントース及びヘキソースの例は上述の通りである。好ましくはＵＤＰ−糖は、ＵＤＰ−ヘキソースであり、更に好ましくは、グルコース、マンノース及びガラクトースからなる群より選択されるヘキソースである。最も好ましくは、前記ＵＤＰ−糖は、ＵＤＰ−グルコースである。
　本発明に係るステビオール配糖体の製造方法は、本発明のタンパク質と、ＵＤＰ糖と、一般式（Ｉ）で示される化合物とを反応させて、一般式（Ｉ）で示される化合物の１９位のカルボキシル基に糖分子を付加する工程を含むが、さらに、前記工程で生成したステビオール配糖体を精製する工程を含んでいてもよい。
　本発明の方法により生成されるステビオール配糖体の例としては、ステビオールビオシド、ステビオシド、レバウディオシドＡ、レバウディオシドＢ、レバウディオシドＣ、レバウディオシドＤ、レバウディオシドＥ、レバウディオシドＦ又はこれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
　生成したステビオール配糖体は、適切な溶媒（水等の水性溶媒又はアルコール、エーテル及びアセトン等の有機溶媒）による抽出、酢酸エチルその他の有機溶媒：水の勾配、高速液体クロマトグラフィー（Ｈｉｇｈ　Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ　Ｌｉｑｕｉｄ　Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ：ＨＰＬＣ）、ガスクロマトグラフィー、飛行時間型質量分析（Ｔｉｍｅ−ｏｆ−Ｆｌｉｇｈｔ　ｍａｓｓ　ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ：ＴＯＦ−ＭＳ）、超高性能液体クロマトグラフィー（Ｕｌｔｒａ（Ｈｉｇｈ）Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ　Ｌｉｑｕｉｄ　ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ：ＵＰＬＣ）等の公知の方法によって精製することができる。
２．ステビオール配糖体高含有非ヒト形質転換体
　ステビオール配糖体は、本発明のタンパク質を用いて細菌（大腸菌又は酵母など）、植物、昆虫、ヒトを除く哺乳動物などの細胞内で生成することもできる。本発明のタンパク質は、ステビアに由来する酵素又はその変異体であるため、細胞内環境においても高い活性を有することが期待されるからである。この場合、本発明のタンパク質をコードするポリヌクレオチド（後述する「本発明のポリヌクレオチド」を参照）を、細菌、植物、昆虫、ヒトを除く哺乳動物などに由来する宿主細胞に導入して本発明のタンパク質を発現させ、本発明のタンパク質と、前記細胞内に存在するＵＤＰ−糖及び一般式（Ｉ）で示される化合物とを反応させることによりステビオール配糖体を生成することができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000007
　そこで、本発明は、以下の（ａ）~（ｅ）よりなる群より選ばれるいずれかに記載のポリヌクレオチド（以下、「本発明のポリヌクレオチド」という）が導入された非ヒト形質転換体（以下、「本発明の形質転換体」という）を提供する。
（ａ）配列番号１の塩基配列を含有するポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号２のアミノ酸配列において、１~４８個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ一般式（Ｉ）で示される化合物の１９位のカルボキシル基に糖分子を付加する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号２のアミノ酸配列に対して、９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ一般式（Ｉ）で示される化合物の１９位のカルボキシル基に糖分子を付加する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；及び
（ｅ）配列番号１の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドと高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、一般式（Ｉ）で示される化合物の１９位のカルボキシル基に糖分子を付加する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
　一般式（Ｉ）の定義及び具体例は既に述べた通りであり、また、一般式（Ｉ）で示される化合物の１９位カルボキシル基に付加される糖分子の定義及び具体例も前述の通りである。
　本明細書中、「ポリヌクレオチド」とは、ＤＮＡ又はＲＮＡを意味する。
　本明細書中、「高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド」とは、例えば、配列番号１の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチド、又は配列番号２のアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるポリヌクレオチドの全部又は一部をプローブとして、コロニーハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法又はサザンハイブリダイゼーション法などを用いることにより得られるポリヌクレオチドをいう。ハイブリダイゼーションの方法としては、例えば、”Ｓａｍｂｒｏｏｋ　＆　Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ　Ｖｏｌ．３，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ，Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ　２００１”及び”Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　Ｓｏｎｓ　１９８７−１９９７”などに記載されている方法を利用することができる。
　本明細書中、「高ストリンジェントな条件」とは、例えば、（１）５×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、０．５％ＳＤＳ、５０％ホルムアミド、５０℃、（２）０．２ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６０℃、（３）０．２ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６２℃、（４）０．２ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃、又は（５）０．１ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃の条件であるが、これに限定されるものではない。これらの条件において、温度を上げるほど高い配列同一性を有するＤＮＡが効率的に得られることが期待できる。ただし、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響する要素としては温度、プローブ濃度、プローブの長さ、イオン強度、時間、塩濃度等の複数の要素が考えられ、当業者であればこれらの要素を適宜選択することで同様のストリンジェンシーを実現することが可能である。
　なお、ハイブリダイゼーションに市販のキットを用いる場合は、例えばＡｌｋｐｈｏｓ　Ｄｉｒｅｃｔ　Ｌａｂｅｌｌｉｎｇ　ａｎｄ　Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍ（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いることができる。この場合は、キットに添付のプロトコルにしたがい、標識したプローブとのインキュベーションを一晩行った後、メンブレンを５５~６０℃の条件下で０．１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳを含む１次洗浄バッファーで洗浄後、ハイブリダイズしたＤＮＡを検出することができる。あるいは、配列番号１の塩基配列と相補的な塩基配列、又は配列番号２のアミノ酸配列をコードする塩基配列の全部又は一部と相補的な配列に基づいてプローブを作製する際に、市販の試薬（例えば、ＰＣＲラベリングミックス（ロシュ・ダイアグノスティクス社）等）を用いて該プローブをジゴキシゲニン（ＤＩＧ）ラベルした場合には、ＤＩＧ核酸検出キット（ロシュ・ダイアグノスティクス社）を用いてハイブリダイゼーションを検出することができる。
　上記以外にハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドとしては、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴ等の相同性検索ソフトウェアにより、デフォルトのパラメーターを用いて計算したときに、配列番号１のＤＮＡ、又は配列番号２のアミノ酸配列をコードするＤＮＡと８０％以上、８１％以上、８２％以上、８３％以上、８４％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、９９．１％以上、９９．２％以上、９９．３％以上、９９．４％以上、９９．５％以上、９９．６％以上、９９．７％以上、９９．８％以上、又は９９．９％以上の配列同一性を有するＤＮＡをあげることができる。
　なお、アミノ酸配列や塩基配列の配列同一性は、ＦＡＳＴＡ（Ｓｃｉｅｎｃｅ　２２７（４６９３）：１４３５−１４４１，（１９８５））や、カーリン及びアルチュールによるアルゴリズムＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ　Ｌｏｃａｌ　Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ　Ｓｅａｒｃｈ　Ｔｏｏｌ）（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８７２２６４−２２６８，１９９０；Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ　９０：５８７３，１９９３）を用いて決定できる。ＢＬＡＳＴのアルゴリズムに基づいたｂｌａｓｔｎ、ｂｌａｓｔｘ、ｂｌａｓｔｐ、ｔｂｌａｓｔｎやｔｂｌａｓｔｘと呼ばれるプログラムが開発されている（Ａｌｔｓｃｈｕｌ　ＳＦ，ｅｔ　ａｌ：Ｊ　Ｍｏｌ　Ｂｉｏｌ　２１５：４０３，１９９０）。ｂｌａｓｔｎを用いて塩基配列を解析する場合は、パラメーターは、例えばｓｃｏｒｅ＝１００、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝１２とする。また、ｂｌａｓｔｐを用いてアミノ酸配列を解析する場合は、パラメーターは、例えばｓｃｏｒｅ＝５０、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝３とする。ＢＬＡＳＴとＧａｐｐｅｄ　ＢＬＡＳＴプログラムを用いる場合は、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。
　上記した本発明のポリヌクレオチドは、公知の遺伝子工学的手法又は公知の合成手法によって取得することが可能である。
　本発明のポリヌクレオチドは、好ましくは、適切な発現ベクターに挿入された状態で宿主に導入される。
　適切な発現ベクターは、通常、
（ｉ）宿主細胞内で転写可能なプロモーター；
（ｉｉ）該プロモーターに結合した、本発明のポリヌクレオチド；及び
（ｉｉｉ）ＲＮＡ分子の転写終結及びポリアデニル化に関し、宿主細胞内で機能するシグナルを構成要素として含む発現カセット
　を含むように構成される。
　発現ベクターの作製方法としては、プラスミド、ファージ又はコスミドなどを用いる方法が挙げられるが特に限定されない。
　ベクターの具体的な種類は特に限定されず、宿主細胞中で発現可能なベクターが適宜選択され得る。すなわち、宿主細胞の種類に応じて、確実に本発明のポリヌクレオチドを発現させるために適宜プロモーター配列を選択し、これと本発明のポリヌクレオチドを各種プラスミド等に組み込んだベクターを発現ベクターとして用いればよい。
　本発明の発現ベクターは、導入されるべき宿主の種類に依存して、発現制御領域（例えば、プロモーター、ターミネーター及び／又は複製起点等）を含有する。細菌用発現ベクターのプロモーターとしては、慣用的なプロモーター（例えば、ｔｒｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、ｌａｃプロモーター等）が使用され、酵母用プロモーターとしては、例えば、ＧＡＬ１プロモーター、ＧＡＬ１０プロモーター、グリセルアルデヒド３リン酸デヒドロゲナーゼプロモーター、ＰＨ０５プロモーター等が挙げられ、糸状菌用プロモーターとしては、例えば、アミラーゼ、ｔｒｐＣ等が挙げられる。また、植物細胞内で目的遺伝子を発現させるためのプロモーターの例としては、カリフラワーモザイクウィルスの３５Ｓ　ＲＮＡプロモーター、ｒｄ２９Ａ遺伝子プロモーター、ｒｂｃＳプロモーター、前記カリフラワーモザイクウィルスの３５Ｓ　ＲＮＡプロモーターのエンハンサー配列をアグロバクテリウム由来のマンノピン合成酵素プロモーター配列の５’側に付加したｍａｃ−１プロモーター等が挙げられる。動物細胞宿主用プロモーターとしては、ウイルス性プロモーター（例えば、ＳＶ４０初期プロモーター、ＳＶ４０後期プロモーター等）が挙げられる。
　発現ベクターは、少なくとも１つの選択マーカーを含むことが好ましい。このようなマーカーとしては、栄養要求性マーカー（ｕｒａ５、ｎｉａＤ、ＴＲＰ１、ＵＲＡ３、ＨＩＳ３、ＬＥＵ２）、薬剤耐性マーカー（ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎｅ、ゼオシン）、ジェネチシン耐性遺伝子（Ｇ４１８ｒ）、銅耐性遺伝子（ＣＵＰ１）（Ｍａｒｉｎ　ｅｔ　ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，ｖｏｌ．８１，ｐ．３３７，１９８４）、セルレニン耐性遺伝子（ｆａｓ２ｍ，ＰＤＲ４）（それぞれ、猪腰淳嗣ら，生化学，ｖｏｌ．６４，ｐ．６６０，１９９２；Ｈｕｓｓａｉｎ　ｅｔ　ａｌ．，Ｇｅｎｅ，ｖｏｌ．１０１，ｐ．１４９，１９９１）などが利用可能である。
　本発明の形質転換体の作製方法（生産方法）は特に限定されないが、例えば、本発明のポリヌクレオチドを含む発現ベクターを宿主に導入して形質転換する方法が挙げられる。
　本発明の形質転換体は、ステビオール配糖体を高効率で生産することが期待される。形質転換に用いられる宿主細胞は、特に限定されるものではなく、公知の各種細胞を好適に用いることができる。例えば、宿主細胞の例としては、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）等の細菌、酵母（出芽酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、分裂酵母Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｐｏｍｂｅ）、植物細胞、ヒトを除く動物細胞等が挙げられる。
　好ましくは、宿主細胞は、一般式（Ｉ）（好ましくはステビオールモノシド、ステビオールビオシド又はステビオール）に示される化合物を生成することのできる宿主細胞である。ここで、宿主細胞は、天然状態で一般式（Ｉ）に示される化合物を生成することのできるものに限定されず、例えば、一般式（Ｉ）に示される化合物を生成することができるように公知の遺伝子で組換操作されたものであってもよい。
　一般式（Ｉ）に示される化合物の合成に寄与する酵素をコードする遺伝子としては、ＥＫ１３Ｈ、ＵＧＴ７４Ｇ１及びＵＧＴ７６Ｇ１（非特許文献２）等が公知のものとして挙げられるがこれらに限定されるものではない。
　宿主細胞が一般式（Ｉ）に示される化合物を生成することができないものである場合、同宿主細胞に本発明の遺伝子を導入して得られた形質転換体の培養系に基質として一般式（Ｉ）の化合物（好ましくはステビオールモノシド、ステビオールビオシド又はステビオール）又は同化合物を含む植物抽出物を添加することにより、一般式（Ｉ）に示される化合物の合成に寄与する酵素をコードする遺伝子を導入せずともステビオール配糖体を製造することが可能である。
　上記の宿主細胞のための適切な培養培地及び条件は当分野で周知である。また、形質転換の対象となる生物も特に限定されるものではなく、上記宿主細胞で例示した各種微生物又は植物又はヒトを除く動物が挙げられる。
　宿主細胞の形質転換方法としては一般に用いられる公知の方法が利用できる。例えば、エレクトロポレーション法（Ｍａｃｋｅｎｘｉｅ，Ｄ．Ａ．ｅｔ　ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，ｖｏｌ．６６，ｐ．４６５５−４６６１，２０００）、パーティクルデリバリー法（特開２００５−２８７４０３）、スフェロプラスト法（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，ｖｏｌ．７５，ｐ．１９２９，１９７８）、酢酸リチウム法（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．１５３，ｐ．１６３，１９８３）、Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　ｙｅａｓｔ　ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２０００　Ｅｄｉｔｉｏｎ：Ａ　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｃｏｕｒｓｅ　Ｍａｎｕａｌなどに記載の方法）で実施可能であるが、これらに限定されない。
　その他、一般的な分子生物学的な手法に関しては、”Ｓａｍｂｒｏｏｋ　＆　Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ　Ｖｏｌ．３，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ　２００１”、”Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｙｅａｓｔ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、Ａ　ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ）”等を参照することができる。
　このようにして得られた形質転換体を培養することにより、形質転換体にステビオール配糖体を生産させることが可能である。前述の通り、形質転換体の培養系に基質として一般式（Ｉ）の化合物又は同化合物を含む植物抽出物を添加することにより、ステビオール配糖体の製造を促進することもできる。蓄積されたステビオール配糖体を抽出・精製することにより、目的のステビオール配糖体を得ることができる。
　従って、本発明は、本発明の形質転換体を用いることを特徴とするステビオール配糖体の第２の製造方法を提供する。適切な培養培地及び条件は当分野で周知である。また、ステビオール配糖体の抽出・精製方法については既に述べた通りである。
　ステビオール配糖体は、特に限定されないが、好ましくはステビオールビオシド、ステビオシド、レバウディオシドＡ、レバウディオシドＢ、レバウディオシドＣ、レバウディオシドＤ、レバウディオシドＥ、レバウディオシドＦ又はこれらの組み合わせからなる群より選択されるものであってもよい。
　本発明の１つの態様において、形質転換体は、植物形質転換体であり得る。本実施形態に係る植物形質転換体は、本発明に係るポリヌクレオチドを含む組換えベクターを、当該ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドが発現され得るように植物中に導入することによって取得される。
　組換え発現ベクターを用いる場合、植物体の形質転換に用いられる組換え発現ベクターは、当該植物内で本発明に係るポリヌクレオチドを発現させることが可能なベクターであれば特に限定されない。このようなベクターとしては、例えば、植物細胞内でポリヌクレオチドを構成的に発現させるプロモーターを有するベクター又は外的な刺激によって誘導的に活性化されるプロモーターを有するベクターが挙げられる。
　植物細胞内でポリヌクレオチドを構成的に発現させるプロモーターの例としては、カリフラワーモザイクウィルスの３５Ｓ　ＲＮＡプロモーター、ｒｄ２９Ａ遺伝子プロモーター、ｒｂｃＳプロモーター、ｍａｃ−１プロモーター等が挙げられる。
　外的な刺激によって誘導性に活性化されるプロモーターの例としては、ｍｏｕｓｅ　ｍａｍｍａｒｙ　ｔｕｍｏｒ　ｖｉｒｕｓ（ＭＭＴＶ）プロモーター、テトラサイクリン応答性プロモーター、メタロチオネインプロモーター及びヒートショックプロテインプロモーター等が挙げられる。
　本発明において形質転換の対象となる植物は、植物体全体、植物器官（例えば葉、花弁、茎、根、種子など）、植物組織（例えば表皮、師部、柔組織、木部、維管束、柵状組織、海綿状組織など）又は植物培養細胞、あるいは種々の形態の植物細胞（例えば、懸濁培養細胞）、プロトプラスト、葉の切片、カルスなどのいずれをも意味する。形質転換に用いられる植物としては、特に限定されず、単子葉植物綱又は双子葉植物綱に属する植物のいずれでもよい。
　植物への遺伝子の導入には、当業者に公知の形質転換方法（例えば、アグロバクテリウム法、遺伝子銃法、ＰＥＧ法、エレクトロポレーション法など）が用いられる。例えば、アグロバクテリウムを介する方法と直接植物細胞に導入する方法が周知である。アグロバクテリウム法を用いる場合は、構築した植物用発現ベクターを適当なアグロバクテリウム（例えば、アグロバクテリウム・チュメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ））に導入し、この株をリーフディスク法（内宮博文著、植物遺伝子操作マニュアル（１９９０）２７~３１頁、講談社サイエンティフィック、東京）などに従って無菌培養葉片に感染させ、形質転換植物を得ることができる。また、Ｎａｇｅｌ　ｅｔ　ａｌの方法（Ｍｉｃｒｉｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．，６７：３２５（１９９０））が用いられ得る。この方法は、まず、例えば発現ベクターをアグロバクテリウムに導入し、次いで、形質転換されたアグロバクテリウムをＰｌａｎｔ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　Ｍａｎｕａｌ（Ｇｅｌｖｉｎ，Ｓ．Ｂ．ｅｔ　ａｌ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ　Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ）に記載の方法で植物細胞又は植物組織に導入する方法である。ここで、「植物組織」とは、植物細胞の培養によって得られるカルスを含む。アグロバクテリウム法を用いて形質転換を行う場合には、バイナリーベクター（ｐＢＩ１２１又はｐＰＺＰ２０２など）を使用することができる。
　また、遺伝子を直接植物細胞又は植物組織に導入する方法としては、エレクトロポレーション法、パーティクルガン法が知られている。パーティクルガンを用いる場合は、植物体、植物器官、植物組織自体をそのまま使用してもよく、切片を調製した後に使用してもよく、プロトプラストを調製して使用してもよい。このように調製した試料を遺伝子導入装置（例えばＰＤＳ−１０００（ＢＩＯ−ＲＡＤ社）など）を用いて処理することができる。処理条件は植物又は試料によって異なるが、通常は４５０~２０００ｐｓｉ程度の圧力、４~１２ｃｍ程度の距離で行う。
　遺伝子が導入された細胞又は植物組織は、まずハイグロマイシン耐性などの薬剤耐性で選択され、次いで定法によって植物体に再生される。形質転換細胞から植物体の再生は、植物細胞の種類に応じて当業者に公知の方法で行うことが可能である。
　植物培養細胞を宿主として用いる場合は、形質転換は、組換えベクターを遺伝子銃、エレクトロポレーション法などで培養細胞に導入する。形質転換の結果得られるカルスやシュート、毛状根などは、そのまま細胞培養、組織培養又は器官培養に用いることが可能であり、また従来知られている植物組織培養法を用い、適当な濃度の植物ホルモン（オーキシン、サイトカイニン、ジベレリン、アブシジン酸、エチレン、ブラシノライドなど）の投与などによって植物体に再生させることができる。
　本発明のポリヌクレオチドが植物に導入されたか否かの確認は、ＰＣＲ法、サザンハイブリダイゼーション法、ノーザンハイブリダイゼーション法などによって行うことができる。例えば、形質転換植物からＤＮＡを調製し、ＤＮＡ特異的プライマーを設計してＰＣＲを行う。ＰＣＲは、前記プラスミドを調製するために使用した条件と同様の条件で行うことができる。その後は、増幅産物についてアガロースゲル電気泳動、ポリアクリルアミドゲル電気泳動又はキャピラリー電気泳動などを行い、臭化エチジウム、ＳＹＢＲ　Ｇｒｅｅｎ液などによって染色し、そして増幅産物を１本のバンドとして検出することによって、形質転換されたことを確認することができる。また、予め蛍光色素などによって標識したプライマーを用いてＰＣＲを行い、増幅産物を検出することもできる。さらに、マイクロプレートなどの固相に増幅産物を結合させ、蛍光又は酵素反応などによって増幅産物を確認する方法も採用することができる。
　本発明のポリヌクレオチドがゲノム内に組み込まれた形質転換植物体が一旦取得されれば、当該植物体の有性生殖又は無性生殖によって子孫を得ることができる。また、当該植物体又はその子孫、あるいはこれらのクローンから、例えば、種子、果実、切穂、塊茎、塊根、株、カルス、プロトプラストなどを得て、それらを基に当該植物体を量産することができる。従って、本発明には、本発明に係るポリヌクレオチドが発現可能に導入された植物体、若しくは当該植物体と同一の性質を有する当該植物体の子孫、又はこれら由来の組織も含まれる。
　また、種々の植物に対する形質転換方法が既に報告されている。本発明に係る形質転換体植物としては、ナス科植物（例えば、ナス、トマト、トウガラシ、ジャガイモ、タバコ、チョウセンアサガオ、ホオズキ、ペチュニア、カリブラコア、ニーレンベルギア等）、マメ科植物（例えば、ダイズ、アズキ、ラッカセイ、インゲンマメ、ソラマメ、ミヤコグサ等）、バラ科植物（例えば、イチゴ、ウメ、サクラ、バラ、ブルーベリー、ブラックベリー、ビルベリー、カシス、ラズベリー、テンチャ等）、ナデシコ科植物（カーネーション、カスミソウ等）、キク科植物（キク、ガーベラ、ヒマワリ、デイジー、ステビア等）、ラン科植物（ラン等）、サクラソウ科植物（シクラメン等）、リンドウ科植物（トルコギキョウ、リンドウ等）、アヤメ科植物（フリージア、アヤメ、グラジオラス等）、ゴマノハグサ科植物（キンギョソウ、トレニア等）ベンケイソウ（カランコエ）、ユリ科植物（ユリ、チューリップ等）、ヒルガオ科植物（アサガオ、モミジヒルガオ、ヨルガオ、サツマイモ、ルコウソウ、エボルブルス等）、アジサイ科植物（アジサイ、ウツギ等）、ウリ科植物（ユウガオ等）、フロウソウ科植物（ペラルゴニウム、ゼラニウム等）、モクセイ科植物（レンギョウ等）、ブドウ科植物（例えば、ブドウ等）、ツバキ科植物（ツバキ、チャノキ等）、イネ科植物（例えば、イネ、オオムギ、コムギ、エンバク、ライムギ、トウモロコシ、アワ、ヒエ、コウリャン、サトウキビ、タケ、カラスムギ、シコクビエ、モロコシ、マコモ、ハトムギ、牧草等）、クワ科植物（クワ、ホップ、コヴゾ、ゴムノキ、アサ等）、アカネ科植物（コーヒーノキ、クチナシ等）、ブナ科植物（ナラ、ブナ、カシワ等）、ゴマ科植物（ゴマ等）、ミカン科植物（例えば、ダイダイ、ユズ、ウンシュウミカン、サンショウ）及びアブラナ科植物（赤キャベツ、ハボタン、ダイコン、シロナズナ、アブラナ、キャベツ、ブロッコリー、カリフラワー等）、シソ科（サルビア、シソ、ラベンダー、タツナミソウ等）が挙げられる。形質転換対象の植物として特に好ましい例としては、ステビオールをアグリコンとして種々の配糖体を生合成することが知られている植物を使用することが望ましく、このような植物としては、ステビアやテンチャ（Ｒｕｂｕｓ　ｓｕａｕｉｓｓｉｍｕｓ）等を挙げることができる。
　本発明のポリヌクレオチドで形質転換された植物体（以下、「本発明の植物」又は「本発明の植物体」）は、適切な基質を有する場合、もしくは、適切な基質を外部から添加した場合、その野生型と比べてステビオール配糖体を多く生産することができる。
　本発明の植物は、本発明の植物の種子、挿し木、球根等を育成することにより、容易に完全な植物体を得ることができる。
　よって、本発明の植物には、植物体全体、植物器官（例えば葉、花弁、茎、根、種子、球根等）、植物組織（例えば表皮、師部、柔組織、木部、維管束、柵状組織、海綿状組織等）又は植物培養細胞、あるいは種々の形態の植物細胞（例えば、懸濁培養細胞）、プロトプラスト、葉の切片、カルス等が含まれる。
３．形質転換体の抽出物及びその利用
　本発明はまた、別の実施形態において、上記の形質転換体の抽出物を提供する。本発明の形質転換体は、適切な基質を有する場合、もしくは、適切な基質を外部から添加した場合、その野生型と比べてステビオール配糖体の含有量が高いので、その抽出物には、ステビオール配糖体が高濃度で含まれると考えられる。
　本発明の形質転換体の抽出物は、形質転換体をガラスビーズ、ホモジェナイザー又はソニケーター等を用いて破砕し、当該破砕物を遠心処理し、その上清を回収することにより、得ることができる。さらに、上記で述べたステビオール配糖体の抽出方法により、さらなる抽出工程を施してもよい。
　本発明の形質転換体の抽出物は、常法に従って、例えば、食品、医薬品、工業原料の製造等の用途に使用することができる。
　本発明はまた、別の実施形態において、本発明の形質転換体の抽出物を含む食品、医薬、工業原料（食品等の原料）を提供する。本発明の形質転換体の抽出物を含む食品、医薬、工業原料の調製は、常法による。このように、本発明の形質転換体の抽出物を含む食品、医薬、工業原料等は、本発明の形質転換体を用いて生成されたステビオール配糖体を含有する。
　本発明の食品の例としては、栄養補助食品、健康食品、機能性食品、幼児用食品、老人用食品等が挙げられる。本明細書中、食品は、固体、流動体、及び液体、並びにそれらの混合物であって、摂食可能なものの総称である。
　栄養補助食品とは、特定の栄養成分が強化されている食品をいう。健康食品とは、健康的な又は健康によいとされる食品をいい、栄養補助食品、自然食品、ダイエット食品等を含む。機能性食品とは、体の調節機能を果たす栄養成分を補給するための食品をいい、特定保健用途食品と同義である。幼児用食品とは、約６歳までの子供に与えるための食品をいう。老人用食品とは、無処理の食品と比較して消化及び吸収が容易であるように処理された食品をいう。
　本発明の食品は、甘味料としてカロリーレスのステビオール配糖体を使用している。このため、本発明の食品は低カロリーであり、健康増進又は健康維持に寄与するというメリットを有する。
　これらの食品の形態の例としては、パン、麺類、パスタ、ごはん、菓子類（ケーキ、アイスクリーム、アイスキャンデー、ドーナツ、焼き菓子、キャンデー、チューインガム、グミ、錠菓、並びに団子及びまんじゅう等の和菓子）、豆腐及びその加工品等の農産食品、清酒、薬用酒、みりん、食酢、醤油、みそ等の発酵食品、ヨーグルト、ハム、ベーコン、ソーセージ等の畜産食品、かまぼこ、揚げ天、はんぺん等の水産食品、果汁飲料、清涼飲料、スポーツ飲料、アルコール飲料、茶等又は調味料であってもよい。さらなる食品の形態の例としては、低カロリー飲料、ノンシュガー飲料、フルーツ缶詰、乳飲料、粉末飲料、ヨーグルト、ゼリー、ドレッシング、麺つゆ、漬物、佃煮、醤油、味噌、塩辛、バーモント酢、甘酢らっきょ漬け、甘酢生姜、酢レンコン、また、漬物、天ぷら及びカバ焼きのタレ、焼肉のタレ、ソース等、ガム、キャンディー・飴、歯磨きペースト、さつま揚げ、だし巻き、焼きそばソース、冷やし中華のタレ、しめ鯖、氷菓、シャーベット、ソフトクリーム、練り製品、スナック、米菓、コーンカップ、味付け海苔、天カス、ふりかけなどが挙げられる。
　本発明の医薬品（組成物）の剤型は、特に限定されず、溶液状、ペースト状、ゲル状、固体状、粉末状等任意の剤型をとることができる。また、本発明の医薬組成物は、オイル、ローション、クリーム、乳液、ゲル、シャンプー、ヘアリンス、ヘアコンディショナー、エナメル、ファンデーション、リップスティック、おしろい、パック、軟膏、パウダー、歯磨、エアロゾル、クレンジングフォーム等の皮膚外用薬の他、浴用剤、養毛剤、皮膚美容液、日焼け防止剤等に用いることができる。
　本発明の医薬組成物は、必要に応じてさらに、その他の医薬活性成分（例えば、消炎成分）又は補助成分（例えば、潤滑成分、担体成分）を含んでいてもよい。
４．ステビオール配糖体含有量の高い植物をスクリーニングする方法
　本発明は、ステビオール配糖体含有量の高い植物をスクリーニングする方法を提供する。具体的には、前記方法は、以下の（１）~（３）の工程を含む。
（１）被検植物からｍＲＮＡを抽出する工程
（２）前記ｍＲＮＡ又は前記ｍＲＮＡから調製したｃＤＮＡと、本発明のポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドと高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドとをハイブリダイズさせる工程
（３）前記ハイブリダイゼーションを検出する工程
　上記工程（１）は、被検植物から、ｍＲＮＡを抽出することにより行うことができる。ｍＲＮＡを抽出する被検植物の部位は、特に限定されないが、好ましくは、花弁である。ｍＲＮＡを抽出した場合には、逆転写することにより、ｍＲＮＡからｃＤＮＡを調製してもよい。
　工程（２）は、上記で抽出したｍＲＮＡに対し、本発明のポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチド若しくはオリゴヌクレオチドをプローブ又はプライマーとして、高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズさせることにより行うことができる。高ストリンジェントな条件は、既に述べたとおりである。ポリヌクレオチド若しくはオリゴヌクレオチドは、好ましくは、５~５００ｂｐ、より好ましくは、１０~２００ｂｐ、さらに好ましくは、１０~１００ｂｐの長さである。ポリヌクレオチド若しくはオリゴヌクレオチドは、各種自動合成装置（例えば、ＡＫＴＡ　ｏｌｉｇｏｐｉｌｏｔ　ｐｌｕｓ　１０／１００（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ））を用いて容易に合成することが可能であり、あるいは、第三者機関（例えば、Ｐｒｏｍｅｇａ社又はＴａｋａｒａ社）等に委託することもできる。
　工程（２）において本発明のポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドをプローブとして用いた場合には、工程（３）は、通常のサザンブロッティング、ノーザンブロッティング（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ　ａｎｄ　Ｍａｎｉａｔｉｓ，”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ”２ｎｄ　Ｅｄｉｔｉｏｎ（１９８９），Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ）、マイクロアレイ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社；米国特許第６，０４５，９９６号、同第５，９２５，５２５号、及び同第５，８５８，６５９号参照）、ＴａｑＭａｎ　ＰＣＲ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ　ａｎｄ　Ｍａｎｉａｔｉｓ，”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ”２ｎｄ　Ｅｄｉｔｉｏｎ（１９８９），Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ）、又はＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ　Ｉｎ　Ｓｉｔｕ　Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（ＦＩＳＨ）（Ｓｉｅｂｅｎ　Ｖ．Ｊ．ｅｔ　ａｌ．，（２００７−０６）．ＩＥＴ　Ｎａｎｏｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　１（３）：２７−３５）等のハイブリダイゼーション検出方法により行うことができる。一方、工程（２）において本発明のポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドをプライマーとして用いた場合には、工程（３）は、ＰＣＲ増幅反応を行い、得られた増幅産物を電気泳動又はシークエンシング（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ　ａｎｄ　Ｍａｎｉａｔｉｓ，”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ”２ｎｄ　Ｅｄｉｔｉｏｎ（１９８９），Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ）等によって解析することにより、ハイブリダイゼーションを検出することができる。
　ハイブリダイゼーションがより多く検出された植物体は、他の植物体と比べて下記一般式（Ｉ）で示される化合物の１９位のカルボキシル基に糖分子を付加する活性を有するタンパク質をより多く発現しているといえるので、ステビオール配糖体含有量が高いことが予測される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000008
　以下、実施例を用いて本発明をより具体的に説明するが、本発明の範囲は、これらの実施例によって限定されるものではない。
［実施例１］ステビオールビオシド配糖体化酵素の候補遺伝子の単離
　先行事例（非特許文献２）ではＵＧＴ８５Ｃ２（ＧＥＮＢＡＮＫ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．ＡＹ３４５９７８）はステビオールの１３位の水酸基にグルコースを一分子転移してステビオールモノグルコシドを生成する活性を有することが報告されている。ＵＧＴ８５Ｃ２遺伝子を得るために、下記のプライマーセット（配列番号３及び４）でステビア葉から調製したｃＤＮＡを鋳型にＰＣＲを行った。
　ステビア葉ｃＤＮＡについてはステビア葉からＲＮｅａｓｙ　Ｐｌａｎｔ　Ｍｉｎｉキット（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて総ＲＮＡを抽出し、そのうち０．５μｇをＲａｎｄｏｍ　Ｏｌｉｇｏ−ｄＴプライマーで逆転写（ＲＴ）反応することによって得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000009
　ＰＣＲ反応液（５０μｌ）は、ステビア葉由来ｃＤＮＡ　１μｌ、１×ＥｘＴａｑ　ｂｕｆｆｅｒ（ＴａＫａＲａＢｉｏ）、０．２ｍＭ　ｄＮＴＰｓ、プライマー各０．４ｐｍｏｌ／μｌ、ＥｘＴａｑ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　２．５Ｕからなる組成とした。ＰＣＲ反応は、９４℃で３分間反応させた後、９４℃で１分間、５０℃で１分間、７２℃で２分間の反応を計３０サイクルの増幅を行った。ＰＣＲ産物を０．８％アガロースゲルによる電気泳動し、エチジウムブロマイド染色した結果、それぞれの鋳型ＤＮＡから推定された約１．４ｋｂのサイズに増幅バンドが得られた。
　このＰＣＲ産物はｐＥＮＴＲ−ＴＯＰＯ　Ｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に製造業者が推奨する方法でサブクローニングした。ＤＮＡ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ　ｍｏｄｅｌ　３１００（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用い、合成オリゴヌクレオチドプライマーによるプライマーウォーキング法によって配列を決定した。
　その結果、得られたＤＮＡ配列は、報告のあるＵＧＴ８５Ｃ２（非特許文献２）とはＤＮＡレベルで９９％の配列同一性（３塩基の違い）、推定アミノ酸レベルで９９％配列同一性（３アミノ酸の違い）を示した（ＣＤＳ配列：配列番号１、アミノ酸配列：配列番号２）。
［実施例２］発現ベクターの構築
　プライマーに付加したＮｄｅＩおよびＢｇｌＩＩの制限酵素部位（配列番号３および４の下線部）を利用して約１．４ｋｂのＵＧＴ８５Ｃ２のＯＲＦ断片を切り出し、大腸菌発現ベクターであるｐＥＴ１５ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ社）のＮｄｅＩおよびＢｇｌＩＩサイトへ連結し、本酵素遺伝子の大腸菌発現ベクターを得た。本ベクターＮｄｅＩサイト上流にあるＨｉｓタグとＵＧＴ８５Ｃ２遺伝子のオープンリーディングフレームが合っており、ＵＧＴ８５Ｃ２とＨｉｓタグの融合したキメラタンパク質が発現するよう設計した。
［実施例３］組み換えタンパク質の発現および精製
　本酵素の生化学的な機能を明らかにするために、本酵素を大腸菌において発現させた。上記で得られたＵＧＴ８５Ｃ２大腸菌発現用プラスミドを用い定法に従って大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換した。得られた形質転換体を、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ培地（１０ｇ／ｌ　ｔｙｐｔｏｎｅ　ｐｅｐｔｏｎ，５ｇ／ｌ　ｙｅａｓｔ　ｅｘｔｒａｃｔ，１ｇ／ｌ　ＮａＣｌ）４ｍｌにて、３７℃で一晩振盪培養した。静止期に達した培養液４ｍｌを同組成の培地８０ｍｌに接種し、３７℃で振盪培養した。菌体濁度（ＯＤ６００）がおよそ０．５に達した時点で終濃度０．５ｍＭのＩＰＴＧを添加し、１８℃で２０ｈｒ振盪培養した。
　以下のすべての操作は４℃で行った。培養した形質転換体を遠心分離（５，０００×ｇ，１０ｍｉｎ）にて集菌し、Ｂｕｆｆｅｒ　Ｓ［２０ｍＭ　ＨＥＰＥＳバッファー（ｐＨ７．５），２０ｍＭ　ｉｍｉｄａｚｏｌ，１４ｍＭ　β−メルカプトエタノール］１ｍｌ／ｇ　ｃｅｌｌを添加して、懸濁した。続いて、超音波破砕（１５ｓｅｃ×８回）を行い、遠心分離（１５，０００×ｇ，１５ｍｉｎ）を行った。得られた上清を粗酵素液として回収した。粗酵素液をＢｕｆｆｅｒ　Ｓにて平衡化したＨｉｓ　ＳｐｉｎＴｒａｐ（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に負荷し、遠心（７０×ｇ，３０ｓｅｃ）した。Ｂｕｆｆｅｒで洗浄後、１００ｍＭおよび５００ｍＭのｉｍｉｄａｚｏｌｅを含むＢｕｆｆｅｒ　Ｓ各５ｍｌにて、カラムに結合したタンパク質を段階的に溶出した。各溶出画分をＭｉｃｒｏｃｏｎ　ＹＭ−３０（Ａｍｉｃｏｎ）を用いて２０ｍＭ　ＨＥＰＥＳバッファー（ｐＨ７．５）、１４ｍＭ　β−メルカプトエタノールにバッファー置換した（透析倍率１０００倍）。
　ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分離後のＣＢＢ染色の結果、５００ｍＭ　ｉｍｉｄａｚｏｌｅ溶出画分においてＨｉｓＴａｇ融合ＵＧＴ８５Ｃ２キメラタンパク質の推定分子量約５０ｋＤａ付近にタンパク質を確認したので、この画分を酵素解析に用いた（図２）。
［実施例４］ＵＧＴ８５Ｃ２の酵素活性測定
　標準的な酵素反応条件は以下の通りである。反応液（２ｍＭ　ＵＤＰ−グルコース，０．１ｍＭ糖受容体基質（ステビオール），１００ｍＭリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．０），精製ＵＧＴ８５Ｃ２酵素溶液２５μｌ）を蒸留水で５０μｌに調製し、３０℃、１時間反応させた。酵素反応液５μｌを下記の条件でＬＣ−ＭＳ分析を行った。
ＬＣ　ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ
　カラム：Ｗａｔｅｒｓ　Ｓｕｎｆｉｒｅ　Ｃ１８　３．５ｕｍ　２．０ｍｍ　Ｉ．Ｄ．×２０ｍｍ
　移動相：Ａ：ＭｉｌｌｉＱ　Ｗａｔｅｒ（＋０．０５％　ｆｏｒｍｉｃ　ａｃｉｄ），Ｂ：ＭｅＣＮ
　グラジエント：Ｂ濃度１５％から５５％への直線濃度勾配（２０分間）
　流速：毎分０．２ｍｌ
カラムオーブン：４０℃
ＭＳ　ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ
　ＥＳＩ（ｎｅｇａｔｉｖｅ　ｍｏｄｅ）
　Ｓｅｌｅｃｔｅｄ　ｉｏｎ　ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ：ｍ／ｚ　３１７，４７９，６４１，６８７，８０３　ａｎｄ　８４９
　ＵＧＴ８５Ｃ２とステビオールとを反応させた。その結果、ステビオールの１３位の水酸基をグルコシル化し（図４：第１パネル：ピークＡ）、ステビオールモノシド（図４：第１パネル：ピークＢ）が生成することが確認された。さらに反応液中には１９位のカルボキシル基がグルコシル化されたルブソシド（図４：第１パネル：ピークＤ）が同時に生成していることが確認された（図４：第１パネル）。両生成物は熱変性により失活したＵＧＴ８５Ｃ２タンパク質との反応液には検出されなかったため（図４：第２パネル）、これらは共にＵＧＴ８５Ｃ２酵素の反応生成物であることが確認された。さらにＵＧＴ８５Ｃ２とＵＧＴ９１Ｄ−ｌｉｋｅ３（ＣＤＳ配列：配列番号５、アミノ酸配列：配列番号６）との同時反応においては、ステビオールビオシド（図４：第３パネル：ピークＣ）とステビオシド（図４：第３パネル：ピークＥ）が生成していることが確認された（図４：第３パネル）。したがって、ＵＧＴ８５Ｃ２タンパク質はステビオールの１３位の水酸基をグルコシル化するとともに、ステビオールモノシドやステビオールビオシドの１９位カルボキシル基もグルコシル化するという新たな知見が得られた。これらの酵素解析結果から、ステビアにおいてステビオシド（図４：第３パネル：ピークＥ）はステビオールビオシド（図４：第３パネル：ピークＣ）とルブソシド（図４：第１パネル：ピークＤ）を経由する２つの生合成経路が存在することが示唆された。
　本発明によれば、ＵＧＴ８５Ｃ２遺伝子を利用してステビオールモノシド、およびステビオールビオシドの１９位のカルボキシル基を配糖体化することができ、ステビオール配糖体の甘味度および味質を向上させることができる。本発明により、レバウディオシドＡまでの生合成経路の全容が明らかになり、植物のみならず微生物においてカロリーレスの天然甘味料であるレバイディオシドＡやステビオシド、その他類縁化合物を生産させるための分子ツールを与える。
　配列番号３：合成ＤＮＡ
　配列番号４：合成ＤＮＡ
配列表

Claims (22)

  1. 　以下の（ａ）~（ｃ）よりなる群より選ばれるいずれかに記載のタンパク質と、ＵＤＰ−糖と、下記一般式（Ｉ）で示される化合物とを反応させる工程を含む、ステビオール配糖体の製造方法。
    （ａ）配列番号２のアミノ酸配列からなるタンパク質；
    （ｂ）配列番号２のアミノ酸配列において、１~４８個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ下記一般式（Ｉ）で示される化合物の１９位のカルボキシル基に糖分子を付加する活性を有するタンパク質；
    （ｃ）配列番号２のアミノ酸配列に対して、９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ下記一般式（Ｉ）で示される化合物の１９位のカルボキシル基に糖分子を付加する活性を有するタンパク質
    Figure JPOXMLDOC01-appb-I000001
    （式中、Ｒ１はＨ、Ｃ１~Ｃ２０アルキル基、Ｃ２~Ｃ２０アルケニル基、Ｃ２~Ｃ２０アルキニル基、Ｃ４~Ｃ２０アルキルジエニル基、Ｃ６~Ｃ１８アリール基、Ｃ６~Ｃ２０アルキルアリール基、Ｃ６~Ｃ２０アリールアルキル基、Ｃ４~Ｃ２０シクロアルキル基、Ｃ４~Ｃ２０シクロアルケニル基、（Ｃ３~Ｃ１０シクロアルキル）Ｃ１~Ｃ１０アルキル基又は糖残基を表す。）
  2. 　前記ＵＤＰ−糖における糖が、ヘキソースである、請求項１に記載の方法。
  3. 　前記ＵＤＰ−糖における糖が、グルコース、マンノース及びガラクトースからなる群より選択されるものである、請求項１に記載の方法。
  4. 　前記１９位のカルボキシル基に付加される糖が、ヘキソースである、請求項１に記載の方法。
  5. 　前記１９位のカルボキシル基に付加される糖が、グルコース、マンノース及びガラクトースからなる群より選択されるものである、請求項１に記載の方法。
  6. 　前記Ｒ１が、Ｈ又はグルコース単量体、グルコース２量体若しくはグルコース３量体の糖残基である、請求項１に記載の方法。
  7. 　前記化合物が、ステビオールモノシド、ステビオールビオシド又はステビオールである、請求項１に記載の方法。
  8. 　前記ステビオール配糖体が、ステビオールビオシド、ステビオシド、レバウディオシドＡ、レバウディオシドＢ、レバウディオシドＣ、レバウディオシドＤ、レバウディオシドＥ、レバウディオシドＦ又はこれらの組み合わせである、請求項１に記載の方法。
  9. 　以下の（ａ）~（ｅ）よりなる群より選ばれるポリヌクレオチドが導入された非ヒト形質転換体。
    （ａ）配列番号１の塩基配列を含有するポリヌクレオチド；
    （ｂ）配列番号２のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
    （ｃ）配列番号２のアミノ酸配列において、１~４８個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ下記一般式（Ｉ）で示される化合物の１９位のカルボキシル基に糖分子を付加する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
    （ｄ）配列番号２のアミノ酸配列に対して、９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ下記一般式（Ｉ）で示される化合物の１９位のカルボキシル基に糖分子を付加する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
    （ｅ）配列番号１の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドと高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、下記一般式（Ｉ）で示される化合物の１９位のカルボキシル基に糖分子を付加する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
    Figure JPOXMLDOC01-appb-I000002
    （式中、Ｒ１はＨ、Ｃ１~Ｃ２０アルキル基、Ｃ２~Ｃ２０アルケニル基、Ｃ２~Ｃ２０アルキニル基、Ｃ４~Ｃ２０アルキルジエニル基、Ｃ６~Ｃ１８アリール基、Ｃ６~Ｃ２０アルキルアリール基、Ｃ６~Ｃ２０アリールアルキル基、Ｃ４~Ｃ２０シクロアルキル基、Ｃ４~Ｃ２０シクロアルケニル基、（Ｃ３~Ｃ１０シクロアルキル）Ｃ１~Ｃ１０アルキル基又は糖残基を表す。）
  10. 　前記糖分子が、ヘキソースである、請求項９に記載の形質転換体。
  11. 　前記糖分子が、グルコース、マンノース及びガラクトースからなる群より選択されるものである、請求項９に記載の形質転換体。
  12. 　前記Ｒ１が、Ｈ又はグルコース単量体、グルコース２量体若しくはグルコース３量体の糖残基の糖残基である、請求項９に記載の形質転換体。
  13. 　前記化合物が、ステビオールモノシド、ステビオールビオシド又はステビオールである、請求項９に記載の形質転換体。
  14. 　前記ポリヌクレオチドが、発現ベクターに挿入されたものである、請求項９に記載の形質転換体。
  15. 　植物体である、請求項９に記載の形質転換体。
  16. 　請求項９に記載の形質転換体の抽出物。
  17. 　請求項１６に記載の抽出物を含む食品、医薬品又は工業原料。
  18. 　請求項９に記載の非ヒト形質転換体を用いることを特徴とするステビオール配糖体の製造方法。
  19. 　前記ステビオール配糖体が、ステビオールビオシド、ステビオシド、レバウディオシドＡ、レバウディオシドＢ、レバウディオシドＣ、レバウディオシドＤ、レバウディオシドＥ、レバウディオシドＦ又はこれらの組み合わせである、請求項１８に記載の方法。
  20. 　配列番号２のアミノ酸配列からなるタンパク質。
  21. 　配列番号２のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
  22. 　配列番号１の塩基配列からなる、請求項２１に記載のポリヌクレオチド。
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