WO2013140104A1 - Facteur h pour son utilisation comme molécule antioxydante - Google Patents

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WO2013140104A1
WO2013140104A1 PCT/FR2013/050631 FR2013050631W WO2013140104A1 WO 2013140104 A1 WO2013140104 A1 WO 2013140104A1 FR 2013050631 W FR2013050631 W FR 2013050631W WO 2013140104 A1 WO2013140104 A1 WO 2013140104A1
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WO
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factor
oxidative stress
ocular
retina
variants
Prior art date
Application number
PCT/FR2013/050631
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English (en)
Inventor
Sylvie JORIEUX Madame
Original Assignee
Laboratoire Francais Du Fractionnement Et Des Biotechnologies
INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale)
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Publication date
Application filed by Laboratoire Francais Du Fractionnement Et Des Biotechnologies, INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) filed Critical Laboratoire Francais Du Fractionnement Et Des Biotechnologies
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/1703—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • A61K38/1709—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • A61K38/1725—Complement proteins, e.g. anaphylatoxin, C3a or C5a
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
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    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
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    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A61P27/12—Ophthalmic agents for cataracts

Definitions

  • the present invention relates to the factor H for its use as an antioxidant molecule, in particular for the treatment of ocular pathologies in which the oxidative stress is involved.
  • Low vision currently affects 12% of the population over 65 and 25% of the population over 75 in economically developed countries and is thus a real public health issue.
  • Leading causes of low vision and blindness include degenerative diseases of the retina such as retinitis pigmentosa and age-related macular degeneration (AMD).
  • AMD age-related macular degeneration
  • Retinopathies pigmentosa refers to a heterogeneous group of ocular disorders characterized by progressive degeneration of rods and cones of the retina by apoptosis.
  • Retinitis pigmentosa is one of the forms of retinopathy that first leads to the degeneration of rod photoreceptors responsible for night vision, and secondly, cone photoreceptors responsible for daytime vision are affected, leading to blindness.
  • the incidence of retinitis pigmentosa is 1/3000 to 1/4000, making it one of the leading causes of irreversible blindness in the workforce.
  • AMD age-related macular degeneration
  • AMD affects the center of the retina, the macula, and results in a loss of precise vision. While preserving peripheral vision, which allows people to navigate globally, AMD affects quality of life significantly. It is the leading cause of irreversible central vision loss in industrialized countries. Age is the primary risk factor for AMD.
  • the retinal pigment epithelium or EPR in the central part of the retina is considered the first target of AMD. Thus, the damage or loss of function of the EPR causes death of the photoreceptors.
  • Various studies have shown that AMD is a complex pathology linked to many factors, including environmental and genetic factors. Although the mechanisms involved are very poorly understood, several pathogenic pathways have been proposed.
  • Document WO2011 / 113641 describes the use of factor H in the treatment and / or prevention of several pathologies, including ocular pathologies.
  • This application describes a factor H activity which relies on its ability to bind endogenous malondialdehyde, thereby preventing the production of pro-inflammatory substances (page 7, lines 15 to 18).
  • the factor H activity described herein is an anti-inflammatory activity; in addition, the strategy proposed by WO2011 / 113641 only aims to treat pathologies comprising an inflammatory component.
  • the inventors have identified, for the first time, an unexpected role of the factor H. After long studies, they have demonstrated the ability of factor H to stimulate the transcription of antioxidant enzymes and thus to have an action factor H antioxidant vis-à-vis retinal cells. Such a technical effect has never been described in the prior art. They also showed the protective effect of Factor H in the survival of cells subjected to oxidative stress. They have thus put forward the possibility of using these antioxidant properties of said factor H for the treatment and / or the prevention of ocular pathologies in which the oxidative stress is involved and plays a crucial role.
  • the invention therefore relates to a compound chosen from the factor H, its fragments, its variants and their mixtures, for its use in the treatment and / or the prevention of an ocular pathology in which the oxidative stress is involved, by protecting the viability and integrity of retinal cells.
  • said ocular pathology does not include an inflammatory component.
  • the inventors have demonstrated that the contribution of exogenous factor H protects the pigment epithelium of the retina subjected to lethal oxidative stress. Also, the contribution of Factor H as an external source to the retina, in order to reduce the level of activation of the alternative complement pathway, proves to be a satisfactory therapeutic solution in patients with retinal degeneration. In addition, they have shown that the repeated addition of Factor H, even at very high dose, in cell cultures of the retinal pigment epithelium does not alter the survival of these cells. Also, the Factor H appears as a relevant, effective and without side effect for the treatment of ocular pathologies related to oxidative stress. Without wishing to be bound by any theory, the inventors believe that the Factor H could act among other things, as a molecule protecting against oxidative stress by stimulating the transcription of enzymes of the antioxidant defense pathway, in particular catalase.
  • the inventors also emit a second hypothesis according to which the polypeptide chain of factor H, containing 19 residues of methionine, 147 negatively charged amino acids, can be directly involved in the protection against oxidative stress, in particular a lethal oxidative stress.
  • the invention proposes an effective therapeutic strategy for the treatment of patients suffering from ocular pathologies that do not have an inflammatory component. It is in fact a new group of patients likely to be treated thanks to the antioxidant activity of Factor H demonstrated by the inventors and to improve the viability and integrity of retinal cells.
  • the invention also relates to a compound selected from Factor H, its fragments, variants and mixtures for its use in improving the viability and integrity of retinal cells. Indeed, the inventors have succeeded in showing that in the presence of factor H, EPR cells subjected to lethal oxidative stress are protected.
  • the invention therefore also relates to said compound for its use in protecting the tight junctions of the cells of the retinal pigment epithelium against oxidative stress.
  • the invention relates to a compound selected from Factor H, its fragments, variants and mixtures thereof for use in improving the viability and integrity of retinal cells under stress. oxidative, said cells not being preferentially not subject to an inflammation phenomenon.
  • the invention also relates to a compound selected from the factor H, its fragments, its variants and their mixtures, for its use in the stimulation of the transcription of enzyme of the antioxidant defense pathway, preferentially the catalase transcription.
  • Factor H a glycoprotein involved in the regulation of the alternate pathway of complement. More specifically, factor H plays a role in the regulation of alternating C3 convertase activity.
  • Factor H encoded by the CHF gene, is predominantly synthesized in the liver.
  • Factor H has repetitive sequences of about 60 amino acids called SCR (short consensus repeat).
  • SCR short consensus repeat
  • the Factor H domains involved in the regulation of the alternate channel in the fluid phase are located on SCR1-4.
  • Factor H has C3b binding sites (SCR12-14 and SCR19-20) and heparin (SCR7, SCR 12-14 and SCR19-20).
  • SCR short consensus repeat
  • Factor H and Factor I regulate the alternative complement path by controlling the C3b amplification loop.
  • Factor H binds C3b competitively, resulting in accelerated dissociation of C3b convertase C3bB, which loses its activity.
  • the C3b-linked Factor H acts as a co-factor for IF, allowing it to cleave C3b into C3bi, a molecule unable to bind to FB to form C3bBb.
  • the factor H is a human factor H. Even more preferably, it is native human Factor H, that is to say the factor H naturally present in humans.
  • the peptide sequence of the native human Factor H is shown in SEQ ID No. 1. This sequence is known to those skilled in the art and is available under the accession number CAA68704.1 in the NCBI base.
  • the inventors have identified, for the first time, a new role of Factor H as an antioxidant and the use of such a Factor H for the treatment of ocular pathologies related to the phenomenon of oxidative stress.
  • the inventors have also demonstrated that oxidative stress decreases the expression of factor H by EPR cells.
  • the term "ocular pathologies in which oxidative stress is involved" encompasses all pathologies that are characterized by decreased expression of factor H in the EPR.
  • the retina is a tissue particularly exposed to the deleterious effects of free radicals. Indeed, retinal oxygen consumption is very important, especially at the outer nuclear layer, and the ocular structures are subject to photon bombardment during the day.
  • the retina is an organ particularly subject to oxidative stress, which triggers a large number of pathologies that can lead to blindness.
  • pathologies are indifferently referred to as “ocular pathologies”, “retinal degenerations” or “degenerative diseases of the retina”, in which oxidative stress is involved.
  • these pathologies are characterized by the death of photoreceptors of the retina as well as the alteration of the structure and / or the function and the survival of the cells of the EPR, phenomena resulting from an oxidative stress. These are the pathologies that the present invention claims to treat and / or prevent.
  • Oxidative stress or “oxidative stress” is meant the action of prooxidant compounds, especially free radicals, which are generally reactive oxygen species (ROS), such as hydrogen peroxide. These compounds damage many cellular structures, such as membrane lipids, proteins, or nucleic acids. Oxidative stress is recognized as an important component of the onset or progression of diseases such as cardiovascular disease, neurodegenerative diseases, cancers, or phenomena such as aging. The inventors have confirmed the role of such oxidative stress in certain retinal degenerations.
  • ROS reactive oxygen species
  • antioxidant molecule is meant a molecule capable of capturing free radicals and converting them into substances that are harmless to the body. Indeed, antioxidants neutralize reactive oxygen species, which are continuously generated by metabolism. The antioxidant molecules thus make it possible to reverse the harmful effects caused by the oxidative stress.
  • ocular pathology not involving an inflammatory component is meant an ocular pathology for which the patient suffering from said pathology is not characterized by the presence or increase of the blood concentration of a marker of inflammation.
  • said marker is C-reactive protein.
  • there is no mention of an inflammatory component if the blood concentration of reactive protein C is less than 7 mg / l.
  • the targeted pathologies involve oxidative stress without involving an inflammatory component.
  • These pathologies include retinitis pigmentosa, age-related macular degeneration (AMD), glaucoma, cataract, ischemia / reperfusion, and dry eye.
  • enhancement of viability and cell integrity is meant improvement of retinal cell survival preferentially of retinal pigment epithelium cells subjected to oxidative stress.
  • Fractor H fragment is meant a part of the peptide sequence of fragment H having retained the same biological property of interest as fragment H. In other words, it is a part of the sequence peptide fragment H having the antioxidant property of factor H.
  • a fragment of Factor H can represent 1 to 99% of the peptide sequence of said factor H.
  • the fragments of factor H are between 1 and 1000, preferably 1 to 500 and even more preferably between 1 and 264 amino acids of the peptide sequence of native human Factor H.
  • Factor H variant is meant a protein functionally identical to Factor H, that is to say a protein in which at least one given amino acid has been modified without, however, altering the overall conformation and / or the biological property. of interest of the Factor H, that is to say its antioxidant properties. Variants include proteins whose amino acid sequence is substantially homologous to that of Factor H.
  • the variants also include proteins having modifications of their amino acid sequences such as deletions, insertions and / or substitutions.
  • the term “deletion” refers to the absence of one or more amino acid residues.
  • the term “insertion” refers to the addition of one or more amino acids.
  • substitution refers to the replacement of an amino acid by another amino acid. Typically, these modifications are conservative in nature, i.e. they do not affect the biological property of interest of the Factor H variant. In the case of substitutions, the substituted amino acid has a structure similar to the amino acid present in the native structure of Factor H.
  • insertions and deletions they are typically carried out on 1 to 5 amino acids, although depending on the location of the insertion, a larger number of amino acids may be inserted or deleted, without affecting the biological property of interest variant of Factor H thus obtained.
  • the variants can be obtained according to the techniques conventionally described in the prior art, such as site-directed mutagenesis (Carter et al., 1985, Nucl Acids Res 13: 4331, Zoller et al., 1982) or else PCR mutagenesis (Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Edition, Cold Spring Harbor Press, NY, (2001)).
  • Two amino acid sequences are said to be "substantially homologous" or “substantially similar” when greater than 80%, preferably more than 85%, preferentially more than 90%, preferentially more than 95%, and even more preferably more than 99% of the amino acids. amino acids of the two sequences are identical. Preferably, the percentages of identity are determined by algorithms well known to those skilled in the art. By way of example, mention may be made of the alignment by the GCG program (Genetics Computer Group) or else of any sequence comparison algorithm such as BLAST, FASTA, etc.
  • biological property of interest of Factor H is meant the antioxidant property of said Factor H.
  • the term “treatment” or “treating” is understood to mean the action of suppressing, reducing, inhibiting the progression of the disease to which this term applies; or the action of suppressing, reducing, inhibiting the progression of the occurrence of one or more symptoms of the condition or disease to which that term applies.
  • this term refers to the protection conferred by factor H against retinal degeneracies and more specifically against the death of photoreceptor cells of the retina.
  • prevention means the action of avoiding the appearance of a pathology or the symptoms of a pathology in a healthy subject, or a subject known to have a predisposition to trigger said pathology.
  • the compound of the invention may be used alone, in combination and / or in combination with other active agents, such as other substances used in the treatment of ocular pathologies.
  • active agents such as other substances used in the treatment of ocular pathologies.
  • steroidal or nonsteroidal anti-inflammatory compounds and antibiotics can be used in combination therapy, and administered in separate, combined, time-spread or concomitant form.
  • the ocular pathology in which the oxidative stress is involved is selected from retinitis pigmentosa, age-related macular degeneration (AMD), glaucoma, cataract, ischemia / reperfusion, and dry eye.
  • AMD age-related macular degeneration
  • the influence of oxidative stress in the etiology of retinitis pigmentosa and AMD is established.
  • the compound of the invention is highly suitable for use in the treatment and / or prevention of these conditions.
  • Glaucoma is a disease of the eye characterized by elevated intraocular pressure, hardening of the globe, atrophy of the optic nerve and impaired visual field that may lead to blindness. This pathology has recently been described as being likely to be triggered by oxidative stress. Indeed, oxidative stress is part of the neurotoxicity phenomena observed during glaucoma, but is also responsible for rearrangements in the trabecular meshwork causing the disorders of the aqueous humor resorption. It has been shown that the increase in intraocular pressure and visual field changes are proportional to the degree of oxidative damage found in the trabecular meshwork.
  • Cataract is a congenital or acquired ocular condition that consists of partial or complete opacity of the lens or its capsule. It is accompanied by a decrease in visual acuity that can go as far as blindness.
  • oxidative stress in this pathology
  • the compound of the invention is relevant for use in the treatment and / or prevention of cataracts.
  • Ischemia / reperfusion is a phenomenon of hypoxia followed by reoxygenation at the cellular level. It is accepted that this phenomenon is an integral part of physiopathological processes, such as myocardial infarction, stroke, cardiac arrest or septic shock. Restoring blood flow is essential to rescue oxygen-deprived organs, but it has been shown that this reperfusion induces significant cellular damage by itself. Indeed, hypoxia and ischemia of nerve tissue are associated with a large production of free radicals. These free radicals are produced not only during the acute phase of ischemia itself, but also during the reperfusion phase.
  • the compound of the invention is highly suitable for use in the treatment and / or prevention of ischemia / reperfusion. More specifically, its use is adapted for the treatment of the symptoms induced by such ischemia / reperfusion.
  • the compound of the invention is suitable for use in the treatment and / or prevention of dry eye.
  • the compound of the invention may also be used to prepare a pharmaceutical composition for the treatment or prevention of ocular pathology in which oxidative stress is involved.
  • the invention also relates to a pharmaceutical composition for use in the treatment and / or prevention of an ocular pathology chosen from retinitis pigmentosa, age-related macular degeneration (AMD), glaucoma, cataract, ischemia / reperfusion, and dry eye, said compositions comprising a compound selected from Factor H, its fragments, variants and mixtures thereof, and a pharmaceutically acceptable carrier.
  • an ocular pathology chosen from retinitis pigmentosa, age-related macular degeneration (AMD), glaucoma, cataract, ischemia / reperfusion, and dry eye
  • AMD age-related macular degeneration
  • glaucoma cataract
  • cataract ischemia / reperfusion
  • dry eye said compositions comprising a compound selected from Factor H, its fragments, variants and mixtures thereof, and a pharmaceutically acceptable carrier.
  • Factor H may be combined with any type of pharmaceutically acceptable vehicle or excipient, and optionally with a sustained diffusion matrix, such as a biodegradable polymer, to form a pharmaceutical composition according to the invention.
  • pharmaceutically acceptable refers to molecular entities and compositions that do not produce an adverse, allergic or other undesired reaction when administered to a mammal, particularly a human.
  • a pharmaceutically acceptable carrier or excipient can be solid, semi-solid or liquid.
  • the form of the pharmaceutical compositions, their route of administration, their dosage and their dosage naturally depend on the severity of the ocular pathology, its stage of evolution, the age, the sex, the weight of the subject to be treated, etc. .
  • the pharmaceutical composition according to the invention can be in any form that can be administered to a patient, and in particular includes liquid or solid forms, typically in the form of eye drops, gel, or oral solution, but also suspensions, lyophilized powder, capsules and tablets.
  • Compositions formulated in such a way as to be administered locally, such as, for example, eye drops and gels, or orally, such as drinkable solutions, tablets, ampoules, are preferred.
  • the composition according to the invention may also be in a form compatible with an injection, ie a local injection, a mucosal administration, an inhalation, an oral administration and more generally any formulation appropriate for the intended purpose.
  • the pharmaceutical composition according to the invention is in a compatible form for ocular, intraocular, intravitreous, sub-tenonial, subretinal, intra-orbital, subconjunctival, intravenous, intra-ocular administration.
  • the pharmaceutical composition according to the invention comprises from 0.001 to
  • the pharmaceutical composition according to the invention contains from 0.1 to 5% of a compound chosen from factor H, its fragments, its variants and their mixtures relative to the total weight of the composition.
  • said topical pharmaceutical composition When formulated for topical administration, that is to say an application on the skin, mucous membranes and / or integuments, said topical pharmaceutical composition may be in liquid, pasty or solid form, and more particularly under form, cream, ointment, powder, soaked pad, solution, gel, spray, mousse, suspension, or lotion. It may also be in the form of suspension of microspheres or nanospheres or lipid or polymeric vesicles allowing controlled release.
  • This pharmaceutical composition for topical application may be in anhydrous form, in aqueous form or in emulsion form.
  • the pharmaceutical composition for topical application is in the form of a solution, a gel or an emulsion.
  • the pharmaceutical composition according to the invention when in the form of an emulsion, it comprises at least one surfactant.
  • An emulsion comprises a mixture of two immiscible liquids, one of which is dispersed in the other in the form of fine droplets (micelles); the dispersion is stabilized by the action of surfactants which modify the structure and the ratio of the forces at the interface, and thus increase the stability of the dispersion by reducing the interfacial tension energy.
  • the surfactants are amphiphilic compounds which have a hydrophobic part having an affinity for the oil and a hydrophilic part having an affinity for water thus creating a link between the two phases. The surfactants thus stabilize the emulsions by adsorbing at the interface and forming lamellar layers of liquid crystals.
  • the surfactant may be ionic (anionic, cationic or amphoteric), or nonionic.
  • the pharmaceutical composition of the invention may furthermore comprise any additive usually used in the pharmaceutical field, such as surfactants, neutralizing agents of the usual or inorganic or organic bases or acids type (for example, triethanolamine, 10% sodium hydroxide, citric acid / sodium citrate buffer, succinic acid / sodium succinate buffer), antioxidants (Butylhydroxyanisole type), fillers, electrolytes, dyes, perfumes, essential oils, essential fatty acids, sphingolipids, soothing and skin-protecting agents such as allantoin, propenetrating agents, or a mixture thereof.
  • surfactants neutralizing agents of the usual or inorganic or organic bases or acids type (for example, triethanolamine, 10% sodium hydroxide, citric acid / sodium citrate buffer, succinic acid / sodium succinate buffer), antioxidants (Butylhydroxyanisole type), fillers, electrolytes, dyes, perfumes, essential oils, essential fatty acids, sphingolipids, soothing and skin-protecting agents such as allantoin, propene
  • additives may be present in the pharmaceutical composition in a proportion of 0.0010% to 20% by weight relative to the total weight of said composition.
  • the pharmaceutical composition of the invention further comprises another active agent, such as, for example, other substances used in the treatment of ocular pathologies.
  • another active agent such as, for example, other substances used in the treatment of ocular pathologies.
  • the compounds anti-inflammatory steroidal or nonsteroidal drugs and antibiotics may be present in the pharmaceutical composition in a proportion of 0.0010% to 20% by weight relative to the total weight of said composition.
  • the inventors have here demonstrated the therapeutic potential of Factor H in relevant models of degenerative retinal pathologies. For this, in a preliminary work, they developed methods of purification of the FH and to control its purity, its integrity and its anti-C3 convertase activity.
  • Purification of human plasma FH is performed from a mixture of cryoprecipitate overflow and non-DEAE-Sephadex column fraction. This product is then subjected to two chromatography steps: a first step of affinity chromatography on a Heparin-Sepharose FF column. The factor H is eluted with a salt buffer and then subjected to a second step of anionic exchange chromatography on Q-Sepharose FF column. After elution, the purified factor H is concentrated, formulated and lyophilized.
  • FH Due to the formulation buffer used, FH can not be used as is; it must be desalinated.
  • the FH is desalted by NAP TM -5 (GE Healthcare, 17-0853) or PD10 (GE Healthcare, 17- 0851) column chromatography, depending on the FH volume to be desalinated according to the supplier's instructions.
  • the purity and the integrity of the FH (2 ⁇ g per sample) are analyzed by polyacrylamide gel electrophoresis 10% in the presence or absence of SDS and by Western blotting.
  • the electrophoretic profile of the FH desalted on NAP-5 or PD-10 is identical to that of FH in formulation buffer.
  • the desalting step carried out under the conditions described does not alter the FH molecule. After electrotransfer on a nitrocellulose membrane, the FH is detected by an anti-FH mouse monoclonal antibody (Serotec).
  • the retinal pigment epithelium or EPR in the central part of the retina is considered the first target of AMD.
  • the damage or loss of function of the EPR phagocytosis of the outer segments of the photoreceptors, blood-retinal barrier, filtration and nutrient supply for RA, retinoid cycle
  • oxidative or inflammatory stress induce death.
  • photoreceptors The inventors have studied the effects of FH on both the human retinal EPR cells in culture and on the retina (more specifically on a spontaneously immortalized EPR human cell line: ARPE-19), after intraperitoneal injection in the mouse.
  • the inventors intraperitoneally injected the desalted FH (900 ⁇ g total, or about twice the plasma concentration) in a healthy mouse aged 2 weeks and this three times (J15, J18 and J21), then after sacrifice either the 4 th week, the third month of life of the mouse, the structure of the retina is analyzed. Microscopic observation of the retina from historesin sections after staining with toluidine blue shows no general alteration of the structure of the retina. The quantification of the thickness of each of the two synaptic layers and the three neuronal layers shows no significant difference between the mice injected with the FH and the mice injected with water or not injected.
  • AMD for which the death of photoreceptors and alteration of the structure and / or functions and survival of EPR cells strongly suggest that oxidative stress is one of the major players in retinal degeneration.
  • the inventors have analyzed the effects of FH on confluent EPR cell cultures, for which the tight junctions are formed, and which will be subjected to lethal oxidative stress. Such oxidative stress disrupts the tight junctions of these cells.
  • These in vivo junctions contribute to the establishment of the selectivity of the transepithelial permeability of the EPR, which guarantees the survival of photoreceptors.
  • the inventors analyzed the effect of FH (300 nM) on the survival of EPR cells subjected to two oxidants, 4-HNE and t-BHP at lethal doses.
  • 4-HNE induces a decrease in cell survival of 46 and 58% after 24 and 48 hours of culture.
  • Pretreatment of 300 nM FH reduced nearly half of oxidant-induced cell death (27 and 32% cell death at 24 and 48 hours), showing a partial protective effect of FH at oxidative stress strong.
  • the inventors have analyzed its protective effects on cellular components known to be targets of oxidative stress.
  • the inventors analyzed the effect of FH on the tight junctions of the EPR cells subjected to the lethal stress of t-BHP.
  • the inventors had previously established the effects of premature senescence induced by oxidative stress on the destabilization of the tight junctions of EPR.
  • Untreated confluent EPR cells have tight junctions visualized by immunohistochemistry using an anti-occludin antibody. T-BHP rapidly induces disorganization of these tight junctions as early as 6 hours of culture.
  • the inventors have thus demonstrated that the resistance of EPR cells to oxidative stress is partly due to the production of antioxidant enzymes. They subsequently hypothesized that HF induces an adaptive response of EPR to oxidative stress, inducing an increase in the expression of enzymes involved in antioxidant defense.
  • the inventors have attempted to identify the pathways potentially involved in the protection by FH of cells subjected to oxidative stress. They have thus demonstrated a specific increase in the expression of the antioxidant catalase enzyme, following the treatment with FH in the presence of oxidant, while treatment with the oxidant alone decreases this expression.
  • SOD2 and GPX shows that their expression is not modified by FH in the presence of oxidant.
  • the inventors have implemented experiments on the mouse model Rd10, genetic model of autosomal recessive retinitis pigmentosa (codon mutation 560 CGC in TGC substituting an arginine to cysteine, Arg560Cys, of the gene encoding the beta subunit of the phosphodiesterase of rod photoreceptors).
  • rod degeneration begins in the postnatal stage in the center of the retina, then in the periphery of the retina, then the number of photoreceptors gradually decreases.
  • the inventors also used a healthy or wild mouse as a witness for their work. They thus analyzed the expression of FH in the neural retina of C57BL / 6J mice by RT-PCR. Surprisingly, only a very weak expression of the FH transcript in the neural retina of healthy control mice has been demonstrated.
  • the degenerating retina fights this degeneration by inducing an adaptive response, whose increase in FH is one of the processes.
  • the inventors have established that the amount of FH produced by the retina in response to degeneration is not sufficient to reverse or stop the degenerative process. Also, exogenous FH intake is necessary to induce effective protection of the retina.
  • the inventors injected FH into the Rd10 mouse.
  • the inventors have established different intraperitoneal FH injection protocols in the RD10 mouse and the C57BL / 6J mouse from the RdlO mouse, taken as a control.
  • the mice first underwent a series of intraperitoneal injections of human FH at a concentration twice that of the plasma of the mouse, ie 900 ⁇ g / 100 ⁇ l.
  • the injections were repeated three times with a frequency of once every 3 days.
  • the analysis of the presence of human FH in the retina and the choroid (richly vascularized) was performed by immunohistochemistry in the mouse Rd10.
  • the inventors After controlling the good diffusion of the FH injected into the Rd10 mouse in the choroid, EPR and neural retina, the inventors determined the layer thickness of photoreceptor cores on retinal sections stained with toluidine blue.

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Abstract

L'invention concerne un composé choisi parmi le Facteur H, ses fragments, ses variants et leurs mélanges, pour son utilisation dans le traitement et/ou la prévention d'une pathologie oculaire dans laquelle le stress oxydatif est impliqué.

Description

Facteur H pour son utilisation comme molécule antioxydante
La présente invention concerne le Facteur H pour son utilisation comme molécule antioxydante, notamment pour le traitement de pathologies oculaires dans lesquelles le stress oxydatif est impliqué.
La malvoyance touche actuellement 12 % de la population de plus de 65 ans et 25% de la population de plus de 75 ans dans les pays économiquement développés et constitue ainsi un réel enjeu de santé publique. En tête des causes de malvoyance et de cécité, on trouve les maladies dégénératives de la rétine comme la rétinite pigmentaire et la dégénérescence maculaire liée à l'âge (DMLA).
Les rétinopathies pigmentaires désignent un groupe hétérogène de désordres oculaires caractérisés par une dégénérescence progressive des bâtonnets et des cônes de la rétine par apoptose. La rétinite pigmentaire est l'une des formes de rétinopathie qui conduit dans un premier temps à la dégénérescence des photorécepteurs à bâtonnets responsables de la vision de nuit puis, dans un second temps, les photorécepteurs à cônes responsables de la vision diurne sont affectés entraînant la cécité. L'incidence de la rétinite pigmentaire est de 1/3000 à 1/4000, ce qui en fait une des premières causes de cécité irréversible dans la population active. Plusieurs types de traitements ont été proposés, notamment des thérapies basées sur des complémentations en vitamine A et oméga 3 qui permettent un ralentissement de l'évolution, ainsi que des complémentaitions en lutéine qui permettent une augmentation du nombre de pigments maculaires sans amélioration de la vision centrale. Il a également été proposé des thérapies basées sur des complémentations en éléments essentiels à la fabrication des photorécepteurs et d'autres éléments contribuant à une bonne circulation sanguine afin d'éviter l'hypoxie.
Les stratégies thérapeutiques actuelles tentent uniquement de ralentir l'avancée de la maladie et d'améliorer la qualité de vie des patients Aussi, elles restent très peu satisfaisantes et ne permettent pas la restauration de la vision chez les individus atteints.
Contrairement à la rétinite pigmentaire, la dégénérescence maculaire liée à l'âge (DMLA), quant à elle, touche d'abord le centre de la rétine, la macula, et entraîne de fait une perte de la vision précise. Bien que préservant la vision périphérique, ce qui permet aux personnes atteintes de s'orienter globalement, la DMLA affecte la qualité de vie de façon importante. Elle constitue la première cause de perte de la vision centrale irréversible dans les pays industrialisés. L'âge est le premier facteur de risque de la DMLA. L'épithélium pigmentaire de la rétine ou EPR dans la partie centrale de la rétine est considéré comme la première cible de la DMLA. Ainsi, les dommages ou la perte de fonction de l'EPR induisent la mort des photorécepteurs. Diverses études ont mis en évidence le fait que la DMLA est une pathologie complexe liée à de nombreux facteurs, notamment environnementaux et génétiques. Bien que les mécanismes impliqués soient très insuffisamment compris, plusieurs voies pathogéniques ont été proposées. La plus sérieuse concerne des processus inflammatoires et le stress oxydatif, déjà observés pour d'autres pathologies neurodégénératives liées à l'âge, comme la maladie d'Alzheimer ou la maladie de Parkinson. Il a donc été proposé de traiter ces pathologies oculaires en agissant sur les protéines du complément, qui ont récemment montré un rôle dans le déclenchement de maladies dégénératives de la rétine. En particulier, le Facteur H peut être utilisé pour traiter certaines dégénérescences rétiniennes uniquement du fait de son activité anti-inflammatoire. A ce jour, on ne dispose d'aucune thérapie efficace pour soigner ces pathologies.
Par conséquent, il n'existe actuellement aucun remède à la perte de vision imputable aux maladies dégénératives de la rétine, notamment la rétinite pigmentaire et la DMLA. Les personnes atteintes perdent lentement la vue jusqu'à finalement devenir totalement non voyantes. Il existe donc un besoin de disposer d'un traitement efficace des pathologies oculaires. Le document WO2011/113641 décrit l'utilisation du facteur H dans le traitement et/ou la prévention de plusieurs pathologies, dont des pathologies oculaires. Cette demande décrit une activité du facteur H qui repose sur sa capacité à se lier à la malondialdéhyde endogène, empêchant ainsi la production de substances pro-inflammatoires (page 7 lignes 15 à 18). Aussi, l'activité du facteur H décrite dans ce document est une activité anti-inflammatoire; en outre, la stratégie proposée par le document WO2011/113641 vise uniquement à traiter des pathologies comprenant une composante inflammatoire.
De manière surprenante, les inventeurs ont identifié, pour la première fois, un rôle inattendu du Facteur H. Après de longues études, ils ont mis en évidence la capacité du facteur H à stimuler la transcription d'enzymes antioxydantes et ainsi à avoir une action antioxydante du Facteur H vis-à-vis des cellules rétiniennes. Un tel effet technique n'a jamais été décrit dans l'art antérieur. Ils ont également montré l'effet protecteur du Facteur H dans la survie des cellules soumises à un stress oxydatif. Ils ont ainsi mis en avant la possibilité d'utiliser ces propriétés antioxydantes dudit facteur H pour le traitement et/ou la prévention de pathologies oculaires dans lesquelles le stress oxydatif est impliqué et joue un rôle crucial.
Les inventeurs ont montré le caractère antioxydant du Facteur H et l'intérêt thérapeutique dudit Facteur H dans le traitement d'un groupe de patients souffrant de pathologies oculaires dans lesquelles le stress oxydatif est impliqué et n'ayant pas de composante inflammatoire. Dans un premier aspect l'invention concerne donc un composé choisi parmi le Facteur H, ses fragments, ses variants et leurs mélanges, pour son utilisation dans le traitement et/ou la prévention d'une pathologie oculaire dans laquelle le stress oxydatif est impliqué, par la protection de la viabilité et de l'intégrité des cellules rétiniennes. Préférentiellement, ladite pathologie oculaire ne comporte pas de composante inflammatoire.
En effet, les inventeurs ont mis en évidence le fait que l'apport de Facteur H exogène protège l'épithélium pigmentaire de la rétine soumis à un stress oxydatif létal. Aussi, l'apport de Facteur H comme source externe à la rétine, afin de réduire le niveau d'activation de la voie alterne du complément, s'avère être une solution thérapeutique satisfaisante chez les patients atteints de dégénérescence rétinienne. En outre, ils ont montré que l'ajout répété de Facteur H, même à très forte dose, dans des cultures de cellules de l'épithélium pigmentaire de la rétine n'altèrent pas la survie de ces cellules. Aussi, le Facteur H apparaît comme une solution pertinente, efficace et sans effet secondaire pour le traitement de pathologies oculaires liées à un stress oxydatif. Sans vouloir être liés par une quelconque théorie, les inventeurs estiment que le Facteur H pourrait agir entre autre, comme une molécule protégeant du stress oxydatif par la stimulation de la transcription d'enzymes de la voie de défense antioxydante, notamment la catalase.
Les inventeurs émettent en outre une seconde hypothèse selon laquelle la chaîne polypeptidique du facteur H, contenant 19 résidus de méthionine, 147 acides aminés chargés négativement, peut être directement impliquée dans la protection contre le stress oxydatif, notamment un stress oxydatif létal.
L'invention propose une stratégie thérapeutique efficace pour le traitement de patients souffrant de pathologies oculaires ne présentant pas de composante inflammatoire. Il s'agit en fait d'un nouveau groupe de patients susceptibles d'être traités grâce à l'activité antioxydante du Facteur H mis en évidence par les inventeurs et permettant d'améliorer la viabilité et l'intégrité des cellules rétiniennes.
L'invention concerne également un composé choisi parmi le Facteur H, ses fragments, ses variants et leurs mélanges, pour son utilisation dans l'amélioration de la viabilité et de l'intégrité des cellules rétiniennes. En effet, les inventeurs ont réussi à montrer qu'en présence de Facteur H, les cellules de l'EPR soumises à un stress oxydatif létal sont protégées.
En outre, ils ont montré l'effet protecteur du Facteur H sur les jonctions serrées des cellules de l'EPR contre le stress oxydatif, plus précisément contre la déstabilisation et la désorganisation des jonctions serrées des cellules rétiniennes soumises à un stress oxydatif. L'invention porte donc également sur ledit composé pour son utilisation dans la protection des jonctions serrées des cellules de l'épithélium pigmentaire de la rétine contre le stress oxydatif.
Dans un mode de réalisation préféré, l'invention concerne un composé choisi parmi le Facteur H, ses fragments, ses variants et leurs mélanges, pour son utilisation dans l'amélioration de la viabilité et de l'intégrité de cellules rétiniennes soumises à un stress oxydatif, lesdites cellules n'étant préférentiellement pas soumises à un phénomène d'inflammation.
L'invention concerne également un composé choisi parmi le Facteur H, ses fragments, ses variants et leurs mélanges, pour son utilisation dans la stimulation de la transcription d'enzyme de la voie de défense antioxydante, préférentiellement la transcription de la catalase.
Par "Facteur H" ou "FH" on entend une glycoprotéine intervenant dans la régulation de la voie alterne du complément. Plus spécifiquement, le Facteur H joue un rôle dans la régulation de l'activité C3 convertase alterne. Le Facteur H, codé par le gène CHF, est majoritairement synthétisé dans le foie. Le Facteur H possède des séquences répétitives d'environ 60 acides aminés appelées SCR (short consensus repeat). Les domaines du Facteur H impliqués dans la régulation de la voie alterne en phase fluide sont localisés sur les SCR1-4. Le Facteur H possède des sites de liaison au C3b (SCR12-14 et SCR19-20) et à l'héparine (SCR7, SCR 12-14 et SCR19-20). Ainsi, le Facteur H peut interagir avec les membranes cellulaires. Le Facteur H et le Facteur I (FI) régulent la voie alterne du complément par le contrôle de la boucle d'amplification de C3b. Le Facteur H se fixe sur C3b de façon compétitive, ce qui entraîne une dissociation accélérée de la C3b convertase alterne C3bB qui perd son activité. De plus, le Facteur H lié à C3b joue le rôle de co-f acteur pour le FI, permettant à celui-ci de cliver C3b en C3bi, molécule incapable de se lier au FB pour former C3bBb.
Préférentiellement, le Facteur H est un Facteur H humain. Encore plus préférentiellement, il s'agit de Facteur H humain natif, c'est-à-dire le Facteur H naturellement présent chez l'homme. La séquence peptidique du Facteur H humain natif est représentée en SEQ ID N° 1. Cette séquence est connue de l'homme du métier et est disponible sous le numéro d'accession CAA68704.1 dans la base NCBI.
Les inventeurs ont identifié, pour la première fois, un nouveau rôle du Facteur H en tant qu'anti-oxydant et l'utilisation d'un tel Facteur H pour le traitement de pathologies oculaires liées au phénomène de stress oxydatif. Les inventeurs ont également mis en évidence le fait que le stress oxydatif diminue l'expression du Facteur H par les cellules de l'EPR. Aussi, l'expression "les pathologies oculaires dans lesquels le stress oxydatif est impliqué" englobe toutes les pathologies qui sont caractérisées par une diminution de l'expression de Facteur H dans l'EPR. La rétine est un tissu particulièrement exposé aux effets délétères des radicaux libres. En effet, la consommation rétinienne en oxygène est très importante, notamment au niveau de la couche nucléaire externe, et les structures oculaires sont soumises à un bombardement par les photons durant le jour. Aussi, la rétine est un organe particulièrement soumis au stress oxydatif, qui déclenche un grand nombre de pathologies pouvant conduire à la cécité. Ces pathologies sont indifféremment désignées "pathologies oculaires", "dégénérescences rétiniennes" ou "maladies dégénératives de la rétine", dans lesquelles un stress oxydatif est impliqué. Aussi, ces pathologies sont caractérisées par la mort des photorécepteurs de la rétine ainsi que l'altération de la structure et/ou la fonction et la survie des cellules de l'EPR, phénomènes résultant d'un stress oxydant. Ce sont ces pathologies que la présente invention prétend traiter et/ou prévenir.
Par "stress oxydatif" ou "stress oxydant", on entend l'action de composés prooxydants, notamment des radicaux libres, qui sont en général des espèces réactives de l'oxygène (ROS), comme le peroxyde d'hydrogène. Ces composés endommagent de nombreuses structures cellulaires, telles que les lipides membranaires, les protéines, ou les acides nucléiques. Le stress oxydatif est reconnu comme étant un élément important du déclenchement ou de la progression de maladies comme les maladies cardiovasculaires, les maladies neurodégénératives, les cancers, ou encore de phénomènes tels que le vieillissement. Les inventeurs ont confirmé le rôle d'un tel stress oxydatif dans certaines dégénérescences rétiniennes.
Par "molécule antioxydante", on entend une molécule capable de capturer les radicaux libres et de les convertir en substances inoffensives pour l'organisme. En effet, les antioxydants neutralisent les espèces réactives de l'oxygène, qui sont continuellement générées par le métabolisme. Les molécules antioxydantes permettent donc de renverser les effets néfastes engendrés par le stress oxydatif.
Par "pathologie oculaire n'impliquant pas de composante inflammatoire" on entend une pathologie oculaire pour laquelle le patient souffrant de ladite pathologie ne se caractérise pas par la présence ou l'augmentation de la concentration sanguine d'un marqueur de l'inflammation. Dans un mode de réalisation particulier, ledit marqueur est la protéine C réactive. Dans ce mode de réalisation, on parle d'absence de composante inflammatoire si la concentration sanguine de protéine C réactive est inférieure à 7 mg/1.
Dans le contexte de la présente invention, les pathologies visées impliquent un stress oxydatif sans impliquer de composante inflammatoire. Parmi ces pathologies, on peut citer la rétinite pigmentaire, la dégénérescence maculaire liée à l'âge (DMLA), le glaucome, la cataracte, l'ischémie/reperfusion, et la sécheresse oculaire.
Par "amélioration de la viabilité et de l'intégrité cellulaire" on entend l'amélioration de la survie de cellules rétiniennes préférentiellement de cellules de l'épithélium pigmentaire de la rétine soumise à un stress oxydatif.
Dans le contexte de la présente invention, on parle d'amélioration de la viabilité et de l'intégrité des cellules rétinienne lorsque l'on constate une survie d'au moins 50%, préférentiellement d'au moins 60%, préférentiellement d'au moins 70%, préférentiellement d'au moins 80%, plus préférentiellement d'au moins 90% et encore plus préférentiellement de la totalité des cellules rétiniennes soumises à un stress oxydatif létal.
Par "fragment de Facteur H", on entend une partie de la séquence peptidique du fragment H ayant conservé la même propriété biologique d'intérêt que le fragment H. En d'autres termes, il s'agit d'une partie de la séquence peptidique du fragment H présentant la propriété antioxydante du facteur H. Typiquement, un fragment du Facteur H peut représenter 1 à 99 % de la séquence peptidique dudit Facteur H. Préférentiellement, les fragments du Facteur H comptent entre 1 et 1000, préférentiellement 1 à 500, et encore plus préférentiellement entre 1 et 264 acides aminés de la séquence peptidique du Facteur H humain natif.
Par "variant du Facteur H", on entend une protéine fonctionnellement identique au Facteur H, c'est-à-dire une protéine dans laquelle au moins un acide aminé donné a été modifié sans toutefois altérer la conformation globale et/ou la propriété biologique d'intérêt du Facteur H, c'est-à-dire ses propriétés antioxydantes. Les variants comprennent les protéines dont la séquence d'acides aminés est sensiblement homologue à celle du Facteur H.
Les variants incluent également des protéines présentant des modifications de leurs séquences d'acides aminés tels que les délétions, insertions et/ou des substitutions. Le terme "délétion" désigne l'absence d'un ou plusieurs résidus d'acides aminés. Le terme "insertion" se réfère à l'ajout d'un ou plusieurs acides aminés. Enfin, le terme "substitution" désigne le remplacement d'un acide aminé par un autre acide aminé. Typiquement, ces modifications sont de nature conservatrice, c'est-à-dire qu'elles n'influent pas sur la propriété biologique d'intérêt du variant du Facteur H. Dans le cas de substitutions, l'acide aminé remplacé a une structure similaire à l'acide aminé présent dans la structure native du Facteur H. Quant aux insertions et délétions, elles s'effectuent typiquement sur 1 à 5 acides aminés, bien que selon l'emplacement de l'insertion, un nombre plus important d'acides aminés peut être insérés ou délétés, sans influence sur la propriété biologique d'intérêt dudit variant du Facteur H ainsi obtenus. Les variants peuvent être obtenus selon les techniques classiquement décrites dans l'art antérieur telles que la mutagenèse dirigée (Carter et al, 1985, Nucl Acids Res 13:4331; Zoller et al. 1982) ou encore la PCR mutagenèse (Sambrook et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3e édition, Cold Spring Harbor Press, NY, (2001)).
Deux séquences d'acides aminés sont dites "sensiblement homologues" ou "essentiellement similaires" quand plus de 80%, préférentiellement plus de 85%, préférentiellement plus de 90%, préférentiellement plus de 95%, et encore plus préférentiellement plus de 99% des acides aminés des deux séquences sont identiques. De préférence, les pourcentages d'identité sont déterminés par des algorithmes bien connus de l'homme du métier. On peut citer, à titre d'exemple, l'alignement par le programme GCG (Genetics Computer Group) ou encore tout algorithme de comparaison de séquences tel que BLAST, FASTA, etc.
Par "propriété biologique d'intérêt du Facteur H", on entend la propriété antioxydante dudit Facteur H.
Selon l'invention, on entend par le terme "traitement" ou "traiter", l'action de supprimer, réduire, inhiber la progression de la maladie à laquelle ce terme s'applique ; ou l'action de supprimer, réduire, inhiber la progression de l'apparition d'un ou plusieurs symptômes de la condition ou de la maladie à laquelle ce terme s'applique. Préférentiellement, ce terme désigne la protection conférée par le facteur H contre les dégénérescences rétiniennes et plus spécifiquement contre la mort des cellules photoréceptrices de la rétine.
Selon l'invention on entend par le terme "prévention" ou "prévenir" l'action d'éviter l'apparition d'une pathologie ou des symptômes d'une pathologie chez un sujet sain, ou un sujet connu pour avoir une prédisposition à déclencher ladite pathologie.
Le composé de l'invention peut être utilisé seul, en combinaison et/ou en association avec d'autres agents actifs, tels que d'autres substances utilisées dans le traitement des pathologies oculaires. On peut citer par exemple les composés anti-inflammatoires stéroïdiens ou non stéroïdiens et les antibiotiques. Ces différents agents actifs peuvent être utilisés en combinaison thérapeutique, et administrés sous forme séparée, combinée, étalée dans le temps ou concomitante. Dans un mode de réalisation préféré de l'invention, la pathologie oculaire dans laquelle le stress oxydatif est impliqué est choisie parmi la rétinite pigmentaire, la dégénérescence maculaire liée à l'âge (DMLA), le glaucome, la cataracte, l'ischémie/reperfusion, et la sécheresse oculaire.
En particulier, l'influence du stress oxydatif dans l'étiologie de la rétinite pigmentaire et de la DMLA est établie. Aussi, le composé de l'invention est hautement adapté pour une utilisation dans le traitement et/ou la prévention de ces pathologies.
Quant au glaucome, il s'agit d'une maladie de l'œil caractérisée par une pression intraoculaire élevée, le durcissement du globe, l'atrophie du nerf optique et l'altération du champ visuel pouvant conduire à la cécité. Cette pathologie a été récemment décrite comme étant susceptible d'être déclenchée par un stress oxydatif. En effet, le stress oxydatif prend part aux phénomènes de neurotoxicité observés au cours du glaucome, mais est également responsable de remaniements au niveau du trabéculum à l'origine des troubles de la résorption de l'humeur aqueuse. Il a été ainsi démontré que l'augmentation de la pression intraoculaire et les altérations du champ visuel sont proportionnelles au degré de dommages oxydatifs retrouvés au niveau du trabéculum. Les conséquences du stress oxydatif sont donc doubles : altérations des cellules endothéliales du trabéculum et neurotoxicité vis-à-vis des cellules ganglionnaires ("Pathologies vasculaires oculaires", Constantin Poumaras, 2008). Aussi, le composé de l'invention, du fait de ses propriétés antioxydantes, est hautement adapté pour une utilisation pour le traitement et/ou la prévention du glaucome.
Quant à la cataracte, il s'agit d'une affection oculaire congénitale ou acquise qui consiste en une opacité partielle ou totale du cristallin ou de sa capsule. Elle s'accompagne d'une diminution de l'acuité visuelle pouvant aller jusqu'à la cécité. Actuellement, la thérapie la plus performante nécessite une intervention chirurgicale. Toutefois, diverses études ont récemment établi le rôle du stress oxydatif dans cette pathologie (Cécile Delcourt, Age et Nutrition, 2002). Aussi, le composé de l'invention est pertinent pour une utilisation dans le traitement et/ou la prévention de la cataracte.
L'ischémie/reperfusion est un phénomène d'hypoxie suivi d'une réoxygénation à l'échelon cellulaire. Il est admis que ce phénomène fait partie intégrante de processus physiopathologiques, comme l'infarctus du myocarde, l'accident vasculaire cérébral, l'arrêt cardiaque ou encore le choc septique. La restauration du flux sanguin est essentielle pour sauver les organes privés d'oxygène, mais il a été démontré que cette reperfusion induit par elle-même des dommages cellulaires importants. En effet, l'hypoxie et l'ischémie des tissus nerveux sont associées à une production importante de radicaux libres. Ces radicaux libres sont produits non seulement pendant la phase aiguë de l'ischémie proprement dite, mais également au cours de la phase de reperfusion. Diverses études ont établi que l'utilisation d'antioxydants enzymatiques et non enzymatiques devrait permettre, de limiter les lésions neurodégénératives observées au cours de l'ischémie (" Pathologies vasculaires oculaires", Constantin Poumaras, 2008). Aussi, le composé de l'invention est hautement adapté pour une utilisation dans le traitement et/ou la prévention de l'ischémie/reperfusion. Plus spécifiquement, son utilisation est adaptée pour le traitement des symptômes induits par une telle ischémie/reperfusion.
En outre, diverses études ont montré que lors d'une sécheresse oculaire, une inflammation et une oxydation des tissus sont observées. Il s'ensuit que les radicaux libres et l'inflammation sont impliqués dans la pathogénèse ou la propagation de la sécheresse oculaire (Augustin et al., Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol, 1995). Aussi, le composé de l'invention est adapté à une utilisation pour le traitement et/ou la prévention de la sécheresse oculaire. Le composé de l'invention peut également être utilisé pour préparer une composition pharmaceutique pour le traitement/ou la prévention d'une pathologie oculaire dans laquelle le stress oxydatif est impliqué.
Ainsi, l'invention concerne aussi une composition pharmaceutique pour une utilisation dans le traitement et/ou la prévention d'une pathologie oculaire choisie parmi la rétinite pigmentaire, la dégénérescence maculaire liée à l'âge (DMLA), le glaucome, la cataracte, l'ischémie/reperfusion, et la sécheresse oculaire, lesdites compositions comprenant un composé choisi parmi le Facteur H, ses fragments, ses variants et leurs mélanges, et un véhicule pharmaceutiquement acceptable.
Le Facteur H, ses fragments, ses variants et leurs mélanges peuvent être combinés à tout type de véhicule ou excipient pharmaceutiquement acceptable, et optionnellement à une matrice à diffusion prolongée, telle qu'un polymère biodégradable, pour former une composition pharmaceutique selon l'invention. Le terme "pharmaceutiquement acceptable" se réfère à des entités moléculaires et des compositions qui ne produisent pas de réaction inverse, allergique ou autre réaction non désirée lorsqu'elles sont administrées à un mammifère, particulièrement un humain. Un véhicule ou excipient pharmaceutiquement acceptable peut être solide, semi-solide ou liquide. La forme des compositions pharmaceutiques, leur voie d'administration, leur dosage et leur posologie dépendent naturellement de la sévérité de la pathologie oculaire, de son stade d'évolution, de l'âge, du sexe, du poids du sujet à traiter, etc.
La composition pharmaceutique selon l'invention peut se présenter sous toute forme administrable à un patient, et inclut notamment les formes liquides ou solides, typiquement sous forme de collyre, de gel, de solution buvable, mais également les suspensions, poudre lyophilisées, capsules et comprimés. On préfère les compositions formulées de manière à pouvoir être administrée localement, comme par exemple les collyres et les gels, ou par voie orale comme les solutés buvables, les comprimés, les ampoules. La composition pharmaceutique selon l'invention peut également se présenter sous une forme compatible avec une injection, i.e. une injection locale, une administration à travers la muqueuse, une inhalation, une administration orale et plus généralement toute formulation appropriée pour le but visé.
De manière préférée, la composition pharmaceutique selon l'invention se présente sous une forme compatible pour une administration oculaire, intra- oculaire, intra-vitréenne, sous-ténonienne, sous-rétinienne, intra-orbital, sous- conjonctivale, intraveineuse, intra-artérielle, intramusculaire, intrapéritonéale, topique, sous-cutanée, intra-nasale, orale ou parentérale.
La composition pharmaceutique selon l'invention comprend de 0,001 à
10% en poids d'un composé choisi parmi le facteur H, ses fragments, ses variants et leurs mélanges par rapport au poids total de la composition. Préférentiellement, la composition pharmaceutique selon l'invention contient de 0,1 à 5% d'un composé choisi parmi le facteur H, ses fragments, ses variants et leurs mélanges par rapport au poids total de la composition.
Lorsqu'elle est formulée pour une administration topique, c'est-à-dire une application sur la peau, les muqueuses et/ou les phanères, ladite composition pharmaceutique topique peut se présenter sous forme liquide, pâteuse ou solide, et plus particulièrement sous forme, de crème, de pommade, de poudre, de tampon imbibé, de solution, de gel, de spray, de mousse, de suspension, ou de lotion. Elle peut également se présenter sous forme de suspension de microsphères ou nanosphères ou de vésicules lipidiques ou polymériques permettant une libération contrôlée. Cette composition pharmaceutique pour application topique peut se présenter sous forme anhydre, sous forme aqueuse ou sous forme d'émulsion.
Dans une variante préférée de l'invention, la composition pharmaceutique pour application topique se présente sous forme de solution, de gel ou d'émulsion.
Lorsque la composition pharmaceutique selon l'invention est sous forme d'une émulsion, elle comprend au moins un agent tensioactif. Une émulsion comprend un mélange de deux liquides non miscibles dont l'un est dispersé dans l'autre sous forme de fines gouttelettes (micelles); la dispersion est stabilisée grâce à l'action d'agents tensioactifs qui modifient la structure et le rapport des forces au niveau de l'interface, et donc augmentent la stabilité de la dispersion en diminuant l'énergie de tension interfaciale. Les tensioactifs sont des composés amphiphiles qui possèdent une partie hydrophobe ayant une affinité pour l'huile et une partie hydrophile ayant une affinité pour l'eau créant ainsi un lien entre les deux phases. Les tensioactifs stabilisent donc les émulsions en s'adsorbant à l'interface et en formant des couches lamellaires de cristaux liquides. Le tensioactif peut être ionique (anionique, cationique ou amphotère), ou non-ionique.
La composition pharmaceutique de l'invention peut comprendre en outre tout additif usuellement utilisé dans le domaine pharmaceutique tel que des tensioactifs, des agents neutralisants de type bases ou acides usuels, minéraux ou organiques (à titre d'exemple, la triéthanolamine, la solution de soude 10%, le tampon acide citrique/sodium citrate, le tampon acide succinique/succinate de sodium), des antioxydants (type Butylhydroxyanisole), des charges, des électrolytes, des colorants, des parfums, des huiles essentielles, des acides gras essentiels, des sphingolipides, des agents apaisants et protecteurs de la peau tels que l'allantoïne, des agents propénétrants, ou un mélange de ceux- ci. Bien entendu, l'homme du métier veillera à choisir ce ou ces éventuels additifs, et leur quantité, de manière telle que les propriétés antioxydantes de la composition pharmaceutique selon l'invention ne soient pas, ou substantiellement pas, altérées.
Ces additifs peuvent être présents dans la composition pharmaceutique à raison de 0,0010% à 20% en poids par rapport au poids total de ladite composition.
Enfin, la composition pharmaceutique de l'invention comprend en outre un autre agent actif, tels que, par exemple, d'autres substances utilisées dans le traitement des pathologies oculaires. On peut citer par exemple les composés anti-inflammatoires stéroïdiens ou non stéroïdiens et les antibiotiques. Typiquement, cet autre agent actif peut être présent dans la composition pharmaceutique à raison de 0,0010% à 20% en poids par rapport au poids total de ladite composition.
Les exemples suivants sont donnés à titre illustratif seulement, et ne sauraient limiter la portée de l'invention.
EXEMPLE
Les inventeurs ont ici démontré le potentiel thérapeutique du Facteur H dans des modèles pertinents de pathologies dégénératives de la rétine. Pour cela, dans un travail préliminaire, ils ont mis au point des méthodes de purification du FH et contrôler sa pureté, son intégrité et son activité anti-C3 convertase.
Dans un second temps, les inventeurs ont testé l'innocuité du Facteur H vis-à-vis des cellules de la rétine in vitro et in vivo.
Enfin, ils ont étudié les effets du Facteur H sur la protection des cellules de la rétine in vitro et in vivo.
Cette étude a permis de mettre en évidence pour la première fois et de façon inattendue, un rôle antioxydant du FH dans la rétine.
1. Purification du FH
La purification du FH plasmatique humain est réalisé à partir d'un mélange entre du surngeant de cryoprécipité et une fraction non retenue sur colonne de DEAE-Séphadex. Ce produit est ensuite soumis à 2 étapes de chromatographie : une première étape de chromatographie d'affinité sur colonne d'Héparine-Sepharose FF. Le facteur H est élué par un tampon salin puis soumis à une seconde étape de chromatographie d'échange anionique sur colonne de Q-Sepharose FF. Après élution, le facteur H purifié est concentré, formulé et lyophilisé.
En raison du tampon de formulation utilisé, le FH ne peut être utilisé en l'état ; il doit être dessalé. Le FH est dessalé par chromatographie sur colonne NAP™-5 (GE Healthcare, 17-0853) ou PD10 (GE Healthcare, 17- 0851), suivant le volume de FH à dessaler en suivant les instructions du fournisseur. La pureté et l'intégrité du FH (2 μg par échantillon) sont analysées par électrophorèse sur gel de polyacrylamide 10% en présence ou absence de SDS et par Western blot. Le profil électrophorétique du FH dessalé sur NAP-5 ou PD-10 est identique à celui du FH en tampon de formulation. L'étape de dessalage réalisée dans les conditions décrites n'altère pas la molécule de FH. Après électrotransfert sur membrane de nitrocellulose, le FH est détecté par un anticorps monoclonal de souris anti-FH (Serotec).
Afin d'évaluer l'impact du dessalage et des conditions de conservation sur l'activité du FH, un test d'activité anti-convertase a été réalisé. Les résultats montrent que les échantillons ont tous une activité anti-convertase comparable.
Par conséquent, les inventeurs ont montré que le dessalage du FH réalisé selon les conditions opératoires décrites, n'altère en rien sa structure moléculaire ni son activité fonctionnelle.
Pour conserver le FH dessalé, il est préférable de le répartir en petites fractions et de le stocker dans un congélateur à -80°C. Avant utilisation, le FH sera décongelé rapidement au bain-marie à 37°C.
2. Analyse de l'innocuité du FH in vitro et in vivo sur les cellules de la rétine
L'épithélium pigmentaire de la rétine ou EPR dans la partie centrale de la rétine est considéré comme la première cible de la DMLA. Ainsi, les dommages ou la perte de fonction de l'EPR (phagocytose des segments externes des photorécepteurs, barrière hémato-rétinienne, filtration et apport de nutriments pour les PR, cycle des rétinoïdes) accompagnés d'un stress oxydatif ou inflammatoire induisent la mort des photorécepteurs. Les inventeurs ont étudié les effets du FH à la fois sur des cellules de l'EPR de la rétine humaine en culture et sur la rétine (plus précisément sur une lignée de cellules humaines de l'EPR immortalisées spontanément : ARPE-19), après injection intrapéritonéale chez la souris.
Dans un premier temps, les inventeurs ont testé différentes concentrations de FH dessalé (30, 100 et 300 nM) sur la survie de cellules de l'EPR humain (lignée ARPE-19) cultivées à confluence. Après 6 semaines de culture à confluence, les cellules de l'EPR possédant les caractéristiques morphologiques de l'EPR observées in vivo y compris des jonctions serrées, sont traitées deux fois au FH (jour zéro et au jour 3 de la culture, après le changement de milieu de culture) et le nombre de cellules est compté à la cellule de Mallasez, après coloration des cellules au bleu trypan.
Ces premières expériences en culture montrent que pour les concentrations de 30 à 300 nM, le FH n'altère en rien la survie des cellules de l'EPR.
Dans un second temps, les inventeurs ont injecté en intrapéritonéal le FH dessalé (900 μg total, soit environ deux fois plus que la concentration plasmatique) dans une souris saine âgée de 2 semaines et ceci à trois reprises (J15, J18 et J21), puis après sacrifice soit à la 4eme semaine, soit au troisième mois de vie de la souris, la structure de la rétine est analysée. L'observation au microscope de la rétine à partir de coupes d'historésine après coloration au bleu de toluidine ne montre aucune altération générale de la structure de la rétine. La quantification de l'épaisseur de chacune des deux couches synaptiques et des 3 couches neuronales ne montre pas de différence significative entre les souris injectées avec le FH et les souris injectées avec l'eau ou non injectées.
Ces résultats montrent l'innocuité d'injections intrapéritonéales répétées de FH à forte concentration.
En conclusion, les traitements répétés de fortes concentrations de FH de cultures de cellules de la rétine ou de souris n'altèrent pas la survie de ces cellules.
3. Analyse des effets du FH sur les différents types cellulaires de la rétine
Les théories sur l'étiologie des dégénérescences rétiniennes de type
DMLA, pour lesquelles on observe la mort des photorécepteurs et l'altération de la structure et/ou des fonctions et de la survie des cellules de l'EPR suggèrent fortement que le stress oxydatif est l'un des acteurs majeurs de la dégénérescence rétinienne. Ainsi, les inventeurs ont analysé les effets du FH sur des cultures de cellules de l'EPR confluentes, pour lesquelles les jonctions serrées sont formées, et qui vont être soumises à un stress oxydatif létal. Un tel stress oxydatif désorganise les jonctions serrées de ces cellules. Ces jonctions in vivo, participent à l'établissement de la sélectivité de la perméabilité transépithéliale de l'EPR, garant de la survie des photorécepteurs.
Dans un premier temps, les inventeurs ont analysé l'effet du FH (300 nM) sur la survie des cellules de l'EPR soumise à deux oxydants, le 4-HNE et le t-BHP à des doses létales. A la concentration de 50 μΜ, le 4-HNE induit une baisse de la survie cellulaire de 46 et 58% après 24 et 48 heures de culture. Un prétraitement de 300 nM de FH permet de diminuer de près de la moitié de la mort cellulaire induite par l'oxydant (27 et 32% de mort cellulaire après 24 et 48 heures), montrant un effet protecteur partiel du FH à un stress oxydatif fort.
En ce qui concerne la protection contre un stress létal de 300 μΜ de t- BHP, qui induit une diminution de 17 et 30 % la survie cellulaire après 24 et 48 heures de culture, un prétraitement de 300 nM de FH permet de protéger complètement les cellules de la mort cellulaire induite par l'oxydant, montrant un effet protecteur total et prolongé du FH à un stress oxydatif modéré.
A la connaissance des inventeurs, il s'agit des premiers essais montrant un rôle antioxydant du FH quelque soit le tissu ou le type de cellule étudiés. Le Facteur H apparaît alors comme particulièrement pertinent pour le développement de stratégies de traitement de dégénérescences rétiniennes dans lesquelles le stress oxydatif est un composant central.
Afin de comprendre par quels mécanismes le FH joue un rôle antioxydant, les inventeurs ont analysé ses effets protecteurs sur les composants cellulaires connus pour être des cibles du stress oxydatif. Ainsi, dans une deuxième étape, les inventeurs ont analysé l'effet du FH sur les jonctions serrées des cellules de l'EPR soumises au stress létal de t-BHP. En effet, les inventeurs avaient préalablement établi les effets de la sénescence prématurée induite par le stress oxydatif sur la déstabilisation des jonctions serrées de l'EPR. Les cellules de l'EPR confluentes non traitées possèdent des jonctions serrées visualisées par immunohistochimie à l'aide d'un anticorps anti- occludine. Le t-BHP induit rapidement dès 6 heures de culture une désorganisation de ces jonctions serrées. Par contre, un prétraitement de 300 nM de FH une heure avant l'addition de l'oxydant permet de sauvegarder une bonne organisation de ces jonctions serrées. Le traitement avec 300 nM de FH seul ne modifie pas l'organisation des jonctions serrées par rapport aux cellules de l'EPR non traitées.
La protection des jonctions serrées par le FH contre le stress oxydatif est également observée après 24 heures de culture, montrant un effet protecteur prolongé du FH.
Les inventeurs ont donc ainsi démontré que la résistance des cellules de l'EPR au stress oxydatif est en partie due à la production d'enzymes antioxydantes. Ils ont par la suite posé l'hypothèse selon laquelle le FH induit une réponse adaptative de l'EPR au stress oxydatif, en induisant une augmentation de l'expression d'enzymes impliquées dans la défense antioxydante. Ainsi, dans une troisième étape, les inventeurs ont tenté d'identifier les voies potentiellement impliquées dans la protection par le FH des cellules soumises au stress oxydatif. Ils ont ainsi mis en évidence une augmentation spécifique de l'expression de l'enzyme antioxydante catalase, suite au traitement par le FH en présence d'oxydant, alors que le traitement par l'oxydant seul diminue cette expression. L'analyse de deux autres enzymes antioxydantes, la SOD2 et la GPX, montre que leur expression n'est pas modifiée par le FH en présence d'oxydant.
En conclusion, ces résultats indiquent que le FH protège les cellules de l'EPR d'un stress oxydatif par la stimulation de la transcription d'enzymes de la voie de défense antioxydante. 4. Analyse des effets du FH sur la protection de la rétine contre la dégénérescence
Pour l'étude du rôle potentiel du FH dans la protection de la rétine contre les dégénérescences, les inventeurs ont mis en œuvre des expériences portant sur le modèle de la souris RdlO, modèle génétique de la rétinite pigmentaire autosomique récessive (mutation sur codon 560 CGC en TGC substituant une arginine en cystéine, Arg560Cys, du gène codant pour la sous unité β de la phosphodiesterase des photorécepteurs à bâtonnet).
Chez cette souris, la dégénérescence des bâtonnets débute au stade post- natal au centre de la rétine, puis en périphérie de la rétine, puis le nombre de photorécepteurs diminue progressivement.
Les inventeurs ont également utilisé une souris saine ou sauvage comme témoin pour leurs travaux. Ils ont ainsi analysé l'expression du FH dans la rétine neurale de souris C57BL/6J par RT-PCR. De manière surprenante, seule une très faible expression du transcrit du FH dans la rétine neurale de souris témoins saines a été mise en évidence.
Un tel résultat contraste avec la présence du facteur H aisément détectée, par immunohistochimie, dans la couche des cellules ganglionnaires, les interneurones, la couche des synapses. De plus, les inventeurs ont noté par RT- PCR de plus haut niveaux de transcrits du FH dans la rétine neurale de souris RdlO comparé au niveau observé chez la souris saine, et ceci a un même stade donné.
Ces résultats indiquent que la production du FH se ferait majoritairement à partir du complexe EPR/choroïde par rapport à la rétine neurale dans les conditions normales (souris WT ou saine).
Aussi, la rétine en voie de dégénérescence lutte contre cette dégénérescence en induisant une réponse adaptative, dont l'augmentation du FH est l'un des processus. Forts de cette observation, les inventeurs ont établi que la quantité de FH produit par la rétine en réaction à la dégénérescence n'est pas suffisante pour renverser ou arrêter le processus dégénératif. Aussi, un apport de FH exogène s'avère nécessaire pour induire une protection efficace de la rétine.
Pour corroborer ce résultat, les inventeurs ont injecté du FH dans la souris RdlO. Pour cela, les inventeurs ont établi différents protocoles d'injection intrapéritonéale de FH chez la souris RD10 et la souris C57BL/6J souche congénique de la souris RdlO, prise comme contrôle. Les souris ont d'abord subit une série d'injections intrapéritonéales de FH humain à la concentration double de celle du plasma de la souris, soit 900 μg/100 μΐ. Les injections ont été répétées trois fois avec une fréquence d'une fois tous les 3 jours. L'analyse de la présence de FH humain dans la rétine et la choroïde (richement vascularisée) a été réalisée par immunohistochimie chez la souris RdlO.
Les résultats sont les suivants: le FH humain est fortement détecté dans la choroïde et l'EPR de la souris RdlO injectée, par rapport à la souris RdlO n'ayant subi aucune injection. Aussi, ces résultats indiquent que le FH injecté de manière intrapéritonéale peut s'accumuler dans la choroïde via le passage des vaisseaux choroïdiens. Ceci est corroboré par le fait que tous les vaisseaux de la choroïde de la souris RdlO injectée présentent une forte immunoréactivité anti- FH. De plus, le FH diffuse dans la rétine neurale, car une forte présence du FH est détectée dans toute l'épaisseur de la rétine neurale et l'EPR des souris RdlO injectée par rapport aux souris RdlO non injectées.
Après avoir contrôlé la bonne diffusion du FH injecté dans la souris RdlO dans la choroïde, l'EPR et la rétine neurale, les inventeurs ont déterminé l'épaisseur de la couche des noyaux des photorécepteurs sur coupes de rétine colorées au bleu de toluidine.
La quantification sur toute l'épaisseur de la rétine (du pôle nasal au pôle temporal) de l'épaisseur de la couche des photorécepteurs par le dénombrement du nombre de leur noyau montre une protection modérée mais statistiquement significative des photorécepteurs chez la souris RdlO injectée par rapport à la souris non injectée. Aussi, l'effet protecteur du FH est plus fort en périphérie qu'au centre de la rétine. Aussi, les inventeurs ont ainsi mis en évidence le fait le Facteur H est hautement adapté pour une utilisation dans le traitement de pathologies oculaires dans lesquelles le stress oxydant joue un rôle.

Claims

Revendications
1. Composé choisi parmi le Facteur H, ses fragments, ses variants et leurs mélanges, pour son utilisation dans le traitement et/ou la prévention d'une pathologie oculaire dans laquelle le stress oxydatif est impliqué, par amélioration de la viabilité et l'intégrité des cellules rétiniennes.
2. Composé selon la revendication 1, caractérisé en ce que ladite pathologie oculaire ne comporte pas de composante inflammatoire.
3. Composé choisi parmi le Facteur H, ses fragments, ses variants et leurs mélanges, pour son utilisation dans l'amélioration de la viabilité et de l'intégrité de cellules rétiniennes soumises à un stress oxydatif.
4. Composé choisi parmi le Facteur H, ses fragments, ses variants et leurs mélanges, pour son utilisation dans la stimulation de la transcription d'enzymes de la voie de défense antioxydante, préférentiellement la transcription de la catalase.
5. Composé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que ledit Facteur H est un Facteur H humain.
6. Composé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que ledit Facteur H est un Facteur H humain natif.
7. Composé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que ledit Facteur H est la séquence peptidique SEQ ID N° 1.
8. Composé selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que ladite pathologie oculaire est choisie parmi la rétinite pigmentaire, la dégénérescence maculaire liée à l'âge (DMLA), le glaucome, la cataracte, l'ischémie/reperfusion, et la sécheresse oculaire.
9. Composition pharmaceutique pour une utilisation dans le traitement et/ou la prévention d'une pathologie oculaire dans laquelle le stress oxydatif est impliqué, ladite composition comprenant un composé choisi parmi le Facteur H, ses fragments, ses variants et leurs mélanges, et un véhicule pharmaceutiquement acceptable.
10. Composition pharmaceutique selon la revendication 9, caractérisée en ce que ladite pathologie oculaire est choisie parmi la rétinite pigmentaire, la dégénérescence maculaire liée à l'âge (DMLA), le glaucome, la cataracte, l'ischémie/reperfusion, et la sécheresse oculaire.
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