WO2013132061A1 - Di- und multifunktional amin-modifizierte oligo- und polysaccharidderivate als antiinfektive substanzen und deren verwendung - Google Patents

Di- und multifunktional amin-modifizierte oligo- und polysaccharidderivate als antiinfektive substanzen und deren verwendung Download PDF

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WO2013132061A1
WO2013132061A1 PCT/EP2013/054719 EP2013054719W WO2013132061A1 WO 2013132061 A1 WO2013132061 A1 WO 2013132061A1 EP 2013054719 W EP2013054719 W EP 2013054719W WO 2013132061 A1 WO2013132061 A1 WO 2013132061A1
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polysaccharide
substitution
oligosaccharide
oligo
hydroxyl groups
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PCT/EP2013/054719
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Thomas Heinze
Tim Liebert
Peter Miethe
Kerstin SCHLUFTER
Uta-Christina HIPLER
Cornelia WIEGAND
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Friedrich-Schiller-Universität Jena
Universitätsklinikum Jena
Fzmb Gmbh Forschungszentrum Für Medizintechnik Und Biotechnologie
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    • A01N43/653—1,2,4-Triazoles; Hydrogenated 1,2,4-triazoles

Definitions

  • the present invention relates to the use of an oligo- or polysaccharide (DP) value above 10) composed of a basic unit having hydroxyl groups which at least partially carry substituents of the di, tri or tetraamine functions without permanent charge on the primary Having positions as an antibacterial and antifungal agent in the form of solutions and emulsions, and articles coated with the basic unit-constituted oligo- or polysaccharide having hydroxyl groups which are at least partially amine-substituted.
  • DP polysaccharide
  • the invention relates to the use of derivatives of oligosaccharides and polysaccharides (DP> 10), in particular cellulose having di- and trifunctional amine substituents, it also being possible for amino substituents having more than three amino groups to be provided as antibacterial and antifungal agents.
  • oligosaccharides and polysaccharides DP> 10
  • cellulose having di- and trifunctional amine substituents it also being possible for amino substituents having more than three amino groups to be provided as antibacterial and antifungal agents.
  • amino substituents having more than three amino groups to be provided as antibacterial and antifungal agents.
  • These compounds can be used, for example, in cosmetic and pharmaceutical formulations as preservatives and as a biologically active compound in pharmaceutical preparations. They are suitable for biocidal finishing of surfaces, fabrics, and packaging materials for, for example, foodstuffs or of products used in medicine, biology, pharmacy.
  • biocidal substances are surfaces of any kind, especially those which are touched by persons, such as doorknobs, light switches, medical apparatus and furniture in hospitals and nursing homes, over which multidrug-resistant bacteria can be transmitted. They can be incorporated into wound cover and used as aggregates in the cosmetic and pharmaceutical industries, agriculture and the food and feed industry.
  • Amines and quaternary ammonium compounds are able to prevent or kill the growth of microorganisms such as bacteria and fungi.
  • low molecular weight quaternary ammonium salts are used as disinfectants or biocidal coatings (J. Controlled Release 50, 1998, 145).
  • ammonium-functionalized polymers are used. These can be prepared by graft copolymerization but have high production costs and are often toxic because they contain residues of the toxic monomers (Trends in Polymer Science 4, 1996, 364; A Chemistry and Applications of Antimicrobial Polymers: A State-of-the-Art Review El Refaie Kenawy, SD Worley, Roy Broughton Biomacromolecules, Vol. 8, No. 5, 2007 1359). Another problem of graft polymers is their difficult-to-control synthesis and often inadequate analytical characterization, which in practice leads to nonreproducibility of the structures and thus the properties of these polymers. This also applies to the graft polymers based on cellulose described in EP 1 918 306 A2 (H.
  • Chitosan is the most abundant cationic polysaccharide obtained naturally or by deacetylation from chitin Tashiro, Macromol, Mater, Eng, Eng, 286, 2001, 63, KC Gupta, M.N.VR Kumar, J.M.S.-Rev. Macromol. Chem., Chem Phys. C40, 2000, 273; Chitosan as Antimicrobial Agent: Applications and Mode of Action Entsar I. Rabea, Mohamed E.-T. Badawy, Christian V.
  • polysaccharide derivatives in particular cellulosic and starch compounds with quaternary ammonium functions, ie. H . synthesized with permanent cationic charge which have an antibacterial effect (DE 10200717 A1, WO 2003/057227, Heinze, T., Schmidtke, M., Möllmann, U .; Dahse, H.-M .; Härtl, A.).
  • the syntheses use the typical quaternary cationization reagents 2,3-epoxypropyltrimethylammonium chloride or 3-chloro-2-hydroxypropyltrimethylammonium chloride.
  • the object of the invention is therefore to provide compounds based on oligo- and polysaccharides for use as antibacterial and antifungal compounds without permanent cationic charge, which are controllable in terms of their bioactivity and which both in aqueous form as solutions or emulsions (nano- or microemulsion ) as well as a layer former for the production of anti-infective coatings can be used.
  • the compounds are said to have a high anti-infective effect in a broad spectrum, to allow effective control of antibiotic resistance in bacterial infections, to offer new possibilities for the treatment of mycotic infections, and to be well tolerated, biodegradable, non-toxic and easily producible.
  • oligopeptides or polysaccharides made up of basic units with hydroxyl groups which at least partially carry substituents. These substituents contain di-, tri-, or tetra-amine functions which, unlike ammonium salts, have no permanent charge.
  • FIG. 6 Influence of TAEA-cellulose-modified papers on the growth of
  • FIG. 7 Influence of TAEA-cellulose-coated modal fibers on Staphylococcus aureus and Klebsiella pneumoniae
  • the oligosaccharide or polysaccharide constructed from basic units according to the invention can be obtained by methods known per se (P. Berlin et al., WO 2006/089499 A1) by derivatization of the hydroxyl groups of an oligosaccharide or polysaccharide to give leaving groups to give a derivatized oligo- or polysaccharide,
  • the average degree of substitution is defined as the quotient of the number of amines having at least two amino functions accessible to nucleophilic substitution, which can be replaced by the substitution into the oligo- or Polysaccharide divided by the number of original hydroxyl groups of the oligosaccharide or polysaccharide multiplied by the number of original hydroxyl groups per oligo or polymer repeat unit.
  • the amino-substituted oligosaccharide or polysaccharide to be used according to the invention is a homo- or heteroglycan.
  • the homoglycan may be a glucan such as starch, glycogen, cellulose, lichenan and pullulan or inulin, chitin, pectins, alginic acid.
  • the heteroglucan may be agarose, hyaluronic acid or heparin in another embodiment of the invention.
  • the average degree of substitution may be 0.1 to 3.0, in particular 0.3 to 1.0.
  • the synthesis requires a preferred functionalization of primary hydroxyl groups.
  • the at least bi-functional amine with which the oligo- or polysaccharide to be used according to the invention is substituted has in particular the following formula
  • X represents a structurally defined arbitrary organic radical, in particular an aromatic, condensed aromatic, heterocyclic and / or heteroaromatic radical, an alkyl and / or alkenyl radical, which is optionally substituted.
  • This organic residue has a defined molecular weight and is not an oligomeric side chain as evidenced by a grafting reaction.
  • the amine having at least two amino functions accessible to nucleophilic substitution has the following formula
  • Formula I Schematic representation of the synthesis of aminocelluloses with antimicrobial activity (3) by A) homogeneous tosylation in the solvent DMAc / LiCl (product 2) and B) nucleophilic substitution of the tosyl function with di- and multifunctional amines and an average degree of substitution is> .
  • the average degree of substitution is defined as the quotient of the number of NH (X) NH 2 groups in the oligosaccharide or polysaccharide divided by the number of original hydroxyl groups of the oligosaccharide or polysaccharide.
  • amino-substituted oligosaccharide or polysaccharide to be used according to the invention may in particular have a cellulose skeleton having the following general formula:
  • hydroxyl groups of the cellulose are at least partially substituted by NH (X) NH 2 ,
  • X represents any organic radical, in particular an aromatic, condensed aromatic, heterocyclic and / or heteroaromatic radical, an alkyl and / or alkenyl radical which is optionally substituted, depending on an average degree of substitution, which is defined as the quotient of the number of NH (X) NH 2 - groups divided by the number of original hydroxyl groups of the oligosaccharide or polysaccharide and the value of _> 0.1.
  • X may have the following meaning:
  • Formula I Schematic representation of the synthesis of aminocelluloses with antimicrobial activity (3) by A) homogeneous tosylation in the solvent DMAc / LiCl (product 2) and B) nucleophilic substitution of the tosyl function with di- and multifunctional amines
  • the amino-substituted oligosaccharides or polysaccharides to be used according to the invention can be used in particular as antibacterial and antimycotic agents.
  • amino-substituted oligosaccharides or polysaccharides to be used according to the invention may advantageously be used as cosmetic agents, as preservatives in solutions and emulsions, for the biocidal finishing of surfaces of objects such as tissues, packaging or dressing materials and auxiliaries in the cosmetic or pharmaceutical industry, agriculture and foodstuffs Feed industry find use.
  • the present invention accordingly also relates to articles which are at least partially coated or impregnated with an amino-substituted oligosaccharide or polysaccharide to be used according to the invention.
  • amino-substituted oligosaccharides or polysaccharides to be used according to the invention can be prepared in a manner known per se as described in WO 2006/089499 A.
  • An advantage of the compounds to be used according to the invention is that the biological activity and the physical properties can be selectively adjusted by the choice of the amine (modular system). This is possible for known polysaccharides such as chitosan and polysaccharide-based quaternary ammonium compounds, if at all, only by follow-up reactions. Furthermore, the compounds to be used according to the invention do not carry any permanent charges, which minimizes the interaction with anionic surfactants.
  • the invention accordingly relates to the use of polysaccharides containing di-, tri- and tetrafunctional amine functions over a deoxy structure with an average degree of substitution (DS) of from 0.1 to 3.0, in particular from 0.3 to 1.0, as antiinfective Agent or for the treatment of infectious diseases.
  • DS degree of substitution
  • the compounds to be used according to the invention without permanent cationic charge or bactericidal side chain have a high biological content Activity and surprisingly inhibit the growth of pathogenic bacteria, such.
  • the Gram-positive bacteria Staphylococcus aureus, the Gram-negative bacteria Klebsiella pneumoniae and yeasts such as Candida albicans, Trichophyton rubrum, Malassezia pachydermatis with IC 50 values of up to 5 mg / L have a cytotoxic effect against endogenous cells such as HaCaT keratinocytes is not observed. Because of these properties, the compounds can be used to prepare medicaments for the prevention and control of bacterial and mycotic infections. They can be used alone or in combination with known therapeutics or with physiologically compatible excipients and carriers.
  • the antiinfective compounds may also be formulated as a solution or suspension in the form of a nanoparticle or microparticle suspension in pharmaceutically acceptable media for topical or parenteral administration, via intravenous, subcutaneous or intramuscular injections, for intranasal administration, and as a tablet, capsule or suppository become.
  • the compounds can be used in dosages of 0.1-1000 mg / kg body weight.
  • oligosaccharides and polysaccharides preferably glucans such as starch, lichenan, pullulan and particularly preferably cellulose and chemically or enzymatically or by other processes (high-energy radiation) partially hydrolyzed or degraded polysaccharides, in particular cellulose, are used.
  • the extent of the reaction at the hydroxyl groups of the polysaccharides is described by the average degree of substitution (DS). This average value indicates, without any differentiation, the number of functionalized hydroxyl groups and is accordingly in the range of 0 to 3 in the case of the stated polysaccharides.
  • the DS on di- and tri- and tetrafunctional amine groups of the anti-infective polysaccharide derivatives of the invention lies between 0, 1 and 3.0, preferably between 0.3 and 1.0.
  • polysaccharide derivatives to be used according to the invention are known or can be obtained in a manner known per se, in particular by introducing a leaving group such as halides or sulfonates, in particular tosylate into the oligosaccharide and polysaccharide skeleton and nucleophilic substitution of the reactive compounds with amines according to the general formula (I) (polysaccharide: cellulose, only one substituent shown).
  • a leaving group such as halides or sulfonates
  • the preferred intermediate compound used is the p-toluenesulfonic acid ester of the oligosaccharides and polysaccharides, for example cellulose (tosyl cellulose, formula IA structure 2).
  • the reagent p-toluenesulfonyl chloride can be used (formula IA).
  • Formula I Schematic representation of the synthesis of aminocelluloses with antimicrobial action (3) by A) homogeneous tosylation in the solution DMAc / LiCl (product 2) and B) nucleophilic substitution of the tosyl function with di- and multifunctional amines
  • the tosylation for the preparation of the activated oligosaccharide and polysaccharide derivative can be carried out in a manner known per se (WO 2006/089499 A), the DS value of tosyl groups in the range from 0.1 to 3.0, preferably from 0.3 to 1, 0 is realized.
  • the oligosaccharide and polysaccharide, in particular cellulose is reacted either heterogeneously or in homogeneous solution in the dipolar aprotic solvents N, N-dimethylacetamide in the presence of lithium chloride as reaction media.
  • the reaction time for the reaction with the reagent is between 1 and 48 h, preferably from 3 to 24 h, and the temperature between -10 and 40 ° C, preferably at 25 ° C.
  • the average degree of substitution of the products can be adjusted and varied within wide limits.
  • multistage reactions are also suitable for obtaining the oligosaccharide and polysaccharide derivatives.
  • the work-up of the reaction products is carried out by conventional methods of polymer chemistry, wherein the low molecular weight by-products and reagent residues are separated by washing processes or reprecipitation.
  • sulfonic acid esters such as the mesylates and triflates can be prepared as reactive intermediates.
  • deoxyhalogen derivatives of oligosaccharides and polysaccharides and derivatives of oligosaccharides and polysaccharides having a leaving group in the sense of the nucleophilic substitution reaction are also suitable as reactive intermediates.
  • the reactive intermediates can be modified on the remaining hydroxyl groups in a variety of ways.
  • anionic functions can be introduced, for example, by sulfation, cationic functions, for example, by reaction with 2,3-epoxypropyltrimethylammonium chloride or 3-chloro-2-hydroxypropyltrimethylammonium chloride or neutral substituents by reaction with phenyl isocyanate.
  • the intermediates can be additionally modified with all known from organic chemistry reactions of hydroxyl groups.
  • the reactive intermediates are converted into the deoxyamino compound by reaction with di- and multifunctional amines (aminopolysaccharides, eg. Aminocellulose).
  • the average degree of substitution (DS) of the amine functions is determined by the DS of the tosylated compound and the amount of amino groups by the number of amino functions in the corresponding di- and multifunctional amine, wherein the number of amino functions at least twice the DS.
  • the structure of the di- and multifunctional amines can further modify the structure of the aminopolysaccharides; the di- and multifunctional amines may contain oxygen, sulfur and other heteroatoms.
  • the average degrees of substitution are determined by elemental analysis and calculated on the basis of the nitrogen value.
  • NMR spectra are suitable for determining the DS values.
  • the aminocellulose solution is introduced into a spray device and the solution is sprayed uniformly onto the surface. Depending on the nature of the surface, this is then washed before drying with distilled water and methanol.
  • the biological activity of the compounds can be demonstrated by examining the antimicrobial activity according to the standard JIS L 1902: 2002.
  • a neutral carrier matrix polyyester
  • the investigations according to JIS L 1902: 2002 show a strong antibacterial activity against Staphylococcus aureus and Klebsiella pneumoniae (FIG. 1).
  • Staphylococcus aureus by more than 7-log steps is achieved and completely inhibited the growth of the germ.
  • growth can be reduced by 4-log levels and germ growth reduced to 40% of the control.
  • EDA-cellulose ethylenediamine cellulose
  • TAEA-cellulose tris (2-aminoethyl) -amino-cellulose
  • the ratio of LC 5 o / IC should be 5 o> 1.
  • the determined in vitro effective concentrations can not yet be understood without further investigation as an application recommendation in vivo.
  • Figure 1 Determination of the antibacterial activity of the samples EDA-cellulose (DS 0.87, RS005) and TAEA-cellulose (DS 0.85, RS006) according to JIS L 1902: 2002.
  • FIG. 2 Growth curves of Staphylococcus aureus with increasing concentrations of EDA-cellulose (DS 0.87) and the dose-response curve for determining the IC 50 value.
  • Figure 3 Growth curves of Klebsiella pneumoniae with increasing concentrations of EDA-cellulose (DS 0.87) and the dose-response curve for determining the IC 50 value.
  • FIG. 4 Growth curves of Staphylococcus aureus with increasing concentrations of TAEA cellulose (DS 0.85) and the dose-response curve for determining the IC 50 value.
  • the anti-infective compounds can be applied for use as coatings of aqueous solutions or suspension on solids of different composition such as glass, synthetic and natural polymers and their derivatives, wood, paper, cardboard, metal, metal oxides or ceramics in various forms of surfaces, moldings or fibers ,
  • the coating can be carried out directly or after known pretreatments, for example pretreatment with plasma or ozone.
  • commercial paper can be coated with TAEA cellulose (DS 0.85) by autoclaving the untreated paper and then spraying the TAEA cellulose under sterile conditions.
  • the papers thus prepared show a strong antimicrobial efficacy when tested according to JIS L 1902: 2002.
  • Bacteria in the nutrient medium are applied to the samples to be examined and incubated for 24 h.
  • the test for antibacterial activity shows an enormous growth inhibition in both Staphylococcus aureus and Klebsiella pneumoniae, depending on the concentration of the coating solution used (FIG. 6).
  • TAEA cellulose solution an inhibition of approximately 50% in Staphylococcus aureus and approximately 20% in Klebsiella pneumoniae can already be achieved.
  • the inhibition is already about 80% in Staphylococcus aureus and about 50% in Klebsiella pneumoniae.
  • a 0.5% TAEA-cellulose solution bacterial growth can no longer be detected.
  • FIG. 6 Influence of TAEA-cellulose-modified papers on the growth of Klebsiella pneumoniae.
  • CM D fibers can be treated with 0.05% TAEA-cellulose solution. After treating the fibers, it is washed with distilled water and methanol. It is achieved for Klebsiella pneumoniae an inhibition of 40%. For Staphylococcus aureus growth on the fibers is inhibited.
  • Antimicrobial materials are further accessible by applying nanofiber layer containing aminocelluloses on supports such as polypropylene nonwovens.
  • nanofiber layer containing aminocelluloses on supports such as polypropylene nonwovens.
  • aminocellulose for example TAEA cellulose
  • polyvinyl alcohol (15% or 18%) are prepared in water and spun by means of an electrospinning machine (Nanospider) via a hedgehog roller.
  • the surfaces provided with aminocellulose-containing nanofibers show a good growth inhibition against Staphylococcus aureus.
  • FIG. 7 Influence of TAEA-cellulose-coated modal fibers on Staphylococcus aureus and Klebsiella pneumoniae.
  • TAEA tris- (2-aminoethyl) -amine
  • glass When glass is used as the substrate, it is placed in sulfuric acid / hydrogen peroxide (2: 1) for 3 hours prior to coating to activate the surface. The glasses are then rinsed thoroughly with distilled water and dried. The carriers to be coated are added to the aminocellulose solution for 15 minutes and shaken. The coating solution is then removed and washed four times with distilled water and four times with methanol.
  • the aminocellulose solution is added to a DC spray finger or a comparable bare spray and spray the solution evenly on the surface. Depending on the nature of the surface, this is then washed before drying with distilled water and methanol.
  • test organisms Staphylococcus aureus ATCC 6538 and Klebsiella pneumoniae ATCC 4352 are grown on Columbia agar plates (bioMerieux, Nürtingen) and then stored at 4 ° C.
  • 20 ml of Caso broth are inoculated in 50 ml glass culture flasks with Kapsenberger caps (VWR International GmbH, Darmstadt) with the appropriate bacterium (amount of material approx. 1 small inoculation loop).
  • the cultures are cultivated for 24 h at 37 ° C. in a shaking water bath (GFL 1083, Deutschen f. Labortechnik, Burgwedel).
  • test pieces are extracted in saline (0.9%, with Tween20). Dilutions are made from the extracts, plated and incubated for 24 hours. Thereafter, the counting of the colonies on the plates and the calculation of the cfu (colony forming units) according to the JIS L 1902: 2002 compared to the initial value:
  • the growth curves of the microorganisms are measured by means of microplate laser nephelometry (MLN).
  • MN microplate laser nephelometry
  • 100 ⁇ _ of the substances to be tested are mixed in 96-well plates with 100 ⁇ inoculum per well. The plates are sealed with a transparent, gas-permeable foil.
  • the turbidity is measured using the NEPHELOstar Galaxy (BMG Labtech, Germany). The experiments are carried out at 37 ° C with shaking for 24 h, the measurements are made every hour. Subsequently, the antibacterial activity (in%) of the substance to be tested is determined in comparison to an untreated control, and the IC 50 (half-maximal inhibitory concentration) is calculated.
  • the individual measurements are made in triplicate. The indicated average values therefore the averaged values of 3 measurements are ⁇ standard error (Microsoft ® Excel SP2). To determine the statistical significance of an unpaired t-test is performed (Microsoft ® Excel SP2). The results are considered p ⁇ 0.05 as statistically significant and are given as follows: * p ⁇ 0.05, ** p ⁇ 0.01 and *** p ⁇ 0.001. Dose-response curves and IC 50 are calculated using Origin 7.0SRO (OriginLab Corporation).
  • Candida albicans ATCC 10231 and Malassezia pachydermatis ATCC 6172 were obtained from the DSMZ (German Collection of Microorganisms and Cell Cultures). Yeast storage was by cryopreservation ⁇ Microbank TM, Pro-Lab Diagnostics, Richmond Hill ON, Canada). For the experiments Candida albicans and Malassezia pachydermatis were first grown on Sabouraud dextrose agar plates (bioMerieux, Nürtingen). For this purpose, using a pair of tweezers, a bead was removed from the microbank system under sterile conditions and carefully rolled out on the agar.
  • Microtiter plate laser nephelometry is an optical analysis method that can be used to quantify the concentration of particles in liquids.
  • the suspended particles in the solution scatter the incident light laterally to the light beam (Tynd all effect).
  • This method allows the measurement of microbial growth curves by determining the turbidity of the solution. Due to the high sensitivity of the technique it is possible to detect even low concentrations of scattering particles as it is in the lag phase and the beginning of the log phase of the falls.
  • the working cultures of the test germs incubated overnight at 37 ° C. were used. A cell density of about 5 ⁇ 10 3 cfu / mL was set by dilution in Sabouraud glucose broth.

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Abstract

Verwendung eines aus einer Grundeineinheit aufgebauten Oligo- oder Polysaccharids (degree of polymerization (DP)-Werte über 10) mit Hydroxylgruppen, die zumindest teilweise Substituenten tragen die Di-, Tri-, oder Tetraaminfunktionen ohne permanente Ladung besitzen, als antibakterielles und antimykotisches Mittel, wobei das aus einer Grundeinheit aufgebaute Oligo- oder Polysaccharid erhältlich ist durch Derivatisierung der Hydroxylgruppen eines Oligo- oder Polysaccharides zu Abgangsgruppen, unter Erhalt eines derivatisierten Oligo- oder Polysaccharids, gefolgt von einer Umsetzung des derivatisierten Oligo- oder Polysaccharids mit einem Amin, das mindestens zwei zu einer nucleophilen Substitution befähigten Aminofunktionen aufweist, unter nucleophiler Substitution zu dem aminosubstituierten Oligo- oder Polysaccharid, wobei die Hydroxylgruppen des Oligo- oder Polysaccharides zumindest teilweise durch das Amin, das mindestens zwei zu einer nucleophilen Substitution befähigten Aminofunktionen aufweist, substituiert sind mit einem durchschnittlichen Substitutionsgrad, der einen Wert von >. 0,1 aufweist, wobei der durchschnittliche Substitutionsgrad definiert ist als der Quotient der Anzahl der Amine mit mindestens zwei einer nucleophilen Substitution zugänglichen Aminofunktionen, die durch die Substitution in das Oligo- oder Polysaccharid eingeführt worden sind, dividiert durch die Anzahl der ursprünglichen Hydroxylgruppen des Oligo- oder Polysacharides, multipliziert mit der Zahl der ursprünglichen Hydroxylgruppen pro Oligo- und Polymer-Grundeinheit.

Description

Di- und multifunktional Amin-modifizierte Oligo- und Polysaccharidderivate als antiinfektive Substanzen und deren Verwendung
Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung eines aus einer Grundeineinheit aufgebauten Oligo- oder Polysaccharids (degree of polymerization (DP)-Werte über 10) mit Hydroxylgruppen, die zumindest teilweise Substituenten tragen die Di-, Tri-, oder Tetraaminfunktionen ohne permanente Ladung an den primären Positionen besitzen, als antibakterielles und antimykotisches Mittel in Form von Lösungen und Emulsionen sowie Gegenstände, die mit dem aus einer Grundeineinheit aufgebauten Oligo- oder Polysaccharids mit Hydroxylgruppen, die zumindest teilweise aminsubstituiert sind, beschichtet sind .
Die Erfindung betrifft die Verwendung von Derivaten von Oligo- und Polysaccha- riden (DP > 10) insbesondere Cellulose mit di- und trifunktionalen Aminsubstituenten, wobei auch Aminosubstituenten mit mehr als drei Amino- gruppen vorgesehen sein können, als antibakterielle und antimykotische Mittel. Diese Verbindungen können beispielsweise in kosmetischen und pharmazeutischen Formulierungen als Konservierungsstoffe und als biologisch aktive Verbin- dung in Arzneimittelzubereitungen eingesetzt werden. Sie sind geeignet zur bioziden Ausrüstung von Oberflächen, von Geweben, und von Verpackungsmaterialien für beispielsweise Lebensmittel oder von Produkten, die in der Medizin, Biologie, Pharmazie Verwendung finden. Ein weiteres Einsatzgebiet der bioziden Substanzen sind Oberflächen jeder Art, insbesondere solchen, die von Personen berührt werden, wie Türklinken, Lichtschalter, medizinische Apparate und Mobiliar in Krankenhäusern und Pflegeheimen, worüber multiresistente Bakterien übertragen werden können. Sie können in Wundabdeckung eingebracht werden und als Zuschlagstoffe in der kosmetischen und pharmazeutischen Industrie, der Landwirtschaft und der Lebensmittel- und Futtermittelindustrie eingesetzt wer- den .
Die Infektionen mit mikrobiellen Krankheitserregern stellen global ein zunehmendes Problem dar, da viele Keime durch Mutationen resistent gegen konventionelle Behandlungsmethoden sind (E. Klein, D. L. Smith, R. Laxminarayan, Emerging Infectious Diseases 13, 2007, 1840). Alternative Wirkstoffe mit neuen Wirkmechanismen zur Bekämpfung bakterieller Infektionen sind dringend notwendig, um der Antibiotikaresistenz entgegenzuwirken und um Unverträglichkeiten gegenüber vorhandenen Wirkstoffen zu umgehen. Nicht nur die Entwicklung von neuen Pharmaka ist von Interesse sondern auch die Bereitstellung antiinfektiver Beschichtungen.
Amine und quartäre Ammoniumverbindungen sind in der Lage, das Wachstum von Mikroorganismen wie Bakterien und Pilzen zu unterbinden bzw. diese abzutöten. So werden niedermolekulare quartäre Ammoniumsalze als Desinfektionsmittel oder biozide Beschichtungen eingesetzt (J. Controlled Release 50, 1998, 145). Ein typisches Problem der niedermolekularen Verbindungen, dazu zählen auch die in WO 2007/028012 A2 (M .T. Migawa et al .) beschriebenen Aminoglycoside (DP < 5), ist eine unzureichende Bioverfügbarkeit, beispielsweise hervorgerufen durch unkontrollierbare Transport- und Abbauvorgänge. Darüber hinaus besteht die Gefahr für den Anwender, dass derartige niedermolekulare oder oligomere biozide Verbindungen durch die Haut aufgenommen werden können. Daher werden ammoniumfunktionalisierte Polymere eingesetzt. Diese lassen sich durch Graftcopolymerisation herstellen, haben jedoch hohe Produktionskosten und sind häufig toxisch, da Reste der toxischen Monomere enthalten sind (Trends in Polymer Science 4, 1996, 364; The Chemistry and Applications of Antimicrobial Polymers: A State-of-the-Art Review El-Refaie Kenawy, S. D. Worley, Roy Broughton Biomacromolecules, Vol. 8, No. 5, 2007 1359 ). Ein weiteres Problem von Graft-Polymeren ist deren schwer zu kontrollierende Synthese und eine oft unzureichende analytische Charakterisierung, was praktisch zu einer Nichtreproduzierbarkeit der Strukturen und damit der Eigenschaften dieser Poly- mere führt. Dies gilt auch für die in EP 1 918 306 A2 (H . Xiao et al .) beschriebenen Graft-Polymere auf der Basis von Cellulose mit z. B. Polyhexamethylenguanidinhydro-Chlorid-Seitengruppen. Darüber hinaus kann es zu unerwünschten und gefährlichen Akkumulationen der Polymere bzw. der durch den Abbau des Grundgerüstes freigesetzten Seitenketten im Organismus kommen, da diese nicht biologisch abbaubar sind . Weiterhin sind Schockreaktionen möglich, da keine Einstellung der Molmassenverteilung gelingt.
Diese Probleme können durch Anwendung von natürlich vorkommenden aminogruppenhaltigen Polymeren oder Polysacchariden und deren Derivaten prinzipiell umgangen werden. Chitosan wird als natürliches oder durch Deacetylierung aus Chitin gewonnenes kationisches Polysaccharid am häufigsten beschrieben und als fungizides und antimikrobielles Mittel in der Kosmetik eingesetzt (T. Tashiro, Macromol . Mater. Eng . 286, 2001, 63, K. C. Gupta, M . N .V. R. Kumar, J. M .S.-Rev. Macromol . Chem. Phys. C40, 2000, 273; Chitosan as Antimicrobial Agent : Applications and Mode of Action Entsar I. Rabea, Mohamed E.-T. Badawy, Christian V. Stevens, Guy Smagghe, Walter Steurbaut Biomacromolecules , 2003, 4, 1457), für die Herstellung von Wundverbänden genutzt (Kulicke et al . , WO 2006/034688 AI) oder in poröse, anorganische, anti- mikrobielle Oxidschichten eingebettet (H . Böttcher et al . DE 10 2004 014483 AI) . Als nachteilig an diesem Polysaccharid treten Verunreinigungen mit anderen bio- genen Substanzen, der hohe Preis aufgrund der aufwendigen Isolierungs- und Reinigungsmethoden und die naturgegebene Struktur, da Ammoniumgruppen ausschließlich am Polymerrückgrat in Position 2 lokalisiert sind, in Erscheinung . Darüber hinaus ist deren Verteilung nicht steuerbar und der Gehalt ist auf einen durchschnittlichen Substitutionsgrad (DS) von maximal 1 beschränkt. Partiell kann eine strukturelle Modifikation durch Umsetzung der Aminfunktion des Chitosans mit hydrophoben Aldehyden erzielt werden (T. C. Le et al . WO 2006/092057 AI) . Die oben beschriebenen strukturellen Einschränkungen bleiben dabei jedoch bestehen .
Daher wurden Polysaccharidderivate insbesondere Cellulose- und Stärkeverbin- düngen mit quartären Ammoniumfunktionen, d . h . mit permanenter kationischer Ladung synthetisiert, die antibakteriell wirken (DE 10200717 AI , WO 2003/057227, Heinze, T. , Schmidtke, M . , Möllmann, U . ; Dahse, H .-M . ; Härtl, A. ). Für die Synthesen kommen die typischen quartären Kationisierungsreagen- zien 2,3-Epoxypropyltrimethylammoniumchlorid oder 3-Chloro-2- hydroxypropyltrimethyl-ammoniumchlorid zum Einsatz. Produkte mit unterschiedlichem durchschnittlichen Substitutionsgrad (DS) von Hydroxypropyltrimethylammoniumchlorid-Gruppen im Polysaccharid sind bekannt. Abgesehen vom DS ist die Struktur nicht variierbar. Im Falle der Cellulose ist die Einführung von quartären Ammonium-Funktionen über eine Folgefunktio- nalisierung von Carboxymethylcellulose möglich, wie in US 5 981 737 A (M . Manuszak-Guerrini e.al . ) und EP 0 170 053 A2 (H . Namikoshi et al . ) beschrieben . Ein Nachteil dieser Verbindungen ist es, dass aufgrund des permanenten kationischen Charakters eine Schichtbildung aus Wasser praktisch unmöglich ist und naturgemäß keine stabilen Schichten in Gegenwart von Wasser vorliegen . Ein weiterer Nachteil ist die Wechselwirkung der permanent kationisch geladenen Polymere mit negativ geladenen Tensiden wie sie in Kosmetika heute standardmäßig eingesetzt werden. Diese Verbindungen führen daher zur Destabilisierung der Suspensionen bis hin zur möglichen Phasenseparation und Flockung .
Es wird allgemein davon ausgegangen, dass die biologische Aktivität der be- schriebenen polymeren Stoffe aus dem Vorhandensein der quartären Ammoniumfunktionen resultiert, wobei andererseits bekannt ist, dass bei typischen Verbindungen mit kationischen Tetraalkylstickstoffgruppen wie Polyquaternium 10 nachweislich keine Bioaktivität vorliegt (W. A. Daly, M . M. Guerrini, D. Culberson, J. Macossay, in : Science and Technology of Polymers and Advanced Materials, Plenum Press 1998, 493). Für oberflächenmodifizierte Cellulose, die Aminocarbamat-Gruppen trägt, konnte dagegen ein mikrobiostatisches Verhalten gefunden werden (T. Laxen et al ., WO 2007/135245 AI). Es lässt sich aus den vorliegenden Literaturergebnissen keineswegs schlussfolgern, ob und welche Strukturen tatsächlich biologisch wirksam sind .
Aufgabe der Erfindung ist es daher, Verbindungen auf der Basis von Oligo- und Polysacchariden zur Verwendung als antibakterielle und antimykotische Verbindungen ohne permanente kationische Ladung bereitzustellen, die hinsichtlich ihrer Bioaktivität steuerbar sind und die sowohl in wässriger Form als Lösungen oder Emulsionen (Nano- oder Mikroemulsion) als auch als Schichtbildner zur Her- Stellung antiinfektiver Beschichtungen verwendet werden können. Die Verbindungen sollen eine hohe antiinfektive Wirkung in einem breiten Spektrum besitzen, eine effektive Bekämpfung von Antibiotikaresistenz bei bakteriellen Infektionen gestatten, neue Möglichkeiten zur Therapie von mykotischen Infektionen bieten, sowie gut verträglich, biologisch abbaubar, nicht toxisch und in einfacher Art herstellbar sein.
Die Aufgabe wurde gelöst durch die Verwendung von aus Grundeineinheiten aufgebauten Oligo- oder Polysacchariden (DP > 10) mit Hydroxylgruppen, die zumindest teilweise Substituenten tragen. Diese Substituenten enthalten Di-, Tri-, oder Tetraaminfunktionen, welche im Gegensatz zu Ammoniumsalzen keine permanente Ladung besitzen.
Figur 1 : Bestimmung der antibakteriellen Aktivität der Proben EDA-Cellulose (DS
0,87; RS005) und TAEA-Cellulose (DS 0,85; RS006) entsprechend dem JIS L 1902 : 2002. Figur 2 : Wachstumskurven von Staphylococcus aureus unter steigenden Konzentrationen von EDA-Cellulose (DS 0,87)und die Dosis-Wirkungs- Kurve zur Bestimmung des IC50-Wertes.
Figur 3 : Wachstumskurven von Klebsiella pneumoniae unter steigenden
Konzentrationen von EDA-Cellulose (DS 0,87) und die Dosis-Wirkungs-
Kurve zur Bestimmung des IC50-Wertes.
Figur 4: Wachstumskurven von Staphylococcus aureus unter steigenden
Konzentrationen von TAEA-Cellulose (DS 0,85) und die Dosis-Wirkungs- Kurve zur Bestimmung des IC50-Wertes.
Figur 5 : Wachstumskurven von Klebsiella pneumoniae unter steigenden
Konzentrationen von TAEA-Cellulose (DS 0,85) und die Dosis-Wirkungs- Kurve zur Bestimmung des IC50-Wertes.
Figur 6: Einfluss TAEA-Cellulose-modifizierter Papiere auf das Wachstum von
Klebsiella pneumoniae.
Figur 7 : Einfluss TAEA-Cellulose-beschichteter Modalfasern auf Staphylococcus aureus und Klebsiella pneumoniae
Das erfindungsgemäß zu verwendende aus Grundeineinheiten aufgebaute Oligo- oder Polysaccharid ist erhältlich durch in an sich bekannter Art und Weise (P. Berlin et al., WO 2006/089499 AI) mittels Derivatisierung der Hydroxylgruppen eines Oligo- oder Polysaccharides zu Abgangsgruppen, unter Erhalt eines derivatisierten Oligo- oder Polysaccharids,
gefolgt von einer Umsetzung des derivatisierten Oligo- oder Polysaccharids mit einem Amin, das mindestens zwei zu einer nucleophilen Substitution befähigten Aminofunktionen aufweist, unter nucleophiler Substitution zu dem aminosubstituierten Oligo- oder Polysaccharid, wobei die Hydroxylgruppen des Oligo- oder Polysaccharides zumindest teilweise durch das Amin, das mindestens zwei einer nucleophilen Substitution zugänglichen Aminofunktionen aufweist, mit einem durchschnittlichen Substitutionsgrad substituiert sind, der einen Wert von >. 0,1 aufweist,
wobei der durchschnittliche Substitutionsgrad definiert ist als der Quotient der Anzahl der Amine mit mindestens zwei einer nucleophilen Substitution zugänglichen Aminofunktionen, die durch die Substitution in das Oligo- oder Polysaccharid eingeführt worden sind, dividiert durch die Anzahl der ursprünglichen Hydroxylgruppen des Oligo- oder Polysacharides, multipliziert mit der Zahl der ursprünglichen Hydroxylgruppen pro Oligo- oder Polymer- Grundeinheit.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist das erfindungsgemäß zu verwendende aminosubstituierte Oligo- oder Polysaccharid ein Homo- oder Heteroglykan. Insbesondere kann das Homoglykan ein Glucan, wie Stärke, Glykogen, Cellulose, Lichenan und Pullulan oder Inulin, Chitin, Pektine, Alginsäure sein. Das Heteroglucan kann in einer weiteren Ausführungsform der Erfindung Agarose, Hyaluronsäure oder Heparin sein.
Im erfindungsgemäß zu verwendenden Oligo- oder Polysaccharid kann der durchschittliche Substitutionsgrad 0,1 bis 3,0, insbesondere 0,3 bis 1,0 betragen. Die Synthese bedingt eine bevorzugte Funktionalisierung primärer Hydroxylgruppen. Das mindestens bi-funktionale Amin, mit dem das erfindungsgemäß zu verwendende Oligo- oder Polysaccharid substituiert wird, weist insbesondere die folgende Formel auf
-NH(X)NH2.
Darin symbolisiert X einen strukturell definierten beliebigen organischen Rest, insbesondere einen aromatischen, kondensierten aromatischen, heterozyclischen und/oder heteroaromatischen Rest, einen Alkyl- und/oder Alkenylrest, der gegebenfalls auch substituiert ist. Dieser organische Rest hat eine definierte Molmasse und ist keine Oligomerseitenkette, wie sie aus einer Graftingreaktion hervorgeht.
Das Amin, das mindestens zwei einer nucleophilen Substitution zugänglichen Aminofunktionen aufweist, besitzt insbesondere die folgende Formel
-NH(X)NH2
worin X
Figure imgf000009_0001
Figure imgf000009_0002
10 y = 0 - 10
Formel I : Schematische Darstellung der Synthese von Aminocellulosen mit antimikrobieller Wirkung (3) durch A) homogene Tosylierung im Lösungsmittel DMAc/LiCI (Produkt 2) und B) nukleophile Substitution der Tosylfunktion mit di- und multifunktionalen Aminen ist und ein durchschnittlicher Substitutionsgrad den Wert von >. 0,1 aufweist, und der durchschnittliche Substitutionsgrad definiert ist als der Quotient der Anzahl der NH(X)NH2 - Gruppen im Oligo- oder Polysacharid dividiert durch die Anzahl der ursprünglichen Hydroxylgruppen des Oligo- oder Polysacharides.
Das erfindungsgemäß zu verwendende aminosubstituierte Oligo- oder Polysaccharid kann insbesondere ein Cellulosegerüst aufweisen mit der folgenden allgemeinen Formel :
Figure imgf000010_0001
wobei die Hydroxylgruppen der Cellulose zumindest teilweise durch NH(X)NH2 substituiert sind,
X einen beliebigen organischen Rest symbolisiert, insbesondere einen aromatischen, kondensierten aromatischen, heterozyclischen und/oder heteroaromatischen Rest, einen Alkyl- und/oder Alkenylrest, der gegebenfalls auch substituiert ist, nach Maßgabe eines durchschnittlichen Substitutionsgrades, der definiert ist als der Quotient der Anzahl der NH(X)NH2 - Gruppen dividiert durch die Anzahl der ursprünglichen Hydroxylgruppen des Oligo- oder Polysacharides und den Wert von _> 0,1 aufweist.
In einer weiteren Ausführungsformen des erfindungsgemäß zu verwendenden aminosubstituierten Oligo- oder Polysaccharids kann X die folgende Bedeutung haben :
Figure imgf000011_0001
10 y = 0 - 10
Formel I : Schematische Darstellung der Synthese von Aminocellulosen mit antimikrobieller Wirkung (3) durch A) homogene Tosylierung im Lösungsmittel DMAc/LiCI (Produkt 2) und B) nukleophile Substitution der Tosylfunktion mit di- und multifunktionalen Aminen Die erfindungsgemäß zu verwendenden aminosubstituierten Oligo- oder Polysaccharide können insbesondere als antibakterielles und antimykotisches Mittel eingesetzt werden.
Die erfindungsgemäß zu verwendenden aminosubstituierten Oligo- oder Polysaccharide können vorteilhafterweise als kosmetische Mittel, als Konservierungsstoff in Lösungen und Emulsionen, zur bioziden Ausrüstung von Oberflächen von Gegenständen, wie Geweben, Verpackungs- oder Verbandmaterialien sowie Hilfsstoffe in der kosmetischen oder pharmazeutischen Industrie, Landwirtschaft sowie Lebensmittel oder Futtermittelindustrie Verwendung finden.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind mithin auch Gegenstände, die zumindest teilweise mit einem erfindungsgemäß zu verwendenden aminosubstituierten Oligo- oder Polysaccharid beschichtet oder imprägniert sind .
Die erfindungsgemäß zu verwendenden aminosubstituierten Oligo- oder Polysaccharide können in an sich bekannter Weise wie in WO 2006/089499 A beschrieben hergestellt werden.
Überraschenderweise wurde gefunden, dass derartige Verbindungen, obwohl sie keine permanente kationische Ladung haben, stark biozid wirken .
Ein Vorteil der erfindungsgemäß zu verwendenden Verbindungen besteht darin, dass die biologische Aktivität und die physikalischen Eigenschaften durch die Wahl des Amins gezielt einstellbar sind (modulares System). Dies ist für bekannte Polysaccharide wie Chitosan und quartären Ammoniumverbindungen auf Polysaccharidbasis, wenn überhaupt, nur durch Folgeumsetzungen möglich. Weiterhin tragen die erfindungsgemäß zu verwendenden Verbindungen keine per- manenten Ladungen, was die Wechselwirkung mit anionischen Tensiden minimiert.
Die Erfindung betrifft demgemäß die Verwendung von Polysacchariden, die di-, tri- und tetrafunktionalen Aminfunktionen über eine Deoxystruktur mit einem durchschnittlichen Substitutionsgrad (DS) von 0,1 bis 3,0, insbesondere von 0,3 bis 1,0 enthalten, als antiinfektive Mittel bzw. zur Behandlung von Infektionserkrankungen.
Die erfindungsgemäß zu verwendenden Verbindungen ohne permanente kationische Ladung oder an sich bakterizider Seitenkette weisen eine hohe biologische Aktivität auf und hemmen überraschenderweise das Wachstum pathogener Bakterien, wie z. B. den gram-positiven Keim Staphylococcus aureus, den gramnegativen Keim Klebsiella pneumoniae und Hefepilze wie Candida albicans, Trichophyton rubrum, Malassezia pachydermatis mit IC50 Werten im Bereich von bis zu 5 mg/L wohingegen ein zytotoxischer Effekt gegen körpereigene Zellen wie HaCaT-Keratinozyten nicht beobachtet wird . Die Verbindungen können auf Grund dieser Eigenschaften zur Herstellung von Arzneimitteln zur Vorbeugung und Bekämpfung bakterieller und mykotischer Infektionen dienen. Sie können sowohl allein als auch in Kombination mit bekannten Therapeutika oder mit phy- siologisch verträglichen Hilfs- und Trägerstoffen angewandt werden.
Die antiinfektiven Verbindungen können zur Verwendung als Lösung oder Suspension auch in Form einer Nano- oder Mikropartikelsuspension in pharmazeutisch akzeptablen Medien für eine topische oder parenterale Applikation, über intravenöse, subkutane oder intramuskuläre Injektionen, für intranasale Applika- tion und als Tablette, Kapsel oder Suppositorium zubereitet werden. Die Verbindungen können in Dosierungen von 0,1-1.000 mg/kg Körpergewicht eingesetzt werden.
Zur Herstellung der erfindungsgemäß zu verwendenden wirksamen Verbindungen werden Oligo- und Polysaccharide, bevorzugt Glucane wie Stärke, Lichenan, Pullulan und besonders bevorzugt Cellulose und chemisch oder enzymatisch oder durch andere Verfahren (energiereiche Strahlung) partiell hydrolysierte bzw. abgebaute Polysaccharide, insbesondere Cellulose, eingesetzt.
Das Ausmaß der Umsetzung an den Hydroxylgruppen der Polysaccharide wird durch den durchschnittlichen Substitutionsgrad (DS) beschrieben. Dieser Durch- schnittswert gibt ohne jede Differenzierung die Anzahl der funktionalisierten Hydroxylgruppen an und liegt demnach bei den genannten Polysacchariden definitionsgemäß im Bereich von 0 bis 3. Der DS an di- und tri- und tetrafunktionalen Amingruppen der antiinfektiv wirksamen Polysaccharidderivate der Erfindung liegt zwischen 0,1 und 3,0, bevorzugt zwischen 0,3 und 1,0.
Die erfindungsgemäß zu verwendenden Polysaccharidderivate sind bekannt oder können in an sich bekannter Weise gewonnen werden, insbesondere durch Einführung einer Abgangsgruppe wie Halogenide oder Sulfonate insbesondere Tosylat in das Oligo- und Polysaccharid-Gerüst und nukleophile Substitution der reaktiven Verbindungen mit Aminen gemäß der allgemeinen Formel (I) (Polysaccharid : Cellulose, nur ein Substituent gezeigt).
Bevorzugt verwendet wird als Zwischenverbindung der p-Toluensulfonsäureester der Oligo- und Polysaccharide beispielsweise der Cellulose (Tosylcellulose, Formel IA Struktur 2). Zur Einführung der Tosyl-Funktion kann das Reagenz p- Toluensulfonsäurechlorid eingesetzt werden (Formel IA). Als di- und multifunktionale Amine sind beispielsweise die Reagenzien der allgemeinen Formel IB Struktur 3 mit Y = 1 -10 geeignet.
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Figure imgf000015_0002
y = 0- 10 y = 0- 10
Formel I: Schematische Darstellung der Synthese von Aminocellulosen mit antimikrobieller Wirkung (3) durch A) homogene Tosylierung im Lösungs- mittel DMAc/LiCI (Produkt 2) und B) nukleophile Substitution der Tosylfunktion mit di- und multifunktionalen Aminen
Die Tosylierung zur Herstellung des aktivierten Oligo- und Polysaccharidderivats kann in an sich bekannter Weise erfolgen (WO 2006/089499 A), wobei der DS- Wert an Tosyl-Gruppen im Bereich 0,1 bis 3,0 vorzugsweise 0,3 bis 1,0 realisiert wird. Das Oligo- und Polysaccharid, insbesondere Cellulose, wird entweder heterogen oder in homogener Lösung im dipolar-aprotischen Lösemitteln N,N- Dimethylacetamid in Gegenwart von Lithiumchlorid als Reaktionsmedien umge- setzt. Die Reaktionszeit für die Umsetzung mit dem Reagenz liegt zwischen 1 und 48 h, bevorzugt bei 3 bis 24 h, und die Temperatur zwischen -10 und 40°C, bevorzugt bei 25°C. Durch die eingesetzten Moläquivalente des Tosylierungsmittels kann zusätzlich der durchschnittliche Substitutionsgrad der Produkte eingestellt und in weiten Grenzen variiert werden. Darüber hinaus sind auch Mehrstufenre- aktionen für die Gewinnung der Oligo- und Polysaccharidderivate geeignet. Die Aufarbeitung der Reaktionsprodukte erfolgt mit üblichen Verfahren der Polymerchemie, wobei die niedermolekularen Nebenprodukte und Reagenzreste durch Waschprozesse oder Umfällen abgetrennt werden.
Über die Tosylate der Oligo- und Polysaccharide hinaus, lassen sich weitere Sulfonsäureester wie beispielweise die Mesylate und Triflate als reaktive Zwischenverbindungen herstellen. Darüber hinaus sind auch Desoxyhalogenderivate von Oligo- und Polysacchariden und Derivate von Oligo- und Polysacchariden mit einer Abgangsgruppe im Sinne der nukleophilen Substitutionsreaktion als reaktive Zwischenprodukte geeignet.
Die reaktiven Zwischenprodukte können an den verbliebenen Hydroxylgruppen in vielfältiger Art und Weise modifiziert werden. So können anionische Funktionen beispielsweise durch Sulfatierung, kationische Funktionen beispielsweise durch Umsetzung mit 2,3-Epoxypropyltrimethylammoniumchlorid oder 3-Chloro-2- hydroxypropyltrimethyl-ammoniumchlorid oder neutrale Substituenten durch Re- aktion mit Phenylisocyanat eingeführt werden. Generell können die Zwischenprodukte mit allen aus der organischen Chemie bekannten Reaktionen von Hydroxylgruppen zusätzlich modifiziert werden.
Die reaktiven Zwischenprodukte werden durch Umsetzung mit di- und multifunktionalen Aminen in die Desoxyaminoverbindung (Aminopolysaccharide, z. B. Aminocellulose) überführt. Dabei wird der durchschnittliche Substitutionsgrad (DS) der Aminfunktionen durch den DS der tosylierten Verbindung bestimmt und die Menge an Aminogruppen durch die Zahl der Aminofunktionen im entsprechenden di- und multifunktionalen Amin, wobei die Zahl der Aminofunktionen mindestens dem doppelten DS entspricht. Zusätzlich kann durch die Struktur der di- und multifunktionalen Amine die Struktur der Aminopolysaccharide weiter modifiziert werden; die di- und multifunktionalen Amine können Sauerstoff-, Schwefel- und andere Heteroatome enthalten.
Die durchschnittlichen Substitutionsgrade werden mittels Elementaranalyse er- mittelt und auf der Basis des Stickstoffwerts berechnet. Darüber hinaus eignen sich NMR-Spektren zur Bestimmung der DS Werte.
Durch einfaches Lösen der Aminocellulose in destilliertem, pyrogenfreiem Wasser ist die Herstellung biozider Lösungen möglich . Diese Lösungen können über einen Zeitraum von 3 Monaten gelagert werden. Eine zusätzliche Stabilisierung ist nicht nötig . Diese Lösungen können direkt zur antibakteriellen Ausrüstung in Kosmetika eingetragen werden. Bei höheren Konzentrationen (c > 2%m/m) liegen kolloidale Lösungen vor. Auch diese können ohne Einschränkungen eingesetzt werden. Gleiches gilt für wässrige Nano- und Mikropartikelsuspensionen der Aminocellulosen.
Mit diesen Lösungen ist eine biozide Beschichtung von festen Materialien wie Glas, Metall, Keramik, Kunststoffen, Holz oder Textilien möglich . Nach Vorbehandlung der Trägermaterialien durch Oberflächenaktivierung z.B. mit Schwefelsäure/ Wasserstoffperoxid wird der zu beschichtende Träger in eine Aminocelluloselösung gegeben und geschüttelt. Anschließend wird die Beschich- tungslösung entfernt und mit destilliertem Wasser und Methanol gewaschen.
Sollen größere, poröse Oberflächen wie Fasern oder Vliese beschichtet werden, gibt man die Aminocelluloselösung in einen Sprüheinrichtung und sprüht die Lösung gleichmäßig auf die Oberfläche auf. Je nach Beschaffenheit der Oberfläche wird diese anschließend vor dem Trocknen noch mit destilliertem Wasser und Methanol gewaschen.
Biologische Aktivität
Die biologische Aktivität der Verbindungen kann durch die Untersuchung der an- timikrobiellen Aktivität gemäß der Norm JIS L 1902 : 2002 belegt werden. Dazu werden die zu testenden Lösungen auf eine neutrale Trägermatrix (Polyester) appliziert, mit dem jeweiligen Inokulum versetzt und für 24 h inkubiert. Anschließend wird die Zahl vermehrungsfähiger Mikroben bestimmt. Die Untersuchungen nach JIS L 1902 : 2002 belegen eine starke antibakterielle Aktivität so- wohl gegen Staphylococcus aureus und Klebsiella pneumoniae auf (Figur 1). So wird eine Reduktion von Staphylococcus aureus um mehr als 7-log Stufen erzielt und das Wachstum des Keimes vollständig inhibiert. Bei Klebsiella pneumoniae kann das Wachstum um 4-log Stufen herabgesetzt und das Keimwachstum auf 40% der Kontrolle verringert werden.
Mit Hilfe der nephelometrischen Bestimmung der Wachstumskurven (NCCLS M27-A2, DIN EN 27027) wird gezeigt, dass beide Substanzen die Vermehrung der Keime konzentrationsabhängig vermindern bzw. vollständig inhibieren können (Figuren 2-5). Aus den erstellten Dosis-Wirkungs-Kurven können die IC50- Werte für die Proben berechnet werden (Tabelle 1). Die Proben zeigen eine ent- sprechende antibakterielle Wirksamkeit in Abhängigkeit von den eingeführten Amin-Substituenten. So zeigt Ethylendiamin-Cellulose (EDA-Cellulose, DS 0,87) und Tris-(2-aminoethyl)-amino-Cellulose (TAEA-Cellulose, DS 0,85) gegen Staphylococcus aureus eine vergleichbare Wirkung während der antibakterielle Effekt von EDA-Cellulose gegen Klebsiella pneumoniae geringer ist als der von TAEA-Cellulose.
Die Untersuchungen auf Zytotoxizität wurden an HaCaT-Keratinozyten durchgeführt. Für die Abschätzung der Zytotoxizität können die in vitro ermittelten Parameter IC50 (halbmaximale inhibitorische Konzentration = 50% der untersuchten Mikroorganismen sind tot) bzw. LC50 (halbmaximale letale Konzentration = 50% der untersuchten HaCaT-Keratinozyten sind tot) dienen. Für einen unbedenklichen Einsatz sollte das Verhältnis aus LC5o/IC5o > 1 sein. Die ermittelten in vitro wirksamen Konzentrationen können jedoch noch nicht ohne weitere Untersuchungen als eine Anwendungsempfehlung in vivo verstanden werden. Tabellen : IC50-Werte verschiedener Aminocellulosen gegen Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, Candida albicans und Malassezia pachydermatis und LC50 für HaCaT Zellen.
Rest LC50 IC50 [pg/mL]
[ g/mL]
HaCaT Candida Malassezia cells S. aureus K. pneumoniae albicans pachydermatis
EDA 2990,8 ± 8,2 ± 0,8 120,7 ± 6,0 198,1 ± 53,4 95,1 ± 6,0
412,2
bakterizid bakteriostatisch fungizid fungizid
EDA-NP* 3790 ± 320,0 ± 30,0 180,0 ± 10,0
540,0 / /
bakteriostatisch bakteriostatisch
TAEA 22,7 ± 20,5 ± 1,2 32,9 ± 13,6 234,3 ± 37,6 58,7 ± 7,9
412,2
bakterizid bakterizid fungizid fungizid
TAEA- 600,0 ± 220,0 ± 60,0 190,0 ± 10,0 / / NP* 70,0
bakteriostatisch bakteriostatisch
37,1 ± 14,6
DETA 70,0 ± 9,3 ± 0,3 51,7 ± 19,6 188,8 ± 45,4
5,5 fungizid bakterizid bakterizid fungizid
38,4 ± 0,6
TETA 33,8 ± 10,5 ± 0, 1 136,0 ± 5,5 189,4 ± 13, 1
1,75 fungizid bakterizid bakterizid fungizid
188,9 ± 4,7 38,5 ± 7,46
TEPA 35,3 ± 10,0 ± 0,6 30,3 ± 0,7
2,4 fungizid fungizid bakterizid bakterizid
193,2 ± 3,9 48,3 ± 6,3
PEHA 54,0 ± 24,2 ± 1,7 94,4 ± 17,5
3,0 fungizid fungizid bakterizid bakteriostatisch
*Suspension mit Nanopartikeln
Figur 1 : Bestimmung der antibakteriellen Aktivität der Proben EDA-Cellulose (DS 0,87; RS005) und TAEA-Cellulose (DS 0,85; RS006) entsprechend dem JIS L 1902 : 2002. Die Beurteilung der antimikrobiellen Aktivität erfolgt nach den log- Stufen der erzielten Reduktion des mikrobiellen Wachstums: < 0,5 = keine anti- mikrobielle Aktivität; 0,5 bis 1 = leichte antimikrobielle Aktivität; > 1 bis <3 = signifikante antimikrobielle Aktivität; > 3 = starke antimikrobielle Aktivität.
Figur 2 : Wachstumskurven von Staphylococcus aureus unter steigenden Konzentrationen von EDA-Cellulose (DS 0,87)und die Dosis-Wirkungs-Kurve zur Be- Stimmung des IC50-Wertes.
Figur 3. Wachstumskurven von Klebsiella pneumoniae unter steigenden Konzentrationen von EDA-Cellulose (DS 0,87) und die Dosis-Wirkungs-Kurve zur Bestimmung des IC50-Wertes.
Figur 4. Wachstumskurven von Staphylococcus aureus unter steigenden Kon- zentrationen von TAEA-Cellulose (DS 0,85) und die Dosis-Wirkungs-Kurve zur Bestimmung des IC50-Wertes.
Figur 5. Wachstumskurven von Klebsiella pneumoniae unter steigenden Konzentrationen von TAEA-Cellulose (DS 0,85) und die Dosis-Wirkungs-Kurve zur Bestimmung des IC50-Wertes.
Die antiinfektiven Verbindungen können zur Verwendung als Beschichtungen aus wässrigen Lösungen oder Suspension auf Feststoffe unterschiedlicher Zusammensetzung wie Glas, synthetische und natürliche Polymere und deren Derivate, Holz, Papier, Pappe, Metall, Metalloxide oder Keramiken in verschiedenen Formen von Flächen, Formkörpern oder Fasern aufgebracht werden . Die Beschichtung kann direkt oder nach bekannten Vorbehandlungen, beispielsweise einer Vorbehandlung mit Plasma oder Ozon, erfolgen.
So kann beispielsweise handelsübliches Papier mit TAEA-Cellulose (DS 0,85) beschichtet werden, indem das unbehandelte Papier autoklaviert wird und die TAEA-Cellulose danach unter sterilen Bedingungen aufgesprüht wird. Die so prä- parierten Papiere zeigen bei der Testung nach JIS L 1902 : 2002 eine starke antimikrobielle Wirksamkeit. Dabei werden Bakterien im Nährmedium auf die zu untersuchenden Proben aufgebracht und für 24 h inkubiert. Der Test auf antibakterielle Wirkung zeigt sowohl bei Staphylococcus aureus als auch bei Klebsiella pneumoniae eine enorme Wachstumshemmung in Abhängigkeit von der Konzent- ration der verwendeten Beschichtungslösung (Figur 6). So kann beispielsweise mit 0,05 %iger TAEA-Celluloselösung bereits eine Hemmung von ca. 50 % bei Staphylococcus aureus und ca. 20 % bei Klebsiella pneumoniae erzielt werden. Bei Verwendung einer 0,25 %igen Lösung beträgt die Inhibition bereits ca. 80 % bei Staphylococcus aureus und ca. 50 % bei Klebsiella pneumoniae. Beim Einsatz einer 0,5 %igen TAEA-Cellulose-Lösung kann kein Bakterienwachstum mehr nachgewiesen werden.
Figur 6: Einfluss TAEA-Cellulose-modifizierter Papiere auf das Wachstum von Klebsiella pneumoniae.
Weiterhin können beispielsweise Cellulose-Modalfasern (CM D-Fasern) mit 0,05 %iger TAEA-Cellulose-Lösung behandelt werden. Nach Behandlung der Fasern wird mit destilliertem Wasser und Methanol gewaschen. Es wird für Klebsiella pneumoniae eine Inhibition von 40 % erreicht. Für Staphylococcus aureus wird das Wachstum auf den Fasern unterbunden.
Antimikrobielle Materialien sind weiterhin durch das Auftragen von Nanofaser- schicht die Aminocellulosen enthalten auf Träger wie Polypropylen-Vliese zugänglich. Dazu werden Mischlösungen von Aminocellulose (beispielsweise TAEA- Cellulose) (1 %ig) und Polyvinylalkohol (15 % bzw. 18 %) in Wasser hergestellt und mittels einer Elektrospinnanlage (Nanospider) über eine Igelwalze versponnen. Die auf diese Weise mit aminocellulosehaltigen Nanofasern versehenen Oberflächen zeigen eine gute Wachstumshemmung gegen Staphylococcus aureus.
Figur 7 : Einfluss TAEA-Cellulose-beschichteter Modalfasern auf Staphylococcus aureus und Klebsiella pneumoniae.
Ausführungsbeispiele
Die folgenden Ausführungsbeispiele sollen die Erfindung näher erläutern, jedoch in keiner Weise einschränken.
Beispiel 1
Synthese von Tosylcellulose
15,0 g (92,6 mmol) Cellulose (AVICEL) werden unter Ausschluß der Luftfeuchtigkeit in 300 ml DMA suspendiert. Anschließend erhitzt man auf 120°C und rührt 2 h bei dieser Temperatur. Nach dem Abkühlen auf 100°C gibt man 22,5 g LiCI zu und rührt ohne weitere Heizung bis zum Erhalt einer klaren Lösung. Die Lösung wird in einen doppelwandigen Laborreaktor überführt und auf 8°C gekühlt. Anschließend gibt man 48,8 ml (185,2 mmol; 2 mol/mol Tosylchlorid) TEA in 50 ml DMA zu. Weiterhin tropft man eine Lösung von 17,6 g (92,6 mmol; 1 mol/mol AGU) Tosylchlorid in 36 ml DMA langsam zu. Der Ansatz wird 24 h bei 8°C gerührt. Zur Aufarbeitung fällt man in 5 I Eiswasser. Das Polymer wird abgesaugt, zuerst mit Wasser und danach gründlich mit Ethanol gewaschen . Es trocknet bei 50°C im Vakuum . Das Polymer löst sich in N MP, DMSO und DMF.
Beispiel 2 Synthese von TAEA-Cellulose
Für die Synthese der TAEA-Cellulose werden 5 g Tosylcellulose (0,016 mol; Avicel, DS=0,99) in 60 ml DMSO gelöst, unter Argonatmosphäre mit 59,90 ml Tris-(2-aminoethyl)-amin (TAEA) (0,40 mol; 25 mol/mol AGU) versetzt und 6 h bei 100°C gerührt. Die Isolierung und Reinigung des Produktes erfolgte durch Fällen in 500 ml Aceton, sowie je zweimaliges Waschen mit Aceton und Isopropanol . Das noch feuchte Produkt wird in Wasser gelöst, am Rotationsverdampfer von Lösemittel resten befreit und im Vakuum getrocknet
Beispiel 3
Herstellung einer bioziden Lösung Zur Herstellung biozider Lösungen werden 1,5 g Aminocellulose in ca 150 ml Wasser aufgenommen und gefriergetrocknet. Von der so gewonnenen Substanz wird 1 g in 99 ml destilliertem, pyrogenfreiem Wasser gelöst. Diese Lösungen können über einen Zeitraum von 3 Monaten gelagert werden . Eine zusätzliche Stabilisierung ist nicht nötig . Beispiel 4
Biozide Beschichtung von Glas
Bei der Verwendung von Glas als Trägermaterial wird dieses vor der Beschichtung für 3 h in Schwefelsäure/ Wasserstoffperoxid (2 : 1 ) gelegt, um die Oberfläche zu aktivieren . Anschließend werden die Gläser gründlich mit destilliertem Wasser gespült und getrocknet. Die zu beschichtenden Träger werden für 15 min in die Aminocelluloselösung gegeben und geschüttelt. Anschließend wird die Be- schichtungslösung entfernt und vier Mal mit destilliertem Wasser und vier Mal mit Methanol gewaschen .
Beispiel 5
Biozide Beschichtung von Fasern
Sollen größere, poröse Oberflächen wie Fasern oder Vliese beschichtet werden, gibt man die Aminocelluloselösung in einen DC-Sprühfinger oder eine vergleich- bare Sprüheinrichtung und sprüht die Lösung gleichmäßig auf die Oberfläche auf. Je nach Beschaffenheit der Oberfläche wird diese anschließend vor dem Trocknen noch mit destilliertem Wasser und Methanol gewaschen.
Beispiel 6
Bestimmung der antimikrobiellen Aktivität
Die Testkeime Staphylococcus aureus ATCC 6538 und Klebsiella pneumoniae ATCC 4352 werden auf Columbia-Agar-Platten (bioMerieux, Nürtingen) angezüchtet und anschließend bei 4°C gelagert. Zur Herstellung der jeweiligen Arbeitskulturen werden 20 mL Caso-Bouillon in 50-mL-Kulturflaschen aus Glas mit Kapsenbergerkappen (VWR International GmbH, Darmstadt) mit dem entsprechenden Bakterium (Materialmenge ca. 1 kleine Impföse) beimpft. Die Kulturen werden für 24h bei 37°C in einem Schüttelwasserbad (GFL 1083, Gesellschaft f. Labortechnik, Burgwedel) kultiviert.
Zur Bestimmung der antibakteriellen Aktivität wird entsprechend dem JIS L 1902 : 2002 200pL der l%igen Lösungen auf 400mg Trägermaterial (Polyester) aufgetragen. Der unbehandelte Polyester dient als Referenzmaterial . Für die Versuche werden die über Nacht bei 24°C bebrüteten Arbeitskulturen der Testkeime S. aureus und Klebsiella pn. verwendet. Es wird eine Zelldichte von ca. 3- 5xl05cfu/mL durch Verdünnen in Caso-Bouillon eingestellt. Die Proben werden mit je 200 pL Testinokulum versetzt und für 24h bei 37°C unter aeroben Bedingungen inkubiert. Für die Keimzahlbestimmung wird die Teststücke in Kochsalzlösung (0,9%ig, mit Tween20) extrahiert. Von den Extrakten werden Verdünnungsreihen hergestellt, ausplattiert und für 24h inkubiert. Danach erfolgt das Auszählen der Kolonien auf den Platten und die Berechnung der cfu (colony forming units) entsprechend dem JIS L 1902 : 2002 im Vergleich zum Anfangswert:
Berechnung der Wachstumsreduktion : Wachstumsreduktion [log] = log(24hMW [cfu]Kontrolle(Gaze))-log(24hMW [cfu]Probe)
Für die Bestimmung des Einflusses der Substanzen auf das bakterielle Wachstum (NCCLS M27-A2, DIN EN 27027) werden die Wachstumskurven der Mikroorganismen mittels Mikroplatten-Laser-Nephelometrie (MLN) gemessen. Für die Versuche werden die über Nacht bei 24°C bebrüteten Arbeitskulturen der Testkeime S. aureus und Klebsiella pn. verwendet. Es wird eine Zelldichte von ca. 5xl03cfu/ml_ durch Verdünnen in Caso-Bouillon eingestellt. 100μΙ_ der zu testenden Substanzen werden in 96-Well-Platten mit 100μΙ_ Inokulum pro Well versetzt. Die Platten werden mit einer transparenten, gasdurchlässigen Folie abgedichtet. Die Messung der Trübung erfolgt mit Hilfe des NEPHELOstar Galaxy (BMG Labtech, Germany). Die Versuche werden bei 37°C unter Schütteln über 24h durchgeführt, wobei die Messungen jeweils jede Stunde erfolgen. Anschließend werden die antibakterielle Aktivität (in %) der zu testenden Substanz im Vergleich zu einer unbehandelten Kontrolle ermittelt und die IC50 (halbmaximale inhibitorische Konzentration) berechnet.
Die einzelnen Messungen erfolgen in Dreifachbestimmungen . Die angegebenen Mittelwerte sind demnach die gemittelten Werte aus 3 Messdaten ± Standardfehler (Microsoft® Excel SP2). Zur Ermittlung der statistischen Signifikanz wird ein ungepaarter t-Test durchgeführt (Microsoft® Excel SP2). Als statistisch signifikant werden Ergebnisse p < 0,05 erachtet und wie folgt angegeben : * p < 0,05, ** p < 0,01 und *** p < 0,001. Die Berechnung der Dosis-Wirkungs-Kurven und dem IC50-Wert erfolgt mit Hilfe von Origin 7.0SRO (OriginLab Corporation).
Berechnung der Wachstumsreduktion : Wachstumsreduktion [log] = log(24hMW [cfu]Kontrolle(Gaze))-log(24hMW [cfu]Probe)
Beispiel 7
Bestimmung der antimykotischen Aktivität
Die Testkeime Candida albicans ATCC 10231 und Malassezia pachydermatis ATCC 6172 wurden von der DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen) bezogen. Die Lagerung der Hefen erfolgte mittels Krykonservierung {Microbank™ , Pro-Lab Diagnostics, Richmond Hill ON, Canada). Für die Versuche wurden Candida albicans und Malassezia pachydermatis zunächst auf Sabouraud-Dextrose-Agar-Platten (bioMerieux, Nürtingen) angezüchtet. Dazu wurden mit Hilfe einer Pinzette ein Bead unter sterilen Bedingungen aus dem Mikrobank-System entnommen und vorsichtig auf dem Agar ausgerollt. Diese Stammkulturen der Hefen wurden bei 37°C unter aeroben Be- dingungen für 48h kultiviert und anschließend bei 4°C gelagert. Zur Herstellung der Arbeitskultur wurden 20 mL Sabouraud-Glukose-Bouillon in 50-mL- Kulturflaschen aus Glas mit Kapsenbergerkappen (VWR International GmbH, Darmstadt) mit den Hefen (Materialmenge ca. 1 kleine Impföse) beimpft. Die Kulturen wurden für 24h (Candida albicans) bzw. 48h (Malassezia pachydermatis) bei 37°C in einem Schüttelwasserbad (GFL 1083, Gesellschaft f. Labortechnik, Burgwedel) kultiviert.
Bei der Mikrotiterplatten-Laser-Nephelometrie (MLN) handelt es sich um ein optisches Analyseverfahren, mit dem sich die Konzentration von Teilchen in Flüssig- keiten quantitativ bestimmen lässt. Die in der Lösung suspendierten Partikel streuen das einfallende Licht seitlich zum Lichtstrahl (Tynd all- Effekt). Diese Methode ermöglicht die Messung mikrobieller Wachstumskurven indem die Trübung der Lösung bestimmt wird . Aufgrund der hohen Sensitivität der Technik ist es möglich bereits geringe Konzentrationen streuender Partikel, wie es in der lag- Phase und dem Anfang der log-Phase der Falls ist, zu erfassen. Für die Versuche wurden die über Nacht bei 37°C bebrüteten Arbeitskulturen der Testkeime verwendet. Es wurde eine Zelldichte von ca. 5xl03 cfu/mL durch Verdünnen in Sabouraud-Glukose-Bouillon eingestellt. 100 pL der Testsubstanz in den entsprechenden Konzentrationen wurden in 96-Well-Platten mit 100 pL Inokulum pro Well versetzt. Die Platten wurden mit einer transparenten, gasdurchlässigen Folie abgedichtet um Flüssigkeitsverlust durch Verdampfen zu vermeiden. Die Wachstumskurven der Mikroorganismen wurden mit Hilfe des NEPHELOstar Galaxy (BMG Labtech, Germany) durch die Messung der Trübung der Kulturen aufgenommen. Der Versuchsansatz wurde bei 37°C unter Schütteln über 24h durchge- führt, wobei die Messungen jeweils jede Stunde erfolgten. Anschließend wurden die antimykotische Aktivität (in %) der zu testenden Substanz im Vergleich zu einer unbehandelten Kontrolle ermittelt.
Die Versuche wurden in zwei unabhängigen Ansätzen durchgeführt. Die einzelnen Messungen erfolgten in Vierfachbestimmungen. Die angegebenen Daten sind Mit- telwert ± Standardfehler (Microsoft® Excel SP2). Die statistische Auswertung der Messwerte erfolgte auf der Basis des Students-T-Test (Microsoft® Excel SP2). Als statistisch signifikant wurden Ergebnisse p < 0,05 erachtet und wie folgt angegeben : [*] p < 0,05, [**] p < 0,01 und [***] p < 0,001. Die Berechnung der Dosis-Wirkungs-Kurven und dem IC50-Wert erfolgte mit Hilfe von Origin 7.0SRO (OriginLab Corporation).

Claims

Patentansprüche
1. Verwendung eines aus einer Grundeineinheit aufgebauten Oligo- oder Polysaccharids (DP > 10) mit Hydroxylgruppen, die zumindest teilweise Substituenten tragen die Di-, Tri-, oder Tetraaminfunktionen ohne permanente Ladung besitzen, als antibakterielles und antimykotisches Mittel.
2. Verwendung nach Anspruch 1, wobei das Oligo- oder Polysaccharid ein Glucan ist, insbesondere Stärke, Cellulose, Lichenan und Pullulan.
3. Verwendung nach Anspruch 1 oder 2, wobei der durchschittliche Substitutionsgrad 0,1 bis 3,0 beträgt.
4. Verwendung nach Anspruch 3, wobei der durchschittliche Substitutionsgrad 0,3 bis 1,0 beträgt.
5. Verwendung nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei das mindestens bi-funktionale Amin die folgende Formel
-NH(X)NH2
aufweist und X einen beliebigen organischen Rest, der gegebenfalls auch substituiert ist, darstellt.
6. Verwendung nach Anspruch 5, wobei X einen aromatischen, kondensierten aromatischen, heterozyclischen und/oder heteroaromatischen Rest, einen Alkyl- und/oder Alkenylrest darstellt.
7. Verwendung nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei das Amin, das mindestens zwei einer nucleophilen Substitution zugänglichen Aminofunktionen aufweist, die folgende Formel
-NH(X)NH2
besitzt und X /132061
25
Figure imgf000027_0001
Figure imgf000027_0002
y = 0- 10 und ein durchschnittlicher Substitutionsgrad den Wert von >. 0,1 aufweist, und der durchschnittliche Substitutionsgrad definiert ist als der Quotient der Anzahl der NH(X)NH2 - Gruppen im Oligo- oder Polysacharid dividiert durch die Anzahl der ursprünglichen Hydroxylgruppen des Oligo- oder Polysacharides.
8. Verwendung nach Ansprüche 1, wobei das Oligo- oder Polysaccharid Cellulose ist und die folgende allgemeine Formel aufweist:
Figure imgf000028_0001
wobei die Hydroxylgruppen der Cellulose zumindest teilweise durch NH(X)NH2 substituiert sind, und
X einen beliebigen organischen Rest symbolisiert, der gegebenfalls auch substituiert ist,
nach Maßgabe eines durchschnittlichen Substitutionsgrades, der definiert ist als der Quotient der Anzahl der NH(X)NH2 - Gruppen dividiert durch die Anzahl der ursprünglichen Hydroxylgruppen des Oligo- oder Polysacharides und den Wert von >. 0,1 aufweist.
9. Verwendung nach Anspruch 8, wobei X einen aromatischen, kondensierten aromatischen, heterozyclischen und/oder heteroaromatischen Rest, einen Alkyl- und/oder Alkenylrest darstellt.
10. Verwendung nach Anspruch 8, wobei X die folgende Bedeutung hat
/132061
27
Figure imgf000029_0001
Figure imgf000029_0002
y = 0- 10
11. Verwendung eines aminosubstituierten Oligo- oder Polysaccharids, das nach einem der Ansprüche 1 bis 10 in kosmetischen Mitteln als Konservierungsstoff in wässriger Lösung oder Suspension.
12. Verwendung eines aminosubstituierten Oligo- oder Polysaccharids nach Anspruch 1 bis 10 zur bioziden Ausrüstung von Oberflächen von Gegenständen, wie Geweben, Verpackungs- oder Verbandmaterialien sowie Hilfsstoffe in der kosmetischen oder Landwirtschaft sowie Lebensmittel oder Futtermittelindustrie.
13. Gegenstände zumindest teilweise beschichtet oder imprägniert mit einem aus einer Grundeineinheit aufgebauten Oligo- oder Polysaccharid (DP > 10) mit Hydroxylgruppen, die zumindest teilweise Substituenten tragen die Di-, Tri-, oder Tetraaminfunktionen ohne permanente Ladung besitzen.
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