WO2013110887A1 - Substrat sur lequel est greffe par liaison covalente du chitosane ou du collagene - Google Patents

Substrat sur lequel est greffe par liaison covalente du chitosane ou du collagene Download PDF

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WO2013110887A1
WO2013110887A1 PCT/FR2013/050132 FR2013050132W WO2013110887A1 WO 2013110887 A1 WO2013110887 A1 WO 2013110887A1 FR 2013050132 W FR2013050132 W FR 2013050132W WO 2013110887 A1 WO2013110887 A1 WO 2013110887A1
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WO
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polymer
substrate
acid
case
Prior art date
Application number
PCT/FR2013/050132
Other languages
English (en)
Inventor
Bérangère Toury
Brigitte GROSGOGEAT
Pauline RENOUD
Cédric DESROCHES
Original Assignee
Universite Claude Bernard Lyon I
Centre National De La Recherche Scientifique
Hospices Civils De Lyon
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Universite Claude Bernard Lyon I, Centre National De La Recherche Scientifique, Hospices Civils De Lyon filed Critical Universite Claude Bernard Lyon I
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/28—Materials for coating prostheses
    • A61L27/34—Macromolecular materials
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/02—Inorganic materials
    • A61L27/04—Metals or alloys
    • A61L27/06—Titanium or titanium alloys

Definitions

  • Suitable for implant prosthesis medical or surgical prosthesis.
  • WO 2004/084966 about covering the surface of dental impressionants with a coating consisting of a polymer based on P and N, by covalent bonding.
  • the bond between the polymer and the surface is carried out by means of inosifane or an alkylphosptaic acid.
  • the inventors of the present invention consider that presumably taking into account the Houses involved between the amino group and the polymer, the covalent linkage used does not allow to sustainably maintain the polymer immobilized on the implant in an aqueous acid medium such as saliva.
  • US Pat. No. 6129956 describes a process for the release of yuronic acid or of polymers having COGH groups on a substrate. Two processes are described: one uses an aqueous solution of silicon dioxide, AFTES and hyaluronic acid which is deposited on the titanium substrate. Given the clutter Because the silicon oxide is "embedded" in the polymer, the bond between the alkoxysilane and the substrate is likely to be weak. Furthermore, it is horned that in aqueous medium, the silicon alkoxides stiydrolysent and condense to form Si-O-Si bonds that are no longer reactive with respect to the substrate.
  • the other method uses PolyEthyienelmlne (PEI) to bind the polymer to the substrate.
  • PEI PolyEthyienelmlne
  • the PEI is immobilized on the substrate according to electrostatic bonds. In addition to the fact that these bonds are weak, they are easily: resistant and resistant: not to oral aggressions, it has, moreover, been shown that PEI is toxic to the oral cells (osteo lastes and Hbrobfasts) (Brunei et al. al Bioma erisis, 28 (2007) 632-640),
  • the inventors are more specifically interested in immobilization, chltosan and collagen which exhibit: interesting biological properties, on titanium substrates most often used in the field of dental implants. in particular, known for its antibacterial properties and the agene collagen facilitates healing,
  • the first method by far the simplest, consists of simply depositing (by "dip” or * spln coating ") an aqueous solution of chltosan on a substrate. In this case, no bond exists between the substrate and the chltosan, This method is used in the literature when it is desired a fast and total restitution of the polymer.
  • the method using dopamine and glutaraldehyde is to create two slow bonds between dopamine and hydroxy groups as shown in SCHEME 1 above. below, then to react the glutaraldehyde to obtain an aldehyde function at the end of the chain, which then makes it possible to create there connection with the amine function of the cytosane.
  • Thin Soild Rlms, 2008 (516), 6277-628) is to react the APTES on the treated titanium surface to obtain a binding
  • the method using TES8 (H, Martin et al., Thin Soiid Fm 2008 (51.6), 6277-628 and HJ Martin, Applied Surface Science, 2008 (254).
  • 4599-4605 ⁇ has the advantage of having only two steps, but unlike the dopamine-using method, ⁇ 5 ⁇ attaches to titanium only through a single covalent bond as shown in Schf3 ⁇ 4â 3 ci
  • the TESB® is a functionalized alkoxysilane, but it directly has the aldehyde function at the end of the chain.Ce makes it possible to save the glutaraldehyde stage, making it possible to hold this function at the end of the chain.
  • EP 308177 also proposes the use of a surface-implanting chitosan film to increase cell adhesion.
  • described method which consists in immersing a titanium implant in a solution of chitosan in the presence of acetic acid, leads to an unstable immobilization of chitosan in an aqueous acid medium such as saliva,
  • WO 2005/089829 emphasizes that the use of covalent binding between the substrate and an active protein affects the activity of the protein and thereby advocates immobilization without a covert bond.
  • the present invention aims to overcome the above inconveniences in terms of substrate-polymer bond stability.
  • the present invention proposes to produce substrates suitable for producing implants coated with a polymer having a biological activity chosen from chitosan, collagen and their derivatives, which have a satisfactory stability in an aqueous pH medium. close to 5 otammen, simulating: physiological media, such as saliva,
  • the proposed solution must allow the maintenance of satisfactory biological properties for the immobilized polymer.
  • the subject of the present invention is a substrate composed of a material chosen from titanium or one of its alloys, on which at least one polymer exhibiting a biological activity, chosen from chitosan, collagen and their derivatives, is immobilized in such a way that covalent thanks to a binding entity Et establishing a peptldic bond: -CO-NH-, urea H ⁇ C (0) ⁇ H ⁇ or thlo-urea: - HC SJ-NH- on the functions -Nhfe present on the polymer before its grafting and which correspond to functions -Nr present on chitosan or collagen in the natural state, or, in the case of chitosan and its derivatives, establishing a rovt ane bond; ⁇ ⁇ NR-C (0) ⁇ O or thio-urethane -NH-C ⁇ O) -0- on the -OH functional groups present on the polymer prior to grafting, which correspond to functions GB ⁇ present on the
  • the present invention also relates to the processes for preparing such substrates as described below.
  • Collagen and chitosan are natural polymers. Derivatives of these are polymers corresponding to collagen or chitosan and which have one or more substitutions which do not reflect the desired biological activity.
  • the collagen derivatives used have, before binding to the substrate, H 2 - bases present on the natural forms of collagen.
  • the chitosan derivatives used comprise, before binding to the substrate, -H 2 functions and / or -OH functions present on the natural forms of chitosan, which will serve for the purpose of their use according to the stable covalent bonds envisaged in the context of the invention. of the invention,
  • the chitosan can be defined as a poiyoside of units giucosam ⁇ ne D and acetyl-D-glucosamine units linked to 8- (I-4), usually distributed in a random distribution. Chitosan is: produced by chemical deacetylatlon (in alkaline medium) or enzymatkgue of chitin.
  • the main sources of chitin are the exoskeletons of arthropods (crustaceans) and the endoskeletons of cephalopods (squids).
  • the degree of acetylation (DA) of chitosan which corresponds to the percentage of acetylated units relative to the number of total units, is less than 50%.
  • Chitosan is soluble in acidic medium in contrast to chitin which is insoluble.
  • the deaetylated units include NH 2 functions which are used in the context of the invention to make peptyl chloride, urea or urea-type linkages for dinimerization. covalently, ie, the polymer on the substrate.
  • Chitosan also includes OH functions that are used in the context of the invention to form urethane or threoethane type bonds for immobilizing, covalently, the polymer on the substrate
  • any type of chtfcosarae may be used.
  • immobilize a chitosan having, for example, a degree of acetylation (DA) of from 15 to 25% and a low molecular weight, in particular of mass less than 6000 g, mol -1 .
  • DA degree of acetylation
  • collagen it is the free NH 2 functions present on some of the amino acids constituting the collagen which will make it possible to form the connections of peptldic, urea or thiourea type.
  • Implant coatings due to: their specific properties, or cliolsls ie polymers among chitosan, ie ollagéne and derivatives thereof, immobilized on Implant coatings will accelerate all stages of the healing process by promoting hemostasis, stimulation of macrophages and proliferation of fibroblasts. At the same time, the bacteriostatic and fungi properties of chitosan against a broad spectrum of bacteria and fungi will limit bacterial contamination and the risk of fungal infections.
  • the substrate is composed of titanium or a titanium age garlic, especially used in the design of implant for prosthesis.
  • the substrate may be composed of a material chosen from titanium, titanium alloys with nickel, especially in an atomic ratio Mi / ⁇ of 40/60 to 60/40 and more particularly of 50/50, and titanium alloys with zirconium, ie iron, nickel, aluminum, molybdenum and / or vanadium, especially in an M / Ti atomic ratio of less than 40/60.
  • M representing zirconium, iron, nlobium, aluminum, molybdenum, vanadium or a mixture thereof.
  • the substrate may have been prepared beforehand, before the grafting of the polymer, so as to present a roughness average in the range of 2 nm to 1.00 pm.
  • the average roughness of the substrate can be determined by Atomic Force Analysis,
  • the degree of grafting could be from 1 to 15 polymer molecules / nm 2 .
  • ⁇ is possi the use analyzes ATG or chemical assays.
  • the specific surface area given above corresponds to the specific surface area of the titanium substrate or a titanium alloy, as such;
  • a deposit of a porous silica layer on the substrate Such a silica layer can be obtained by sol-gel process, followed by a heat treatment at a temperature ranging from 100 to 700 ° C, and in particular at a temperature of the order of 300 ° C.
  • the specific surface area given above corresponds to. specific surface of the porous silica layer deposited on the substrate made of titanium or a titanium alloy.
  • Anodisatlon in aqueous solution makes it possible to create a microroughness or a microstructure of the surface of the substrate. It is possible to use in particular anodisatlon in the presence of suicosic acid, especially at a molar concentration (as described in particular by D.
  • 1 EL linker preferably corresponds to the next haul; in which :
  • M represents a titanium atom of the substrate
  • Fi represents a porous silica layer bonded to M by a bond - M-0 ⁇ $! and at O-X through an Si-O-X bond,
  • n is equal to o or i
  • X represents n atom of silicon or phosphorus
  • o Y 2 represents - (CQ) -NH- and Y * represents TM HC (0) ⁇ o sot Y2 and Yi are identical and represent -NH-C (Z) ⁇ NH with Z ⁇ G or S,
  • q ⁇ ⁇ and / or X represents a silicon atom and / or HF2 represents ⁇ ⁇ 3 ⁇ 4 ⁇ 3 -00- ⁇ -,
  • X-SiZ 1 i could be indicated with Z t and 3 ⁇ 4 u i are two atoms selected from the carbon oxygen atoms, the silicon atom derived from the reaction of an afcoxysilane, a hydroxysilane or a hydroxyalkoxysilane on the surface OH functions as explained in the following description, in relation to the process for obtaining the substrates.
  • the substrates according to the invention are stable in acidic aqueous medium and are perfectly adapted to the manufacture of dental implant.
  • stability in acidic aqueous medium and stability to hydrolysis in acidic medium can be demonstrated by immersing at 22 ° C the substrate in an aqueous medium of pH-5 described by Fusayama (M.
  • the biological properties of the graft polymer are preserved, the chemical grafting not entailing a loss of properties.
  • the EL binding entity can be obtained by reaction on -OH functions present at the surface of the substrate:
  • the acid halide functions can in particular correspond to a chloride (C (O) Cl) .
  • the anhydride functions -C (O) -C (O) may in particular correspond to groups such as:
  • the substrate Stane or a titanium alloy is, in most cases subjected to a prior oxidizing chemical treatment by reaction with a mixture of acid and oxidizing agent such as a mixture of sulfuric acid and hydrogen peroxide, or by passing, by the action of the king's reagent (nitric acid), or by chemical treatment in a mixture of NaOH + alcohol.
  • a mixture of acid and oxidizing agent such as a mixture of sulfuric acid and hydrogen peroxide
  • nitric acid nitric acid
  • n is equal to I. which means that it is a covalent bond established via a porous silica layer deposited on the substrate and on which the polymer is grafted.
  • the silica layer is advantageously obtained by sol-gel process, followed by a heat treatment at a temperature in the range of from 100 ° C. to 70 ° C.
  • the EL entity can then be supplemented, by reaction on -OH functions present at the surface of the silica layer:
  • the intermediate porous silica layer covering the substrate has residual OH functions, in particular because of the implementation of the sol-gel process.
  • Sol-gel processes are known to those skilled in the art. Nevertheless, for more details on the self -gel method that can be implemented, reference may be made to: i3
  • R represents a hydrogen atom or an aldehyde group of 1 to 4 carbon atoms, and for example a methyl or ethyl group
  • R 3 ⁇ 4 which represents:
  • the function Y 2 will react with a reactive function -NH 1 or -OH, depending on the case, present on the bioactive polymer at graft, to form a peptiye bond, urea, thiourea, urethane thiourethane.
  • a reactive function Y 3 will react with a reactive function -3 ⁇ 4 i present on the surface of the su strat or the intermediate layer of silica and the other function Y 3 will react with a reactive function -Nl1 ⁇ 4 or -OH, depending on the case ,, present on the bioactive polymer to be grafted, in order to form peptldic bond urea, ttilo -yrée, ryttiane or thiouretiane.
  • Such reactions may be conducted under the following conditions;
  • apofane solvent for example, toluene, exane, diethyl ether for example
  • apofane solvent for example, toluene, exane, diethyl ether for example
  • grafting of alkoxysilane, I droxysllan8, I tsyd roxya icoxy s lane or phosphonate at room temperature then rinsing with m. polar medium (eg DMF, Water, THF, acetonitrile,.,),
  • the latter may be solubilized in slightly acidic medium (for example in a water / acetic acid mixture).
  • slightly acidic medium for example in a water / acetic acid mixture.
  • the grafting of the polymer on the substrate can then be carried out at room temperature and optionally catalyzed by a reagent such as C or DOC or by any other known catalyst for peptide coupling.
  • the substrate may be rinsed and dried according to any technique well known to those skilled in the art. Drying is then generally carried out at temperatures between 50 and 150 ° C. Preferably, the polymer forms a homogeneous coating.
  • the substrates according to the invention can be used for the manufacture of any type of implant for a medical or surgical prosthesis, and in particular a dental implant or an orthopedic implant .
  • the substrate according to the invention is in the form of a prosthesis implant, and in particular an implant for dental prosthesis or orthopedic protfièse.
  • the shape of the implant can be more or less complex.
  • the carrier substrate of the bioactive polymer will be sterilized, prior to implantation into the body, according to a sterilization technique which does not affect the integrity of the bioreactive polymer, in particular autoclave, gamma ray sterilization, or sterilization. oxide of yléoe can be implemented.
  • the present invention is particularly suitable for the grafting of chstosan onto substrates made of titanium or a titanium alloy, especially in the form of an implant for prosthesis deotalre.
  • the fat of limmobillsatton of the bioactive polymer on the substrate by a covalent bond which involves at least one peptide bond ⁇ C (G ⁇ - H- f urea bond -NH-C (0 ) Or a urethane bond ⁇ ⁇ ( ⁇ ) ⁇ or thio-urethane ⁇ MH-C (S) -O- (these bonds intervening from the substrate to the polymer ⁇ , which is: stable to ilivolysis in acidic medium, it is possible to consider the possibility of keeping the bioactive polymer on the Implant even in acid medium, especially at a pH of S ,, which corresponds in particular to the sallvary medium .
  • L nvenJon therefore provides access to the installation of including implant therapy in the case of dental implants, for patients at risk (diabetic, transplanted, HIV carriers, ...) that can not currently benefit.
  • the invention therefore makes it possible, by the single ipose of the Implant, to obtain a biological effect in the vicinity of the implant, without additional therapeutic treatment.
  • the biological properties of the coating on the substrate, of the antibacterial and and / or healing and / or antifungal obtained especially with chifcosan or the other polymers envisaged will allow in vivo to slow down or suppress the growth of pathogenic bacteria and thus prevent complications inflammatory infectious origin, and / or promote proliferation and cell migration and thus tissue scarring.
  • Fifpre 1 shows the Infra-Red Spectrum (I) of the surface of the susotrat prepared according to Example 1, after 24 hours in salivary medium,
  • Figure 1 is a MES photograph of the chitosan layer present at the surface of the substrate of Example 1 ,. after 24h in salivary medium.
  • FIG. 3 represents an optical microscope image of the substrate of example 2 covered by chitosan under the conditions of peeHsst
  • Figure 4 shows a diagram showing the% reduction of resazurlne for the substrate of Example 4, with and without surface-immobilized chitosan after 2, 4 and days for a NIH3T3 fibroblast culture.
  • the data presents the mean ⁇ the standard cost.
  • Fi ⁇ yre SA and SB show the effects of a substrate in ⁇ on which chitosan is immobilized, according to the invention on Porphymmonas 0ngivaiis ( Figure 5A) and on Ac & nomyoes meslundii ( Figure SB) in liquid medium for 32 hours.
  • the data are expressed as a percentage of bacteria in contact with the sample according to the invention, with respect to the bacteria in contact with the titanium control sample
  • the data correspond to: the mean ⁇ the standard deviation for 3 different experiments ,
  • Figures ISA-6C show the IR spectra of the coated anodized surface obtained in Example 4, before ( Figure 6A) and after immersion in salivary medium at pH S ( Figure 8B) or 3 ( Figure 6).
  • FIG ? presents the SEM images of a covalently grafted ⁇ (a) ⁇ anodized + chitosan substrate in accordance with example 4, (b) ⁇ idem + saliva pH5 24ti, (c) ⁇ Idem + saliva pH3, 24h and (d) ) ⁇ anodized reference.
  • Figure S shows the Infra-red spectrum of the surface obtained in Comparative Example 1 before exposure to salient medium (curve starting at about 99%) and after 24 h in salient medium (curve start at about 97%).
  • FIG. 4 shows the Infra-red spectrum of the surface obtained in Comparative Example 2 before exposure to the equivalent medium (curve starting at about 81%) and after 24 hours to a salient medium (curve starting at about 61%).
  • Fifyre 10 has an MES image of the surface of Comparative Example 3 prior to exposure to saliva (a) and after exposure to saliva
  • Pure smooth titanium substrates are placed for 30 minutes in an ultrasound bath of sopropanol. They are then immersed for 15 minutes in a solution Piranha (concentrated sulfuric acid / hydrogen peroxide 30% (Sigma-Ald ich) 70: 30 vv). After rinsing with distilled water (ED) and drying, the samples are immersed for 24 hours in a solution of TESPSA (triethyloxysilyl propyl triamide anhydride, ABC) at 10% volumetric in extra-dry toluene (Sigma-Aldrich). They are then introduced into a clean solution of toluene, which will be placed for 30 minutes in an ultrasonic bath.
  • Piranha concentrated sulfuric acid / hydrogen peroxide 30%
  • ED distilled water
  • TESPSA triethyloxysilyl propyl triamide anhydride
  • This saliva medium corresponds to an artificial saliva prepared according to the method of Fusayama (H. Simon et al., "Corrosion resistance and locomotion of a new ponxts surface for titanlum implants * Eur, 1 Orai Sa ', 113 (2005): 537-545):
  • the peel-tes is carried out using a grid comb (El omeîer 1542) and a standard adhesive tape (ISO 2409), Results
  • the IR analysis of the coating makes it possible to confirm the presence of ditosane after 24 to 5 h in salivary manner.
  • Taestemt 3 scattered im imm carfame / OMy relie The ipee! Test shows that the coating adheres well to the substrate, as shown in FIG.
  • Example 2 The samples were prepared as in Example 1. The volume concentration of chitosan is modified: 3% by mass to 4% ileu,: M analyzes performed on this sample show that chitosan and its accession held in salivary medium are not modified by this changing concentration-
  • the substrate obtained was then tested in salivary medium at pHS and pH 3.
  • the artificial saliva is prepared according to the fusayama method with addition of acetic acid to the desired pH as previously described.
  • Ta Tai has 4 ⁇ p d d d d fragments fragments specific fragments
  • the samples are placed under an IN 254nm lamp at IScro of the lamp.
  • HGF-1 fibroblasts provided by American Type Culture (AICC). They are grown in the DMEM (PM) culture medium with 10% fetal calf serum and 1%
  • the cells are incubated at 37 ° C. with 5% CQi. In order to preserve and multiply the cells, a passage is made every 3 days.
  • Viability is assessed using the resazurin test after 2, 4 and 7 days of culture in the presence of substrates, 10 ⁇ of resazurin solution (Sigma-Aldnefi) at 0 1 mg / ml in PBS (PAA) are added to the culture medium (1ml). After incubation of the cells for 4 hours at 37 ° C., 200 ⁇ l of the supernatant are removed and placed in a 95-well plate. The optical density of each well is measured using a Hicropiate Reader EL 308 Bio-Teck Instrument plate reader at 570 and 630 nrn. Then you have to apply a formula that gives the percentage reduction of resazurin:
  • RET is one of the contactless culture medium with the cells The supernatant is then aspirated from the wells and, after rinsing with PBS f of middle nine is added for the next measurement,
  • the test result shows that the flbroblases develop on both the titanium and the iosane coating thus proving that the grafting is as biocompatible as the titanium with respect to these cellulase cells.
  • Titanium is known for its high molecular weight. This is a very interesting result,
  • the cell morphology is examined after 2, 4 and 7 days of culture. After fixation of the cells in a solution of glutaraldehyde (Sig maAld ich), samples are dehydrated in successive baths of 5 minutes éHianof in increasing degree (30 °, 50 e, 70% 90 ° and 100 °). Finally, the starch lilies undergo desiccation for 5 minutes in an ethanol and HD S mixture (I: i, v / v, Sigma Aidrich) and then in pure HDMS. Microscopic observation is performed with a Hitachi S800 scanning electron microscope.
  • the substrates are placed in culture dishes of 12 microwells (Dominique Outscher) and inoculated with fioroblasts at a density of
  • the cells were fixed during. The cells were then permeabilized with Triton X1D0 (PAA), which was then blocked with 10 minutes in P3 (PAA) -dehyde (Siçma-Aldrisson) form. bovine serum albumin, the microfetilamines are labeled with the fluorescent marker Alexa Fluor 488 p1ioidoid (invinogen) and the nuclei are labeled with propyloid iodide (Sigroa-Atdrich). The cells are then observed with a Zeiss LSH 510 Meta microscope (Carl Zelss),
  • P, gin0vaiis and A mesiundi bacteria are cured on blood agar in 90 mm Petri dishes for transplanting. Before each test or transplanting, a Gram control is: performed, dishes were incubated in jars at 37 e C according to the respiratory type different bacteria u generator Genbox anaer® (Biomerieux). P, gfn & vaffs is grown for 6 days prior to testing while
  • a reference tube 50 ml conical cups are used for each bacterium: a reference tube, a control tube, a tube for the sample, in which are placed the corresponding sterile pellet (with the exception of the reference) and 10 ml of bacterial suspension in Schaedler broth (Sigmaaldrich).
  • This suspension must have an optical density (OD) close to 0.300 to 550 nm in the spectrophotometer (Thermo Spectroriic). This measurement corresponds to time T.sub.T Further measurements of OD are carried out at times 11 (T.sub.t + 6h), 12 CT.sub.o + 24h), 13 (T.sub.o + 28h) and T.sub.4 C.sub.TQ + 32. Meanwhile, the tubes are set. Incubate at 37 ° C in jars in the presence of GENbox anaer®.
  • the chitosan coating induces a strong inhibition of the development of the A strain eslundB (60% compared to the control after 28 of bacterial growth - Figyre SB), On the other hand the nhiàtion of P.gmgivaHs (Figure SA) is lower. This, however, proves that the ch osane coating has many anti-bacterial properties.
  • the smooth pure titanium substrates (TEKKA) are anodized before the covalent grafting.
  • the titanium electrode constitutes the anode and the counter electrode used is a platinum electrode.
  • the anodatization is carried out at room temperature and with magnetic stirring. The conditions used are given T water 4.
  • Reagents are provided by Sgma-Aldrich.
  • the substrates are then placed for 30 minutes under ultrasound in a water / acetone bath (50:50, v: v). Coating
  • the substrates are then immersed for 15 minutes in a solution Piranha (concentrated sulfuric acid / hydrogen peroxide 30% (Sigma-Aldrich) 70: 30 v / v). After rinsing with distilled water (ED) and drying, the samples are immersed 24h in a solution of TESPSA (anhydride triethoxysilylpropylsulicylic acid, ABCR) at 10% by volume in extra-dry toluene (3 ⁇ 4ma-aldfi " ch) are then introduced into a clean toluene solution, which will be dissolved for 30 minutes in an ultrasonic bath.
  • Piranha concentrated sulfuric acid / hydrogen peroxide 30%
  • ED distilled water
  • TESPSA anhydride triethoxysilylpropylsulicylic acid
  • Example l f One proceeds according to Example l f using substrates TA6% V 4% (Titanium Alloy 90%, 6% aluminum and vanadium: 4%, 5 TlHETj medium Test salivary acid.
  • Example 2 The procedure is as in Example 1, using Nickel / Titanium ( ⁇ ) (TIMET) substrates.
  • This artificial saliva is prepared according to Fusayama's method.
  • the samples are left in this medium for 24 hours, peas removed and rinsed with ⁇ .
  • the samples are then analyzed in I.
  • the smooth pure titanium (TMI) substrates are placed in ultrasonic bath in an isopropanol bath. They are then immersed for 15 minutes in a Piranha solution (concentrated sulfuric acid / 30% hydrogen peroxide (Slgma-Aldrich) 70: 30 vv). After rinsing with distilled water (ED) and drying, the samples are immersed in a solution of TESBA 2-methoxysilylbutyraldehyde (A8CR) at 2% by volume in toluene extra-dry (Sigma-aldrich). They are then introduced into a solution of clean anhydrous toluene, which is then placed in an ultrasonic bath for 30 minutes.
  • Piranha solution concentrated sulfuric acid / 30% hydrogen peroxide (Slgma-Aldrich) 70: 30 vv.
  • ED distilled water
  • A8CR 2-methoxysilylbutyraldehyde
  • A8CR 2-methoxysilylbutyral
  • Fi ⁇ yre ⁇ shows that no characteristic band of chitosan is present after soaking for 24 hours in a salivary medium. We even see the characteristic strip of titanium (1150 cm -1 ).
  • the smooth pure titanium substrates ( ⁇ ) are placed for 30 minutes under ultrasound in a disopropanol bath. They are then immersed for 15 minutes in a Piranha solution (concentrated solfuric acid / 30% hydrogen peroxide (Stgma-aldrich) 70: 30 v / v). After rinsing with distilled water (ED) and drying, the samples are immersed for 24 hours in a solution of dopamine (500 mg of dopamine per 10 ml of deionized water). The substrates are then rinsed with deionized water and introduced into a 3% solution of glutaraldehyde (Sigma-aidrich) in deionized water for 24 hours.
  • the samples are left for 24 hours in this medium, then removed and rinsed with 1 ⁇ .
  • the samples are then analyzed at R.
  • the smooth pure titanium ( ⁇ ) substrates are sonicated for 30 minutes in an isopropanol bath. They are then immersed for 15 minutes in a Piranha solution (concentrated sulfuric acid / 30% hydrogen peroxide (Sigma-aldldi) 70: 30 v / v). After rinsing with distilled water (ED) and drying, the samples are immersed in a solution of AFTES (3-aminopropyltriethoxysilane, AUC) at 3% by volume in extra dry toluene. They are then introduced into a solution of clean anhydrous toluene, which is then placed in an ultrasonic bath for 30 minutes.
  • Piranha solution concentrated sulfuric acid / 30% hydrogen peroxide (Sigma-aldldi) 70: 30 v / v).
  • ED distilled water
  • AFTES 3-aminopropyltriethoxysilane
  • the substrates obtained were then tested in pH5 salivary medium.
  • This artificial saliva is prepared according to Fusayama's method. Samples are left 24h in this medium, then removed and rinsed with ED. The samples are then analyzed in I.
  • the substrates of Ta6V are placed for 30 minutes under ultrasound in an isopropanol bath. They are then immersed for 10 minutes in a solution Piranha (concentrated sulphuric acid / hydrogen peroxide 30% (Sigma-Aid rich) 70: 30 v / v). After rinsing with distilled water (ED) and drying, the samples are immersed for 24 hours in a solution of 10% volumetric diisopropyltrimethoxysilane (A8CR) in extra-toluene (Sigma-Aldiich). toluene solution clean, which will be put 30 minutes in an ultrasonic bath.
  • Piranha concentrated sulphuric acid / hydrogen peroxide 30%
  • This operation is repeated with DMF and then with distilled water, to obtain a duration of 90 minutes in total in the ultrasonic bath.
  • the substrate is finally rinsed with ethanol and dried at room temperature. It is then dip-coated with a solution of low molecular weight chitosan ( ⁇ 6000 g / ml) at 4% by mass (Slgma-Aldnch) dissolved in an acidic solution (3% acetic acid + ED After coating, the sample is dried at 80 ° C. for 4 hours. The resulting bond is illustrated on the SOIEHA 5 below.
  • the substrates obtained were then tested in a salivary medium identical to Example 1, but for 24 hours at pH 3 and 24 hours at pH 5. After 24 hours at pH 5, a large remainder of chltosan was visible in SEM. After 24 hours at pH 3, the analysis confirms that Î ie coating tosane c is always present

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Abstract

La présente invention concerne un substrat composé d'une matière choisie parmi le titane ou un de ses alliages sur lequel au moins un polymère présentant une activité biologique, choisi parmi le chitosane, le collagène et leurs dérivés, est immobilisé de manière covalente grâce à une entité de liaison (EL) établissant une liaison peptidique; -CO-NH-, urée : -NH-C(O)-NH- ou thio-urée : -NH-C(S)-NH- sur les fonctions -MH2 présentes sur le polymère avant son greffage et qui correspondent à des fonctions -NH2 présentes sur le chitosane ou le collagène à l'état naturel, ou, dans le cas du chitosane et de ses dérivés, établissant une liaison uréthane : -NH-C(O)-O- ou thiouréthane : -NH-C(S)-O- sur les fonctions -OH présentes sur le polymère avant son greffage et qui correspondent à des fonctions -OH présentes sur le chitosane à l'état naturel, ainsi que leur procédé de préparation.

Description

adaptés à la onstitui z d'implant pour prothèse: médicale ou chirurgicale.
Un problème majeur dans la pose d'Implants médicaux ou chirurgicaux est lié aux risques d nfecSon, Actuellement, les risques dlnfection post opératoires sont limités par la veille scrupuleuse du respect de conditions opératoires stériles et éventuellement par des prescriptions médicamenteuses du type antibiotique et/ou antiseptique» Cependant, les patients à risque, tels que les diabétiques, les porteurs de greffes ou les porteurs du virus HIV, restent à ce jour exclus de ce ty de soin*
Afin de tenter de remédier à de tels problèmes, différentes solutions ont déjà été envisagées dans fart antérieur. Par exemple, Il a été proposé de recouvrir la surface d'implants dentaires avec un peptlde présentant me activité antim&robiertne dans la demande US 2010/0150985. Ce document concerne exclusivement 11 m mobilisation de peptldes, ce qui Imite fortement les spectres d'activités obtenus.
Le document WO 2004/084966... quant à lui, propos de recouvrir la surface dimpiants dentaires avec un revêtement constitué d'un polymère à base de P et de N, par liaison covaiente. Dans ce document, la liaison entre le poiymère et la surface est: réalisée grâce m a inosifane ou à un acide alkylphosptaique. Aucune élude: de stabilité en milieu sallvaire n'est menée et, les inventeurs de la présente invention, considèrent que vraisemblablement compte tenu des Maisons mises en jeu entre le groupe amino et le polymère, le lien covalent utilisé ne permet pas de maintenir durablement le poiymère Immobilisé sur l'implant dans un milieu aqueux acid telle que fa salive.
On peut également citer le brevet US 6 129956 décrit un procédé dlmmob sation de l'acide yaîuroniqye ou de polymères présentant des groupements COGH sur un substrat Deux procédés sont décrits : l'un utilise une solution aqueuse d'akoxyde de silicium, d'AFTES et d'acide iiyaluronlque qui est déposée sur le substrat de titane. Compt tenu de l'encombrement stérique du polymère et du fait que l'alœxyde de silicium est « noyé » dans le polymère, la liaison entre l'alcoxysllane et le substrat est vraisemblablement faible. Par ailleurs, il est cornu qu'en milieu aqueux, les alcoxydes de silicium stiydrolysent et condensent pour former des liaisons Si- O-SI qui ne sont plus réactives vis à vis du substrat. Pour ces deux raisons, le taux de greffage du polymère à la surface du substrat est très certainement très faible et donc peu efficace. L'autre procédé utilise la PolyEthyienelmlne (PEI) pour lier le polymère au substrat. Or, 1 est connu que le PEI est immobilisé sur le substrat selon des liaisons électrostatiques. Outre le fat que ces liaisons sont faibles, facilement: clIvabJes et m résistent: pas aux agressions buccales, il , par ailleurs, été démontré que le PEI est toxique vis-à-vis des cellules buccales (ostéo lastes et Hbrobfastes) ( Brunei et al Bioma erîsis, 28 (2007) 632-640),
Dans ie cadre de ['invention, les. inventeurs se sont plus précisément intéressés à l'immobilisation, du chltosane et du colla§ène qui présentent: des propriétés biologiques Intéressantes, sur des substrats â base de titane le plus souvent, utilisés dans le domaine des Implants dentaires.. Le c ltosane est notamment, connu pour ses propriétés antibactériennes et 1e col agène facilite la cicatrisation,
Plusieurs mét odes de dépôt du chltosane sur des substrats, et notamment sur des substrats à base de titane, ont été décrites dans l'art antérieur, La première méthode, de loin la plus simple, consiste à dépose simplement (par « dip » ou * spln coating ») une solution aqueuse de chltosane sur un substrat. Dans ce cas, aucune liaison n'existe entre le substrat et: le chltosane, Cette méthode est utilisée dans la littérature lorsqu'il est souhaité une: restitution rapide et totale du polymère.
D'autres méthodes permettant de former une liaison covaiente entre le c ltosane et le titane ont également été décrites. Une de ces méthodes utilise comme intermédiaires de liaison de la dopamine et du glutaraldéhyde (T. Y. Lim et ai 3, Hâter, Sci.# 2ÔQ9 (20), 1-10), une autre consiste à utiliser de i 'APTES {AmlnoFropyiThEthoxv'Silane) ou de I1CPTES (Isocyantopropyltfletrioxysîlane) (H. 3, Martin et al, Thin Solîd Films, 2008 (516), 6277~628et Y. Yuan, et al. 3 Biomeef Hâter es Part B: AppI Biomater, 2008 (86B), 245-252) et du glutaraidéhyde, et enfin, une dernière, utilise du TESBÂ (TrEthoxSI ButyrAl fehyde) (H. 3. Martin et al, T in Solid Films, 2008 (516), 6277-628 et H. 3. Nartîn, et al Applied Surface Science,, 2008
La métnode utilisant te dopamine et te glutaraidéhyde (T. Y. tim et si 3. Mater. Sel, 2ÔÛ9 (20}, i-10) consiste à créer deux liaisons cova lentes entre la dopamine et les groupements hydrsxy comme présenté sur le SCHEMA 1 ci-dessous, puis à faire réagir le glutaraidéhyde pour obtenir une fonction aldéhyde en fin de chaîne. Celle-ci permet ensuite de créer y ne liaison avec la fonction amîrse du c ltosane.
Figure imgf000004_0001
La méthode utllsant i'APTES et le glutaraidéhyde (H. 1, Martin et alf
Thin Soîld Rlms, 2008 (516), 6277-628) consiste à faire réagir I'APTES sur la surface de titane traitée pour obtenir une liaison
Figure imgf000004_0002
(SCHEMA 2 ci-après), Comme pour le procédé avec, la dopamine, c'est ensuite ia fonction aminé qui réagit avec le glutaraidéhyde, donnant une fonction imine, mais surtout une fonction aldéhyde en fin de chaîne.
Figure imgf000005_0001
Qfitralrement aux deux autres procédés, la méthode utilisant du TES8 (H, X Martin ef a/., Thin Soiid F!m¾ 2008 (51.6), 6277-628 et H. J. Martin, ef a/. Applied Surface Science, 2008 (254), 4599-4605} a l'avantage de ne comporter que deux étapes. Mais, contrairement au procédé utilisant la dopamine, te ΤΈ5ΒΑ ne s'attache au titane que par le biais d'une unique liaison covalente comme illustré sur le SCHf¾â 3 ci-dessous. Comme FAITES, le TESB est un alcoxysilane fonctionnalisé, mais i! possède directement la fonction aldéhyde en fin de chaîne. Cec permet d'économiser l'étape du glutaraldéhyde, permettant d'o tenir cette fonction en bout de chaîne,
Figure imgf000005_0002
Joules ces méthodes mettent: en œuvre une liaison de type imlne connue de la littérature comme peu stable en milieu acide comme cela a été confirmé par les inventeurs de la présente -demande de brevet et comme l'attestent les exemples comparatifs donnés dans la suite de îa description,
Le: document EP i 308 177 propose également l'utilisation d'un f lm de chitosane en surface dimplant, afin: d'augmenter {'adhérence des cellules, La méthode décrite qui consiste à immerger on Implant en titane dans une solution de chitosane en présence d'acide acétique, conduit à une immobilisation instable du chitosane en milieu aqueux acide telle que la salive,
Enfin, Il convient de noter que le document WO 2005/089829, souligne que l'utilisation de liaison covalente entre m substrat et une protéine active affecte l'activité d la protéine et préconise de ce fait une Immobilisation sans liaison covatente.
La présente invention vise à remédier aux incon énient ci-dessus, en termes de stabilité de fa liaison substrat-polymère.
Dans ce contexte, la présente invention propose de réaliser des substrats adaptés à la réalisation d'implants revêtus d'un polymère présentant une activité biologique choisi parmi le chitosane, le collagène et leurs dérivés, qui présentent une stabilité satisfaisante dans un milieu aqueux de pH proche de 5 otammen , simulant: des milieux physiologiques, tels que la salive, La solution proposée se doit de permettre le maintien de propriétés biologiques satisfaisantes pour le polymère Immobilisé.
Ainsi, la présente invention a pour objet un substrat composé d'une matière choisie parmi le titane ou un de ses alliages sur lequei au moins un polymère présentant uns activité biologique, choisi parmi le chitosane, ie collagène et leurs dérivés, est immobilisé de manière covalente grâce à une entité de liaison Et établissant une liaison peptldique : -CO-NH-, urée H~C(0)~ H~ ou thlo-urée : - H-C SJ-NH- sur les fonctions -Nhfe présentes sur le polymère avant son greffage et qui correspondent à des fonctions -Nr présentes sur le chitosane ou le collagène à l'état naturel, ou, dans le cas du chitosane et de ses dérivés, établissant une liaison urét ane ; ■~NR-C(0)~O ou thio-uréthane : -NH-C{S)-0- sur les fonctions -OH présentes sur le polymère avant son greffage et qui correspondent à des fonctions ~GB présentes sur le chitosane à l'état naturel
La présente Invention a également pour objet les procédés de préparation de tels substrats tels que décrits d-après. Le collagène et le chitosane sont des polymères naturels. Par dérivés de ces derniers, on entend des polymères correspondant au collagène ou au chitosane et qui présentent une ou plusieurs substitutions qui rfaftère{nt} pas l'activité biologique recherchée. Les dérivés du collagène utilisés comportent,, avant liaison au substrat, des fondons - H2 présentes sur les formes naturelles du collagène. Les dérivés du chitosane utilisés comportent, avant liaison au substrat, des foncions -H 2 et/ou des fonctions -OH présentes sur ies formes naturelles du chitosane, qui vont servir pour l mmobllisation de ces derniers selon les liaisons covalentes stables envisagées dans le cadre de l'Invention,
Le chitosane peut être défini comme un poiyoside d'unités D- giucosamïne et d'unités -acétyl-D-glucosamine liées en 8-(î-4), le plus souvent reparties selon une distribution aléatoire. Le chitosane est: produit par désacétylatlon chimique (en milieu alcalin) ou enzymatkgue de la chitine.
Les sources principales de chitine sont les exosquelettes des arthropodes (crustacés) et les endosquelettes des céphalopodes {calamars»,,). Le degré d'acétyla ion (DA) du chitosane qui correspond au pourcentage d'unités acétyïées par rapport au nombre d'unités totales, est inférieur à 50%. Le chitosane est soluble en milieu acide contrairement à la chitine qui est Insoluble, Les unités désaeétylées Incluent des fonctions NH2 qui sont utilisées dans le cadre de ilnvention pour réaliser des liaisons de type peptldlque, urée, ou tfiio-urée permettant dinirnooiliser,. de manière covalente, ie olymère sur le substrat.
Figure imgf000007_0001
Le chitosane inclut également des fonctions OH qui sont utilisées dans le cadre de l'invention pour réaliser des liaisons de type uréthane ou thlo- uréthane permettant d'immobiliser, de manière covalente, le polymère sur le substrat Dans te cadre de l'Invention, tout type de chtfcosarae peut être utilisé. îl est notamment possible dlmmobiliser de manière covaJente un chitosane présentant, par exemple, m degré d'acétyiatfofi (DA) de Î5 à 25% et un bas poids moléculaire, notamment de masse i¾ inférieure à 6000g, mo "1.
Dans ie cas du collagène, ce sont les fonctions NH2 libres présentes sur certains des acides aminés constitutifs du collagèrte qui vont permettre de former les liaisons de type peptldique, urée ou thio-urée.
Dans le cadre de l'Invention, I est possible d'immobiliser sur le substrat un seul t de polymère ou différents polymères, par exemple deux ou trois polymères différents, de manière à obtenir simultanément différents effets biologiques sou aités ou un effet biologique plus performant.
Selon l'Invention, du fait: de leurs propriétés spécifiques, le ou les polymères cliolsls parmi ie chitosane, ie ollagéne et leurs dérivés, immobilisés sur des revêtements Implantaires, permettra d'accélérer l'ensemble des étapes du processus de cicatrisation en favorisant l'hémostase, la stimulation des macrophages et la prolifération des fibroblastes. Parallèlement, les propriétés bactériostatiques et fongi statiques du chitosane vis-à-vis d'un large spectre de bactéries et de champignons permettront de limiter la contamination bactérienne et les risques de mycoses.
te substrat est composé de titane ou d'un ail âge de titane, notamment utilisé dans la conception d'Implant pour prothèse. En particulier, le substrat peut être composé d'une matière choisie parmi ie titane, tes alliages de titane avec 1e nickel, notamment dans un rapport atomique Mi/ΊΊ de 40/60 à 60/40 et plus particulièrement de 50/50, et les alliages de titane avec le zirconium, ie fer, le nio ium, l'aluminium, le molybdène et/ou le vanadium, notamment dans un rapport atomique M/Ti inférieur à 40/60,. M représentant le zirconium, le fer, 1e nlobium, l'aluminium, le molybdène, le vanadium ou un de leur mélange.
De manière avantageuse, le substrat aura pu être préalablement préparé, avant le greffage du polymère, de manièr à présenter une rugosité moyenne appartenant à la gamme allant de 2 nm à 1.00 pm. La rugosité moyenne du substrat pourra être déterminée par Analyse s Force Atomique,
Une telle rugosité moyenne permet par la suite d'accroître la surface sur laquelle le polymère va pouvoir être greffé. De manière avantageuse, Le taux de greffage pourrait être de 1. à 15 molécules de polymère / nm2. Pour calculer ce taux de greffage, \\ est possi le d'utiliser des analyses par ATG ou des dosages chimiques.,
L'otoHon d'une telle surface spécifique peut notamment être obtenue selon deux voies différentes :
(i) un traitement éiê trechimique du substrat par anociisa on. Dans ce cas, la surface spécifique donnée ci -dessu correspond à la surface spécifique du substrat en titane ou en un alliage de titane, en tant que tel ;
(il) un dépôt d'une couche de silice poreuse sur le substrat, Une telle couche de silice peut être obtenue par procédé sol-gel, suivi d'un traitement thermique à une température appartenant à la gamme allant: de 100 à 700°C, et en particulier à une température de Tordre de 300°C Dans ce cas, la surface spécifique donnée ci-dessus correspond à la. surface spécifique de la couche de silice poreuse déposée sur le substrat en titane ou en un alliage de titane.
Une anodîsatlon en solution aqueuse permet de créer une microrugosité ou une mîcrostructyratlon de la surface du substrat. Il est possible d'utiliser notamment une anodîsatlon en présence d'acide su!furique, notamment à une concentration molaire (comm décrit notamment par D, Capek;( et al, Surface and Coating Tec , 2008, 202, 1379-1384), ou en présence d'un mélange de fluorure d'ammonium et de sulfate d'ammonium (comme décrit notamment par Z, Lockman, et aL 1 ofAfïoys and Compounds* 2010, 503, 359-364), ou encore en présence d'un mélange de fluorure d'ammonium et d'éthylène glycoi (comme décrit notamment par S, II, et al, 1 P ys. C em, C 2009, 113, 12759-12765),
Dans le cadre de ( nvention, 1 entité de liaison EL correspond, de préférence, à l'en hainement suivant ; dans lequel :
- M représente un atome de titane du substrat,,
- Fi représente y ne couche de silice poreuse liée à M par une liaison - M-0~$! et à O-X par une liaison Si-O-X,
- n est égal à ô ou i,
- X représente n atome de silicium ou de phosphore,
- ¥2 représente ~ CH2)m~[V {CH2)p:] ~Y2i avec m qui est égal à î, 2, 3,
4, 5 ou 6 ; p qui est égal à 1, 2, 3r 4, 5 m 6 ; q qui est; égal à 0 ou 1 ; et: Yi et Y2 qui sont définis comme suit :
o soit Y2 représente -{CQ)-NH- et Y* représente™ H-C(0}~ o sot Y2 et Yi sont identiques et représentent -NH-C{Z)~NH avec Z ~ G ou S,
o soit Y2 représente ~ H-C(Z)-0- et Yt représente - H~C(Z H avec Z = Q ou S,
Dans les définitions données ci-dessus» la lecture des substituants se fait toujours de la gauche vers ia droite.
Selon des modes de réalisation particuliers, q~ô et/ou X représente un atome de silicium et/ou HF2 représente ~{<¾}3-00-ΝΗ-,
Dans la définition de X, bien entendu lorsque X est: un atome de silicium, ce dernier n'est pas lié uniquement à l'atome d'oxygène et a ¥2 représenté dans ia définition de EL, mais à d'autres atomes non représentés pour avoir la valence souhaitée. De manière plus précise, on pourrait indiquer X-SiZî i avec Zt et ¾ ui sont deux atomes choisis parmi les atomes d'oxygène e de carbone, l'atome de silicium provenant: de la réaction d'un afcoxysilane, d'un hydroxysi!ane ou d'un hvdroxyalcoxysilane sur les fonctions OH de surface comme expliqué dans la description qui va suivre, en relation avec le procédé d'obtention des substrats. De même,, lorsque X est m atome de phosphore, ce dernier n'est pas lé uniquement a l'atome d'oxygène et à F2 représenté dans ia définition de EL, mais à d'autres atomes non représentés pour avoir la valence souhaitée.. De manière plus précise, on pourrait indiquer que X=P(0)Z'i avec Z qui est un atome choisi iô
parmi les atomes d'oxygène et: de carbone, fatome de phosphore provenant de ia réaction d'un phosphonate sur les ondions OH de surface comme expliqué dans la description qui va suivre, en relation avec le procédé d'obtention des su strats,
Les substrats selon ilnventlon sont stables en milieu aqueux acide et sont parfaitement adaptés à la fabrication d mplant dentaire. Dans le cadre de ilnvenUon, à titre de référence, la stabilité en milieu aqueux acide et la stabilité à l'hydrolyse en milieu acide pourra être mise en évidence en Immergeant à 22°C le substrat dans un milieu aqueux de pH-5 décrit par Fusayama (M. Simon et al, '"Corrosion résistance and biocompatibiity of a ne porous s rface for t-tanium implants", Eur, 1 O fScL 113 (2005) 537- 545} dont la composition exacts est: donnée dans les exemples qui vont suivre. En particulier- les liens covaients mis en œuvre sont considérés comme stables.,, car dans ces conditions., avec les substrats selon Ilnventlon, on observe toujours après 24 heures, voire même après 48 heures, la présence de polymère bioactff, par analyse infra-rouge du substrat m par analyse chimique par spectrosœpie de pliotoéiectron X,
Oe plus, des propriétés biologiques du polymère greffé sont conservées, le greffage chimique n'entraînant pas une perte de propriétés,
Selon un premie mode de réalisation des substrats selon 1 nvention,. n-0. Dans ce cas, l'entité de liaison EL peut être obtenue par réaction sur des fonctions -OH présentes en surface du substrat: :
·· dans le cas où q=Q, d'un aîcoxysiane, d'un h droxysilane, d'un hydroxyaicoxysîiane ou d'un phosphonate porteur d'une fonction acide carboxylîque (î), anhydride {2}r ester (3), haiogénure d'acide (4);f
Isocyanate N~C~Q (S) ou tfclocyanate : -H-C-S (6)f suivie, dans le cas des fonctions £1) à (6) d'un couplage avec le polymère par réaction avec une fonction— Ha présente sur le polymère, ou dans le cas des fonctions (5) et (6) d¾n couplage avec le chitosane ou un de ses dérivés par réaction avec une fonction -OH présente sur ledit polymère. II
- dans le cas où q=î, d'un alcoxysslane, d'un hydroxysiiane, d'un droxyalcoxysilane m d'un phosphonate porteur d'un groupement - (OÎ2)m- H2 avec m qui est égal à lt 2, 3, 4, S ou 6 , suivi d'un couplage avec un réactif Y3KCH2 Y3 avec p qui est égal à 1 2, 3, 4, 5 ou 6 et Y3 qui est choisi parmi les fonctions acide carboxyliqye (1), anhydride (2), ester (3), halogénure d'acide (4), isocyanate :- N=C=0 (5) ou thiocyanate : -N=C=S (6), en présence du pol mère à immobiliser. L'une des fonctions Y3 va alors réagir sur une fonction - N¾ présente en surface du substrat et l'autre sur une fonction présente sur le polymère qui correspond soit à une fonction - H2 dans le cas des fonctions (i) à (6), soit dans le cas des fonctions (5) et (8) à une fonction -OH présente sur le chitosane ou son dérivé, Les fonctions halogénure d'acide peuvent notamment correspondre à un chlorure d¾clde (-C{0)C1). Les fonctions anhydride -C(0) "C(0) peuvent notamment correspondre à des groupements tels que :
Figure imgf000012_0001
A titre d'exemple de fonctions esters, on peut citer ~C(0)O ' avec R' = méthyle ou éthyle.
Afin de présenter en surface des fonctions Ti-OH réactives, le substrat en Stane ou en un alliage de titane sera, le plus souvent, soumis à un traitement chimique oxydant préalable, par action d'un mélange d'acide et d'agent oxydant tel qu'un mélange d'acide suifurique et d'eau oxygénée, ou par une passlvation, par action du réactif de roii (acide nitrique), ou par traitement chimique dans un mélange NaOH + alcool Lorsque le substrat est: également: soumis â une réaction d'anodfsation, celle-ci sera, de préférence, réalisée préalaolement à ce traitement oxydant
Selon un deuxième mode die réalisation des substrats selon l'Invention,, n est égal à I. ce qui signifie que il est un lien covalent établi par l'intermédiaire d'une couche de silice poreuse déposée sur le substrat et sur laquelle le polymère est greffé. Dans ce cas, la couche de silice est avantageusement obtenue par procédé sol-gel, suivi d'un traitement thermique à une température appartenant à 1s gamme allant de i00°C à 70Ô°C
L'entité de laissa EL peut alors être complétée, par réaction sur des fonctions -OH présentes en surface de la couche de siiice :
- dans e cas où q=G, d'un afœxysfïane, d'un hvdroxysilane, d'un hydroxyaicoxysiiane ou d'un phosphonate porteur d'une fonction acide carboxyli ue (1), anhydride (2), ester (3% halogériure d'acide (4), isocyanate :-N=€=0 (5) ou ttiiocyanate : -N=C=S (6), suivie, dans le cas des fonctions (i) à (6) d'un couplage avec ie polymère par réaction avec une fonction ~ H2 présente sur le polymère, ou dans ie cas des fonctions (5) et (6) d'un couplage avec le chitosane ou un de ses dérivés par réaction avec une fonction -OH présente sur ledit polymère.
- dans te cas ou q-t, d'u alcoxysilane, d'un hydroxysiiane, d'un hydroxyal-coxyîiiane ou d'un phosphonate porteu d'un groupemen -(CHJW HÎ avec m qui est égal à 1, 2f 3f 4, 5 ou 6 , suivi d'un ■couplage avec un réactif YHCHa Yi avec p qui est égal à X, 2t 3, 4, 5 ou 6 et Y3 ui est choisi parmi les fonctions acide car oxylique (i), anhydride (2),, ester (3), alogénure d'acide (4), isocyanate :~N~O0 (S) ou thiocyanate ; ~N=0=S (6), en présence du polymère à immobiliser. L'une des fonctions Y3 va alors réagir sur une fonction ~NH2 présente en surface de la couche de silice et l'autre sur une fonction présente sur le polymère qui correspond soit à une fonction ~NH?. dans le cas des fonctions (i) à (6), soit dans le cas des fonctions (5) et (6) à une fonction -OH présente sur le chitosane ou
La couche de silice poreuse intermédiaire recouvrant le substrat présente des fonctions OH résiduelles, du fait notamment de l mise en œuvre du procédé sol-gel. Les procédés sol-gel sont ien connus de l'homme du métier. Néanmoins, pour plus de détails sur ie procédé soi -gel qui peut être mis en œuvre, on pourra se référer à î)~ Techniques de l'ingénieur : Î3
Procédé sol-gel de polymérisation, Référence 35820, Date de publication : 10 déc. 2005, Pierre AUDEBERT, Fabien MIO A DRE ou 2} Cahier Technologique sol-gel, CERTECH asbl (Œntre de Ressources TEchnologîques en CHImle). Par ailleurs, Il est connu que la couche de silice obtenue après un traitement thermique, notamment sous air, à une température appartenant à la gamme allant de 100 à 7Ô0°C est robuste est stable en milieu aqueux ac de. Il s'établit des liaisons covalentes Ti-O-Si entre le substrat et la couche de silice, La couche de silice intermédiaire, présente, par exemple, une épaisseur pouvant aller jusqu'à 10 pm,
Quel que soit le procédé mis en œuvre, il est possible d'utiliser un aleoxysiiane, hydrox sîlane ou phûsptorate répondant à l'une des formules ci-après :
(RaO)3SI- toi (RaO)3Si(R )¾ (TOS ^ (¾0}2P(0)(R¾) ou (R30) (0)(R¾)2 avec Ra qui représente un atome d'hydrogène ou un groupe al ège de 1 à 4 atomes de carbone, et par exemple un groupe méthyle ou éthyle, et R¾ qui représente :
- dans le cas oy q~Ûf
Figure imgf000014_0001
avec m qui est égal à 1, 2, 3, ,. 5 ou 6 et: Ï2 qui est une fonction réactive choisie parmi les fonctions anhydride, comme par exemple ;
Figure imgf000014_0002
acide œrboxylique, ester, halogénure d'acide, isocyanate (-N=O0) ou thiocyanate (-N=C=S),
- dans le cas où q~l, - CH2)œ-MH2avec m qui est égal à ï:i 2, 3, 4, 5 ou 6.
La partie GRa va réagir avec une fonction -OH présente en surface du substrat ou de la couche de silice Intermédiaire, alors que ;
- dans le cas où q-û, la fonction Y2 va réagir avec une fonction réactive -NHi ou -OH, en fonction des cas, présente sur le polymère bioactif à greffer, afin de former un lien peptîdiq e, urée, thio-urée, uréthane thîo-uréthane..
- dans le cas ou q-l( la fonction ~ H2 de Y2 va réagir avec un réactif intermédiaire Ya-CCHa ^ te! que précédemment défini : une fonction réactive Y3 va réagir avec une fonction réactive -¾ i présente en surface du su strat ou de la couche de silice intermédiaire et l'autre fonction Y3 va réagir avec une fonction réactive -Nl¼ ou -OH, en fonction des cas,, présente sur le polymère bioactif à greffer, afin de former on lien peptldique urée, ttilo-yrée, uréttiane ou thio-urétfiane.
De telles réactions pourront être menées dans les conditions suivantes ;
- Réaction dans solvant apofaire (par exemple, toluène, exane, éther diéthyilque par exemple) pour le greffage de alccxysilane, I droxysllan8, I tsyd roxya icoxy s lane ou du phosphonate à température ambiante,, puis rinçage avec m. milieu polaire (par exemple, DMF, Eau, THF, acétonitrfe,.,),
~ Pour le couplage du polymère, ce dernier pourra être solubilisé en milieu légèrement acide (par exemple dans un mélange eau / acide acétique). Le greffage du polymère sur le substrat peut ensuite être réalisé à température ambiante et éventuellement catalysé par un réactif tel que i¾ C ou le DOC ou par tout autre catalyseur connu pour un couplage peptidique.
Ensuite,, le substrat pourra être rincé et séché selon toute technique bien connue de l'homme de l'art, Un séchage est: ensuite généralement réalisé à des températures entre 50 et i5Ô°C De manière préférée, le polymère forme un revêtement homogène,
Les substrats selon l'invention peuvent: être utilisés pour la fabrication de tout type dimplant pour prothèse médicale ou chirurgicale, et notamment dimplant dentaire ou dimplant orthopédique*
Aussi, selon des modes de réalisation particuliers, le substrat selon l'invention se présente sous la forme d'un implant pour prothèse, et notamment d'un Implant pour prothèse dentaire ou protfièse orthopédique. La forme de f implant peut être plus ou moins complexe. Dans c cas, te substrat porteur du polymère bioactif sera stérilisé, avant Implantation dan l'organisme, selon une technique de stérilisation: n'affectant pas f ntégrité du polymère bïoacîif, Notamment, une stérilisation autoclave, par rayons gamma, ou avec de l'oxyde d-'ét ylèoe pourra être mise en œuvre.
La présente nvention est particulièrement adaptée au greffage do chstosane sur des substrats constitués de titane ou d'un alliage de titane, se présentant notamment sous ia forme d'un Implant pour prothèse deotalre.
Dans le cadre de l nvention, du fat de limmobillsatton du polymère bioactif sur le substrat, par un lien covalent qui met en jeu au moins une liaison pepti ique ~C(G}- H-f une liaison urée -NH-C(0)-MH- ou thlo-yrée- NH-G'G^ H, ou encore une liaison uréthane ~ Η (ϋ) ~ ou thio-uréthane ~MH-C(S}-0- (ces liaisons intervenant du substrat vers le polymère}, qui est: stable à ilivdrolyse en milieu acide, il est possible d'envisager la possibilité de conserver le polymère bioactif sur l'Implant même en milieu acide, notamment à un pH de S,, ce qui correspond notamment au milieu sallvaire. Il est ainsi possible de limiter les complications post opératoires, tels que les risques dlnfeetion ou d'inflammation, suite à la pose d'implants pour prothèse constitués avec un substrat selon I nvention* L nvenJon ouvre donc l'accès à la pose d mplants, et notamment à une thérapeutique implantaire dans le cas des Implants dentaires, pou des patients à risque (diabétiques, greffés, porteurs HIV,,.) ne pouvant à ce jour pas en bénéficier.
En effet, il a été démontré, dans le cadre de l'invention, que ma gre la liaison covalente permettant d'immobiliser ie polymère bioactif, il est possible de conserver une activité biologique du polymère initial,, et ce de manière prolongée, L'Invention rend donc possible, par la seule ipose de l'Implant, l'obtention d'un effet biologique à proximité de l'implant, sans traitement thérapeutique additionnel En particulier, les propriétés biologiques du revêtement sur le substrat, de type antfbactériennes et/ou cicatrisantes et/ou antifongiques obtenues notamment avec ie chifcosane ou les autres polymères envisagés, permettront in vivo de ralentir ou de supprimer ia croissance de bactéries pathogènes et donc de prévenir des complications inflammatoires d'origine infectieuse, et/ou de favoriser a prolifération et la migration cellulaire et donc la cicatrisation tissuialre.
Les exemples ci-après,, en référence aux figures annexées,, permettent d'illustrer l'Invention mais n'ont aucun caractère limitatif.
La Fifpre 1 présente le Spectre Infra-Rouge (I ) de la surface du susotrat préparé conformément à l'exemple i, après 24 heures en milieu salivaire,
La Figure l est une photographie MES de la couche de chitosane présente à la surfac du substrat de l'exemple i,. après 24h en milieu salivaire.
La Figure 3 représente une image de microscope optique du substrat de l'exemple 2 recouvert par du chitosane dans les conditions de peeHsst
La Figure 4 présente un diagramme représentant le % de réduction de la resazurlne pour le substrat de l'exemple 4, avec et sans chitosane immobilisé en surface après 2, 4 et ? jours pour une culture de fibrobiastes NIH3T3. Les données présentent la moyenne ± l'éca t type.
Les Fi§yre SA et SB montrent les effets d'un substrat en ΊΗ sur lequel du chitosane est immobilisé,, conformément à l'Invention sur Porphymmonas 0ngivaiis (Figure 5A} et sur Ac&nomyoes meslundii (Figure SB} en milieu liquide pendant 32 heures. Les données sont exprimées en pourcentage de bactéries en contact avec l'échantillon selon l'invention, par rapport aux bactéries en contact ave l'échantillon contrôle m titane. Les données correspondent: à la moyenne ± l'écart type pour 3 expérimentations différentes,
Les Figures ISA à 6C présentent les spectres IR de la surface anodlsée revêtue obtenue à l'exemple 4, avant (ligure 6A) et après immersion en milieu salivaire à pH S (Figure 8B) ou 3 (Figure 6€).
La Figure ? présente les images MEB d'un substrat ΊΠ (a}~ anodisé + chitosane greffé de manière covalente conformément à l'exemple 4, (b}~ idem + salive pH5 24ti, (c}~ Idem + salive pH3, 24h et (d)~ anodisé de référence. La Figure S présente le spectre Infra-rouge de la surface obtenue à l'exemple comparatif 1 avant exposition au milieu saiivalre (courbe démarrant à environ 99%) et après 24h en milieu saiivalre (courbe démarrent à environ 97%).
La Figure § présente le spectre Infra-rouge de la surface obtenue à l'exemple comparatif 2 avant expos!tJoo su milieu saiivalre (courbe démarrant à environ 81%) et après 24h ers milieu saiivalre (courbe démarrant à environ 61%),.
La Fifyre 10 présente une Image MES de la surface de l'exemple comparatif 3 avant exposition a la salive (a) et après exposition à la salive
Revêlement
Les substrats de titane pur lisses (ΊΊΜΕΤ) sont placés 30 minutes aux ultrasons dans un bain d' sopropanol. Ils sont ensuite plongés 15 minutes dans une solution Piranha (acide suifurique concentré /eau oxygénée 30% (Sigma-AId ich) 70 :30 v v). Après rinçage à l'eau distillée (ED) et séchage les échantillons sont plongés 24h dans une solution de TESPSA (anhydride trléthoxysilylpropyl suaM ue, ABC ) à 10% vofumlque dans du toluène extra-dry (Sigma-AIdrich). Ils sont ensuite Introduits dans une solution de toluène propre,, qui sera mise 30 minutes dans on bain à ultrasons. Cette opération est renouvelée: avec du DMF puis avec de l'eau distillée, pour obtenir une durée de 90 minutes au total dans le bain à ultrasons. Le substrat est finalement rincé à iéthanol et séché à température ambiante. ïl est ensuite recouvert par Immersion (en anglais * dip *>) avec une solution de chitosane de bas poids moléculaire (<6G0Q g/mol) à 4% massique (Sigma-Aïdrich) dissous dans une solution acide (acide acétique 3%+ ED, pH = 4),. Après le recouvrement, l'échantillon est séché à 80°C pendant 4h, La méthode de qreffaqs utilisée est illustrée sur le SCHEHA 4 ci-dessous.
Figure imgf000019_0001
lest en miileu salivai r acide
Le substrat obtenu a ensuite été testé en milieu sativaire à pH 5. Ce milieu salva re correspond à une salive artificielle préparée selon la méthode de Fusayama (H. Simon et al,, "Corrosion résistance and locompatiblib of a new ponxts surface for titanlum implants* Eur, 1 Orai Sa'. 113 (2005) : 537- 545):
Figure imgf000019_0002
Tous ces réactifs sont fournis par Sigma-AIdnch, Les éc antillons sont laissés 24h dans ce milieu puis retirés et rincés avec de S'ED, Les échantillons sont ensuite analysés en Infra-rouge (IR), en micros-copie électronique à balayage (MES, Hitachi S800 SEH) et en specfcroscople de ptiotoetectrons aux: Rayons X (XPS, Spectromètre PHI Quaritera SXM).
Peë-test
Le peel-tes est effectué à l'aide d'un peigne de quadrillage (El omeîer 1542} et d'un scotch adhésif normalisé (ISO 2409), Résultats
Après 24h en milieu salivaire à pH5, le revêtement semble toujours présent visuellement
L'analyse IR du revêtement permet bien de confirmer la présence de ditosane après 24 â H 5 en mieu salivaire.
En effet, îe spectre Ifê obtenu présenté Figure 1 correspond bien à celui du chitosane. Ceci est confirmé par l'observate* de la syr aœ au MEB (Figure 2% ainsi qu par \ PS.
Les données présentées dans le Tableau 2 montrent que la composition atomique est isien la même en surface de l'échantillon avant et après Immersion dans la salive acide. Les liaisons carbone-oxygène semblent également être conservées d'après les données du Tableau 3.
Figure imgf000020_0001
TaÊtôemt 3 ; épartiiim m i imm carfame/OMygène
Figure imgf000020_0002
Le ipee!-test montre que te revêtement adhère bien au substrat, comme le montre ia Ffqyre 3«
Les échantillons sont préparés comme dans l'exemple 1. La concentration volumique de chitosane est modifiée : 3% massique au ileu de 4%,: Les analyses M réalisées sur cet échantillon montrent que fadhésïon du chitosane et sa tenue en milieu salivaire ne sont pas modifiées par ce changeaient de concentration-
Les échantillons sont préparés de la même façon que dans l'exemple 1
Test en milieu salivaire acide
Le substrat obtenu a ensuite été testé en milieu salivaire à pHS et pH3, La salive artiflcieHe est préparée selon la méthode de fusayama avec ajout d'acide acétique usq'au pH désiré comme précédemment décrit
Les échantillons ont été analysés en Tof-SIMS (Tof-SÎ S V instrument ÎGN-TOF GmbH; Allemagne} en trois points différents pris au asard.
Résultats
§ fragments spécifiques du chltosane ont: été Identifiés et quantifiés grâce à l'analyse d'une solution de chltosane pur déposée sur de l'aluminium. Ces 6 fragments, ainsi que celui correspondant au titane, ont été quantifiés, ensuite sur les pastilles avant et après salive, La proportion relative de chaque fragment est calculée et présenté dans le TaWean 4 ci-dessous. 2 J.
Taèi a 4ΐ P p®rii@ d s fragments spécifiques c i^s^ne
Figure imgf000022_0001
La présence des fragments caractéristiques sur la surface §reffée, après salive pHS et après salive PR3 montre qu'il y a bien du chitosane restant à la surface. Cela prouve bien que le greffage résiste aux conditions addes (pH5) voire même très acides (pH3), De plus les faibles écarts types entre les mesures montrent qu te recouvrement est homogène dans cha ue cas.
-t m le 4:
Les échantillons soîit préparés de la même façon que dans l'exempte L Stérilisation
Les échantillons sont placés sous lampe IN 254nm à IScro de la lampe.
Chaque côté de l'échantillon est exposé 20 minutes aux UV, Culture cellulaire
Les cellules utilisées sont des fîbrobfas es HGF-î fournies par American Type Culture (AICC). Elles sont cultivées dans le mi n de culture DMEM (PM) avec 10% de sérum de veau fœtal et 1% de
Figure imgf000023_0001
Les cellules sont incubées à 37*C ave 5% de CQi, Afin de conserver et multiplier les cellules un passage est effectué tous les 3 jours.
Test de viabilité
La viabilité est évaluée grâce au test à la résazurine après 2, 4 et 7 jours de culture en présence des substrats, 10 ≠ d' ne solution de résazurine (Sigma-AIdnefi) à 0 1 mg/ml dans du PBS (PAA) sont ajoutés au milieu de culture {1ml). Après Incubation des cellules pendant 4h à 37 °C 200 pi die surnageant sont: prélevés et placés dans une plaque 95 puits. La densité optique de chaque puits est mesurée grâce à un lecteur de plaques Hicropiate Reader EL 308 Bio-Teck Instrument à 570 et 630 nrn. Il faut ensuite appliquer une formule qui donne le pourcentage de réduction de la résazurine:
Figure imgf000023_0002
■xlOO i 155i677KiDO630rei)-(5?494xDO57Ûref] où "ecf est une condition à mesurer et: "reT est celle du milieu de culture sans contact avec les cellules. Le surnageant est ensuite aspiré des puits, puis après rinçage au PBSf du milieu neuf est ajouté pour la prochaine mesure,
Analyse statistique
5 échantillons par temps, états de surface et tests sont réalisés pour le test de viabilité (n=5) et chacun est réalisé en duplicata. Une analyse de varia r¾ce (AMOVA) et un test t de Student non apparié sont effectués pour préciser la validité statistique des résultats» Le résultat est déclaré significatif lorsque la valeur p de la probabilité est inférieure au seuil fixé à 5 %. ' Si p> 0.05 pas de différence significative
* SI p<0„05 _ différence significative {*)
Résultats
Les résultats sont présentés Fig e 4»
Le résultat do test: montre que les flbroblasfes se développent autant sur le titane que sur le revêtement c iosane prouvant ainsi que le greffage est aussi biocompatlble que le titane vis-à-vis de ces cellules tàssulaïres. Le titane étant connu pour sa haute bïoeompsb iiité., ceci est un résultat très intéressant,
Norpholoaie cellulaire
La morphologie cellulaire est examinée après 2, 4 et 7 jours de culture. Après fixation des cellules dans une solution de glutaraldéhyde (Sig maAld ich), les échantillons sont déshydratés dans des bains de 5 minutes successifs d'éHianof à degré croissant (30°, 50e, 70% 90° et 100°). Enfin, les écnantil loris subissent une dessiccation de 5 minutes dans un mélange éthanol et HD S (I : i, v/v, Sigma Aidrich) puis dans du HDMS pur. L'o servation microscopique est réalisée avec un microscope électronique à balayage Hitachi S8Û0.
Ad ésion cellulaire
Les substrats sont placés dans des boites de culture de 12 micropuits (Dominique Outscher) et ensemencés avec des fioroblastes à une densité de
1JÛ cellules/cm2. Af n d'éviter l'adhésion des cellules sur les parois pendant l'ensemencement des cellules, 0,1 mi de suspension cellulaire a été d'abord soigneusement déposé à la surface des substrats. Four l'évaluation de la fixation: des cellules les fibroblastes sont fixés pour une future observation en icroscopie confocale après 6 et 18 h de culture.
Les cellules ont été fixées pendant. 10 min dans du forma Idéhyde (Siçma-Aldrîch} à 3,7% dans le PBS (PAA)_ Les cellules ont été perméabtisées avec du Triton X1D0 (PAA) ensuite bloquées avec de l'albumine de sérum bovin, Les mîcrofilamenîs faetine sont marqués par le marqueur fluorescen Alexa Fluor 488 p aiioïdioe (invi rogen) et tes noyaux sont marqués par i¾dure de propldîym (Sigroa-Atdrich). Les cellules sont ensuite observées avec m microscope Zeiss LSH 510 Meta (Cari Zelss),
Propriétés antl actérienoes
Les bactéries P, gin0vaiis et A mesiundi (Institut Pasteur) sont cuiSvées sur gélose au sang dans des boites de Pétri de 90 mm pour le repiquage. Avant chaque test ou repiquage, un Gram de contrôle est: effectué, Les boites sont mises à incuber dans des jarres à 37eC selon le type respiratoire des différentes bactéries u générateur GENbox anaer® (Biomérieux). P, gfn&vaffs est cultivé pendant 6 jours avant fes tests tandis que
Figure imgf000025_0001
coniques de 50 ml sont utilisés pour chaque bactérie : un tube de référence, un tube témoin, un tube pour l'échantillon, dans lesquels sont placés la pastille stérile qui leur correspond (à l'exception du tu e référence) et 10 ml de suspension bactérienne effectuée dans du bouillon Schaedler (Sigma- aldrich). Cette suspension doit avoir une densité optique (DO) proche de 0,300 à 550 nrn au spectrophotomètre (Thermo Spectroriic). Cette mesure correspond au temps Ttt D'autres mesures de DO sont effectuées aux temps 11 (Tû+ôh), 12 CT0+24h), 13 (T0+28h) et T4 ÇTQ+32 )_ Entre-temps, les tubes sont mis à incuber à 37°C dans des jarres en présence de GENbox anaer®.
L'évolution de la DO bactérienne est observée. 3 réplicats sont réalisés pour chaque souche bactérienne.
Analyse statistique
5 échantillons par temps, états de surface et tests sont réalisés pour le test de viabilité (n~5) et chaque mesure est réalisée m duplicata. Une analyse de va iance (AMOVÂ) et on test t de Student non apparie sont effectués pour préciser la validité statistique des résultats. Le résultat est déclaré significatif lorsque la valeur p de la probabilité est Inf rieure au seuil fixé à 1 %,
Résultats
Les résultais sont présentés Figures SA et 5B,
Le revêtement chitosane Induit une forte inhibition du développement de la souche A eslundB (60% par rapport au contrôle après 28 de croissance bactérienne - Figyre SB), En revanche i nhiàtion de P.gmgivaHs (Figure SA) est plus faible. Cela prouve cependant que le revêtement ch osane possède bien des propriétés anti bactérien nés.
Anodlsatlon
Les substrats titane pur lisses (TEKKA) sont anodises avant le greffage covalent L'électrode de titane constitue l'anode et la contre électrode utilisée est une électrode de platine, L'anod sati-on est réalisée à température ambiante et sous agitation magnétique. Les conditions utilisées sont données T leau 4.
Figure imgf000026_0001
Les réactifs sont fournis par Sgma-aldrich. Les substrats sont ensuite placés 30 minutes aux ultrasons dans un bain d'eau/acétone (50:50, v:v). Revêtement
Les substrats sont ensuite plongés 15 minutes dans une solution Piranha (acide suifurique concentré /eau oxygénée 30% (Sîgma-aldrich) 70 :30 v/v). Après rinçage à l'eau distillée (ED) et séchage, les échantillons sont plongés 24h dans une solution de TESPSA (anhydride triéthoxysilylpropyi suc ioique, ABCR) à 10% volumique dans du toluène extra-dry (¾ma-aldfi"ch). lis sont ensuite Introduits dans une solution de toluène propre, qu sera m se 30 minutes dans un bain à ultrasons. Cette opération est renouvelée avec du OMF puis avec de l'eau distillée, pour obtenir une durée de 90 minutes au total dans le bain à ultrasons, te substrat est finalement rincé à iéihanot et séché à température ambiante. Il est ensuite recouvert par trempage (en anglais « dîp »} avec une solution de chiosane de bas poids moléculaire (Mw<6000 g/mol), DA =75-85%) à 4% massique (Slgma-akJrlch) dissous dams une solution acide (acide acétique 3%- ED pH = 4). Après le recouvrement, l'échantillon est séché à 8Q°C pendant 4h-
Test en milieu salvalre acide
Le test est: réalisé conformément à l'exemple L
Résultats
Après 48h en milieu salrvaire à pH 5, le revêtement semble toujours présent visuellement A pH 3, il semble rester une légère couche de chiosane . Les tests à pH 3 ont été menés car dans certains cas,, lors de la cicatrisation:, le pH d la salive peut descendre à un H~3 dans les zones peu aérées telles que dans la partie cervicale.
Les spectres IR présentés Figyras iA à iC montrent que ce sot à pH 5 ou à pH 3f les bandes caractéristiques du chitosane sont bien présentes sur les substrats. Cependant; le signai est un peu atténué à pH 3,
Les observations HEB présentées Fîgyre 7 confirment ce résultat. En effet, il apparaît que le revêtement est bien présent à pH 5 et pH 3. Même si la couche est abîmée: à pH3, on voit bien qu ! reste d'importantes traces de chitosane. xem le S *
Revêtement
On procède conformément à l'exemple lf en utilisant des substrats TA6%V 4% (Alliage de titane 90%, aluminium 6% et vanadium: 4%, TlHETj. 5 Test en milieu salîvaire acide
Le test est réalisé conformément à l'exemple 1.
Résultats
Après 24h en milieu salîvaire à pH5, l'analyse I et: l'Observation de la surface au MES confirment que le revêtement est toujours présent.
lu
Revêlement
On procède conformément à l'exemple 1, en utilisant des substrats 15 Nickel/titane ( ΠΊ) {TÎMET}.
Test en milieu salîvaire acide
Le test est réalisé conformément à l'exemple 1.
20 Résultats
Après 24h en milieu salîvaire à p Sf l'analyse IR et l'observation de la surface au MEB confirment que ie revêtement est toujours présent,
E iriele comparatif i ; Dépôt sim le de diî ûsaaie
25
Revêtement
Les substrats titane pur lisses (TÎMET) sont placés SÔmînutes aux ultrasons dans un bain dlsopropanok Ils sont e suite plongés 15 minutes dans une solution Piranha (acide sulfurique concentré /eau oxygénée 30% 30 (Sigma-aldrich) 70 :30 v/v)- Après rinçage à l'eau distillée (ED) et séchage les échantillons sont ensuite recouverts par une solution de chîtosane de bas poids moléculaire à 4% massique {Sigma-aldrich} dissous dans une solution sch e (acide acétique 3%-r EQ, pH = 4). Après ie recouvrement, les échant llons sont séchés à 8Ô°C pendant 4h.
Test n milieu salivalre acide
Les substrats obtenus ont ensuite été testés en milieu salivaire pH5,
Cette salive artificielle est préparée selon la méthode de Fusayama. Les échantillons sont laissés 24h dans ce milieu, pois retirés et rincés, avec de ΙΈΟ, Les échantillons sont ensuite analysés en I .
L'analyse infrarouge présentée Figure S montre qu'aucune bande caractéristique du chitosane n'était présente après trempage de 24 en milieu salivaire.
Exemple Comparatif 2 utilisant siu TESBA Revêtement
Les substrats titane pur lisses (TÏMEÏ) sont placés 3Ûmlnutes aux ultrasons dans un bain d'isopropanoL Ils sont ensuite plongés 15 minutes dans une solution Piranha (adde suffurique concentré /eau oxygénée 30% (Slgma-aldrich) 70 :30 v v). Après rinçage à l'eau distillée (ED) et séchage tes échantillons sont plongés 24h dans une solution de TESBA Tnéthoxysilylbutyraldéhyde, A8CR) à 2% voiumique dans du toluène extra- dry (Sigma-aldrich). Us sont ensuite introduits dans une solution de toluène anhydre propre, qui est ensuite mise 30 minutes dans un bain à ultrasons. Cette opération est renouvelée deux fois avec du toluène anhydre propre,: pour obtenir une durée de 9ΰ minutes au total dans le bain à ultrason. Les substrats sont finalement rincés à iëthanol et séchés à température ambiante. Ils son ensuite recouverts par une solution de chitosane de bas poids moléculaire à 4% massique (Sigma -aldrfch) dissous dans une solution acid (acide acétique 3%+ ED, pH = 4), Après le recouvrement, les échant llons sont séchés à 8G°C pendant 4h. Test en milieu saivaire acide
Les substrats obtenus ont ensuite été testés en milieu sallvaire p:H5* Cette salive artificielle est préparée selon la méthode de Fusayama»
Les échangions sont laissés 24h dans ce milieu puis retirés e rincés avec de 1*ED. Les échantillons sont ensuite analysés en IR, en. MEB (Hitachi S80Q SEM),
L'analyse infrarouge présentée Fi§yre § montre qu'aucune bande caractéristique du chitosane n'est présente après trempage pendant 24h en milieu saivaire. On voit même la bande caractéristique du titane (1150 cm"1).
La visualisation de la surface par MEB présentée Figure 10 confirme donc le résultat obtenu en ïnfra Rouge, Seules quelques traces de chitosane restent à la surface du substrat, mais elles ne sont pas liées au substrat. Ce greffage covatent o¾st donc pas résistant en milieu adde, contrairement à celui de l'invention,
Exemple comparatif 3 : Iftflisation de Doparoine et de glotaraldeliyde
Revêtement
Les substrats titane pur lisses (ΤΊΜΕΤ) so t placés 30minutes aux ultrasons dans un bain disopropanoL Ils sont ensuite plongés 15 minutes dans une solution Piranha (acide solfurique concentré /eau oxygénée 30% (Stgma-aldrich) 70 :3Q v/v), Après rinçage à l'eau distillée (ED) et séchage les échantillons sont plongés 24h dans une solution de dopamine (500 mg de dopamine pour lOmL d'eau déîonisée). Les substrats sont ensuite rincés à l'eau déionisée, et introduit dans une solution de glutaraldéhyde (Sigma- aidrich) à 3% dans l'eau déîonisée pendant 24 heures» A l'issue des 2.4 heures, les substrats sont abondamment rincés à l'eau déîonisée et séc és, lis sont ensuit recouverts par une solution de chitosane de bas poids moléculaire à 4% massique (Sigma-aldridi) dissous dans une solution acide (a ide acétique 3%+ EDf pH = 4), Après le recouvrement, les échantillons sont séchés à 80°C pendant 4h,
5 lest en milieu sallv lre acide
Les substrats obtenus ont ensuite été testés en milieu salvalre pH5. Cette salive artificielle est préparée selon la méthode de Pusayama,
Les échantillons sont laissés 24h dans ce milieu, puis retirés e rincés avec de 1ΈΟ. Les échantillons sont ensuite analysés en îR.
10 L'analyse infrarouge montre qu'aucune bande caractéristique du chllosane n'est présente après trempage pendant 24h en milieu sallvalre. Ce greffage covalent n'est donc pas résistant en milieu acide, contrairement à celui de l'invention.
½5 mpfe c&mmmtW 4 ι iftiligatioïi dTAPTES et lie cfti araldehvde
Revêtement
Les substrats titane pur lisses (ΊΊΜΕΤ) sont placés 30minutes aux ultrasons dans un bain dlsopropanol Ils sont ensuite plongés 15 minutes 20 dans une solution Piranha (acide sulfurfque concentré /eau oxygénée 30% (Sïgma-aldrldi) 70 :3Ô v/v). Après rinçage à l'eau distillée (ED) et séchage, les échantillons sont plongés 24fi dans une solution d'AFTES (3- aminopropyltriéthcxysilane, ASC ) à 3% en volume dans du toluène extra sec. Ils sont ensuite Introduits dans une solution de toluène anhydre propre, 25 qui est ensuite mise 30 minutes dans un bain à ultrasons. Cette opération est renouvelée deux fois avec du toluène anhydre propre, pour obtenir une durée de 90 minutes au total dans le bain à ultrasons. Les substrats sont finalement rincés à iéthanoi et séchés à température ambiante. Les substrats sont ensuite introduits dans une solution de giutaraldéhyde à 3% en volume 30 pendant 24 heures. Enfin, les substrats sont abondamment rincés à l'eau déionisée et séchés à température ambiante., puis recouverts par une solution d ; cnltosane de bas poids moléculaire à 4% massique (Sigma- aidrlch) dissous dans une solution acide (acide acétique 3%+ £D, pH = Après le recouvrement l'échantillon est séché à 8Ô°C pendant 4h.
Test en milieu salivaire acide
Les substrats obtenus ont ensuite été testés en milieu salivaire pH5. Cette salive artificielle est préparée selon la méthode de Fusayama. Les échantillons sont laissés 24h dans ce milieu,, puis retirés et rincés avec de l'ED. Les échantillons sont ensuite analysés en I .
L'analyse Infrarouge montre qu'aucune bande caractéristique du chitosane n'est présente après trempage pendant 24h en milieu sailvaire. Ce greffage covalent n'est donc pas résistant en milieu acide, contrairement à celui décrit dans le cadre de l'Invention,
Revêtement
Les substrats de Ta6V (alliage Ti 90%-At 6%-V 4% en masse) anodlsés sont placés 30 minutes aux ultrasons dans un bain d'isopropanol. Ils sont ensuite plongés 10 minutes dans une solution Piranha (acide sulfuhque concentré /eau oxygénée 30% (Sigma- Aid rich) 70 :30 v/v). Après rinçage à l'eau distillée (ED) et séchage les échantillons sont plongés 24 heures clans une solution de ^sc yaûaîopropyltriméthoxysllane (A8CR) à 10% volumlque dans du toluène extra-se (Sigma-Aîdiich), Ils sont ensuite introduits dans une solution de toluène propre, qui sera mise 30 minutes dans un bain à ultrasons. Cette opération est renouvelée avec du DMF puis avec de l'eau distillée, pour obtenir une durée de 90 minutes au total dans le bain à ultrasons. Le substrat est finalement rincé à l'éthanol et: séché à température ambiante. Il est ensuite recouvert par immersion (en anglais « dïp ») avec une solution de chitosane de bas poids moléculaire (<6000 g/moi) à 4% massique (Slgma-Aldnch} dissous dans une solution acide (acide acétique 3%+ ED, H - 4),. Après le recouvrement, l'échantillon est séché à 8Û°C pendant 4 heures, La liaison obtenue est illustrée sur le SOiEHA 5 el- dessous.
Figure imgf000033_0001
Test en milieu salivaire acide
Les substrats obtenus ont ensute été testés dans un milieu salivaire identique à I "exemple i, mais pendant 24 heures à pH 3 et: 24 heures à pH 5. Après 24 heures à pH 5, un reste important de chltosane es visible au MEB. Après 24 heures à pH 3, l'analyse Î confirme que ie revêtement de c tosane est toujours présent

Claims

1 - Substrat composé d'une matière choisie parmi le titane ou un de ses alliages sur lequel au moins m polymère présentant une activité biologique, choisi parmi le chitosane, le collagène et leurs dérivés, est immobilisé de manière covalente grâce à une entité de liaison EL établissant une liaison peptidique : -CO-NH-, urée : ~MH-C{0)- H- ou thio-unée : -NH-C{S)-MH- sures foncions - H2 présentes sur le polymère avant son greffage et qui correspondent à des fonctions -UH2 présentes sur le chitosane ou le collagène à l'état naturel,, ou, dans le cas du; chitosane et de ses dérivés, établissant une liaison urétfcane : ••••NH-C(O)-Û- ou thlD-uréthans : - H-C(S>- O sur les fonctions -OH présentes sur le polymère avant son greffage et q i correspondent à des fonctions -OH présentes sur le chitosane à l'état naturel
2 ~ Substrat selon la revendication 1 caractérisé en ce que le polymère présentant une activité biologique est: le chitosane,
3 ~ Substrat selon l'une des revendications précédentes caractérisé en ce que le substrat est composé d'une matière choisie parmi le titane, les alliages de titane avec le nickel, notamment dans un rapport atomique NI/H de 40/60 à 60/40 et pius particulièrement de 50/50, et les alliages de titane avec un métal M choisi parmi le zir nium, le fer, le nloblum, l'aluminium, le molybdène, 1e vanadium et leur mélange, notamment dans un rapport atomique Μ/ΊΊ Inférieur à 40/60,
4 - Su strat selon l'une des revendications précédentes caractérisé en ce qui! se présente sous la forme d'un implant pour prothèse,
S - Substrat selon l'une des revendications précédentes caractérisé en ce qui se présente sous la forme d'un implant pour prothèse dentaire,
§ - Substrat selon furie des revendications précédentes caractérisé en ce que le taux de greffage en polymère est de 1 à 15 molécules de poiymère/nrn2 de substrat
? » Substrat selon l'une des revendications précédentes caractérisé en ce que l'entité de liaison EL correspond à l'enchaînement suivant ; dans lequel ;
- M représente on atome de ti ane do substrat,
- ¥1 représente une couche de silice poreuse liée à H par yrte liaison - M-G-Si et à OX par une liaison S-O-X,
- n est égal à G ou lt
- X représente un atome de silicium ou de phosphore,
- F2 représente -(QH2)-rf£Yr(CH2)p]cY2J avec m qui est égal à i, 2t 3,
4, 5 ou 6 ; p qui est égal à i, 2, 3, 4, 5 ou 6 ; q qui est égal à 0 ou i ; et Yi et Ys qui sont définis comme suit :
G soit Y2 représente -(CO)-NH- et Yi représente -NH~C(Û}- c soit Y2 et Yi sont: Identiques et représentent -NH-C(Z)- H avec Z™ G ou S,
G soit Y2 représente ~NH~C(Z)-0~ et Y* représente -NH-C(∑}-MH avec Z « O ou S.
S - Substrat selon la revendication ? caractérisé en ce que q-Q.
9 - Substrat selon la revendication 7 ou 8 caractérisé en ce que X ente un atome de silicium..
10 - Substrat l'une des revendications 7 à § caractérisé en ce que F représente -{CHils-CO-f H-»
11 » Substrat selon l'une des revendications 7 à îCf caractérisé en ce que n - 0.
12 - Substrat selon la revendication 11 caractérisé en ce que l'entité de liaison Et est obtenue par réaction sur des fonctions -OH présentes en surface du substrat :
- dans le cas où q-Qt d'un afcoxysilane, d'un hydroxysilane* d'un hydroxyalcQxysflane ou d'un pbosphonate porteur d'une fonction acide car oxyiîque (1), anhydride (2), ester (3), halogénure d'acide (4)f Isocyanate U-C~Q (S) ou thiocyanate : -N=G=S (6), suivie, dans le cas des fonctions (1) à (6) d'un couplage avec le polymère par réaction avec des fonctions - H?. présente sur le polymère, ou dans l cas des fonctions (5) et (6) d'un couplage avec un chitosane au m de ses dérivés par réaction avec des fonctions -OH présentes sur ledit polymère,
~ dans te cas où q~i, d un aî xysllane, d'un hydroxysllane, d'un hydroxyalcoxysîiane ou d'un phosphonafe porteur d'un groupement - (CH2)m-^H2 avec m qui est égal à 1, 2, 3, 4, 5 ou 6 , suivi d'un couplage avec un réactif Υ3~(<¾¼τγ3 avec p qui est égal à i, 2, 3, 4. 5 ou 6 et Y¾ qui est choisi parmi les fonctions acide carboxylique ( anhydride (2), ester (3), halogénore d'acide (4), isocyanate :- ~C=Q (5) ou thiocyanate : ~N=C=S (€}# en présence du polymère à immobiliser.
13 - Substrat selo Tune des revendications 7 à 10 caractérisé en ce que n =s i,
14 - Substrat: selon la revendication 13 caractérisé en ce que la couche de silice poreuse est obtenue par procédé sol~ge!; suivi d'un traiteme t thermique à une température appartenant à la gamme allant die 10Û°C à 700°C.
15 - Substrat selon la revendication 13 ou 14 caractérisé en ce que l'entité de liaison EL est complétée par réaction sur des fonctions -OH présentes en surface de la couche de silice :
- dans le cas où q~0, d'un alcoxyslfaoe, d'un hydroxysllane, d'un ydroxyalcoxysilaoe ou d'un phospnonafce porteur d'une fonction acide car oxyiique (l), anhydride (2), ester (3), haiogénure d'acide (4), isocyanate :-N~C-0 (S) ou thiocyanate : -N-OS (6), suivie», dans le cas des fonctions (i) à (6) d'un couplage avec le polymère par réaction avec des fonctions ~~UH2 présentes sur le polymère, ou dans le cas des fonctions (5) et (6) d'un couplage avec un chltosane ou un de ses dérivés par réactio avec des fonctions -OH présentes sur ledit polymère,
~ dans le cas où q~i, d'un alcoxysilarte, d'un hydroxysllane, d'un nydr oxya Icoxysl i a ne ou d'un p osphonate porteur d'un groupement -
{CrÎ2)m- H2 avec m qui est égal à lf 2, 3, 4, 5 ou 6 , suivi d'un couplage avec u réactif Y3-{ H2)P-Y3 avec p qui est égal à 2, 3., 4, 35
5 ou 6 et Y.3 qui est choisi parmi les fonctions acide carboxylique (i)f anhydride (2), ester (3)., haiogénure d'acide (4), isocyanate :- U=C-Q (5) ou tiiocyanate : -N=C=S (6), en présence du polymère à Immobiliser*
16 - Procédé de préparation d'un substrat selon la revendication il ou 12 caractérisé en ce qui comprend la réaction sur des fonctions -OH présentes en surface du substrat ;
- dans le cas où q=Gf d'un alcoxys!!ane, d'un hydroxysîlane, d'un hydroxyalcoxysilaoe ou d'un phosphonate porteur d'une fonction acide carboxylique (1), anhydride (2), ester (3), haiogênure d'acide (4), Isocyanate :-N=C-0 (5} ou thiocyanste : -N=C=S (6), suivie, dans le cas des fonctions (1) à (6) d'u couplage avec ie polymère pa réaction avec des fonctions -Nr½ présentes sur le polymère, ou dans le cas des fonctions (5) et (6) d'un couplage avec un cbltosane ou un de ses dérivés par réaction avec des fonctions -OH présentes sur ledit
- dans ie cas ou q~l, d'u alcoxysiiane, d'un hydroxysilane., d'un hydroxyalcoxysilane ou d'un phosphonate porteur d'un groupement - {€!" )m-MH2 avec m qui est égal à i, 2, .3, 4, 5 ou 6 , suivi d'un couplage avec un réactif Ϊ3~(0-½) -¥3 avec p qui est égal à l, 2, 3, , 5 ou 6 et Ys qui est choisi parmi les fonctions acide carboxylique (1), anhydride (2), ester (3)., haiogênure d'acide (4), Isocyanate U-QzQ (S) ou thiccyanate : - ~€~S (6), en présence du polymère à Immobiliser,
17 - Procédé de préparation d'un substrat selon l'une des revendications 13 à 15 caractérisé en ce qu'il comprend la réaction sur des fonctions OH présentes en surface de la couche de silice :
- dans te cas où q-Q, d'un alcoxysilane, d' n hydroxyslane, d'un hydroxyalcoxysilane ou d'un phosphonate porteur d'une fonction acide carboxylique (1), anhydride (2% ester (3), haiogênure d'acide (4)f isocyanate :-N=C=0 (S) ou thlocyanate : -N=C=S (6), suivie, dans le cas des fonctions (1) à (6) d'un couplage avec le polymère par réaction avec des fonctions -IMH2 présentes s r le polymère, ou dans le cas des fonctions (5) et (6) d'un couplage avec un chitosane ou un de ses dérivés par réaction avec des fonctions -OH présentes sur ledit polymère,
- dans le cas où q=l, d'un alooxyslane, d'un hydrcxysilane, d'u hydroxyalcoxysiiane oy d'un phosphonate porteur d'un groupement - (CHzjfe- Hi avec m qui est égal à i, 2, 3, 5 ou 6 , suivi d'un couplage avec un réactif Ys-CCHa Ys ave p qui est égal à 1, 2, 3, 4, 5 ou 6 et Y3 gui est: choisi parmi les fondions acide carboxyllque (I), an ydride (2), ester (3), halogénure d¾c de {4), isocyanate >
N=O=0 (S) ou thiocyanate : -N=€-S (6), en présence du polymère à immobiliser.
18 ~ Procédé selon la revendication 17 caractérisé en ce que la couche de silice poreuse est obtenue par procédé sol-gel, suivi d'un traitement thermique à une température appartenant à la gamme allant de 100CC à 700°C.
19 - Procédé selon les revendications 16, 17 ou 18 caractérisé en ce que la réaction sur les fonctions -OH de surface est réalisée avec un aleoxysi a e, hydroxysilane ou phosphonate répondant à l'une des formules ci-après :
{Fy%Si~F½, {¾0)2Si(R¾)2i (¾0)5ΐ(¾)3, (¾0)2Ρ(0)(¾) ou [¾0}Ρ(0)(¾)2 avec s qui représente un atome d'hydrogène ou un groupe a kyle de i à 4 atomes de carbone, et par exemple m groupe méthyfe ou éthyle, et qui représente :
- dans le cas où q-Q, -{0"½}κ,Υ¾ avec m qui est égal à 1, 2, 3, 4, 5 ou
8 et Y2 qui est une fonction réactive choisie parmi les fonctions anhydride, comme par exemple
Figure imgf000038_0001
acide carfeoxvlique, ester, halogénu e cfacide, isocyanate (-N= =0) ou thiocyanate {-N=OS},
- dans te cas où
Figure imgf000039_0001
avec m qui est égal à i, 2f 3, , 5 ou:
6.
S 20 - Procédé selon l'une des revendications 16 à 19 caractérisé en c que la réaction sur les fonctions -OH de l'aicoxysltane, de l* ydroxysi!arie, de l^hydroxyalcoxysilane ou du phosphonate est réalisée dans un solvant apoiaire tel que le toluène, fhexarte GO l'éttier diéthyiique.
21 - Procédé selon l'une des revendications 16 à 20 caractérisé en ce0 que le polymère greffé est du chitosane et en ce que la fonction réactive Y2 ou Y3 est un anhydride,
22 « Procédé selon l'une des revendications 16 à 21 caractérisé en ce qui! comprend une étape préalable de traitement chimique oxydant, de la surface du substrat, de manière à obtenir des fonctions ïi-GH de surface.5 23 - Procédé selon la revendication 22 caractérisé en ce qye le traitement chimique oxydant est réalisé par action d'un mélange d'acide et d'agent oxydant tel qu'un mélange d'acide suliunque et d'eau oxygénée.
24 ~ Procédé selon furie des revendications 16 à 23 caractérisé en ce qui! comprend un traitement électrochsmlque du substrat par anodlsation.0 25 - Procédé selon les revendications 22 et 24, ou selon les revendications 23 et 24, caractérisé en ce que ranodisation est réalisée avant le traitement c imi ue oxydant,
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