WO2013081198A1 - 헤파티티스 ｃ 바이러스 검출용 키트 및 이를 이용한 헤파티티스 ｃ 바이러스의 검출 방법 - Google Patents

헤파티티스 ｃ 바이러스 검출용 키트 및 이를 이용한 헤파티티스 ｃ 바이러스의 검출 방법 Download PDF

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Abstract

테스트 시료에서 HCV를 검출하는 키트를 개시한다. 또한, 상기 키트를 사용하여 테스트 시료에서 HCV를 실시간으로 검출하는 방법을 개시한다. 상기 검출 방법에 의하면, 적은 카피 수의 대상 시료만으로도 검출 결과를 실시간으로 신속하게 확인할 수 있다.

Description

헤파티티스 Ｃ 바이러스 검출용 키트 및 이를 이용한 헤파티티스 Ｃ 바이러스의 검출 방법
본 발명은 헤파티티스 C 바이러스 검출용 키트 및 이를 이용한 헤파티티스 C 바이러스의 검출 방법을 개시한다. 또한, 상기 방법에서 사용하기에 적합한 올리고뉴클레오티드를 개시한다.
헤파티티스 C 바이러스(Hepatitis C virus, HCV)는 비경구 감염성 바이러스로 대부분의 경우의 수혈 후 간염 및 산재성 간염으로 나타나며, 세계 인구 중 약 1% 정도가 감염된 것으로 추정되고 있다. HCV 감염은 급성 간염, 만성 간염, 경변 및 후속적인 간암과 연관된다. HCV는 헤파시바이러스(Hepacivirus)로 분류되며, 약 3,000개 아미노산의 폴리단백질 전구체를 암호화하는 단일의 거대한 ORF를 갖는 약 9,500개 뉴클레오티드의 (+) RNA 분자로 이루어져 있다.
따라서, HCV의 감염 여부와 감염된 HCV의 유전형을 신속하고 정확하게 진단하기 위해 실시간 PCR 방법을 이용한 HCV 검출 방법 및 검출 키트 개발의 필요성이 요구되고 있다.
예시적인 구체예에 따르면, HCV의 검출을 위한 키트가 제공된다.
일 구체예에서, 샘플 중 HCV의 실시간 검출을 위한 방법이 개시된다.
일 구체예에 따르면, HCV genotype 특이적 타겟 서열의 민감하고 정확한 검출을 가능하게 하는, 제1 프라이머, 제2 프라이머, 및 프로브를 포함하는 HCV의 실시간 검출용 키트가 제공된다.
일 구체예에서, 상기 제1 프라이머는 서열번호 1, 2, 12 또는 13의 서열을 가질 수 있다.
일 구체예에서, 상기 제2 프라이머는 서열번호 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 14 또는 15의 서열을 가질 수 있다.
일 구체예에서, 상기 프로브는 서열번호 10, 11, 16 또는 17의 서열을 가질 수 있다.
일 구체예에서, 하기 프라이머 세트 및 프로브로 구성된 군으로부터 선택되는, HCV의 실시간 검출을 위한 키트가 제공된다:
서열번호 1의 뉴클레오티드 서열을 갖는 제1 프라이머 및 서열번호 3의 뉴클레오티드 서열을 갖는 제2 프라이머를 포함하는 프라이머 세트, 및 서열번호 10의 뉴클레오티드 서열을 갖는 프로브;
서열번호 1의 뉴클레오티드 서열을 갖는 제1 프라이머 및 서열번호 4의 뉴클레오티드 서열을 갖는 제2 프라이머를 포함하는 프라이머 세트, 및 서열번호 10의 뉴클레오티드 서열을 갖는 프로브;
서열번호 1의 뉴클레오티드 서열을 갖는 제1 프라이머 및 서열번호 5의 뉴클레오티드 서열을 갖는 제2 프라이머를 포함하는 프라이머 세트, 및 서열번호 10의 뉴클레오티드 서열을 갖는 프로브;
서열번호 1의 뉴클레오티드 서열을 갖는 제1 프라이머 및 서열번호 6의 뉴클레오티드 서열을 갖는 제2 프라이머를 포함하는 프라이머 세트, 및 서열번호 10의 뉴클레오티드 서열을 갖는 프로브;
서열번호 1의 뉴클레오티드 서열을 갖는 제1 프라이머 및 서열번호 7의 뉴클레오티드 서열을 갖는 제2 프라이머를 포함하는 프라이머 세트, 및 서열번호 10의 뉴클레오티드 서열을 갖는 프로브;
서열번호 1의 뉴클레오티드 서열을 갖는 제1 프라이머 및 서열번호 8의 뉴클레오티드 서열을 갖는 제2 프라이머를 포함하는 프라이머 세트, 및 서열번호 10의 뉴클레오티드 서열을 갖는 프로브;
서열번호 1의 뉴클레오티드 서열을 갖는 제1 프라이머 및 서열번호 9의 뉴클레오티드 서열을 갖는 제2 프라이머를 포함하는 프라이머 세트, 및 서열번호 10의 뉴클레오티드 서열을 갖는 프로브;
서열번호 1의 뉴클레오티드 서열을 갖는 제1 프라이머 및 서열번호 3의 뉴클레오티드 서열을 갖는 제2 프라이머를 포함하는 프라이머 세트, 및 서열번호 11의 뉴클레오티드 서열을 갖는 프로브;
서열번호 1의 뉴클레오티드 서열을 갖는 제1 프라이머 및 서열번호 4의 뉴클레오티드 서열을 갖는 제2 프라이머를 포함하는 프라이머 세트, 및 서열번호 11의 뉴클레오티드 서열을 갖는 프로브;
서열번호 1의 뉴클레오티드 서열을 갖는 제1 프라이머 및 서열번호 5의 뉴클레오티드 서열을 갖는 제2 프라이머를 포함하는 프라이머 세트, 및 서열번호 11의 뉴클레오티드 서열을 갖는 프로브;
서열번호 1의 뉴클레오티드 서열을 갖는 제1 프라이머 및 서열번호 6의 뉴클레오티드 서열을 갖는 제2 프라이머를 포함하는 프라이머 세트, 및 서열번호 11의 뉴클레오티드 서열을 갖는 프로브;
서열번호 1의 뉴클레오티드 서열을 갖는 제1 프라이머 및 서열번호 7의 뉴클레오티드 서열을 갖는 제2 프라이머를 포함하는 프라이머 세트, 및 서열번호 11의 뉴클레오티드 서열을 갖는 프로브;
서열번호 1의 뉴클레오티드 서열을 갖는 제1 프라이머 및 서열번호 8의 뉴클레오티드 서열을 갖는 제2 프라이머를 포함하는 프라이머 세트, 및 서열번호 11의 뉴클레오티드 서열을 갖는 프로브;
서열번호 1의 뉴클레오티드 서열을 갖는 제1 프라이머 및 서열번호 9의 뉴클레오티드 서열을 갖는 제2 프라이머를 포함하는 프라이머 세트, 및 서열번호 11의 뉴클레오티드 서열을 갖는 프로브;
서열번호 2의 뉴클레오티드 서열을 갖는 제1 프라이머 및 서열번호 3의 뉴클레오티드 서열을 갖는 제2 프라이머를 포함하는 프라이머 세트, 및 서열번호 10의 뉴클레오티드 서열을 갖는 프로브;
서열번호 2의 뉴클레오티드 서열을 갖는 제1 프라이머 및 서열번호 4의 뉴클레오티드 서열을 갖는 제2 프라이머를 포함하는 프라이머 세트, 및 서열번호 10의 뉴클레오티드 서열을 갖는 프로브;
서열번호 2의 뉴클레오티드 서열을 갖는 제1 프라이머 및 서열번호 5의 뉴클레오티드 서열을 갖는 제2 프라이머를 포함하는 프라이머 세트, 및 서열번호 10의 뉴클레오티드 서열을 갖는 프로브;
서열번호 2의 뉴클레오티드 서열을 갖는 제1 프라이머 및 서열번호 6의 뉴클레오티드 서열을 갖는 제2 프라이머를 포함하는 프라이머 세트, 및 서열번호 10의 뉴클레오티드 서열을 갖는 프로브;
서열번호 2의 뉴클레오티드 서열을 갖는 제1 프라이머 및 서열번호 7의 뉴클레오티드 서열을 갖는 제2 프라이머를 포함하는 프라이머 세트, 및 서열번호 10의 뉴클레오티드 서열을 갖는 프로브;
서열번호 2의 뉴클레오티드 서열을 갖는 제1 프라이머 및 서열번호 8의 뉴클레오티드 서열을 갖는 제2 프라이머를 포함하는 프라이머 세트, 및 서열번호 10의 뉴클레오티드 서열을 갖는 프로브;
서열번호 2의 뉴클레오티드 서열을 갖는 제1 프라이머 및 서열번호 9의 뉴클레오티드 서열을 갖는 제2 프라이머를 포함하는 프라이머 세트, 및 서열번호 10의 뉴클레오티드 서열을 갖는 프로브;
서열번호 2의 뉴클레오티드 서열을 갖는 제1 프라이머 및 서열번호 3의 뉴클레오티드 서열을 갖는 제2 프라이머를 포함하는 프라이머 세트, 및 서열번호 11의 뉴클레오티드 서열을 갖는 프로브;
서열번호 2의 뉴클레오티드 서열을 갖는 제1 프라이머 및 서열번호 4의 뉴클레오티드 서열을 갖는 제2 프라이머를 포함하는 프라이머 세트, 및 서열번호 11의 뉴클레오티드 서열을 갖는 프로브;
서열번호 2의 뉴클레오티드 서열을 갖는 제1 프라이머 및 서열번호 5의 뉴클레오티드 서열을 갖는 제2 프라이머를 포함하는 프라이머 세트, 및 서열번호 11의 뉴클레오티드 서열을 갖는 프로브;
서열번호 2의 뉴클레오티드 서열을 갖는 제1 프라이머 및 서열번호 6의 뉴클레오티드 서열을 갖는 제2 프라이머를 포함하는 프라이머 세트, 및 서열번호 11의 뉴클레오티드 서열을 갖는 프로브;
서열번호 2의 뉴클레오티드 서열을 갖는 제1 프라이머 및 서열번호 7의 뉴클레오티드 서열을 갖는 제2 프라이머를 포함하는 프라이머 세트, 및 서열번호 11의 뉴클레오티드 서열을 갖는 프로브;
서열번호 2의 뉴클레오티드 서열을 갖는 제1 프라이머 및 서열번호 8의 뉴클레오티드 서열을 갖는 제2 프라이머를 포함하는 프라이머 세트, 및 서열번호 11의 뉴클레오티드 서열을 갖는 프로브;
서열번호 2의 뉴클레오티드 서열을 갖는 제1 프라이머 및 서열번호 9의 뉴클레오티드 서열을 갖는 제2 프라이머를 포함하는 프라이머 세트, 및 서열번호 11의 뉴클레오티드 서열을 갖는 프로브;
서열번호 13의 뉴클레오티드 서열을 갖는 제1 프라이머 및 서열번호 15의 뉴클레오티드 서열을 갖는 제2 프라이머를 포함하는 프라이머 세트, 및 서열번호 16의 뉴클레오티드 서열을 갖는 프로브;
서열번호 13의 뉴클레오티드 서열을 갖는 제1 프라이머 및 서열번호 15의 뉴클레오티드 서열을 갖는 제2 프라이머를 포함하는 프라이머 세트, 및 서열번호 17의 뉴클레오티드 서열을 갖는 프로브;
서열번호 12의 뉴클레오티드 서열을 갖는 제1 프라이머 및 서열번호 14의 뉴클레오티드 서열을 갖는 제2 프라이머를 포함하는 프라이머 세트, 및 서열번호 16의 뉴클레오티드 서열을 갖는 프로브;
서열번호 12의 뉴클레오티드 서열을 갖는 제1 프라이머 및 서열번호 14의 뉴클레오티드 서열을 갖는 제2 프라이머를 포함하는 프라이머 세트, 및 서열번호 17의 뉴클레오티드 서열을 갖는 프로브;
서열번호 13의 뉴클레오티드 서열을 갖는 제1 프라이머 및 서열번호 14의 뉴클레오티드 서열을 갖는 제2 프라이머를 포함하는 프라이머 세트, 및 서열번호 16의 뉴클레오티드 서열을 갖는 프로브;
서열번호 13의 뉴클레오티드 서열을 갖는 제1 프라이머 및 서열번호 14의 뉴클레오티드 서열을 갖는 제2 프라이머를 포함하는 프라이머 세트, 및 서열번호 17의 뉴클레오티드 서열을 갖는 프로브;
서열번호 12의 뉴클레오티드 서열을 갖는 제1 프라이머 및 서열번호 15의 뉴클레오티드 서열을 갖는 제2 프라이머를 포함하는 프라이머 세트, 및 서열번호 16의 뉴클레오티드 서열을 갖는 프로브; 또는
서열번호 12의 뉴클레오티드 서열을 갖는 제1 프라이머 및 서열번호 15의 뉴클레오티드 서열을 갖는 제2 프라이머를 포함하는 프라이머 세트, 및 서열번호 17의 뉴클레오티드 서열을 갖는 프로브.
일 구체예에서, 제1 프라이머 올리고뉴클레오티드는, X1이 부재하거나 또는 G이고, X2가 부재하거나 또는 T이고, 및 X3는 부재하거나 또는 G인, 하기 서열번호 18의 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드를 포함한다:
X1X2X3GCTCCATCTTAGCCCTAGT (서열번호 18).
일 구체예에서, 상기 제1 프라이머는 하기 서열번호 1-2 및 12-13의 올리고뉴클레오티드로 구성된 군으로부터 선택되는 하나일 수 있다:
GTGGCTCCATCTTAGCCCTAGT (서열번호 1),
GCTCCATCTTAGCCCTAGT (서열번호 2),
GTCTAGCCATGGCGTTAGTATGA (서열번호 12), 및
TGTCTTCACGCAGAAAGCGTCTA (서열번호 13).
일 구체예에서, 제2 프라이머는 하기 서열번호 3-9 및 14-15의 올리고뉴클레오티드로 구성된 군으로부터 선택되는 하나일 수 있다:
TGCGGCTCACGGACCTTT (서열번호 3),
GGTCCGTGAGCCGCATGA (서열번호 4),
AGTCATGCGGCTCACGGA (서열번호 5),
GCACTCTCTGCAGTCATGCG (서열번호 6),
CAGAGAGGCCAGTATCAGCACTCTCTGCAG (서열번호 7),
TCTCTGCAGTCATGCGGCTC (서열번호 8),
CTCTCTGCAGTCATGCGGCT (서열번호 9),
GGCCTTTCGCGACCCAACACTAC (서열번호 14), 및
GCCTTTCGCGACCCAACACTACT (서열번호 15).
일 구체예에서, 상기 프로브는, 뉴클레오티드 "rU", "rC", "rA" 및 "rG"가 리보뉴클레오티드인 것인, 하기 서열번호 10-11 및 16-17의 올리고뉴클레오티드로 구성된 군으로부터 선택되는 하나일 수 있다:
CTTrUrCrArCAGCTAGCCG (서열번호 10),
CGGCTrArGrCrUGTGAAAG (서열번호 11),
GGAGAGCCATrArGrUrGGTCTGCGGAA (서열번호 16), 및
TGCGGAACCGrGrUrGrAGTACACCGG (서열번호 17),
상기 프로브는 그의 3'-말단 및 5'-말단 중 하나 또는 양쪽 모두에서, 전술된 바와 같은, 검출가능한 표지와 커플링될 수 있다.
일 구체예에서, 전술된 바와 같은, 제1 프라이머 및 제2 프라이머를 포함하는 키트가 제공된다. 상기 키트는 전술된 바와 같은 프로브를 더 포함한다. 그와 같은 키트는 샘플 중 HCV의 정확하고, 민감하며, 신속한 검출에 적합하고, 유용하다.
상기 키트는 역전사 효소 활성, 폴리머라제 활성, 및 프로브 올리고뉴클레오티드의 내부 부위(internal site)를 절단할 수 있는 절단제(cleaving agent)를 더 포함할 수 있다. 상기 절단제는 RNase H, Kamchatka crab 이중 가닥 특이적 뉴클레아제(duplex specific nuclease), 엔도뉴클레아제, 및 니킹(nicking) 엔도뉴클레아제로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다. 상기 키트는 상기 설명된 바와 같이, 우라실-N-글리코실라제(uracil-N-glycosylase)를 더 포함할 수 있다.
일 구체예에 따르면, HCV의 존부에 대해 시험될 샘플을 제공하는 단계, 상기 샘플로부터 RNA를 추출하는 단계; 상기 RNA와, 우라실-n-글리코실라제, DNA 폴리머라제, 역전사 효소, 적절한 데옥시리보뉴클레오티드 트리포스페이트, HCV 타겟 cDNA에 실질적으로 상보적인 DNA 및 RNA 핵산 서열을 갖는, 검출가능한 마커를 포함하는 핵산 결합 프로브, 반응 완충액, 및 상류(upstream) 프라이머 및 하류(downstream) 프라이머를 혼합함으로써, 증폭 매질을 생성하는 단계; 상기 증폭 매질을, 상기 우라실-N-글리코실라제를 활성화하고, 주형 핵산을 오염시키는 이월물질(carryover)을 제거하기에 충분한 온도에서, 및 시간 동안 인큐베이션시키는 단계; 상기 증폭 매질을, 상기 우라실-N-글리코실라제를 불활성화시키고, 상기 RNA를 역전사 효소 및 하류 프라이머와 접촉시켜 cDNA를 합성하는데 충분한 온도에서 및 시간 동안 인큐베이션시키는 단계; 상기 증폭 매질을, 상기 역전사 효소를 불활성화시키고 상기 cDNA의 변성을 야기하는데 충분한 온도에서 및 시간 동안 인큐베이션시키는 단계; 상기 증폭 매질을 변성 온도 이상 및 연장 온도 사이에서 열순환(thermally cycling)시키는 단계로, 상기 상류 및 하류 프라이머의 조합은 타겟 핵산 또는 그의 일부를 증폭시키고, 상기 일부는, 프로브 내의 핵산 서열이 HCV 타겟 cDNA의 PCR 단편 내의 상보적인 DNA 서열과 RNA:DNA 이형이중가닥을 형성할 수 있는 조건 하에서, HCV 게놈에 고유한 것이면 임의의 길이를 가질 수 있는 것인 단계; 복수의 핵산 프로브 중 제1 검출가능한 마커를 포함하는 제1 핵산 프로브가 타겟 핵산 또는 그의 일부에 혼성화할 수 있는 조건 하에서, 타겟 핵산 서열 및 각각이 검출가능한 마커를 포함하는 복수의 핵산 프로브의 반응 혼합물을 생성시키는 단계; 상기 검출가능한 마커를 활성화하기 위한, 상기 핵산 프로브의 구조 또는 배좌(conformation)의 변화를 야기하는 단계; 상기 반응 혼합물 내의 복수의 핵산 프로브에서 유래한 제2 핵산 프로브를 사용하여 단계 (g) 및 (h)를 반복하는 단계로, 복수의 활성화된 검출가능한 마커가 형성되는 것인 단계; 및 상기 프로브에 위치한 표지로부터 신호 방출의 실시간 증가를 검출하는 단계로, 상기 신호의 증가는 샘플 중 HCV 타겟 cDNA의 존재를 나타내는 것인 단계를 포함하는, 샘플 중 HCV의 실시간 검출을 위한 방법이 제공된다.
일 양태에서, 상기 프로브에 위치한 표지로부터의 신호 방출의 실시간 증가는, 상기 프로브 및 PCR 단편의 가닥들 중 하나 사이에 형성된 이형이중가닥의 RNase H 절단에 기인한다.
또 다른 구체예에서, 상기 방법은 샘플 중 HCV의 양을 결정하는데 사용될 수 있다.
일 구체예에 따르면, 전술된 방법을 실시하기에 적합한, HCV 검출용 키트가 제공된다.
본 명세서에 개시된 구체예의 실험은, 달리 표시되어 있지 않으면, 당업계에서 알려진 통상적인 분자 생물학적 기법을 사용하였다. 이러한 기법들은 당업자들에게 잘 알려져 있으며, 문헌에 충분히 설명되어 있다. 예를 들어, Ausubel, et al., ed., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., NY, N.Y. (1987-2008) 및 Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)를 참조하였다.
본 명세서에서 달리 정의되어 있지 않다면, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적, 과학적 용어는 당업자가 일반적으로 이해하는 의미와 동일한 의미를 갖는다. 또한 본 명세서는 상세한 설명 및 청구항의 해석을 돕기 위해 용어의 정의를 제공한다. 결과적으로, 정의가 다른 정의와 일치하지 않으면, 상기 정의는 본 명세서에 설명되어 있는 것으로 규정될 것이다.
"표적 DNA" 또는 "표적 RNA" 또는 "표적 핵산" 또는 "표적 핵산 서열"은 DNA 증폭에 의해 표적이 되는 핵산을 의미한다. 표적 핵산 서열은 PCR 반응 또는 역전사-PCR 반응에서 증폭을 위한 주형으로 제공된다. 표적 핵산 서열은 천연 분자 및 합성 분자를 포함한다. 표적 핵산은 예를 들어, 게놈 DNA 또는 게놈 RNA일 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.
용어 “뉴클레오티드(nucleotide)”는 단일 가닥 또는 이중 가닥 형태로 존재하는 디옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드로, 특별하게 언급되어 있지 않은 한 뉴클레오티드의 유사체를 포함하는 의미로 해석된다.
용어 “프로브(probe)”는 특정 폴리뉴클레오티드 서열에 혼성화될 수 있는 디옥시리보뉴클레오티드 및/또는 리보뉴클레오티드를 포함하는 자연 또는 변형된 모노머(monomer) 또는 결합을 갖는 선형의 올리고머(oligomer)를 의미한다.
일 구체예에 따른 프로브는 주형이 되는 폴리뉴클레오티드 서열에 완전하게 (perfectly) 상보적인 서열일 수 있으나, 특이적 혼성화를 방해하지 않는 범위 내에서 실질적으로 상보적인 서열일 수도 있다. 혼성화에 적합한 조건은 상술한 바와 같다.
본 명세서에서 사용된 용어, "실질적으로 상보적인(substantially complementary)"은 서열 내에서 충분히 상보적인 2개의 핵산 가닥이 어닐링되고 안정적인 듀플렉스를 형성하는 것을 의미한다. 상기 상보성은 완전할 필요는 없다; 예를 들어, 2개의 핵산 사이에 염기 쌍의 미스매치(mismatch)가 몇개 정도 있을 수 있다. 그러나, 미스매치의 숫자가 너무 많아서 최소한의 엄격한 혼성화 조건에서 조차 혼성화가 일어나지 않는 경우에는, 상기 서열은 실질적으로 상보적인 서열이 아니다. 본 명세서에서 2개의 서열이 "실질적으로 상보적인" 것으로 해석되면, 상기 서열은 엄격한 혼성화 조건과 같이 선택된 반응 조건 하에서 서로가 혼성화될 수 있도록 충분히 상보적인 것을 의미한다. 특이성을 달성할 수 있는 충분한 핵산의 상보성과 혼성화의 엄격성의 관계는 당업계에 잘 알려져 있다. 2개의 실질적으로 상보적인 가닥은, 예를 들어, 완전하게 상보적이거나 또는 예를 들어, 쌍을 이루는 서열 및 쌍을 이루지 않는 서열 사이의 차이점을 충분히 허용하는 한 1 내지 다수의 미스매치를 포함할 수 있다. 따라서, "실질적으로 상보적인" 서열은 이중 가닥 구역에서 99, 95, 90, 80, 75, 70, 60, 50% 이하, 또는 상기 숫자 사이의 어떠한 %의 염기쌍 상보성을 갖는 서열을 의미할 수 있다.
용어 “실질적으로 상보적인 서열(substantially complementary sequence)”은 당업계에 공지된 엄격 조건 하에서 주형이 되는 폴리뉴클레오티드와 혼성화될 수 있는 서열을 의미한다. 용어 “엄격 조건(stringent conditions)"은 Joseph Sambrook, et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001) 및 Haymes, B. D., et al., 핵산 Hybridization, A Practical Approach, IRL Press, Washington, D.C. (1985)에 개시되어 있으며, 엄격 조건은 온도, 이온세기 (완충액 농도) 및 유기 용매와 같은 화합물의 존재 등을 조절하여 결정될 수 있고, 혼성화되는 서열에 따라 다르게 결정될 수 있다. 예를 들어, 엄격 조건은 a) 50℃ 온도 및 0.015 M 소듐 클로라이드/0.0015 M 소듐 시트레이트/0.1% 소듐 도데실 설페이트로 세척하거나, b) 혼성화 완충액 (50% 포름아미드, 2 x SSC 및 10% 덱스트란 설페이트 포함)에서 55℃로 혼성화한 다음, EDTA-함유 0.1 x SSC로 55℃에서 세척하는 조건으로 이루어질 수 있다.
용어 “프라이머(primer)”는 적합한 온도에서 적합한 완충액 내에서 적합한 조건(즉, 4종의 다른 뉴클레오시드 트리포스페이트 및 중합 반응 효소) 하에서 주형-지시 DNA 합성의 개시점으로 작용할 수 있는 단일 가닥의 올리고뉴클레오티드를 의미한다.
프라이머의 적합한 길이는 다양한 인자, 예를 들어, 온도와 프라이머의 용도에 따라 차이가 있지만 전형적으로 15-35개의 뉴클레오티드이다. 짧은 프라이머는 주형과 충분히 안정된 혼성화 복합체를 형성하기 위하여 일반적으로 보다 낮은 온도를 요구할 수 있다. 용어 "전방향 프라이머(forward primer)" 및 "역방향 프라이머(reverse primer)"는 중합 효소 연쇄 반응에 의해 증폭되는 주형의 일정한 부위의 3'말단 및 5'말단에 각각 결합하는 프라이머를 의미한다.
프라이머의 서열은 주형의 일부 서열과 완전하게 상보적인 서열을 가질 필요는 없으며, 주형과 혼성화 되어 프라이머 고유의 작용을 할 수 있는 범위 내에서의 충분한 상보성을 가지면 충분하다. 따라서, 일 구체예에 따른 프라이머 세트는 주형인 뉴클레오티드 서열에 완벽하게 상보적인 서열을 가질 필요는 없으며, 이 서열에 혼성화되어 프라이머 작용을 할 수 있는 범위 내에서 충분한 상보성을 가지면 충분한 것으로 해석된다.
일 구체예에 따른 프라이머는 주형의 한 부위에 혼성화 또는 어닐링되어, 이중쇄 구조를 형성한다. 이러한 이중쇄 구조를 형성하는 데 적합한 핵산 혼성화의 조건은 Joseph Sambrook, et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001) 및 Haymes, B. D., 등, 핵산 Hybridization, A Practical Approach, IRL Press, Washington, D.C.(1985)에 개시되어 있다.
헤파티티스 C 바이러스(Hepatitis C Virus, HCV)는 플라비비리데(flaviviridae) 패밀리의 헤파시바이러스(hepacivirus)속에 속하며, 외피를 가진 외가닥의 RNA 바이러스이다. HCV는 간세포를 감염시켜 염증을 유발시키고, 간 손상을 초래하는 병원체로 알려져 있다. 상기 헤파티티스 C 바이러스는 6가지의 유전자형으로 구분되며, 예를 들어, HCV genotype 1, HCV genotype 2, HCV genotype 3, HCV genotype 4, HCV genotype 5 및 HCV genotype 6 타입일 수 있다. HCV는 예를 들어, HCV 1a, HCV 1b 및 HCV 1c와 같이 더욱 다양한 아종으로 구분될 수 있다.
일 구체예에 따르면, HCV를 검출하기 위해 다양한 HCV 유형에 대해 공통적으로 인식할 수 있는 HCV 특이적인 프라이머는 50 내지 300 bp가 되도록 증폭 산물의 크기를 조절하여 제작하였다.
일 구체예에 따른 HCV 검출용 프라이머 세트 및 프로브에서 상기 프로브는 서로 상이한 검출 가능한 수단으로 표지될 수 있다. 상기 검출 가능한 수단은 프로브에 연결, 결합, 또는 부착시켜 통상적인 방식으로 밀도, 농도, 양 등을 확인할 수 있는 화합물, 생체 분자 또는 생체 분자 유사체 등을 의미한다. 예를 들면, 통상적으로 사용되는 형광 표지 인자, 발광물질, 생발광물질, 동위원소 등이 있으나, 이로 한정되는 것은 아니다. 일 구체예에 따르면, 상기 프로브의 5' 말단은 FAM, VIC, TET, JOE, HEX, CY3, CY5, ROX, RED610, TEXAS RED, RED670, TYE563 및 NED로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나의 형광 표지 인자로 표지되며, 3' 말단은 6-TAMRA, BHQ-1,2,3, Iowa Black RQ-Sp 및 MGBNFQ (molecular grove binding non-fluorescence quencher)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나의 형광 억제 물질(Quencher)로 표지된 것일 수 있다. 상기 형광 표지 인자는 현재 시중에 다수 종이 시판되고 있으므로, 상업적으로 용이하게 입수 가능하다. 상기 형광 표지 인자는 종류에 따라 여기 및 방출 파장이 다르며, 사용 방법 또한 상이하다. 형광 표지 인자는 당업계에 알려진 통상의 방법에 따라 상기 프로브에 표지될 수 있다. 일 구체예에 따른 카타클리브 프로브는 5'말단을 형광 표지 인자(예를 들면, Texas Red 615 등)로 3'말단을 형광 억제 물질(예를 들어, Iowa Black RQ-Sp 등)로 수식하여 PCR 반응액에 첨가될 수 있다. 카타클리브 프로브의 형광 발생 과정은 상기 설명한 바와 같다.
일 구체예에 따르면, 상기 프로브는 카타클리브 프로브(CatacleaveTM probe)일 수 있다. 카타클리브 프로브 기술은 DNA 중합 효소 활성을 갖고 있지 않은 두 번째 효소, 즉 RNase H에 의해 프로브의 절단이 이루어진다는 점에서 TaqManTM 와 다르다. 카타클리브 프로브는 프로브 분자 내에 예를 들면, 제한 효소 또는 RNase와 같은 엔도뉴클레아제의 표적이 되는 염기 서열, 즉 절단 부위를 갖는다. 일 구체예에 따르면, 카타클리브 프로브는 프로브의 5' 및 3' 말단은 DNA로 이루어져 있고, 절단 부위는 RNA로 이루어진 키메라 구조를 갖는다. 상기 프로브의 DNA 서열 부분은 말단 또는 내부적으로 FRET 쌍으로 표지될 수 있다. 카타클리브 프로브를 포함하는 실시간 PCR 반응에서, PCR 반응물은 RNA-DNA 듀플렉스(duplex)의 RNA 서열 부분을 특이적으로 자르는 RNase H 효소를 포함할 수 있다. 상기 효소에 의해 프로브 내의 RNA 서열 부분이 절단되면, 반응 온도에서 두 개의 반쪽 프로브(즉, 도너(donor)와 억셉터(acceptor))가 표적 엠플리콘(amplicon)으로부터 분리되고 반응 완충액으로 확산된다. 도너와 억셉터가 분리되면, TaqManTM 프로브와 같은 방법으로 형광 공명 에너지 이동(Fluorescence Resonance Energy Transfer, FRET)이 역전되고 도너의 발산이 모니터될 수 있다. 상기 절단 및 분리는 추가적인 카타클리브 프로브의 결합을 위한 위치를 엠플리콘 상에 재생성하게 된다. 이러한 방법으로 하나의 엠플리콘이 표적으로서 역할하거나, 프라이머가 카타클리브 프로브의 결합 위치를 통해 연장될 때까지 복수 회의 프로브 절단이 가능하다. 한편, 카타클리브 프로브에 대한 상세한 설명은 Anal. Biochem. 333:246-255, 2004 및 미국 특허 제6,787,304호에 자세히 개시되어 있으며, 상기 내용은 본 명세서에 참조로서 삽입된다.
용어, "올리고뉴클레오티드"는 일부 경우에서, "프라이머" 또는 "폴리뉴클레오티드"와 혼용될 수 있다.
올리고뉴클레오티드는 당업계에 알려진 방법에 따라, 적절한 방법(화학적 합성과 같은)에 의해 합성되고 제조될 수 있다. 또한, 올리고뉴클레오티드는 상업적으로 구입할 수 있다.
용어, "어닐링(annealing)" 및 "혼성화(hybridization)"는 혼용될 수 있으며, 하나의 핵산과 다른 핵산이 염기쌍 형성 상호 작용에 의해 듀플렉스, 트리플렉스(triplex), 또는 다른 고차원 구조의 형성을 야기하는 것을 의미한다. 일 구체예에서, 일차 상호 작용은, 예를 들어, A/T 및 G/C와 같이, Watson/Crick 및 Hoogsteen-type 수소 결합에 의한 염기 특이적이다. 일 구체예에서, 또한, 염기-스태킹(base-stacking) 및 소수성 상호 작용이 듀플렉스 안정성에 기여할 수 있다.
당업자라면, HCV 게놈 서열로부터 원하는 PCR 프라이머를 고안할 수 있을 것이다. 합성된 올리고는 대체적으로 55℃ 근처의 Tm(melting temperature) 값에 따라 12 내지 36 bp 길이일 수 있다.
용어, "표지(lable)" 또는 "검출가능한 표지(detectable label)"는 뉴클레오티드, 뉴클레오티드 중합체, 또는 핵산 결합 인자에 결합된 어떠한 화학적 모이어티를 의미할 수 있으며, 상기 결합은 공유 결합 또는 비공유 결합일 수 있다. 바람직하게는, 상기 표지는 검출 가능하며, 본 발명의 실험자에게 검출될 수 있는 상기 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 중합체일 수 있다. 검출가능한 표지는 발광 분자, 화학 발광 분자, 형광 색소, 형광 퀀칭제(quenching agent), 색깔 분자, 방사성 동위원소 또는 신틸런트(scintillant)를 포함한다. 검출가능한 표지는 또한, 임의의 유용한 링커 분자 (예를 들어, 비오틴, 아비딘, 스트랩트아비딘, HRP, protein A, protein G, 항체 또는 그의 단편, Grb2, 폴리히스티딘, Ni2+, FLAG 태그, myc 태그), 중금속, 효소(예를 들어. 알칼라인 포스파타제, 퍼옥시다제 및 루시퍼라제), 전자 공여체(donor)/수용체(acceptor), 아크리디늄 에스테르, 염료(dye) 및 열량 측정 기질(calorimetric substrate)를 포함한다. 또한, 표면 플라스몬 공명(surface plasmon resonance) 검출의 경우와 같이, 질량의 변화(a change in mass)를 나타내는데 검출가능한 표지가 고려될 수 있다. 당업자는 상기 언급되지 않은 유용한 검출가능한 표지에 대해서도 용이하게 인식할 수 있을 것이며, 이들 또한 본 발명의 실시에 사용될 수 있다.
다른 양상은 대상 시료로부터 총 핵산을 분리하는 단계; 상기 분리된 총 핵산 및 상기 키트를 혼합하여 실시간 PCR을 수행하는 단계; 및 상기 실시간 PCR 결과로부터 HCV의 존재 유무를 확인하는 단계를 포함하는 HCV를 검출하는 방법을 제공한다.
상기 HCV를 검출하는 방법을 각각의 단계별로 상세하게 설명하면 다음과 같다. 먼저, 상기 방법은, 대상 시료로부터 총 핵산을 분리하는 단계를 포함할 수 있다. 일 구체예에 따른 검출 방법은 HCV에 감염되었을 것으로 예상되는 시료(sample)에 적용할 수 있다. 상기 시료는 예를 들어, 배양된 세포, 동물 또는 인간의 간세포, 혈액, 혈장, 혈청, 정액, 타액 또는 점액 등의 체액을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 상기 핵산의 분리는 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 이루어질 수 있다. 이에 대한 구체적인 방법은 Joseph Sambrook, et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001)에 개시되어 있으며, 이 문헌은 본 명세서에 참조로써 삽입된다.
다음으로, 상기 분리된 총 핵산 및 상기 키트를 혼합하여 실시간 PCR을 수행하는 단계를 포함할 수 있다.
일 구체예에 따르면, 상기 실시간 PCR을 수행하는 단계 이전에 상기 분리된 총 RNA를 대상으로 역전사 반응을 수행하는 단계를 추가적으로 포함할 수 있다. 상기 방법은 RNA 바이러스인 HCV를 대상으로 하므로, 분리된 RNA를 실시간 PCR 반응에 사용될 수 있는 주형인 DNA(cDNA)로 변형시켜야 한다. 역전사 반응은 당업계에 잘 알려진 다양한 종류의 역전사 효소를 이용하여 실시될 수 있다.
일 구체예에 따르면, 상기 HCV 바이러스 검출용 키트는 통상적인 실시간 PCR 방법 및 장치를 사용하여 실시할 수 있다. 상기 실시간 PCR 방법은 열 순환기(thermal cycler) 및 분광 형광 광도계가 일체화된 장치를 이용하여, DNA 중합 효소와 FRET의 원리에 의해 PCR의 매 주기마다 실시간으로 나타나는 형광을 검출하고 정량하는 방법이다. 이러한 방법은 특이적인 증폭 산물을 비 특이적인 증폭 산물로부터 구별하여 확인할 수 있으며, 자동화된 양상으로 분석 결과를 쉽게 입수할 수 있다. 상기 실시간 PCR 방법에 사용할 수 있는 기기로는 AB 사의 실시간 PCR 기기 7900, 7500, 7300, Stratagene 사의 Mx3000p, BioRad 사의 Chromo 4 및 Roche Lightcycler 480 기기 등이 있으나, 이로 한정되는 것은 아니다. PCR 과정에서 상기 실시간 PCR 기기의 레이저는 증폭된 PCR 산물의 프로브에 표지된 형광 표지 인자를 감지하여 도 1과 같은 피크를 구현할 수 있다.
일 구체예에 따른 HCV의 검출 방법에 있어서, 실시간 PCR 반응은 당업계에 알려진 통상적인 조건으로 실시할 수 있으며, 예를 들어, 초기 변성(initial denaturation)을 95℃에서 10분 동안 수행한 후, 변성(denaturation, 95℃에서 10초), 어닐링 및 RNase HⅡ의 반응(55℃에서 10초) 및 신장(elongation, 72℃에서 30초)을 총 50회 실시하는 조건으로 수행할 수 있다. 상기 방법에 의해 검출할 수 있는 HCV는 상기한 바와 같다.
마지막으로, 상기 실시간 PCR 결과로부터 HCV의 존재 유무를 확인하는 단계를 포함할 수 있다.
상기 HCV의 존재 유무는 상기 실시간 PCR 과정에서 증폭된 PCR 산물의 프로브에 표지된 형광 표지 인자를 감지하여 나타나는 곡선으로부터, PCR 증폭 산물이 일정량 증폭되었을 때의 사이클 수인 Ct 값을 계산함으로써 확인할 수 있다. Ct 값은 예를 들어, 15 내지 50, 또는 20 내지 45인 경우에 상기 HCV 속의 바이러스가 존재한다고 판단할 수 있다. 한편, 상기 Ct 값의 계산은 상기 실시간 PCR 기기 내에 포함된 프로그램에 의해 자동으로 수행될 수 있다.
HCV를 검출하는 키트 및 상기 키트를 사용하여 HCV를 검출하는 방법에 따르면, 적은 카피 수의 대상 시료만으로도 검출 결과를 실시간으로 신속하게 확인할 수 있다.
상기 개시된 구체예는 시료 중 HCV 핵산 서열을 실시간으로 검출할 수 있다는 이점을 포함하여, 많은 이점을 가지고 있다. 상기 검출 방법은 신속하고, 정확하며, 고효율에 적합하다.
증폭
상기 핵산이 시료로부터 분리되고, 프라이머가 선택되면, 핵산 증폭은 중합효소 연쇄 반응 (PCR) 또는 Ligase Chain Reaction, Self-Sustained Sequence Replication, Strand Displacement Amplification, Transcriptional Amplification System, Q-Beta Replicase, Nucleic Acid Sequence Based Amplification (NASBA), Cleavage Fragment Length Polymorphism, Isothermal and Chimeric Primer-initiated Amplification of Nucleic Acid, Ramification-extension Amplification Method 또는 다른 적절한 핵산 증폭 방법과 같은 증폭 반응을 포함한 다양한 방법에 의해 수행될 수 있다.
"중합 효소 연쇄 반응(polymerase chain reaction)" 또는 "PCR"은, 일반적으로 원하는 뉴클레오티드 서열을 인 비트로(in vitro)에서 증폭하는 방법을 의미한다. 상기 과정은 미국 특허 제4,683,202호, 제4,683,195호, 제4,800,159호, 및 제4,965,188호에 상세하게 설명되어 있으며, 상기 내용은 전체로서 본 명세서에 삽입된다. 일반적으로, 상기 PCR 과정은 2배 몰농도 이상 과량의, 상기 이중 가닥 표적 서열의 반대 가닥에 상보적인 올리고뉴클레오티드 프라이머를 원하는 표적 서열(들)을 포함하는 반응 혼합물에 넣는 단계로 이루어져 있다. 상기 반응 혼합물은 DNA 폴리머라제의 존재 하에 온도 싸이클링(thermal cycling) 프로그램에 적용하여, 상기 DNA 프라이머 세트 사이의 원하는 표적 서열을 증폭하도록 한다.
상기 DNA 중합 효소는 예를 들어, Thermus aquaticus (Taq), Thermus thermophilus (Tth), Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis 또는 Pyrococcus furiosus (Pfu)로부터 수득한 열 안정성 DNA 중합 효소일 수 있다. 또한, RNase H는 예를 들어, Pyrococcus furiosus RNase H II, Pyrococcus horikoshi RNase H II, Thermococcus litoralis RNase HI 또는 Thermus thermophilus RNase HI과 같은 열 안정적인 RNase H 효소를 포함하나 이에 한정하지는 않는다. 완충 용액은 증폭 반응의 pH를 조절함으로써 증폭 반응의 하나 이상의 구성 요소의 안정성, 활성, 및/또는 수명을 변형시키는 증폭 반응에 첨가되는 화합물로서, 이러한 완충 용액들은 당업계에 잘 알려져 있으며, 예를 들어, Tris, Tricine, MOPS, 또는 HEPES일 수 있으나 이에 한정하지는 않는다. 이 외에도, 상기 키트는 dNTP 혼합물(dATP, dCTP, dGTP, dTTP) 및 DNA 중합 효소 조인자를 포함할 수 있다. 상기 프라이머 세트 및 프로브는 하나의 반응 용기, 스트립 또는 마이크로 플레이트에 패키징될 수 있으며, 당업계에 공지된 방법으로 패키징될 수 있다.
유전자 발현을 연구하기 위해 가장 광범위하게 사용되는 기법 중 하나가 PCR에 의한 증폭을 위해 mRNA 서열(들)을 주형으로 최초-가닥 cDNA를 활용하는 것이다. 종종 PCR 또는 역전사 효소-PCR로서 해석되는, 상기 방법은 PCR 과정의 높은 민감성 및 특이성을 이용하며, RNA의 검출 및 정량에 광범위하게 사용된다.
종점(end-point) 또는 실시간 어세이로서 수행되는 상기 역전사 효소-PCR 과정은 두 단계의 분리된 분자적 합성을 포함한다: (i) RNA 주형으로부터 cDNA의 합성; 및 (ii) PCR 증폭을 통해 새로 합성된 cDNA의 복제. 역전사 효소-PCR와 종종 연관된 기술적인 문제를 처리하기 위한 시도로, 상기 과정의 3가지 기본적인 단계를 고려하여 다수의 프로코콜이 개발되었다: (a) RNA의 변성(denaturation) 및 역방향 프라이머의 혼성화; (b)cDNA의 합성; 및 (c) PCR 증폭. 소위 "연결되지 않은된(uncoupled)" 역전사 효소-PCR 과정(예를 들어, 투 스텝(two step) 역전사 효소-PCR)에서 역전사는 역전사 효소 활성을 위한 최적의 완충액 조건을 사용하여 독립적인 단계로서 수행된다. cDNA 합성에 이어, 상기 반응은 Taq DNA 폴리머라제 활성에 최적인 조건으로 MgCl2 및 디옥시리보뉴클레오시드 트리포스페이트(dNTP) 농도가 감소하도록 희석한 다음, PCR을 표준 조건(미국 특허 제4,683,195호 및 제4,683,202호를 참조한다.)에 따라 수행한다. 이에 반해, "연결된(coupled)" 역전사 효소 PCR 방법은 역전사 효소 및 Taq DNA 폴리머라제 활성을 위하여 공통의 완충액을 사용한다. 제1 버전에서, 역방향 프라이머의 어닐링은 효소의 첨가 이전 분리된 단계이며, 이후 단일 반응 용기에 첨가한다. 다른 버전에서, 역전사 효소 활성은 열안정성 Tth DNA 폴리머라제의 구성 요소이다. 어닐링 및 cDNA 합성은 Mn2+의 존재 하에서 수행되며, 이후 PCR은 킬레이트 시약에 의해 Mn2+가 제거된 후에 Mg2+의 존재 하에서 수행된다. 마지막으로, 상기 "연속적인(continuous)" 방법(예를 들어, 원 스텝(one step) 역전사 효소-PCR)은 상기 역전사 효소-PCR 3 단계를 성분 또는 효소 첨가를 위한 반응 튜브의 개방을 방지하는 하나의 연속적인 반응으로 통합한다. 연속적인 역전사 효소-PCR은 DNA 폴리머라제 및 역전사 효소 활성을 사용하는 단일 효소 시스템(예를 들어, Tth 또는 ZO5) 및 역전사 효소 활성을 갖는 효소(예를 들어, AMV, MMLV 등) 및 DNA 폴리머라제 활성을 갖는 효소(예를 들어, Taq DNA 폴리머라제)의 2가지의 효소를 조합한 2 효소 시스템으로서 설명된다. RNA 변성 단계는 생략한다.
실시간에서 첫단계인, 역전사 PCR은 주형 특이적인 DNA 프라이머의 하나를 사용하여 상보적인 DNA 가닥을 생성한다. 전통적인 PCR 반응에서 이 생성물은 변성되고, 제2 주형 특이적인 프라이머가 상기 cDNA에 결합하여, 듀플렉스 DNA를 형성하도록 확장된다. 이 생성물은 온도 싸이클링의 다음 단계에서 증폭된다. 가장 높은 민감성을 유지하기 위해, cDNA의 합성 전에 상기 RNA는 분해되지 않는 것이 중요하다. RNA:DNA 하이브리드는 RNase H의 기질이 될 수 있기 때문에 반응 완충액에서 RNase H의 존재는 상기 과정의 첫 단계에서 형성되는 RNA:DNA 하이브리드의 원하지 않는 분해를 야기할 것이다. 이러한 문제를 극복하는 2가지 주요 방법이 존재한다. 하나는 DNA 변성 단계 시작의 높은 온도 동안에 녹을 수 있는 왁스와 같은 막을 사용함으로써 역전사 반응의 나머지로부터 RNase H를 물리적으로 분리하는 것이다. 두번째 방법은 일반적으로 45-55℃인 역전사 온도에서 불활성화되도록 RNase H를 변형시키는 것이다. RNase H를 항체와 반응시키거나, 또는 가역적인 화학 변형을 포함한 여러 방법이 당업계에 알려져 있다. 예를 들어, 핫 스타트(hot start) RNase H가 개시되어 있다.
본 발명에서 사용될 수 있는 RNAse H 효소 및 핫 스타트 RNAse H 효소의 추가적인 예는 Walder et al.의 미국 특허 출원 제2009/0325169호에 개시되어 있다.
원 스텝 역전사 효소-PCR는 연결되지 않은 역전사 효소-PCR에 비해 몇가지 이점을 제공한다. 원 스텝 역전사 효소-PCR은 연결되지 않은 역전사 효소-PCR(예를 들어, 두 단계의 반응 사이에서 성분 또는 효소의 첨가를 위해 반응 튜브를 여는 등)에 비해 반응 혼합물 시약 및 핵산 산물의 조작(handling)이 덜 요구되며, 따라서 노동 강도가 적고, 요구되는 시간이 줄어든다. 원 스텝 역전사 효소-PCR은 또한, 시료를 적게 요구하며, 오염의 위험을 줄일 수 있다. 원-스텝 역전사 효소-PCR의 민감성 및 특이성은 주어진 시료 또는 병원성 RNA의 검출에 있어서 하나 내지 여러 개의 유전자의 발현 수준을 연구하는데 적합하다고 증명되었다. 일반적으로, 이러한 과정은 cDNA 합성을 시작하기 위해 유전자-특이적인 프라이머의 사용을 제한한다.
이들 역전사 효소-PCR 기법과 조합된 실시간 검출에 의한 PCR 반응의 동역학을 측정하는 능력은 높은 민감도를 갖는 RNA 카피 수를 정확하고 정밀하게 결정하도록 한다. 이는 하기 설명될 5' 형광 발생 뉴클레아제 어세이(Taq-Man) 또는 엔도뉴클레아제 어세이(CataCleave)와 같은, 형광 이중-표지된 혼성화 프로브 기법에 의한 증폭 과정 동안 PCR 산물의 형광 모니터링 및 측정을 통해 역전사 효소-PCR 산물을 검출함으로써 가능하다.
실시간 방법은 상기 PCR 과정 동안 증폭을 모니터링하기 위해 개발되었다. 이들 방법은 일반적으로 새로 합성되는 DNA에 결합하는 형광 표지된 프로브 또는 두가닥의 DNA에 인터칼레이트(intercalate)될 때 형광 방출이 증가하는 다이(dye)를 사용한다.
CataCleave 프로브를 이용한 HCV 표적 핵산 서열의 실시간 PCR
상기 프로브는 일반적으로 표적이 없을 경우, 두개의 발색단 사이에서 형광 공명 에너지 이동(fluorescence resonance energy transfer: FRET)에 의해 공여체 방출이 소멸될 수 있도록 설계된다. 공여체 발색단(donor chromophore)은 여기 상태(excited state)에서, 발색단 쌍이 가까운 거리에 위치시에 수용체 발색단(acceptor chromophore)에 에너지를 전달한다. 이러한 전달은 항상 비-방사선으로, 쌍극자-쌍극자 결합(dipole-dipole coupling)을 통하여 일어난다. 발색단 사이의 거리를 충분히 증가시키는 모든 공정은 FRET 효율을 감소시켜서, 공여체 발색단 방출을 방사능적으로 검출할 수 있게 된다. 일반적인 수용체 발색단은 FAM, TAMRA, VIC, JOE, Cy3, Cy5, 및 Texas Red 등을 포함한다. 수용체 발색단은 공여체의 방출 스펙트럼와 여기 스펙트럼(excitation spectra)이 겹칠 수 있도록 선택된다. 예를 들어, 이러한 결합 쌍에는 FAM-TAMRA가 있다. 또한, 광범위한 공여체를 퀀치(quench)하는 비형광 수용체가 있을 수 있다. 이외에도 적합한 공여체-수용체 FRET 쌍의 다른 예들은 당업자에게 잘 알려져 있다.
PCR의 실시간 검출을 위해 사용될 수 있는 FRET 프로브의 공통적인 예는 분자 비콘 (molecular beacons)(예를 들어, 미국 특허 제5,925,517호), Taq-Man 프로브(예를 들어, 미국 특허 제5,210,015호 및 제5,487,972호), 및 CataCleave 프로브(예를 들어, 미국 특허 제5,763,181호)를 포함한다. 분자 비콘은 단일 가닥의 올리고뉴클레오티드로서, 비결합상태에서는 상기 프로브는 공여체와 수용체 발색단과 근접하여, 공여체 방출을 감소시킬 수 있는 이차 구조를 형성하게끔 고안되어 있다. 적절한 반응 온도에서, 비콘은 구조가 풀어져서, 특히 앰플리콘에 결합한다. 일단 풀리게 되면, 공여체와 수용체 발색단 사이의 거리가 증가하여, FRET이 바뀌게 되고, 특별한 기기를 이용하여 공여체 방출을 모니터할 수 있게 된다. Taq-Man 및 CataCleave 기법은, 이용되는 FRET 프로브가 절단되어, 공여체와 수용체 발색단이 FRET을 바꾸기에 충분할 정도로 떨어지게 된다는 점에서 분자 비콘과는 다르다.
Taq-Man 기법은 5' 말단에 공여체 발색단으로 표지되고, 3' 말단에 수용체 발색단으로 표지된 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 프로브를 이용한다. 증폭을 위해 이용되는 상기 DNA 폴리머라제는 5'->3' 엑소뉴클레아제 활성(exonuclease activity)을 가지고 있어야 한다. Taq-Man 프로브는 프라이머가 결합할 때 같이 앰플리콘의 하나의 가닥에 결합한다. DNA 폴리머라제가 프라이머를 신장시키는 동안, 폴리머라제는 결국 결합된 Taq-Man 프로브와 마주치게 될 것이다. 이때, 폴리머라제의 엑소뉴클레아제 활성이 5' 말단에서 시작하여 순차적으로 Taq-Man 프로브를 분해하게 될 것이다. 상기 프로브가 분해됨에 따라, 프로브를 포함하는 모노뉴클레오티드는 반응 완충액으로 나오게 된다. 공여체가 수용체로부터 확산됨에 따라, FRET은 바뀌게 된다. 공여체로부터의 방출은 프로브 절단을 확인하기 위하여 모니터된다. Taq-Man의 작용 때문에, 특별한 앰플리콘은 PCR의 매 싸이클마다 오직 한번씩 검출될 수 있다. Taq-Man 표적 부위를 통한 프라이머의 신장은 이중 가닥 산물을 생성하고, 앰플리콘이 다음 PCR 싸이클에서 변성되기 전까지 Taq-Man 프로브의 추가 결합을 막는다.
본 명세서에 참조로서 결합된 미국 특허 제5,763,181호의 내용은 또 다른 실시간 검출 방법(CataCleave라고 명명함)을 개시하고 있다. CataCleave 기법은 프로브의 절단이 폴리머라제 활성이 없는 2차 효소에 의해 수행된다는 점에서 Taq-Man과 다르다. CataCleave 프로브는, 예를 들어 제한 효소 또는 RNase와 같은 엔도뉴클레아제의 표적 분자 내에 서열을 가지고 있다. 일 구체예에서, CataCleave 프로브는 프로브의 5' 및 3' 말단은 DNA로, 절단 부위는 RNA로 구성되어 있는, 키메릭 구조를 가지고 있다. 상기 프로브의 DNA 서열 부분은, 양말단이나 또는 내부에 FRET 쌍으로 표지된다. PCR 반응은 RNA-DNA 이중가닥의 RNA 서열 부분을 특이적으로 절단할 수 있는 RNase H 효소를 포함한다. 절단후에, 프로브의 반쪽 모두는 반응 온도에서 표적 앰플리콘에서 해리되며, 반응 용액으로 분산된다. 공여체 및 수용체가 분리될수록, FRET은 Taq-Man 프로브와 같은 방법으로 바뀌게 되며, 공여체 방출은 모니터 될 수 있다. 절단 및 해리는 추가적인 CataCleave 결합을 위한 부위를 재생산하게 된다. 이러한 방법으로, 프라이머가 CataCleave 프로브 결합 부위를 통하여 신장될 때까지, 단일 앰플리콘이 표적으로서 또는 프로브 절단을 여러회 반복할 수 있게 해준다.
HCV-특이적인 CataCleave 프로브의 표지
용어, "프로브(probe)"는 예를 들어, 표적 핵산 서열과 같은 특이적인 핵산 서열의 상보적인 영역을 갖는 서열-특이적인 방법으로 혼성화되도록 고안된 특이적인 부분을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일 구체예에서, 상기 올리고뉴클레오티드 프로브는 15 내지 60개의 뉴클레오티드 범위이다. 더욱 바람직하게는, 상기 올리고뉴클레오티드 프로브는 18 내지 45개의 뉴클레오티드 범위이다. 본 발명의 올리고뉴클레오티드 프로브의 정확한 서열 및 길이는 상기 프로브가 결합하는 표적 폴리뉴클레오티드의 성질에 따라 부분적으로 달라진다. 결합 위치 및 길이는 특정한 구체예에서 적절한 어닐링 및 변성되는 특성을 이루기 위하여 다양할 수 있다. 이러한 고안 선택을 위한 지침은 Taq-man 어세이 또는 CataCleave를 개시하는 문헌, 미국 특허 제5,763,181호, 제6,787,304호, 및 제7,112,422호에서 발견될 수 있으며, 상기 내용은 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입된다.
본 명세서에서 사용되는 용어, "표지(label)" 또는 "검출가능한 표지(detectable lebel)"는 공유 결합 또는 비공유 결합에 의해 프로브에 결합된 형광 색소 화합물을 포함하는 CataCleave 프로브의 임의의 표지를 의미할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어, "형광 색소(fluorochrome)"는 방출되는 빛보다 더 짧은 파장의 빛에 의해 여기(excitation)되는 빛을 방출하는 형광 화합물을 의미한다. 용어, "형광 공여체(fluorescent donor 또는 or fluorescence donor)"는 본 발명에 개시된 어세이에서 측정되는 빛을 방출하는 형광 색소를 의미한다. 더욱 구체적으로, 형광 공여체는 형광 수용체(acceptor)에 의해 흡수되는 빛을 제공한다. 용어, "형광 수용체(fluorescent acceptor 또는 fluorescence acceptor)"는 형광 공여체로부터 방출되는 에너지를 흡수하는 제2 형광 색소 또는 퀀칭(quencing) 분자를 의미한다. 제2 형광 색소는 형광 공여체로부터 방출되는 에너지를 흡수하며, 형광 공여체에 의해 방출되는 빛보다 더 긴 파장의 빛을 방출한다. 퀀칭 분자는 형광 공여체에 의해 방출된 에너지를 흡수한다.
어떠한 발광 분자, 바람직하게는 형광 색소 및/또는 형광 퀀쳐(quencher)라도 본 발명의 실시에 사용될 수 있다. 상기 발광 분자는 예를 들어, Alexa Fluor 350, Alexa Fluor 430, Alexa Fluor 488, Alexa Fluor 532, Alexa Fluor 546, Alexa Fluor 568, Alexa Fluor 594, Alexa Fluor 633, Alexa Fluor 647, Alexa Fluor 660, Alexa Fluor 680, 7-디에틸아미노카우마린-3-카르복실산, 플루오레세인, Oregon Green 488, Oregon Green 514, 테트라메틸로다민, 로다민 X, 텍사스 레드 염료, QSY 7, QSY33, Dabcyl, BODIPY FL, BODIPY 630/650, BODIPY 6501665, BODIPY TMR-X, BODIPY TR-X, 디알킬아미노코우마린, Cy5.5, Cy5, Cy3.5, Cy3, DTPA(Eu3+)-AMCA 및 TTHA(Eu3+)AMCA를 포함하나, 이에 한정하지는 않는다.
일 구체예에서, 상기 올리고뉴클레오티드 프로브의 3' 말단 뉴클레오티드는 차단되어 있거나 또는 핵산 폴리머라제에 의해 확장되지 못하도록 되어 있다. 이러한 차단은 상기 프로브의 말단 3' 지역에 리포터(reporter) 또는 퀀쳐 분자를 부착함으로서 편리하게 수행될 수 있다.
일 구체예에서, 리포터 분자는 연결 모이어티를 통해 상기 프로브의 3' 말단 또는 5' 말단의 끝에 부착을 위해 유래된 형광 유기 염료이다. 바람직하게는, 퀀쳐 분자는 본 발명의 구체예에 따라 형광 또는 형광이 아닐 수 있는, 유기 염료이다. 예를 들어, 본 발명의 바람직한 구체예에서, 상기 퀀쳐 분자는 비-형광이다. 일반적으로 퀀쳐 분자가 형광이거나 또는 비-방사성의 분해에 의해 리포터로부터 전달되는 에너지를 단순히 방출한다면, 상기 퀀쳐의 흡수 밴드는 상기 리포터 분자의 형광 방출의 흡수 밴드와.실질적으로 겹치게 될 것이다. 본 명세서에서, 여기된 리포터 분자로부터 흡수되지만, 방사성의 에너지를 방출시키지 않는 비-형광 퀀쳐 분자를 발색성 분자(chromogenic molecule)로 해석되어진다.
리포터-퀀쳐 쌍은 예를 들어, 플루오레세인 및 로다민 염료를 포함하는 잔텐 염료(xanthene dye)들로부터 선택될 수 있다. 올리고뉴클레오티드의 결합을 위한 결합 부위로서 또는 결합 기능성(functionality)으로서 사용될 수 있는 페닐 모이어티 상에 치환기를 갖는, 이들 화합물의 다양한 적절한 형태를 널리 상업적으로 입수할 수 있다. 형광 화합물의 다른 그룹은 알파 또는 베타 위치에 아미노기를 갖는 나프틸아민이다. 상기 나프틸아미노 화합물은 1-디메틸아미노나프틸-5-술포네이트, 1-아닐리노-8-나프탈렌 술포네이트 및 2-p-토우리디닐-6-나프탈렌 술포네이트와 같은 화합물을 포함한다. 다른 염료는 3-페닐-7-이소시아나토코우마린, 9-이소티오시아나토아크리딘 및 아크리딘 오렌지과 같은 아크리딘; N-(p-(2-벤조옥사졸릴)페닐)말레이미드; 벤조옥사디아졸, 스틸벤(stilbene), 피렌(pyrene) 등을 포함한다.
일 구체예에서, 리포터 및 퀀쳐 분자는 플루오레세인 및 비-형광 퀀쳐 염료로부터 선택된다.
올리고뉴클레오티드의 5' 또는 3' 말단에 리포터 또는 퀀쳐 분자를 부착하는 다양한 링킹 모이어티(linking moiety) 및 방법론은 하기 참고 문헌에 예시되어 있다: Eckstein, editor, Oligonucleotide and Analogues: A Practical Approach (IRL Press, Oxford, 1991); Zuckerman et al., Nucleic Acid Research, 15: 5305-5321 (1987) (3' thiol group on oligonucleotide); Sharma et al., Nucleic Acid Research, 19: 3019 (1991) (3' sulfhydryl); Giusti et al., PCR Method and Applications, 2: 223-227 (1993) and Fung et al., 미국 특허 제4,757,141호 (5' phosphoamino group via Aminolink. II available from Applied Biosystems, Foster City, Calif.) Stabinsky, 미국 특허 제4,739,044호 (3' aminoalkylphosphoryl group); Agrawal et al., Tetrahedron Letters, 31: 1543-1546 (1990) (attachment via phosphoramidate linkages); Sproat et al., Nucleic Acid Research, 15: 4837 (1987) (5' mercapto group); Nelson et al., Nucleic Acid Research, 17: 7187-7194 (1989) (3' amino group) 등.
로다민 및 비-형광 퀀쳐 염료는 또한 고체상 합성의 시작 단계에서 올리고뉴클레오티드의 3' 말단에 편리하게 부착될 수 있다, 예를 들어, Woo et al., 미국 특허 제5,231,191호; 및 Hobbs, Jr., 미국 특허 제4,997,928호를 참조한다.
고체 지지체에의 HCV-특이적 CataCleave 프로브의 부착
본 발명의 일 구체예에서, 올리고뉴클레오티드 프로브는 고체 지지체에 부착될 수 있다. 상이한 프로브들은 고체 지지체에 부착될 수 있고 시료 내의 상이한 표적 서열을 동시에 검출하는데 사용될 수 있다. 상이한 형광 파장을 갖는 리포터 분자는 상이한 프로브에 사용될 수 있고, 따라서 상이한 프로브에 대한 혼성화가 별개로 검출되는 것을 가능하게 한다.
올리고뉴클레오티드 프로브의 고정을 위한 고체 지지체의 바람직한 형태의 예는 폴리스티렌, 아비딘 코팅된 폴리스티렌 비드 셀룰로즈, 나일론, 아크릴아미드 겔 및 활성화된 덱스트란, 통제된 공극 유리(controlled pore glass: CPG), 유리 플레이트 및 고 교차-결합(highly cross-linked) 폴리스티렌을 포함한다. 이러한 고체 지지체들은 그들의 화학적 안정성, 기능화(functionalization)의 용이함 및 잘 규정된 표면 면적 때문에 혼성화 및 진단 연구에서 바람직하다. 통제된 공극 유리 (500 Å, 1000 Å) 및 비-팽창 고 교차-결합 폴리스티렌 (1000 Å)과 같은 고체 지지체가 올리고뉴클레오티드 합성과의 그들의 친화성(compatibility) 때문에 특히 바람직하다.
올리고뉴클레오티드 프로브는 고체 지지체에 다양한 방식으로 부착될 수 있다. 예를 들면, 상기 프로브는 상기 프로브의 3' 또는 5' 말단 뉴클레오티드를 상기 고체 지지체에 부착하는 것에 의해 상기 고체 지지체에 부착될 수 있다. 그러나, 상기 프로브는 상기 프로브를 상기 고체 지지체로부터 거리를 두도록 하는 링커에 의해 상기 고체 지지체에 부착될 수 있다. 상기 링커는 가장 바람직하게는 30 원자 길이 이상, 더 바람직하게는 50 원자 길이 이상이다.
고체 지지체에 고정된 프로브의 혼성화는 일반적으로 상기 프로브가 30 원자 이상, 더 바람직하게는 50 원자 이상에 의해 상기 고체 지지체로부터 분리되는 것을 필요로 한다. 이러한 분리를 성취하기 위해서, 링커는 일반적으로 상기 링커 및 3' 뉴클레오시드 사이에 위치한 스페이서(spacer)를 포함한다. 올리고뉴클레오티드 합성을 위해, 상기 링커 팔(arm)은 보통 염기성 시약으로 절단되어 올리고뉴클레오티드를 상기 고체 지지체로부터 자유롭게 할 수 있는 에스테르 결합에 의해 3' 뉴클레오시드의 3'-OH에 부착된다.
올리고뉴클레오티드 프로브를 고체 지지체에 부착하는데 사용할 수 있는 다양한 종류의 링커가 당업계에 알려져 있다. 링커는 표적 서열이 고체 지지체에 부착된 프로브에 혼성화되는 것을 현저하게 방해하지 않는 임의의 화합물로 형성될 수 있다. 링커는 자동화된 합성에 의해 링커에 쉽게 첨가될 수 있는 동종중합체 올리고뉴클레오티드로 형성될 수 있다. 대안적으로, 기능화된 폴리에틸렌 글리콜과 같은 폴리머가 상기 링커로서 사용될 수 있다. 이러한 폴리머는 그들이 프로브의 표적 올리고뉴클레오티드에의 혼성화를 현저하게 방해하지 않기 때문에 동종중합체 올리고뉴클레오티드에 비해 바람직하다. 폴리에틸렌 글리콜은 그것이 상업적으로 구입 가능하고, 유기 및 수성 배지 모두에 용해 가능하고, 기능화하기 편리하고, 및 올리고뉴클레오티드 합성 및 합성-후 상태 하에서 완전히 안정하기 때문에 특히 바람직하다.
고체 지지체, 링커 및 프로브 간의 결합은 높은 온도에서의 염기 조건 하에서 염기 보호기의 제거 동안 바람직하게는 절단되지 않는다. 바람직한 결합의 예는 카르바메이트 및 아미드 결합을 포함한다. 프로브의 고정(immobilization)은 당업계에 잘 알려져 있고, 업계의 통상의 기술자는 고정 조건을 결정할 수 있다.
본 방법의 일 구체예에 따르면, 혼성화 프로브는 고체 지지체 상에 고정된다. 올리고뉴클레오티드 프로브는 혼성화에 유리한 조건 하에서 핵산의 시료과 접촉된다. 비혼성화 상태에서는, 형광 표지는 퀀쳐(quencher)에 의해 억제된다. 표적과 혼성화되면, 형광 표지는 퀀쳐로부터 분리되어 형광을 발한다.
또한 고체 지지체에의 혼성화 프로브의 고정은 프로브에 혼성화된 표적 서열을 시료로부터 쉽게 분리될 수 있게 한다. 그 후의 단계에서, 분리된 표적 서열을 고체 지지체에서 분리하여 연구자의 특별한 필요에 따라, 당업계에 잘 알려진 방법으로 가공(예를 들어, 정제, 증폭)될 수 있다.
CataCleave 프로브를 사용한 HCV 표적 핵산 서열의 실시간 검출.
상기 표지된 올리고뉴클레오티드 프로브는 시료 내에서 살모넬라 표적 핵산 서열의 실시간 검출을 위한 프로브로서 사용될 수 있다.
CataCleave 올리고뉴클레오티드 프로브는 먼저 선택된 살모넬라 표적 서열을 포함하는 PCR 엠플리콘 내에서 발견되는 서열과 상보적인 DNA 및 RNA 서열로 합성된다. 일 구체예에서, 상기 프로브는 FRET 쌍, 예를 들면 프로브의 한 쪽 말단은 플루오레세인 분자로 및 다른 말단은 비-형광 퀀쳐 분자로 표지된다. 따라서, 상기 프로브가 PCR 엠플리콘과 혼성화 되었을 때, RNase H 활성에 의해 절단될 수 있는 RNA:DNA 헤테로듀플렉스 형태가 형성된다.
RNase H는 RNA-DNA 혼성체에서 RNA를 가수분해한다. 이 효소는 처음 소의 가슴샘에서 확인되었으나 그 후 다양한 생물에서 발견되었다. RNase H 활성은 진핵생물 및 박테리아에 편재하여(ubiquitous) 나타난다. 비록 RNase H가 다양한 분자량 및 핵 용해 활성의 단백질 패밀리로 구성되나, 기질 필요물은 다양한 동형(isotype) 간에 유사하게 나타난다. 예를 들면, 지금까지 연구된 대부분의 RNase H는 엔도뉴클레아제로서 기능을 하고 5' 포스페이트 및 3' 히드록실 말단을 갖는 절단 생산물을 생산하기 위해 2가 양이온(예를 들면, Mg2+, Mn2+)을 필요로 한다.
E.coli 유래의 RNase HI는 RNase H 패밀리 중 가장 잘 알려져 있다. RNase HI외에도, 2번째의 E.coli RNase H, RNase HII가 클로닝되고 특성이 확인되었다 (Itaya, M., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1990, 87, 8587-8591). RNase HI은 155개의 아미노산으로 이루어져 있는데 비해, 이는 213개의 아미노산으로 이루어져 있다. E. coli RNase HII는 E. coli RNase HI과 단지 17%의 상동성(homology)를 나타낸다. S. 티피무리움으로부터 클로닝된 RNase H는 E. coli RNase HI와 단지 11개의 위치에서 상이하고 155개의 아미노산으로 이루어져 있다 (Itaya, M. and Kondo K., 핵산s Res., 1991, 19, 4443-4449).
RNase H 활성을 나타내는 단백질이 클로닝되고 여러 개의 바이러스, 다른 박테리아 및 효모로부터 정제되었다 (Wintersberger, U. Pharmac. Ther., 1990, 48, 259-280). 많은 경우에 있어서, RNase H 활성을 갖는 단백질들이 RNase H가 다른 효소, 보통 DNA 또는 RNA 폴리머라제의 아미노 또는 카르복시 말단에 융합된 융합 단백질로 나타난다. RNase H 도메인은 대장균 RNase HI과 높은 상동성이 있는 것으로 지속적으로 밝혀졌으나 다른 도메인이 실질적으로 다양하여, 융합 단백질의 분자량 및 다른 특성이 매우 다양하다.
고등 진핵 생물에서 RNase H의 2개 클래스는 분자량, 2가 양이온의 효과, 술프히드릴(sulfhydryl) 시약에 대한 감수성 및 면역학적 교차-반응성의 차이에 기초하여 정의되어 왔다(Busen et al., Eur. J. Biochem., 1977, 74, 203-208). RNase HI 효소는 68-90 kDa 범위의 분자량을 가지고, Mn2+ 또는 Mg2+에 의해 활성화되고 및 술프히드릴 시약에 무감수성인 것으로 보고되었다. 반대로, RNase H II 효소는 31-45 kDa 범위의 분자량을 갖고, Mg2+를 필요로하고, 술프히드릴 시약에 고감수성을 보이고, Mn2+에 의해 억제되는 것으로 보고되었다(Busen, W., and Hausen, P., Eur. J. Biochem., 1975, 52, 179-190; Kane, C. M., Biochemistry, 1988, 27, 3187-3196; Busen, W., J. Biol. Chem., 1982, 257, 7106-7108.).
RNase HII 특성을 갖는 효소가 인간 태반으로부터 거의 균질하게 정제되었다 (Frank et al., 핵산s Res., 1994, 22, 5247-5254). 이 단백질은 약 33kDa의 분자량을 갖고 6.5-10의 pH 범위에서 활성화되고 최적 pH가 8.5-9인 것으로 보고된다. 상기 효소는 Mg2+를 필요로 하고 Mn2+및 n-에틸 말레이미드에 의해 억제되는 것으로 보고되었다. 절단 반응의 생성물은 3' 히드록실 및 5' 포스페이트 말단을 갖는다.
일 구체예에 따르면, 실시간 핵산 증폭은 열안정성 핵산 폴리머라제, RNase H 활성, 살모넬라 표적 폴리뉴클레오티드에 혼성화될 수 있는 PCR 증폭 프라이머 쌍, 및 표지된 CataCleave 올리고뉴클레오티드 프로브의 존재 하에 표적 폴리뉴클레오티드에서 수행된다. 실시간 PCR 반응 동안, RNase H에 의한 프로브의 절단은 형광 퀀쳐로부터 형광 공여체를 분리시켜 시료 내의 살모넬라 표적 DNA 서열의 실시간 검출에 따라 프로브의 형광이 실시간으로 증가하게 한다.
일 구체예에서, 실시간 핵산 증폭은 약 45회 이하의 PCR 증폭 싸이클에서 단일 표적 DNA 분자의 실시간 검출을 가능하게 한다.
시료 중 HCV 유전자 서열의 실시간 검출의 예시
먼저, 상기 방법은, 대상 시료로부터 총 핵산을 분리하는 단계를 포함한다. 일 구체예에 따른 검출 방법은 HCV에 감염되었을 것으로 예상되는 시료(sample)에 적용할 수 있다. 상기 시료는 예를 들어, 배양된 세포, 동물 또는 인간의 간세포, 혈액, 혈장, 혈청, 정액, 타액 또는 점액 등의 체액을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 상기 핵산의 분리는 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 이루어질 수 있다. 이에 대한 구체적인 방법은 Joseph Sambrook, et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001)에 개시되어 있으며, 이 문헌은 본 명세서에 참조로써 삽입된다.
다음으로, 상기 방법은 상기 분리된 총 핵산 및 관련된 반응 성분들을 혼합하여 실시간 PCR을 수행하는 단계를 포함한다.
일 구체예에 따르면, 상기 실시간 PCR을 수행하는 단계 이전에 상기 분리된 총 RNA를 대상으로 역전사 반응을 수행하는 단계를 추가적으로 포함할 수 있다. 상기 방법은 RNA 바이러스인 HCV를 대상으로 하므로, 분리된 RNA를 실시간 PCR 반응에 사용될 수 있는 주형인 DNA(cDNA)로 변형시켜야 한다. 역전사 반응은 Avian Myeloblastosis Virus (AMV) 또는 Moloney Murine Leukemia Virus (MMLV) 등으로부터 분리된 당업계에 잘 알려진 다양한 종류의 역전사 효소를 이용하여 실시될 수 있다.
일 구체예에 따르면, 온도 사이클링의 수행 및 결과물 특이적인 증폭된 산물의 실시간 검출을 위한 기기는 상업적으로 구입 가능하다. 상기 실시간 PCR 방법에 사용할 수 있는 기기로는 Applied Biosystems Incorporated 사의 실시간 PCR 기기 7900, 7500, 7300, Stratagene 사의 Mx3000p, BioRad 사의 Chromo 4 및 Roche Lightcycler 480 기기 등이 있으나, 이로 한정되는 것은 아니다. 실시간 PCR을 수행하는 동안, 이들 기기는 검출가능한 표지로부터 방출 강도의 변화를 모니터링하여 상기 정보를 표적 주형이 테스트 시료에 존재하는지 여부를 결정하는데 분석될 수 있는 그래픽 및/또는 수치 정보로 변환한다.
일 구체예에 따른 HCV의 검출 방법에 있어서, 실시간 PCR 반응은 당업계에 알려진 통상적인 조건으로 실시할 수 있으며, 예를 들어, 초기 변성(initial denaturation)을 95℃에서 10분 동안 수행한 후, 변성(denaturation, 95℃에서 10초), 어닐링 및 RNase HⅡ의 반응(55℃에서 10초) 및 신장(elongation, 72℃에서 30초)을 총 60회 실시하는 조건으로 수행할 수 있다. 상기 방법에 의해 검출할 수 있는 HCV는 상기한 바와 같다.
마지막으로, 상기 실시간 PCR 결과로부터 HCV의 존재 유무를 확인하는 단계를 포함할 수 있다.
상기 HCV의 존재 유무는 상기 실시간 PCR 과정에서 증폭된 PCR 산물의 프로브에 표지된 형광 표지 인자를 감지하여 나타나는 곡선으로부터, PCR 증폭 산물이 일정량 증폭되었을 때의 사이클 수인 Ct 값을 계산함으로써 확인할 수 있다. Ct 값은 예를 들어, 15 내지 50, 또는 20 내지 45인 경우에 상기 HCV 속의 바이러스가 존재한다고 판단할 수 있다. 한편, 상기 Ct 값의 계산은 상기 실시간 PCR 기기 내에 포함된 프로그램에 의해 자동으로 수행될 수 있다.
하기 실시예에서 사용된 효소 "Hot Start" RNase HII는 가역적으로 변형된 RNase HII이다. 상기 변형된 효소가 Tris 기반의 완충액과 함께 반응에서 사용되고, 온도를 95℃로 올리면, 상기 용액의 pH는 떨어지고, RNase H 활성은 회복된다. 이 방법은 역전사의 시작 이전에 반응 혼합물에서 RNase H를 포함하도록 한다. RNase HII 및 이에 대한 자세한 내용은 2010년 5월 25일에 제촐된 미국 가출원 제61/347,984호에 개시되어 있으며, 이는 전체로 본 명세서에 참조로써 삽입된다.
일 구체예에 따른 HCV 검출 방법에 의하면, 적은 카피 수의 대상 시료만으로도 검출 결과를 실시간으로 신속하게 확인할 수 있다.
도 1은 일 구체예에 따른 키트를 사용하여 HCV-1 RNA (AcroMetrix)를 대상으로 실시간 PCR 반응에 의한 증폭 곡선을 나타낸 결과이다.
도 2는 실시예 4에 따라 HCV RNA (AcroMetrix)를 검출한 결과이다.
이하 하나 이상의 구체예를 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 하나 이상의 구체예를 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: HCV의 실시간 검출을 위한 프라이머 및 프로브 제작
HCV의 실시간 검출을 위한 프라이머를 얻기 위하여, 레퍼런스 HCV 종인, HCV-1 H77의 5'-UTR 및 3'-UTR X-tail 지역 내의 뉴클레오티드 서열을 획득하였으며, 실시간 PCR에 사용될 수 있는 프라이머 세트를 선택하였다. 선택된 뉴클레오티드 프라이머는 먼저, 선택한 프라이머의 뉴클레오티드 서열이 오직 HCV-1 H77의 게놈에서 5'-UTR 또는 3'-UTR X-tail 지역의 일부분을 증폭시킬 수 있는지 여부를 확인하기 위해, 인 실리코(in silico)로, BLAST(basic local alignment search tool)를 사용하여 시험하였다(HCV-1 분리 종 H77의 게놈 서열은 Genbank accession number AF009606에서 확인할 수 있다.). 레퍼런스 3'-UTR X-tail 서열은 NCBI Accession # AB001040에서 확인할 수 있다.
프로브는 상기 PCR의 대상이 되는 주형에 특이적으로 결합할 수 있는 카타클리브 프로브(CatacleaveTM probe)를 제작하여 실시간 PCR 동안 생성되는 PCR 산물의 양을 검출할 수 있도록 하였다. 증폭된 PCR 산물의 양은 PCR 동안 상기 프로브로부터 방출되는 형광을 사용하여 검출하였다. 이러한 프로브-검출 방법은 기존의 PCR 산물을 확인하는 겔 전기 영동 방식에 비해 특이성과 민감도가 더욱 높다. 상기 프로브는 상기 프라이머의 제작과 동일한 방법에 의해, 상기 프라이머 세트에 의해 증폭되는 주형인 HCV의 5'-UTR 및 3'-UTR 지역에 기초하여 선택되었다. TYETM 563으로 5' 말단을 표지하였고, Black Hole Quencher(Integrated DNA Technologies, Coralville, IA)로 3' 말단을 표지하였다. 상기 결정된 프라이머는 Sigma-Genosys에 의뢰하여 합성하였으며, 프로브는 IDT에 의뢰하여 합성하였다.
본 실험에서 사용한 프라이머 및 프로브의 염기 서열을 표 1에 나타내었다.
표 1
서열번호 프라이머/프로브 염기서열(5' - 3')
1 HCV 3'X 1F GTGGCTCCATCTTAGCCCTAGT
2 HCV 3'X 1.3F GCTCCATCTTAGCCCTAGT
3 HCV 3'X 1R TGCGGCTCACGGACCTTT
4 HCV 3'X 1.5R TCATGCGGCTCACGGACC
5 HCV 3'X 1.6R AGTCATGCGGCTCACGGA
6 HCV 3'X 2R GCACTCTCTGCAGTCATGCG
7 HCV 3'X 3R CAGAGAGGCCAGTATCAGCACTCTCTGCAG
8 HCV 3'X 5R TCTCTGCAGTCATGCGGCTC
9 HCV 3'X 6R CTCTCTGCAGTCATGCGGCT
10 HCV 3'X CataP4rc CTTrUrCrArCAGCTAGCCG
11 HCV 3'X CataP4b CGGCTrArGrCrUGTGAAAG
12 HCV-5UTR-F48 GTCTAGCCATGGCGTTAGTATGA
13 HCV-5UTR-F35 TGTCTTCACGCAGAAAGCGTCTA
14 HCV-5UTR-R44 GGCCTTTCGCGACCCAACACTAC
15 HCV-5UTR-R45 GCCTTTCGCGACCCAACACTACT
16 HCV_CCProbe1 TYE563/GGAGAGCCATrArGrUrGGTCTGCGGAA/BFQ
17 HCV_CCProbe2 TYE563/TGCGGAACCGrGrUrGrAGTACACCGG/BFQ
상기 표에서 소문자 "r"은 RNA 염기를 의미하며(즉 rG는 리보구아노신이다.), TYE563은 TYETM 563을, BFQ은 단파장 발산을 위한 Black Hole Quencher을 나타낸다.
실시예 2: 실시간 PCR을 이용한 HCV의 검출 방법
실시간 PCR 반응에서 주형으로 사용하기 위한 HCV의 총 RNA는 마그네틱-비드에 기반한 바이러스 핵산 분리 키트(Chemagen, AG)를 사용하여 제조사의 프로토콜에 따라 추출하였다. 본 실험에서, 모든 실시간 PCR은 17 ㎕의 CataCleaveTM master mix와 33 ㎕의 상기 분리된 RNA를 포함하는 혼합물을 사용하여 수행하였다. CataCleaveTM master mix의 구성 성분을 하기 표 2에 기재하였다.
표 2
HCV RT-PCR CataCleave Master Mix (per reaction)
12.5 ㎕ 4X RT-PCR 버퍼
1 ㎕ 10 mM dNTP Mix (각각 10 mM의 dATP, dCTP, dGTP, 및 dTTP)
0.4 ㎕ 125X HCV 프라이머 및 프로브 세트 (15 μM HCV 정방향 프라이머 + 15 μM HCV 역방향 프라이머 + 10 μM HCV CataCleave 프로브)
1 ㎕ P. furiosus RNase HII
1 ㎕ 1 U/㎕ Life Technoloiges SuperScript III Reverse Transcriptase
1 ㎕ 5 U/㎕ Life Technologies Platinum Taq DNA Polymerase
0.1 ㎕ Nuclease-free water
17 ㎕ 총 Master Mix Volume
상기 바이러스의 RNA를 주형으로 사용하고 50℃에서 15분 동안 역전사를 수행하여 cDNA를 합성한 다음(제1 반응), 95℃로 열을 가하여 자발적으로 RNA:cDNA 듀플렉스를 변성시키고, 역전사 활성을 불활성화시키며, 핫-스타트 DNA 폴리머라제 활성을 활성화시켰다. 마지막으로, 95℃에서 10초 동안 변성, 55℃에서 10초 동안 프라이머 및 카타클리브 프로브의 어닐링(annealing) 및 RNase HⅡ의 반응 및 65℃에서 30초 동안 신장(elongation) 반응을 55회 반복하여 실시간 PCR 반응(제2 반응)을 수행하였다. 실시간 증폭 신호의 생성은 상기 PCR의 어닐링 단계 중에 RNase HⅡ에 의해 카타클리브 프로브를 절단함으로써 수행되었다. 상기 제1 반응 및 제2 반응은 동일한 튜브 내에서 원-스텝(one-step)으로 진행되었으며, Roche Lightcycler 480 II 시스템을 사용하여 수행하였다.
실시예 3: HCV RNA의 검출
도 1은 상기 CataCleaveTM master mix 및 하기 프라이머 및 프로브 조합을 사용하여 실시간 PCR을 수행하여 얻은 증폭 곡선을 나타낸다: HCV 3'X 1F (서열번호 1), HCV 3'X 1.5R (서열번호 4), 및 HCV 3'X CataP4rc 프로브(서열번호 10). 상기 반응은 50 ㎕ RT-PCR로 Roche LightCycler 480 II 시스템에서 수행되었다. 하기 표 3은 도 1의 증폭 곡선으로부터 Ct값(PCR 증폭 산물이 일정량 증폭되었을 때의 사이클 수)을 계산하여 나타낸 결과이다. 상기 실험에서 HCV 게놈 RNA의 초기 농도는 3.7e3, 3.7e2, 3.7e1, 및 3.7e0 International Units (IU)이었으며, 이를 카피 수로 계산한 결과는 1e4, 1e3, 1e2, 및 1e1 카피였다. 하기 결과는 상기 프라이머 세트 및 카타클리브 프로브를 이용하여 실시간 PCR 반응을 수행하였을 때, 10 개의 카피만으로도 증폭이 가능함을 보여주었다. 한편, RNA 주형 대신 증류수를 첨가한 음성 대조군에서는 형광이 검출되지 않았다.
표 3
HCV RNA 농도(카피 수) Ct 값
증류수 negative
10 37.62
100 33.89
1,000 31.30
10,000 28.17
실시예 4: HCV RNA의 검출
5 mM HEPES (4-(2-hydroxyethyl)-1-(piperazineethanesulfonic acid)-KOH, pH 7.8) 내에 10배씩 연속 희석하여 가장 많이 희석된 시료가 RNA 주형 10 카피/㎕을 포함하도록, 추출된 게놈 RNA 주형을 준비하였다. 각각의 희석액 중 2 ㎕을 23 ㎕의 PCR mix와 함께 원-스텝 RT-PCR에 RNA 주형으로 사용하였다. RT-PCR 반응 내에서 각각 구성 성분의 최종 농도는 다음과 같다: 1 X PCR reaction buffer, 400 uM의 각각의 dATP dCTP dGTP, 800 uM dUTP, 300 nM 정방향 프라이머(서열번호: 13), 300 nM 역방향 프라이머(서열번호: 15), 200 nM 프로브(서열번호 16), 5 U의 핫-스타트 RNase HII, 0.4 U의 열안정성 UDG (Bacillus ssp.), 2.5 U의 Platinum Tfi exo-DNA Polymerase (Life Technologies) 및 0.5 U의 Superscript III 역전사효소(Life Technologies). 원-스텝 RT-PCR 반응은 LightCycler 480 II real-time PCR 기기 (Roche)에서 하기 사이클 파라미터를 사용하여 수행하였다: 50℃에서 15분 동안 제1 가닥 cDNA 합성, 95℃에서 5분 동안 열을 가하여 역전사 효소를 불활성화시키고, RNase HII 및 DNA 폴리머라제를 활성화시킨 다음, 95℃에서 10초 동안 변성, 55℃ 에서 10초 동안 어닐링 및 72℃ 에서 30초 동안 신장 과정을 50회 반복하였다. 형광의 검출은 72℃ 신장 과정 동안 각 사이클에서 실시되었다. 그 결과를 도 2에 나타내었다.
도 2는 상기 반응 내에서 20 카피 정도의 주형이 존재할 때 이들 프라이머/프로브 세트로 HCV 게놈 RNA를 검출할 수 있음을 나타낸다.
상기 실시예 3 및 4의 결과로부터 상기 프라이머 세트 및 카타클리브 프로브를 이용하면, 기존의 방법에 비해 더 적은 양의 시료만으로도 HBV을 효율적으로 검출할 수 있어, 검체로부터 HBV를 검출하는데 시간과 노력을 절감할 수 있다는 사실을 알 수 있다.
본 발명은 구체적으로 표현되고, 그의 예시적인 구체예에 대한 참조로 개시되어 있지만, 당업자에게 하기 청구항에 의해 정의된 본 발명의 범위를 벗어나지 않는 한도 내에서 다양하게 설명되고 형태가 변화될 수 있는 것으로 이해될 것이다.

Claims (20)

  1. 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 12, 및 서열번호 13으로 구성된 군으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열을 갖는 제1 프라이머; 및
    서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9, 서열번호 14, 및 서열번호 15로 구성된 군으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열을 갖는 제2 프라이머를 포함하는, HCV 검출용 키트.
  2. 제1항에 있어서, 서열번호 10, 서열번호 11, 서열번호 16, 및 서열번호 17로 구성된 군으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열을 갖는 프로브를 더 포함하는 것인 키트.
  3. 제2항에 있어서, 증폭 폴리머라제(amplifying polymerase) 활성 및 RNase H 활성을 더 포함하는 것인 키트.
  4. 제1항에 있어서, 역전사 효소 활성을 더 포함하는 것인 키트.
  5. 제1항에 있어서, dATP, dCTP, dGTP, 및 dTTP; DNA 폴리머라제; RNase HⅡ; 및 완충 용액을 포함하는 혼합물을 더 포함하는 것인 키트.
  6. 제1항에 있어서, 우라실-N-글리코실라제를 더 포함하는 것인 키트.
  7. 제3항에 있어서, 상기 증폭 폴리머라제 활성은 열안정성 DNA 폴리머라제의 활성인 것인 키트.
  8. 제3항에 있어서, 상기 RNase H 활성은 열안정성 RNase H의 활성인 것인 키트.
  9. 제3항에 있어서, 상기 RNase H 활성은 핫 스타트(hot start) RNase H 활성인 것인 키트.
  10. 제1항에 있어서, 상기 HCV는 HCV A형, HCV B형, HCV C형, HCV D형, HCV E형, HCV F형, HCV G형, 및 HCV H형으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 키트.
  11. 올리고뉴클레오티드의 조합을 포함하고, 상기 조합은 하기 프라이머 세트 및 프로브로 구성된 군으로부터 선택되는 것인, HCV 검출용 키트:
    서열번호 1의 뉴클레오티드 서열을 갖는 제1 프라이머 및 서열번호 3의 뉴클레오티드 서열을 갖는 제2 프라이머를 포함하는 프라이머 세트, 및 서열번호 10의 뉴클레오티드 서열을 갖는 프로브;
    서열번호 1의 뉴클레오티드 서열을 갖는 제1 프라이머 및 서열번호 4의 뉴클레오티드 서열을 갖는 제2 프라이머를 포함하는 프라이머 세트, 및 서열번호 10의 뉴클레오티드 서열을 갖는 프로브;
    서열번호 1의 뉴클레오티드 서열을 갖는 제1 프라이머 및 서열번호 5의 뉴클레오티드 서열을 갖는 제2 프라이머를 포함하는 프라이머 세트, 및 서열번호 10의 뉴클레오티드 서열을 갖는 프로브;
    서열번호 1의 뉴클레오티드 서열을 갖는 제1 프라이머 및 서열번호 6의 뉴클레오티드 서열을 갖는 제2 프라이머를 포함하는 프라이머 세트, 및 서열번호 10의 뉴클레오티드 서열을 갖는 프로브;
    서열번호 1의 뉴클레오티드 서열을 갖는 제1 프라이머 및 서열번호 7의 뉴클레오티드 서열을 갖는 제2 프라이머를 포함하는 프라이머 세트, 및 서열번호 10의 뉴클레오티드 서열을 갖는 프로브;
    서열번호 1의 뉴클레오티드 서열을 갖는 제1 프라이머 및 서열번호 8의 뉴클레오티드 서열을 갖는 제2 프라이머를 포함하는 프라이머 세트, 및 서열번호 10의 뉴클레오티드 서열을 갖는 프로브;
    서열번호 1의 뉴클레오티드 서열을 갖는 제1 프라이머 및 서열번호 9의 뉴클레오티드 서열을 갖는 제2 프라이머를 포함하는 프라이머 세트, 및 서열번호 10의 뉴클레오티드 서열을 갖는 프로브;
    서열번호 1의 뉴클레오티드 서열을 갖는 제1 프라이머 및 서열번호 3의 뉴클레오티드 서열을 갖는 제2 프라이머를 포함하는 프라이머 세트, 및 서열번호 11의 뉴클레오티드 서열을 갖는 프로브;
    서열번호 1의 뉴클레오티드 서열을 갖는 제1 프라이머 및 서열번호 4의 뉴클레오티드 서열을 갖는 제2 프라이머를 포함하는 프라이머 세트, 및 서열번호 11의 뉴클레오티드 서열을 갖는 프로브;
    서열번호 1의 뉴클레오티드 서열을 갖는 제1 프라이머 및 서열번호 5의 뉴클레오티드 서열을 갖는 제2 프라이머를 포함하는 프라이머 세트, 및 서열번호 11의 뉴클레오티드 서열을 갖는 프로브;
    서열번호 1의 뉴클레오티드 서열을 갖는 제1 프라이머 및 서열번호 6의 뉴클레오티드 서열을 갖는 제2 프라이머를 포함하는 프라이머 세트, 및 서열번호 11의 뉴클레오티드 서열을 갖는 프로브;
    서열번호 1의 뉴클레오티드 서열을 갖는 제1 프라이머 및 서열번호 7의 뉴클레오티드 서열을 갖는 제2 프라이머를 포함하는 프라이머 세트, 및 서열번호 11의 뉴클레오티드 서열을 갖는 프로브;
    서열번호 1의 뉴클레오티드 서열을 갖는 제1 프라이머 및 서열번호 8의 뉴클레오티드 서열을 갖는 제2 프라이머를 포함하는 프라이머 세트, 및 서열번호 11의 뉴클레오티드 서열을 갖는 프로브;
    서열번호 1의 뉴클레오티드 서열을 갖는 제1 프라이머 및 서열번호 9의 뉴클레오티드 서열을 갖는 제2 프라이머를 포함하는 프라이머 세트, 및 서열번호 11의 뉴클레오티드 서열을 갖는 프로브;
    서열번호 2의 뉴클레오티드 서열을 갖는 제1 프라이머 및 서열번호 3의 뉴클레오티드 서열을 갖는 제2 프라이머를 포함하는 프라이머 세트, 및 서열번호 10의 뉴클레오티드 서열을 갖는 프로브;
    서열번호 2의 뉴클레오티드 서열을 갖는 제1 프라이머 및 서열번호 4의 뉴클레오티드 서열을 갖는 제2 프라이머를 포함하는 프라이머 세트, 및 서열번호 10의 뉴클레오티드 서열을 갖는 프로브;
    서열번호 2의 뉴클레오티드 서열을 갖는 제1 프라이머 및 서열번호 5의 뉴클레오티드 서열을 갖는 제2 프라이머를 포함하는 프라이머 세트, 및 서열번호 10의 뉴클레오티드 서열을 갖는 프로브;
    서열번호 2의 뉴클레오티드 서열을 갖는 제1 프라이머 및 서열번호 6의 뉴클레오티드 서열을 갖는 제2 프라이머를 포함하는 프라이머 세트, 및 서열번호 10의 뉴클레오티드 서열을 갖는 프로브;
    서열번호 2의 뉴클레오티드 서열을 갖는 제1 프라이머 및 서열번호 7의 뉴클레오티드 서열을 갖는 제2 프라이머를 포함하는 프라이머 세트, 및 서열번호 10의 뉴클레오티드 서열을 갖는 프로브;
    서열번호 2의 뉴클레오티드 서열을 갖는 제1 프라이머 및 서열번호 8의 뉴클레오티드 서열을 갖는 제2 프라이머를 포함하는 프라이머 세트, 및 서열번호 10의 뉴클레오티드 서열을 갖는 프로브;
    서열번호 2의 뉴클레오티드 서열을 갖는 제1 프라이머 및 서열번호 9의 뉴클레오티드 서열을 갖는 제2 프라이머를 포함하는 프라이머 세트, 및 서열번호 10의 뉴클레오티드 서열을 갖는 프로브;
    서열번호 2의 뉴클레오티드 서열을 갖는 제1 프라이머 및 서열번호 3의 뉴클레오티드 서열을 갖는 제2 프라이머를 포함하는 프라이머 세트, 및 서열번호 11의 뉴클레오티드 서열을 갖는 프로브;
    서열번호 2의 뉴클레오티드 서열을 갖는 제1 프라이머 및 서열번호 4의 뉴클레오티드 서열을 갖는 제2 프라이머를 포함하는 프라이머 세트, 및 서열번호 11의 뉴클레오티드 서열을 갖는 프로브;
    서열번호 2의 뉴클레오티드 서열을 갖는 제1 프라이머 및 서열번호 5의 뉴클레오티드 서열을 갖는 제2 프라이머를 포함하는 프라이머 세트, 및 서열번호 11의 뉴클레오티드 서열을 갖는 프로브;
    서열번호 2의 뉴클레오티드 서열을 갖는 제1 프라이머 및 서열번호 6의 뉴클레오티드 서열을 갖는 제2 프라이머를 포함하는 프라이머 세트, 및 서열번호 11의 뉴클레오티드 서열을 갖는 프로브;
    서열번호 2의 뉴클레오티드 서열을 갖는 제1 프라이머 및 서열번호 7의 뉴클레오티드 서열을 갖는 제2 프라이머를 포함하는 프라이머 세트, 및 서열번호 11의 뉴클레오티드 서열을 갖는 프로브;
    서열번호 2의 뉴클레오티드 서열을 갖는 제1 프라이머 및 서열번호 8의 뉴클레오티드 서열을 갖는 제2 프라이머를 포함하는 프라이머 세트, 및 서열번호 11의 뉴클레오티드 서열을 갖는 프로브;
    서열번호 2의 뉴클레오티드 서열을 갖는 제1 프라이머 및 서열번호 9의 뉴클레오티드 서열을 갖는 제2 프라이머를 포함하는 프라이머 세트, 및 서열번호 11의 뉴클레오티드 서열을 갖는 프로브;
    서열번호 13의 뉴클레오티드 서열을 갖는 제1 프라이머 및 서열번호 15의 뉴클레오티드 서열을 갖는 제2 프라이머를 포함하는 프라이머 세트, 및 서열번호 16의 뉴클레오티드 서열을 갖는 프로브;
    서열번호 13의 뉴클레오티드 서열을 갖는 제1 프라이머 및 서열번호 15의 뉴클레오티드 서열을 갖는 제2 프라이머를 포함하는 프라이머 세트, 및 서열번호 17의 뉴클레오티드 서열을 갖는 프로브;
    서열번호 12의 뉴클레오티드 서열을 갖는 제1 프라이머 및 서열번호 14의 뉴클레오티드 서열을 갖는 제2 프라이머를 포함하는 프라이머 세트, 및 서열번호 16의 뉴클레오티드 서열을 갖는 프로브;
    서열번호 12의 뉴클레오티드 서열을 갖는 제1 프라이머 및 서열번호 14의 뉴클레오티드 서열을 갖는 제2 프라이머를 포함하는 프라이머 세트, 및 서열번호 17의 뉴클레오티드 서열을 갖는 프로브;
    서열번호 13의 뉴클레오티드 서열을 갖는 제1 프라이머 및 서열번호 14의 뉴클레오티드 서열을 갖는 제2 프라이머를 포함하는 프라이머 세트, 및 서열번호 16의 뉴클레오티드 서열을 갖는 프로브;
    서열번호 13의 뉴클레오티드 서열을 갖는 제1 프라이머 및 서열번호 14의 뉴클레오티드 서열을 갖는 제2 프라이머를 포함하는 프라이머 세트, 및 서열번호 17의 뉴클레오티드 서열을 갖는 프로브;
    서열번호 12의 뉴클레오티드 서열을 갖는 제1 프라이머 및 서열번호 15의 뉴클레오티드 서열을 갖는 제2 프라이머를 포함하는 프라이머 세트, 및 서열번호 16의 뉴클레오티드 서열을 갖는 프로브; 및
    서열번호 12의 뉴클레오티드 서열을 갖는 제1 프라이머 및 서열번호 15의 뉴클레오티드 서열을 갖는 제2 프라이머를 포함하는 프라이머 세트, 및 서열번호 17의 뉴클레오티드 서열을 갖는 프로브.
  12. a) 폴리머라제 활성, 절단제(cleaving agent), 및 데옥시리보뉴클레오티드 트리포스페이트의 존재 하에서, 타겟 핵산과 제1 프라이머 올리고뉴클레오티드, 제2 프라이머 올리고뉴클레오티드, 및 제1 프로브 올리고뉴클레오티드를 반응시키는 것에 의해 HCV의 타겟 핵산을 증폭시키는 단계로, 상기 제1 프라이머 올리고뉴클레오티드 및 제2 올리고뉴클레오티드는 상기 타겟 핵산에 어닐링할 수 있고, 상기 제1 프로브 올리고뉴클레오티드는 분자 내에 DNA 서열 및 RNA 서열을 가지며, 제1 검출가능한 표지(detectable label)를 갖고, 상기 프로브 올리고뉴클레오티드의 DNA 및 RNA 서열은 상기 타겟 핵산에 실질적으로 상보적이며, 상기 제1 프로브 올리고뉴클레오티드의 RNA 서열은 절단제에 의해 절단될 수 있고 상기 프로브 내 RNA의 절단은 상기 표지로부터 검출가능한 신호의 방출을 야기하며, 및 상기 증폭은 프로브 올리고뉴클레오티드 내의 RNA 서열이 타겟 핵산 내의 상보적인 서열과 RNA:DNA 이형이중가닥(heteroduplex)을 형성하는 조건 하에서 수행되는 것인 단계; 및
    b) 상기 제1 프로브 올리고뉴클레오티드에 위치한 제1 표지로부터의 신호 방출의 증가를 검출하는 단계를 포함하며, 상기 신호의 증가는 샘플 중 HCV의 존재를 나타내는 것인, 샘플 중 HCV의 검출 방법.
  13. 제12항에 있어서, 상기 타겟 핵산은 HCV RNA의 cDNA인 것인 방법.
  14. a) HCV의 존부에 대해 시험될 샘플을 제공하는 단계;
    b) 상기 HCV의 RNA를 추출하는 단계;
    c) 뉴클레오티드의 존재 하에서, 상기 RNA와 역전사 활성을 접촉시켜 상기 RNA에 상보적인 cDNA를 생성시키는 단계;
    d) 폴리머라제 활성, 절단제, 및 데옥시뉴클레오티드 트리포스페이트의 존재 하에 상기 cDNA와, 제1 프라이머 올리고뉴클레오티드, 제2 프라이머 올리고뉴클레오티드 및 제1 프로브 올리고뉴클레오티드를 반응시키는 것에 의해 cDNA를 증폭시키는 단계로, 상기 제1 프로브 올리고뉴클레오티드는 분자 내에 DNA 서열 및 RNA 서열을 가지며 제1 검출가능한 표지를 포함하고, 프로브 올리고뉴클레오티드의 DNA 및 RNA 서열은 상기 cDNA에 실질적으로 상보적이며, 상기 제1 프로브 올리고뉴클레오티드의 RNA 서열은 절단제에 의해 절단될 수 있고 프로브 내 RNA 서열의 절단은 상기 표지로부터의 검출가능한 신호의 방출을 야기하며, 및 상기 증폭은 상기 프로브 올리고뉴클레오티드 내의 RNA 서열이 상기 cDNA 내의 상보적인 서열과 RNA:DNA 이형이중가닥을 형성하는 조건 하에서 수행되는 것인 단계; 및
    e) 상기 제1 프로브 올리고뉴클레오티드에 위치한 제1 표지로부터의 신호 방출의 증가를 검출하는 단계로, 상기 신호의 증가는 샘플 중 HCV의 존재를 나타내는 것인 단계를 포함하는, HCV의 검출 방법.
  15. 제14항에 있어서, 상기 HCV는 HCV genotype 1형, HCV genotype 2형, HCV genotype 3형, HCV genotype 4형, HCV genotype 5형, 및 HCV genotype 6형으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  16. 제14항에 있어서, 상기 단계 c) 및 d)는 동시에, 또는 순차적으로 수행되는 것인 방법.
  17. 제14항에 있어서, 상기 단계 d)의 반응 혼합물은 분자 내에 DNA 서열 및 RNA 서열을 가지며 제2 검출가능한 표지를 포함하는, 제2 프로브 올리고뉴클레오티드를 더 포함하고, 상기 DNA 및 RNA 서열은 상기 cDNA에 실질적으로 상보적이며, 상기 제2 프로브 올리고뉴클레오티드는 제1 프로브 올리고뉴클레오티드의 서열과 서로 다른 뉴클레오티드 서열을 갖고; 상기 제2 프로브 올리고뉴클레오티드의 RNA 서열은 절단제에 의해 절단될 수 있으며; 및 상기 단계 e)에서, 제2 프로브 올리고뉴클레오티드의 제2 표지로부터의 신호 방출의 증가는 샘플 중 HCV의 존재를 나타내는 것인 방법.
  18. 제14항에 있어서,
    상기 제1 및 제2 표지로부터의 신호 방출의 강도가 기준치 값(baseline value)보다 높은 고정된 역치 값에 도달하는, 역치 증폭반응 싸이클 수를 결정하는 단계; 및
    샘플 중 HCV에 대해 결정된 역치 증폭반응 싸이클 수와 알려진 양의 HCV에 대해 결정된 표준 역치 증폭반응 싸이클 수를 비교함으로써, 상기 샘플 중 HCV의 양을 계산하는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
  19. 제14항에 있어서, 상기 단계 d)의 반응 혼합물은 우라실-N-글리코실라제를 더 포함하는 것인 방법.
  20. 제14항에 있어서, 상기 절단제는 RNase H, Kamchatka crab 이중가닥 특이적 뉴클레아제(duplex specific nuclease), 엔도뉴클레아제, 및 니킹(nicking) 엔도뉴클레아제로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 방법.
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