WO2013069962A1 - 다능성 세포의 제조방법 - Google Patents

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WO2013069962A1
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cell
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윌리암스다런
정다운
김웅희
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    • C12N2506/13—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from connective tissue cells, from mesenchymal cells
    • C12N2506/1323—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from connective tissue cells, from mesenchymal cells from skeletal muscle cells

Definitions

  • the present invention relates to a method for chemical preparation of pluripotent cells and their use.
  • Dedifferentiation refers to the phenomenon in which differentiated cells acquire a 'pleasant cell'-like or multipotent state prior to differentiation into one or more different tissue forms (1). Phenotype-based screening methods of small molecule libraries were performed to discover new regulators involved in intracellular dedifferentiation (2). Cell manipulation with small molecules has significant advantages over genetic approaches (3). For example, small molecules provide a high level of technology to temporarily regulate protein function. In addition, a single small molecule has the potential to simultaneously control multiple specific targets in a cell.
  • European amphibians have excellent reverse differentiation and tissue regeneration (4).
  • the whole can be regenerated after limb amputation, moreover, this regeneration is maintained throughout the animal's life (5).
  • studying these phenomena one can develop an approach to improve human tissue regeneration by understanding the molecular mechanism of regeneration.
  • the inventors have tried to produce pluripotent cells. As a result, when the differentiated cells were treated with p21 down-regulated inducer compounds, pluripotent cells were obtained and their differentiation capacity (for example, differentiation into adipose cell group, bone cell group, muscle cell group or neuronal cell group) was obtained. By confirming, this invention was completed.
  • an object of the present invention is to provide a method for chemically preparing pluripotent cells (multipotent or pluri potent eel Is).
  • Another object of the present invention is to provide a pluripotent cell prepared according to the method of the present invention.
  • Another object of the present invention is to provide pluripotent cells prepared according to the method of the present invention.
  • Another object of the present invention is to provide a method for regeneration of a mammalian tissue or organ.
  • the present invention provides a method for chemical preparation of multipotent eel Is from mammalian differentiated cells comprising the following steps:
  • pluripotent cells (b) treating the differentiated cells with a p21 down-regulatory inducing compound to obtain pluripotent cells.
  • the inventors have tried to produce pluripotent cells.
  • pluripotent cells were obtained and their differentiation capacity (e.g., reverse differentiation of adipocytes, osteoblasts, myoblasts or neuroblastomas). Confirmed.
  • the chemical preparation of the pluripotent cells of the present invention will be described in detail by dividing each step as follows:
  • differentiated cells are obtained from a mammal.
  • the term 'mammal' includes, but is not limited to, humans, mice, rats, guinea pigs, rabbits, pigs, pigs, horses, cattle, sheep, antelopes, dogs, and cats.
  • the differentiated cells are terminally differentiated cells.
  • the term 'end stage differentiated cell' refers to a mature cell having a specialized phenotype as a cell at an endpoint stage during the development process. Differentiated cells have one or more features or functions that distinguish them from other cell types and have limited ability to proliferate.
  • the differentiated cells are one cell selected from the group consisting of skeletal muscle cells, cardiomyocytes, smooth muscle cells, skin cells, chondrocytes, adipocytes and osteocytes, more preferably the differentiated cells are skeletal muscle cells, One cell selected from the group consisting of cardiomyocytes and smooth muscle cells, most preferably said differentiated cells are skeletal muscle cells.
  • the differentiated cells are connective tissue, nerve cells, lymph cells, vasculature cells, kidney cells, pancreas cells, lung cells, urethral cells, bladder cells, gastric cells, liver cells, small intestine cells, colon cells and esophageal cells.
  • p21 plays an important role in regulating nuclear events due to environmental stress. p21 is induced at very high levels following oxidative stress and DNA damage. The p21 protein acts as an inhibitor of cyclin-dependent kinases and is overexpressed in aging or fully differentiated cells because it effectively blocks cell cycle progression. According to the present invention, down-p21 expression Regulation induces myofiber cellularization and cell cycle re-entry to mimic the early stages of regeneration of chylopod amphibians and appendages.
  • the p21 down-regulation inducing compounds of the present invention are compounds that induce down-regulation by inhibiting the expression of the p21 gene, inhibiting the activity of the p21 protein or reducing the stability of the p21 protein.
  • the p21 down-regulation inducing compound has four kinds of compounds as follows:
  • the p21 downregulation-inducing compound used in step (b) is a compound that down-regulates p21 and inhibits the activity of glycogen synthase-3 kinase protein.
  • the compound of the first group is BICX6-bromoindirubin-3'-oxaim), 3F8 (5-ethyl-7,8-dimethoxy-1H-pyrrolo [3,4-c ] Isoquinoline—1,3 (2H) _dione) and AR-A 014418 (N-[(4-methoxyphenyl) methyl] -N '-(5-nitro-2—diazoyl) urea)
  • the compound corresponding to the first group is BI0.
  • the chemical structure of BI0 is as follows:
  • the p21 down-regulatory inducing compound used in step (b) is a compound that downregulates p21 and inhibits the p38 MAPCMitogen-Activated Protein kinase pathway.
  • the compound corresponding to the second group is CMPD-K2'-fluoro-N- (4-hydroxyphenyl)-[1,1'-biphenyl] -4-butanamide), E0 1428 ((2-methylphenyl) ⁇ [4-[(2-amino-4-bromophenyl) amino] -2-chlorophenyl] methanone) and SB203580 (4- [4- (4-fluorophenyl) -2 -(4-methylsulfinylphenyl) -1H-imidazol-5-yl] pyridine), and is most preferably SB203580.
  • the chemical structure of SB203580 is as follows:
  • the p21 down-regulatory inducer compound used in step (b) is a compound that downregulates p21 and inhibits adenylyl cyclase.
  • the compound of the third group is BPIPP (5- (3-bromophenyl) ⁇ 5, ll-dihydro-l, 3-dimethyl-1H—inolol [2 ', 1': 5 , 6] Pyrido
  • SQ22536 9- (tetrahydro-2-furanyl) -9H-purine-6-amine) And most preferably, SQ22536.
  • the chemical structure of SQ22536 is as follows:
  • the p21 down-regulation inducing compound used in step (b) is a compound that activates G-prote in-coupled receptor-mediated signaling while down-regulating p21.
  • p21 Preferably LPACLysophosphatidic acid.
  • the chemical formula of LPA is as follows:
  • the p21 down-regulation inducing compound is 10 (6- Bromoindirubin-3'-oxaim), SB203580 (4- [4- (4-fluorophenyl) -2- (4-methylsulfinylphenyl) -1H-imidazol-5-yl] pyridine) SQ22536 (9_ (tetrahydro-2-furanyl) -9H-purine-6-amine) or one compound selected from the group consisting of Lysophosphatidic acid (LPA).
  • LPA Lysophosphatidic acid
  • down-regulation of p21 expression in the present invention induces re-entry and differentiation of the proliferated and cell cycle of the cellized root canal.
  • the inherent myogenic potential is maintained even after down-regulation of p21 expression.
  • the present invention can obtain pluripotent cells from differentiated cells through a very simple process.
  • the pluripotent cells obtained by the method of the invention are cells of the same lineage or germ layer as the differentiated cells used in step (a).
  • the pluripotent cells obtained by the present invention are cells of the same germ cells of skeletal muscle such as skeletal muscle, bone, dermis, connective tissue, urogenital system, heart, blood (lymph cells), kidneys and It is a pluripotent cell that can differentiate into the cells that make up the spleen.
  • the differentiated cells used in step (a) are skeletal muscle cells, and the pluripotent cells obtained in step (b) can be differentiated into skeletal muscle cells, adipocytes or osteocytes. to be.
  • the method further comprises the step of treating the cells obtained in step (b) with a p21 down-regulating inducer compound of step (b) to obtain pluripotent cells, wherein the pluripotent cells are prepared in step (b). have the ability to differentiate into differentiated cells of (a) and cells of other germ lineages.
  • the term 'dedifferentiation agent' refers to an agent that promotes dedifferentiation of one or more cell types, and includes chemicals, nucleic acid peptides, polypeptides, small organic molecules, antibodies, antisense oligonucleotides, RNAi consensus. Includes truck and ribozymes.
  • variety De-differentiation agents can induce re-differentiation by contacting one or more de-differentiation factors with cells in vivo or int ⁇ for a time sufficient to induce re-differentiation in fully differentiated mammalian cells.
  • the three germ layers are composed of endoderm, mesoderm and ectoderm, the endoderm of the stomach, colon, liver, pancreas, the inside of the bladder urethra, epithelial part of the airway, lung, pharynx, thyroid, parathyroid gland and small intestine tissues are generated and In mesoderm, skeletal muscle, luck, dermis, connective tissue, genitourinary system, heart, blood (lymph cells), kidneys and spleen, cells are formed. In ectoderm, meso nervous system, lens 1, skull and sensory organs, ganglion And cells that make up nerves, pigment cells, head connective tissues, epidermis, hair and mammary gland.
  • the differentiated cells of step (a) can be differentiated into other three germ lineages following the treatment of the p21 down-regulation inducing compound followed by the treatment of the reverse differentiation agent.
  • Cell material derived from skeletal muscle is differentiated into neurons when cultured with reversin, retinoic acid, and N2 additive after low molecular treatment of the present invention to exhibit the characteristics of pluripotent cells.
  • the reverse differentiating agent is reversin (N6-cyclonucleosil-N2— (4-morpholin-4-yl-phenyl) -9H-purine-2, 6-diamine), trichostatin A ), Valproic acid, buphenyl and 5-azacytidine.
  • the differentiation inducing agent is treated with the cells obtained in step (b) so that other cell lineages of the same triplet germ line as the differentiated cells of step (b) ( cell lineage).
  • the term 'differentiation inducing agent' refers to growth factors, hormones, and the like, which are included in the culture medium to differentiate into desired cells.
  • the differentiation inducing agent used to obtain lipogenic cell lineage from the pluripotent stem cells obtained in step (b) is insulin, dexamethasone, rosiglitazone, isobutylmethylxanthine (IBMX) or a combination thereof.
  • the pluripotency obtained in step (b) Differentiation inducers used to obtain osteogenic cell lineage from stem cells are ascorbic acid-2-phosphate, dexamethasone, ⁇ -glycerophosphate or a combination thereof.
  • the pluripotent or pluripotent cells of the invention are myogenic lineage, adipogenic lineage, osteogenic lineage or neurogenic cell lineage ( neurogenic lineage).
  • the invention provides a pluripotent cell prepared according to the method of the invention.
  • the invention provides a pluripotent cell prepared according to the method of the invention.
  • composition for treating myopathy comprising muscle forming cell lineage or muscle cells differentiated from pluripotent or pluripotent cells prepared according to the method of the present invention as an active ingredient.
  • the term 'muscle disease' refers to muscle fatigue, muscular dystrophy, wound or muscular dystrophy due to accident or surgery
  • the term 'muscular dystrophy' refers to Becker's muscular dystrophy, congenital muscular dystrophy, and Duchenne muscular dystrophy. (Duchenne muscular dystrophy), distal muscular dystrophy, Emery-Dreifuss muscular dystrophy, facial shoulder dystrophy, dystrophic muscular dystrophy, myotonic muscular dystrophy, oropharyngeal dystrophy, muscular dystrophy Complications, spinal muscular atrophy or BWUBrown-Vialetto- Van Laere syndrome).
  • composition for treating bone diseases comprising osteogenic cell lineage differentiated from pluripotent cells prepared according to the method of the present invention as an active ingredient.
  • the term 'bone disease' refers to osteoporosis, juvenile osteoporosis, osteopenia (osteogenesis imperfecta), hyperosclerosis, hypercalcemia, hyperparathyroidism, osteomalacia, soluble bone disease, osteonecrosis, Paget's disease of bone, Bone disease, bone fractures, bone loss due to rheumatoid arthritis, inflammatory rheumatoid arthritis, osteomyelitis, metastatic bone disease, periodontal bone loss, rickets, bone loss due to cancer or aging loss of bone . It can provide a composition for treating neurological disorders (neurological disorder) comprising a neuronal cell lineage or neurons differentiated from pluripotent or pluripotent cells prepared according to the method of the present invention as an active ingredient.
  • neurological disorders neurological disorder
  • the term 'neuropathy' is a neurological disease resulting from physical, metabolic, toxic, chemical or immunological damage of the central nervous system, preferably amyotrophic lateral sclerosis, multiple sclerosis, Alzheimer's disease, traumatic brain injury, Reversible or metabolic encephalopathy, including stroke, ischemic brain disease, hepatic encephalopathy and hypoxia, epilepsy, head trauma, Parkinson's disease, Alzheimer's disease, Huntington's disease, tertiary neuralgia, Yeti neuralgia, Bell's palsy, severe sclerosis, muscular dystrophy, progressive Peripheral neuropathy caused by muscle atrophy, progressive atrophy-induced muscle atrophy, herniated, destroyed or escaped invertebrate disc syndrome, cervical spondylosis, obstructive dysfunction, thoracic outlet destruction syndrome, reed, dazzling teak, porphyrinosis or Guillain-Barré syndrome It includes, but is not limited to.
  • compositions of the present invention comprise (a) a pharmaceutically effective amount of cells differentiated from the pluripotent or pluripotent cells described above (eg, myogenic cell population, osteogenic cell population); And (b) a pharmaceutically acceptable carrier.
  • the term 'pharmaceutically effective amount means an amount sufficient to achieve the efficacy or activity of cells differentiated from the pluripotent cells described above.
  • the pharmaceutical composition of the present invention includes a pharmaceutically acceptable carrier.
  • Pharmaceutically acceptable carriers contained in the pharmaceutical composition of the present invention are those commonly used in the preparation, lactose, textose, sucrose, sorbbi, manny, starch, acacia rubber, calcium phosphate, alginate, Gelatin, Calcium Silicate, Microcrystalline Cellulose, Polyvinylpyrrolidone, Cellulose, Water, Syrup, Methyl Cellulose, Methylhydroxybenzoate, Propylhydroxybenzoate, Talc, Stearic Acid Magnesium and Mineral Oil Including, but not limited to no.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may further include a lubricant, a humectant, a sweetener, a flavoring agent, an emulsifier, a suspending agent, a preservative, and the like.
  • a lubricant e.g., talc, kaolin, kaolin, kaolin, kaolin, kaolin, kaolin, kaolin, kaolin, kaolin, a kaolin, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, mannitol, mannitol, mannitol, mannitol, mannitol, mannitol, mannitol, mannitol, mannitol, mann
  • compositions of the invention may be administered parenterally, for example, by subcutaneous injection, intramuscular injection, transdermal administration, intraarticular injection, and the like.
  • Suitable dosages of the pharmaceutical compositions of the present invention may vary depending on factors such as formulation method, mode of administration, age of patient, weight, sex, morbidity, food, time of administration, route of administration, rate of excretion and response. It may be prescribed.
  • Typical dosages of the pharmaceutical compositions of the present invention to an adult per day based on 10 2 - 10 is 10 cells.
  • compositions of the present invention may be prepared in unit dosage form by formulating with a pharmaceutically acceptable carrier and / or excipient according to methods which can be easily carried out by those skilled in the art. Or may be prepared by incorporation into a multi-dose container.
  • the formulation may be in the form of solutions, suspensions, syrups or emulsions in oil or aqueous media, or in the form of extracts, powders, granules, tablets or accelerators, and may further comprise dispersants or stabilizers.
  • the invention provides a method of regeneration of a mammalian tissue or organ comprising the following steps:
  • Step (C) differentiating the pluripotent cells into the desired tissue or organ. Since the method of the present invention uses the above manufacturing method, the contents common between the two are omitted in order to avoid excessive complexity of the present specification. Step (c): Differentiate pluripotent cells into desired tissues or organs
  • the pluripotent cells obtained in step (b) are replaced with Differentiate into organs.
  • the differentiation is performed by adding a differentiation inducing agent of a desired tissue or organ to the culture medium of the pluripotent cells obtained in step (b).
  • the present invention provides a method for producing pluripotent or pluripotent cells using a p21 down-regulatory inducing compound.
  • Figure 1 shows the structure of the small molecules used for skeletal muscle dedifferentiation or differentiation (in alphabetical order).
  • FIG. 2A shows a schematic diagram of the experimental procedure to investigate the cell proliferation by treating small molecules in the C2C12-differentiated mouse root canal.
  • FIG. 2B shows 2,5 ⁇ BI0 (6-bromoindirubin-3'-oxime), 10 ⁇ SB203580 (4- [4- (4-f luorophenyl) -2- (4-methylsul f inylphenyl)-in C2C12 muscle cells lH-imidazol-5-yl] pyridine), 300 ⁇ SQ22536 (9- (Te tr ahydr o-2- fur any 1) -9H-pur i ⁇ -6-am i ne) or 30 ⁇ LPACLysophosphatidic acid) It was confirmed that the FITC-BrdU signal was increased as a result of inhibiting DNA synthesis by treating for a time.
  • FIG. 2C shows 48 h treatment of 10 ⁇ SB203580, 300 ⁇ SQ22536, 30 ⁇ LPA, 50 ⁇ MLB, or 5 ⁇ MPcll to C2C12 muscle cells, showing no cytotoxicity through 7-D staining. 0.1% Triton X-100 as a positive control of cytotoxicity Treated.
  • Figure 2d shows the results confirmed by the ⁇ analysis that the cytotoxicity was not induced by treating the C2C12 muscle cells with 2.5 ⁇ BIO for 48 hours.
  • 2E shows cell cycle re-entry induced by treatment of 2.5 yM BIO, 10 ⁇ SB203580, 300 yM SQ22536 or 30 ⁇ LPA in C2C12 root canal for 48 hours, via cell cycle G staining via PKpropidium iodide staining.
  • Cell content of 2- M phase is shown by flow cytometry.
  • C2C12 myoblasts were used as positive controls.
  • FIG. 3A shows Western blot results confirming the reduction of ⁇ 57 expression of C2C12 muscle cells treated for 2.5 hours with 2.5 uM BI0 or 10 ⁇ SB203580.
  • C2C12 muscle cells treated with 300 ⁇ SQ22536 or 30 ⁇ LPA did not reduce the expression of p57, but when CIO treated with BIO, SB203580, SQ22536 or LPA on C2C12 muscle cells, the expression of p27 was not affected. Shows none.
  • C2C12 muscle cells were treated with BIO, SB203580, SQ22536 or LPA p21 expression was reduced.
  • GAPDH expression was used as a loading control. Markers shown below the band image show the intensity of the band compared to untreated cells.
  • FIG. 1 shows Western blot results confirming the reduction of ⁇ 57 expression of C2C12 muscle cells treated for 2.5 hours with 2.5 uM BI0 or 10 ⁇ SB203580.
  • FIG. 3B shows the expression of differentiated muscle-specific acetylcholine receptors (detection of FITC-binding ⁇ -Bungarotoxin) by treatment of C2C12 muscle cells with 2.5 ⁇ BI0, 10 ⁇ SB203580 or 30 ⁇ LPA for 48 hours. This is the result of confirming reverse differentiation.
  • Treatment with 300 ⁇ SQ22536, 50 ⁇ MLB or 5 ⁇ MPcll for 48 hours shows no decrease in acetylcholine receptor expression.
  • Figure 3c induces the differentiation of C2C12 muscle cells by treatment with BIO, SB203580, or LPA and confirmed the reduction of FITC-binding ⁇ -Bungarotoxin labeling by fluorescence microplate reader analysis.
  • Reliability is shown in p ⁇ 0.05 compared to untreated cells.
  • 3D shows fusion indices (eg, multiple cell nuclei are multinucleated) when C2C12 muscle cells were treated with 2.5 ⁇ BI0, 10 ⁇ SB203580, 300 ⁇ SQ22536 or 30 ⁇ LPA for 48 hours after incubation for 5 days in differentiation medium. Results in no effect on sexual root canal fusion). In contrast, after 5 days of incubation in differentiation media, the fusion index decreased when 1 ⁇ reversin was treated for 48 hours. Compared to untreated cells, the reliability of ⁇ ⁇ 0.05 is shown.
  • FIG. 4 shows that C2C12 muscle cells were treated with 2.5 ⁇ BIO, 10 ⁇ SB203580, 300 ⁇ SQ22536 or 30 ⁇ LPA for 48 hours and adipocyte-forming factor for 7 days to induce lipid accumulation, which is characteristic of adipogenesis. Indicates. Lipids were visualized by oil red 0 staining. Treatment with adipocyte-forming factors in untreated C2C12 cells or C2C12 muscle cells treated with 50 ⁇ MLB or 5 ⁇ MPcll for 48 hours showed no lipid accumulation. Lipid accumulation was confirmed as in the previously reported paper when C2C12 myoblasts were treated with 250 nM reversin and incubated in adipocyte culture medium for 48 hours (33).
  • Lipid accumulation of 3T3-L1 adipocytes is shown for comparison.
  • 4bi shows lipid accumulation as measured by AdipoRed TM labeling. Lipid accumulation increased significantly when C2C12 muscle cells were treated with 2.5 ⁇ BIO, 10 ⁇ SB203580, 300 ⁇ SQ22536 or 30 ⁇ LPA for 48 hours and then treated with adipocyte-forming factors. In contrast, treatment with C2C12 muscle cells treated with untreated C2C12 cells or 50 ⁇ MLB or 5 ⁇ MPcll for 48 hours showed no increase in lipid accumulation. The results show a reliability of ⁇ ⁇ 0 ⁇ 05 compared to untreated cells.
  • 4bii shows the morphotype signal from the Adipored TM probe as a result of culturing C2C12 muscle cells with BI0, SB203580, SQ22536 or LPA for 48 hours and treatment with 250 nM reversin, followed by treatment with adipocyte formation factor. It was confirmed that lipid accumulation increased by increasing. C2C12 muscle cells were treated with MLB or MPcll for 48 hours and treated with 250 nM reversin, and then cultured with adipocyte-forming factors. Lipid accumulation did not increase. The results show a reliability of p ⁇ 0.05 compared to untreated cells. FIG.
  • C2C12 muscle cells were treated with BIO, SB203580, SQ22536 or LPA for 48 hours and treated with adipocyte-forming factors, and showed insulin-path mediated glucose uptake ability as a fat cell-specific function.
  • adipocyte-forming factor in C2C12 muscle cells treated with untreated C2C12 cells or 50 ⁇ MLB or 5 ⁇ MPcll for 48 hours, they show no insulin-path mediated glucose uptake.
  • the result has a reliability of p ⁇ 0.05 compared to cell material that did not stimulate the insulin-path.
  • FIG. 5A shows 2.5 ⁇ BI0, 10 ⁇ SB203580, 300 in C2C12 muscle cells
  • Treatment with uM SQ22536 or 30 ⁇ LPA for 48 hours followed by the treatment of osteogenic factors shows the induction of mineralization which is characteristic of bone formation conversion. Mineralization was not seen when cultured with osteogenic factors in C2C12 muscle cells treated with untreated cells or 50 ⁇ MLB or 5 ⁇ MPcll for 48 hours. Mineralization was formed when C2C12 myoblasts were treated with 250 nM reversinol and incubated in osteogenic medium for 48 hours, consistent with previous reports (33). Comparison was made to mineralization of ATDC5 osteogenic cells.
  • FIG. 5bi shows that when C2C12 muscle cells were treated with BIO, SB203580, SQ22536 or LPA for 48 hours and treated with osteogenic factors, mineralization increased significantly. In contrast, when osteoblasts were treated with C2C12 cells untreated or C2C12 muscle cells treated with MLB or MPcll for 48 hours, mineralization did not increase as compared to untreated cells (p ⁇ 0.05).
  • FIG. 5bii shows C2C12 muscle cells treated with BIO, SB203580, SQ22536 or LPA for 48 hours, and treated with 250 nM reversin for 48 hours, and then cultured with osteogenic factor. It shows an increase in mineralization. In addition, the difference in reversin treatment between the four treatment groups was reduced.
  • Figure 5di shows the difference in alkaline phosphatase activity between the four treatment groups when C2C12 muscle cells were treated with BIO, SB203580, SQ22536 or LPA for 48 hours, and treated with 250 nM reversin for 48 hours, followed by culture with osteogenic factor. Shows a decrease.
  • Treatment with osteogenic factor and treatment with 250 nM reversin for 48 hours, followed by incubation with osteogenic factor showed no increase in alkaline phosphatase activity.
  • Untreated, MLB or MPcll treated C2C12 muscle cells showed similar assays.
  • 6A shows 2.5 ⁇ BIO, 10 ⁇ SB203580 or C2C12 muscle cells
  • FIG. 6B shows that the C2C12 muscle cells were treated with BI0 and treated with 250 nM reversin for 48 hours, followed by culturing in neuronal media.
  • 6C shows depolarizat-dependent vesicle recycling, which is a neuro-specific feature when cultured with neurogenic factors after 48 hours treatment with BIO, SB203580 or SQ22536 and 48 hours treatment with 250 nM reversin in C2C12 muscle cells This is the result of confirming independent vesicle recycling.
  • Vesicle recycling is fluorescently labeled. Visualized by FM 1-43.
  • MLB or MPcll was treated with C2C12 muscle cells for 48 hours and 250 nM reversin for 48 hours, when cultured in a medium containing neuronal factors, depolarization-dependent vesicle recycling was not shown.
  • 6D shows FM 1-43 by depolarization with high concentrations of extracellular potassium when CIO cells were treated with BIO, SB203580 or SQ22536 for 48 hours and treated with 250 nM reversin for 48 hours. Absorption increased. Conversely, after 48 hours of MLB or MPcll and 48 hours of 250 nM reversin in C2C12 muscle cells, the FM 1-43 fluorescence signal does not increase when cultured with neuronal factors. It has a reliability of p ⁇ 0.05 compared to the control with low extracellular potassium. Pl9 neurons were used to compare the depolarization-dependent increase in FM 1-43 fluorescence signal.
  • 6E shows that glutamate-dependent stamina influx as a neuro-specific feature as a result of incubation with neuronal factors after treatment with BIO, SB203580 or SQ22536 for 48 hours and treatment with 250 nM reversin for 48 hours in C2C12 muscle cells Confirmed The result is. Glutamate-dependent calcium influx was visualized with the fluorescent label, Fluo-3. On the contrary, glutamate-dependent intake was not observed when C2C12 muscle cells were treated with MLB or MPcll for 48 hours and 250 nM reversin for 48 hours and then cultured with neuronal factors.
  • FIG. 7 shows a schematic of a low molecular method for obtaining pluripotent cells from fully differentiated skeletal muscle tissue.
  • the low molecular weight method of the present invention can broaden the developmental plasticity of cells to mammalian muscle tissue by dedifferentiating them into cells with pluripotent capacity, as shown by the transition to cells that characterize neurons.
  • FIG. 1 shows a schematic of a low molecular method for obtaining pluripotent cells from fully differentiated skeletal muscle tissue.
  • FIG. 8A is a microarray analysis showing the change of total gene expression between C2C12 cells (proliferative and multipotent cells) treated with 2.5 ⁇ BIO for 48 hours versus C2C12 myoblasts (lineage restricted C2C12 myoblasts).
  • Figure 8b is a result showing the expression changes of genes involved in p53 signaling according to the Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) analysis.
  • KEGG Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes
  • FIG. 9A shows induction of DNA synthesis of cells obtained from primary root canal cultures and treated with 2.5 ⁇ BIO for 48 hours, as shown by the increased FITC—BrdU signal.
  • FIG. 9B shows that fluorescence microplate reader assay for FITC-binding ⁇ -bungarotoxin labeling, as shown by the reduced fluorescence signal, enhanced BI0 treated primary muscle cells. Confirmed. In contrast, no reverse differentiation was induced when 50 ⁇ MLB was treated for 48 hours or treated with DMS0. The results have a reliability of p ⁇ 0.05 compared to untreated cells and are shown as representative values for three independent experiments.
  • FIG. 9C shows that fat accumulation was induced when adipogenic factors were treated for 7 days in primary muscle cells treated with 2.5 ⁇ M BI0 for 48 hours, which is a characteristic of the conversion of adipocyte formation. Lipids were visualized by oil red 0 staining. Lipids when adipocyte-forming factors were treated in untreated primary cells or C2C12 muscle cells treated with 50 yM MLB or DMS0 for 48 hours. It shows no accumulation.
  • Figure 9d is 2.5 when ⁇ BIO a treated primary muscle cells process the fat cell formation factor in water, for 48 hours, epinephrine-stimulated shows the sensitivity of the release of free fatty acids (adipocyte-specific features) after insulin.
  • FIG. 9E shows a significant increase in mineralization, as shown by Alizarin red staining, when osteomyocytes were treated with primary muscle cells treated with 2.5 ⁇ BIO for 48 hours.
  • Figure 9f shows the result of an increase in alkaline phosphatase activity, another feature of bone formation conversion in BIO treated cells.
  • Alkaline phosphatase activity was measured after 10 minutes of incubation of cell lysates treated with AttoPhos TM reagent. The results were expressed as representative values for three independent experiments with a confidence of p ⁇ 0.05 for increased activity compared to untreated cells.
  • Figure 9g shows that depolarizat ion-dependent vesicle recirculation, a neuro-specific feature, when treated with 250 nM reversin for 48 hours in primary muscle cell treated with 2.5 ⁇ BI0 for 48 hours and treated with neuronal factors. It shows that cells are made that are capable of vesicle recycling.
  • FIG. 9H shows glutamate-dependent calcium influx, a neuron-specific feature, when treated with 250 nM reversin 48 hours and neurogenic factors in primary muscle cells treated with 2.5 ⁇ BI0 for 48 hours. ) Shows that possible cells are made. Cells that exhibit neuronal morphology receive signals from the Fluo-3 probe. Increased. On the other hand, treatment with 50 ⁇ MLB or DMS0 for 48 hours instead of BIO shows that this effect does not occur. The results were expressed as representative values for three independent experiments with a p ⁇ 0.05 confidence for increased signal compared to untreated cells.
  • C2C12 mouse Ow / s musculus myoblasts were cultured according to previously reported methods (11). Myoblasts were cultured in collagen-coated tissue culture plates (Sigma, USA) to differentiate into root canal. Differentiation was induced by culturing confluent myoblasts in differentiation medium (DMEM with 5% horse serum, 50 units / mi penicillin and 50 g / ⁇ streptomycin) for 10 days. In order to enhance differentiation and remove mononuclear myoblasts, the cells were cultured in different culture medium for 24 hours and then treated with 50 ⁇ AraC3 for 72 hours.To obtain the purified culture of the root canal, trypsinized the differentiated root canal culture at 800 rpm.
  • differentiation medium DMEM with 5% horse serum, 50 units / mi penicillin and 50 g / ⁇ streptomycin
  • 3T3-L1 mouse GTO / S musculus embryonic fibroblasts were cultured and differentiated into adipocytes by the reported method (11).
  • Osteo-chondrogenic precursor eel Is of ATDC5 mice (mus musculus) was cultured and differentiated into osteoblasts by the previously reported method (11).
  • Induction of bone formation in the cellized skeletal muscle root canal was performed by a previously reported reversin-treatment method (33). Induction of neurogenesis in the cellized skeletal muscle root canal
  • the method of inducing neurogenesis was based on reports of the formation of neurons in reversin-treated C2C12 myoblasts (28).
  • Cells were cultured in laminin-coated culture dishes at 1.5 ⁇ 10 6 cells /9.6 cirf. After small molecule treatment, cells were treated with 250 nM reversin for 48 hours, neural induction medium (DMEM / F12 with N2, invitrogen, USA) and 1.5 ⁇ aU-trans retinoic acid Incubated at 11 for 7 days.
  • DMEM / F12 with N2, invitrogen, USA neural induction medium
  • aU-trans retinoic acid Incubated at 11 for 7 days.
  • RNA sample 200 ng was labeled and amplified using a Low Input Quick Amp labeling kit (Agilenttechnologies, CA). Cy3-labeled aRNA was resuspended in 50 uL of the shake solution (Agilenttechnologies, CA).
  • RNAs were placed on an Agilent SurePrint G3 Human GE 8x60K array (Agilent technologies, CA) and covered with a Gasket 8-lex slide (Agilent technologies, CA). The slides were shaken for 17 hours at 65 ° C. The shakes were washed at 2 x SSC, 2 min with 0.1 3/4 SDS, 3 min with 1 X SSC and 2 min with 0.2 X SSC at phase silver. The slides were dried by centrifugation at 3000 rpni for 20 seconds. Microarray Data Analysis
  • the array was analyzed using an Agilent scanner with associated software. Gene expression levels were calculated using Feature Extraction vlO.7.3.1 (Agilent technologies, CA). Robust Multi-Array Average algorithm was used to generate relative signal intensities for each gene. The data was processed based on the quant ilenormalizat ion method using GeneSpring GX 11.5.1 (Agilent technologies, CA). This normalization method allows equal distribution of intensities for each array in one array set. To be carried out. Normalized and log transformed intensity values were analyzed using GeneSpringGX 11.5.1 (Agilent technologies, CA). The fold change filter includes a gene requirement that is at least 200% compared to the control for up-regulated genes and less than 503 ⁇ 4 compared to the control for down-regulated genes. Isolation and Growth of Mouse Primary Myoblasts
  • mice were bred at specific pathogen-free barrier facilities. All protocols of the experiments carried out in the present invention were carried out with the permission of the Gwangju Institute of Science and Technology.
  • Day 14 Mice were euthanized by inhaling CO 2 and isolated gastrocnemius muscle using a stereoscopic dissection microscope (Carl Zeiss 2000-C). Transfer the muscles to a sterile culture hood and chop them with a sharp knife while keeping the muscles dry with a decent amount of PBS. Add 2 ml of collagenase / dispase / CaCl 2 solution per gram of tissue and chop further for a while.
  • Finely chopped tissue was incubated at 37 ° C. for 20 minutes, and the agglomerated sections were gently crushed with a plastic pipette.
  • Cells were centrifuged at 350 xg for 5 minutes to determine F-10- primary myoblast growth medium (F-10 media plus 20% fetal calf serum, 2.5 ng / mL basic fibroblast growth factor 100 U / mL penicillin and 100 yg / mL Resuspend in 4 ml and place in a 35 mm collagen coated culture dish. After 48 hours, the growth medium of the dish is aspirated off, and the dish is washed with PBS. At this time, leave a little PBS and hit the side of the plate very hard, even if the cells fall off.
  • the cells obtained were then pre-plated in the collagen-coding dish for 15 minutes before transferring the cells remaining in the suspension to a new collagen-coding dish. This process was repeated every 48 hours for 6 days to remove fibroblasts.
  • Change the culture medium to the primary myoblast growth medium DMEM to F-10 culture ratio 1: 1, 20% fetal calf serum, 2.5 ng / ml basic fibroblast growth factor 100 U / ml penicillin and 100 ug / ml streptomycin
  • Myoblasts were used for the experiment when the density was reached.
  • FIG. 2A shows the extent of the proliferation of muscle cells.
  • concentration of each small molecule was performed at a concentration having activity with reference to the previously reported literature (17, 20, 21).
  • Inhibitors of synthesis of MPcl FlFO mitochondrial ATP synthase 9 and 50 ⁇ MLB (magnesium l i thospermate B, natural antioxidant) 8 were used as negative controls (22, 23).
  • C2CI2 muscle cells treated with 50 ⁇ MLB or 5 ⁇ MPcll for 48 hours did not increase proliferation and induced cytotoxicity (FIGS. 2B and 2C). Due to the cell staining by BI0, cells treated with BI0 cannot be 7-MD stained. Thus, ⁇ assay shows that BI0 does not induce cytotoxicity (FIG. 2D). Nucleostaining showed that cell cycle re-entry to increase cells in G 2 -M phase upon treatment with BI0, SB203580, SQ22536 or LPA (FIG. 2E).
  • CDKN cyclin-dependent kinase inhibitors
  • p21 CIPl / CDKNlA
  • p27 CDKNlB / KIPl
  • p57 CDKNlC / KIP2
  • BIO or SB203580 in muscle cell water reduced p57 expression (FIG. 3A).
  • small molecule treatment did not significantly affect p27 expression (FIG. 3A).
  • small molecule treatment reduces p21 expression (FIG. 3A).
  • BIO, SB203580, SQ22536 or LPA When treated with BIO, SB203580, SQ22536 or LPA in muscle cells, FITO-bound ⁇ -bungarotoxin indicating dedifferentiated cells Labeling was reduced (FIG. 3B). In contrast, SQ22536, MLB or MPcll did not reduce FITC-linked ex-Bungarotoxin labeling (FIG. 3B). It was confirmed by fluorescence plate reader assay that BIO, SB203580, SQ22536 or LPA attenuated the FITC-linked ⁇ -Bungarotoxin label (FIG. 3C).
  • the ability to build muscle (myogenic potential) of muscle cells was analyzed using a fusion index (11). After incubation for 5 days in differentiation medium, BIO, SB203580, SQ22536 or LPA did not affect the fusion index (FIG. 3D). In contrast, treatment with reversine decreased the cell fusion index.
  • BIO, SB203580, and SQ22536 follicles induce fat cellification of LPA
  • C2C12 muscle cells treated with BIO, SB203580, SQ22536 or LPA were treated with a cocktail of adipogenic factors and cultured to induce lipid accumulation (FIG. 4A).
  • Treatment of C2C12 muscle cells with MLB or MPcll and adipogenic factors did not induce lipid accumulation.
  • the conversion of adipocyte formation with p21 knockout in our previous study was dependent on reversin treatment (11).
  • BIO, SB203580, SQ22536 or LPA to C2C12 muscle cells
  • adipocyte-forming factors were treated to confirm lipid accumulation without reversin treatment (FIG. 4Bi).
  • BIO, SB203580, SQ22536 or LPA the degree of lipid accumulation increased in the experimental group treated with reversin and adipocyte-forming factors (FIG. 4bii).
  • the uptake of glucose by insulin-stimulation which is characteristic of adipocytes, is attributed to the fluorescent glucose analogue 2-NBDG (2- [N- (7-nitrobenz-2-oxa-l, 3-diaxol-4-yl) amino] -2-deoxygkicose) (25).
  • 2-NBDG fluorescent glucose analogue
  • BIO, SB203580, SQ22536 or LPA for 48 hours followed by incubation with a cocktail of adipocyte-forming factors induced insulin-stimulated glucose uptake (FIG. 4ci).
  • MLB or MPcll and adipocyte-forming factors were not insulin sensitive.
  • Increased mineralization is a major feature of osteoogenesis (26).
  • C2C12 muscle cells were treated with BIO, SB203580, SQ22536 or LPA and incubated with a cocktail of bone formation factors that induce mineralization (FIG. 5A).
  • No mineralization was observed in the experimental groups treated with MLB or MPcll and osteogenic factors.
  • more mineralization was induced compared to the experimental group treated with LPA or SQ22536 after incubation with osteogenic factors (FIG. 5bii).
  • treatment with BIO, SB203580, SQ22536 or LPA and reversin and osteogenic factors reduced the difference in mineralization between the experimental groups.
  • Hes-6 gene upregulated in C2C12 myoblasts neurized with transcription factors that promote neuronal differentiation was measured via RT-PCR assay (FIG. 6A). Hes-6 expression was not upregulated when incubated with neural reversin and neurogenic factors following treatment with LPA, MLB or MPcll. Upregulated Hes-6 expression is accompanied by morphological changes in which the nerve of the cell is to be formed (FIGS. 5B, 28). Depolarization-dependent vesicle recycling Physiological features specific to neurons (FIG. 6C). The occurrence of depolarization-dependent vesicle recirculation was confirmed by microplate reader assay (FIG. 6D).
  • Glutamate-dependent induction is also a neuronal specific physiological feature (29).
  • BIO, SB203580 or SQ22536 When treated with BIO, SB203580 or SQ22536 and incubated with reversin and neuronal factors, glutamate-dependent calcium influx was observed (FIG. 6E).
  • Microarray analysis shows the change in total gene expression between C2C12 cells (proliferative and multipotent cells) treated with 2.5 ⁇ M BIO for 48 hours versus C2C12 myoblasts (lineage restricted C2C12 myoblasts).
  • C2C12 myoblasts lineage restricted C2C12 myoblasts.
  • FIGS. 8A and 8B the expression of genes involved in p53 signaling according to KEGGOCyoto Encyclopedia of Genes and Genomes
  • Adipose accumulation was induced when adipogenic factors were treated for 7 days in primary muscle cells treated with 2.5 ⁇ ⁇ 0 for 48 hours, which is a characteristic of adipocyte conversion. Lipids were visualized by oil red 0 staining. Treatment with adipocyte forming factors in untreated primary cells or C2C12 muscle cells treated with 50 ⁇ MLB or DMS0 for 48 hours showed no lipid accumulation (FIG. 9C). The release of insulin-sensitive free fatty acids after epinephrine-stimulation (adipocyte-specific function) was confirmed when the adipocyte-forming factor was treated in primary muscle cells treated with 2.5 ⁇ BIO for 48 hours.
  • the primary muscle cells treated with 2.5 ⁇ BIO for 48 hours were treated with osteogenic factors, which showed a significant increase in mineralization, as shown by Alizarin red staining. It was shown that mineralization did not increase when untreated primary cells or C2C12 muscle cells treated with 50 ⁇ MLB or DMS0 for 48 hours were treated with osteogenic factors (FIG. 9E).
  • the primary muscle cells treated with 2.5 ⁇ ⁇ 0 for 48 hours were treated with 250 nM reversin for 48 hours and treated with neuronal factors, resulting in neuro-specific glutamate-dependent calcium influx. Cells were prepared. Cells showing neuronal morphology increased the signal coming from the Fluo-3 probe. On the other hand, treatment with 50 ⁇ MLB or DMS0 for 48 hours instead of BI0 shows that this effect does not occur (FIG. 9H). Review
  • limb regeneration of Rhesus amphibians is a special example of tissue regeneration (7).
  • Early stages of limb regeneration are associated with cellularization of cells and cell cycle re-entry (4, 6).
  • siRNA-based approaches to induce similar actions in mammalian muscle have been studied (11, 12).
  • the low molecular-based approach is better than the siRNA-based approach.
  • the focus of the present invention is the differentiation of purified population of the root canal excluding 'contaminating' undifferentiated myoblasts.
  • the inventors used previously reported sequential cell seiving (11, 16).
  • the inventors previously confirmed that the method is suitable for obtaining purified myotube cultures (11).
  • the inventors induced cellularization using myoseberg, a low molecular molecule with relatively low cytotoxicity (11,15).
  • Acetylcholine receptor expression is considered a marker of muscle differentiation (30).
  • the results of the present invention indicate that inhibition of glycogen synthase—3 kinase using BI0, activation of G-protein-coupled receptor-mediated signaling using LPA, or inhibition of the p38 MAP kinase pathway using SB203580 may be associated with acetylcholine in mammalian muscle cells. It shows a significant decrease in the expression of receptors (FIGS. 3B-3C).
  • the results of the present invention indicate that the introduction of cell cycle reentry in the cell material is a major factor of reverse differentiation.
  • De-differentiated muscle cells of the limbic amphibian limb remodel new muscle tissue (4).
  • the results of the present inventors show that BIO, LPA, SB203580 or SQ22536 do not inhibit the reverse differentiation of the cells into the muscle root canal (FIG. 3D).
  • the inventors show differentiation into adipocytes and osteogenic cells, showing the state of multipotency by treatment with BIO, LPA, SB203580 or SQ22536 (FIGS. 4 and 5).
  • the results of the present invention induced the differentiation of the cells by using siRNA-mediated p21 knockdown with reversin, a myoblast dedifferentiation agent (11). Only p21 knockdown was undifferentiated to prepare multipotent cells (11).
  • BIO, LPA, SB203580 without reversin treatment Or SQ22536 was treated to induce a multipotent state.
  • the result that can induce the differentiation of the cell by this low molecular weight method shows that the low molecular weight that controls the complex biochemical reaction is superior to the siRNA method.
  • a pluripotent state is defined as a cell population that has the ability to differentiate into trioderm (endoderm, mesoderm and ectoderm) and its derived cells (2).
  • the mammalian muscle cells are treated with BIO, SB203580 or SQ22536 and treated with reversin to differentiate into cells having neuronal characteristics (FIG. 6).
  • Cells treated with small molecules showed morphological changes to neurons. This is thought to be neurogenesis in muscle cells because it induces 'typical' neurons and other morphological changes induced by cellular stress by other factors, such as cytochalasin B or dimethyl sulfoxide (DMS0) treatment (28 ).
  • the inventors conducted a functional test to confirm the conversion to neurons (FIGS. 6D-6E). Previously, these tests were used to show neuronal cell switch in muscle cells introduced with REST—VP16 constructs that activate neuronal genes inhibited by transcriptional inhibitors and neuro-restrictive silencer factors. (29). LPA treatment did not show neuronal cell turnover, indicating that activation of G-protein-binding receptors is required for muscle cells to have multipotents rather than pluripotents.
  • the small molecule-based method for inducing dedifferentiated muscle of the present invention offers numerous possibilities for further study.
  • human muscle biopsies can be utilized to produce patient-specific multipotent cells.
  • the method can be applied to a mammalian model of wound healing.
  • Small molecules used in the present invention (BIO, LPA, SB203580 and SQ22536) downregulate p21 expression.
  • Murphy Roths Large mice show improved wound healing capacity associated with reduced p21 expression (32). Therefore, these small molecules can improve wound healing and reduce scarring, thus forming the basis of topical medical application.
  • the results of the present invention provide for the development of a method for inducing limb regeneration of stunts and suggests a novel approach to pluripotent stem cells of fully differentiated mammalian tissue.

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Abstract

본 발명은 골격근-유래된 다능성 세포의 화학적 제조방법 및 이의 용도에 관한 것으로, 다음의 단계를 포함하는 포유동물 분화세포로부터 다능성 세포(multipotent cells)의 화학적 제조방법을 제공한다: (a) 포유동물부터 분화세포를 수득하는 단계; 및 (b) 상기 분화세포에 p21 하향-조절 유도 화합물을 처리하여 다능성 세포를 수득하는 단계. 본 발명의 다능성 또는 전능성 세포 제조방법을 통해 근육형성 세포 리니지(myogenic lineage), 지방형성 세포 리니지(adipogenic lineage), 골형성 세포 리니지(osteogenic lineage) 또는 신경형성 세포 리니지(neurogenic lineage)를 제공할 수 있으며, 화학물질-기반된 접근방법은 포유동물에서 사지 재생을 유도하는 전략들의 개발에 중요하며, 말기 분화세포로부터 다능성 또는 전능성 세포의 개발을 위한 새로운 접근방법을 제시한다.

Description

【명세서】
【발명의 명칭】
다능성 세포의 제조방법
【기술분야】
본 발명은 다능성 세포의 화학적 제조방법 및 이의 용도에 관한 것이다. 【배경기술】
역분화 (dedifferentiation)는 분화된 세포가 하나 이상의 서로 다른 조직 형태로 분화하기 전의 '즐기세포' -유사 또는 다분화능 상태 (multipotent state)를 획득하는 현상에 대한 것이다 (1). 세포내 역분화와 관련된 새로운 조절인자를 발견하기 위해 저분자 라이브러리 (small molecule libraries)의 표현형-기반된 스크리닝 방법을 실시하였다 (2). 저분자를 이용한 세포 조작은 유전적 접근법과 비교하여 상당한 장점을 갖는다 (3). 예컨대， 저분자는 일시적으로 단백질의 기능을 조절할 수 있는 고도의 기술을 제공한다. 또한， 단일 저분자는 세포 내의 복합적인 특이 타겟을 동시에 조절할 수 있는 가능성을 갖는다.
유미목 양서류 (urodele amphibians)는 뛰어난 역분화능 및 조직 재생능을 갖는다 (4). 예컨대, 사지 절단 후에 전체를 재생할 수 있다, 더욱이, 이러한 재생능은 동물의 전생애 동안 유지된다 (5). 이러한 현상의 연구를 통해， 재생능의 분자적 기작을 이해함으로써 인간 조직 재생을 향상시킬 수 있는 접근법을 개발할 수 있다.
유미목 양서류의 사지 재생 초기에는 절단 부분을 중심으로 골격근 섬유의 역분화가 일어난다 (6). 섬유 융합체 (syncytia)는 세포화 (cellular izat ion)하여 아체 (blastema)라 불리는 간엽 성장 영역 (mesenchymal growth zone)을 구성하는 단핵 세포로 증식한다. 손실된 사지를 재생하기 위한 다분화능 세포에서 아체는 ¾수적이다. 그러나ᅳ 이러한 조직을 재생하는 선천적 기능은 분류학상 '고등' 척추동물에서 감소한다 (7). 포유류 골격근의 역분화를 유도하기 위해 다른 실험적 접근법들이 실시되어 왔다. 예컨대, 마우스 근관 (myotubes)에서 세포 주기 정지 또는 아픕토시스 후에， 바이러스성 종양유전자 (oncogene)를 발현하여 세포화 및 증식을 유도하였다 (8). 그러나， 이러한 역분화된 세포 중 일부는 다분화능 (multipotency)을 보여주며, 간엽 리니지 (mesenchmal lineage)로부터 세포로 재-분화될 수 있다 (8). 유미목 양서류 사지 재생의 추출물과 함께 배양하여 마우스 근관의 역분화를 달성할 수 있으나， 세포는 본질적인 능력을 갖지는 못한다 (9). 전사 억제 인자로 구성된 호메오박스 (homeobox), (초기 아체 및 마우스 사지 발달에 발현하는) msxl의 유도 발현은 대체 간엽계로의 근관 역분화 및 이형분화 (transdifferentiation)를 보여주었다 (9， 10).
그러나, 이러한 접근법은 유전 인자의 근육 핵으로의 도입에 의존적이므로， 조직 재생을 증진하기 위한 치료로써 그 가능성이 제한적이다.
근관 역분화를 유도하기 위한 가장 최근의 접근법은 말기 분화를 유지하기 위한 특이 유전자를 타겟하는 siRNA-기반 전략이다. 본 발명진은 최근 연구에서 근관의 세포화 및 다분화능을 유도하는 저분자 및 사이클린- 의존 키나제 (kinase) 억제제인 p21(CDKN 1A, CIP1)의 녹아웃 (knockout)을 조합하여 근관 역분화를 실시하였다 (11)· 사이클린 -의존 키나제 억제제 2A(CDKN2A, ARF) 및 망막아종 (ret inoblastoma) 단백질 (RBI, 0SRC)의 녹아웃은 분화된 근관 핵에서 세포 주기 재진입을 유도하고 세포질 분열기작을 상향조절 및 분화능의 소실을 야기한다 (12). 그러나， siRNA- 기반 접근법은 치료제로써 저분자 약물과 비교하여 보다 문제될 수 있는 비 -특이 세포독성 (cytotoxicity) 및 그의 발생을 유도할 수 있다 (13， 14). 본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다. 【발명의 내용】
【해결하려는 과제】
본 발명자들은 다능성 세포를 제조하기 위해 연구 노력하였다. 그 결과, 분화세포에 p21 하향 -조절 유도 화합물올 처리하는 경우， 다능성 세포를 얻을 수 있었고 이들의 분화능 (예컨대， 지방형성 세포군, 골형성 세포군， 근육형성 세포군 또는 신경형성 세포군로의 재분화)을 확인함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서， 본 발명의 목적은 다능성 세포 (multipotent or pluri potent eel Is)의 화학적 제조방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 본 발명의 방법에 따라 제조된 다능성 세포를 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 본 발명의 방법에 따라 제조된 전능성 세포를 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 포유동물 조직 또는 기관의 재생 (regeneration)방법을 제공하는데 있다. 본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명 및 청구범위에 의해 보다 명확하게 된다. 【과제의 해결 수단】
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 포유동물 분화세포로부터 다능성 세포 (multipotent eel Is)의 화학적 제조방법을 제공한다:
(a) 포유동물부터 분화세포를 수득하는 단계; 및
(b) 상기 분화세포에 p21 하향 -조절 유도 화합물을 처리하여 다능성 세포를 수득하는 단계. 본 발명자들은 다능성 세포를 제조하기 위해 연구 노력하였다. 그 결과， 분화세포에 p21 하향—조절 유도 화합물을 처리하는 경우， 다능성 세포를 얻을 수 있었고 이들의 분화능 (예컨대， 지방형성 세포군， 골형성 세포군， 근육형성 세포군또는신경형성 세포군의 역분화)을 확인하였다. 본 발명의 다능성 세포의 화학적 제조방법을 각각의 단계로 나누어 상세하게 설명하면 다음과 같다:
단계 (a): 포유동물로부터 분화세포를 수득
본 발명에 따르면， 포유동물로부터 분화세포를 수득한다.
본 명세서에서， 용어 '포유동물' 은 인간， 마우스， 래트, 기니어 피그， 토끼， 원승이， 돼지， 말， 소, 양， 영양， 개 및 고양이를 포함하지만， 이에 한정되는 것은 아니다.
바람직하게는， 상기 분화세포는 말기 분화세포 (terminally differentiated cell)이다.
본 명세서에서, 용어 '말기 분화세포' 는 발생 (development) 과정 중 종^ (endpoint) 단계의 세포로, 특성화된 표현형을 갖는 성숙한 (mature) 세포를 말한다. 분화세포는 다른 세포 종류와 구별되는 하나 이상의 특징 또는 기능을 갖으며, 증식할 수 있는 능력이 제한적이다.
바람직하게는, 상기 분화세포는 골격근 세포， 심근 세포, 평활근 세포， 피부 세포, 연골 세포， 지방 세포 및 골세포로 구성된 군으로부터 선택되는 하나의 세포이고， 보다 바람직하게는 상기 분화세포는 골격근 세포， 심근 세포 및 평활근 세포로 구성된 군으로부터 선택되는 하나의 세포이며， 가장 바람직하게는 상기 분화세포는 골격근 세포이다.
바람직하게는, 상기 분화세포는 결합 조직, 신경 세포， 림프 세포, 맥관 세포, 신장 세포， 췌장 세포， 폐 세포, 요도 세포， 방광 세포, 위 세포， 간 세포, 소장 세포, 대장 세포 및 식도 세포로 구성된 군으로부터 선택되는 하나의 세포이다. 단계 (b): p21 하향—조절 유도 화합물을 처리하여 다능성 세포의 이어, 분화세포에 p21하향 -조절 유도 화합물을 처리한다.
p21은 환경적 스트레스에 따른 핵 이벤트를 조절하는 과정들에서 중요한 기능을 한다. p21은 산화적 스트레스 및 DNA 손상에 따라 매우 높은 레벨로 유도된다. p21 단백질은 사이클린-의존성 키나제의 억제제로 기능하며 세포주기 진행을 효과적으로 차단하기 때문에， 노화 또는 완전 분화된 세포들에서 과다발현 된다. 본 발명에 따르면， p21 발현의 하향- 조절은 근섬유 세포화 및 세포주기 재—진입을 유도하여 유미목 양서류와 부속기관 재생의 초기 단계를 모방하도록 유도한다.
본 발명의 p21 하향 -조절 유도 화합물은 p21 유전자의 발현 억제, p21 단백질의 활성 억제 또는 p21 단백질의 안정성을 감소시켜 하향-조절을 유도하는 화합물이다.
바람직하게는， 상기 p21 하향 -조절 유도 화합물은 다음과 같이 4 종류의 화합물이 있다:
첫 번째， 단계 (b)에서 이용되는 p21 하향ᅳ조절 유도 화합물은 p21을 하향조절하면서 글리코겐 신타제 -3 키나제 (glycogen synthase-3 kinase) 단백질의 활성을 억제하는 화합물이다. 바람직하게는， 상기 첫 번째 군에 해당하는 화합물은 BICX6-브로모인디루빈 -3'—옥사임), 3F8(5-에틸 -7，8- 다이메톡시 -1H-피를로 [3,4-c]이소퀴놀린— 1,3(2H)_디원) 및 AR-A 014418(N- [(4-메록시페닐)메틸] -N'-(5-니트로 -2—디아조일)우레아)로 구성된 군으로부터 선택되는 하나의 화합물이다. 가장 바람직하게는 상기 첫 번째 군에 해당하는 화합물은 BI0이다. BI0의 화학 구조식은 다음과 같다:
Figure imgf000007_0001
두 번째， 단계 (b)에서 이용되는 p21 하향 -조절 유도 화합물은 p21을 하향조절.하면서 p38 MAPCMitogen-Activated Protein) 키나제 경로를 억제하는 화합물이다. 바람직하게는， 상기 두 번째 군에 해당하는 화합물은 CMPD-K2 ' -플루오로 -N-(4-하이드록시페닐) -[ 1 , 1 ' -바이페닐] -4- 부타나마이드)， E0 1428((2-메틸페닐)ᅳ [4-[(2-아미노 -4- 브로모페닐)아미노 ]-2-클로로페닐]메타논) 및 SB203580(4-[4-(4- 플루오로페닐 )-2-(4—메틸설피닐페닐) -1H-이미다졸 -5-일]피리딘)로 구성된 군으로부터 선택되는 하나의 화합물이고， 가장 바람직하게는, SB203580이다. SB203580의 화학구조식은 다음과 같다:
Figure imgf000008_0001
세 번째， 단계 (b)에서 이용되는 p21 하향 -조절 유도 화합물은 p21을 하향조절하면서 아데니릴 사이클라세 (adenylyl cyclase)의 억제하는 화합물이다. 바람직하게는， 상기 세 번째 군에 해당하는 화합물은 BPIPP(5- (3-브로모페닐)ᅳ 5,ll-dihydro-l,3-다이메틸 -1H—인데올 [2'，1' :5，6]피리도
[2,3-d]피리미딘 -2,4,6(3H)-trione), KH7((士) -2-(1Η-벤지미다졸 -2-일디오) 프로파노익 애시드 2-[(5-브로모 -2-하이드록시페닐)메틸린]하이드라자이드) 및 SQ22536(9- (테트라하이드로 -2-푸라닐 )-9H-퓨린 -6-아민)로 구성된 군으로부터 선택되는 하나의 화합물이고， 가장 바람직하게는， SQ22536이다. SQ22536의 화학구조식은 다음과 같다:
Figure imgf000008_0002
네 번째， 단계 (b)에서 이용되는 p21 하향 -조절 유도 화합물은 p21을 하향조절하면서 G-단백질 -결합 수용체 -매개 신호전달 (G-prote in-coupled receptor-mediated signaling)의 활성화하는 화합물이다. 바람직하게는 LPACLysophosphatidic acid)이다. LPA의 화학구조식은 다음과 같다:
Figure imgf000008_0003
보다 바람직하게는, 상기 p21 하향 -조절 유도 화합물은 10(6- 브로모인디루빈 -3 ' -옥사임 )， SB203580(4-[4-(4-플루오로페닐 )-2-(4- 메틸설피닐페닐) - 1H-이미다졸 -5-일]피리딘)， SQ22536 ( 9_ (테트라하이드로 -2- 푸라닐 )-9H-퓨린 -6—아민) 또는 LPA(Lysophosphatidic acid)로 구성된 군으로부터 선택되는 하나의 화합물이다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면， 본 발명에서 p21 발현의 하향- 조절은 세포화된 근관의 증식ᅳ 세포주기로의 재ᅳ진입 (re-entry) 및 분화를 유도한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, p21 발현의 하향—조절 후에도 고유한 근전위 (myogenic potential)를 유지고유한 근전위 (myogenic potential)를 유지한다.
상술한 바와 같이， 본 발명은 매우 간단한 처리를 통하여 분화세포로부터 다능성 세포를 얻을 수 있다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명의 방법에 의해 수득되는 다능성 세포는 단계 (a)에서 이용되는 분화세포와 동일한 리니지 또는 배엽의 세포이다. 예컨대， 분화세포로서 골격근 세포를 이용하는 경우, 본 발명에 의해 수득되는 다능성 세포는 골격근 동일한 배엽의 세포， 예컨대 골격근, 뼈 , 진피， 결합 조직 , 비뇨생식계， 심장, 피 (림프 세포), 신장 및 비장을 구성하는 세포로 분화될 수 있는 다능성 세포이다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면， 단계 (a)에서 이용되는 분화세포는 골격근 세포이고， 단계 (b)에서 수득한 다능성 세포는 골격근 세포， 지방세포 또는 골세포로 분화될 수 있는 다능성 세포이다.
한편， 본 발명에 따르면， 매우 흥미롭게도 분화세포로부터 간단한 처리를 통하여 전능성 세포를 얻을 수 있다. 바람직하게는， 단계 (b)의 p21 하향 -조절 유도 화합물 처리 이후 역분화제를 단계 (b)에서 얻은 세포에 처리하여 전능성 세포 (pluripotent cell)를 수득하는 단계를 추가적으로 포함하며, 상기 전능성 세포는 단계 (a)의 분화세포와 다른 3배엽 계통의 세포로 분화되는 능력을 갖는다.
본 발명의 용어 '역분화제 (dedifferentiation agent)' 는 하나 이상의 세포형태들의 역분화를 촉진하는 제제를 의미하며, 화학물질, 핵산 펩타이드， 폴리펩타이드, 작은 유기분자, 항체， 안티센스 을리고뉴클레오타이드， RNAi 컨스트럭트 및 리보자임을 포함한다. 다양한 역분화제는 완전 분화된 포유동물 세포에서 역분화를 유도하기에 충분한 시간 동안 하나 이상의 역분화 인자들과 인 비보 또는 인 트^에서 세포와 접촉시킴으로써 역분화를 유도할 수 있다.
상기 3배엽은 내배엽， 중배엽 및 외배엽으로 구성되며， 내배엽에서는 위, 결장， 간， 췌장, 방광 요도의 안쪽， 기도의 상피부분， 폐, 인두， 갑상선, 부갑상선 및 소장 조직을 구성하는 세포가 발생하고, 중배엽에서는 골격근， 뻐， 진피， 결합 조직, 비뇨생식계， 심장, 피 (림프 세포)， 신장 및 비장을 구성하는 세포가 발생하며, 외배엽에서는 중주신경계， 눈의 수정처 1， 두개골 및 감각， 신경절 및 신경， 색소 세포， 머리결합조직 (head connective tissues), 표피, 털 및 유선을 구성하는 세포가 발생한다.
본 발명의 방법에 따르면， 단계 (a)의 분화세포는 p21 하향 -조절 유도 화합물 처리 이후 역분화제의 처리에 따라, 다른 3배엽 계통으로 분화할 수 있다.
바람직한 구현예에 따르면， 골격근 유래인 C2C12.세포물은 본 발명의 저분자 처리 후， 리버신과 레티노산 및 N2 첨가제와 배양한 경우 신경 세포로 분화하여 전능성 세포의 특징을 나타낸다.
보다 바람직하게는， 상기 역분화제는 리버신 (N6-사이클로핵실 -N2— (4- 모폴린 -4-일-페닐) -9H-퓨린 -2, 6-다이아민), 트리코스타틴 A(trichostatin A), 발프론산 (valproic acid), 부페닐 (buphenyl ) 및 5-아자시티딘 (5- azacytidine)으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나의 화합물이다.
바람직하게는, 본 발명의 단계 (b)의 p21 하향 -조절 유도 화합물 처리 이후 분화 유도제를 단계 (b)에서 얻은 세포에 처리하여 단계 (b)의 분화세포와 동일 3배엽 계통의 다른 세포 리니지 (cell lineage)로 분화시키는 단계를 추가적으로 포함한다.
본 명세서에서， 용어 '분화 유도제' 는 원하는 세포로 분화시키기 위해 배양배지에 포함시키는 성장인자 및 호르몬 등을 말한다.
바람직한 구현예에 따르면， 단계 (b)에서 수득한 다능성 줄기세포로부터 지방형성 세포 리니지를 수득하기 위하여 이용되는 분화 유도제는 인슬린, 덱사메타손， 로시글리타존, IBMX(isobutylmethylxanthine) 또는 이의 흔합물이다.
바람직한 구현예에 따르면， 단계 (b)에서 수득한 다능성 줄기세포로부터 골형성 세포 리니지를 수득하기 위하여 이용되는 분화 유도제는 아스코르브산 -2-포스페이트, 덱사메타손, β-글리세로포스페이트 또는 이의 흔합물이다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면， 본 발명의 다능성 또는 전능성 세포는 근육형성 세포 리니지 (myogenic lineage), 지방형성 세포 리니지 (adipogenic lineage), 골형성 세포 리니지 (osteogenic lineage) 또는 신경형성 세포 리니지 (neurogenic lineage)로 분화할 수 있다. 본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 본 발명의 방법에 따라 제조된 다능성 세포를 제공한다. 본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 본 발명의 방법에 따라 제조된 전능성 세포를 제공한다.
본 발명의 방법에 따라 제조된 다능성 또는 전능성 세포로부터 분화된 근육형성 세포 리니지 또는 근육세포를 유효성분으로 포함하는 근질환 (myopathy) 치료용 조성물을 제공할 수 있다.
본 명세서에서, 용어 '근질환' 은 근육 피로， 근위축증, 사고 또는 수술에 의한 상처 또는 근이영양증이고， 용어 '근이영양증' 은 베커형 근이영양증 (Becker's muscular dystrophy), 선천성 근이영양증 (congenital muscular dystrophy) , 뒤셴형근이영양증 (Duchenne muscular dystrophy) , 원위 근이영양증 (distal muscular dystrophy), 에머리 -드라이푸스 근이영양증 (Emery-Dreifuss muscular dystrophy), 안면견갑상완 근이영양증， 지대형 근이영양증， 근긴장성 근이영양증, 안인두성 근이영양증， 근긴장성 근이영양증, 사르코글리칸증, 척수성 근육위축 또는 BWUBrown-Vialetto- Van Laere syndrome)을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 방법에 따라 제조된 다능성 세포로부터 분화된 골형성 세포 리니지을 유효성분으로 포함하는 골 질환 치료용 조성물을 제공할 수 있다。
본 명세서에서, 용어 '골 질환' 은 골다공증， 청소년 골다공증， 불완전 골형성증 (osteogenesis imperfecta), 과골화증， 고칼슘혈증， 부갑상선 기능항진증, 골연화증, 용해성 골질환， 골괴사증， 뼈의 파젯병， 골 발생 질환, 골 골절, 류마티스 관절염에 의한 골 손실, 염증성 류마티스 관절염， 골수염， 전이성 골질환， 치주성 골 소실, 구루병， 암에 의한 골 손실 또는 골의 노인성 손실을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 방법에 따라 제조된 다능성 또는 전능성 세포로부터 분화된 신경형성 세포 리니지 또는 신경세포를 유효성분으로 포함하는 신경질환 (neurological disorder) 치료용 조성물을 제공할 수 있다.
본 명세서에서， 용어 '신경질환' 은 물리적， 대사적， 독성, 화학적 또는 면역학적인 중추신경계의 손상으로부터 유래한 신경계 질환이며， 바람직하게는 근위축성측생경화증， 다발성경화증, 알츠하이머병， 외상성 뇌손상, 뇌졸중， 허혈성 뇌질환， 간성 뇌증 및 저산소증을 포함하는 가역성 또는 대사성 뇌병증， 간질, 머리 외상， 파킨슨 질환, 알츠하이머 질환, 헌팅턴 질환, 3차 신경통， 설인 신경통, 벨 마비, 중증 경화증， 근육 이영양증， 점진성 근육 위축, 점진적 연수 유래 근육 위축, 헤르니아된, 파괴된 또는 탈출된 무척추 디스크 증후군， 경부 척추증， 집강 장애, 흉곽 아웃렛 파괴 증후군, 리드, 답손ᅳ 티크， 포르피린증 또는 길랑 -바레 증후군에 의해 야기되는 말초신경병을 포함하지만， 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 조성물은 (a) 상술한 다능성 또는 전능성 세포로부터 분화된 세포 (예컨대, 근육형성 세포군, 골형성 세포군)의 약제학적 유효량; 및 (b) 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물이다.
본 명세서에서 용어 '약제학적 유효량' 은 상술한 다능성 세포로부터 분화된 세포의 효능 또는 활성을 달성하는 데 충분한 양을 의미한다.
본 발명의 조성물이 약제학적 조성물로 제조되는 경우, 본 발명의 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 본 발명의 약제학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서， 락토스， 텍스트로스， 수크로스, 솔비를, 만니를， 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘， 알기네이트， 젤라틴, 규산 칼슘， 미세결정성 셀를로스, 폴리비닐피롤리돈， 셀를로스， 물, 시럽， 메틸 셀를로스, 메틸히드록시벤조에이트， 프로필히드록시벤조에이트， 활석， 스테아르산 마그네슴 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제， 감미제, 향미제， 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed. , 1995)에 상세히 기재되어 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 비경구 투여할 수 있으며, 예를 들어 피하 주입, 근육 주입， 경피 투여， 관절강내 주사, 등으로 투여할 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법， 투여 방식， 환자의 연령， 체중， 성， 병적 상태, 음식, 투여 시간， 투여 경로， 배설 속도 및 반웅 감웅성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물의 일반적인 투여량은 성인 기준으로 1일 당 102- 1010 세포이다.
본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및 /또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액， 현탁액， 시럽제 또는 유화액 형태이거나 엑스제， 산제, 분말제, 과립제， 정제 또는 갑셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다. 본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 포유동물 조직 또는 기관의 재생 (regeneration)방법올 제공한다:
(a) 포유동물부터 분화세포를 수득하는 단계;
(b) 상기 분화세포에 p21 하향 -조절 유도 화합물을 처리하여 다능성 세포를 수득하는 단계 ; 및
(C) 상기 다능성 세포를 원하는 조직 또는 기관으로 분화시키는 단계. 본 발명의 방법은 상기 제조방법을 이용하기 때문에, 이 둘 사이에 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여, 그 기재를 생략한다. 단계 (c): 다능성 세포를 원하는 조직 또는 기관으로 분화
이어， 단계 (b)에서 수득한 다능성 세포를 원하는 조직 또는 기관으로 분화시킨다 .
상기 분화는 단계 (b)에서 수득한 다능성 세포의 배양배지에 원하는 조직 또는 기관의 분화유도제를 첨가하여 실시한다. 【발명의 효과】
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:
(a) 본 발명은 p21 하향 -조절 유도 화합물을 이용한 다능성 또는 전능성 세포의 제조방법을 제공한다.
(b) 본 발명의 다능성 또는 전능성 세포 제조방법을 통해 근육형성 세포 리니지 (myogenic lineage), 지방형성 세포 리니지 (adipogenic lineage), 골형성 세포 리니지 (osteogenic lineage) 또는 신경형성 세포 리니지 (neurogenic lineage)를 제공할 수 있다.
(c) 본 발명의 화학물질-기반된 접근방법은 포유동물에서 사지 재생을 유도하는 전략들의 개발에 중요하며ᅳ 말기 분화세포로부터 다능성 또는 전능성 세포의 개발을 위한 새로운 접근방법을 제시한다.
【도면의 간단한 설명】
도 1은 골격근 역분화 또는 분화에 사용된 저분자의 구조를 보여준다 (알파벳순).
도 2a는 C2C12분화 마우스 근관에서 저분자를 처리하여 세포 증식을 조사한 실험과정의 모식도를 보여준다. 도 2b는 C2C12 근육 세포물에 2,5 μΜ BI0(6-bromoindirubin-3'-oxime), 10 μΜ SB203580(4-[4-(4- f luorophenyl )-2-(4-methylsul f inylphenyl )-lH-imidazol-5-yl ]pyridine) , 300 μΜ SQ22536 ( 9- ( Te t r ahydr o-2- fur any 1 ) -9H-pur i η-6-am i ne ) 또는 30 μΜ LPACLysophosphatidic acid)를 48 시간 동안 처리하여 DNA 합성을 유£한 결과로 FITC-BrdU신호가 증가된 것을 확인하였다. C2C12 근육 세포물에 50 μΜ MLB 또는 5 μΜ MPcll을 48 시간 동안 처리한 결과 DNA 합성이 증가하지 않음을 보여준다. 도 2c는 C2C12 근육 세포물에 10 μΜ SB203580, 300 μΜ SQ22536, 30 μΜ LPA, 50 μΜ MLB 또는 5 μΜ MPcll을 48 시간 동안 처리한 결과， 세포독성을 유도하지 않음올 7- D 염색을 통해 보여준다. 세포독성 확인의 양성대조군으로 0.1% 트리톤 X-100을 처리하였다. 도 2d는 C2C12 근육 세포물에 2.5 μΜ BIO를 48 시간 동안 처리하여 세포독성이 유도되지 않음을 Μπ 분석으로 확인한 결과를 보여준다. 도 2e는 C2C12 근관에 2.5 yM BIO, 10 μΜ SB203580, 300 yM SQ22536 또는 30 μΜ LPA를 48 시간 동안 처리하여 유도된 세포주기 재- 진입 (re-entry)을 PKpropidium iodide) 염색을 통해 세포주기의 G2-M기의 세포함량을 유세포 분석을 실시한 결과로 보여준다. C2C12 근아세포를 양성 대조군으로 이용하였다.
도 3a은 2.5 uM BI0 또는 10 μΜ SB203580올 48 시간 동안 처리한 C2C12 근육 세포물의 ρ57 발현 감소를 확인한 웨스턴 블럿 결과를 보여준다. 300 μΜ SQ22536 또는 30 μΜ LPA를 처리한 C2C12 근육 세포물은 p57의 발현을 감소시키지 않음을 보여준다, 그러나， C2C12 근육 세포물에 BIO, SB203580, SQ22536 또는 LPA를 처리하였을 때， p27의 발현에 영향이 없음을 보여준다. 대조적으로, C2C12 근육 세포물에 BIO, SB203580, SQ22536 또는 LPA를 처리하였을 때, p21 발현이 감소한 결과를 보여준다. GAPDH 발현을 로딩 대조군으로 사용하였다. 밴드 이미지 밑에 표기된 슷자는 무처리 세포물과 비교한 밴드의 강도 (intensity)를 보여준다. 도 3b는 C2C12 근육 세포물에 2.5 μΜ BI0, 10 μΜ SB203580 또는 30 μΜ LPA를 48시간 동안 처리하여 분화된 근육 -특이 아세틸콜린 수용체의 발현 (FITC-결합 α- 붕가로톡신의 검출)이 감소된 것으로 역분화를 확인한 결과이다. 300 μΜ SQ22536, 50 μΜ MLB 또는 5 μΜ MPcll를 48시간 동안 처리한 경우， 아세틸콜린 수용체의 발현이 감소되지 않음을 보여준다. 도 3c는 C2C12 근육 세포물에 BIO, SB203580, 또는 LPA를 처리로 역분화를 유도하여 이를 FITC-결합 α-붕가로톡신 표지의 감소를 형광 마이크로플레이트 리더 (reader) 분석을 통해 확인한 결과이다. 무처리 세포물과 비교하여 p<0.05의 신뢰도를 나타낸다. 도 3d는 분화배지에서 5 일 동안 배양 후, C2C12 근육 세포물에 2.5 μΜ BI0, 10 μΜ SB203580, 300 μΜ SQ22536 또는 30 μΜ LPA를 48 시간 동안 처리한 경우 융합지수 (예컨대， 다수의 세포 핵이 다핵성 근관 융합체에 포함)에 영향이 없음을 나타낸 결과이다. 대조적으로 분화배지에서 5 일 동안 배양 후， 1 μΜ 리버신을 48 시간 동안 처리한 경우 융합지수가 감소되었다. 무처리 세포물과 비교하여 ρ<0.05의 신뢰도를 나타낸다. 도 4는 C2C12 근육 세포물에 2.5 μΜ BIO, 10 μΜ SB203580, 300 μΜ SQ22536 또는 30 μΜ LPA를 48시간 동안 처리하고 지방세포형성 인자를 7일 동안 처리한 경우 지방세포화의 특징인 지질 축적이 유도됨을 나타낸다. 지질은 오일 레드 0(0il Red 0) 염색으로 가시화하였다. 무처리 C2C12 세포물 또는 50 μΜ MLB 또는 5 μΜ MPcll를 48시간 동안 처리한 C2C12 근육 세포물에 지방세포 형성 인자를 처리한 경우 지질 축적이 나타나지 않음을 보여준다. C2C12 근아세포에 250 nM 리버신을 처리하고 48시간 동안 지방세포화 배지에서 배양한 경우 이전 보고된 논문에서와 같이 지질 축적이 확인되었다 (33). 비교를 위해 3T3-L1 지방세포의 지질 축적을 나타내었다. 도 4bi는 아디포레드 (AdipoRed)™ 라벨링으로 측정한 지질축적을 나타낸다. C2C12 근육 세포물에 2.5 μΜ BIO, 10 μΜ SB203580, 300 μΜ SQ22536 또는 30 μΜ LPA를 48시간 동안 처리하고 지방세포형성 인자를 처리한 경우 지질 축적이 상당히 증가한 결과이다. 대조적으로, 무처리 C2C12 세포물 또는 50 μΜ MLB 또는 5 μΜ MPcll를 48시간 동안 처리한 C2C12 근육 세포물에 치방세포형성 인자를 처리한 경우에는 지질 축적이 증가하지 않음을 나타낸다. 결과는 무처리 세포물과 비교하여 ρ<0·05의 신뢰도를 나타낸다. 도 4bii는 C2C12 근육 세포물에 BI0, SB203580, SQ22536 또는 LPA를 48시간 동안 처리하고 250 nM 리버신을 처리한 후, 지방세포형성 인자를 처리하여 배양한 결과 아디포레드™ 프로브 (probe)로부터 형관 신호가 증가하는 것으로 지질 축적이 증가함을 확인하였다. C2C12 근육 세포물에 MLB 또는 MPcll을 48시간 동안 처리하고 250 nM 리버신을 처리한 후, 지방세포형성 인자를 처리하여 배양한 결과， 지질 축적이 증가하지 않았다. 결과는 무처리 세포물과 비교하여 p<0.05의 신뢰도를 나타낸다. 도 4c는 C2C12 근육 세포물에 BIO, SB203580, SQ22536 또는 LPA를 48시간 동안 처리하고 지방세포형성 인자를 처리한 결과， 지방세포 특이적 기능인 인술린 -경로 매개 글루코즈 섭취능을 나타냈다. 무처리 C2C12 세포물 또는 50 μΜ MLB 또는 5 μΜ MPcll를 48시간 동안 처리한 C2C12 근육 세포물에 지방세포형성 인자와 배양한 경우， 인슐린- 경로 매개 글루코즈 섭취능을 나타내지 않음을 보여준다. 결과는 인슐린- 경로를 자극하지 않은 세포물과 비교하여 p<0.05의 신뢰도를 갖는다.
도 5a는 C2C12 근육 세포물에 2.5 μΜ BI0, 10 μΜ SB203580, 300 uM SQ22536 또는 30 μΜ LPA를 48시간 동안 처리하고 골형성 인자를 처리하여 골형성 전환의 특징인 무기질화 (mineralization)를 유도한 결과를 나타낸다. 무처리 세포물 또는 50 μΜ MLB또는 5 μΜ MPcll를 48시간 동안 처리한 C2C12 근육 세포물에 골형성 인자와 배양한 경우， 무기질화를 나타내지 않았다. C2C12 근아세포에 250 nM 리버신올 처리한 후, 골형성 배지에서 48 시간 동안 배양한 경우 무기질화가 형성되었으며, 이는 이전 보고와 일치한다 (33). ATDC5 골형성 세포의 무기질화 비교하여 나타내었다. 도 5bi는 C2C12 근육 세포물에 BIO, SB203580, SQ22536 또는 LPA를 48 시간 동안 처리하고 골형성 인자를 처리한 경우, 무기질화가 상당히 증가함을 보여준다. 반대로， 무처리 C2C12 세포물, 또는 MLB 또는 MPcll를 48 시간 동안 처리한 C2C12 근육 세포물에 골형성 인자를 처리한 경우， 무처리 세포물과 비교하여 무기질화가 증가하지 않았다 (p<0.05). 도 5bii는 C2C12 근육 세포물에 BIO, SB203580, SQ22536 또는 LPA를 48 시간 동안 처리하고 250 nM 리버신을 48 시간 처리한 후， 골형성 인자를 첨가하여 배양한 경우， 알리자린 레드 (Alizarin red) 염색을 통해 무기질화가 증가함을 보여준다. 또한， 4 처리군 간의 리버신 처리에 대한 차이는 감소하였다. MLB 또는 MPcll를 48 시간 동안 처리한 C2C12 근육 세포물에 골형성 인자를 처리한 경우 250 nM 리버신을 48 시간 처리한 후， 골형성 인자를 첨가하여 배양한 경우, 무기질화가 증가하지 않음을 보여준다, 결과는 무처리 세포물과 비교하여 p<0.05의 신뢰도를 갖는다. 도 5Ci는 증가된 알칼라인 포스파타제 활성은 골형성 전화의 하나의 특징이다. C2C12 세포물에 BIO, SB203580, SQ22536 또는 LPA를 48 시간 처리하고 골형성 인자를 처리한 후 알칼라인 포스파타제 활성 상당히 증가한 결과를 보여준다. 반대로， 무처리 C2C12 근육 세포물， 또는 MLB 또는 MPcll를 48 시간 동안 처리한 C2C12 근육 세포물에 골형성 인자를 처리한 경우， 알칼라인 포스파타제 활정이 증가하지 않음을 보여준다. 무처리， MLB 또는 MPcll 처리한 C2C12 근육 세포물은 유사한 분석값을 보여준다. 도 5di는 C2C12 근육 세포물에 BI0, SB203580, SQ22536 또는 LPA를 48 시간 동안 처리하고 250 nM 리버신을 48 시간 처리한 후, 골형성 인자를 첨가하여 배양한 경우， 4 처리군 간의 알칼라인 포스파타제 활성의 차이가 줄어듬을 보여준다. 반대로， 무처리 C2C12 세포물, MLB 또는 MPcll를 48 시간 동안 처리한 C2C12 근육 세포물에 골형성 인자를 처리하고 250 nM 리버신을 48 시간 처리한 후， 골형성 인자를 첨가하여 배양한 경우, 알칼라인 포스파타제 활성을 증가시키지 않음을 보여준다. 무처리, MLB 또는 MPcll 처리한 C2C12 근육 세포물은 유사한 분석값을 보여준다.
도 6a는 C2C12 근육 세포물에 2.5 μΜ BIO, 10 μΜ SB203580 또는
300 μΜ SQ22536를 48 시간 동안 처리하고 신경형성 인자롤 처리하고 250 nM 리버신을 48 시간 처리한 후， 신경형성 배지에서 배양하여 신경 전사인자, Hes-6의 발현을 유도을 유도한 결과이다. 반대로， 30 μΜ LPA, 50 yM MLB또는 5 μΜ MPcll를 C2C12 근육 세포물에 48 시간 처리하고 250 nM 리버신을 48 시간 처리한 후, 신경형성 배지에서 배양한 경우， Hes-6 발현을 유도하지 않음을 보여준다. 도 6b는 C2C12 근육 세포물에 BI0를 처리하고 250 nM 리버신을 48시간 처리한 후， 신경형성 배지에서 배양한 결과 신경형성으로 보이는 형태학적 변화가 관찰되었다. 도 6c는 C2C12 근육 세포물에 BIO, SB203580 또는 SQ22536를 48 시간 처리하고 250 nM 리버신을 48 시간 처리한 후, 신경형성 인자와 배양한 경우 신경-특이적 특징인 탈분극화 -의존 소포 재순환 (depolarizat ion-dependent vesicle recycling)을 확인한 결과이다. 소포 재순환은 형광 표지. FM 1-43으로 가시화하였다. 반대로, MLB 또는 MPcll를 C2C12 근육 세포물에 48 시간 처리하고 250 nM 리버신을 48 시간 처리한 후， 신경형성 인자가 포함된 배지에서 배양한 경우, 탈분극화 -의존 소포 재순환을 나타내지 않았다. 도 6d는 C2C12 근육 세포불에 BIO, SB203580 또는 SQ22536를 48 시간 동안 처리하고 250 nM 리버신을 48 시간 처리한 후, 신경형성 인자를 첨가하여 배양한 경우 고농도 세포외 칼륨을 이용한 탈분극으로 FM 1-43 흡수가 증가하였다. 반대로， C2C12 근육 세포물에 MLB 또는 MPcll을 48시간 처리하고 250 nM 리버신을 48 시간 처리한 후， 신경형성 인자를 첨가하여 배양한 경우 FM 1-43 형광 신호가 증가하지 않음을 보여준다. 저농도 세포외 칼륨을 이용한 대조군과 비교하여 p<0.05의 신뢰도를 갖는다. FM 1- 43 형광 신호의 탈분극—의존 증가를 비교하기 위해 pl9 뉴런을 이용하였다. 도 6e는 C2C12 근육 세포물에 BIO, SB203580 또는 SQ22536를 48 시간 동안 처리하고 250 nM 리버신을 48 시간 처리한 후, 신경형성 인자를 포함하여 배양한 결과, 신경-특이적 특징인 글루타메이트 -의존 칼슴 유입을 확인한 결과이다. 글루타메이트 -의존 칼슘 유입은 형광 표지， Fluo-3로 가시화하였다. 반대로， C2C12 근육 세포물에 MLB 또는 MPcll을 48시간 처리하고 250 nM 리버신을 48 시간 처리한 후， 신경형성 인자를 포함하여 배양한 경우 글루타메이트—의존 칼슴 유입이 확인되지 않았다.
도 7는 완전히 분화된 골격근 조직으로부터 전능성 세포를 수득하기 위한 저분자 방법의 모식도를 보여준다. 최근에 발표된 결과는 도룡뇽과 같은 유미목 양서류의 사지 재생 동안 근조직의 역분화 및 본질적으로 새로운 사지 (예컨대， 단분화능 세포)에 새로운 근조직을 형성함을 보여준다 (31). 본 발명의 저분자 방법은 신경세포의 특징을 나타내는 세포로의 전환이 보여주듯이， 전분화능을 갖는 세포로 역분화함으로써 포유류 근육 조직에 대한 세포의 발생학적 가소성을 보다 넓힐 수 있다. 도 8a는 2.5 μΜ BIO를 48 시간 동안 처리한 C2C12 세포물 (증식성， 다분화능 세포) 대 리니지가 예정된 C2C12 근아세포 (lineage restricted C2C12 myoblasts)간의 전체 유전자 발현 변화를 보여주는 마이크로어레이 분석결과이다. 도 8b는 KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)분석에 따른 p53 신호전달에 연관된 유전자들의 발현 변화를 보여주는 결과이다.
도 9a는 증가된 FITC— BrdU 시그널이 보여주는 바와 같이, 일차 근관 배양으로부터 획득하여 2.5 μΜ BIO를 48 시간 동안 처리한 세포물의 DNA 합성 유도를 나타낸다. 도 9b는 FITC-결합 α-붕가로특신 (bungarotoxin) 표지에 대한 형광 마이크로플레이트 리더 어세이 결과로서， 감소된 형광 시그널이 보여주는 바와 같이， BI0를 처리한 일차 근육 세포물이 역분화가 강화되었다는 것을 확인하였다. 반면, 50 μΜ MLB를 48 시간 동안 처리하가나 또는 DMS0를 처리한 경우에는 역분화가 유도되지 않았다. 결과는 무처리 세포물과 비교하여 p<0.05의 신뢰도를 가지며， 세 개의 독립적인 실험에 대한 대표 값으로 나타냈다. 도 9c는 2.5 μΜ BI0를 48 시간 동안 처리한 일차 근육 세포물에 지방세포형성 인자 (adipogenic factors)를 7 일 동안 처리한 경우 지방 축적이 유도되었고， 이는 지방세포형성 전환의 특징이다. 지질은 오일 레드 0(0il Red 0) 염색으로 가시화하였다. 무처리 일차 세포물， 또는 50 yM MLB 또는 DMS0를 48 시간 동안 처리한 C2C12 근육 세포물에 지방세포 형성 인자를 처리한 경우 지질 축적이 나타나지 않음을 보여준다. 도 9d는 2.5 μΜ BIO를 48 시간 동안 처리한 일차 근육 세포물에 지방세포 형성 인자를 처리한'경우 에피네프린- 자극 (지방세포-특이적 기능) 후 인슐린-감수성 유리 지방산의 방출을 보여준다. 반면, 무처리 C2C12 세포물， 또는 50 μΜ MLB 또는 DMS0를 48 시간 동안 처리한 C2C12 근육 세포물에 지방세포 형성 인자를 처리한 경우 이러한 지방세포-특이적 기능이 유도되지 않음을 보여준다. 결과는 에피네프린 단독 처리와 비교하여 p<0.05의 신뢰도를 가지며， 세 개의 독립적인 실험에 대한 대표 값으로 나타냈다. 도 9e는 2.5 μΜ BIO를 48 시간 동안 처리한 일차 근육 세포물에 골형성 인자를 처리한 경우， 알리자린 레드 (Alizarin red) 염색이 보여주는 바와 같이 무기질화가 유의하게 증가된 것을 나타낸다. 무처리 일차 세포물， 또는 50 μΜ MLB 또는 DMS0를 48 시간 동안 처리한 C2C12 근육 세포물에 골형성 인자를 처리한 경우 무기질화가 증가하지 않음을 보여준다. 도 9f는 BI0를 처리한 세포물의 경우 골형성 전환의 또다른 특징인 알칼라인 포스파타제 활성이 증가한 결과를 보여준다. 알칼라인 포스파타제 활성은 AttoPhos™ 시약을 처리한 세포 용해물을 10 분 동안 인큐베이션 한 후 측정하였다. 결과는 무처리 세포물와 비교하여 증가된 활성에 대하여 p<0.05의 신뢰도를 가지며 세 개의 독립적인 실험에 대한 대표 값으로 나타냈다. 도 9g는 2.5 μΜ BI0를 48 시간 동안 처리한 일차 근육 세포물에 250 nM 리버신을 48 시간 처리하고 신경형성 인자를 처리한 경우， 신경-특이적 특징인 탈분극화 -의존 소포 재순환 (depolarizat ion— dependent vesicle recycling)이 가능한 세포가 제조된다는 것을 보여준다. 신경세포 형태를 보이는 세포들은 FM 1- 43 프로브로부터의 나오는 시그널이 증가하였다. 반면， BI0를 처리하는 대신 50 yM MLB 또는 DMS0를 48 시간 동안 처리한 경우 이러한 효과가 발생하지 않음을 보여준다. 결과는 무처리 세포물와 비교하여 증가된 F 1- 43 시그널에 대하여 p<0.05의 신뢰도를 가지며 세 개의 독립적인 실험에 대한 대표 값으로 나타냈다. 도 9h는 2.5 μΜ BI0를 48 시간 동안 처리한 일차 근육 세포물에 250 nM 리버신을 48 시간 처리하고 신경형성 인자를 처리한 경우, 신경-특이적 특징인 글루타메이트 -의존 칼슘 유입 (glutamate- dependent calcium influx)이 가능한 세포가 제조된다는 것을 보여준다. 신경세포 형태를 보이는 세포들은 Fluo-3 프로브로부터의 나오는 시그널이 증가하였다. 반면, BIO를 처리하는 대신 50 μΜ MLB 또는 DMS0를 48 시간 동안 처리한 경우 이러한 효과가 발생하지 않음을 보여준다. 결과는 무처리 세포물와 비교하여 증가된 시그널에 대하여 p<0.05의 신뢰도를 가지며 세 개의 독립적인 실험에 대한 대표 값으로 나타냈다.
【발명을 실시하기 위한 구체적인 내용】
이하， 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로， 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다. 실시예
실험방법
세포배양
C2C12 마우스 Ow/s musculus) 근아세포 (myoblasts)를 이전에 보고된 방법에 따라 배양하였다 (11). 근관으로 분화하기 위해， 근아세포를 콜라겐- 코팅 조직 배양 플레이트 (시그마, 미국)에서 배양하였다. 컨플루언트 근아세포에 10 일 동안 분화 배지 (5% 호을스 (horse) 혈청， 50 units/mi 페니실린 및 50 g/Άί 스트렙토마이신이 첨가된 DMEM)에서 배양하여 분화 유도하였다. 분화를 높이고 단핵 근아세포를 제거하기 위해, 분화배양배지에 24시간 배양후 50 μΜ AraC3을 72시간 동안 처리한다, 근관의 정제 배양물을 수득하기 위해， 분화된 근관 배양물에 트립신 처리하여 800 rpm으로 10분 동안 원심분리하고, 10 분화배지에 재 -현탁 한 후에 40 urn 메쉬 (BD sciences, 미국)에 2 번 분리하였다. 메쉬를 20 배양배지로 세척하여 근관을 수득하였다. 일반적으로， 하나의 10 cilf 디쉬의 근관을 얻는데, 5 개의 컨플루언트 10 ciif 디쉬의 분화된 C2C12 배양물이 필요하다.
3T3-L1 마우스 GTO/S musculus) 배아 섬유아세포를 배양하여 보고된 방법으로 지방세포로 분화하였다 (11). ATDC5 마우스 (mus musculus)의 골- 연골형성 전구세포 (osteo-chondrogenic precursor eel Is)를 이전 보고된 방법으로 골아세포로 배양 및 분화하였다 (11). 골격근 근관의세포화
C2C12 근관 배양물에 20 μΜ 미오세버린을 48 시간 동안 처리하고 이전 보고된 방법으로 수확하였다 (11). 세포화된 골격근 근관에서의지질형성 유도
세포를 10% FBS, 100 ηΜ 인슬린 , 5 μΜ 덱사메사손 (dexamethasone)， 1 yM 로시글리타존 (rosiglitazone) 및 0.5 mM
IBMX(Isobutylmethylxanthine)가 첨가된 DMEM 로 48 시간 동안 배양하고， 100 nM 인슐린 및 1 μΜ로시글리타존으로 7일 동안추가 배양하였다. 배양 배지를 매 48시간 마다 교환하였다. 세포화된 골격근 근관에서의 골형성 유도
세포화된 골격근 근관에서의 골형성 유도는 이전에 보고된 리버신- 처리 방법으로 실시하였다 (33). 세포화된 골격근 근관에서의신경형성 유도
신경형성을 유도하는 방법은 리버신ᅳ처리 C2C12 근아세포에서 뉴런을 형성한 보고를 기초로 하였다 (28). 세포물을 라미닌 -코팅 배양디쉬에 1.5X106 세포 /9.6 cirf으로 배양하였다. 저분자 처리 후에, 세포를 250 nM 리버신을 48 시간 동안 처리하고, 신경 유도 배지 (N2 가 첨가된 DMEM/F12, invitrogen, 미국) 및 1.5 μΜ 전-트랜스 (aU-trans) 레티노산 (ret inoic acid) 11로 7일 동안 배양하였다. 통계분석
3 번의 독립적인 실험의 평균값으로 맨-휘트니 (Mann-Whitney) U 테스트를 통해 유의값을 결정하였다 (TalkStats software; Jelsoft Enterprises), p 값은 0.05 미만의 유의성을 나타내었다. 모든 오차범위는 중간값의 표준편차값이다. 마이크로어레이 각각의 총 RNA 시료 (200 ng)를 Low Input Quick Amp labeling kit (Agilenttechnologies, CA)를 이용하여 표지하고 증폭시켰다. Cy3-표지 aRNA 는 흔성화 용액 (Agilenttechnologies, CA)50 uL 에 재현탁시켰다. 표지된 aRNA 를 Agilent SurePrint G3 Human GE 8x60K 어레이 (Agilent technologies, CA)상에 위치시키고 Gasket 8- lex 슬라이드 (Agilent technologies, CA)로 덮었다. 상기 슬라이드는 65 °C에서 17 시간 동안 흔성화시켰다. 상기 흔성화된 슬라이드는 상은에서 2 X SSC, 0.1 ¾ SDS로 2 분， 1 X SSC 로 3 분 및 0.2 X SSC 로 2 분 동안 세척하였다. 상기 슬라이드를 3000 rpni에서 20초 동안 원심분리하여 건조시켰다. 마이크로어레이 데이터 분석
관련 소프트웨어가 장착된 Agilent 스캐너를 이용하여 어레이를 분석하였다. Feature Extraction vlO.7.3.1 (Agilent technologies, CA)으로 유전자 발현 수준을 계산하였다. Robust Multi-Array Average algorithm 을 이용하여 각 유전자에 대한 상대적인 시그널 강도를 발생시켰다. GeneSpring GX 11.5.1 (Agilent technologies, CA)을 이용하는 quant ilenormalizat ion 방법을 기반으로 하여 상기 데이터를 처리하였다ᅳ 이러한 노멀라이제이션 방법은 하나의 어레이 세트에서 각각의 어레이에 대한 강도의 분포를 동일하게 하기 위하여 실시된다. 노멀라이제이션 및 로그 변환된 상기 강도 값은 GeneSpringGX 11.5.1 (Agilent technologies, CA)을 이용하여 분석하였다. 배수 변화 필터는， 상향-조절된 유전자들에 대해서는 대조군 대비 최소 200%, 하향-조절된 유전자들에서 대해서는 대조군 대비 50¾ 이하로 존재하는 유전자 요건을 포함한다. 마우스 일차 근아세포 (mouse primary myoblasts) 분리 및 성장
마우스 일차 근아세포는 이전에 공개된 프로토콜을 이용하여 뮤린 (murine) 골격 근육으로부터 정제하였다 (34). 간략하게 설명하자면， BALB/c 마우스를 무병균 入 ^(specific pathogen-free barrier facilities )에서 사육하였다. 본 발명에서 실시한 실험의 모든 프로토콜은 광주과학기술원 동물실험윤리위원회의 허가를 받아 실시하였다. 14 일째 마우스에 C02를 흡입시켜 안락사시키고 입체 해부 현미경 (Carl Zeiss 2000- C)을 이용하여 비장근 (gastrocnemius muscle)을 분리하였다. 근육을 멸균 배양 후드로 옮겨서 층분한 양의 PBS 로 근육이 마르지 않도록 유지하면서 날카로운 칼로 잘게 자른다. 조직 g 당 콜라게나제 /디스파제 / CaCl2용액 2 ml 씩 첨가하고 잠시 동안 추가적으로 잘게 자른다. 잘게 잘라진 조직을 37°C에서 20 분 동안 배양하고， 플라스틱 파이펫으로 뭉쳐진 부분을 부드럽게 분쇄시켰다. 세포를 350 xg 에서 5 분 동안 원심분리하여 F-10- 일차 근아세포 성장 배양액 (F-10 media plus 20% fetal calf serum, 2.5 ng/mL basic fibroblast growth factor 100 U/mL penicillin 및 100 yg/mL streptomycin) 4 ml 로 재현탁시키고, 35 mm콜라겐 코팅 배양접시에 넣는다. 48 시간 후， 접시의 성장 배양액을 흡입하여 제거하고， PBS 로 접시를 세척한다. 이때 PBS를 약간 남긴 후 접시의 옆을 매우 세게 쳐서 세포들이 떨어지도특 한다. 이어, 현탁액에 잔존하는 세포를 새로운 콜라겐 -코딩 접시에 옮기기 전에， 수득된 세포들을 콜라겐 -코딩 접시에서 15 분 동안 프리-플레이팅 하였다. 이러한 과정을 매 48 시간 마다 6 일 동안 반복하여 섬유아세포 (fibroblasts)를 제거하였다. 배양액을 일차 근아세포 성장 배양액 (DMEM 과 F-10 배양액의 비율 1:1， 20% fetal calf serum, 2.5 ng/ml basic fibroblast growth factor 100 U/ml penicillin 및 100 ug/ml streptomycin)으로 바꾸고 적합한 세포 밀도가 되었을 때 근아세포를 실험에 이용하였다. 결과
현재 화학 생물학 연구에 있어 세포를 조작하는 화학적 접근법은 가장 중요한 분야이다. 포유류 근육에서 양서류 사지 재생의 초기 단계를 유도하기위한 저분자의 개발이 시도되었으나 완전한 역분화를 성공하지는 못했다 (15ᅳ 16). 따라서, 화학 생물학 분야에서는 저분자를 이용한 포유류 근육 역분화의 증명에 관심이 많다.
BIO, SB203580, SQ22536 및 LPA 의 DNA 합성 및 세포 주기 재 -진입 (re- entry) 유도 본 발명에 사용한 저분자를 도 1 에 나타내었다. 도 2a 는 근육 세포물의 증식 정도를 보여준다. 본 발명에서 각 저분자의 농도는 이전에 보고된 문헌을 참고하여 활성을 갖는 농도로 실시하였다 (17， 20， 21). 2.5 μΜ BI0(6-bromoindi rubin-3 ' -oxime) , 10 μΜ SB203580(4-[4-(4- f luorophenyl )-2-(4-methy lsul f inylphenyl )-lH-imidazol-5-yl]pyr idine) , 300 μΜ SQ22536 ( 9- (Tet r ahydr o-2- fur any 1 ) -9H-pur i η-6-am i ne ) 또는 30 μΜ LPACLysophosphatidic acid)를 48 시간 동안 처리한 세포물은 세포물 안의 BrdU(5' -브로모 -2' ᅳ데옥시우리딘) 결합 (incorporation)이 증가하여 DNA 합성이 증가한 것을 보여준다 (도 2b) · BrdU 결합은 상대적으로 SQ22536 을 처리한 세포물에서 적게 나타났다. MPcl FlFO 미토콘드리아 ATP 신타아제의 합성 억제제) 9 및 50 μΜ MLB (마그네슘 리토스퍼메이트 (magnesium 1 i thospermate) B, 천연 항산화제) 8 을 음성대조군으로 사용하였다 (22， 23). 50 μΜ MLB 또는 5 μΜ MPcll 을 48 시간 동안 처리한 C2CI2 근육 세포물은 증식이 증가하지 않았으며， 세포독성을 유도하지 않았다 (도 2b 및 도 2c). BI0 에 의한 세포 염색으로 인해, BI0 를 처리한 세포물은 7-MD 염색을 할 수 없다. 따라서， ΜΠ 분석법은 BI0 가 세포독성을 유도하지 않는 것을 보여준다 (도 2d). BI0, SB203580, SQ22536 또는 LPA 처리 시 세포 주기 재-진입하여 G2-M 단계의 세포를 증가시킴을 핵염색을 통해 보여주었다 (도 2e).
BIO, SB203580, SQ22536 는 LPA의 CDKN 발현조절
p21(CIPl/CDKNlA), p27(CDKNlB/KIPl) 및 p57(CDKNlC/KIP2)를 포함하는 수많은 사이클린 -의존 키나제 억제제 (Cyclin-Etependent Kinase Inhibitors, CDKN)는 골격근의 지속적인 분화양상을 보여준다 (18, 24). 근육 세포물에서 BI0 또는 SB203580 의 처리는 p57 발현을 감소시킨다 (도 3a). 그러나， 저분자 처리는 p27 발현에 뚜렷하게 영향을 주지 않는다 (도 3a). 반면， 저분자 처리는 p21 발현을 감소시킨다 (도 3a).
BIO, SB203580, SQ22536 드는 LPA의 역분화 유도
근육 세포물에 BIO, SB203580, SQ22536 또는 LPA 를 처리한 경우， 역분화된 세포물을 가리키는 FITO결합된 α-붕가로톡신 (bungarotoxin) 표지가 감소하였다 (도 3b). 반대로， SQ22536, MLB 또는 MPcll 은 FITC- 결합된 ex-붕가로톡신 표지를 감소시키지 않았다 (도 3b). BIO, SB203580, SQ22536 또는 LPA 이 FITC-결합된 α-붕가로톡신 표지를 감조시킴을 형광 평판 리더 분석법을 통해 확인하였다 (도 3c).
BIO, SB203580, SQ22536또는 LPA의 근전위 (myogenic potential) 영향
근육 세포물의 근육을 형성하는 능력 (근전위， myogenic potential)을 세포융합지수 (fusion index)를 이용하여 분석하였다 (11). 분화 배지에서 5 일 동안 배양 한 후에 BIO, SB203580, SQ22536 또는 LPA 는 융합지수에 영향을 주지 않았다 (도 3d). 대조적으로， 리버신 (reversine)의 처리는 세포융합지수를 감소시켰다.
BIO, SB203580, SQ22536포는 LPA의지방세포화 유도
BIO, SB203580, SQ22536 또는 LPA 를 처리한 C2C12 근육 세포물에 지방세포형성 인자 (adipogenic factors)의 칵테일을 처리하고 배양하여 지질 축적을 유도하였다 (도 4a). C2C12 근육 세포물에 MLB 또는 MPcll 및 지방세포형성 인자를 처리한 경우, 지질 축적을 유도하지 않았다. 발명진의 이전 연구의 p21 녹아웃을 이용한 지방세포형성 전환은 리버신 처리에 의존적이였다 (11). 그러나， C2C12 근육 세포물에 BIO, SB203580, SQ22536 또는 LPA 의 처리 후， 지방세포형성 인자를 처리하니 리버신의 처리 없이도 지질이 축적되는 것을 확인하였다 (도 4Bi ). 더욱이, BIO, SB203580, SQ22536 또는 LPA 의 처리 후, 리버신 및 지방세포형성 인자를 함께 처리한 실험군에서 지질 축적 정도가 증가하였다 (도 4bii).
지방세포의 특징인 인술린-자극에 의한 포도당의 흡수 (uptake)는 형광 포도당 유사체인 2-NBDG(2-[N-(7-nitrobenz-2-oxa-l,3-diaxol-4- yl)amino]-2-deoxygkicose)로 측정하여 알 수 있다 (25). BIO, SB203580, SQ22536 또는 LPA 를 48 시간 동안 처리한 후에 지방세포형성 인자의 칵테일을 처리하여 배양하여 인슬린 -자극 포도당 흡수를 유도하였다 (도 4ci). MLB 또는 MPcll 및 지방세포형성 인자는 인슐린 감수성이 없었다. 또한， 리버신 및 지방세포형성 인자를 48시간 동안 처리하고 BIO, SB203580, SQ22536 또는 LPA 를 처리하니 2-NBDG 흡수량이 증가하였다. 그러나， 인술린 -자극 및 비인슐린 -자극 세포에서 2-NBDG 흡수의 차이는 유사하게 나타났다 (도 4c Π)
BIO, SB203580, SQ22536또는 LPA의 골형성 (osteogenic) 전환
무기질화 (mineralization)의 증가는 골형성 (osteogenesis)의 주요한 특징이다 (26). C2C12 근육 세포물에 BIO, SB203580, SQ22536 또는 LPA 를 처리하고， 무기질화를 유도하는 골형성 인자 칵테일과 함께 배양하였다 (도 5a). MLB 또는 MPcll 및 골형성 인자를 처리한 실험군에서 무기질화가 관찰되지 않았다. BI0또는 SB203580을 처리한 실험군에서는 골형성 인자와 배양한 후에 LPA 또는 SQ22536 을 처리한 실험군과 비교하여 보다 많은 무기질화가 유도되었다 (도 5bii). 또한, BIO, SB203580, SQ22536 또는 LPA와 리버신 및 골형성 인자를 처리하니 실험군 사이의 무기질화에 차이가 감소하였다.
BIO, SB203580, SQ22536 또는 LPA 와 골형성 인자를 처리하여 골형성 전환을 나타내는 알칼린 포스파타제 활성을 유도하였다 (도 5c i ). MLB 또는 MPcll 및 골형성 인자를 처리한 C2C12 근육 세포물에서는 알칼린 포스파타제 활성이 유도되지 않았다. 알칼린 포스파타제 활성의 유도는 LPA 및 SQ22536 을 처리한 군에 비해, BI0 및 SB203580 에서 더 높게 나타났다, 또한， BIO, SB203580, SQ22536 또는 LPA 및 리버신과 골형성 인자를 처리한 실험군에서는 알칼린 포스파타제 활성 정도가 증가하였다 (도 5c ii). 또한, 처리 과정에서 리버신을 추가한 경우 실험군 간의 알칼린 포스파타제 활성의 차이가 감소하였다.
BIO, SB203580 및 SQ22536의 신경형성 (neurogenic) 유도
C2C12 세포물에 저분자를 처리한 후에 신경성 특징이 발생하는지
Hes-6(신경 분화를 촉진하는 전사인자로 신경화된 C2C12 근아세포 (myoblast)에서 상향 조절되는 유전자)의 발현을 RT-PCR 분석법을 통해 측정하였다 (도 6a). LPA, MLB 또는 MPcll 를 처리한 후에 신경 리버신 및 신경형성 인자와 배양하였을 때， Hes-6의 발현이 상향 조절되지 않았다. 상향 조절된 Hes-6 발현은 세포물의 신경이 형성되려는 형태학상 변화를 수반한다 (도 5b, 28). 탈분극 (depolarization)-의존 소낭의 재순환 작용은 신경세포에 특이적인 생리학적 특징이다 (도 6c). 탈분극 -의존 소낭 재순환 작용의 발생을 마이크로플레이트 리더 (microplate reader) 분석법으로 확인하였다 (도 6d). 글루타메이트 -의존 칼슴유입 또한 신경세포 특이적인 생리학적 특징이다 (29). BIO, SB203580또는 SQ22536을 처리하고 리버신 및 신경형성인자와 배양하였을 때, 글루타메이트 -의존 칼슘 유입이 확인되었다 (도 6e). 반면， MLB또는 MPcll 를 처리하고 리버신 및 신경형성 인자와 7 일 동안 배양한 실험군에서는 클루타메이트 -의존 칼슘 유입이 나타나지 않았다. 마이크로어레이 분석에 의한 유전자 발현 변화
마이크로어레이 분석결과는 2.5 μΜ BIO를 48시간 동안 처리한 C2C12 세포물 (증식성， 다분화능 세포) 대 리니지가 예정된 C2C12 근아세포 (lineage restricted C2C12 myoblasts)간의 전체 유전자 발현 변화를 보여준다. 또한 KEGGOCyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)분석에 따른 p53 신호전달에 연관된 유전자들의 발현 변화를 보여준다 (도 8a 및 도 8b). 마우스 일차 근육 세포물에서의 BI0에 의한 다능성 드는 전능성 유도
도 9a 에서 증가된 FITC-BrdU 시그널이 보여주는 바와 같이, 일차 근관 배양으로부터 획득하여 2.5 μΜ BI0 를 48 시간 동안 처리한 세포물의 DNA 합성 유도를 확인하였다. FITC-결합 α-붕가로특신 (bungarotoxin) 표지에 대한 형광 마이크로플레이트 리더 어세이 결과는 감소된 형광 시그널이 보여주는 바와 같이， BI0를 처리한 일차 근육 세포물이 역분화가 강화되었다는 것을 보여준다. 반면， 50 μΜ MLB를 48시간 동안 처리하거나 또는 DMS0를 처리한 경우에는 역분화가 유도되지 않았다 (도 9b).
2.5 μΜ ΒΙ0 를 48 시간 동안 처리한 일차 근육 세포물에 지방세포형성 인자 (adipogenic factors)를 7 일 동안 처리한 경우 지방 축적이 유도되었고， 이는 지방세포형성 전환의 특징이다. 지질은 오일 레드 0(0il Red 0) 염색으로 가시화하였다. 무처리 일차 세포물, 또는 50 μΜ MLB또는 DMS0 를 48 시간 동안 처리한 C2C12 근육 세포물에 지방세포 형성 인자를 처리한 경우 지질 축적이 나타나지 않음을 보여준다 (도 9c). 2.5 μΜ BIO 를 48 시간 동안 처리한 일차 근육 세포물에 지방세포 형성 인자를 처리한 경우 에피네프린 -자극 (지방세포-특이적 기능) 후 인슐린-감수성 유리 지방산의 방출을 확인하였다. 반면, 무처리 C2C12 세포물， 또는 50 μΜ MLB 또는 DMS0 를 48 시간 동안 처리한 C2C12 근육 세포물에 지방세포 형성 인자를 처리한 경우 이러한 지방세포-특이적 기능이 유도되지 않음을 보여준다 (도 9d).
2.5 μΜ BIO 를 48 시간 동안 처리한 일차 근육 세포물에 골형성 인자를 처리한 경우 알리자린 레드 (Alizarin red) 염색이 보여주는 바와 같이 무기질화가 유의하게 증가된 것을 확인하였다. 무처리 일차 세포물， 또는 50 μΜ MLB 또는 DMS0 를 48 시간 동안 처리한 C2C12 근육 세포물에 골형성 인자를 처리한 경우 무기질화가 증가하지 않음을 보여준다 (도 9e).
BIO를 처리한 세포물의 경우 골형성 전환의 또다른 특징인 알칼라인 포스파타제 활성이 증가하였다. 알칼라인 포스파타제 활성은 AttoPhos™ 시약을 처리한 세포 용해물을 10 분 동안 인큐베이션 한 후 측정하였다 (도 9f).
2.5 μΜ ΒΙ0 를 48 시간 동안 처리한 일차 근육 세포물에 250 nM 리버신을 48 시간 처리하고 신경형성 인자를 처리한 경우， 신경—특이적 특징인 탈분극화 -의존 소포 재순환 (depolari zat ion— dependent vesicle recycling)이 가능한 세포가 제조되었다. 신경세포 형태를 보이는 세포들은 FM 1-43 프로브로부터의 나오는 시그널이 증가하였다. 반면, BI0 를 처리하는 대신 50 μΜ MLB 또는 DMS0 를 48 시간 동안 처리한 경우 이러한 효과가 발생하지 않음을 보여준다 (도 9g).
2.5 μΜ ΒΙ0 를 48 시간 동안 처리한 일차 근육 세포물에 250 nM 리버신을 48 시간 처리하고 신경형성 인자를 처리한 경우， 신경-특이적 특징인 글루타메이트 -의존 칼슘 유입 (glutamate-dependent calcium influx)이 가능한 세포가 제조되었다. 신경세포 형태를 보이는 세포들은 Fluo-3프로브로부터의 나오는 시그널이 증가하였다. 반면， BI0를 처리하는 대신 50 μΜ MLB 또는 DMS0 를 48 시간 동안 처리한 경우 이러한 효과가 발생하지 않음을 보여준다 (도 9h). 고찰
동물계에서， 유미목 양서류의 사지 재생은 조직재생의 특별한 예이다 (7). 사지 재생의 초기단계는 근육의 세포화 및 세포 주기 재-집입과 관련이 있다 (4, 6). 최근에， 포유류의 근육에서 유사한 작용을 유도하는 siRNA-기반 접근법이 연구되었다 (11, 12). 그러나， 비-특이적 세포독성 및 빈약한 생물학적 기여의 문제점을 갖고 있으므로， siRNA-기반 접근법에 비해 저분자 -기반 접근법이 더 우수하다.
본 발명의 중점은 '오염시키는 (contaminating)' 미분화된 근아세포를 배제한 근관의 정제 파퓰레이션의 분화이다. 본 발명의 목적을 이루기 위해, 발명진은 이전에 보고된 연속 세포 분리법 (sequential cell seiving)을 이용하였다 (11, 16). 발명진은 이전에 상기 방법이 정제 근관 배양물 (purified myotube cultures)을 수득하는데 알맞은지 확인하였다 (11). 발명진은 상대적으로 낮은 세포독성을 갖는 저분자인 미오세버린을 이용하여 세포화를 유도하였다 (11,15). 저분자인 BI0를 이용하여 글리코겐- 3 키나제의 억제하고 LPA로 G-단백질 -결합 수용기 -매개 신호전달을 활성화， SQ22536 을 이용한 아데니릴 사이클라제 억제 또는 SB203580 을 이용하여 p38 MAP 키나제 경로를 억제하여 근육 세포물의 세포를 세포주기로 재진입 시켰다 (도 2b). 이는 복합적인 생화학적 경로조절를 세포의 증식을 유도하도록 조절할 수 있음을 보여준다.
이전 연구에서， 근관에서의 siRNA-매개 유전자 녹다운 또는 바이러스성 종양형성 유전자의 발현은 증식 및 아픕토시스를 유도하였다 (8, 13, 14). 그러나, BIO, LPA, SB203580 및 SQ22536 은 세포독성을 유도하지 않았다 (도 2c). 또한， 증식하는 세포물의 세포 주기는 증식하는 근육 근아세포 및 정상세포와 유사하였다. (도 2d). 그러므로， 근육 세포물의 저분자, BIO. LPA, SB203580 또는 SQ22536 에 의한 증식 도입은 조직 재생능을 개선하기 위한 치료제를 개발하는데 적합함을 보여준다.
포유류 근육 세포물 증식의 유도는 p21 발현의 녹아웃과 관련이 있다 (11, 18) 저분자인 BIO, LPA, SB203580 또는 SQ22536 의 처리는 근육 세포물의 p21 발현을 감소시켰다 (도 3a). p27 발현은 BIO를 처리한 분화된 심근세포에서 세포주기 철회의 전환과 관련 있다 (21). 그러나， 본 발명진의 결과는 포유류 근육 세포물에 저분자 처리하였을때 p27 의 발현에 극적인 영향을 주지 않음을 보여준다. 이러한 결과는 미요세버린 -유래 세포물 및 분화된 심근세포 간의 생화학적 차이 때문일 것이다. 또한， 심근세포에서의
P21 발현은 측정하지 않았다 (21). 게다가， 본 발명진의 결과는 세포물에서 저분자 BI0 및 SB203580 을 처리하여 p57 의 발현을 감소시킨 결과를 보여준다 (도 3a). p57 은 근육 세포물에서 세포 주기 철회의 중요한 조절자는 아니지만， BI0 및 SB203580 에 의한 하향조절은 저분자가 p57 이 정지 상태 (세포 주기 철회)를 유지하는데 중요한 역할을 하는 다른 조직의 역분화를 유도하는데 적절한 방법임을 말해준다.
아세틸콜린 수용체 발현은 근육 분화의 마커로 여겨진다 (30). 본 발명의 결과는 BI0 를 이용한 글리코겐 신타제—3 키나제의 억제， LPA 를 이용한 G-단백질 -결합 수용체 -매개 신호전달의 활성화 또는 SB203580 을 이용한 p38 MAP 키나제 경로의 억제는 포유류 근육 세포물에서 아세틸콜린 수용체의 발현을 상당히 감소시킴을 보여준다 (도 3b-3c). 본 발명의 결과는 세포물에서 세포 주기 재진입의 도입이 역분화의 주요한 요소임을 나타낸다. SQ22536 을 이용한 아데니릴 사이클라제의 억제는 아세틸콜린 수용체의 발현에 영향을 주지 않고 세포가 비만 형성 세포 및 골형성 세포를 형성하는 다분화능을 갖는다 (도 3b-3c, 도 4 및 도 5). 이러한 결과는 미오세버린—유래 근육 세포물의 특성일 것이다. 이전 연구에서 미오세버린 단독처리 시 세포물은 역분화하지 않았지만， 아세틸콜린 수용체의 발현을 감소시킬 수 있음을 보여주었다 (16， 30). 그러므로, 미오세버린 -유래 근육 세포물은 본래의 근관 배양물과 비교하여 '덜 분화된 (less differentiated)' 상태일 것이다.
유미목 양서류 사지의 역분화된 근육 세포는 새로운 근육 조직을 재형성한다 (4). 본 발명진의 결과는 BIO, LPA, SB203580 또는 SQ22536 이 세포물이 근육 근관으로 역분화하는 것을 억제하지 않음을 보여준다 (도 3d). 또한, 발명진은 지방형성 세포 및 골형성 세포로 분화하는 것을 보여줌으로써， BIO, LPA, SB203580 또는 SQ22536 의 처리에 의한 다분화능 상태를 보여준다 (도 4 및 도 5). 본 발명의 결과는 근아세포 역분화 제제인 리버신과 함께 siRNA-매개 p21 녹다운을 이용하여 세포물의 역분화를 유도하였다 (11). p21 녹다운만 할 경우， 다분화능 세포를 제조하는데 불층분하였다 (11). 본 발명에서는 리버신 처리 없이 BIO, LPA, SB203580 또는 SQ22536 을 처리하여 다분화능 상태를 유도하였다. 이러한 저분자 방법으로 세포물의 역분화를 유도할 수 있는 결과는 복합적인 생화학적 반웅을 조절하는 저분자가 siRNA방법보다 우수함을 보여준다.
전분화능 (pluripotent) 상태는 3 배엽 (내배엽， 중배엽 및 외배엽) 및 그의 파생된 세포로 분화할 수 있는 능력을 갖는 세포군으로 정의된다 (2). 본 발명에서, 발명진은 포유류 근육 세포물에 BIO, SB203580 또는 SQ22536 올 처리하고 리버신을 처리하여 신경세포의 특징을 갖는 세포로 분화함을 보여준다 (도 6). 저분자를 처리한 세포물은 신경세포로의 형태학적 변화를 보여주었다. 사이토칼라신 (cytochalasin) B 또는 DMS0(Dimethyl sulfoxide) 처리와 같은 다른 인자에 의한 세포 스트레스로부터 유도되는 '전형적인' 신경세포와 다른 형태학적인 변화를 유도하기 때문에 이는 근육 세포 내의 신경발생으로 생각된다 (28). 발명진은 신경 세포로의 전환을 확인하는 기능 테스트를 실시하였다 (도 6d- 6e). 이전에, 이러한 테스트는 전사 억제제 및 신경 -제한 억제 인자 (neuron-restrictive silencer factor)에 의해 억제된 신경 유전자를 활성화 시키는 REST— VP16 컨스트럭트를 도입한 근육세포에서 신경세포 전환을 보이기 위해 사용했었다 (29). LPA 처리는 신경 세포 전환능을 나타내지 않았으며, 이는 G-단백질 -결합 수용체의 활성화는 근육 세포물이 전분화능이 아닌 다분화능을 갖는데 요구됨을 가리킨다.
유미목 양서류 사지 재생 과정에 있어， 최근 연구는 역분화된 근관이 계통 제한된 재생 사지에서 새로운 근육 조직을 형성함을 보여준다 (31), 그러므로, 본 발명의 포유류 근육 역분화를 유도하기 위한 저분자 -기반 접근법은 자연에서 관찰되는 부분적 재생보다 더 큰 발생학적 가소성 얻기 위해 성인 포유류 골격근에 허용된다. 본 발명의 저분자 -기반 접근법의 구성도를 도 7 에 나타내었다. 피부의 섬유아세포는 유미목 양서류 사지 재생과정 동안 다분화능군을 구성하는 것으로 생각된다 (4， 31). 그러므로, 본 발명에서 저분자 방법은 양서류 피부 섬유아세포와 유사한 방식으로 작용하여 역분화된 포유류 근육 세포를 유도한다고 설명한다.
본 발명의 역분화 근육을 유도하기 위한 저분자 -기반 방법은 추가 연구에 대한 수많은 가능성을 제공한다. 예를 들면， 인간 근육 조직검사는 환자 -특이 다분화능 세포를 생산하는데 활용될 수 있다. 또한 이러한 방법은 상처 치유의 포유류 모델에 적용할 수 있다. 본 발명에 사용된 저분자 (BIO, LPA, SB203580 및 SQ22536)는 p21 발현을 하향 조절한다. 머피 로지스 라지 (Murphy Roths Large) 마우스는 감소된 p21 발현과 관련된 개선된 상처 치유 능력을 보여준다 (32). 그러므로， 이러한 저분자는 상처 치유를 개선하고 흉터를 감소시켜 국부의 의학적 적용의 기반을 형성할 수 있다. 본 발명의 결과는 표유류의 사지 재생을 유도하는 방법의 개발에 제공하며， 완전히 분화된 포유류 조직의 전분화능 줄기세포에 대한 새로운 접근법을 제시한다. 이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다. 관련 정부과제 표기
1. 당뇨병 치료제 개발을 위한 인슐린양 (樣) 작용 저분자 화합물의 탐색과 특성 규명
(1) 과제고유번호: NRF-2012-003460
(2) 부처명: 교육과학기술부
(3) 연구관리 전문 기관: 한국연구재단
(4) 연구사업명: 일반연구자 지원사업 /신진연구자지원사업
(5) 연구과제명: 당뇨병 치료제 개발을 위한 인슐린양 (樣) 작용 저분자 화합물의 탐색과 특성 규명
(6) 기여율: 1/2
(7) 주관기관: 광주과학기술원
(8) 연구기간: 2012.05.01-2015.04.30
2. 암 미세환경 제어에 의한 새로운 항암 기전 및 항암 표적 발굴
(1) 과제고유번호: NRF-2012-000462
(2) 부처명: 교육과학기술부 (3) 연구관리 전문 기관: 한국연구재단
(4) 연구사업명: 일반연구자 지원사업 /여성과학자지원사업
(5) 연구과제명: 암 미세환경 제어에 의한 새로운 항암 기전 및 항암 표적 발굴
(6) 기여율 : 1/2
(7) 주관기관: 광주과학기술원
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Claims

【특허청구범위】
【청구항 1】
다음의 단계를 포함하는 포유동물 분화세포로부터 다능성 세포 (mult i potent or pluripotent eel Is)의 화학적 제조방법 :
(a) 포유동물부터 분화세포를 수득하는 단계; 및
(b) 상기 분화세포에 p21 하향 -조절 유도 화합물을 처리하여 다능성 세포를 수득하는 단계 .
【청구항 2】
제 1 항에 있어서， 상기 분화세포는 말기 분화세포 (terminally differentiated cell)인 것을 특징으로 하는 방법.
【청구항 3】
제 1 항에 있어서， 상기 분화세포는 골격근 세포, 심근 세포， 평활근 세포， 피부 세포， 연골 세포， 지방 세포 및 골세포로 구성된 군으로부터 선택되는 하나의 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
【청구항 4]
제 1 항에 있어서， 상기 분화세포는 결합 조직, 신경 세포, 림프 세포， 맥관 세포， 신장 세포， 췌장 세포, 폐 세포, 요도 세포， 방광 세포， 위 세포, 간 세포， 소장 세포, 대장 세포 및 식도 세포로 구성된 군으로부터 선택되는 하나의 세포인 것을 특징으로 하는 방법 .
【청구항 5】
제 1 항에 있어서， 상기 p21 하향 -조절 유도 화합물은 BI0(6- bromoindirubi n-3 '-oxime), SB203580 (4-[4-(4-f luor opheny l)-2-(4- methylsulf inyl pheny 1 )一 1H_ imidazol一 5— y 1 ] yr idine) , SQ22536 ( 9-
(Te t r ahydr 0-2- fur any 1 ) -9H-pur i η-6-am i ne ) 또는 LPA(Lysophosphat i di c acid)으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나의 화합물인 것을 특징으로 하는 방법 .
【청구항 6】
제 1 항에 있어서, 상기 방법은 단계 (b)의 p21 하향 -조절 유도 화합물 처리이후 역분화제를 단계 (b)에서 얻은 세포에 처리하여 전능성 세포 (pluripotent cell)를 수득하는 단계를 추가적으로 포함하며, 상기 전능성 세포는 단계 (a)의 분화세포와 다른 3배엽 계통의 세포로 분화되는 능력을 가지는 것을 특징으로 하는 방법.
【청구항 7]
제 6 항에 있어서, 상기 역분화제는 리버신 (N6-사이클로핵실 N2— (4- 모폴린 -4-일-페닐) -9H-퓨린 -2,6-다이아민)， 트리코스타틴 A(trichostatin A), 발프론산 (valproic acid), 부페닐 (buphenyl) 및 5-아자시티딘 (5- azacytidine)으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나의 화합물인 것을 특징으로 하는 방법 .
【청구항 8】
제 1 항에 있어서， 상기 방법은 단계 (b)의 p21 하향 -조절 유도 화합물 처리이후 분화 유도제를 단계 (b)에서 얻은 세포에 처리하여 단계 (b)의 분화세포와 동일 3배엽 계통의 다른 세포 리니지 (cell lineage)로 분화시키는 단계를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법 .
【청구항 9]
제 3 항에 있어서， 상기 분화세포는 골격근 세포인 것을 특징으로 하는 방법 . 【청구항 10】
상기 제 1 항의 방법에 따라 제조된 다능성 세포.
【청구항 111
상기 제 6항의 방법에 따라 제조된 전능성 세포. 【청구항 12】
다음의 단계를 포함하는 포유동물 조직 또는 기관의 재생 (regenerat i on)방법:
(a) 포유동물부터 분화세포를 수득하는 단계;
(b) 상기 분화세포에 p21 하향 -조절 유도 화합물을 처리하여 다능성 세포를 수득하는 단계; 및
(c) 상기 다능성 세포를 원하는 조직 또는 기관으로 분화시키는 단계.
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