WO2013060989A1 - Puce microstructurée comprenant des surfaces convexes pour analyse par résonance des plasmons de surface, dispositif d'analyse contenant ladite puce microstructurée et utilisation dudit dispositif - Google Patents

Puce microstructurée comprenant des surfaces convexes pour analyse par résonance des plasmons de surface, dispositif d'analyse contenant ladite puce microstructurée et utilisation dudit dispositif Download PDF

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WO2013060989A1
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cavities
chip
face
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Thibaut Mercey
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Thibaut Mercey
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    • G01N21/251—Colorimeters; Construction thereof
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Definitions

  • Microstructured chip comprising convex surfaces for Surface Plasmon Resonance analysis, analysis device containing said microstructured chip and use of said device
  • the present invention relates to a microstructured chip comprising convex surfaces for Surface Plasmon Resonance analysis, an analysis device comprising said microstructured chip, a method of analysis and the uses of said device.
  • SPR Surface Plasmon Resonance
  • SPR is a physical phenomenon of collective electron excitation of a metal on a metal-dielectric medium interface (said dielectric medium typically being a liquid medium or a gas).
  • dielectric medium typically being a liquid medium or a gas.
  • TM Magnetic Transverse Polarization
  • plasmon resonance angle For a particular polarization of light (Magnetic Transverse Polarization, or "TM") incident on this interface (also referred to as “surface” in the rest of the text) and for an angle called “plasmon resonance angle", a phenomenon occurs. of resonance resulting in the coupling of the incident light energy to a surface wave (called “surface plasmon”) propagating parallel to the interface. This phenomenon physical is reflected by a drop in the intensity of light reflected from the surface.
  • incident radiation arrives at a given angle of incidence on one of the side faces of a chip (generally a prism in the state of the art, because it is the method of coupling light onto the most sensitive surface to be used), one of the faces of which is covered with a metal layer, said incident radiation is refracted when it enters the prism (because of the difference in optical index between the medium constituting the prism and the previous optical medium, usually air) and is reflected on said metal surface.
  • This configuration is well known to those skilled in the art as the Kretschmann configuration (E. Kretschmann, The Determination of the Optical Constants of Metals by Excitation of Surface Plasmons, Z Physik 241: 313-324 (1971)) .
  • the phenomenon of SPR can also make it possible to study biomolecular interactions.
  • ligands are previously immobilized on the metal surface of the prism in defined areas.
  • any subsequent attachment of other molecules with these ligands will locally modify the optical thickness at said defined areas, and will therefore cause variations in the resonance conditions and therefore a displacement of the resonance angle.
  • This displacement is, as a first approximation, proportional to the quantity of biological material that has come to interact with the ligands.
  • small molecules will cause a small displacement of the angle of incidence while larger molecules will induce a much larger angular shift.
  • It is the study of the optical reflectivity variations related to the resonance phenomenon which will make it possible to detect and measure biomolecular interactions and their temporal evolution at the defined zones.
  • SPR devices for performing imaging and monitoring fixed angle of incidence and wavelength, the evolution of biomolecular interactions in defined areas on a chip.
  • US 7678584 (Guédon et al.), US 7576863 (Weibel and al), US 7551286 (Tani et al) have such SPR devices. Although these devices allow analysis of several interactions in parallel, they exhibit moving parts or do not allow a fine analysis of the interaction when no part moves.
  • the detection surface area is a metallized flat surface, and allows only to perform an analysis at a precise angle ⁇ .
  • LSPR localized surface plasmon physics
  • an SPR analysis device comprising a microstructured chip having a particular architecture makes it possible to meet these requirements.
  • chips or “microstructured chip” in the rest of the text.
  • Figure 1 shows in section protuberances according to various embodiments of the invention.
  • Figure 2 shows in section cavities according to different embodiments of the invention.
  • FIG. 3 represents a microstructured chip according to the invention provided with protuberances arranged in the form of a matrix.
  • FIG. 4 represents the upper face of a microstructured chip according to the invention provided with protuberances arranged in the form of chutes along the X axis.
  • Figure 5 shows in section a tilt-free protuberance irradiated by collimated and polarized monochromatic incident radiation.
  • FIG. 6 is a sectional view of a protuberance having a tilt with a ⁇ angle, irradiated by collimated and polarized monochromatic incident radiation.
  • Figure 7 shows a chip according to one embodiment of the invention which has distances between the planar surfaces separating the different protuberances and the base.
  • FIG. 8 represents a device comprising a microstructured chip having distances between the plane surfaces separating the identical protuberances and the base.
  • FIG. 9 represents a device comprising a microstructured chip having distances between the plane surfaces separating the different protuberances and the base.
  • Figure 10 shows a representative plasmon curve of different angular ranges studied (without tilt).
  • Figure 11 shows a representative plasmon curve of different angular ranges studied (with tilt).
  • FIG. 12 represents an exemplary image on a camera of 3 protuberances of a microstructured chip according to the invention.
  • FIG. 13 represents a chip according to the invention comprising 16 protuberances of which at least one is different from the others.
  • Figure 14 shows the percentage of reflectivity as a function of the angle of incidence ⁇ .
  • FIG. 15 represents the plasmon curves before and after attachment of the bacterium Escherichia coli on the protuberances functionalized with specific ligands of the bacterium.
  • FIG. 16 represents the plasmon curves before and after attachment of the shigatoxins on the protuberances functionalized with ligands specific for shigatoxins.
  • a first object of the invention is a microstructured chip for resonance analysis of surface plasmons (SPR) in the form of a solid consisting of a base, an upper face of which at least a portion is covered with a metal layer, and at least one side face, characterized in that said upper face is provided with micrometer-sized areas for receiving species to be analyzed selected from n protuberances and m cavities; and in that when n + m> 2, said areas are separated from each other by planar surfaces, with n ranging from 1 to j and m from 0 to i, j and i being integers.
  • SPR surface plasmons
  • the upper face of the chip has size zones micrometric intended to receive species to be analyzed chosen only from at least one protuberance.
  • m is different from 0 (m> 0).
  • the upper face of the chip is provided with zones of micrometric size intended to receive species to be analyzed selected from at least one protuberance and at least one cavity.
  • microstructured chip is meant a chip having areas of micrometric size for receiving species to be analyzed.
  • the chip is not necessarily of micrometric size but includes areas that are micron sized.
  • micrometric size zones zones which have at least two of three dimensions of micron size, said micrometric dimensions ranging from lym to 1000m, and preferably from 10m to 500m.
  • the third dimension of the zone is therefore not necessarily micrometric and may have distances of between 1 mm and 20 mm, preferably between 1 mm and 10 mm.
  • the zones according to the invention have particular geometries in the form of protuberances and possibly cavities which will be described later. It is at the level of these areas covered with a metal layer that the plasmon effect will be observed.
  • At least a portion of the upper face is coated with the metal layer. It represents the useful detection surface (also called sensitive surface thereafter).
  • at least a zone of micrometric size chosen from n protuberances and m cavities is coated with the metal layer.
  • the upper face is completely covered by the metal layer.
  • not only the zones but also the plane surfaces separating said zones are intended to receive species to be analyzed.
  • the direct orthonormal reference (XYZ) is used in which the planar surfaces separating the zones are parallel to the plane (XY) and in which the Z axis is oriented downwards.
  • Fiber surfaces means flat or substantially flat surfaces may have some defects.
  • inter ⁇ area zones The plane surface separating two zones for receiving species to be analyzed is called inter ⁇ area zones.
  • inter ⁇ area zones The plane surface separating two zones for receiving species to be analyzed.
  • the following terms will be used indifferently: flat surfaces or inter-zone surfaces or even inter-zone flat surfaces. More specificly :
  • an inter-cavity-protuberance surface when the flat surface separates an area which is a cavity and another area which is a protuberance, it is referred to as an inter-cavity-protuberance surface.
  • the zones are arranged in the form of a matrix on the upper face of the chip.
  • the planar surfaces separate the areas both along the X axis and the Y axis.
  • the zones are arranged in the form of continuous chutes along the upper face of the chip.
  • the plane surfaces separate the zones along the X axis or along the Y axis.
  • the zones are separated by a distance D along the Y axis and a distance D 'along the X axis by the flat surfaces (or inter-zone surfaces); D and D'being between Oym (in the case of a continuous chute according to one of the X or Y axes) and 5 mm, preferably between 50 mm and 5 mm, preferably between 200 and 1000 ⁇ m and particularly preferably between 300 and 700ym.
  • the zones are separated by a center-to-center distance CTC of between 10 ⁇ m and 25,000 ⁇ m, preferably between 50 ⁇ m and 5000 ⁇ m, and more preferably between 100 ⁇ m and 1000 ⁇ m.
  • the plane surfaces belong to planes parallel to the plane (XY); the upper face is then in the form of steps.
  • the plane surfaces belong to the same plane (XY) (ie Z is constant).
  • protuberance is meant an outgrowth on the upper face of the chip, said protuberance being between two flat surfaces (also called inter-zone surface).
  • the protuberance can be defined either in 3 dimensions (XYZ mark) or in 2 dimensions (section in a plane).
  • a protuberance is a volume whose coordinates are located above a fictitious plane connecting the two inter-zone flat surfaces adjacent to said protuberance. Subsequently, the protrusion will be described in the plane (YZ).
  • a protuberance according to the invention is defined by at least one curve of average radius of curvature R and / or at least one straight line.
  • the curve is necessarily convex (that is, radius of curvature along the + Z axis).
  • the curve may be either concave (i.e., radius of curvature along the Z axis) or convex.
  • the protuberance is defined by two straight lines separated by a curve.
  • the two lines are parallel.
  • the two lines have different dimensions.
  • cavity means a hollow in the upper face of the chip, said hollow being between two flat surfaces (also called inter-zone surface).
  • the cavity can be defined either in 3 dimensions (XYZ mark) or in 2 dimensions (section in a plane).
  • a cavity is called a volume, all of whose coordinates lie beneath a fictitious plane connecting the two inter-zone flat surfaces adjacent to said cavity.
  • a cavity according to the invention is described in the plane (YZ) and is defined by at least one curve of radius of curvature R and / or at least one straight line.
  • the curve is necessarily concave (that is, radius of curvature along the -Z axis).
  • the curve may be either concave or convex (i.e., radius of curvature along the + Z axis).
  • the cavity is defined by two straight lines separated by a curve.
  • the two lines are parallel.
  • the two lines have different dimensions.
  • the areas of the chip are defined only by a curve of average radius of curvature R (concave for a cavity and convex for a protuberance); the radius of curvature R being between 0.1 mm and 600 mm, preferably between 0.3 mm and 300 mm.
  • the n protuberances and cavities have a semi-cylindrical shape in the reference (XYZ).
  • the radius of curvature of the zones is perpendicular to the plane (XY), that is to say along the Z axis.
  • the radius of curvature of the zones is not perpendicular to the plane (XY) (That is, the n protuberances and the cavities have a tilting or tilt).
  • the zones intended to receive species to be analyzed have a radius of curvature R identical.
  • the base of the chip may be a flat or curved surface, or an edge, or a point.
  • the base of the chip is a flat surface which, preferably, is parallel to the flat surfaces (also called inter-zone surfaces).
  • the planar surfaces belong to the same plane (XY).
  • XY the distances between the flat surfaces and the base of the chip are identical.
  • the upper face is parallel to the base.
  • the plane surfaces belong to multiple planes parallel to the (XY) plane.
  • the distances between the flat surfaces and the base of the chip are different (upper face in the form of step).
  • Distance between flat surfaces (or inter-zone surfaces) and the base refers to the heights of the chip, that is, the length of the perpendicular connecting the surfaces and the base, or extension of the base.
  • the (or) side face (s) of the chip may (may) be flat (s) (perpendicular (s) or not to the base and / or to the upper face of the chip ) or curve (s).
  • the (or) side face (s) of the chip is (are) flat (s).
  • At least one lateral face of the chip is perpendicular to the base and / or to the upper face.
  • the upper face is parallel to the base of the chip.
  • the chip is contiguous to a prism well known in the state of the art.
  • the chip is in the form of a parallelepiped (that is to say a chip having planar surfaces belonging to the same plane (XY) and a base parallel to said flat surfaces ).
  • the heights of the lateral surfaces are of small dimensions of the order of 0.1mm to 20mm, preferably 1mm to 10mm).
  • species to be analyzed for example means materials, gases or biological species such as single or double-stranded DNA, proteins, bacteria, toxins, viruses, mycoplasmas, chemical agents or any another biological or chemical species that may interact with other biological or chemical species.
  • the species to be analyzed are biological species, such as pathogenic bacteria such as Salmonella spp. , Listeria monocytogenes, Clostridium difficile, or
  • the present inventor has demonstrated that it is possible by using the chip according to the invention to advantageously study strains of Escherichia coli producing shigatoxins (STEC), because it allows the analysis. simultaneous large molecules (bacteria themselves), but also small toxins they produce.
  • the n protuberances and cavities will be functionalized with different monoclonal antibodies specific for biomarkers.
  • Figure 1 shows a section along the plane (ZY) of a protuberance according to different embodiments.
  • the protuberance is represented by a surface in the plane (XY) (or by a volume in the XYZ coordinate system) of which all the points are located above (negative Z) of a fictitious line represented in dotted line (or fictitious plane in the reference XYZ for a volume) connecting the two plane surfaces adjacent to the protuberance:
  • the protuberance is defined only by a convex shape curve of radius of curvature R (that is to say having a radius of curvature along the + Z axis);
  • the protuberance is defined by two parallel straight lines separated by a curve of radius of curvature R of convex shape;
  • the protuberance is defined by two parallel straight lines separated by a curve of curvature radius R of concave shape (that is to say having a radius of curvature along the -Z axis).
  • Figure 2 shows a section along the (ZY) plane of a cavity according to different embodiments.
  • the cavity is represented by a surface in the plane (XY) (or by a volume in the XYZ coordinate system) of which all the points are below (positive Z) of a fictitious line represented in dashed line (or fictitious plane in the reference XYZ for a volume) connecting the two plane surfaces adjacent to the cavity in case a): the cavity is defined only by a concave shape curve of radius of curvature R; (i.e. having a radius of curvature along the -Z axis);
  • the cavity is defined by two parallel straight lines separated by a curve of concave shape of radius of curvature R;
  • the cavity is defined by two parallel straight lines a curvature radius curve R of convex shape (that is to say having a radius of curvature along the + Z axis).
  • FIG. 3 represents a microstructured chip 3 in which the upper face 4 comprising plane inter-protuberance surfaces is parallel to the base 5 of the chip 3.
  • the upper face 4 is covered with a metal layer 2 and is provided with protuberances 1 sensitive to the plasmon effect, intended to receive species to be analyzed.
  • the protuberances 1 are separated from one another by a distance D along the Y axis and by a distance D 'along the X axis by plane surfaces (also called inter-protuberance surfaces).
  • the microstructured chip 3 may be made of any type of material allowing the propagation of light.
  • material allowing the propagation of light.
  • glass, a crystal or plastics may be mentioned.
  • the chip 3 is made of plastic material (s) such as for example PMMA (polymethyl methacrylate), PC (polycarbonate), PS (polystyrene), SU-8 (negative photosensitive resin based on epoxy) or PDMS (Polydimethylsiloxane).
  • plastic material such as for example PMMA (polymethyl methacrylate), PC (polycarbonate), PS (polystyrene), SU-8 (negative photosensitive resin based on epoxy) or PDMS (Polydimethylsiloxane).
  • PMMA polymethyl methacrylate
  • PC polycarbonate
  • PS polystyrene
  • SU-8 negative photosensitive resin based on epoxy
  • PDMS Polydimethylsiloxane
  • the metal layer 2 which covers the upper layer 4 of the chip 3 (and in particular the protuberances 1) can be made with various metals such as gold, silver, platinum or aluminum.
  • the metal layer 2 is gold.
  • the thickness of the metal layer 2 is between 10 nm and 200 nm, preferably between 30 nm and 100 nm and more preferably between 40 nm and 50 nm.
  • a thin layer of chromium is used as a pre-cling layer of gold on the upper face 4 of the chip 3.
  • FIG. 4 represents the upper face of a microstructured chip according to the invention entirely covered with a metal layer 2, said microstructured chip is provided with protuberances which are arranged in the form of chutes along the X axis thus forming 4 columns C1-C4.
  • d represents the diameter of the chute and CTC represents the center-to-center distance between two successive chutes.
  • the chip according to the invention makes it possible to adapt the sensitivity of each zone (that is to say n protuberances and m cavities) in order to study very different biological species.
  • At least one of the n protuberances and cavities has a radius of curvature different from the others.
  • FIG. 5 represents a sectional enlargement of FIG. 3 of the convex curved surface protuberance 1 chip 3 (covered with the metal layer 2) which is irradiated by a monochromatic collimated beam of incidence angle ⁇ and linearly polarized according to the TM polarization.
  • the protuberance of semicylindrical shape (in the XYZ coordinate system), having a surface defined by a single curve (in the ZY plane) in FIGS. 3 and 5, is characterized by its radius of curvature R and by the two halves. angles a (thus defining a total angle of 2a).
  • the radius of curvature R and the half-angle a will thus define the length of the cord d, or the diameter of said cavity.
  • the choice of the radius of curvature R of the n protuberances and cavities of the chip according to the invention is very important because it will determine, as a function of the essential physical parameters (optical index of the chip n P , index optics of the external dielectric medium n e , average angle of incidence of the collimated beam ⁇ and the size of the biological species that one wishes to analyze), the sensitivity and the angular dynamics of the measurement, for each of the n protuberances and m cavities.
  • angular momentum of the measurement is meant the angular range that can be visualized during the analyzes.
  • sensitivity is meant the smallest variation in optical thickness that can be measured on the sensitive surface.
  • At least one of the n protuberances and cavities has a tilt (or tilt) of an angle ⁇ .
  • the radius of curvature R is deviated with respect to the Z axis.
  • FIG. 6 represents a sectional enlargement of a convex curved surface protrusion 41 of a chip 43 (whose upper face is covered with a metal layer 42) which has a tilt of angle ⁇ and which is irradiated by a monochromatic beam collimated with a mean angle of incidence ⁇ and polarized linearly in the transverse magnetic direction TM.
  • the angle ⁇ is defined as follows: 0 ° ⁇ ⁇ 80 °, preferably 15 ° ⁇ ⁇ 45 °.
  • At least one of the zones (that is to say at least one of the n protuberances and cavities) has both a different radius of curvature and a different orientation with respect to the other zones. the chip.
  • At least one distance between the base and the flat surfaces (also called inter ⁇ surface zone) is different.
  • FIG. 7 represents a chip 33 whose upper face 44 which is covered with a metal layer 22 is provided with curved protuberances 11.
  • the lateral faces (55, 66) of the chip 33 are perpendicular to the base 77 and to the flat surfaces.
  • the distances separating the planar surfaces between the protuberances 11 (or inter-protuberance surfaces) and the base 77 are all different from each other with d4 ⁇ d3 ⁇ d2 ⁇ dl.
  • the inter-zone surfaces belong to multiple planes parallel to the (XY) plane (5 planes shown).
  • the chip according to the invention can be made by different methods which necessarily include a step of manufacturing the chip followed by a step of depositing at least one thin metal layer.
  • Methods of manufacture include high pressure injection, direct mechanical machining, hot stamping, plasma etching, photolithography or laser ablation.
  • the chip is manufactured by high pressure injection.
  • the embodiment of the chip according to the invention requires the use of a mold of concave shape to achieve a protrusion of convex shape which allows to reduce its cost of production.
  • a mold of concave shape to achieve a protrusion of convex shape which allows to reduce its cost of production.
  • the most expensive step in the development of a production of components by the high pressure injection process is the realization of the mold (or "master"). Having a final surface of the part to be made with convex protuberances will make it possible to produce a mold with concave shapes, which amounts to removing material in the "master", which is very easy to achieve with classical mechanical machining methods.
  • Metallic deposition methods include sputtering, vacuum evaporation techniques, or cold deposition techniques.
  • Cold deposition techniques are particularly useful in the case of a plastic support because the plastic does not support high temperature rises.
  • FIGS 8 and 9 show different embodiments of measuring devices comprising the microstructured chip described above.
  • Another object of the present invention is an SPR analysis device comprising:
  • a light source 7 for generating an incident beam possibly an optical system of collimation
  • microstructured chip (3; 33; 43; 53; 63) as previously described disposed in the optical path of said incident beam;
  • an imaging optical system (9;
  • the coupling between the energy of the incident beam and the surface wave of the metal surface of the chip is carried out by the chip itself.
  • the coupling means is a prism, a waveguide or a diffraction grating.
  • the chip according to the invention when the coupling is made by a prism, is contiguous to said prism so that the base of the chip is brought into contact with the upper face of the prism not presenting metal surface using a coupling coupling oil which is a method well known to those skilled in the art.
  • the chip is contiguous to a waveguide.
  • the chip is contiguous to a diffraction grating.
  • the source 7 may for example be a mercury vapor lamp, an incandescent lamp, a laser diode, a laser, a light emitting diode (LED) or an organic light-emitting diode (OLED).
  • a mercury vapor lamp an incandescent lamp
  • a laser diode a laser
  • a light emitting diode LED
  • OLED organic light-emitting diode
  • the source 7 is a monochromatic LED.
  • monochromatic we mean a LED whose spectral width at mid-height does not exceed 40nm.
  • IR visible or near infrared
  • a wavelength of between 790 and 825 nm is used.
  • the beam can be collimated.
  • various techniques well known to those skilled in the art may be used.
  • a collimating optical system 8 a first convergent lens which makes it possible to focus the light emitted by the source 7 onto a hole of diameter ⁇ , said hole being in the focal plane of a converging lens. which makes it possible to generate the collimated beam.
  • the optical collimation system 8 is integrated in the source 7.
  • the polarizing system 6 makes it possible to work in transverse magnetic mode (or TM, or polarization-p).
  • linear polarizer or a polarizing splitter cube.
  • the polarizing system 6 makes it possible to switch easily from a TM bias to a TE polarization (Transverse
  • the detector (10; 70) can be for example a CCD, CMOS camera or be a matrix of photodetectors. According to a preferred embodiment, the cameras operate on 8, 10, 12 or 16 bits and preferably on 10 or 12 bits.
  • the device further comprises an imaging optical system (9; 69) for imaging the microstructured chip (3; 33; 43; 53; 63) on the detector (10; 70).
  • an imaging optical system (9; 69) for imaging the microstructured chip (3; 33; 43; 53; 63) on the detector (10; 70).
  • the imaging optical system (9; 69) must be sufficiently open to accept all the radiation from the microstructured chip.
  • the convex geometry of the n protuberances with which the chip according to the invention is made makes it possible, in particular, to make the beams converge after reflection of the incident radiation on the latter, thus making the imaging optical system (9; 69) much simpler to produce.
  • the imaging optical system (9; 69) is selected so that the image of 2 protuberances or 1 protuberance and 1 cavity of the microstructured chip correspond to 2 different positions on the detector (10; 70).
  • the optical system has a magnification that maximizes the number of useful pixels on the detector (10; 70).
  • optical imaging system (9; 69)
  • plano-convex lenses mounted in afocal.
  • the entrance face is the face through which incident radiation enters the chip and exit face the face through which the radiation reflected by the sensitive surface.
  • the source 7 emits incident radiation, which is collimated by means of the collimation system 8 and polarized with the aid of the polarizer 6 before reaching the input face 54 of the chip 53 (FIG. covered a metal layer 52) under a given incidence.
  • the radiation is deflected at its entry into the chip 53 and is reflected on the protuberances 51.
  • the imaging system 9 located after the exit face 57 of said chip 53, makes it possible to collect the intensity of the reflected radiation and to image the irradiated protuberances 51 on the detector 10.
  • the device shown in Figure 9 comprises a chip 61 (covered with a metal layer 62) whose side faces are perpendicular to the base and whose distances between the surfaces between the protuberances 61 of the base are different from each other.
  • FIG. 9 represents an embodiment in which the incident radiation emitted by the source (not shown in FIG. 9) that arrives perpendicularly on the input face 64 (corresponding to the lateral face), is not deflected when it passes through the chip 63, and irradiates all the different protuberances 61.
  • the imaging system 69 and the detector 70 are located after the exit face 67, which in this embodiment corresponds to the base of said chip 63, thus making it possible to collect the intensity of the reflected radiation and to produce the image protuberances 61.
  • the imaging optical system (9; 69) can be integrated directly into the output face (57; 67) of the chip (53; 63) in the form of a microlens array.
  • the collimation system 8 and possibly the polarizer 6 are made integral with the input face (54; 64) and / or the imaging optical system (9; 69) and the detector (10; 70) are made integral with the exit face (57; 67). Measuring process
  • Another object of the invention relates to a measurement method by SPR which comprises the following steps:
  • Another object of the invention relates to a measurement method by SPR which comprises the following steps:
  • the immobilization of the ligands on the upper surface can be carried out with various techniques well known to those skilled in the art, such as immobilization by covalent chemical bonding or electro-copolymerization of pyrrole on the surface. metallic.
  • fluid is meant a gas or a liquid.
  • the fluid comprises at least one biological species.
  • These measurement methods are suitable for measuring, in a non-limiting manner, conformational variations of molecules immobilized on a surface, biomolecular interactions, optical indices of fluids (gases or liquids), the quality of a surface (parallelism, roughness microscopic, quality of a deposit of thin layers) or still the presence of metal nanobeads near the surface.
  • the incident beam enters perpendicularly through the input face 64 of the chip 63.
  • each of the zones is defined by the vertex angle 2a and the radius of curvature R of each of the protuberances or protuberances and cavities.
  • the choice of angle ⁇ is therefore essential to observe at best all areas of interest. It is thus possible, as a function of the radius of curvature of the zone studied, to explore an angular range of the greater or smaller plasmon curve. In the case where the zones do not have a tilt ⁇ (this is the case for FIG. 10) this angular range will always be centered on the same value ⁇ .
  • the measurement method further comprises a step in which an image of the n protuberances and cavities of the chip is produced.
  • This choice can be made for each of the n protuberances and cavities, which makes it possible to adapt to several types of species immobilized on the same chip.
  • the choice can be made according to the type of species that will interact with the species previously immobilized on the chip: it is thus possible to "adapt" each of the protuberances or protuberances and cavities to the desired species.
  • Another subject of the invention relates to the use of the device according to the invention for the measurement of biomolecular interactions.
  • Example 1 Protein chip - monitoring and correction of the external environment index in real time in kinetics of interactions
  • a microstructured chip made of polycarbonate (PC) comprising 16 protuberances is shown in FIG. 13.
  • a layer of gold with a thickness of 48 nm was deposited by sputtering on the upper face of said chip in order to obtain a plasmon effect.
  • BSA bovine serum albumin
  • the chip is irradiated with polarized, collimated and monochromatic incident radiation and the intensity of the radiation reflected by the protuberances is detected by a CMOS type detector.
  • the radius of curvature of the semi-cylindrical surfaces of the protuberances of the columns C 1, C 2 and C 3 is 9.5 mm (equivalent to a study angular zone A 9 a on the plasmon curve of about 3 °) and the protuberances of the column C4 have a radius of curvature of 1.9 mm (equivalent to one angular study area AQ b of about 15 °).
  • the angular ranges A9 a and AQ b respectively correspond to the angular ranges ⁇ and ⁇ 3 in FIG.
  • a liquid of unknown optical index containing hCG proteins is brought into contact with the chip in the protuberances.
  • a characteristic variation of the signal is observed as a function of time on the protuberances of the L 2 line but not on the others because a specific interaction takes place on the anti-hCG monoclonal antibodies and not on the other immobilized proteins.
  • the protuberance located in (L 2 , C 4 ) has a radius of curvature such that the entire plasmon curve can be visualized on the detector, the angular value of the limit refraction angle can be easily determined and it is thus possible to deduce the index of the unknown liquid medium.
  • bacteria of this category are strains 0157: H7, 026: H11 or even O103: H2.
  • the bacteria of this type and the shigatoxins that they produce cause severe intestinal disorders, for which the vital prognosis can be engaged.
  • the size and molecular weight of these shigatoxins (a few nanometers in diameter and a molecular weight of about 68kDa) is very different from that of an Escherichia coli bacterium (about 10 million times heavier). Therefore, the plasmon signals for the hooking of these two types of families are very different.
  • conventional SPR devices it is therefore not possible to study both these bacteria and these toxins during the same experiment and in real time. Indeed, in the case of hooking bacteria, the curve will shift angularly close to 0.1 ° while it will move only less than 0.01 ° in the case of toxins (which does not). is not easily detectable by conventional SPR methods).
  • a chip made of polycarbonate comprising two semi-cylindrical protuberances of diameter 600 ⁇ m and length 800 mm is produced.
  • the upper face of said chip is covered by a chromium layer with a thickness of 2 nm and a layer of gold of a thickness of 48nm both deposited by sputtering to obtain a plasmon effect.
  • the chip is irradiated with polarized, collimated and monochromatic incident radiation and the intensity of the radiation reflected by the sensitive surface of the protuberances is detected by a CCD detector.
  • the average angle of incidence of the optical system is mechanically fixed by the architecture of the system and is equal to 26.5 °.
  • the radius of curvature of the two protuberances is also different: 11.5mm for the first protuberance (corresponding to a study angular range ⁇ of 3 °) and 100mm for the second (which corresponds to an angular range of analysis ⁇ ' 0.3 °) ( Figure 14).
  • Monoclonal antibodies directed against the 0157: H7 bacterium are covalently and uniformly immobilized on the first protuberance and monoclonal antibodies directed specifically against the shigatoxins secreted by the bacteria are immobilized on the second protuberance.
  • the two plasmon curves generated from these two protuberances have the same plasmon resonance angle (about 26.7 °) before reaction.
  • H7 bacteria When a mixture containing a large amount of 0157: H7 bacteria is brought into contact with the sensitive surface of the chip (that is, on the protuberances), some of them interact specifically with the antibodies of the first protuberance. Since the bacteria are well detected molecules by the SPR (because of their significant weight), the plasmon curve shifts sufficiently so that this shift is very well perceived by the detector imaging the first protuberance. By elsewhere, this bacterium also secretes shigatoxins during the same experiment.
  • ⁇ 0.5 °
  • ⁇ ' 0.3 °
  • FIGS. 15 and 16 show the signals obtained on the detector for the two protuberances before and after interaction of the immobilized antibodies on each of the protuberances with respectively the bacteria and the toxins.
  • this example demonstrates that the chip according to the invention makes it possible to adapt the dynamics and the measurement sensitivity to the species to be measured during a single experiment.

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Abstract

La présente invention concerne une puce microstructurée (3; 33; 43; 53; 63) pour analyse par résonance des plasmons de surface (SPR) se présentant sous la forme d'un solide constitué d'une base (5; 77), d'une face supérieure (4; 44) dont au moins une partie est recouverte d'une couche métallique (2; 22; 42; 52; 62), et d'au moins une face latérale (55; 66), caractérisée en ce que ladite face supérieure est dotée de zones de taille micrométrique destinées à recevoir des espèces à analyser choisies parmi n protubérances et m cavités; et en ce que lorsque n+m≥ 2, lesdites zones sont séparées les unes des autres par des surfaces planes, avec n allant de 1 à j, m allant de 0 à i; j et i étant des entiers.

Description

Puce microstructurée comprenant des surfaces convexes pour analyse par Résonance des Plasmons de Surface, dispositif d'analyse contenant ladite puce microstructurée et utilisation dudit dispositif
[Domaine de l'invention]
La présente invention concerne une puce microstructurée comprenant des surfaces convexes pour analyse par Résonance des Plasmons de Surface, un dispositif d'analyse comprenant ladite puce microstructurée, un procédé d'analyse et les utilisations dudit dispositif.
La Résonance des Plasmons de surface (ou SPR pour « Surface Plasmon Résonance » en anglais) est une technique optique qui permet de détecter de fines variations de propriétés physiques au voisinage immédiat d'une surface. Cette technique est surtout connue pour permettre de suivre en temps réel, et sans marqueur (de type fluorescent ou radioactif par exemple), des interactions biomoléculaires. Elle permet notamment de qualifier et quantifier des interactions entre des ligands immobilisés sur une surface et des analytes en solution dans un échantillon.
La SPR est un phénomène physique d'excitation collective des électrons d'un métal sur une interface métal-milieu diélectrique (ledit milieu diélectrique étant typiquement un milieu liquide ou un gaz) . Pour une polarisation particulière de la lumière (polarisation Transverse Magnétique, ou « TM ») incidente sur cette interface (également dénommée « surface » dans la suite du texte) et pour un angle appelé « angle de résonance plasmon », il se produit un phénomène de résonance se traduisant par le couplage de l'énergie lumineuse incidente à une onde de surface (dénommée « plasmon de surface ») se propageant parallèlement à l'interface. Ce phénomène physique se traduit par une chute de l'intensité de la lumière réfléchie par la surface. Cette excitation n'a lieu que pour des angles d' incidence sur la surface au-delà de l'angle critique de réflexion totale (qui ne peut exister que lorsqu'un rayonnement passe d'un milieu plus réfringent d' indice optique ni à un milieu moins réfringent d' indice optique n2, avec nl>n2) . Dans ce cas, le plasmon de surface va venir « sonder » l'épaisseur optique à la surface du métal, du côté du milieu diélectrique, l'épaisseur optique étant définie comme le produit de l'indice de réfraction par l'épaisseur. Quand ces conditions sont réunies, on peut alors dire que la surface est sensible à l'effet plasmon.
Typiquement un rayonnement incident arrive selon un angle d'incidence donné sur une des faces latérales d'une puce (en général un prisme dans l'état de l'art, car il s'agit de la méthode de couplage de la lumière sur la surface sensible la plus simple à utiliser) dont une des faces est recouverte d'une couche métallique, ledit rayonnement incident est réfracté lorsqu' il entre dans le prisme (du fait de la différence d'indice optique entre le milieu constituant le prisme et le milieu optique précédent, en général de l'air) et vient se réfléchir sur ladite surface métallique. Cette configuration est bien connue de l'homme de l'art sous le nom de configuration de Kretschmann (E. Kretschmann, The détermination of the Optical Constants of Metals by Excitation of Surface Plasmons, Z Physik 241:313-324 (1971)). Des configurations équivalentes existent également en remplaçant le prisme par un réseau de diffraction pour coupler la lumière (configuration de Raether : H. Raether in "Surface Polaritons", Eds . Agranovich and Mills, North Holland Pubi . Comp., Amsterdam, 1982).
Le phénomène de SPR peut permettre en outre d'étudier des interactions biomoléculaires. Dans ce cas, des ligands sont préalablement immobilisés sur la surface métallique du prisme dans des zones définies. Ainsi, tout accrochage ultérieur d'autres molécules avec ces ligands va modifier localement l'épaisseur optique au niveau desdites zones définies, et va donc provoquer des variations des conditions de résonance et donc un déplacement de l'angle de résonance. Ce déplacement est, en première approximation, proportionnel à la quantité da matière biologique qui est venue interagir avec les ligands. Ainsi, des petites molécules vont provoquer un faible déplacement de l'angle d'incidence tandis que des molécules plus grosses vont induire un décalage angulaire bien plus important. C'est l'étude des variations de réflectivité optique liées au phénomène de résonance qui va permettre de détecter et mesurer des interactions biomoléculaires et leur évolution temporelle au niveau des zones définies.
En outre, d'autres méthodes optiques permettent également réaliser de tels phénomènes physiques sans marqueur (miroir résonnant, interférométrie, ondes acoustiques de surface, microbalance à quartz) , mais ces techniques nécessitent des appareillages coûteux et inadaptés à des applications industrielles concrètes.
[Problème technique]
Les systèmes actuels de SPR sont encombrants, coûteux et difficiles à mettre en œuvre et ne permettent donc pas de réaliser des analyses à de faibles coûts. En effet, la plupart des systèmes actuellement commercialisés nécessitent des stratégies de mesure compliquées et ne permettent des mesures que sur une zone bien précise (quasi-ponctuelle) de la surface. Les dispositifs qui permettent des analyses de plusieurs zones en parallèle sont très complexes et présentent des pièces mécaniques en mouvement, rendant ainsi le système encombrant et difficile à utiliser. C'est pourquoi, depuis plusieurs années, de nombreuses recherches scientifiques sont dédiées au développement de dispositifs optiques SPR performants, économiques et faciles à mettre en œuvre.
Le document US5313264 (Ivarsson et al) décrit un dispositif SPR utilisant une interrogation dite « angulaire » dans lequel la surface à étudier est excitée avec un faisceau convergent et l'intensité du faisceau réfléchi est observée sur un détecteur. Cette technique ne permet cependant pas de réaliser l'étude de plusieurs zones en parallèle, à moins de juxtaposer plusieurs détecteurs (on parle d'analyse essentiellement « mono-point ») .
Le document "Designing a curved surface SPR device, J Rooney et E. A. H. Hall, Sensors and Actuators B 114 (2006) 804-811" décrit un dispositif qui permet de détecter une interaction biomoléculaire sur un substrat sphérique courbe concave. Bien que ce document suggère de juxtaposer 8 fois ledit dispositif, les éléments de détection du dispositif sont également multipliés 8 fois, ce qui rend le dispositif final onéreux et encombrant.
Les documents US6862094 (Johansen et al) et US7576863 (Weibel et al) décrivent un dispositif SPR qui utilise non pas une interrogation angulaire mais une interrogation en longueur d'onde à l'aide d'un monochromateur ou d'une source de lumière blanche. Ces dispositifs permettent d'étudier plusieurs interactions biomoléculaires en parallèle mais comportent des pièces en mouvement, ce qui augmente les opérations de maintenance sur le système, et donc le coût global pour l'utilisateur.
II existe également des dispositifs SPR permettant de réaliser de l'imagerie et de suivre à angle d'incidence et longueur d'onde fixés, l'évolution des interactions biomoléculaires dans des zones définies sur une puce. Les documents US 7678584 (Guédon et al), US 7576863 (Weibel et al), US 7551286 (Tani et al) présentent de tels dispositifs SPR. Bien que ces dispositifs permettent une analyse de plusieurs interactions en parallèle, ils présentent des pièces en mouvement ou ne permettent pas une analyse fine de l'interaction lorsqu' aucune pièce ne bouge.
De plus, tous les dispositifs décrits précédemment utilisent des puces qui sont onéreuses de par leur procédé de fabrication. Par ailleurs, comme la majorité des dispositifs sont des dispositifs « mono-point », le prix par point d'analyse est important.
Par ailleurs, on peut également citer dans l'état de l'art le document WO2009/021964A2 (Maccraith and al) qui décrit une plate-forme optique destinée à détecter des analytes par fluorescence. Dans ce document, la surface plane supérieure d'un réseau de protubérances de forme paraboloïde est métallisée puis fonctionnalisée par des espèces biologiques. Puis, un signal de fluorescence est excité grâce à un effet plasmonique généré par la géométrie paraboloïde des protubérances, qui permet d'obtenir un faisceau incident sur ladite surface plane métallisée au- delà de l'angle critique.
Cependant, dans ce document, aucune information ne peut être déduite directement des caractéristiques de l'onde plasmon elle-même car elle ne sert qu'à l'émission indirecte de lumière par luminescence. De plus, la surface utile de détection est une surface plane métallisée, et ne permet que de réaliser une analyse à un angle Θ précis.
Enfin, il existe également dans l'état de l'art de nombreux documents décrivant des puces présentant des nanostructures à leur surface, qui pour certaines d'entre elles, utilisent le phénomène physique des plasmons de surface localisés (LSPR) . A titre d'exemple, le document "Grating coupler integrated photodiodes for plasmon résonance based sensing, B. Turker and al . , Conférence on lasers and Electro-Optics 2011" décrit des biopuces disposant à leur surface de nanostructures agencées selon un réseau périodique. Ce réseau de nanostructures est utilisé pour coupler une lumière incidente à l'onde plasmon de l'interface métal/diélectrique du réseau. Le document "Localised plasmons in gold photonic nanocavities , S. Coyle and al., Quantum Electronics and Laser Science Conférence 2002" présente quant à lui une surface nanostructurée avec des nanocavités d'or. Ces nanocavités d'or mettent en jeu le phénomène physique des plasmons de surface localisés (LSPR) qui diffère du phénomène SPR et qui mène à une amplification des signaux plasmoniques .
Ainsi, dans les deux documents précités, non seulement la réalisation de réseaux et de cavités à une échelle nanométrique est difficile, mais aussi il est nécessaire de faire appel à des pièces mobiles pour évaluer la variation de réflectivité de la couche métallique en fonction de l'angle d'incidence du faisceau lumineux. Enfin, les dispositifs les plus compacts utilisent des puces dont la surface est concave. Or, la réalisation de pièce de forme concave est difficile à mettre en œuvre et coûteuse .
Il existe donc un réel besoin en un dispositif SPR compact, ne présentant pas de pièce en mouvement, économique, et comprenant une puce simple à réaliser permettant ainsi de réaliser des analyses SPR à de faibles coûts .
[Description de l'invention]
Le présent inventeur a trouvé qu'un dispositif d'analyse par SPR comprenant une puce microstructurée présentant une architecture particulière permettait de répondre à ces exigences. On utilisera indifféremment le terme « puce » ou « puce microstructurée » dans la suite du texte.
On utilisera indifféremment le terme , « rayonnement » ou « faisceau » dans la suite du texte.
La figure 1 représente en coupe des protubérances selon différents modes de réalisation de l'invention.
La figure 2 représente en coupe des cavités selon différents modes de réalisation de l'invention.
La figure 3 représente une puce microstructurée selon l'invention dotée de protubérances disposées sous forme de matrice .
La figure 4 représente la face supérieure d'une puce microstructurée selon l'invention dotée de protubérances disposées sous forme de goulottes le long de l'axe X.
La figure 5 représente en coupe une protubérance sans tilt irradiée par un rayonnement incident monochromatique collimaté et polarisé.
La figure 6 représente en coupe une protubérance présentant un tilt d'un angle β, irradiée par un rayonnement incident monochromatique collimaté et polarisé.
La figure 7 représente une puce selon un mode de réalisation de l'invention qui présente des distances entre les surfaces planes séparant les protubérances et la base différentes .
La figure 8 représente un dispositif comprenant une puce microstructurée présentant des distances entre les surfaces planes séparant les protubérances et la base identiques .
La figure 9 représente un dispositif comprenant une puce microstructurée présentant des distances entre les surfaces planes séparant les protubérances et la base différentes .
La figure 10 montre une courbe plasmon représentative de différentes plages angulaires étudiées (sans tilt) . La figure 11 montre une courbe plasmon représentative de différentes plages angulaires étudiées (avec tilt) .
La figure 12 représente un exemple d' image sur une caméra de 3 protubérances d'une puce microstructurée selon 1 ' invention .
La figure 13 représente une puce selon l'invention comprenant 16 protubérances dont au moins une est différente des autres.
La figure 14 représente le pourcentage de réflectivité en fonction de l'angle d'incidence Θ.
La figure 15 représente les courbes plasmons avant et après accrochage de la bactérie Escherichia coli sur les protubérances fonctionnalisées avec des ligands spécifiques de la bactérie.
La figure 16 représente les courbes plasmons avant et après accrochage des shigatoxines sur les protubérances fonctionnalisées avec des ligands spécifiques des shigatoxines .
Puce microstructurée
Un premier objet de l'invention est une puce microstructurée pour analyse par résonance des plasmons de surface (SPR) se présentant sous la forme d'un solide constitué d'une base, d'une face supérieure dont au moins une partie est recouverte d'une couche métallique, et d'au moins une face latérale, caractérisée en ce que la dite face supérieure est dotée de zones de taille micrométrique destinées à recevoir des espèces à analyser choisies parmi n protubérances et m cavités; et en ce que lorsque n+m> 2, lesdites zones sont séparées les unes des autres par des surfaces planes, avec n allant de 1 à j et m allant de 0 à i, j et i étant des entiers.
Selon un mode de réalisation particulier, la puce ne comprend pas de cavité (m=0) . En d'autres termes, la face supérieure de la puce est dotée de zones de taille micrométrique destinées à recevoir des espèces à analyser choisies uniquement parmi au moins une protubérance.
Selon un autre mode de réalisation, m est différent de 0 (m>0) . En d'autres termes, la face supérieure de la puce est dotée de zones de taille micrométrique destinées à recevoir des espèces à analyser choisies parmi au moins une protubérance et au moins une cavité.
Par « puce microstructurée », on entend une puce présentant des zones de taille micrométrique destinées à recevoir des espèces à analyser. Ainsi, la puce n'est pas nécessairement de taille micrométrique mais comprend des zones qui sont de taille micrométrique.
Par « zones de taille micrométrique », on entend des zones qui présentent au moins deux dimensions sur trois de taille micrométrique, lesdites dimensions micrométriques allant de lym à lOOOym, et préférentiellement de 10ym à 500ym.
La troisième dimension de la zone n'est donc pas nécessairement micrométrique et peut présenter des distances comprise entre 1mm et 20mm, de préférence entre 1mm et 10mm.
Les zones selon l'invention présentent des géométries particulières sous la forme de protubérances et éventuellement de cavités qui seront décrites par la suite. Ce sont au niveau de ces zones recouvertes d'une couche métallique que l'effet plasmon sera observé.
Selon l'invention, la puce comprend un nombre de zones (c'est-à-dire n protubérances et m cavités) compris entre 1 (lorsque m=0 et n=l) et 500000, de préférence entre 10 et 10000 et plus préférentiellement entre 25 et 400.
Selon l'invention, au moins une partie de la face supérieure est revêtue de la couche métallique. Elle représente la surface utile de détection (appelée également surface sensible par la suite) . Selon l'invention, au moins une zone de taille micrométrique choisie parmi n protubérances et m cavités est revêtue de la couche métallique .
Selon un mode de réalisation particulier, la face supérieure est entièrement recouverte par la couche métallique .
Ainsi, selon un mode de réalisation particulier combiné au précédent, non seulement les zones mais également les surfaces planes séparant lesdites zones sont destinées à recevoir des espèces à analyser.
Pour faciliter la description qui suit, le référentiel orthonormé direct (XYZ) est utilisé dans lequel les surfaces planes séparant les zones sont parallèles au plan (XY) et dans lequel l'axe Z est orienté vers le bas.
Par « surfaces planes », on entend des surfaces planes ou sensiblement planes pouvant présenter quelques défauts.
La surface plane séparant deux zones destinées à recevoir des espèces à analyser est appelée surface inter¬ zones. Ainsi, on utilisera indifféremment les termes suivants : surfaces planes ou surfaces inter-zones ou encore surfaces planes inter-zones. Plus spécifiquement :
- lorsque la surface plane sépare deux zones qui sont des cavités, on parle de surface inter-cavité ;
- lorsque la surface plane sépare deux zones qui sont des protubérances, on parle de surface inter-protubérance ; et
- lorsque la surface plane sépare une zone qui est une cavité et une autre zone qui est une protubérance, on parle de surface inter-cavité-protubérance .
Selon un mode de réalisation, les zones sont disposées sous la forme d'une matrice sur la face supérieure de la puce. Ainsi, les surfaces planes séparent les zones à la fois selon l'axe X et l'axe Y. Selon un autre mode de réalisation, les zones sont disposées sous forme de goulottes continues le long de la face supérieure de la puce. Ainsi, selon ce mode de réalisation, les surfaces planes séparent les zones selon l'axe X ou selon l'axe Y.
Selon un mode de réalisation, lorsque n+m≥2; les zones sont séparées d'une distance D selon l'axe Y et d'une distance D' selon l'axe X par les surfaces planes (ou surfaces inter-zones) ; D et D'étant compris entre Oym (dans le cas d'une goulotte continue selon l'un des axes X ou Y) et 5mm, de préférence entre 50ym et 5mm, de préférence entre 200 et 1000 ym et de manière particulièrement préférée entre 300 et 700ym.
Selon un mode de réalisation, lorsque n+m≥2, les zones sont séparées d'une distance centre à centre CTC comprise entre 10ym et 25000ym, de préférence entre 50ym et 5000ym et plus préférentiellement entre lOOym et lOOOym.
Selon un mode de réalisation, les surfaces planes appartiennent à des plans parallèles au plan (XY) ; la face supérieure se présente alors sous la forme de marches d' escalier .
Selon un autre mode de réalisation, les surfaces planes appartiennent à un même plan (XY) (c'est à dire Z est constant) .
Par « protubérance », on entend une excroissance sur la face supérieure de la puce, ladite excroissance se trouvant entre deux surfaces planes (appelées également surface inter-zone) .
La protubérance peut être définie soit en 3 dimensions (repère XYZ) soit en 2 dimensions (coupe dans un plan) .
Ainsi, on appelle protubérance, un volume dont toutes les coordonnées se trouvent au-dessus d'un plan fictif reliant les deux surfaces planes inter-zones adjacentes à ladite protubérance. Par la suite, la protubérance sera décrite dans le plan (YZ) .
Ainsi, une protubérance selon l'invention, décrite dans le plan (YZ),est définie par au moins une courbe de rayon de courbure R moyen et/ou au moins une droite.
Lorsque la protubérance est définie uniquement par une courbe, alors la courbe est nécessairement convexe (c'est- à-dire rayon de courbure selon l'axe +Z) .
Lorsque la protubérance est définie par au moins une courbe et au moins une droite, alors la courbe peut être soit concave (c'est-à-dire rayon de courbure selon l'axe - Z ) , soit convexe .
Selon un mode de réalisation particulier, la protubérance est définie par deux droites séparées par une courbe.
Selon un mode de réalisation particulier combiné au précédent, les deux droites sont parallèles.
Selon un autre mode de réalisation pouvant être combiné au précédent, les deux droites présentent des dimensions différentes.
Par « cavité », on entend un creux dans la face supérieure de la puce, le dit creux se trouvant entre deux surfaces planes (appelées également surface inter-zones) .
La cavité peut être définie soit en 3 dimensions (repère XYZ) soit en 2 dimensions (coupe dans un plan) .
Ainsi, on appelle cavité, un volume dont toutes les coordonnées se trouvent sous un plan fictif reliant les deux surfaces planes inter-zones adjacentes à ladite cavité .
Par la suite, la cavité sera décrite dans le plan
(YZ) .
Ainsi, une cavité selon l'invention est décrite dans le plan (YZ) et est définie par au moins une courbe de rayon de courbure R moyen et/ou au moins une droite. Lorsque la cavité est définie uniquement par une courbe, alors la courbe est nécessairement concave (c'est- à-dire rayon de courbure selon l'axe -Z) .
Lorsque la cavité est définie par au moins une courbe et au moins une droite, alors la courbe peut être soit concave, soit convexe (c'est-à-dire rayon de courbure selon 1' axe +Z) .
Selon un mode de réalisation particulier, la cavité est définie par deux droites séparées par une courbe.
Selon un mode de réalisation particulier combiné au précédent, les deux droites sont parallèles.
Selon un autre mode de réalisation pouvant être combiné au précédent, les deux droites présentent des dimensions différentes.
Ainsi, selon un mode de réalisation particulièrement préféré, les zones de la puce (n protubérances et m cavités) , décrites dans le plan (YZ) , sont définies uniquement par une courbe de rayon de courbure moyen R (concave pour une cavité et convexe pour une protubérance) ; le rayon de courbure R étant compris entre 0,1mm et 600mm, de préférence entre 0,3mm et 300mm.
A titre d'exemple, on peut citer n protubérances et m cavités de forme semi-sphérique, semi-elliptique ou semi- cylindrique (repère (XYZ) ) .
Selon un mode de réalisation préféré de l'invention, les n protubérances et m cavités présentent une forme semi-cylindrique dans le repère (XYZ) .
Selon un mode de réalisation particulier, le rayon de courbure des zones (i.e. des n protubérances et des m cavités) est perpendiculaire au plan (XY) , c'est-à-dire selon 1 ' axe Z .
Selon un autre mode de réalisation, le rayon de courbure des zones n'est pas perpendiculaire au plan (XY) (c'est-à-dire, les n protubérances et les m cavités présentent un basculement ou tilt) .
Selon un mode de réalisation particulier, les zones destinées à recevoir des espèces à analyser (les n protubérances et m cavités) présentent un rayon de courbure R identique.
Selon l'invention, la base de la puce peut être une surface plane ou courbe, ou une arête, ou un point.
Selon un mode de réalisation préféré, la base de la puce est une surface plane qui, de manière préférée, est parallèle aux surfaces planes (appelées aussi surfaces inter-zones) .
Selon un autre mode de réalisation pouvant être combiné au précédent, les surfaces planes appartiennent au même plan (XY) . Autrement dit, si la base est parallèle aux dites surfaces planes, les distances entre les surfaces planes et la base de la puce sont identiques. Dans ce cas, on dit que la face supérieure est parallèle à la base.
Selon un autre mode de réalisation, les surfaces planes appartiennent à de multiples plans parallèles au plan (XY) . Autrement dit, si la base est parallèle aux dites surfaces planes, les distances entre les surfaces planes et la base de la puce sont différentes (face supérieure en forme de marche d'escalier) .
Par « distances entre les surfaces planes (ou surfaces inter-zones) et la base », il est fait référence aux hauteurs de la puce, c'est-à-dire à la longueur de la perpendiculaire reliant les surfaces et la base ou une prolongation de la base.
Selon l'invention, la (ou les) face (s) latérale (s) de la puce peut (peuvent) être plane (s) (perpendiculaire ( s ) ou non à la base et/ou à la face supérieure de la puce) ou courbe ( s ) . Selon un mode de réalisation préféré, la (ou les) face (s) latérale (s) de la puce est (sont) plane (s).
Selon un autre mode de réalisation préféré, au moins une face latérale de la puce est perpendiculaire à la base et/ou à la face supérieure.
Selon un autre mode de réalisation, la face supérieure est parallèle à la base de la puce.
Selon un mode de réalisation particulier de l'invention, la puce est accolée à un prisme bien connu de l'état de l'art.
Ainsi, selon un mode de réalisation particulier, la puce se présente sous la forme d'un parallélépipède (c'est- à-dire une puce présentant des surfaces planes appartenant à un même plan (XY) et une base parallèle aux dites surfaces planes) . Selon ce mode de réalisation, les hauteurs des surfaces latérales sont de faibles dimensions de l'ordre de 0,1mm à 20mm, de préférence de 1mm à 10mm) .
Par espèces à analyser, on entend par exemple des matériaux, des gaz ou des espèces biologiques telles que de l'ADN simple ou double-brin, des protéines, des bactéries, des toxines, des virus, des mycoplasmes, des agents chimiques ou toute autre espèce biologique ou chimique susceptible d' interagir avec d' autres espèces biologiques ou chimiques .
Selon un mode de réalisation préféré, les espèces à analyser sont des espèces biologiques, telles que des bactéries pathogènes comme Salmonella spp . , Listeria monocytogenes, Clostridium difficile, ou encore
Campylobacter spp.
Le présent inventeur a démontré qu'il était possible en utilisant la puce selon l'invention d'étudier avantageusement des souches d' Escherichia coli productrices de shigatoxines (STEC) , car elle permet l'analyse simultanée de grosses molécules (bactéries elles-mêmes) , mais également de petites toxines qu'elles produisent.
Selon un autre mode préféré de l'invention, les n protubérances et m cavités seront fonctionnalisées avec différents anticorps monoclonaux spécifiques de biomarqueurs .
La figure 1 représente une coupe selon le plan (ZY) d'une protubérance selon différents modes de réalisation. Sur chacune de ces figures, la protubérance est représentée par une surface dans le plan (XY) (ou par un volume dans le repère XYZ) dont tous les points se situent au-dessus (Z négatif) d'une droite fictive représentée en pointillée (ou plan fictif dans le repère XYZ pour un volume) reliant les deux surfaces planes adjacentes à la protubérance :
- dans le cas a) : la protubérance est définie uniquement par une courbe de forme convexe de rayon de courbure R (c'est-à-dire présentant un rayon de courbure selon l' axe +Z) ;
- dans le cas b) : la protubérance est définie par deux droites parallèles séparées par une courbe de rayon de courbure R de forme convexe;
- dans le cas c) : la protubérance est définie par deux droites parallèles séparées par une courbe de rayon de courbure R de forme concave (c'est-à-dire présentant un rayon de courbure selon l'axe -Z) .
La figure 2 représente une coupe selon le plan (ZY) d'une cavité selon différents modes de réalisation. Sur chacune de ces figures, la cavité est représentée par une surface dans le plan (XY) (ou par un volume dans le repère XYZ) dont tous les points se situent au-dessous (Z positif) d'une droite fictive représentée en pointillée (ou plan fictif dans le repère XYZ pour un volume) reliant les deux surfaces planes adjacentes à la cavité - dans le cas a) : la cavité est définie uniquement par une courbe de forme concave de rayon de courbure R; (c'est-à-dire présentant un rayon de courbure selon l' axe -Z) ;
- dans le cas b) : la cavité est définie par deux droites parallèles séparées par une courbe de forme concave de rayon de courbure R;
- dans le cas c) : la cavité est définie par deux droites parallèles séparées une courbe de rayon de courbure R de forme convexe (c'est-à-dire présentant un rayon de courbure selon l'axe +Z) .
La figure 3 représente une puce microstructurée 3 dans laquelle la face supérieure 4 comprenant des surfaces planes inter-protubérances est parallèle à la base 5 de la puce 3. La face supérieure 4 est recouverte d'une couche métallique 2 et est dotée de protubérances 1 sensibles à l'effet plasmon, destinées à recevoir des espèces à analyser .
Sur la figure 3, les protubérances 1 sont séparées les unes des autres d'une distance D selon l'axe Y et d'une distance D' selon l'axe X par des surfaces planes (appelées également surfaces inter-protubérances) .
La puce microstructurée 3 peut être réalisée en tout type de matériaux permettant la propagation de la lumière. On peut citer par exemple, le verre, un cristal ou des matières plastiques.
Selon un mode de réalisation préféré, pour des raisons de coût, la puce 3 est réalisée en matière (s) plastique (s) comme par exemple le PMMA (polyméthacrylate de méthyle) , le PC (Polycarbonate) , le PS (Polystyrène) , le SU-8 (résine photosensible négative à base d' époxy) ou le PDMS (Polydiméthylsiloxane) . Selon un mode de réalisation particulier, lorsque la puce est accolée à un prisme, elle peut être réalisée dans un matériau différent de celui du prisme.
La couche métallique 2 qui recouvre la couche supérieure 4 de la puce 3 (et en particulier les protubérances 1) peut être réalisée avec divers métaux tels que l'or, l'argent, le platine ou l'aluminium.
Selon un mode de réalisation préféré, en raison de ses très bonnes propriétés anti-corrosives , la couche métallique 2 est en or.
L'épaisseur de la couche métallique 2 est comprise entre lOnm et 200nm, de préférence entre 30nm et 100 nm et plus préférentiellement encore entre 40nm et 50nm.
Selon un autre mode de réalisation combiné aux précédents, une fine couche de chrome est utilisée comme couche de pré-accrochage de l'or sur la face supérieure 4 de la puce 3.
La figure 4 représente la face supérieure d'une puce microstructurée selon l'invention entièrement recouverte d'une couche métallique 2, ladite puce microstructurée est dotée de protubérances qui sont disposées sous forme de goulottes le long de l'axe X formant ainsi 4 colonnes C1-C4. Dans la figure 4, d représente le diamètre de la goulotte et CTC représente la distance centre à centre entre deux goulottes successives.
La puce selon l'invention permet d'adapter la sensibilité de chaque zone (c'est-à-dire des n protubérances et m cavités) afin d'étudier des espèces biologiques très différentes.
Selon un mode de réalisation, au moins une des n protubérances et m cavités présente un rayon de courbure différent des autres.
La figure 5 représente un agrandissement en coupe de la figure 3 de la protubérance de surface courbe convexe 1 de la puce 3 (recouverte de la couche métallique 2) qui est irradiée par un faisceau collimaté monochromatique d'angle d' incidence Θ et polarisé linéairement suivant la polarisation TM.
La protubérance, de forme semi-cylindrique (dans le repère XYZ) , présentant une surface définie par une unique courbe (dans le plan ZY) sur les figures 3 et 5, est caractérisée par son rayon de courbure R et par les deux demi-angles a (définissant ainsi un angle total de 2a) .
Le rayon de courbure R et le demi-angle a vont ainsi définir la longueur de la corde d, ou encore le diamètre de ladite cavité.
Du fait de la réflexion sur la surface sensible (ou protubérance 1), l'angle d'incidence sur les deux extrémités A et C vont être respectivement, pour un angle d'incidence moyen du faisceau collimaté de Θ, de θι=θ-2α et θ3=θ+2α. Ainsi, le faisceau réfléchi (θι pour le point A, Θ2 pour le point B, Θ3 pour le point C) par ladite protubérance 1 présente une largeur angulaire Δθ (Δθ=θ3-θι) égale à 4a, centrée autour de l'angle 9moyen (correspondant à l'angle Θ2 sur la figure 5) . Dans ce cas, on a Qmoyen=Q2=Q .
Il est important de noter que le choix du rayon de courbure R des n protubérances et m cavités de la puce selon l'invention est très important car il va déterminer, en fonction des paramètres physiques essentiels (indice optique de la puce nP, indice optique du milieu diélectrique extérieur ne, angle d' incidence moyen du faisceau collimaté Θ et la taille des espèces biologiques que l'on souhaite analyser) , la sensibilité et la dynamique angulaire de la mesure, pour chacune des n protubérances et m cavités.
Par « dynamique angulaire de la mesure », on entend la plage angulaire qui va pouvoir être visualisée lors des analyses . Par « sensibilité », on entend la plus petite variation d'épaisseur optique qu'on va pouvoir mesurer sur la surface sensible.
En effet, si le rayon de courbure est très grand, on va se rapprocher d'un plan, donc les angles θι et Θ3 seront très proches (la plage angulaire d'analyse ΔΘ sera donc très petite) rendant cette configuration particulièrement adaptée à l'analyse de petites molécules (c'est-à-dire une bonne sensibilité) . A l'opposé, un rayon de courbure très petit permettra d'observer la courbe plasmon dans son ensemble, avec certes une sensibilité de mesure plus faible mais plus adaptée à l'analyse de grosses molécules.
Il est ainsi possible selon l'invention, d'adapter la sensibilité de mesure pour différentes espèces étudiées.
Selon un autre mode de réalisation pouvant être combiné au précédent, au moins une des n protubérances et m cavités présente un tilt (ou basculement) d'un angle β.
Selon ce mode de réalisation, le rayon de courbure R est dévié par rapport à l'axe Z.
La figure 6 représente un agrandissement en coupe d'une protubérance de surface courbe convexe 41 d'une puce 43 (dont la face supérieure est recouverte d'une couche métallique 42) qui présente un tilt d'un angle β et qui est irradiée par un faisceau monochromatique collimaté avec un angle d'incidence moyen Θ et polarisé linéairement suivant la direction transverse magnétique TM.
Dans le cas d'un tilt β de la surface sensible (ici de la protubérance) par rapport à la perpendiculaire au plan moyen de la surface sensible, le plan moyen étant défini comme le plan parallèle aux surfaces planes inter¬ protubérances, le faisceau réfléchi présentera encore une largeur angulaire ΔΘ égale à 4a, mais cette fois-ci centrée autour de l'angle moyen Y'moyen (représenté par Θ2 sur la figure 3) tel que Y'm0yen =θ+2β pour une surface convexe. Selon un mode de réalisation, l'angle β est défini de la façon suivante : 0° <β<80°, de préférence 15°< β<45°.
Il est ainsi possible selon l'invention d'ajuster, pour chacune des n protubérances et m cavités, à la fois la largeur angulaire étudiée, mais aussi l'angle moyen (c'est-à-dire Θ2 ou θ'2 représenté sur les figures 5 et 6 selon que la protubérance soit tiltée ou pas) de cette plage angulaire, permettant ainsi d'adapter la sensibilité de mesures pour différentes espèces au sein d'une même puce, lors d'une même expérience.
Ainsi, selon un mode de réalisation particulier, au moins une des zones (c'est à dire au moins une des n protubérances et des m cavités) présente à la fois un rayon de courbure différent et une orientation différente par rapport aux autres zones de la puce.
Selon un autre mode de réalisation, pouvant être combiné aux précédents, au moins une distance entre la base et les surfaces planes (appelée également surface inter¬ zone) est différente des autres.
La figure 7 représente une puce 33 dont la face supérieure 44 qui est recouverte d'une couche métallique 22 est dotée de protubérances de forme courbe 11. Les faces latérales (55, 66) de la puce 33 sont perpendiculaires à la base 77 et aux surfaces planes.
Les distances séparant les surfaces planes entre les protubérances 11 (ou surfaces inter-protubérances ) et la base 77 sont toutes différentes les unes des autres avec d4<d3<d2<dl . Sur la figure 7, les surfaces inter-zones appartiennent à de multiples plans parallèles au plan (XY) (5 plans représentés) .
La puce selon l'invention peut être réalisée par différentes méthodes qui comportent nécessairement une étape de fabrication de la puce suivie d'une étape de dépôt d'au moins une couche mince métallique. Parmi les méthodes de fabrication, on peut citer l'injection haute pression, l'usinage mécanique direct, l'emboutissage à chaud, la gravure au plasma, la photolithographie ou l'ablation par laser.
Selon un mode de réalisation préféré, la puce est fabriquée par injection haute pression.
La réalisation de la puce selon l'invention nécessite l'utilisation d'un moule de forme concave afin de réaliser une protubérance de forme convexe ce qui permet ainsi de diminuer son coût de production. En effet, un homme de l'art sait que l'étape la plus coûteuse lors de la mise au point d'une production de composants par le procédé d'injection haute pression est la réalisation du moule (ou « master ») . Le fait d'avoir une surface finale de la pièce à réaliser avec des protubérances convexes va permettre de réaliser un moule avec des formes concaves, ce qui revient à retirer de la matière dans le « master », ce qui est très simple à réaliser avec des méthodes d'usinage mécanique classique .
Parmi les méthodes de dépôt de couches minces métalliques, on peut citer la pulvérisation cathodique, des techniques d' évaporation sous vide, ou des techniques de dépôt à froid.
Les techniques de dépôt à froid sont utiles notamment dans le cas d'un support en plastique car le plastique ne supporte pas des montées en températures importantes.
Dispositif d'analyse
Les figures 8 et 9 représentent différents modes de réalisation de dispositifs de mesure comprenant la puce microstructurée décrite précédemment.
Ainsi, un autre objet de la présente invention est un dispositif d'analyse par SPR comprenant:
une source lumineuse 7 destinée à générer un faisceau incident; éventuellement un système optique de collimation
8;
un système polarisant 6;
une puce microstructurée (3; 33; 43; 53; 63) telle que décrite précédemment disposée dans le trajet optique dudit faisceau incident;
éventuellement un système optique d'imagerie (9;
69)
un détecteur (10; 70) .
Selon un mode de réalisation, le couplage entre l'énergie du faisceau incident et l'onde de surface de la surface métallique de la puce est réalisé par la puce elle-même .
Selon un autre mode de réalisation, le moyen de couplage est un prisme, un guide d'onde ou un réseau de diffraction .
Ainsi, selon un mode de réalisation particulier, lorsque le couplage est réalisé par un prisme, la puce selon l'invention est accolée audit prisme de telle façon que la base de la puce est mise en contact avec la face supérieure du prisme ne présentant pas de surface métallique à l'aide d'une huile de couplage d'indice qui est une méthode bien connue de l'homme de l'art.
Selon un autre mode de réalisation, la puce est accolée à un guide d'onde.
Selon encore un autre mode de réalisation particulier, la puce est accolée à un réseau de diffraction.
Selon l'invention, la source 7 peut être par exemple une lampe à vapeur de mercure, une lampe à incandescence, une diode laser, un laser, une diode électroluminescente (LED) ou une diode électroluminescente organique (OLED) .
Selon un mode de réalisation préféré, la source 7 est une LED monochromatique. Par monochromatique, on entend une LED dont la largeur spectrale à mi-hauteur n'excède pas 40nm.
Selon l'invention, différentes gammes de longueur d'onde peuvent être utilisées telles que le visible ou le proche infrarouge (IR) .
Selon un mode de réalisation préféré, une longueur d'onde comprise entre 790 et 825nm (proche IR) est utilisée .
Selon l'invention le faisceau peut être collimaté. Pour ce faire, différentes techniques bien connues de l'homme de l'art pourront être utilisées.
A titre d'exemple, on peut utiliser comme système optique de collimation 8 une première lentille convergente qui permet de focaliser la lumière émise par la source 7 sur un trou de diamètre Φ, ledit trou étant dans le plan focal d'une lentille convergente ce qui permet de générer le faisceau collimaté.
Selon un mode de réalisation, le système optique de collimation 8 est intégré à la source 7.
Selon l'invention, le système polarisant 6 permet de travailler en mode Transverse Magnétique (ou TM, ou polarisation-p) .
A titre d'exemple, on peut citer un polariseur linéaire ou un cube séparateur polarisant.
Selon un mode de réalisation préféré, le système polarisant 6 permet de basculer facilement d'une polarisation TM à une polarisation TE (Transverse
Électrique), et inversement. Afin d'éviter tout mouvement de pièce, ceci peut être réalisé à l'aide d'une lame à cristaux liquides, pilotée par des courants et tensions électriques .
Selon l'invention, le détecteur (10; 70) peut être par exemple une caméra CCD, CMOS ou être une matrice de photodétecteurs . Selon un mode de réalisation préféré, les caméras fonctionnent sur 8, 10, 12 ou 16 bits et de préférence sur 10 ou 12 bits.
Selon un mode de réalisation, le dispositif comprend en outre un système optique d'imagerie (9; 69) qui permet de réaliser l'image de la puce microstructurée (3; 33; 43; 53; 63) sur le détecteur (10; 70) .
Le système optique d'imagerie (9; 69) doit être suffisamment ouvert pour accepter tous les rayonnements issus de la puce microstructurée. La géométrie convexe des n protubérances dont est dotée la puce selon l'invention permet notamment de faire converger les faisceaux après réflexion du rayonnement incident sur ces dernières, rendant ainsi le système optique d'imagerie (9; 69) beaucoup plus simple à réaliser.
De plus, le système optique d'imagerie (9; 69) est choisi pour que l'image de 2 protubérances ou de 1 protubérance et 1 cavité de la puce microstructurée correspondent à 2 positions différentes sur le détecteur (10; 70) .
Enfin de manière avantageuse, le système optique présente un grandissement qui maximise le nombre de pixels utiles sur le détecteur (10; 70) .
A titre d'exemple comme système optique d'imagerie (9; 69) , on peut citer 2 lentilles plan-convexe montées en afocal .
Selon l'invention, on appelle face d'entrée la face par laquelle rentre un rayonnement incident dans la puce et face de sortie la face par laquelle sort le rayonnement réfléchi par la surface sensible.
Sur la figure 8, la source 7 émet un rayonnement incident, qui est collimaté à l'aide du système de collimation 8 et polarisé à l'aide du polariseur 6 avant d'arriver sur la face d'entrée 54 de la puce 53 (recouverte d'une couche métallique 52) sous une incidence donnée. Le rayonnement est dévié à son entrée dans la puce 53 et vient se réfléchir sur les protubérances 51.
Le système d'imagerie 9, situé après la face de sortie 57 de ladite puce 53, permet de collecter l'intensité des rayonnements réfléchis et de réaliser l'image des protubérances irradiées 51 sur le détecteur 10.
Le dispositif représenté sur la figure 9 comprend une puce 61 (recouverte d'une couche métallique 62) dont les faces latérales sont perpendiculaires à la base et dont les distances entre les surfaces séparant les protubérances 61 de la base sont différentes les unes des autres.
La figure 9 représente un mode de réalisation dans lequel le rayonnement incident émis par la source (non représentée sur la figure 9) qui arrive perpendiculairement sur la face d'entrée 64 (correspondant à la face latérale), n'est pas dévié lorsqu'il traverse la puce 63, et irradie l'ensemble des différentes protubérances 61.
Le système d'imagerie 69 et le détecteur 70 sont situés après la face de sortie 67, qui dans ce mode de réalisation correspond à la base de ladite puce 63, permettant ainsi de collecter l'intensité des rayonnements réfléchis et de réaliser l'image des protubérances 61.
Selon un mode de réalisation, le système optique d'imagerie (9; 69) peut être intégré directement dans la face de sortie (57; 67) de la puce (53; 63) sous la forme d'une matrice de microlentilles.
Selon un mode de réalisation préféré, le système de collimation 8 et éventuellement le polariseur 6 sont rendus solidaires de la face d'entrée (54; 64) et/ou le système optique d'imagerie (9; 69) et le détecteur (10; 70) sont rendus solidaires de la face de sortie (57; 67) . Procédé de mesure
Un autre objet de l'invention concerne un procédé de mesure par SPR qui comporte les étapes suivantes :
détecter un état initial (i) en irradiant la surface sensible d'au moins une des n protubérances et m cavités par la face d'entrée de la puce microstructurée à l'aide d'un faisceau incident monochromatique préalablement polarisé et éventuellement collimaté et (ii) en détectant simultanément l'intensité des rayonnements réfléchis par la surface sensible d'au moins une desdites n protubérances et m cavités, sortant par la face de sortie;
mettre en contact au moins un fluide avec la surface sensible d'au moins une desdites n protubérances et m cavités;
- irradier la surface sensible d'au moins une desdites n protubérances et m cavités contenant ledit fluide par la face d'entrée de la puce microstructurée à l'aide d'un faisceau incident monochromatique préalablement polarisé, et éventuellement collimaté; et détecter simultanément l'intensité des rayonnements réfléchis par la surface sensible d'au moins une desdites n protubérances et m cavités, sortant par la face de sortie pour suivre en temps réel et en continu des modifications d'épaisseur optique dans au moins une desdites n protubérances et m cavités; avec n>0 et m>0.
Un autre objet de l'invention concerne un procédé de mesure par SPR qui comporte les étapes suivantes :
immobiliser des ligands sur la face supérieure recouverte d'une couche métallique d'une puce microstructurée telle que définie précédemment;
détecter un état initial (i) en irradiant la surface sensible d'au moins une des n protubérances et m cavités par la face d'entrée de la puce microstructurée à l'aide d'un faisceau incident monochromatique préalablement polarisé, et éventuellement collimaté; et (ii) en détectant simultanément l'intensité des rayonnements réfléchis par la surface sensible d'au moins une desdites n protubérances et m cavités, sortant par la face de sortie;
- mettre en contact au moins un fluide avec la surface sensible d'au moins une desdites n protubérances et m cavités de ladite puce microstructurée;
irradier la surface sensible d'au moins une desdites n protubérances et m cavités contenant ledit fluide par la face d'entrée de la puce microstructurée à l'aide d'un faisceau incident monochromatique préalablement polarisé, et éventuellement collimaté; et détecter simultanément l'intensité des rayonnements réfléchis par la surface sensible d'au moins une desdites n protubérances et m cavités, sortant par la face de sortie pour suivre en temps réel et en continu des modifications d'épaisseur optique dans au moins une desdites n protubérances et m cavités ;
avec n>0 et m>0.
Selon l'invention, l'immobilisation des ligands sur la surface supérieure peut être réalisée avec diverses techniques bien connues de l'homme de l'art comme par exemple l'immobilisation par liaison chimique covalente ou par électro-copolymérisation de pyrrole sur la surface métallique.
Par fluide on entend un gaz ou un liquide.
Selon un mode de réalisation préféré de l'invention, le fluide comprend au moins une espèce biologique.
Ces procédés de mesure sont adaptés pour mesurer, de manière non limitative, des variations de conformation de molécules immobilisées sur une surface, des interactions biomoléculaires, des indices optiques de fluides (gaz ou liquides), la qualité d'une surface (parallélisme, rugosité microscopique, qualité d'un dépôt de couches minces) ou encore la présence de nanobilles métalliques à proximité de la surface.
Ces procédés de mesure permettent également de mesurer des paramètres extérieurs tels que l'indice optique du milieu extérieur qui permet de remonter à la valeur de l'angle de réfraction limite.
Selon un mode de réalisation, le faisceau incident entre perpendiculairement par la face d'entrée 64 de la puce 63.
La détection de l'intensité des rayonnements réfléchis dans la plage angulaire ΔΘ (ou Δθ ' ) par le détecteur (10; 70) permet de générer toute ou une partie de la courbe plasmon dont les principales zones d' intérêt sont les suivantes :
- le minimum de sensibilité plasmon;
la plage angulaire dans laquelle la sensibilité est la plus forte (c'est-à-dire là où la dérivée du plasmon est la plus importante) appelée également « flanc du plasmon »;
- la zone aux alentours de l'angle de réfraction limite (où on passe d'un régime de réfraction à un régime de réflexion totale) .
Les figures 10 et 11 représentent une courbe plasmon de 3 zones choisies parmi n protubérances et m cavités avec n+m=3 présentant des plages angulaires d'études différentes (lere protubérance ayant une plage angulaire Δθι pour la figure 10 et Δθι ' pour la figure 11, 2eme cavité et/ou protubérance ayant une plage angulaire ΔΘ2 pour la figure 10 et Δθ2 ' pour la figure 11 et 3eme cavité et/ou protubérance ayant une plage angulaire ΔΘ3 pour la figure 10 et Δθ3' pour la figure 11).
La figure 10 représente les plages angulaires de 3 zones choisies parmi n protubérances et m cavités avec n+m=3 lorsque β=0 (sans tilt) alors que la figure 11 représente les plages angulaires de 3 choisies parmi n protubérances et m cavités avec n+m=3 lorsque β≠0 (avec tilt) .
Dans la figure 10, c'est-à-dire lorsque β=0 (sans tilt) , les 3 plages angulaires étudiées sont centrées sur l'angle Θ. La largeur de chacune des zones est définie par l'angle au sommet 2a et le rayon de courbure R de chacune des protubérances ou protubérances et cavités. Le choix de l'angle Θ est donc primordial pour observer au mieux toutes les zones d'intérêt. Il est ainsi possible, en fonction du rayon de courbure de la zone étudiée, d'explorer une plage angulaire de la courbe plasmon plus ou moins grande. Dans le cas où les zones ne présentent pas de tilt β (c'est le cas pour la figure 10) cette plage angulaire sera toujours centrée sur la même valeur Θ.
Dans la figure 11, c'est-à-dire lorsque β≠0 (avec tilt), les trois plages angulaires Δθ'ι, Δθ'2 et Δθ'3 sont centrées respectivement sur les angles γ'ι, γ' 2 et γ'3, lesdits angles γ'ι, γ' 2 et γ' 3 étant chacun définis par des angles β différents. Dans ce cas de figure (avec tilt), les plages angulaires ne sont pas centrées sur la même valeur. Il est ainsi possible d'explorer une plage angulaire variable de la courbe plasmon tout en ayant un faisceau incident à un angle unique, permettant ainsi de ne pas avoir besoin des pièces mobiles habituellement utilisées pour effectuer une rotation angulaire du faisceau incident.
Selon un autre mode de réalisation, le procédé de mesure comprend en outre une étape dans laquelle une image des n protubérances et des m cavités de la puce est réalisée.
La figure 12 représente l'image des 3 zones choisies parmi n protubérances et m cavités avec n+m=3 (courbe plasmon de la figure 11) sur un détecteur matriciel dans laquelle la bande noire entre les bandes lumineuses (en dégradé de gris) représente les surfaces inter-cavités et/ou inter-protubérances qui ont une réflectivité constante car ce sont des surfaces planes.
Selon l'invention, on peut ainsi, connaissant l'angle incident Θ constant et fixé par l'architecture du système optique (puisqu' aucune pièce mécanique n'est en mouvement), choisir la plage angulaire ΔΘ qui sera éventuellement imagée sur le détecteur (en choisissant le rayon de courbure R et l'angle , ou le rayon de courbure R et le diamètre d, car a et d se déduisent l'un de l'autre grâce au rayon de courbure R) et l'angle moyen Y'moyen (avec le choix du tilt β) de la microstructure en fonction des différentes espèces à analyser avec Y'moy =θ+2β. Ce choix peut être fait pour chacune des n protubérances et des m cavités, ce qui permet de s'adapter à plusieurs types d'espèces immobilisées sur la même puce.
De même, le choix peut être fait en fonction du type d'espèces qui vont venir interagir avec les espèces préalablement immobilisées sur la puce : on peut ainsi « adapter » chacune des protubérances ou protubérances et cavités à l'espèce recherchée.
Ainsi, un autre objet de l'invention concerne l'utilisation du dispositif selon l'invention pour la mesure d'interactions biomoléculaires.
L'invention est illustrée à l'aide des exemples qui sont donnés à titre d' illustration uniquement et ne sont pas limitatifs.
Exemple 1 : Puce à protéines - suivi et correction de l'indice du milieu extérieur en temps réel dans des cinétiques d' interactions
Une puce microstructurée réalisée en polycarbonate (PC) comprenant 16 protubérances est représentée sur la figure 13. Une couche d'or d'une épaisseur de 48nm a été déposée par pulvérisation cathodique sur la face supérieure de ladite puce afin d'obtenir un effet plasmon.
En polarisation TM, le minimum de réflectivité est obtenu aux alentours de l'angle Θ =28°.
Les 16 protubérances sont réparties suivant une matrice régulière de 4x4 surfaces semi-cylindriques de diamètre d=500ym et de longueur L=500ym, chacune espacée d'une distance centre-à-centre (CTC) de 1mm.
Quatre espèces différentes ont été immobilisées de manière covalente grâce à une électro-polymérisation d'un film de polypyrrole fonctionnalisé avec les ligands d' intérêt .
Ainsi, les espèces suivantes présentes dans les protubérances sont :
sur la ligne Li : anticorps monoclonaux anti¬ souris
sur la ligne L2 : anticorps monoclonaux dirigés contre l'hormone gonadotrophine chorionique humaine (hCG, impliquée en tant que biomarqueur dans plusieurs pathologies cancéreuses)
sur la ligne L3 : anticorps monoclonaux dirigés contre la bactérie Listeria monocytogenes
sur la ligne L4 : de la BSA (« bovin sérum albumine ») .
La puce est irradiée avec un rayonnement incident polarisé, collimaté et monochromatique et l'intensité des rayonnements réfléchis par les protubérances est détectée par un détecteur de type CMOS .
Le rayon de courbure des surfaces semi-cylindriques des protubérances des colonnes Ci, C2 et C3, est de 9,5mm (équivalent à une zone angulaire d'étude A9a sur la courbe plasmon d'environ 3°) et les protubérances de la colonne C4 présentent un rayon de courbure de 1,9mm (équivalent à une zone angulaire d'étude AQb d'environ 15°) . Les plages angulaires A9a et AQb correspondent respectivement aux plages angulaires Δθι et ΔΘ3 sur la figure 10.
Un liquide d'un indice optique inconnu contenant des protéines hCG est mis en contact avec la puce dans les protubérances. Une variation caractéristique du signal est observée en fonction du temps sur les protubérances de la ligne L2 mais pas sur les autres car une interaction spécifique a lieu sur les anticorps monoclonaux anti hCG et pas sur les autres protéines immobilisées.
De plus, puisque la protubérance située en (L2,C4) présente un rayon de courbure tel que toute la courbe plasmon peut être visualisée sur le détecteur, la valeur angulaire de l'angle de réfraction limite peut être aisément déterminé et il est ainsi possible de déduire l'indice du milieu liquide inconnu.
Ainsi, connaissant cet indice, il est possible de déterminer avec précision la variation du signal sur les protubérances situées en (L2,Ci), (L2,C2) et (L2,C3) , en décorrélant la variation de signal liée au milieu extérieur de la variation de signal liée à l'accrochage de protéines hCG sur les anticorps monoclonaux anti-hCG.
Exemple 2 : puce pour l' étude de bactéries Escherichia coli émettrices de shigatoxines
Dans cet exemple, la présence de bactéries Escherichia coli émettrices de shigatoxines (STEC) dans un échantillon issu de l'industrie agro-alimentaire a été étudiée.
Des exemples de bactéries de cette catégorie sont les souches 0157:H7, 026:H11 ou encore O103:H2. Les bactéries de ce type et les shigatoxines qu'elles produisent sont à l'origine de troubles intestinaux sévères, pour lesquels le pronostic vital peut être engagé. La taille et le poids moléculaire de ces shigatoxines (quelques nanomètres de diamètre et un poids moléculaire d'environ 68kDa) est très différent de celui d'une bactérie Escherichia coli (environ 10 millions de fois plus lourde) . Par conséquent, les signaux plasmon pour l'accrochage de ces 2 types de familles sont très différents. Avec des appareils SPR classiques, on ne peut donc pas étudier à la fois ces bactéries et ces toxines lors d'une même expérience et en temps réel. En effet, dans le cas d'accrochage de bactéries, la courbe va se décaler angulairement de près de 0,1° tandis qu'elle ne va bouger que de moins de 0,01° dans le cas de toxines (ce qui n'est pas facilement détectable par des méthodes SPR classiques) .
Cet exemple démontre qu'en utilisant une puce microstructurée selon l'invention qui présente une architecture particulière, il est possible d'étudier ces 2 espèces biologiques de tailles différentes au cours d'une seule expérience.
Une puce réalisée en polycarbonate comprenant deux protubérances semi-cylindriques, de diamètre 600ym et de longueur 800ym est réalisée.
La face supérieure de ladite puce est recouverte par une couche de chrome d'une épaisseur de 2nm et d'une couche d'or d'une épaisseur de 48nm toutes les deux déposées par pulvérisation cathodique afin d'obtenir un effet plasmon.
La première protubérance présente un tilt nul (β=0) et la seconde protubérance présente un tilt de valeur β=0,5°.
La puce est irradiée avec un rayonnement incident polarisé, collimaté et monochromatique et l'intensité des rayonnements réfléchis par la surface sensible des protubérances est détectée par un détecteur de type CCD.
L'angle moyen d'incidence du système optique est fixé mécaniquement par l'architecture du système et est égal à 26,5°.
Le rayon de courbure des deux protubérances est également différent : 11,5mm pour la première protubérance (correspondant à une plage angulaire d'étude ΔΘ de 3°) et 100mm pour la deuxième (ce qui correspond à une plage angulaire d'analyse ΔΘ ' de 0,3°) (figure 14).
Des anticorps monoclonaux dirigés contre la bactérie 0157 :H7 sont immobilisés de manière covalente et de manière uniforme sur la première protubérance et des anticorps monoclonaux dirigés spécifiquement contre les shigatoxines que la bactérie sécrète sont immobilisés sur la deuxième protubérance .
Les deux courbes plasmons générées à partir de ces 2 protubérances présentent le même angle de résonance plasmon (environ 26,7°), avant réaction.
Lorsqu'un mélange contenant une grande quantité de bactéries 0157 :H7 est mis en contact avec la surface sensible de la puce (autrement dit sur les protubérances) , certaines d'entrés elles interagissent spécifiquement avec les anticorps de la première protubérance. Comme les bactéries sont des molécules bien détectées par la SPR (du fait de leur poids important) , la courbe plasmon se décale suffisamment pour que ce décalage soit très bien perçu par le détecteur imageant la première protubérance. Par ailleurs, cette bactérie sécrète également des shigatoxines au cours de la même expérience.
La deuxième protubérance présente un léger tilt (β=0,5°) et une largeur angulaire étudiée beaucoup plus faible (Δθ'=0,3°) . Ainsi, la sensibilité de mesure de la seconde protubérance est plus importante et il est possible de détecter des shigatoxines venant se fixer sur les anticorps de la deuxième protubérance. Les figures 15 et 16 représentent les signaux obtenus sur le détecteur pour les deux protubérances avant et après interaction des anticorps immobilisés sur chacune des protubérances avec respectivement les bactéries et les toxines.
Ainsi, cet exemple démontre que la puce selon l'invention permet d'adapter la dynamique et la sensibilité de mesure aux espèces à mesurer au cours d'une seule expérience .

Claims

REVENDICATIONS
1. Puce microstructurée (3; 33; 43; 53; 63) pour analyse par résonance des plasmons de surface (SPR) se présentant sous la forme d'un solide constitué d'une base (5; 77), d'une face supérieure (4; 44) dont au moins une partie est recouverte d'une couche métallique (2; 22; 42; 52; 62), et d'au moins une face latérale (55; 66), caractérisée en ce que ladite face supérieure est dotée de zones de taille micrométrique destinées à recevoir des espèces à analyser choisies parmi n protubérances et m cavités; et en ce que lorsque n+m> 2, lesdites zones sont séparées les unes des autres par des surfaces planes, avec n allant de 1 à j, m allant de 0 à i; j et i étant des entiers.
2. Puce microstructurée (3; 33; 43; 53; 63) selon la revendication 1, caractérisée par le fait qu'au moins une zone choisie parmi les n protubérances et les m cavités est recouverte par la couche métallique.
3. Puce microstructurée (3; 33; 43; 53; 63) selon la revendication 1 ou 2, caractérisée par le fait que m=0.
4. Puce microstructurée (3; 33; 43; 53; 63) selon la revendication 1 ou 2, caractérisée par le fait que m>0.
5. Puce microstructurée (3; 33; 43; 53; 63) selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisée en ce que la base
(5; 77) est une surface plane.
6. Puce microstructurée (3; 33; 43; 53; 63) selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisée en ce que la face supérieure (4;44) est parallèle à la base (5; 77).
7. Puce microstructurée (3; 33; 43; 53; 63) selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisée en ce qu'au moins une face latérale (55; 66) est plane.
8. Puce microstructurée (3; 33; 43; 53; 63) selon la revendication 6, caractérisée en ce qu'au moins une face latérale (55; 66) est plane.
9. Puce microstructurée (3; 33; 43; 53; 63) selon la revendication 7, caractérisée en ce que au moins une face latérale (55; 66) est perpendiculaire à la base (5; 77) ou à la face supérieure ( 4 ; 44 ) .
10. Puce microstructurée (3; 33; 43; 53; 63) selon la revendication 8, caractérisée en ce que au moins une face latérale (55; 66) est perpendiculaire à la base (5; 77) et à la face supérieure ( 4 ; 44 ) .
11. Puce microstructurée (3; 33; 43; 53; 63) selon l'une des revendications 1 à 9, caractérisée en ce que les n protubérances et m cavités (1; 11; 41; 51; 61) présentent une surface courbe de rayon de courbure R, de préférence compris entre 0,1 et 600mm.
12. Puce microstructurée (3; 33; 43; 53; 63) selon la revendication 11, caractérisée en ce que les n protubérances et m cavités (1; 11; 41; 51; 61) présentent un rayon de courbure identique.
13. Puce microstructurée (3; 33; 43; 53; 63) selon la revendication 11 , caractérisée en ce que au moins une des n protubérances et m cavités (1; 11; 41; 51; 61) présente un rayon de courbure différent des autres.
14. Puce microstructurée (3; 33; 43; 53; 63) selon l'une des revendications 1 à 13, caractérisée en ce qu'au moins une des n protubérances et m cavités (1; 11; 41; 51; 61) présente un basculement d'un angle β, de préférence tel que 0°< β<80°.
15. Puce microstructurée (3; 33; 43; 53; 63) selon l'une des revendications 1 à 14, caractérisée en ce qu'au moins une des distances séparant les surfaces planes entre les n protubérances et m cavités (1; 11; 41; 51; 61) de la base (5; 77) est différente des autres.
16. Dispositif d'analyse par SPR comprenant:
une source lumineuse (7) destinée à générer un faisceau incident;
éventuellement un système optique de collimation ( 8 ) ;
un système polarisant (6);
une puce microstructurée (3; 33; 43; 53; 63) telle que définie dans l'une des revendications 1 à 15, disposée dans le trajet optique dudit faisceau incident;
- éventuellement un système optique d'imagerie (9;
69) ;
un détecteur (10; 70) .
17. Dispositif selon la revendication 16, caractérisé en ce que le système de collimation (8) et éventuellement le polariseur (6) sont rendus solidaire de la face d'entrée (54; 64) et/ou le système optique d'imagerie (9; 69) et le détecteur (10; 70) sont rendus solidaire de la face de sortie ( 57 ; 67 ) .
18. Procédé de mesure par SPR qui comporte les étapes suivantes :
détecter un état initial (i) en irradiant la surface sensible d'au moins une des n protubérances et m cavités par la face d'entrée de la puce microstructurée telle que définie selon l'une des revendications 1 à 15 à l'aide d'un faisceau incident monochromatique préalablement polarisé et éventuellement collimaté et (ii) en détectant simultanément l'intensité des rayonnements réfléchis par la surface sensible d'au moins une desdites n protubérances et m cavités, sortant par la face de sortie;
- mettre en contact au moins un fluide avec la surface sensible d'au moins une desdites n protubérances et m cavités;
irradier la surface sensible d'au moins une desdites n protubérances et m cavités contenant ledit fluide par la face d'entrée de la puce microstructurée à l'aide d'un faisceau incident monochromatique préalablement polarisé et éventuellement collimaté et détecter simultanément l'intensité des rayonnements réfléchis par la surface sensible d'au moins une desdites n protubérances et m cavités, sortant par la face de sortie pour suivre en temps réel et en continu des modifications d'épaisseur optique dans au moins une desdites n protubérances et m cavités ;
avec n>0 et m≥0.
19. Procédé de mesure par SPR qui comporte les étapes suivantes :
immobiliser des ligands sur la face supérieure recouverte d'une couche métallique d'une puce microstructurée telle que définie selon l'une des revendications 1 à 15;
détecter un état initial (i) en irradiant la surface sensible d'au moins une des n protubérances et m cavités par la face d'entrée de la puce microstructurée à l'aide d'un faisceau incident monochromatique préalablement polarisé et éventuellement collimaté et (ii) en détectant simultanément l'intensité des rayonnements réfléchis par la surface sensible d'au moins une desdites n protubérances et m cavités, sortant par la face de sortie;
- mettre en contact au moins un fluide avec la surface sensible d'au moins une desdites n protubérances et m cavités de ladite puce microstructurée;
irradier la surface sensible d'au moins une desdites n protubérances et m cavités contenant ledit fluide par la face d'entrée de la puce microstructurée à l'aide d'un faisceau incident monochromatique préalablement polarisé et éventuellement collimaté et détecter simultanément l'intensité des rayonnements réfléchis par la surface sensible d'au moins une desdites n protubérances et m cavités, sortant par la face de sortie pour suivre en temps réel et en continu des modifications d'épaisseur optique dans au moins une desdites n protubérances et m cavités ;
avec n>0 et m≥0.
20. Procédé selon l'une des revendications 18 ou 19, caractérisé en ce qu' il comporte en outre une étape finale dans laquelle une image des n protubérances et m cavités (1; 11; 41; 51; 61) de la puce est réalisée.
21. Utilisation du dispositif tel que défini selon l'une des revendications 16 ou 17 pour mesurer des interactions biomoléculaires.
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