WO2013054063A1 - Procede pour la preparation de complexes comprenant de l'amylose assemble avec au moins une molecule organique d'interet - Google Patents

Procede pour la preparation de complexes comprenant de l'amylose assemble avec au moins une molecule organique d'interet Download PDF

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WO2013054063A1
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interest
amylose
organic molecule
acids
organic
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Patricia LE BAIL
Cécile LORENTZ
Gaëlle PENCREAC'H
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Institut National de la Recherche Agronomique INRA
Le Mans Universite
University of Maine System
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Institut National de la Recherche Agronomique INRA
Le Mans Universite
University of Maine System
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Definitions

  • the present invention relates to processes for the preparation of complexes in which amylose constitutes the "host molecule", as well as the complexes resulting from these processes.
  • Starch is a polysaccharide of vegetable origin. It is the main source and carbohydrate reserve synthesized by higher plants (cereals, tubers and legumes) during photosynthesis.
  • the starch is native in the form of grains ranging in size from one micron to one hundred microns depending on the botanical origin.
  • Starch consists of two fractions: a very predominant carbohydrate fraction (98 to
  • the carbohydrate fraction of the starch consists mainly of a mixture of two ⁇ -D glucopyranosyl polymers, namely amylopectin and amylose, in variable proportions depending on the origin of the starch.
  • Amylose represents about 20 to 30% of the carbohydrate portion of the starches. But this amount can reach up to 80% for some varieties of maize (Zea mays), barley
  • Amylose is an essentially linear molecule composed of 500 to 6000 units.
  • D glucopyranosyl spread over 1 to 20 different chains with an average degree of polymerization of 500.
  • the molar mass of amylose is generally between 2.10 5 and 2.10 6 g / mol and depends on the botanical origin but also on the fractionation method used.
  • amylose population is heterogeneous, with a polydispersity generally between 1, 3 and 2.1 but which sometimes reaches higher values (5-10).
  • Amylose is known for its ability to form stable complexes with other molecules, i.e. a molecular association in which amylose is a "host” molecule (receptor or sequestrant) and the molecule (s) of interest form “guest” molecules (substrate or complexing agent).
  • the links between the "host” molecule and the “guest” molecule are weak interactions (in particular non-covalent bonds).
  • the complexes encountered generally consist of so-called “inclusion” complexes (also called simply “clathrate”).
  • the "guest” molecule is then totally or partially encapsulated in the "host” molecule.
  • amylose is capable of complexing with hydrophobic (or lipophilic) molecules because of its essentially linear character, and the almost exclusive presence of ⁇ - (1, 4) type bonds.
  • This complexation is based on a conformational rearrangement which is induced by the complexing agent and which leads to a new helical conformation in simple helices (6 glucose units per revolution), in which the hydrophilic groups of the chain are turned outwards and the hydrophobic groups inwards. This results in the formation of a hydrophobic helical cavity in the simple amylose helix, which can be occupied by the hydrophobic compounds.
  • Molecular encapsulation techniques with amylose enable the protection of a molecule of interest that is normally sensitive to oxidation, hygroscopicity, interaction with other components, light, acidity and alkalinity and / or evaporation.
  • This technique can be used for the molecular encapsulation of active ingredients of interest in the pharmaceutical, cosmetic and agri-food fields.
  • amylose in particular the hydrophobic molecules of the fatty acid and fatty alcohols type.
  • phenolic compounds and more particularly phenolic acids, are of growing interest. These molecules, while protecting against oxidation, act against oxidative stress (damage caused in the body by the action of free radicals) and contribute to the prevention of certain diseases such as cardiovascular diseases, cancers, joint problems and neurovegetative diseases.
  • oxidative stress damage caused in the body by the action of free radicals
  • the use of these phenolic compounds in emulsion-type formulations is delicate (fragile and easily oxidizable molecules) and may be accompanied by a decrease in their effectiveness in protecting the lipids against oxidation, but also contribute to a loss. of their nutritional intake. Indeed, in the aqueous phase are often produced the first free radicals (it is the medium through which diffuses the oxygen coming from the external medium).
  • the potential antioxidant power of phenolic compounds vis-à-vis lipids and proteins of the digestive system is likely to be limited or neutralized, by the formation of new interactions with proteins or with the food matrix , at the oral and gastrointestinal level, and especially if the phenolic functions are blocked.
  • the complexes obtained would have a crystalline form, with a significant percentage of crystallinity of between 20 and 35%.
  • the present invention relates to a process for the preparation of complexes comprising amylose assembled with at least one organic molecule of interest.
  • steps of contacting (b) and forming complexes (c) consist of a hydro-thermal protocol with stirring.
  • This strategy consists of considerably reducing the polarity of the molecules of interest by grafting a fatty aliphatic chain.
  • This step makes it possible in particular to give it a complexing action with amylose, advantageously by trapping the grafted fatty aliphatic chain in the helical cavity of the simple amylose helix thus formed.
  • the inventors find that, surprisingly, the complexes obtained advantageously do not have any crystalline form (amorphous inclusion complex), which makes it possible in particular to eliminate any precipitation due to the formation of crystallites, which then leads to high instability. in the gelled aqueous phase of an emulsion.
  • the complexes obtained by the hydro-thermal process according to the invention can be either in powder form or in gel form; As subsequently developed, especially for amylose alone, it is sufficient for this purpose to vary the solubilization temperature and the concentration of the amylose in the starting suspension.
  • the complexes obtained in gel form can be directly used as the aqueous phase of an emulsion, contributing to the physical stability of the emulsion and to the enrichment in active principles of this emulsion.
  • the complexes obtained in powder form advantageously amorphous, have the advantage of being able to be reincorporated for example in food bases, because their melting temperature is relatively low (about 80 ° C); such a temperature is regularly reached and must allow the release of the active ingredients trapped in the complexes during cooking including pasta (pastries, bread %) enriched in active ingredients protected by amylose.
  • the hydro-thermal stirring protocol comprises:
  • the complexes obtained can be in two different forms, in particular as a function of the temperature used for the solubilization of amylose alone in its aqueous solution, namely - a precipitate or - a fluid gel.
  • the organic molecule of interest is advantageously chosen from polyphenols, more preferably from phenolic acids.
  • the organic molecule of interest is advantageously chosen from hydroxycinnamic acids or hydroxycinnamic acid esters.
  • the organic molecule of interest in the form of hydroxycinnamic acid is preferably selected from ferulic acids, p-coumaric acids, o-coumaric acids, caffeic acids and sinapic acids.
  • the organic molecule of interest in the form of hydroxycinnamic acid ester is preferably chosen from among caffeoylquinic acids, p-coumaroylquinic acids, feruloylquinic acids and sinapoylquinic acids, or from rosmarinic acids.
  • the lipophilization step (a) advantageously consists in grafting the fatty aliphatic chain onto the quinic group of the organic molecule of interest, more preferably on one of the hydroxyl functional groups of the quinic group of the organic molecule. interest.
  • the organic molecule of interest advantageously consists of 5 -octoylquinic; the lipophilization step (a) consists in grafting the fatty aliphatic chain on the hydroxyl group in position 3 or in position 4 of the quinic group of said organic molecule of interest.
  • Advantage characteristics which can be taken independently or in combination, are developed below:
  • the lipophilic derivative of the organic molecule of interest derived from the lipophilization step (a) comprises a grafted fatty aliphatic chain comprising (see consisting of) a linear (unbranched) alkyl group, comprising a chain length preferably between 12 and 16 carbon atoms, inclusive;
  • the step of forming the complexes (c) is carried out so as to obtain inclusion complexes (advantageously amorphous), in which the fatty aliphatic chain of lipophilic derivatives of organic compounds of interest is included in one of helices of the associated amyloidosis;
  • the amylose molecule consists of amylose alone or of amylose in the form of starch.
  • the present invention also relates to an organic chemical compound in the form of a complex, comprising amylose assembled with at least one organic molecule of interest; this organic molecule of interest is in a lipophilic derivative form, carrying a fatty aliphatic grafted chain.
  • This organic chemical compound is advantageously obtained by the implementation of the process developed above.
  • the organic molecule of interest bearing the grafted fatty aliphatic chain is as defined above.
  • this organic molecule of interest is advantageously chosen from among caffeoylquinic acids, p-coumaroylquinic acids, feruloylquinic acids and sinapoylquinic acids, or from rosmarinic acids.
  • the lipophilic derivative of the organic molecule of interest advantageously carries the fatty aliphatic chain grafted on its quinic group, preferably on one of the oxygens covalently bonded to the cyclohexyl group of the quinic group.
  • the lipophilic derivative of the organic molecule of interest consists of a 5-O-caffeoylquinique, whose grafted fatty aliphatic chain is carried by the oxygen atom in the 3-position or in the 4-position of the quinic group.
  • the grafted fatty aliphatic chain advantageously comprises (see consists of) a linear (unbranched) alkyl group, the chain length of which is advantageously between 12 and 16 carbon atoms, inclusive.
  • the organic chemical compound is advantageously in the form of an inclusion complex (advantageously amorphous or predominantly amorphous), in which the chain fatty aliphatic grafted lipophilic derivatives of organic compounds of interest is included in one of the helices of the associated amyloidosis.
  • FIG 1 Differential Enthalpy Analysis (“DAL”) thermogram of amyloidosis alone
  • FIG. 1 AED thermogram of the amylose / chlorogenic acid assembly: (A) mounted 1, (B) descent, (C) mounted 2;
  • FIG. 3 AED thermogram of the amylose / hexadecyl chlorogenate assembly: (A) mounted 1, (B) descent, (C) mounted 2;
  • FIG. 4 AED thermogram of the amylose / 3-O-palmitoyl chlorogenic acid assembly: (A) mounted 1, (B) descent, (C) mounted 2;
  • FIG. 5 AED thermogram of the amylose / 4-O-palmitoyl chlorogenic acid assembly: (A) mounted 1, (B) descent, (C) mounted 2;
  • Figure 6 X-ray diffraction pattern for (A) amylose alone, (B) amylose / chlorogenic acid assembly, (C) amylose / 4-O-palmitoyl chlorogenic acid assemblage, (D) amylose / 3-O-palmitoyl chlorogenic assembly and (E) the amylose / hexadecyl chlorogenate assembly;
  • Figure 7 Solid state 3 C NMR spectrum (CP-MAS) for (A) amylose alone, (B) amylose / chlorogenic acid assembly, (C) amylose / 4-O- chlorogenic palmitoyl, (D) the chlorogenic amylose / 3-O-palmitoyl acid assembly and (E) the amylose / hexadecyl chlorogenate assembly;
  • Figure 8 Schematic model of the complex amylose / acid 4-O-chlorogenic acid.
  • the present invention thus provides a new process for the preparation of complexes comprising amylose encapsulating at least one organic molecule of interest, the latter not being initially capable of forming such complexes with amylose.
  • this invention relates to a method for preparing complexes in which the following steps are implemented:
  • steps of contacting and forming consist of a hydrothermal protocol with stirring.
  • the organic molecule of interest advantageously consists of a bioactive molecule.
  • This organic molecule of interest in the native state (before the lipophilization step), is not capable of forming a complex with amylose (molecule in the native state non-complexable with amylose).
  • this organic molecule of interest advantageously does not include, intrinsically, a group or radical (preferably a side chain, advantageously a linear alkyl side group) capable of lodging in a simple helix of amylose.
  • a group or radical preferably a side chain, advantageously a linear alkyl side group
  • the organic molecule of interest is advantageously chosen from among molecules having an antioxidant activity, more preferably from polyphenols.
  • antioxidant activity is advantageously meant a molecule which decreases, or prevents, the oxidation of other chemical substances.
  • a molecule capable of neutralizing or reducing the damage caused by free radicals in the body is still advantageously meant.
  • polyphenols or "phenolic compounds” is meant in particular organic molecules having one or more aromatic rings (or benzene rings), bearing one or more hydroxyl functions.
  • Phenolic compounds are known for various actions: anticarcinogen for some of them, and antioxidant to fight against cellular aging.
  • the phenolic compounds can be grouped into classes that are differentiated first by the complexity of the basic skeleton (ranging from a simple C6 to extremely complex highly polymerized forms), then by the degree of modification of this skeleton (degree of oxidation, etc.), finally by the possible links of these basic molecules with other molecules (carbohydrates, lipids, proteins, etc.).
  • the organic molecule of interest is advantageously chosen from phenolic acids.
  • a phenolic acid (or "phenol acid”) is an organic compound having at least one carboxylic function and one phenolic hydroxyl.
  • phenolic acid is meant in particular:
  • hydroxybenzoic acids have the following formula (I):
  • hydroxybenzoic acids are derived from benzoic acid and have a C6-C1 base formula, among which the most abundant in the plant kingdom are gallic, protocatechic, vanillic and syringic acids.
  • hydroxycinnamic acids have the following formula (II):
  • hydroxycinnamic acids represent a very important class whose basic structure (C6-C3) derives from that of cinnamic acid.
  • C6-C3 basic structure
  • caffeic, ferulic, p-coumaric and sinapic acids are found in particular.
  • esters of hydroxycinnamic acids generally comprise a glucose group, quinic acid or tartaric acid.
  • the family of hydroxycinnamates includes in particular the esters of caffeic, ferulic and p-coumaric acids with quinic acid, but also rosmarinic acid, which is a particular ester of caffeic acid and 3- (3, 4) -dihydroxyphényl-lactic acid.
  • the organic molecule of interest advantageously consists of "chlorogenic acid” as such, that is to say the ester of caffeic acid and (L) -quinic acid 3 (referred to as trans -5-O-caffeoyl-D-quinate, or caffeylquinic acid, or 5-ACQ (or “5-CQA” in English) or 5-O-caffeylquinique).
  • chlorogenic acid is also meant the family of acids whose chemical structure is similar to the aforementioned chlorogenic acid, and which groups together the compounds formed by one (or more) hydroxycinnamic acid conjugated with quinic acid.
  • the organic molecule of interest thus encompasses the compounds formed of quinine-conjugated hydroxycinnamic acids, forming the "class (or family) of chlorogenic acids" whose formula (IV) is the following:
  • family of chlorogenic acids means the mono-esters, in particular, cafylquinic acid (ACQ), ferulylquinic acid (AFQ), p-coumarylquinic acid (APQ), sinapylquinic acid, and the like. dimethoxycinnamylquinic acid.
  • chlorogenic acid family also refers to di-esters, namely in particular dicaféylquinique acid, caféylférulylquinique acid, diférulylquinique acid, di-p-coumarylquinic acid and dimethoxycinnamylquinique acid.
  • family of chlorogenic acids is meant finally the isomeric forms. For example, depending on whether the bond is in the 3, 4 or 5 position on the hydroxyls of quinic acid, it includes:
  • Rosmarinic acid has the following formula (V):
  • the objective of the lipophilization step (a) is to functionalize the organic molecule of interest so as to confer on it properties of a complexing agent with amylose.
  • lipophilization is meant the chemical reaction of reporting, by a covalent bond, a fatty aliphatic chain on a receptor group of the organic molecule of interest.
  • the fatty aliphatic grafted chain (or fatty aliphatic side chain), reported on the organic molecule of interest, comprises (advantageously consists of) advantageously an organic group (or radical) (acyclic) advantageously hydrocarbon, linear non-branched, saturated.
  • this fatty aliphatic graft chain comprises, or even consists of, an unbranched saturated linear fatty chain, advantageously also an unbranched linear alkyl group (formula C n H 2 n + 1).
  • This grafted fatty aliphatic chain advantageously comprises a carbon chain length chosen from 12, 14, 16, 18, 20 or 22 carbon atoms, and more preferably chosen from 12 (lauryl or dodecyl group), 14 (myristyl or tetradecyl group). or 16 (palmityl or hexadecyl group) carbon atoms.
  • This lipophilization step (a) is chosen from the protocols making it possible to obtain an organic molecule of interest to which a single fatty aliphatic chain is reported by a covalent bond.
  • the product resulting from this lipophilization operation is referred to as the "lipophilic derivative” (or “lipophilic derivative” or “lipophilized derivative”) of the organic molecule of interest.
  • lipophilic derivative or “lipophilic derivative” or “lipophilized derivative” of the organic molecule of interest.
  • lipophilic derivatives of polyphenols we will speak of "lipophilic derivatives of polyphenols”.
  • the "acylation" reaction may be defined as the establishment of a covalent bond between an acyl group and a nucleophilic function such as a hydroxyl function.
  • alkylation reaction can be defined as a chemical reaction consisting of the transfer of an alkyl group from one organic molecule to another.
  • the synthesis reaction, acylation or alkylation is chosen according to the nature of the polyphenol, in particular whether or not it has a hydroxyl or carboxyl function (group of phenolic acids or flavonoids and lignans).
  • acylation reaction if the acyl donors are fatty acids or fatty acid esters and the lipophilization takes place on other polyphenols and in particular on the glycosylated portions of the flavonoids, the reaction will be called an "acylation" reaction.
  • the alkylation reaction is described, for example, in Lopez-Giraldo et al., 2007 (OCL 2007, 14: 51-9, and Enz Micro Tech 41: 721-6).
  • the enzymatic synthesis reaction by acylation is, for example, described in the document Lorentz et al., 2010 (Biotechnol Lett 32: 1955-1960).
  • lipophilization reactions of polyphenols are known to allow the synthesis of molecules having not only antioxidant activities, but also pharmacological properties, surfactant activities, or antimicrobial activities, corresponding to the concept of multifunctional compounds.
  • This lipophilization can be carried out by a chemical synthesis route or by an enzymatic synthesis route, which are conventional per se.
  • the protocol is chosen according to the organic molecule of interest to be functionalized, taking into account in particular the desired receptor group as developed after.
  • This chemical synthesis can, for example, be chosen from:
  • the main drawbacks of chemical methods are the production of by-products, the use of toxic solvents or catalysts and the production of mixtures of esters or isomers carrying a variable number of carbon chains that are required. to separate.
  • the grafting sometimes involves hydroxyls responsible for the antioxidant activity (use of fatty acid chloride).
  • the methods of protecting and deprotecting hydroxyl groups are also widely used to allow the choice of the reaction site and the degree of esterification but these are often complex and time-consuming steps.
  • Enzymes are a contrario a valuable synthesis tool for soft reaction conditions and regioselectivity.
  • the growing demand for products of therapeutic, agri-food or cosmetic interest in addition to the requirements for environmentally friendly synthesis processes, reinforces the interest of using biocatalysts.
  • enzymes can replace chemical catalysts and meet the requirements of sustainable industrial development. They can increase production efficiency and reduce energy consumption for those operating at room temperature.
  • Many industrial processes operate at high or high pressure or in highly acidic or basic conditions.
  • the advantages of using enzymes despite their sometimes high cost, are simplified purification steps, as well as mild experimental conditions avoiding the degradation of substrates and allowing the reuse of the biocatalyst (Villeneuve, 2007).
  • Biocatalysis allows the selective production of complex and original structures.
  • lipases For the lipophilization of organic molecules of interest belonging to polyphenols, various enzymes can be implemented, such as lipases, transferases, isomerases, esterases and proteases.
  • lipases are the most frequently used for this type of biotransformation (Figueroa-Espinoza and Villeneuve 2005, Chebil et al., 2006, J. Agric. Food Chem 55: 9496-9502).
  • Lipases means the enzymes triacylglycerol hydrolases, class EC 3.1 .1 .3
  • the lipase is advantageously derived from a microorganism (bacterium or fungus), such as Aspergillus niger, Candida rugosa, Candida lipolytica, Rhizopus oryzae, Penicillium camembertii, Penicillium roquefortii and Mucor javanicus. This enzyme can also come from plants or animals.
  • bacterium or fungus such as Aspergillus niger, Candida rugosa, Candida lipolytica, Rhizopus oryzae, Penicillium camembertii, Penicillium roquefortii and Mucor javanicus.
  • This enzyme can also come from plants or animals.
  • the lipophilization step (a) of the process according to the invention may in particular be carried out with one of the following enzymes.
  • Novozym 435 is an industrial preparation produced by Novozymes (Dk) and marketed by Sigma, resulting from the immobilization of the B isoform of Candida antarctica lipase on a macroporous acrylic resin.
  • This preparation is in the form of white microbeads with a diameter of between 0.3 and 0.9 mm. It is provided with an activity of 7000 U / g (1 unit is defined as the amount of enzyme which allows the conversion of a lauric acid ⁇ to propyl laurate per minute under standard and equimolar conditions). Its water content is 1 to 2% (w / w) and its enzymatic protein content is between 1 and 10%.
  • Lipozyme RM is a preparation produced and marketed by Novozymes (Dk) resulting from the immobilization of Mucor miehei lipase on a macroporous anion exchange resin. This preparation is in the form of brown microbeads with a diameter of between 0.2 and 0.6 mm. It is supplied with a minimum activity of 42 U / g (1 unit is the amount of enzyme that allows the release of one ⁇ ole of oleic acid per minute at pH 8.0 to 40% when hydrolyzing triolein).
  • the lipase of Pseudomonas cepacia immobilized on diatomaceous earth is a preparation produced by Amano Enzymes (UK) and marketed by Sigma. This preparation is in the form of beige microbeads and is provided with a minimum activity of 500 U / g (1 unit corresponds to the amount of enzyme which allows the release of a ⁇ e of oleic acid per minute at pH 8.0 at 40 ° C during hydrolysis of triolein).
  • Lipozyme TL is a preparation produced and marketed by Novozymes (Dk) resulting from the immobilization of Thermomyces lanuginosa lipase on silica beads. This preparation is in the form of white microbeads.
  • the lipophilization step (a) of the "alkylation" type is advantageously carried out by direct esterification from fatty alcohol in the presence of Novozym 435 (Candida antarctica lipase acrylic resin - SIGMA), with or without a solvent.
  • the bioconversion and the reaction time are improved by means of a chemo-enzymatic strategy consisting of a methylation of chlorogenic acid followed by a transesterification of methyl chlorogenate in a molten medium (Lopez-Giraldo et al., 2007) .
  • the alcohol donor advantageously consists of a saturated, linear (unbranched) fatty alcohol, the carbon chain length of which is preferably chosen from C12, C14 or C16.
  • acylation reaction is meant in particular (i) a transacylation reaction or (ii) a direct acylation reaction.
  • the acyl donor is advantageously chosen from fatty acid esters, preferably either methyl or ethyl esters, or vinyl esters.
  • these fatty acid esters comprise a carboxyl group consisting of a linear saturated fatty chain whose length is preferably selected from C12, C14 or C16.
  • fatty acid esters are thus advantageously chosen from ethyl laurate (C12), ethyl palmitate (C16) and ethyl stearate (C18).
  • the acyl donor is advantageously chosen from linear saturated fatty acids, and in particular lauric acid (C12), myristic acid (C14) and palmitic acid (C16). .
  • Such biosynthetic reactions are further detailed hereinafter in the Example section, for obtaining three lipophilic derivatives of chlorogenic acid, namely hexadecyl chlorogenate (obtained by alkylation), and 4-O-acids. chlorogenic palmitoyl and chlorogenic 3-O-palmitoyl (obtained by acylation).
  • the lipophilic derivative of the organic molecule of interest obtained at the end of the lipophilization step (a) described above, comprises a core constituted by the organic molecule of interest described above, carrying a fatty aliphatic side chain. grafted.
  • the lipophilic derivative of the organic molecule of interest thus advantageously carries a single fatty aliphatic side chain.
  • side chain is meant a part of molecule attached to the core or the main chain of the structure, that is to say to the organic molecule of interest.
  • the grafted fatty aliphatic chain (or fatty aliphatic side chain), referred to the organic molecule of interest, advantageously comprises (optionally consists of) an acyclic organic group (or radical), linear (not connected), saturated.
  • this fatty aliphatic grafted chain comprises, or even consists of, a linear non-branched saturated fatty chain, advantageously a linear alkyl group.
  • This grafted fatty aliphatic chain preferably comprises a carbon chain length chosen from 12, 14, 16, 18, 20 or 22 carbon atoms, and more preferably chosen from 12 (lauryl or dodecyl group), 14 (myristyl or tetradecyl group). ) or 16 (palmityl or hexadecyl group) carbon atoms.
  • the organic molecule of interest in the form of hydroxycinnamic acid ester is chosen from among caffeoylquinic acids, p-coumaroylquinic acids, feruloylquinic acids and sinapoylquinic acids, or from rosmarinic acids.
  • the lipophilic derivative of such an organic molecule of interest advantageously carries the fatty aliphatic chain grafted on its quinic group.
  • the grafted fatty aliphatic chain is preferably carried by one of the oxygens covalently bonded to the cyclohexyl group of the quinic group.
  • the lipophilic derivative of the organic molecule of interest consists of a 5-O-cafoylquinic heart (corresponding to the chlorogenic acid molecule), whose grafted fatty aliphatic chain is carried by the oxygen atom in the 3-position. or in position 4 of the quinic group.
  • the lipophilic derivative of such an organic molecule of interest is thus chosen from chlorogenic 3-O-lauroyl acid, chlorogenic 3-O-myristoyl acid, chlorogenic 3-O-palmitoyl acid and 4-O-chlorogenic acid. Chlorogenic o-lauroyl, chlorogenic 4-O-myristoyl acid or chlorogenic 4-O-palmitoyl acid.
  • the lipophilic derivative of the organic molecule of interest advantageously consists of a chlorogenic 3-O-palmitoyl acid or a chlorogenic 4-O-palmitoyl acid.
  • the lipophilic derivatives of such organic molecules of interest advantageously have the formula (VIII) below:
  • R corresponding to the grafted fatty aliphatic chain, comprises (or consists of) an alkyl group (formula C n H 2 n + 1), the length of the carbon chain of which is advantageously chosen from C 12 (dodecyl rosmarinate), C 14 (tetradecyl rosmarinate) or C16 (hexadecyl rosmarinate).
  • the lipophilic derivatives of rosmarinic acid are for example obtained by catalysis using a Candida antarctica lipase B (i) direct esterification or (ii) transesterification by chemo-enzymatic route.
  • the organic molecule of interest is chosen from hydroxycinnamic acids, and its lipophilic derivative advantageously has formula (IX) below:
  • R 5 corresponding to the grafted fatty aliphatic chain, comprises (or consists of) an alkyl group (formula C n H 2 n + 1) whose length of the carbon chain is advantageously chosen from C 12, C 14 or C 16.
  • the organic molecule of interest is chosen from hydroxybenzoic acids, and its lipophilic derivative advantageously has formula (X) below:
  • R 4 corresponding to the grafted fatty aliphatic chain, comprises (or consists of) an alkyl group (formula C n H 2 n + 1) whose length of the carbon chain is advantageously chosen from C 12, C 14 or C 16.
  • R 4 corresponding to the grafted fatty aliphatic chain, comprises (or consists of) an alkyl group (formula C n H 2 n + 1) whose length of the carbon chain is advantageously chosen from C 12, C 14 or C 16.
  • the complexes according to the invention can be directly prepared from starch.
  • the starch is advantageously derived from plant reserve organs, for example:
  • seeds especially cereals such as maize, wheat, wheat), or legumes (such as peas), or
  • the complexes according to the invention are advantageously prepared from amylose alone, especially if it is desired to overcome the presence of amylopectin.
  • amylose can be extracted from starch grains dispersed in water by selective reprecipitation in the presence of alcohol (butanol for example).
  • Amylose can also be synthesized in vitro enzymatically either from ADP-glucose with 1,4-aD-glucan-4- ⁇ -D-glucosyltransferase (Granule Bound Starch Synthase, GBSS), or from sucrose. with a recombinant amylosucrase which makes it possible to obtain amylose of 35-58 highly crystalline DP.
  • 1,4- ⁇ -D-glucan ortophosphate, ⁇ -glucosyl transferase (starch phosphorylase) is also used to produce amylose from glucose-1-phosphate.
  • Amylose can still be obtained from starch with a debranching enzyme: isoamylase or pullulanase.
  • amylose for the formation of such complexes are further specified in Godet et al., 1995 (Carbohydrate Polymers 27: 47-52). Contacting step and complex formation step
  • the steps of contacting and forming the complexes consist of a hydro-thermal stirring protocol, as described for example in the Example section below.
  • hydro-thermal protocol is meant a process implemented from one or more aqueous solutions, subjected to heating.
  • Such a hydro-thermal protocol is thus carried out with the exclusion of any organic polar solvent, such as dimethylsulfoxide (also known as DMSO).
  • organic polar solvent such as dimethylsulfoxide (also known as DMSO).
  • this hydro-thermal protocol firstly comprises, for the step of bringing into contact (b), the preparation of two aqueous solutions: (i) an aqueous solution containing said lipophilic derivative of said organic molecule of interest bearing said grafted aliphatic fatty chain, resulting from said lipophilization step (a), and
  • aqueous solution is meant a solution whose solvent is advantageously constituted by water.
  • This aqueous solution is advantageously degassed to prevent oxidation phenomena.
  • the aqueous solution containing amylose (ii) can be obtained from the starch, which is to be gelatinized to form a gelatinized starch.
  • starch By “gelatinized starch” is meant a starch whose amylose is out of the starch grain when heating the starch in excess of water.
  • the gelatinization temperature of the starch is generally less than 90.degree. C., advantageously between 60.degree. C. and 80.degree.
  • the dispersed amylose of the gelatinized starch is intended to form complexes with the lipophilic derivative of the organic molecule of interest.
  • the aqueous solution containing amylose (ii) can be further prepared from amylose alone.
  • the dispersion of the amylose can be carried out under hot and under pressure (Biais et al., 2006, Dzzier et al., Progr. Colloid Polym Sci 90: 61-65 (192)).
  • the aqueous solution obtained contains:
  • gelled amylose advantageously for a dissolution temperature of less than 160 ° C., for example between 140 ° C. and 160 ° C., or
  • amylose solution a solubilized amylose (also called “amylose solution”), advantageously for a temperature above 160 ° C., for example between 160 ° C. and 170 ° C.
  • the dispersion of the amylose can be further cold-processed in sodium hydroxide solution followed by dialysis against water or neutralization (Buléon et al., 1990).
  • the two aqueous solutions are thus mixed to obtain a mixing solution.
  • the two aqueous solutions (i) and (ii) may be preheated prior to this mixing, independently of one another, in particular to ensure optimal dispersion amylose in its aqueous solution (ii); this approach is particularly suitable for the amylose alone being subjected to a hot dispersion as indicated above, and for a lipophilic derivative of the organic molecule of interest that would be heat-sensitive.
  • the two aqueous solutions (i) and (ii) can be mixed without prior preheating; this approach is particularly suitable for an aqueous solution containing starch whose gelatinization temperature has the advantage of being lower than the dispersion temperature of amylose alone.
  • This hydro-thermal protocol then comprises, for the complex formation step (c), maintaining said mixing solution under heating and stirring.
  • this mixing solution is advantageously maintained at a temperature of between 60 ° C. and 100 ° C., preferably between 70 ° C. and 100 ° C., more preferably between 70 ° C. and 90 ° C.
  • This hot keeping is carried out for a period of at least 5 minutes, preferably of the order of 10 minutes.
  • stirring in particular a magnetic stirring of at least 200 revolutions per minute, preferably of the order of 220 revolutions per minute.
  • this heating is preferably also intended to ensure the transformation of the starch in the form of gelatinized starch.
  • the complexes are constituted either by gelation in a form of a fluid gel (in particular for gelled amylose), or by precipitation in a form precipitates (in particular for solubilized amylose).
  • the mixing solution is advantageously cooled to a temperature of between 15 ° C. and 25 ° C., advantageously at least for 24 hours, preferably for 48 hours, and
  • the mixing solution is then advantageously subjected to centrifugation (for example of at least 2000 g, preferably at least 3500 g, for at least 5 minutes and preferably for at least 5 minutes. minus 30 minutes), for the recovery of the precipitate constituted by said complexes.
  • centrifugation for example of at least 2000 g, preferably at least 3500 g, for at least 5 minutes and preferably for at least 5 minutes. minus 30 minutes
  • this precipitate is placed under a drying atmosphere until equilibration of the mass, to obtain a powder.
  • the organic chemical compound in the form of a complex obtained at the end of the preparation process developed above, comprises amylose assembled with the derivative lipophilic of the organic molecule of interest or with the lipophilic derivative of at least two organic molecules of different interest.
  • This organic chemical compound thus consists of a complex in which amylose constitutes a "host molecule” (receptor or sequestering agent), and the associated lipophilic derivatives correspond to "guest molecules” (substrate or complexing agent).
  • Amylose thus ensures the molecular encapsulation of the lipophilic derivative of the organic molecule of interest.
  • the organic chemical compound obtained advantageously consists of an inclusion complex (also called simply "clathrate”), in which the fatty aliphatic chain grafted lipophilic derivatives of the organic molecule of interest is included in one of the propellers of the amyloidosis associated.
  • an inclusion complex also called simply "clathrate”
  • the fatty aliphatic chain grafted lipophilic derivatives of the organic molecule of interest is included in one of the propellers of the amyloidosis associated.
  • this inclusion complex is amorphous, or predominantly amorphous.
  • the absence, or near-absence, of crystalline form makes it possible in particular to eliminate the risk of possible precipitation due to the formation of crystallites, which then leads to high instability in the gelled aqueous phase of an emulsion.
  • amorphous or “predominantly amorphous” is advantageously meant an absence of an X-ray diffraction (XRD) signature (advantageously no diffraction peak corresponding to V-type complexes), while highlighting complexes by the differential enthalpy analysis (AED) and solid NMR as specified below.
  • XRD X-ray diffraction
  • AED differential enthalpy analysis
  • amorphous or “predominantly amorphous” is advantageously meant a percentage of crystallinity of less than 5%.
  • the characterization of the amylose / lipophilic derivative assemblies of the organic molecule of interest is advantageously carried out by three different techniques, namely differential scanning calorimetry (DSC), X-ray diffraction (XRD) and solid NMR.
  • DSC differential scanning calorimetry
  • XRD X-ray diffraction
  • solid NMR solid NMR
  • the lipophilic derivatives of chlorogenic acid are capable of forming such complexes (advantageously inclusion complexes) with amylose.
  • the organic chemical compound in complex form can be isolated in a solid form, for example a powder (if precipitation) or a film (for a gel).
  • the hydro-thermal protocol used to develop the amylose / lipophilic derivative complexes can thus be adapted to obtain complexes in the form of powder, advantageously an amorphous powder.
  • the precipitate obtained allows the structural study of the complexes with the usual characterization methods (solid NMR, DRX and DSC).
  • the dispersion conditions of amylose in particular the variation of the solubilization temperature of amylose alone in the aqueous phase, as well as the starting concentration of the amylose suspension in water, allow for either an amylose gel or a precipitate (D reconsiderer et al., Progr. Colloid Polym Sci 90: 61-65, 1992).
  • the complexes obtained are amorphous or crystallized on a small scale (no proper signature of the structure V in XRD), which limits the precipitation due largely to the crystallization of the complexes after the nucleation phase.
  • the complexes formed in the solid form (powder) can therefore be introduced directly into pasta (pastries or other) before cooking; amorphous complexes having a much lower melting temperature (80 ° C) than that of crystalline complexes (1 10 ° C), the molecules of interest can be released during cooking (temperature generally reaching 90 ° C in the core of the product).
  • the chemical compound in the form of a complex according to the invention is advantageously intended to be incorporated in a composition, for example a food composition, a pharmaceutical composition or a cosmetic composition.
  • the chemical compound in the form of a complex may be (i) prepared beforehand and then introduced into the composition or (ii) prepared directly within this composition.
  • This composition consists, for example, of an emulsion (the chemical compound in the form of a complex is then advantageously found in the aqueous phase), an aqueous solution or a hydrogel.
  • composition may also consist of a solid medium, for example a food product.
  • the composition according to the invention containing the organic compound in complex form
  • the invention is particularly applicable to compositions containing amylose, optionally in the form of starch, for example pasta or bakery products.
  • the organic compound in complex form can be incorporated at a suitable time during the preparation of the composition.
  • the organic compound can be formed directly within and during the method of preparing the food composition (particularly for starch-containing compositions).
  • the chemical compound according to the invention can also be used in a pharmaceutical application or a cosmetic application, alone or in a composition containing in particular any other desired active substance and / or appropriate excipent.
  • oxidation is probably one of the major parameters at the origin of the deterioration of food products.
  • the resulting oxidative degradations affect the nutritional and sensory qualities of the products and may have repercussions on the health of the consumer.
  • the promotion of antioxidants of plant origin for food is a major challenge for research and industry.
  • the molecular encapsulation of chlorogenic acid or even other phenolic compounds by amylose has the particularity of ensuring, on the one hand, the protection of the ligand against oxidation and, on the other hand, consider a targeted release of the organic molecule of interest by enzymatic digestion (under the action of pancreatic amylases or intestinal lipases) or under the action of an acid attack.
  • the lipase used is Lipozym RM from M. miehei immobilized on an ion exchange resin and purchased from NOVOZYMES (Dk).
  • Chlorogenic acid was purchased from Acros, France, with a purity of 99%.
  • chlorogenic acid, vinyl palmitate and Lipozym RM were dried for at least two days under P 2 0 5 , before use.
  • the activity of the water (a w ) of the reaction medium was determined using an AqualabLite® device (Decagon Devices Inc, USA). The initial water activity of all reaction media was below 0.2.
  • the reaction mixture has a molar ratio (vinyl palmitate / chlorogenic acid) of 40 in 10 mL of 2-methyl-2-butanol (2M2B).
  • the initial concentration of chlorogenic acid was 28 mM.
  • the vinyl palmitate and the chlorogenic acid were first solubilized for 12 h in 1 ml of 2M2B and stirred at 1000 rpm at 60 ° C. in an Eppendorf Thermomixer device (Roucaire, Courtabeuf, France).
  • reaction was initiated by addition of 40 g / L of enzyme and 200 g / L of molecular sieves (3 A), previously dried overnight at 200 ° C. 2M2B was also previously dried on molecular sieves (3A).
  • the immobilized enzyme is separated from the synthesis medium by filtration through a glass filter (1, 6 ⁇ ).
  • the purification of the products is carried out by chromatography, either on a preparative thin layer (TLC) or on a column or on silica gel or Sephadex.
  • the reaction media previously filtered in order to remove the enzyme, are concentrated by evaporation under reduced pressure and then deposited on a 20 x 20 cm preparative silica plate.
  • the plate is developed using an eluent and then revealed with UV or iodine vapors in order to locate the migration zone of the synthesized compound.
  • the silica located in this zone is then detached from the support, and the compound is then desorbed in 5 ml of a methanol / chloroform mixture (50/50 v / v) with stirring at 250 rpm for 10 min, this twice. The mixture is then filtered and then evaporated to dryness.
  • the purification of the hexadecyl chlorogenate was carried out by column chromatography on silica gel.
  • the method is that described by Lopez-Giraldo et al. (2007).
  • a first liquid-liquid extraction separation step is carried out using 500 mL of a hexane / acetonitrile mixture (1/3 v / v).
  • the hexane phase which contains the majority of the fatty alcohol, is removed, while the acetonitrile phase, mainly containing the ester, is washed a further 3 times with 100 ml of hexane. After these washes, the acetonitrile phase is evaporated at 40 ° C under reduced pressure using a rotary evaporator.
  • the dry residue is dissolved in 60 ml of a toluene / ethyl acetate mixture (70/30, v / v) and deposited on a glass column (40 ⁇ 2.5 cm) of silica (previously dried at 100 ° C. C for 48 h).
  • amylose / chlorogenic acid (or with hexadecyl chlorogenate or C16 acyl derivatives of chlorogenic acid) assemblies were made from 1% amylose gels.
  • chlorogenic acid or lipophilic derivatives of chlorogenic acid
  • 10 mg of "molecule of interest" chlorogenic acid, hexadecyl chlorogenate or C16 acyl derivatives chlorogenic acid
  • This solution is then placed in an airtight bottle and heated at 90 ° C. for 30 minutes (in a bath of silicone oil) with magnetic stirring and then returned to ambient temperature.
  • amylose solution without the addition of chlorogenic acid (or lipophilic derivatives of chlorogenic acid), is prepared under the same conditions so that the results obtained can be compared with a reference.
  • amylose / chlorogenic acid (or lipophilic derivatives of chlorogenic acid) assemblies To characterize the amylose / chlorogenic acid (or lipophilic derivatives of chlorogenic acid) assemblies, the assemblies obtained from the amylose / chlorogenic acid gel (or lipophilic derivatives of chlorogenic acid) after packaging under NaCl are used.
  • the starting molecules (chlorogenic acid, lipophilic derivatives of chlorogenic acid) are also studied.
  • amylose / chlorogenic acid (or alkylated or acylated chlorogenic acid) assemblies and the reference amylose gel required three different techniques, namely differential scanning calorimetry (DSC), diffraction of X-ray (XRD) and solid NMR.
  • DSC differential scanning calorimetry
  • XRD diffraction of X-ray
  • solid NMR solid NMR
  • the sample was examined by X-ray diffractometry or XRD.
  • the data was collected using a 120 ° curve detector for 10 minutes and normalized between 3 and 30 ° (2 ⁇ ).
  • DSC Different Scanning Calorimetry
  • the capsules are then sealed with a heat-resistant seal and placed in the oven of the device.
  • the chosen kinetics include a first cycle with an increase of 3 ° C / min from 1 oC to 140 oC, followed by a cooling of 3 ° C / min to 1 ° C. A second temperature cycle was performed at 3oC / min to 160 ° C. Then the sample is rebalanced at room temperature at a fast speed, without recording the data.
  • Solid state 3 C NMR spectra were recorded on a 400 MHz Bruker Wide Bore spectrometer equipped with a double resonance 4 mm H CP-MAS (cross-polarization-magic-angle-spinning) probe. / X.
  • the CP-MAS sequence was performed with a rotation of 7 KHz, a 90 ° proton pulse of 3.75 ⁇ , a recycling time of 7s and a 30ms acquisition time during which dipole decoupling was applied.
  • the contact time was 1 ms.
  • the complexing ability with amylose of chlorogenic acid, and its lipophilic derivatives is determined by differential scanning calorimetry, in comparison with ligand-free amylose.
  • the suspension of amylose alone (without ligand) was obtained following the same protocol as that used for the amylose / ligand suspensions.
  • thermogram obtained ( Figure 1), during the differential analysis (DAL) study, serves as a reference for the rest of the study.
  • DAL differential analysis
  • an endotherm at 108 ° C is observed.
  • the amylose solution was heated to 145oC in order to solubilize the amylose, but the melting temperature of the amylose used was 148oC, which was verified by AED in excess of water (thermogram not shown).
  • At 145 ° C only part of the amylose is fused (the least well organized) and then retrograde rapidly on cooling.
  • the endotherm at 108% corresponds to poorly retrograded amyloidosis with poor crystalline organization.
  • the differential enthalpic analysis was carried out on the ligands, in excess of water, in the temperature range of 20 oC to 140 ° C with a kinetics of 3oC / m ⁇ n.
  • thermograms obtained show an endotherm, respectively, at: 65 ° for chlorogenic acid, 51 ° C for 4-O-palmitoyl chlorogenic acid, 91 ° C for 3-O-palmitoyl chlorogenic acid, and 84oC for hexadecyl chlorogenate.
  • thermograms obtained for the various assemblies are illustrated in FIGS. 2 to 5.
  • the low melting temperature (82 oC) of these complexes In the literature, the temperature of the amylose / lipid complexes is around 110.degree. C. (for example, for palmitic acid, the melting point of the complexes is 112% ).
  • FIG. 6A An X-ray diffraction study was carried out on amylose alone (FIG. 6A) and the four assemblages (amylose / chlorogenic acid - FIG. 6B, amylose / hexadecyl chlorogenate - FIG. 6E, amylose / 3-O-palmitoyl acid chlorogenic - Figure 6D and amylose / chlorogenic 4-O-palmitoyl acid - Figure 6C).
  • the X-ray diffraction patterns obtained are shown in FIG. 6.
  • the X-ray diffraction pattern obtained for amylose alone and used as a reference has a characteristic structure of type B (FIG. 6A). In this case the reflections obtained show that the amylose has demoted to double helices in a hexagonal stack.
  • Type B spectrum is characterized by a doublet of lines equal intensities around "l OOppm. This byte is explained assuming that the repeating unit that generates the double helix is maltose. Or all spectra for amylose alone (FIG. 7A) or the assemblages (amylose / chlorogenic acid - FIG. 7B, amylose / lipophilic derivatives of chlorogenic acid - FIGS. 7C to 7E) have a doublet at 100 ppm, which confirms the presence of retrograded type B amylose. in all samples.
  • the peak at 61 ppm has a large shoulder which corresponds to the presence of two types of left-left and left-frank orientations (FIGS. 7C and 7D).
  • the width of the peak is small, the left-frans orientation is predominantly predominant, the left-left orientation being almost non-existent and therefore undetected, whereas in the case of a structure of type V the two types of left-to-left and left-to-trans orientations are clearly expressed.
  • X-ray diffraction data only show type B structure spectra, regardless of the assemblages formed with amylose (chlorogenic acid, acylated or alkylated derivatives); these results do not make it possible to determine the nature of the possible interactions, in particular the presence of simple helices characteristic of the formation of clathrates.
  • amylose / acyl derivative assemblies For the amylose / acyl derivative assemblies, the presence of the complexes is shown, on the one hand, by the presence of their fusion endotherms in differential enthalpy analysis and by the reversibility of their formation during cooling and on the other hand by the presence of an intense singlet at 102.6 ppm in solid NMR.
  • the grafting of a longer aliphatic chain for the alkylated derivative should make it possible to obtain a sufficient complexing effect with amylose, for the formation of a complex (The steric hindrance being the only factor limiting the complexation of the graft chain by alkylation).
  • a major disadvantage in the addition of protective assemblies in the aqueous phase of an emulsion is the phase shift of the aqueous phase due to the nucleation and precipitation of the complex crystals.
  • Inclusion complexes are taken in the disorganized network of uncomplexed amylose chains, which should allow a clear reduction in the risk of precipitation in the aqueous phase.

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Abstract

La présente concerne un procédé pour la préparation de complexes comprenant de l'amylose assemblé avec au moins une molécule organique d'intérêt. Ce procédé selon l'invention comprend les étapes suivantes : (a) une étape de lipophilisation consistant à greffer une chaîne aliphatique grasse sur ladite molécule organique d'intérêt, pour la préparation d'un dérivé lipophilique de ladite molécule organique d'intérêt, (b) une étape de mise en contact entre (i) ledit dérivé lipophilique de ladite molécule organique d'intérêt portant ladite chaîne aliphatique grasse greffée, issu de ladite étape de lipophilisation (a), et (ii) ledit amylose, et (c) une étape de formation desdits complexes amylose / dérivé lipophilique de la molécule organique d'intérêt, lesquelles étapes de mise en contact et de formation des complexes consistent en un protocole hydro-thermique sous agitation. La présente invention concerne également les composés chimiques organiques sous forme d'un complexe, comprenant de l'amylose assemblé avec au moins une molécule organique d'intérêt, dans lesquels ladite molécule organique d'intérêt se présente sous une forme dérivée lipophilique, portant une chaîne aliphatique grasse greffée.

Description

PROCEDE POUR LA PREPARATION DE COMPLEXES COMPRENANT DE L'AMYLOSE ASSEMBLE AVEC AU MOINS UNE MOLECULE ORGANIQUE D'INTERET
DOMAINE DE L'INVENTION
La présente invention se rapporte aux procédés pour la préparation de complexes dont l'amylose constitue la « molécule hôte », ainsi que les complexes issus de ces procédés.
ART ANTERIEUR
L'amidon est un polysaccharide d'origine végétale. C'est la principale source et réserve glucidique synthétisée par les végétaux supérieurs (céréales, tubercules et légumineuses) au cours de la photosynthèse.
L'amidon se présente à l'état natif sous forme de grains d'une taille variant de un micron à une centaine de microns suivant l'origine botanique.
L'amidon est constitué de deux fractions : une fraction glucidique très majoritaire (98 à
99 %) et une fraction non glucidique très minoritaire (0,1 à 2 %).
La fraction glucidique de l'amidon est principalement constituée d'un mélange de deux polymères α-D glucopyranosyl, à savoir l'amylopectine et l'amylose, en proportions variables en fonction de l'origine de l'amidon.
L'amylose représente environ 20 à 30 % de la partie glucidique des amidons. Mais cette quantité peut atteindre jusqu'à 80 % pour certaines variétés de maïs (Zea mays), d'orge
(Hordeum vulgaré), de riz (Oriza sativa) ou de pois (Pisum sativum).
L'amylose est une molécule essentiellement linéaire, composée de 500 à 6000 unités a-
D glucopyranosyl, réparties sur 1 à 20 chaînes différentes d'un degré de polymérisation moyen de 500.
La masse molaire de l'amylose est généralement comprise entre 2.105 et 2.106 g/mol et dépend de l'origine botanique mais aussi de la méthode de fractionnement utilisée.
Une population d'amylose est hétérogène, avec une polydispersité généralement comprise entre 1 ,3 et 2,1 mais qui atteint parfois des valeurs plus élevées (5-10).
L'amylose est connu pour son aptitude à former des complexes stables avec d'autres molécules, c'est-à-dire une association moléculaire dans laquelle l'amylose constitue une molécule « hôte » (récepteur ou séquestrant) et la ou les molécules d'intérêt forment des molécules « invitées » (substrat ou agent complexant).
Les liens entre la molécule « hôte » et la molécule « invitée » sont des interactions faibles (en particulier des liaisons non-covalentes). Les complexes rencontrés consistent très généralement en des complexes dits « d'inclusion » (dits encore tout simplement « clathrate »). La molécule « invitée » est alors encapsulée de façon totale, ou partielle, dans la molécule « hôte ».
Plus précisément, l'amylose est susceptible de se complexer avec les molécules hydrophobes (ou lipophiles) du fait de son caractère essentiellement linéaire, et de la présence quasi-exclusive de liaisons de type a-(1 ,4).
Cette complexation est fondée sur un réarrangement conformationnel qui est induit par l'agent complexant et qui aboutit à une nouvelle conformation hélicoïdale en simples hélices (6 unités glucose par tour), dans laquelle les groupements hydrophiles de la chaîne sont tournés vers l'extérieur et les groupements hydrophobes vers l'intérieur. Il en résulte la formation d'une cavité hélicoïdale hydrophobe dans la simple hélice d'amylose, pouvant être occupée par les composés hydrophobes.
Ce phénomène de complexation avec l'amylose est employé dans les techniques dites « d'encapsulation moléculaire ».
Les techniques d'encapsulation moléculaire avec l'amylose permettent la protection d'une molécule d'intérêt qui est normalement sensible vis-à-vis de l'oxydation, de l'hygroscopie, de l'interaction avec d'autres composants, de la lumière, de l'acidité et l'alcalinité et/ou encore de l'évaporation.
Elles permettent d'en faciliter l'utilisation, de masquer le goût et l'odeur, d'augmenter la stabilité et de contrôler le mode de libération (thermique, enzymatique, mécanique).
La formation de complexes avec l'amylose permet également d'incorporer et de stabiliser une molécule hydrophobe dans un milieu aqueux.
Cette technique peut être utilisée pour l'encapsulation moléculaire de principes actifs d'intérêt dans les domaines pharmaceutique, cosmétique et agro-alimentaire.
Un grand nombre de molécules possède ce type de propriété complexante vis-à-vis de l'amylose, notamment les molécules hydrophobes du genre acides gras et alcools gras.
Mais de nombreuses autres molécules d'intérêt ne sont pas aptes à former de tels complexes avec l'amylose.
C'est notamment le cas pour la plupart des antioxydants, par exemple les composés phénoliques, notamment du fait de leur encombrement, de leur structure et/ou de leur polarité.
Or, parmi les antioxydants naturels, les composés phénoliques, et plus particulièrement les acides phénoliques, suscitent un intérêt grandissant. Ces molécules, tout en protégeant de l'oxydation, agissent contre le stress oxydatif (dégâts causés dans l'organisme par l'action des radicaux libres) et contribuent à la prévention de certaines affections comme les maladies cardiovasculaires, les cancers, les problèmes articulaires et les maladies neurovégétatives. La mise en œuvre de ces composés phénoliques dans les formulations de type émulsions est délicate (molécules fragiles et facilement oxydables) et peut s'accompagner d'une diminution de leur efficacité à protéger les lipides contre l'oxydation, mais aussi contribuer à une perte de leur apport nutritionnel. En effet, dans la phase aqueuse sont souvent produits les premiers radicaux libres (c'est le milieu au travers duquel diffuse l'oxygène en provenance du milieu extérieur).
De plus, après ingestion, le pouvoir antioxydant potentiel des composés phénoliques vis-à-vis des lipides et des protéines du système digestif est susceptible d'être limité ou neutralisé, par la formation de nouvelles interactions avec des protéines ou bien avec la matrice alimentaire, au niveau buccal et gastro-intestinal, et en particulier si les fonctions phénoliques se retrouvent bloquées.
Compte tenu de ce qui précède, il serait particulièrement intéressant de pouvoir complexer l'amylose avec ces molécules d'intérêt, de manière à protéger ces dernières par phénomène d'encapsulation moléculaire.
Le document Lay et al. (Carbohydrate Polymers 83 (201 1 ) 1869 - 1878) étudie la formation de complexes entre l'amylose et des dérivés de composés d'intérêt sous une forme estérifiée : l'ascorbyl palmitate (AP), le rétinyl palmitate (RP) et le phytostérol esters (PE).
Des complexes seraient obtenus dans le cadre d'un protocole nécessitant l'emploi d'un solvant polaire organique, à savoir le diméthylsulfoxyde (noté aussi DMSO), avec chauffage à 90 °C durant 1 heure. Une fois les complexes formés, ce solvant polaire organique doit encore être éliminé par lavage à l'éthanol.
Or, l'emploi de solvants polaires organiques et d'éthanol constitue un obstacle dans les applications pharmaceutiques, cosmétiques ou agro-alimentaires.
En outre, ce document Lay et al. ne démontre aucunement que cette démarche permet effectivement l'obtention de complexes d'inclusion, avec l'emprisonnement de la chaîne aliphatique grasse greffée dans la cavité hélicoïdale de la simple hélice d'amylose ainsi formée.
De plus, les complexes obtenus présenteraient une forme cristalline, avec un pourcentage de cristallinité significatif compris entre 20 et 35%.
Du fait de cette forme cristalline, les complexes élaborés se présentent automatiquement sous la forme de poudre. Or, ce phénomène génère une difficulté supplémentaire lors de la réincorporation de ces complexes dans des bases alimentaires, car leur température de fusion relativement élevée (1 10 °C environ) est rarement, voire jamais atteinte, en cuisson alimentaire.
Il existe par conséquent un besoin pour de nouveaux procédés permettant la préparation de complexes entre, d'une part, l'amylose et, d'autre part, des molécules organiques d'intérêt qui ne sont pas aptes, de façon intrinsèque, à former des complexes avec cette molécule « hôte ».
RESUME DE L'INVENTION
La présente invention porte sur un procédé pour la préparation de complexes comprenant de l'amylose assemblé avec au moins une molécule organique d'intérêt.
Ce procédé est caractérisé par le fait qu'il comprend les étapes suivantes :
(a) une étape de lipophilisation consistant à greffer une chaîne aliphatique grasse sur la molécule organique d'intérêt, pour la préparation d'un dérivé lipophilique de ladite molécule organique d'intérêt,
(b) une étape de mise en contact entre (i) ledit dérivé lipophilique de ladite molécule organique d'intérêt portant ladite chaîne aliphatique grasse greffée, issu de ladite étape de lipophilisation (a), et (ii) ledit amylose, et
(c) une étape de formation desdits complexes amylose / dérivé lipophilique de la molécule organique d'intérêt.
Ces étapes de mise en contact (b) et de formation des complexes (c) consistent en un protocole hydro-thermique sous agitation.
Cette stratégie consiste à diminuer considérablement la polarité des molécules d'intérêt, par le greffage d'une chaîne aliphatique grasse.
Les inventeurs démontrent que cette démarche permet notamment de lui conférer une action complexante avec l'amylose, avantageusement par l'emprisonnement de la chaîne aliphatique grasse greffée dans la cavité hélicoïdale de la simple hélice d'amylose ainsi formée.
De plus, les inventeurs constatent que, de manière surprenante, les complexes obtenus ne présentent avantageusement aucune forme cristalline (complexe d'inclusion amorphe), ce qui permet notamment d'éliminer une éventuelle précipitation due à la formation de cristallites entraînant alors une forte instabilité dans la phase aqueuse gélifiée d'une émulsion.
De manière intéressante, les complexes obtenus par le procédé hydro-thermique selon l'invention peuvent se présenter soit sous forme de poudre soit sous forme de gel ; tel que développé par la suite, notamment pour l'amylose seul, il suffit pour cela de faire varier la température de solubilisation et la concentration de l'amylose dans la suspension de départ.
Les complexes obtenus sous forme de gel peuvent être directement utilisés comme phase aqueuse d'une émulsion, contribuant à la stabilité physique de l'émulsion et à l'enrichissement en principes actifs de cette émulsion.
Les complexes obtenus sous forme de poudre, avantageusement amorphe, ont l'intérêt de pouvoir être réincorporés par exemple dans des bases alimentaires, car leur température de fusion est relativement faible (environ 80 °C) ; une telle température est régulièrement atteinte et doit permettre la libération des principes actifs piégés dans les complexes lors de la cuisson notamment de pâtes (viennoiserie, pain...) enrichies en principes actifs protégés par l'amylose.
Selon un mode de réalisation préféré, le protocole hydro-thermique sous agitation comprend :
d'une part, pour l'étape de mise en contact (b) :
- la préparation d'une solution aqueuse contenant ledit dérivé lipophilique de ladite molécule organique d'intérêt portant ladite chaîne aliphatique grasse greffée, issu de ladite étape de lipophilisation (a), et d'une solution aqueuse contenant l'amylose,
- le mélange desdites solutions aqueuses pour l'obtention d'une solution mélange, avec ou sans préchauffage desdites solutions aqueuses,
d'autre part, pour l'étape de formation des complexes (c) :
- le maintien de ladite solution mélange sous chauffage et sous agitation, puis
- le refroidissement de ladite solution mélange.
Du fait de leur structure amorphe ou majoritairement amorphe, les complexes obtenus peuvent se présenter sous deux formes différentes, notamment en fonction de la température mise en œuvre pour la solubilisation de l'amylose seul dans sa solution aqueuse, à savoir - un précipité ou - un gel fluide.
La molécule organique d'intérêt est avantageusement choisie parmi les polyphénols, de préférence encore parmi les acides phénoliques.
Dans ce cas la molécule organique d'intérêt est avantageusement choisie parmi les acides hydroxycinnamiques ou les esters d'acides hydroxycinnamiques.
La molécule organique d'intérêt sous forme d'acide hydroxycinnamique est de préférence choisie parmi les acides féruliques, les acides p-coumariques, les acides o- coumariques, les acides caféiques et les acides sinapiques.
La molécule organique d'intérêt sous forme d'ester d'acide hydroxycinnamique est choisie de préférence parmi les acides caféoylquiniques, les acides p-coumaroylquiniques, les acides féruloylquiniques et les acides sinapoylquiniques, ou parmi les acides rosmariniques.
Dans ce dernier cas, l'étape de lipophilisation (a) consiste avantageusement à greffer la chaîne aliphatique grasse sur le groupement quinique de la molécule organique d'intérêt, de préférence encore sur l'une des fonctions hydroxyles du groupement quinique de la molécule organique d'intérêt.
En particulier, la molécule organique d'intérêt consiste avantageusement en du 5-0- caféoylquinique ; l'étape de lipophilisation (a) consiste à greffer la chaîne aliphatique grasse sur le groupement hydroxyle en position 3 ou en position 4 du groupement quinique de ladite molécule organique d'intérêt. D'autres caractéristiques avantageuses, pouvant être prises indépendamment ou en combinaison, sont développées ci-dessous :
- le dérivé lipophilique de la molécule organique d'intérêt, issu de l'étape de lipophilisation (a), comporte une chaîne aliphatique grasse greffée comprenant (voir consistant en) un groupement alkyle linéaire (non-ramifié), comportant une longueur de chaîne comprise de préférence entre 12 et 16 atomes de carbone, bornes incluses ;
- l'étape de formation des complexes (c) est mise en œuvre de sorte à obtenir des complexes d'inclusion (avantageusement amorphe), dans lesquels la chaîne aliphatique grasse des dérivés lipophiliques de composés organiques d'intérêt est incluse dans l'une des hélices de l'amylose associé ;
- lors de l'étape de mise en contact (b), la molécule d'amylose consiste en de l'amylose seul ou en de l'amylose sous forme d'amidon.
La présente invention concerne encore un composé chimique organique sous forme d'un complexe, comprenant de l'amylose assemblé avec au moins une molécule organique d'intérêt ; cette molécule organique d'intérêt se présente sous une forme dérivée lipophilique, portant une chaîne aliphatique grasse greffée.
Ce composé chimique organique est avantageusement obtenu par la mise en œuvre du procédé développé ci-dessus.
La molécule organique d'intérêt, portant la chaîne aliphatique grasse greffée, est telle que définie ci-dessus.
En particulier, cette molécule organique d'intérêt est avantageusement choisie parmi les acides caféoylquiniques, les acides p-coumaroylquiniques, les acides féruloylquiniques et les acides sinapoylquiniques, ou parmi les acides rosmariniques.
Dans ce cas, le dérivé lipophilique de la molécule organique d'intérêt porte avantageusement la chaîne aliphatique grasse greffée sur son groupement quinique, de préférence sur l'un des oxygènes lié par liaison covalente au groupe cyclohexyle du groupement quinique.
De préférence, le dérivé lipophilique de la molécule organique d'intérêt consiste en un 5- O-caféoylquinique, dont la chaîne aliphatique grasse greffée est portée par l'atome d'oxygène en position 3 ou en position 4 du groupement quinique.
La chaîne aliphatique grasse greffée comporte avantageusement (voir consiste en) un groupement alkyle linéaire (non-ramifié), dont la longueur de chaîne est avantageusement comprise entre 12 et 16 atomes de carbone, bornes incluses.
Le composé chimique organique est avantageusement sous forme d'un complexe d'inclusion (avantageusement amorphe ou majoritairement amorphe), dans lesquels la chaîne aliphatique grasse greffée des dérivés lipophiliques de composés organiques d'intérêt est incluse dans l'une des hélices de l'amylose associé.
DESCRIPTION DES FIGURES
Figure 1 : Thermogramme analyse enthalpique différentielle (« AED ») de l'amylose seul ;
Figure 2 : Thermogramme AED de l'assemblage amylose / acide chlorogénique : (A) montée 1 , (B) descente, (C) montée 2 ;
Figure 3 : Thermogramme AED de l'assemblage amylose / chlorogénate d'hexadécyle : (A) montée 1 , (B) descente, (C) montée 2 ;
Figure 4 : Thermogramme AED de l'assemblage amylose / acide 3-O-palmitoyle chlorogénique : (A) montée 1 , (B) descente, (C) montée 2 ;
Figure 5 : Thermogramme AED de l'assemblage amylose / acide 4-O-palmitoyle chlorogénique : (A) montée 1 , (B) descente, (C) montée 2 ;
Figure 6 : Diagramme de diffraction des rayons X pour (A) l'amylose seul, (B) l'assemblage amylose / acide chlorogénique, (C) l'assemblage amylose/acide 4-O-palmitoyle chlorogénique, (D) l'assemblage amylose/acide 3-O-palmitoyle chlorogénique et (E) l'assemblage amylose / chlorogénate d'hexadécyle ;
Figure 7 : Spectre RMN 3C à l'état solide (CP-MAS) pour (A) l'amylose seul, (B) l'assemblage amylose / acide chlorogénique, (C) l'assemblage amylose/acide 4-O-palmitoyle chlorogénique, (D) l'assemblage amylose/acide 3-O-palmitoyle chlorogénique et (E) l'assemblage amylose / chlorogénate d'hexadécyle ;
Figure 8 : Modèle schématique du complexe amylose / acide 4-O-chlorogénique acide. DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION
La présente invention fournit ainsi un nouveau procédé pour la préparation de complexes comprenant l'amylose encapsulant au moins une molécule organique d'intérêt, cette dernière n'étant à l'origine pas apte à former de tels complexes avec l'amylose.
Cette invention concerne en particulier un procédé de préparation de complexes dans lequel les étapes suivantes sont mises en œuvre :
(a) une étape de lipophilisation consistant à greffer une chaîne aliphatique grasse sur ladite molécule organique d'intérêt, pour la préparation d'un dérivé lipophilique de ladite molécule organique d'intérêt,
(b) une étape de mise en contact entre (i) ledit dérivé lipophilique de ladite molécule organique d'intérêt portant ladite chaîne aliphatique grasse greffée, issu de ladite étape de lipophilisation (a), et (ii) ledit amylose, et (c) une étape de formation desdits complexes amylose / dérivé lipophilique de la molécule organique d'intérêt,
lesquelles étapes de mise en contact et de formation consistent en un protocole hydrothermique sous agitation.
Molécule organique d'intérêt
La molécule organique d'intérêt consiste avantageusement en une molécule bioactive. Cette molécule organique d'intérêt, à l'état natif (avant l'étape de lipophilisation), n'est pas apte à former un complexe avec l'amylose (molécule à l'état natif non-complexable avec l'amylose).
En particulier, cette molécule organique d'intérêt ne comporte avantageusement pas, de façon intrinsèque, un groupement ou radical (de préférence une chaîne latérale, avantageusement un groupement latéral alkyle linéaire) capable de se loger dans une simple hélice de l'amylose.
La molécule organique d'intérêt est choisie avantageusement parmi les molécules comportant une activité antioxydante, de préférence encore parmi les polyphénols.
Par « activité antioxydant », on entend avantageusement une molécule qui diminue, ou empêche, l'oxydation d'autres substances chimiques. On entend encore avantageusement une molécule capable de neutraliser, ou de réduire, les dommages causés par les radicaux libres dans l'organisme.
Par « polyphénols », ou « composés phénoliques », on entend en particulier les molécules organiques comportant un ou plusieurs cycles aromatiques (ou cycles benzéniques), portant une ou plusieurs fonctions hydroxyles.
Tous les végétaux contiennent de tels composés phénoliques mais, comme c'est le cas pour la plupart des substances naturelles qualifiées de métabolites secondaires, leur répartition qualitative et quantitative est inégale selon les espèces, les organes, les tissus et les stades physiologiques.
Les composés phénoliques sont connus pour différentes actions : anticancérigène pour certains d'entre eux, et antioxydante permettant de lutter contre le vieillissement cellulaire.
Les composés phénoliques peuvent être regroupés en classes qui se différencient d'abord par la complexité du squelette de base (allant d'un simple C6 à des formes très polymérisées extrêmement complexes), ensuite par le degré de modification de ce squelette (degré d'oxydation, etc.), enfin par les liaisons possibles de ces molécules de base avec d'autres molécules (glucides, lipides, protéines, etc.).
Ainsi, dans le cas de tels composés phénoliques, la molécule organique d'intérêt est avantageusement choisie parmi les acides phénoliques. Un acide phénolique (ou « acide-phénol ») est un composé organique possédant au moins une fonction carboxylique et un hydroxyle phénolique.
Par « acide phénolique », on entend notamment :
(i) les composés dérivés de l'acide benzoïque, à savoir les acides hydroxybenzoïques, et
(ii) les composés dérivés de l'acide cinnamique, à savoir les acides hydroxycinnamiques ou les esters d'acides hydroxycinnamiques.
Les acides hydroxybenzoïques ont la formule (I) suivante :
Figure imgf000010_0001
Les acides hydroxybenzoïques sont dérivés de l'acide benzoïque et ont une formule de base de type C6-C1 , parmi lesquels les plus abondants dans le règne végétal sont les acides gallique, protocatéchique, vanillique et syringique.
Les acides hydroxycinnamiques ont quant à eux la formule (II) suivante :
Figure imgf000010_0002
Figure imgf000011_0001
Ces acides hydroxycinnamiques représentent une classe très importante dont la structure de base (C6-C3) dérive de celle de l'acide cinnamique. Dans cette subdivision, on rencontre en particulier les acides caféique, férulique, p-coumarique et sinapique.
Les esters d'acides hydroxycinnamiques (ou hydroxycinnamates) comportent quant à eux généralement un groupe glucose, acide quinique ou acide tartarique.
La famille des hydroxycinnamates regroupe en particulier les esters des acides caféique, férulique et p-coumarique avec l'acide quinique, mais également l'acide rosmarinique qui est un ester particulier de l'acide caféique et de l'acide 3-(3,4)-dihydroxyphényl-lactique.
La molécule organique d'intérêt consiste avantageusement en « l'acide chlorogénique » en tant que tel, c'est-à-dire l'ester de l'acide caféique et de l'acide (L)-quinique 3 (désignée encore trans-5-O-caféoyl-D-quinate, ou acide caféylquinique, ou 5-ACQ (ou « 5-CQA » en anglais) ou 5-O-caféylquinique).
La formule (III) de l'acide chlorogénique est la suivante :
Figure imgf000011_0002
Par « acide chlorogénique », on désigne aussi la famille des acides dont la structure chimique est similaire à l'acide chlorogénique précité, et qui regroupe les composés formés par un (ou plusieurs) acide hydroxycinnamique conjugué avec l'acide quinique.
La molécule organique d'intérêt englobe ainsi les composés formés d'acides hydroxycinnamiques conjugués à l'acide quinique, formant la « classe (ou famille) des acides chlorogéniques » dont la formule (IV) est la suivante :
Figure imgf000012_0001
Ainsi, par « famille des acides chlorogéniques », on entend les mono-esters, notamment l'acide caféylquinique (ACQ), l'acide férulylquinique (AFQ), l'acide p-coumarylquinique (APQ), l'acide sinapylquinique, l'acide diméthoxycinnamylquinique.
Par « famille des acides chlorogéniques », on entend également les di-esters, à savoir notamment l'acide dicaféylquinique, l'acide caféylférulylquinique, l'acide diférulylquinique, l'acide di-p-coumarylquinique, l'acide diméthoxycinnamylquinique.
Par « famille des acides chlorogéniques », on entend enfin les formes isomériques. Par exemple, suivant que la liaison se fait en position 3, 4 ou 5 sur les hydroxyles de l'acide quinique, on englobe :
- les 3-O-caféylquinique, 4-O-caféylquinique et 5-O-caféylquinique, pour les acides caféylquiniques (ACQ) ;
- les 3-O-férulylquinique, 4-O-férulylquinique et 5-O-férulylquinique, pour les acides férulylquiniques ; et
- le 3-O-p-coumarylquinique, le 4-O-p-coumarylquinique et le 5-O-p-coumarylquinique, pour les acides p-coumarylquiniques.
On rencontre aussi des composés formés de plusieurs acides hydroxycinnamiques conjugués avec un acide quinique, comme les acides 1 ,3-O-dicaféylquinique, 3,4-0- dicaféylquinique, 3,5-O-dicaféylquinique, etc., ou bien l'acide caféylférulylquinique.
L'acide rosmarinique présente quant à lui la formule (V) suivante :
Figure imgf000013_0001
Sur l'étape de lipophilisation
L'étape de lipophilisation (a) a pour objectif de fonctionnaliser la molécule organique d'intérêt de sorte à lui conférer des propriétés d'un agent de complexation avec l'amylose.
Par « lipophilisation », on entend la réaction chimique consistant à rapporter, par une liaison covalente, une chaîne aliphatique grasse sur un groupement récepteur de la molécule organique d'intérêt.
La chaîne aliphatique grasse greffée (ou chaîne latérale aliphatique grasse), rapportée sur la molécule organique d'intérêt, comporte (avantageusement consiste en) avantageusement un groupement (ou radical) organique (avantageusement hydrocarboné) acyclique, linéaire non-branché, saturé.
De préférence encore, cette chaîne aliphatique grasse greffée comporte, voire consiste en, une chaîne grasse linéaire saturée non-ramifiée, avantageusement encore un groupement alkyle linéaire non-ramifiée (formule CnH2n+i ).
Cette chaîne aliphatique grasse greffée comporte avantageusement une longueur de chaîne carbone choisie parmi 12, 14, 16, 18, 20 ou 22 atomes de carbone, et de préférence encore choisie parmi 12 (groupe lauryle ou dodécyle), 14 (groupe myristyle ou tétradécyle) ou 16 (groupe palmityle ou hexadécyle) atomes de carbone.
Cette étape de lipophilisation (a) est choisie parmi les protocoles permettant l'obtention d'une molécule organique d'intérêt sur laquelle est rapportée, par une liaison covalente, une unique chaîne aliphatique grasse.
Dans la présente description, le produit issu de cette opération de lipophilisation est désigné sous l'appellation de « dérivé lipophilique » (ou de « dérivé lipophile » ou de « dérivé lipophilisé ») de la molécule organique d'intérêt. Pour des molécules organiques d'intérêt appartenant aux polyphénols, on parlera ainsi de « dérivés lipophiliques de polyphénols ».
Les procédés de lipophilisation des polyphénols, par greffage de chaînes aliphatiques grasses, sont connus de l'état de la technique. On peut se référer notamment aux documents suivants : Figueroa-Espinoza et Villeneuve, 2005 (J. Agric. Food. Chem., 53 :2779-2787) ; Villeneuve et al. 2007 (Biotechn. Adv. 25 : 515-536), Lopez et al., 2007 (Enz. Microb. Tech., 41 :721 -726 ; Ol Corps Gras Lipides, 14 :51 -59).
Ces réactions de synthèse de tels dérivés lipophiliques de polyphénols sont avantageusement des réactions d'acylation ou d'alkylation.
La réaction « d'acylation » peut être définie comme l'établissement d'une liaison covalente entre un groupe acyle et une fonction nucléophile telle qu'une fonction hydroxyle.
La réaction « d'alkylation » peut quant à elle être définie comme une réaction chimique constituée du transfert d'un groupement alkyle d'une molécule organique à une autre.
La réaction de synthèse, acylation ou alkylation, est choisie suivant la nature du polyphénol, en particulier s'il présente, ou non, une fonction hydroxyle ou carboxyle (groupe des acides phénoliques ou des flavonoïdes et lignanes).
Ainsi, en pratique :
- si les donneurs d'acyle sont des alcools gras ou des esters d'alcool gras et que la lipophilisation a lieu sur des acides phénoliques, la réaction sera appelée réaction « d'alkylation » ;
- si les donneurs d'acyle sont des acides gras ou des esters d'acides gras et que la lipophilisation a lieu sur d'autres polyphénols et en particulier sur les parties glycosylées des flavonoïdes, la réaction sera appelée réaction « d'acylation ».
La présence d'une partie quinique portant des hydroxyles non phénoliques et un groupement carboxyle (ainsi qu'une partie caféique présentant des hydroxyles phénoliques), fait de l'acide chlorogénique un des rares polyphénols qui permet d'envisager la synthèse de dérivés par alkylation et aussi par acylation.
La réaction d'alkylation est par exemple décrite dans le document Lopez-Giraldo et al., 2007 (OCL 2007, 14 :51 -9 ; et Enz. Micro. Tech. 41 :721 -6). La réaction de synthèse enzymatique par acylation est quant à elle par exemple décrite dans le document Lorentz et al., 2010 (Biotechnol Lett 32 : 1955-1960).
Ces réactions de lipophilisation de polyphénols sont connues pour permettre la synthèse de molécules présentant non seulement des activités antioxydantes, mais aussi des propriétés pharmacologiques, des activités tensioactives, ou antimicrobiennes, correspondant au concept de composés multifonctionnels. Cette lipophilisation peut être mise en œuvre par une voie de synthèse chimique ou par une voie de synthèse enzymatique, qui sont classiques en soi.
Le protocole est choisi en fonction de la molécule organique d'intérêt à fonctionnaliser, tenant compte notamment du groupement récepteur souhaité tel que développé après.
> Synthèse par voie chimique
Plusieurs méthodes ont été décrites pour la synthèse par voie chimique de dérivés lipophiliques de composés organiques, notamment de dérivés lipophiliques de polyphénols.
Cette synthèse par voie chimique peut, par exemple, être choisie parmi :
(i) l'acylation de la molécule organique d'intérêt par des chlorures d'acide gras dans des solvants anhydres (Zhong et Shahidi, 201 1 , J. Agric. Food. Chem 59(12) pp. 6526-6533 ; Fukami et al., 2008, US-20080058409 ; Xiang et Ning, 2008, Swiss. Soc. Food. Sci. Tech, 41 :1 189-1203) ;
(ii) l'acylation de la molécule organique d'intérêt par des acides gras et par des alcools gras (saturés, mono-insaturés, ramifiés ou non) sur les fonctions hydroxyles et carboxyles avec ou sans catalyseur (par exemple Ν,Ν'-dicyclohexylcarbodiimide (DCC) et/ou chlorure de thionyle (SOCI2)).
D'autre part, des réactions de couplage régiosélectif avec des cétones ont aussi été décrites (Poaty et al., 2009, European Food Research and Technology 230 : 1 1 1 -1 17).
> Synthèse par voie enzymatique
De façon générale, les principaux inconvénients des méthodes chimiques sont l'obtention de sous-produits, l'utilisation de solvants ou catalyseurs toxiques et la production de mélanges d'esters ou d'isomères portant un nombre variable de chaînes carbonées qu'il faut séparer. De plus, le greffage implique parfois des hydroxyles responsables de l'activité antioxydante (utilisation de chlorure d'acide gras). Les méthodes de protection et de déprotection de groupements hydroxyles sont aussi largement utilisées pour permettre de choisir le site de réaction et le degré d'estérification mais ce sont souvent des étapes complexes et fastidieuses.
Les enzymes sont a contrario un outil de synthèse précieux en matière de conditions de réaction douce et de régiosélectivité. De plus, la demande croissante en produits d'intérêt thérapeutique, agroalimentaire ou cosmétique parallèlement aux exigences en matière de procédés de synthèse respectueux de l'environnement, renforce l'intérêt de l'utilisation des biocatalyseurs. En effet, les enzymes peuvent se substituer aux catalyseurs chimiques et répondre aux exigences du développement industriel durable. Elles peuvent augmenter l'efficacité de production et réduire, pour celles qui agissent à température ambiante, la consommation d'énergie. Beaucoup de procédés industriels fonctionnent à haute température ou haute pression ou dans des conditions hautement acides ou basiques. Au niveau industriel, les avantages de l'utilisation des enzymes, malgré leur coût parfois élevé, sont des étapes de purification simplifiées, ainsi que des conditions expérimentales douces évitant la dégradation des substrats et permettant la réutilisation du biocatalyseur (Villeneuve, 2007). La biocatalyse permet d'envisager la production sélective de structures complexes et originales.
Pour la lipophilisation de molécules organiques d'intérêt appartenant aux polyphénols, différentes enzymes peuvent être mises en œuvre, telles que les lipases, transférases, isomérases, estérases et protéases. Toutefois, les lipases sont les plus fréquemment utilisées pour ce type de biotransformation (Figueroa-Espinoza et Villeneuve, 2005 ; Chebil et al., 2006, J. Agric. Food. Chem. 55 :9496-9502).
Par « lipases », on entend les enzymes triacylglycérol hydrolases, classe EC 3.1 .1 .3
(selon la classification INTERNATIONAL UNION OF BIOCHEMISTRY AND MOLECULAR BIOLOGY), appartenant à la famille des hydrolases d'esters carboxyliques.
La lipase provient avantageusement d'un microorganisme (bactérie ou champignon), tels que Aspergillus niger, Candida rugosa, Candida lipolytica, Rhizopus oryzae, Pénicillium camembertii, Pénicillium roquefortii et Mucor javanicus, Cette enzyme peut aussi provenir de plantes ou d'animaux.
L'étape de lipophilisation (a), du procédé selon l'invention, peut en particulier être mise en œuvre avec l'une des enzymes suivantes.
Novozym 435 est une préparation industrielle produite par Novozymes (Dk) et commercialisée par Sigma, résultant de l'immobilisation de l'isoforme B de la lipase de Candida antarctica sur une résine acrylique macroporeuse. Cette préparation se présente sous forme de microbilles blanches de diamètre compris entre 0,3 et 0,9 mm. Elle est fournie avec une activité de 7000 U/g (1 unité est définie comme étant la quantité d'enzyme qui permet la transformation d'une μηιοΐβ d'acide laurique en laurate de propyle par minute en conditions standards et équimolaires). Sa teneur en eau est de 1 à 2 % (p/p) et sa teneur en protéines enzymatiques est comprise entre 1 et 10 %.
Lipozyme RM est une préparation produite et commercialisée par Novozymes (Dk) résultant de l'immobilisation de la lipase de Mucor miehei sur une résine macroporeuse échangeuse d'anions. Cette préparation se présente sous forme de microbilles brunes de diamètre compris entre 0,2 et 0,6 mm. Elle est fournie avec une activité minimale de 42 U/g (1 unité correspond à la quantité d'enzyme qui permet la libération d'une μηιοΐe d'acide oléique par minute à pH 8,0 à 40^ lors de l'hydrolyse de la trioléine).
La lipase de Pseudomonas cepacia immobilisée sur terre de diatomée est une préparation produite par Amano Enzymes (UK) et commercialisée par Sigma. Cette préparation se présente sous forme de microbilles beiges et est fournie avec une activité minimale de 500 U/g (1 unité correspond à la quantité d'enzyme qui permet la libération d'une μηιοΐe d'acide oléique par minute à pH 8,0 à 40 ºC lors de l'hydrolyse de la trioléine).
Lipozyme TL est une préparation produite et commercialisée par Novozymes (Dk) résultant de l'immobilisation de la lipase de Thermomyces lanuginosa sur des billes de silice. Cette préparation se présente sous forme de microbilles blanches.
De manière générale, pour un ester d'acide phénolique, l'étape de lipophilisation (a) du type « alkylation » est avantageusement réalisée par estérification directe à partir d'alcool gras en présence de Novozym 435 (Résine acrylique lipase de Candida antarctica - SIGMA), avec ou sans solvant.
La capacité de Novozym 435 à catalyser l'alkylation de l'acide chlorogénique avec des alcools gras saturés et insaturés de longueurs de chaîne variables (C8 à C18) a été étudiée. Des esters d'acide chlorogénique ont en effet été synthétisés par estérification directe (Guyot et al., 2000, Eur. J. Sci. Technol. 102 :93-96) et par transestérification (Lopez-Giraldo et al., 2007) en présence de Novozym 435.
La bioconversion et le temps de réaction sont améliorés au moyen d'une stratégie chemo- enzymatique qui consiste en une méthylation de l'acide chlorogénique suivie d'une transestérification du chlorogénate de méthyle en milieu fondu (Lopez-Giraldo et al., 2007).
Dans le cadre d'une telle réaction d'alkylation, le donneur d'alcool consiste avantageusement en un alcool gras saturé, linéaire (non-ramifié), dont la longueur de chaîne carbone est choisie de préférence parmi C12, C14 ou C16.
Par « réaction d'acylation », on entend notamment (i) une réaction de transacylation ou (ii) une réaction d'acylation directe.
Pour une réaction de « transacylation », le donneur d'acyle est avantageusement choisi parmi les esters d'acides gras, de préférence soit des esters méthylique ou éthylique, soit des esters vinyliques.
De préférence encore, ces esters d'acides gras comprennent un groupement carboxyle consistant en une chaîne grasse linéaire saturée dont la longueur est de préférence choisie parmi C12, C14 ou C16.
Ces esters d'acides gras sont ainsi avantageusement choisis parmi le laurate d'éthyle (C12), le palmitate d'éthyle (C16) et le stéarate d'éthyle (C18). Pour une réaction « d'acylation directe », le donneur d'acyle est avantageusement choisi parmi les acides gras saturés linéaires, et particulier l'acide laurique (C12), l'acide myristique (C14) et l'acide palmitique (C16).
De telles réactions de biosynthèse sont encore détaillées ci-après dans la partie Exemple, pour l'obtention de trois dérivés lipophiliques de l'acide chlorogénique, à savoir le chlorogénate d'hexadécyle (obtenu par alkylation), et les acides 4-O-palmitoyle chlorogénique et 3-O-palmitoyle chlorogénique (obtenus par acylation).
Sur le dérivé lipophilique de la molécule organique d'intérêt
Le dérivé lipophilique de la molécule organique d'intérêt, obtenu à l'issue de l'étape de lipophilisation (a) décrite ci-dessus, comporte un cœur constitué par la molécule organique d'intérêt décrite précédemment, portant une chaîne latérale aliphatique grasse greffée.
Le dérivé lipophilique de la molécule organique d'intérêt porte ainsi avantageusement une unique chaîne latérale aliphatique grasse.
Par « chaîne latérale », on entend une partie de molécule rattachée au cœur ou à la chaîne principale de la structure, c'est-à-dire à la molécule organique d'intérêt.
La chaîne aliphatique grasse greffée (ou chaîne latérale aliphatique grasse), rapportée sur la molécule organique d'intérêt, comporte avantageusement (éventuellement consiste en) un groupement (ou radical) organique acyclique, linéaire (non-branché), saturé.
De préférence encore, cette chaîne aliphatique grasse greffée comporte, voire consiste en, une chaîne grasse linéaire saturée non-ramifiée, avantageusement un groupement alkyle linéaire.
Cette chaîne aliphatique grasse greffée comporte de préférence une longueur de chaîne carbone choisie parmi 12, 14, 16, 18, 20 ou 22 atomes de carbone, et de préférence encore choisie parmi 12 (groupe lauryle ou dodécyle), 14 (groupe myristyle ou tétradécyle) ou 16 (groupe palmityle ou hexadécyle) atomes de carbone.
Selon un mode de réalisation particulier, la molécule organique d'intérêt sous forme d'ester d'acide hydroxycinnamique est choisie parmi les acides caféoylquiniques, les acides p- coumaroylquiniques, les acides féruloylquiniques et les acides sinapoylquiniques, ou parmi les acides rosmariniques.
Pour les molécules organiques comportant un groupement quinique (avantageusement acides caféoylquiniques, acides p-coumaroylquiniques, acides féruloylquiniques et acides sinapoylquiniques), le dérivé lipophilique d'une telle molécule organique d'intérêt porte avantageusement la chaîne aliphatique grasse greffée sur son groupement quinique. Dans ce cas, la chaîne aliphatique grasse greffée est portée de préférence encore par l'un des oxygènes lié par liaison covalente au groupe cyclohexyle du groupement quinique.
De préférence encore, le dérivé lipophilique de la molécule organique d'intérêt consiste en un cœur 5-O-caféoylquinique (correspondant à la molécule acide chlorogénique), dont la chaîne aliphatique grasse greffée est portée par l'atome d'oxygène en position 3 ou en position 4 du groupement quinique.
Le dérivé lipophilique d'une telle molécule organique d'intérêt est ainsi choisi parmi l'acide 3-O-lauroyle chlorogénique, l'acide 3-O-myristoyle chlorogénique, l'acide 3-O-palmitoyle chlorogénique, l'acide 4-O-lauroyle chlorogénique, l'acide 4-O-myristoyle chlorogénique ou l'acide 4-O-palmitoyle chlorogénique.
Par exemple, pour une chaîne latérale aliphatique grasse en C16, le dérivé lipophilique de la molécule organique d'intérêt consiste avantageusement en un acide 3-O-palmitoyle chlorogénique ou un acide 4-O-palmitoyle chlorogénique.
La formule chimique (VI) de l'acide 4-O-palmitoyle chlorogénique est rappelée ci- dessous :
Figure imgf000019_0001
La formule chimique (VII) de l'acide 3-O-palmitoyle chlorogénique est quant à elle rappelée ci-dessous :
Figure imgf000020_0001
Parmi les acides rosmariniques, les dérivés lipophiliques de telles molécules organiques d'intérêt présentent quant à eux avantageusement la formule (VIII) ci-dessous :
Figure imgf000020_0002
dans laquelle R, correspondant à la chaîne aliphatique grasse greffée, comprend (ou consiste en) un groupement alkyle (formule CnH2n+i ) dont la longueur de la chaîne carbone est avantageusement choisie parmi C12 (rosmarinate de dodécyle), C14 (rosmarinate de tétradécyle) ou C16 (rosmarinate d'hexadécyle).
Les dérivés lipophiliques de l'acide rosmarinique sont par exemple obtenus par catalyse au moyen d'une lipase Candida antarctica B (i) estérification directe ou (ii) transestérification par voie chimio-enzymatique.
Selon un autre mode de réalisation particulier, la molécule organique d'intérêt est choisie parmi les acides hydroxycinnamiques, et son dérivé lipophilique présente avantageusement la formule (IX) ci-dessous :
Figure imgf000021_0001
et dans laquelle R5, correspondant à la chaîne aliphatique grasse greffée, comprend (ou consiste en) un groupement alkyle (formule CnH2n+i ) dont la longueur de la chaîne carbone est avantageusement choisie parmi C12, C14 ou C16.
Selon encore un autre mode de réalisation particulier, la molécule organique d'intérêt est choisie parmi les acides hydroxybenzoïques, et son dérivé lipophilique présente avantageusement la formule (X) -dessous :
Figure imgf000021_0002
et dans laquelle R4, correspondant à la chaîne aliphatique grasse greffée, comprend (ou consiste en) un groupement alkyle (formule CnH2n+i ) dont la longueur de la chaîne carbone est avantageusement choisie parmi C12, C14 ou C16. Sur l'amylose
Les complexes selon l'invention peuvent être directement préparés à partir de l'amidon. Dans ce cas, l'amidon est avantageusement issu d'organes de réserve de plantes, par exemple :
- les graines (en particulier les céréales tels que le maïs, le froment, le blé), ou les légumineuses (tels que le pois), ou
- les tubercules et rhizomes (pomme de terre, patate douce, manioc, etc.).
Cependant, les complexes selon l'invention sont avantageusement préparés à partir d'amylose seul, notamment si l'on souhaite s'affranchir de la présence de l'amylopectine.
L'amylose peut être extrait à partir de grains d'amidons dispersés dans l'eau par reprécipitation sélective en présence d'alcool (butanol par exemple).
L'amylose peut également être synthétisé in vitro par voie enzymatique soit à partir d'ADP-glucose avec la 1 ,4-a-D-glucan 4- α-D-glucosyltransferase (Granule Bound Starch Synthase, GBSS), soit à partir de saccharose avec une amylosaccharase recombinante qui permet d'obtenir de l'amylose de DP de 35-58 hautement cristalline.
La 1 ,4-a-D-glucan : ortophosphate, α-glucosyl transferase (starch phosphorylase) est aussi utilisée pour produire de l'amylose à partir de glucose-1 -phosphate.
L'amylose peut encore être obtenu à partir d'amidon avec une enzyme débranchant : isoamylase ou pullulanase.
Les caractéristiques de l'amylose pour la formation de tels complexes sont encore précisées dans le document Godet et al., 1995 (Carbohydrate Polymers 27 :47-52). Etape de mise en contact et étape de formation des complexes
Les étapes de mise en contact et de formation des complexes consistent en un protocole hydro-thermique sous agitation, tel que décrit par exemple dans la partie Exemple ci- après.
Par « protocole hydro-thermique », on entend un procédé mis en œuvre à partir d'une ou plusieurs solutions aqueuses, soumises à un chauffage.
Un tel protocole hydro-thermique s'effectue ainsi à l'exclusion de tout solvant polaire organique, tel que le diméthylsulfoxyde (noté aussi DMSO).
Selon un mode de réalisation préféré, ce protocole hydro-thermique comprend tout d'abord, pour l'étape de mise en contact (b), la préparation deux solutions aqueuses : (i) une solution aqueuse contenant ledit dérivé lipophilique de ladite molécule organique d'intérêt portant ladite chaîne aliphatique grasse greffée, issu de ladite étape de lipophilisation (a), et
(ii) une solution aqueuse contenant l'amylose.
Par « solution aqueuse », on entend une solution dont le solvant est avantageusement constitué par l'eau.
Cette solution aqueuse est avantageusement dégazée pour éviter les phénomènes d'oxydation.
La solution aqueuse contenant l'amylose (ii) peut être obtenue à partir de l'amidon, destiné à subir une gélatinisation pour former un amidon gélatinisé.
Par « amidon gélatinisé », on entend un amidon dont l'amylose est sortie hors du grain d'amidon lors du chauffage de l'amidon en excès d'eau.
La température de gélatinisation de l'amidon est généralement inférieure à 90 ºC, avantageusement comprise entre 60 ºC et 80 ºC.
Ainsi, au cours du refroidissement qui suit la gélatinisation, l'amylose dispersé de l'amidon gélatinisé est destiné à former des complexes avec le dérivé lipophilique de la molécule organique d'intérêt.
La solution aqueuse contenant l'amylose (ii) peut encore être préparée à partir de l'amylose seul.
Dans ce second cas, la formation d'un grand nombre de complexes d'amylose nécessite une dispersion préalable de l'amylose dans une phase aqueuse (avantageusement pour former un hydrocolloïde) suivi de l'ajout du dérivé lipophilique de la molécule organique d'intérêt.
La dispersion de l'amylose peut être réalisée à chaud et sous pression (Biais et al., 2006 ; Doublier et al., Progr Colloid Polym Sci 90 :61 -65 (192)). Notamment en fonction de la température de dissolution, la solution aqueuse obtenue contient :
- un amylose dit « gélifié », avantageusement pour une température de dissolution inférieure à 160°C, par exemple comprise entre 140°C et 160°C, ou
- un amylose solubilisé (dit encore « solution d'amylose »), avantageusement pour une température supérieure à 160°C, par exemple comprise entre 160 ºC et 170 °C.
La dispersion de l'amylose peut encore être réalisée à froid dans une solution d'hydroxyde de sodium suivie d'une dialyse contre de l'eau ou une neutralisation (Buléon et al., 1990).
Les deux solutions aqueuses sont ainsi mélangées pour l'obtention d'une solution mélange.
Les deux solutions aqueuses (i) et (ii) peuvent être préchauffées préalablement à ce mélange, indépendamment l'une de l'autre, notamment pour assurer une dispersion optimale de l'amylose dans sa solution aqueuse (ii) ; cette approche est en particulier adaptée pour l'amylose seul faisant l'objet d'une dispersion à chaud comme indiqué ci-dessus, et pour un dérivé lipophilique de la molécule organique d'intérêt qui serait thermosensible.
De manière alternative, les deux solutions aqueuses (i) et (ii) peuvent être mélangées, sans préchauffage préalable ; cette démarche est en particulier adaptée pour une solution aqueuse contenant de l'amidon dont la température de gélatinisation a l'intérêt d'être moins élevée que la température de dispersion de l'amylose seul.
Ce protocole hydro-thermique comprend ensuite, pour l'étape de formation des complexes (c), le maintien de ladite solution mélange sous chauffage et sous agitation.
En particulier, cette solution mélange est avantageusement maintenue à une température comprise entre 60 °C et l OO 'C, de préférence entre 70 °C et 100°C, de préférence encore entre 70 ºC et 90 ºC.
Ce maintien à chaud s'effectue pendant une période d'au moins 5 minutes, de préférence de l'ordre de 10 minutes.
Par « agitation », on entend en particulier une agitation magnétique d'au moins 200 tours par minutes, de préférence de l'ordre de 220 tours par minutes.
Dans le cas d'une solution aqueuse contenant de l'amidon et en l'absence de préchauffage préalable au mélange des solutions aqueuses, ce chauffage est de préférence destiné également à assurer la transformation de l'amidon sous sa forme d'amidon gélatinisé.
A l'arrêt de l'agitation, du fait de leur structure amorphe ou majoritairement amorphe, les complexes se constituent soit par gélification sous une forme d'un gel fluide (en particulier pour l'amylose gélifié), soit par précipitation sous une forme de précipités (en particulier pour l'amylose solubilisé).
Pour cela, la solution mélange est avantageusement refroidie jusqu'à une température comprise entre 15ºC et 25°C, avantageusement au moins pendant 24 heures, de préférence pendant 48 heures, et
Dans le cas de complexes sous une forme de précipités, la solution mélange est ensuite avantageusement soumise à une centrifugation (par exemple d'au moins 2000 g, de préférence d'au moins 3500 g, pendant au moins 5 minutes et de préférence pendant au moins 30 minutes), pour la récupération du précipité constitué par lesdits complexes.
Avantageusement, ce précipité est placé sous une atmosphère de séchage jusqu'à équilibration de la masse, pour l'obtention d'une poudre.
Complexe amylose/dérivé lipophilique de la molécule organique d'intérêt
Le composé chimique organique sous forme de complexe, obtenu à l'issue du procédé de préparation développé ci-dessus, comprend de l'amylose assemblé avec le dérivé lipophilique de la molécule organique d'intérêt ou avec le dérivé lipophilique d'au moins deux molécules organiques d'intérêt différentes.
Ce composé chimique organique consiste ainsi en un complexe dans lequel l'amylose constitue une « molécule hôte » (récepteur ou séquestrant), et les dérivés lipophiliques associés correspondent aux « molécules invitées » (substrat ou agent complexant). L'amylose assure ainsi l'encapsulation moléculaire du dérivé lipophilique de la molécule organique d'intérêt.
Le composé chimique organique obtenu consiste avantageusement en un complexe d'inclusion (dit encore tout simplement « clathrate »), dans lequel la chaîne aliphatique grasse greffée des dérivés lipophiliques de la molécule organique d'intérêt est incluse dans l'une des hélices de l'amylose associé.
De préférence, ce complexe d'inclusion est amorphe, ou majoritairement amorphe. L'absence, ou la quasi-absence, de forme cristalline permet notamment d'éliminer le risque d'une éventuelle précipitation due à la formation de cristallites entraînant alors une forte instabilité dans la phase aqueuse gélifiée d'une émulsion.
Par « amorphe » ou « majoritairement amorphe », on entend avantageusement une absence de signature en diffraction des rayons X (DRX) (avantageusement aucun pic de diffraction correspondant à des complexes de type V), tout en mettant en évidence des complexes par l'analyse enthalpique différentielle (AED) et par RMN du solide tel que précisé ci-dessous.
Par « amorphe » ou « majoritairement amorphe », on entend avantageusement encore un pourcentage de cristallinité inférieur à 5%.
La caractérisation des assemblages amylose / dérivé lipophilique de la molécule organique d'intérêt, s'effectue avantageusement par trois techniques différentes que sont l'analyse enthalpique différentielle (AED), la diffraction des rayons X (DRX) et la RMN du solide.
La formation d'un complexe d'inclusion est avantageusement mise en évidence, d'une part, par la présence de l'endotherme de fusion en analyse enthalpique différentielle et par le caractère réversible de la formation au cours du refroidissement et, d'autre part, par la présence d'un singulet intense à 102,6ppm en RMN du solide.
En pratique, l'exemple ci-après démontre que les dérivés lipophiliques de l'acide chlorogénique sont aptes à former de tels complexes (avantageusement des complexes d'inclusion), avec l'amylose.
Ces résultats sont tout à fait transposables à toute autre molécule organique d'intérêt tel que défini précédemment.
Pour chacune de ces molécules organiques d'intérêt, il suffit de déterminer le groupement récepteur optimal pour la fixation de la chaîne aliphatique grasse, et éventuellement la longueur de cette dernière, qui permet la complexation de ce dérivé lipophilisé avec l'amylose.
Tel qu'abordé précédemment, le composé chimique organique sous forme de complexe peut être isolé sous une forme solide, par exemple une poudre (si précipitation) ou un film (pour un gel).
Ces formes solides sont par exemple décrites dans le document Doublier et al., 1989 (Carbohydrate Research 193 :215-226).
Le protocole hydro-thermique mis en œuvre pour élaborer les complexes amylose / dérivé lipophilique peut ainsi être adapté afin d'obtenir des complexes sous la forme de poudre, avantageusement une poudre amorphe. Le précipité obtenu permet notamment l'étude structurale des complexes avec les méthodes de caractérisation usuelles (RMN du solide, DRX et DSC).
Mais, selon la présente invention, les conditions de dispersion de l'amylose, notamment la variation de la température de solubilisation de l'amylose seul dans la phase aqueuse ainsi que la concentration de départ de la suspension d'amylose dans l'eau, autorisent l'obtention soit d'un gel d'amylose soit d'un précipité (Doublier et al., Progr Colloid Polym Sci 90 :61 -65, 1992).
Les complexes obtenus sont amorphes ou cristallisés à petite échelle (pas de signature propre de la structure V en DRX), ce qui limite la précipitation due en grande partie à la cristallisation des complexes après la phase de nucléation.
Ces complexes formés peuvent ainsi être conservés sous la forme de gel aqueux (plus ou moins fluide) en faisant varier la concentration d'amylose et la température de solubilisation de l'amylose seule ; il est ainsi possible de se servir de cette phase aqueuse gélifiée, contenant des molécules d'intérêt piégées par l'amylose, pour former une émulsion (huile dans eau).
Les molécules d'intérêt greffées présentent un caractère antioxydant bien marqué
(Laguerre et al., J. Agric. Food.Chem, 2009, 57, 1 1335-1 1342). Les complexes formés sous la forme solide (poudre) pourront donc être introduits directement dans des pâtes (viennoiserie ou autre) avant cuisson ; les complexes amorphes ayant une température de fusion nettement plus faible (80°C) que celle des complexes cristallins (1 10 °C), les molécules d'intérêt pourront être libérées lors de la cuisson (température atteignant en général 90 °C au cœur du produit).
Composition intégrant le composé chimique organique
Le composé chimique sous forme de complexe, selon l'invention, est avantageusement destiné à être intégré dans une composition, par exemple une composition alimentaire, une composition pharmaceutique ou une composition cosmétique. Le composé chimique sous forme de complexe peut être (i) préparé préalablement puis introduit dans la composition ou (ii) préparé directement au sein de cette composition.
Cette composition consiste par exemple en une émulsion (le composé chimique sous forme de complexe se retrouve alors avantageusement dans la phase aqueuse), en une solution aqueuse ou en un hydrogel.
Cette composition peut également consister en un milieu solide, par exemple un produit alimentaire.
Par exemple, la composition selon l'invention, contenant le composé organique sous forme complexe, peut être introduite dans un aliment ou peut consister en un aliment. L'invention est en particulier applicable aux compositions contenant de l'amylose, éventuellement sous forme d'amidon, par exemple les pâtes ou les produits de panification. Le composé organique sous forme de complexe peut être incorporé à un moment approprié au cours de la préparation de la composition. De manière alternative, le composé organique peut être formé directement au sein et au cours du procédé de préparation de la composition alimentaire (en particulier pour les compositions contenant de l'amidon).
Le composé chimique selon l'invention peut également être employé dans une application pharmaceutique ou une application cosmétique, seul ou dans une composition contenant notamment tout autre substance active souhaitée et/ou excipent approprié. Intérêt de la formation de complexes avec l'amylose
La formation de complexes avec l'amylose permet d'assurer l'encapsulation moléculaire des molécules organiques d'intérêt associées.
Une telle encapsulation moléculaire permet notamment :
- de protéger les molécules organiques d'intérêt contre l'oxydation,
- d'envisager une libération des molécules organiques d'intérêt, tout en conservant la chaîne aliphatique grasse au sein de l'hélice d'amylose, par digestion enzymatique, en particulier sous l'action des amylases pancréatiques ou des lipases intestinales, ou par attaque acide (lors de la digestion ou de la prédigestion),
- de masquer le goût des molécules organiques d'intérêt,
- de garantir la stabilité des molécules organiques d'intérêt, ou
- d'augmenter la biodisponibilité de ces molécules organiques d'intérêt.
En particulier, l'oxydation constitue probablement l'un des paramètres majeurs à l'origine de l'altération des produits alimentaires. Les dégradations oxydatives qui en résultent affectent les qualités nutritionnelles et sensorielles des produits et peuvent avoir des répercussions sur la santé du consommateur. La valorisation d'antioxydants d'origine végétale à des fins alimentaires représente ainsi un enjeu majeur pour la recherche et pour l'industrie. L'encapsulation moléculaire de l'acide chlorogénique, voire d'autres composés phénoliques, par l'amylose présente la particularité d'assurer, d'une part, la protection du ligand contre l'oxydation et, d'autre part, d'envisager une libération ciblée de la molécule organique d'intérêt par digestion enzymatique (sous l'action des amylases pancréatiques ou des lipases intestinales) ou sous l'action d'une attaque acide.
EXEMPLE
Matériels et méthodes
Matériels biologique et chimique
La lipase utilisée est Lipozym RM issue de M. miehei immobilisée sur une résine échangeuse d'ion et acheté auprès de la société NOVOZYMES (Dk).
Tous les solvants et les réactifs utilisés ont été obtenus de sources commerciales et étaient soit de qualité HPLC ou analytique.
Le palmitate de vinyle et des plaques de gel de silice ont été achetés chez Sigma-
Aldrich, France.
L'acide chlorogénique a été acheté chez Acros, en France, avec une pureté de 99%. L'amylose de pomme de terre (type III), essentiellement libre d'amylopectine, a été obtenu auprès de Sigma (France) et utilisé tel que reçu.
Synthèse enzymatique des dérivés lipophiliques acylés de l'acide chlorogénique
Deux dérivés lipophiliques de l'acide chlorogénique, à savoir l'acide 3-O-palmitoyle chlorogénique et l'acide 4-O-palmitoyle chlorogénique, ont été synthétisés par voie enzymatique selon un procédé similaire à celui décrit dans le document Lorentz et al., 2010, précité, moyennant quelques modifications.
Pour cela, l'acide chlorogénique, le palmitate de vinyle et le Lipozym RM ont été séchés pendant au moins deux jours sous P205, avant utilisation.
L'activité de l'eau (aw) du milieu réactionnel a été déterminée en utilisant un dispositif AqualabLite® (Decagon Devices Inc, Etats-Unis). L'activité de l'eau initiale de tous les milieux réactionnels ont été en dessous de 0,2.
Les réactions d'acylation ont été réalisées dans des tubes Eppendorf de 50 m L dans l'obscurité.
Le mélange réactionnel présente un rapport molaire (palmitate de vinyle/acide chlorogénique) de 40 dans 10 mL de 2-méthyl-2-butanol (2M2B). La concentration initiale de l'acide chlorogénique était de 28 mM. Le palmitate de vinyle et l'acide chlorogénique ont d'abord été solubilisés pendant 12 h dans 1 mL de 2M2B et agités à 1000 rpm à 60 'C dans un dispositif Eppendorf Thermomixer (Roucaire, Courtabeuf, France).
La réaction a été initiée par addition de 40 g/L d'enzyme et 200 g/L de tamis moléculaires (3À), préalablement séché pendant une nuit à 200 °C. 2M2B a également été préalablement séché sur tamis moléculaires (3À).
Des échantillons ont été retirés à différents moments pour surveiller la réaction par chromatographie sur couche mince (« CCM » ou « TLC » en anglais) et chromatographie en phase liquide à haute performance (« HPLC »), et purifié comme décrit dans Lorentz et al. (2010).
En fin de synthèse, l'enzyme immobilisée est séparée du milieu de synthèse par filtration à travers un filtre en verre (1 ,6 μιτι). La purification des produits est réalisée par chromatographie, soit sur couche mince préparative (CCM) ou sur colonne soit sur gel de silice ou bien de Sephadex.
Par exemple, les milieux réactionnels, préalablement filtrés afin d'éliminer l'enzyme, sont concentrés par évaporation sous pression réduite puis déposés sur une plaque de silice préparative 20 x 20 cm. La plaque est développée à l'aide d'un l'éluant puis révélée aux UV ou aux vapeurs d'iode afin de localiser la zone de migration du composé synthétisé. La silice localisée dans cette zone est alors décollée du support, puis le composé est désorbé dans 5 mL d'un mélange méthanol/chloroforme (50/50 v/v) sous agitation à 250 rpm pendant 10 min, ceci à deux reprises. Le mélange est alors filtré puis évaporé à sec.
Synthèse enzymatique du dérivé lipophilique alkylé de l'acide chlorogénique
La synthèse enzymatique du chlorogénate d'hexadécyle a été réalisée d'après les conditions mises au point par Lopez-Giraldo et al. (2007).
A l'abri de la lumière, 1 ,5 g d'acide chlorogénique et 260 g d'hexadécanol sont introduits dans un ballon pendant 2 h dans un bain marie à 55 °C et sous agitation à 250 rpm, afin de permettre la solubilisation de l'acide chlorogénique dans l'hexadécanol. La réaction est démarrée par l'addition de Novozym 435, préalablement équilibré pendant 15 jours avec une solution de sel saturé de NaOH à une valeur théorique d'aw de 0,05. La quantité de catalyseur employée est de 5 % (p/p) (calculée sur une base pondérale prenant en compte la totalité des substrats impliqués). Dans le but d'orienter les réactions vers la synthèse, l'eau produite par la réaction est adsorbée sur tamis moléculaire 4 À (30 mg/mL de milieu réactionnel).
La purification du chlorogénate d'hexadécyle a été réalisée par chromatographie sur colonne sur gel de silice. La méthode est celle décrite par Lopez-Giraldo et al. (2007). Une première étape de séparation par extraction liquide-liquide est effectuée à l'aide de 500 mL d'un mélange hexane/acétonitrile (1/3 v/v). La phase hexanique, qui contient la majorité de l'alcool gras, est éliminée, tandis que la phase acétonitrile, contenant principalement l'ester, est lavée encore 3 fois par 100 mL d'hexane. Après ces lavages, la phase acétonitrile est évaporée à 40 °C sous pression réduite à l'aide d'un évaporateur rotatif. Le résidu sec est dissous dans 60 mL d'un mélange toluène/acétate d'éthyle (70/30, v/v) et déposé sur une colonne en verre (40 x 2,5 cm) de silice (préalablement séchée à 100°C pendant 48 h).
L'élution est réalisée avec 1 ,5 L de mélange toluène/acétate d'éthyle (70/30, v/v). Les fractions contenant l'ester sont recueillies et le solvant évaporé à 40 ^ sous pression réduite. Préparation des assemblages avec l'amylose
Les différentes solutions (acide chlorogénique, dérivés lipophiliques de l'acide chlorogénique sous forme acylée et alkylée) sont mélangées avec l'amylose pour déterminer leur éventuelle activité complexante envers ce dernier.
Les assemblages amylose/acide chlorogénique (ou avec chlorogénate d'hexadécyle ou dérivés acylés en C16 de l'acide chlorogénique) ont été réalisés à partir de gels d'amylose à 1 %.
Le protocole de construction des assemblages est initialement adapté de celui de Biais et a., 2006 (Carbohydrate Polymers 66(3) : 306-315).
Cinq millilitres d'une solution d'acide chlorogénique (ou de dérivés lipophiliques de l'acide chlorogénique) sont préparés comme suit : 10 mg de « molécule d'intérêt » (acide chlorogénique, chlorogénate d'hexadécyle ou dérivés acylés en C16 de l'acide chlorogénique) sont introduits dans un volume de 5 mL d'eau préalablement dégazée (15 min pour éviter les phénomènes d'oxydation).
Cette solution est ensuite placée dans un flacon hermétique et chauffée à 90 °C pendant 30 min (dans un bain d'huile de silicone) avec agitation magnétique, puis retour à température ambiante.
Deux cents milligrammes d'amylose sont introduits dans un flacon hermétique contenant 20 m L d'eau préalablement dégazée à l'azote. Cette solution est chauffée à 160 ºC pendant 45 minutes avec une forte agitation magnétique, puis refroidit à 90 ^.
En parallèle 2,5 mL du filtrat de la solution d'acide chlorogénique (ou de dérivés lipophiliques de l'acide chlorogénique) sont chauffés à 90 ^.
Lorsque les deux solutions sont à 90°C, la solution d'amylose est introduite dans le flacon contenant la solution d'acide chlorogénique (ou de dérivés lipophiliques de l'acide chlorogénique). Cette solution est maintenue à 90°C pendant 10 min avec une forte agitation magnétique, puis refroidie à température ambiante et conservée dans le flacon pendant 48H. La solution est centrifugée à 2000g pendant 5 min ; une partie du précipité est récupérée, pesée dans une boîte à tare, et placée sous atmosphère saturée en NaCI (activité de l'eau aw = 0,75 à température ambiante) jusqu'à équilibration de la masse (environ 72h).
Une solution d'amylose, sans ajout d'acide chlorogénique (ou de dérivés lipophiliques de l'acide chlorogénique), est préparée dans les mêmes conditions de façon à pouvoir comparer les résultats obtenus à une référence.
Caractérisation des complexes amylose/ acide chlorogénique (ou de dérivés lipophiliques de l'acide chlorogénique) et du gel d'amylose de référence
Pour caractériser les assemblages amylose/acide chlorogénique (ou de dérivés lipophiliques de l'acide chlorogénique), on utilise les assemblages obtenus à partir du gel amylose/acide chlorogénique (ou de dérivés lipophiliques de l'acide chlorogénique) après un conditionnement sous NaCI.
Les molécules de départ (acide chlorogénique, les dérivés lipophiliques de l'acide chlorogénique) sont également étudiés.
La caractérisation des assemblages amylose/ acide chlorogénique (ou de dérivés alkylé ou acylé de l'acide chlorogénique), et du gel d'amylose de référence, a nécessité trois techniques différentes que sont l'analyse enthalpique différentielle (AED), la diffraction des rayons X (DRX) et la RMN du solide.
> Diffractométrie de rayons X ou « DRX »
Vingt milligrammes d'échantillon, équilibrés à aw = 0,75, sont placés dans une rondelle en cuivre entre deux feuilles de ruban adhésif, pour empêcher tout changement de teneur en eau.
L'échantillon a été examiné par diffractométrie des rayons X ou DRX.
Les mesures ont été effectuées en utilisant un spectromètre D8 Discover avec détecteur GADDS et croisé avec des miroirs de Bruker-AXS, travaillant à 40 kV et 40 mA, avec un monochromateur cuivre (λ = 1 ,54059 À) et un alignement de l'échantillon par vidéo microscopique et laser.
Les données ont été collectées au moyen d'un détecteur de courbe à 120° pendant 10 minutes et normalisées entre 3 et 30° (2Θ).
> Calorimétrie différentielle à balayage Q100
(analyse enthalpique différentielle « AED » - « DSC ou Differential Scanning Calorimetry ») Le thermogramme AED est enregistré au moyen d'un automate pour calorimétrie différentielle à balayage T.A Instruments Q100.
Huit milligrammes d'échantillon et 12 μΙ d'eau préalablement dégazée à l'azote sont introduits dans une capsule en inox (T.A. Instruments). La référence est une capsule contenant 12 μΙ d'eau.
Les capsules sont ensuite fermées hermétiquement avec un joint thermorésistant puis placées dans le four de l'appareil.
La cinétique choisie comprend un premier cycle avec une augmentation de 3°C/min de 1 ºC jusqu'à 140 ºC, suivi d'un refroidissement de 3 °C/min jusqu'à 1 °C. Un second cycle de température a été effectuée à 3ºC/min jusqu'à 160°C. Ensuite l'échantillon est rééquilibré à température ambiante à vitesse rapide, sans enregistrement des données.
> Spectrométrie RMN du solide
Cette étude a été réalisée sur des échantillons préalablement équilibrés sous solution saline saturée NaCI.
Les spectres RMN 3C à l'état solide (CP-MAS) ont été enregistrés sur un spectromètre Bruker Wide Bore 400 MHz équipé d'une sonde CP-MAS (cross-polarization-magic-angle- spinning) double résonance 4 mm H/X.
La séquence CP-MAS a été réalisée avec une rotation de 7 KHz, une impulsion 90 ° sur les protons de 3,75 με, un délai de recyclage de 7s et un temps d'acquisition de 30ms pendant lequel un découplage dipolaire était appliqué. Le temps de contact était de 1 ms.
Les déplacements chimiques des carbones ont été calibrés par rapport au déplacement chimique du groupement carbonyle de la glycine à 176,03 ppm (21 °C). Résultats et discussion
Propriétés thermiques des suspensions d'amylose
La capacité de complexation avec l'amylose de l'acide chlorogénique, et de ses dérivés lipophiliques, est déterminée par calorimétrie différentielle à balayage, en comparaison avec l'amylose sans ligand.
> L'amylose seul (sans ligand) - référence
La suspension d'amylose seul (sans ligand) a été obtenue en suivant le même protocole que celui utilisé pour les suspensions amylose/ligands.
Le thermogramme obtenu (Figure 1 ), lors de l'étude en analyse enthalpique différentielle (AED), sert de référence pour la suite de l'étude. Lors du premier cycle, il est observé un endotherme à 108°C. Au cours de l'expérimentation, la solution d'amylose a été chauffée à 145ºC afin de solubiliser l'amylose, or la température de fusion de l'amylose utilisé est de 148ºC, ce qui a été vérifié par AED en excès d'eau (thermogramme non présenté). A 145°C, une partie seulement de l'amylose fusionne (la moins bien organisée) puis rétrograde rapidement lors du refroidissement. L'endotherme à 108^ correspondrait à de l'amylose mal rétrogradé ayant une mauvaise organisation cristalline.
Lors du second cycle, deux endothermes sont observés : à 120ºC et 145ºC.
Ces deux endothermes correspondent respectivement à la fusion de l'amylose rétrogradé au cours de la descente en température effectuée entre les deux cycles et à la fusion de l'amylose initial, ayant une bonne organisation cristalline.
> Acide chlorogénique et dérivés lipophiliques de l'acide chlorogénique
L'analyse enthalpique différentielle a été menée sur les ligands, en excès d'eau, dans la gamme de température allant de 20 ºC à 140°C avec une cinétique de 3ºC/mίn.
Les thermogrammes obtenus (non représentés) montrent un endotherme, respectivement, à : 65º pour l'acide chlorogénique, 51 °C pour l'acide 4-O-palmitoyle chlorogénique, 91 °C pour l'acide 3-O-palmitoyle chlorogénique, et 84ºC pour le chlorogénate d'hexadécyle.
> Assemblage avec l'amylose
Les thermogrammes obtenus pour les différents assemblages sont illustrés par les Figures 2 à 5.
Les endothermes sont identiques pour les quatre assemblages, avec :
- lors du premier cycle, un endotherme à 108°C, et
- lors du second cycle, un endotherme à 120ºC et à 148ºC.
Ces endothermes sont similaires à ceux de l'amylose seul (Figure 1 ).
Pour l'assemblage amylose/dérivés acylés de l'acide chlorogénique, un endotherme à 82 °C est visible au premier cycle et au second cycle (Figures 4 et 5). Cet endotherme ne peut pas correspondre aux dérivés lipophiliques seuls (température de fusion à 51 °C et à 91 °C pour l'acide 4-0- palmitoyle chlorogénique et l'acide 3-0- palmitoyle chlorogénique, respectivement).
Le fait que cet endotherme soit visible lors du second cycle, montre que cette réaction est réversible. Tout laisse penser que cet endotherme correspond à la fusion de complexes amylose/ acide 4-O-palmitoyle chlorogénique et amylose/acide 3-O-palmitoyle chlorogénique.
II faut cependant noter la faible température de fusion (82 ºC) de ces complexes. Dans la littérature, la température des complexes amylose/lipides est aux alentours de 1 10 °C (par exemple pour l'acide palmitique, la température de fusion des complexes est de 1 12 <€).
Pour l'assemblage amylose/chlorogénate d'hexadécyle, un endotherme aux alentours de 83 ^ est également visible, mais il disparaît au second cycle (Figure 3). La température de fusion de ce dérivé alkylé étant de 84 °C, l'endotherme semble correspondre au dérivé alkylé pur et non complexé.
Aucun endotherme supplémentaire à ceux de l'amylose n'est apparent sur le thermogramme des assemblages amylose/acide chlorogénique (Figure 2).
En conclusion, l'analyse enthalpique différentielle semble conclure qu'il n'y a pas interaction entre, d'une part, l'amylose et l'acide chlorogénique et, d'autre part, l'amylose et le dérivé alkylé (chlorogénate d'hexadécyle).
En revanche, il existe des interactions entre, d'une part, l'amylose et l'acide 4-O-palmitoyle chlorogénique et, d'autre part, l'amylose et l'acide 3-O-palmitoyle chlorogénique.
Structure cristalline des assemblages in vitro
Une étude en diffraction des rayons X a été menée sur l'amylose seul (Figure 6A) et les quatre assemblages (amylose/acide chlorogénique - Figure 6B, amylose/chlorogénate d'hexadécyle - Figure 6E, amylose/acide 3-O-palmitoyle chlorogénique - Figure 6D et amylose/acide 4-O-palmitoyle chlorogénique - Figure 6C).
Tous les échantillons ont préalablement été placés sous atmosphère saturée de NaCI durant une semaine.
Les diagrammes de diffraction des rayons X obtenus sont représentés sur la Figure 6. Le diagramme de diffraction des rayons X obtenu pour l'amylose seul et utilisé comme référence présente une structure caractéristique de type B (Figure 6A). Dans ce cas les réflexions obtenues montrent que l'amylose a rétrogradé en doubles hélices selon un empilement hexagonal.
En présence de l'acide chlorogénique ou des dérivés lipophiliques de l'acide chlorogénique, la diffraction des rayons X montre également une structure de type B (Figures 6B à 6E).
Cette structure s'explique par la présence d'amylose rétrogradé due à la solubilisation incomplète de cette dernière lors du protocole de formation des assemblages. Néanmoins il est curieux de ne pas observer également des raies caractéristique du type V, c'est-à-dire caractéristique des complexes cristallins formés avec l'amylose pour les assemblages amylose/dérivés acylés. En conclusion, les réflexions obtenues sont identiques pour tous les assemblages et sont caractéristiques du type cristallin B qui s'explique par la présence d'amylose rétrogradé. Ces résultats sont en accord avec ceux obtenus en AED pour les assemblages amylose/acide chlorogénique et amylose/chlorogénate d'hexadécyle, mais cette technique ne nous permet pas de conclure sur la complexation de l'amylose et des dérivés acylés de l'acide chlorogénique.
RMN du solide
Les spectres RMN 3C CP/MAS obtenus sont illustrés par la Figure 7.
Un spectre de type B est caractérisé par un doublet de raies d'égales intensités autour de "l OOppm. Ce multiplet s'explique en considérant que l'unité répétitive qui génère la double hélice est le maltose. Or tous les spectres pour l'amylose seul (Figure 7A) ou les assemblages (amylose/acide chlorogénique - Figure 7B, amylose/dérivés lipophiliques de l'acide chlorogénique - Figures 7C à 7E) présentent un doublet à 100ppm. Ceci confirme la présence d'amylose rétrogradé en type B dans tous les échantillons.
Pour les assemblages amylose/dérivés acylés de l'acide chlorogénique (acide 3-0- palmitoyle chlorogénique et acide 4-0- palmitoyle chlorogénique), on observe encore une raie intense à 102,6ppm (Figures 7D et 7C).
Or, cette raie est caractéristique des spectres d'amylose de type V (simple hélice). Ceci est en accord avec l'unicité des conformations a-(1 -4) dans les mailles de simples hélices.
De plus pour ces deux assemblages amylose/dérivés acylés de l'acide chlorogénique, le pic à 61 ppm présente un épaulement important qui correspond à la présence de deux types d'orientations gauche-gauche et gauche-frans (Figures 7C et 7D).
Pour les structures de type B, la largeur du pic est faible, l'orientation gauche-frans est très largement prédominante, l'orientation gauche-gauche étant quasi inexistante et de ce fait non détectée, alors que dans le cas d'une structure de type V les deux types d'orientations gauche-gauche et gauche- trans sont clairement exprimées.
Dans le cas des deux assemblages amylose/dérivés acylés de l'acide chlorogénique
(Figures 7C et 7D), la présence des deux types cristallins V et B explique l'orientation gauche- trans comme étant majoritaire mais pas unique.
On est donc dans ce cas en présence de simples hélices (type V) et de doubles hélices avec un arrangement cristallin de type B.
En conclusion, cette étude nous permet d'affirmer la présence de simples hélices dans le cas des dérivés acylés de l'acide chlorogénique complexés avec l'amylose, et de confirmer l'absence d'interaction entre, d'une part, l'amylose et l'acide chlorogénique et, d'autre part, l'amylose et le chlorogénate d'hexadécyle. Conclusion générale
Dans la présente étude, les différents assemblages, et leurs signatures respectives du type calorimétrique, rayons X et RMN à l'état solide, ont été observés et comparés à la référence constituée par l'amylose sans ligand.
Les techniques utilisées montrent une excellente complémentarité dans la détermination des caractéristiques structurelles importantes telles que le type cristallin, la conformation hélicoïdale ou la nature de l'inclusion.
Les données de diffraction des rayons X montrent uniquement des spectres de structure de type B, quelles que soit les assemblages formés avec l'amylose (acide chlorogénique, dérivés acylés ou alkylés) ; ces résultats ne permettent pas de déterminer la nature des interactions possibles, notamment la présence de simples hélices caractéristiques de la formation de clathrates.
Pour les assemblages amylose / acide chlorogénique et amylose / dérivés alkylés, les résultats d'analyse enthalpique différentielle et de RNM du solide confirment l'absence de complexes.
Pour les assemblages amylose / dérivés acylés, la présence des complexes est montrée, d'une part, par la présence de leurs endothermes de fusion en analyse enthalpique différentielle et par le caractère réversible de leur formation au cours du refroidissement et, d'autre part, par la présence d'un singulet intense à 102,6ppm en RMN du solide.
Ces données permettent la mise en évidence de la présence de simples hélices et d'affirmer l'absence d'un espace inter-hélice permettant la capture de molécules encombrantes.
Ces résultats associés à la diffraction des rayons X permettent de conclure que les complexes obtenus sont des complexes d'inclusion amorphes et/ou structurés à très faible échelle (température de fusion faible, pas de signature en diffraction des rayons X), et que seul le greffon (chaîne aliphatique) est capturé dans la cavité hélicoïdale de l'amylose.
Ces travaux ont permis de mettre en évidence la difficulté à piéger, par l'amylose, une molécule imposante comme l'acide chlorogénique et de ce fait à la protéger de l'oxydation.
La synthèse de dérivés lipophiles d'acide chlorogénique en C16 par acylation, a permis de montrer que l'amylose pouvait piéger la chaîne grasse greffée en l'emprisonnant dans sa cavité hélicoïdale.
Cette étude a montré également l'importance de la position de la chaîne aliphatique greffée sur le cycle, au regard de la meilleure complexation de l'acide 4-O-palmitoyle chlorogénique par rapport à l'acide 3-O-palmitoyle chlorogénique.
Les présents résultats montrent notamment que l'acide 4-O-palmitoyle chlorogénique forme un complexe amorphe avec l'amylose, avec seulement la chaîne latérale greffée incluse dans la cavité d'amylose. Ces résultats permettent de déduire le modèle schématique complexe tel qu'illustré sur la Figure 8.
Sans être limité par aucune théorie, le greffage d'une chaîne aliphatique plus longue pour le dérivé alkylé, par exemple en C18 ou en C20, devrait permettre d'obtenir un effet complexant suffisant avec l'amylose, pour la formation d'un complexe (l'encombrement stérique étant le seul facteur limitant la complexation de la chaîne greffée par alkylation).
Par ailleurs, un inconvénient majeur dans l'ajout d'assemblages protecteurs dans la phase aqueuse d'une émulsion est le déphasage de la phase aqueuse dû à la nucléation puis à la précipitation des cristaux de complexes.
Or dans notre cas, nous obtenons des complexes d'inclusion amorphes et/ou structurés à très faible échelle, l'encombrement stérique de la molécule ne permettant pas un arrangement cristallin plus important.
Les complexes d'inclusion sont pris dans le réseau désorganisé des chaînes d'amylose non complexées, ce qui doit permettre une nette diminution du risque de précipitation dans la phase aqueuse.
Ces travaux permettent d'envisager notamment la protection de molécules sensibles à l'oxydation lors de leur incorporation dans une émulsion ou simplement dans une phase aqueuse ou un milieu aqueux. L'autre point intéressant de ce travail est le fait que les complexes amylose/acide gras en C16 (acide palmitique) sont bien connus dans la littérature pour leur grande stabilité face aux hydrolyses acides et enzymatiques, laissant penser que lors de la libération de l'acide chlorogénique, l'acide gras saturé ne sera pas relargué, mais restera prisonnier de l'amylose jusqu'à la fin de la digestion.

Claims

- REVENDICATIONS - 1 .- Procédé pour la préparation de complexes comprenant de l'amylose assemblé avec au moins une molécule organique d'intérêt, lequel procédé est caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes :
(a) une étape de lipophilisation consistant à greffer une chaîne aliphatique grasse sur ladite molécule organique d'intérêt, pour la préparation d'un dérivé lipophilique de ladite molécule organique d'intérêt,
(b) une étape de mise en contact entre (i) ledit dérivé lipophilique de ladite molécule organique d'intérêt portant ladite chaîne aliphatique grasse greffée, issu de ladite étape de lipophilisation (a), et (ii) ledit amylose, et
(c) une étape de formation desdits complexes amylose / dérivé lipophilique de la molécule organique d'intérêt,
lesquelles étapes de mise en contact (b) et de formation des complexes (c) consistent en un protocole hydro-thermique sous agitation.
2.- Procédé selon la revendication 1 , caractérisé en ce que le protocole hydro-thermique sous agitation comprend :
d'une part, pour l'étape de mise en contact (b) :
- la préparation d'une solution aqueuse contenant ledit dérivé lipophilique de ladite molécule organique d'intérêt portant ladite chaîne aliphatique grasse greffée, issu de ladite étape de lipophilisation (a), et d'une solution aqueuse contenant l'amylose,
- le mélange desdites solutions aqueuses pour l'obtention d'une solution mélange, d'autre part, pour l'étape de formation des complexes (c) :
- le maintien de ladite solution mélange sous chauffage et sous agitation,
- le refroidissement de ladite solution mélange.
3.- Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce que la molécule organique d'intérêt est choisie parmi les molécules organiques comportant une activité antioxydante.
4.- Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que la molécule organique d'intérêt est choisie parmi les polyphénols.
5.- Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que la molécule organique d'intérêt est choisie parmi les acides phénoliques.
6.- Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que la molécule organique d'intérêt est choisie parmi les acides hydroxycinnamiques ou les esters d'acides hydroxycinnamiques.
7. - Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que la molécule organique d'intérêt sous forme d'acide hydroxycinnamique est choisie parmi les acides féruliques, les acides p-coumariques, les acides o-coumariques, les acides caféiques et les acides sinapiques.
8. - Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que la molécule organique d'intérêt sous forme d'ester d'acide hydroxycinnamique est choisie parmi les acides caféoylquiniques, les acides p-coumaroylquiniques, les acides féruloylquiniques et les acides sinapoylquiniques, ou parmi les acides rosmariniques.
9. - Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce que l'étape de lipophilisation (a) consiste à greffer la chaîne aliphatique grasse sur le groupement quinique de la molécule organique d'intérêt.
10. - Procédé selon la revendication 9, caractérisé en ce que l'étape de lipophilisation (a) consiste à greffer la chaîne aliphatique grasse sur l'une des fonctions hydroxyles du groupement quinique de la molécule organique d'intérêt.
1 1 . - Procédé selon la revendication 10, caractérisé en ce que la molécule organique d'intérêt consiste en du 5-O-caféoylquinique, et en ce que l'étape de lipophilisation (a) consiste à greffer la chaîne aliphatique grasse sur le groupement hydroxyle en position 3 ou en position 4 du groupement quinique de ladite molécule organique d'intérêt.
12. - Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 1 1 , caractérisé en ce que le dérivé lipophilique de la molécule organique d'intérêt, issu de l'étape de lipophilisation (a), comporte une chaîne aliphatique grasse greffée comprenant un groupement alkyle linéaire.
13. - Procédé selon la revendication 12, caractérisé en ce que la chaîne aliphatique grasse greffée comporte une longueur de chaîne comprise entre 12 et 16 atomes de carbone, bornes incluses.
14. - Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 13, caractérisé en ce que l'étape de formation des complexes (c) est mise en œuvre de sorte à obtenir des complexes d'inclusion, dans lesquels la chaîne aliphatique grasse des dérivés lipophiliques de composés organiques d'intérêt est incluse dans l'une des hélices de l'amylose associé.
15. - Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 14, caractérisé en ce que, lors de l'étape de mise en contact (b), la molécule d'amylose consiste en de l'amylose seul ou en de l'amylose sous forme d'amidon.
16. - Composé chimique organique sous forme d'un complexe, comprenant de l'amylose assemblé avec au moins une molécule organique d'intérêt, caractérisé en ce que ladite molécule organique d'intérêt se présente sous une forme dérivée lipophilique, portant une chaîne aliphatique grasse greffée.
17. - Composé chimique organique selon la revendication 16, caractérisé en ce que la molécule organique d'intérêt, portant la chaîne aliphatique grasse greffée, est choisie parmi les molécules organiques comportant une activité antioxydante.
18. - Composé chimique organique selon l'une quelconque des revendications 16 ou 17, caractérisé en ce que la molécule organique d'intérêt est choisie parmi les polyphénols.
19. - Composé chimique organique selon la revendication 18, caractérisé en ce que la molécule organique d'intérêt est choisie parmi les acides phénoliques.
20. - Composé chimique organique selon la revendication 19, caractérisé en ce que la molécule organique d'intérêt est choisie parmi les acides hydroxycinnamiques ou les esters d'acides hydroxycinnamiques.
21 . - Composé chimique organique selon la revendication 20, caractérisé en ce que la molécule organique d'intérêt sous forme d'acide hydroxycinnamique est choisie parmi les acides féruliques, les acides p-coumariques, les acides o-coumariques, les acides caféiques et les acides sinapiques.
22.- Composé chimique organique selon la revendication 20, caractérisé en ce que la molécule organique d'intérêt sous forme d'ester d'acide hydroxycinnamique est choisie parmi les acides caféoylquiniques, les acides p-coumaroylquiniques, les acides féruloylquiniques et les acides sinapoylquiniques, ou parmi les acides rosmariniques.
23. - Composé chimique organique selon la revendication 22, caractérisé en ce que le dérivé lipophilique de la molécule organique d'intérêt porte la chaîne aliphatique grasse greffée sur son groupement quinique.
24. - Composé chimique organique selon la revendication 23, caractérisé en ce que la chaîne aliphatique grasse greffée est portée par l'un des oxygènes lié par liaison covalente au groupe cyclohexyle du groupement quinique.
25.- Composé chimique organique selon la revendication 24, caractérisé en ce que le dérivé lipophilique de la molécule organique d'intérêt consiste en un 5-O-caféoylquinique, dont la chaîne aliphatique grasse greffée est portée par l'atome d'oxygène en position 3 ou en position 4 du groupement quinique.
26. - Composé chimique organique selon l'une quelconque des revendications 16 à 25, caractérisé en ce que la chaîne aliphatique grasse greffée comprend un groupement alkyle linéaire.
27. - Composé chimique organique selon la revendication 26, caractérisé en ce que la chaîne aliphatique grasse greffée comporte une longueur de chaîne comprise entre 12 et 16 atomes de carbone, bornes incluses.
28.- Composé chimique organique selon l'une quelconque des revendications 16 à 27, caractérisé en ce que ledit composé chimique organique est sous forme d'un complexe d'inclusion, dans lequel la chaîne aliphatique grasse greffée des dérivés lipophiliques de composés organiques d'intérêt est incluse dans l'une des hélices de l'amylose associé.
29.- Composition intégrant le composé chimique organique selon l'une quelconque des revendications 16 à 28.
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