WO2013026795A1 - Verfahren zur herstellung von beschichteten glasoberflächen - Google Patents

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WO2013026795A1
WO2013026795A1 PCT/EP2012/066094 EP2012066094W WO2013026795A1 WO 2013026795 A1 WO2013026795 A1 WO 2013026795A1 EP 2012066094 W EP2012066094 W EP 2012066094W WO 2013026795 A1 WO2013026795 A1 WO 2013026795A1
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glass
silyl
hpg
coating
polyglycerol
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PCT/EP2012/066094
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Rainer Haag
Marie Weinhart
Tobias Becherer
Wolfgang Friess
Sarah KÜCHLER
Kerstin HÖGER
Uwe Schedler
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PolyAn Gesellschaft zur Herstellung von Polymeren für spezielle Anwendungen und Analytik mbH
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    • C03C2218/30—Aspects of methods for coating glass not covered above
    • C03C2218/31—Pre-treatment

Definitions

  • the invention relates to a process for the production of coated glass surfaces, in particular of glass vessels, which are preferably used for the packaging of biopharmaceuticals and other pharmaceutical and biological materials. These include materials such as cells, bacteria or viruses, or solutions of biomolecules (e.g., proteins, enzymes, DNA) or drugs, and e.g. used in medicine, biotechnology or pharmacy.
  • biomolecules e.g., proteins, enzymes, DNA
  • drugs e.g. used in medicine, biotechnology or pharmacy.
  • the invention also relates to modified glass vessels and glassware for handling biomolecules or biological materials.
  • special silyl-modified polyglycerols are used for surface modification of the glass, preferably on the contact surfaces of glass vessels or equipment.
  • the method according to the invention allows the provision of a heat sterilization-resistant or autoclavable non-stick coating on glass surfaces for biopharmaceuticals.
  • Glass containers are among the most commonly used packaging materials for biomolecules such as protein-based pharmaceuticals. This is due on the one hand by cost-effective production of glass and on the other by numerous advantageous chemical and physical properties of this material such as high (temperature) stability and chemical resistance, hydrophilicity of the material, non-toxic properties, impermeability to gases, and the applicability various sterilization procedures without decomposition of the material. Based on variable glass composition, different glass qualities result, which differ mainly in the hydrolytic resistance of the glass, which may result in different levels of outdiffusion of (alkali, alkaline earth) metal ions from the glass into the solution, which in turn impairs the stability and functionality of Biomolecules can be significantly affected.
  • Such a coating can prevent the outdiffusion of certain metal ions from the glass material into the solution and concomitant pH changes of the solution and metal ion-induced denaturation of biomolecules, it does not prevent the non-specific adsorption of biomolecules.
  • the applied quartz glass layer like uncoated glass, is also negatively charged under physiological conditions, so that adhesive electrostatic interactions also occur between such a layer and pharmaceutical and biotechnological substances, materials or formulations.
  • plastic coatings e.g. Polyethylene glycol derivatives (PEG) are currently widely used in the coating of biomedical devices (Blummel, J., et al., Biomaterials, 28 (2007) 4739-4747).
  • PEG Polyethylene glycol derivatives
  • these derivatives are sensitive to oxidation and thus do not allow heat sterilization at temperatures> 200 ° C, which are absolutely necessary for Entpyrogentician of surfaces.
  • Depyrogenated vessels for storage of biopharmaceuticals are particularly important if the stored preparation is intended for later intravenous administration.
  • a coating with PEG is technically complex, since it usually has to be carried out under a protective gas atmosphere in order to ensure the exclusion of moisture. This also requires working with poorly water-miscible solvents, e.g. Toluene, which is harmful to health.
  • the object of the invention was to find suitable materials for a non-stick coating and to provide so that the coating meets the requirements in the field of medicine and pharmacy, adsorption of biomolecules or biological materials is completely or at least significantly prevented, and the coated Glass surfaces can be exposed to typical pharmaceutical and biological sterilization conditions, without the non-stick layer is impaired in their function. Furthermore, technically simple coating methods are to be used which do not require inert gas conditions.
  • silyl-modified polymers based on glycerol on chemically activated glass surfaces wherein the silyl linker on a Urea bond bound to the polyglycerols is present.
  • silyl-modified polymers form a covalently bonded coating on the glass surface, preferably in the form of an onolayer or multilayer, which has the property of an anti-adhesion layer to biomolecules and biological materials and which simultaneously survives autoclaving and / or heat sterilization without impairing its function ,
  • Silyl linkers which are used according to the invention are selected from the group consisting of trialkoxysilyl, dialkoxyalkylsilyl and monoalkoxydialkylsilyl.
  • Alkyl and alkoxy preferably comprise 1 to 6 carbon atoms. Particularly preferred is a triethoxysilyl linker.
  • the coated surfaces have a static water contact angle of ⁇ 50 °, more preferably ⁇ 30 °.
  • HPG Highly branched polyglycerols
  • OMe highly branched, methylated HPG
  • LPG linear, methylated polyglycerols
  • LPG linear polyglycerols
  • HPGs and LPGs as well as their protein-resistant properties are known per se.
  • HPG (OH) by anionic ring-opening polymerization according to A. Sunder, R. Mühlhaupt, R. Haag, H. Frey, Adv. Mater. 2000, 12, 235 or RK Kainthan, EB Muliawan, SG Hatzikiriakos and DE Brooks, Macromolecules 2006, 39, 7708.
  • Synthesis during HPG (OMe) by polymer-analogous methylation of the terminal OH groups of HPG (OH) with methyl iodide, such as it is known to those skilled in the organic synthesis, is accessible.
  • LPG (OMe) and LPG (OH) is e.g. in US 2005/01 13560 A1 or DE 10 2006 027 125 A1.
  • the inventive method is characterized in that the silyl-modified polyglycerols used in the invention, preferably of HPG (OH), HPG (OMe), LPG (OMe) and LPG (OH), from corresponding mono-amine-functionalized precursor polyglycerols by reaction with the corresponding silylpropyl isocyanates, [3- (trialkoxy) silyl-propyl isocyanate, 3- (dialkoxyalkyl) silyl-propyl isocyanate or 3- (monoalkoxydialkyi) silyl-propyl isocyanate, preferably 3- (triethoxysilyl) -propyl isocyanate].
  • the silyl radical is thus bound to the polyglycerol via a stable urea linkage.
  • the modified polyglycerols are coupled in one step to activated glass surfaces.
  • the cleaning and activation of the glass surfaces takes place e.g. by a 30 minute piranha pretreatment or plasma activation to give reactive hydroxyl groups on the glass surface.
  • the thus activated surfaces may be e.g. washed with water and / or an alcohol and dried.
  • the activated vessels are used immediately for the silanization process, wherein the silyl-modified polyglycerol in a polar organic solvent or solvent mixture, preferably a primary alcohol, is dissolved and added with heating to preferred temperatures of 40 - 100 ° C, optionally in Presence of a catalyzing organic base.
  • Alcohols which are preferably used are methanol, ethanol, propanol and / or butanol.
  • Coating processes are known to the person skilled in the art.
  • the coating can be applied to the surface by spraying, dipping, (plasma-mediated) chemical vapor deposition, evaporation or sputtering, wherein the silane groups react with the activated surface and become covalently bonded.
  • Unbound polymer molecules with unreacted silane groups can e.g. be removed by washing with the organic solvent. Subsequent temperature treatment at preferably 80 to 120 ° C leads to the final cross-linking of the surface-bound oxysilanes and ensures the solid covalent attachment of the polyglycerol layer as a monolayer (single-stage layer) or as a multilayer with layer thicknesses between 1 -1000 nm.
  • the preferred layer thickness is between 1 -15 nm for monolayers and 50-200 nm for multilayers.
  • a pharmaceutically acceptable non-stick layer thus obtained discloses static contact angles to water, which are preferably between 0 ° and 30 ° for the case of the highly hydrophilic polymers HPG (OH) and LPG (OH) and between 40 ° and 50 ° for the more hydrophobic polymers HPG ( OMe) and LPG (OMe). It survives autoclaving at about 120 ° C for about 20 minutes and / or heat sterilization of e.g. at least 180 ° C for about 120 minutes or depyrogenation at temperatures> 200 ° C for about 30 minutes.
  • Glass in the sense of the invention in addition to the silicate glasses known per se, such as borosilicate glass and soda-lime glass, also includes silanized or quartz-glass-coated surfaces, as well as silicon-based organic glasses and other silicon-based polymers, e.g. Polydimethylsiloxane (POMS).
  • silicate glasses known per se such as borosilicate glass and soda-lime glass
  • silanized or quartz-glass-coated surfaces as well as silicon-based organic glasses and other silicon-based polymers, e.g. Polydimethylsiloxane (POMS).
  • POMS Polydimethylsiloxane
  • Particularly preferred compounds used according to the invention for coating glass surfaces are the compounds represented by the formulas 1 to 4 - LPG (OMe) (1); LPG (OH) (2); HPG (OMe) (3) and HPG (OH) (4). Repeating units are preferably between 10 and 15,000, more preferably between 10 and 80, for polyethylene glycols having a degree of branching of 0-100%, with a degree of branching of 0% or 50-70% being particularly preferred.
  • Hexadecantriethylsilane (HDS, 5) and monomethoxypolyethylene glycol (mPEG, 6) served as a hydrophobic or hydrophilic control surface coating for comparison.
  • the attached formula scheme 1A and 1B shows the inventive coating of activated glass with the preferred compounds.
  • HPG hyperbranched polyglycerol having free hydroxyl groups
  • the loss of biopharmaceutical / protein due to adsorption to the surface / inner vessel wall is still reduced by at least 50% even after heat sterilization.
  • HPG (OH) Since the silyl-modified HPG (OH) coatings also allow the process of heat sterilization in comparison, they significantly increase the potential application area and are therefore particularly preferably used coating compositions. Thus, HPG (OH) is suitable as a coating material for reusable glass containers or reusable glassware. Furthermore, the hyperbranched structure of HPG (OH) provides a more complete coverage of the surface and thus better shielding thereof compared to linear coating materials, such as e.g. mPEG.
  • linear coating materials such as e.g. mPEG.
  • the coating method of the present invention can provide sterilized glass surfaces of glass plates, in glass jars and glassware such as glass pipettes or glass pipette tips with reduced adsorption of biopharmaceuticals and other pharmaceutical and biological materials.
  • Such coated glass surfaces are of particular interest in the fields of medicine, pharmacy, biology, biochemistry and biotechnology.
  • Biopharmaceuticals are e.g. Coagulation factors, fibrinolytics, hormones, hematopoietic growth factors, interferons, interleukin-based products, vaccines, monoclonal antibodies and other products, e.g. other therapeutic enzymes / proteins, cells, bacteria or viruses.
  • the silyl-modified polyglycerol coating used in the invention is e.g. suitable for packaging materials and storage containers, but also for all glass-based reaction vessels and tools. These include, for example, glass-based diagnostic tools, e.g. Assay matrices, analytical tools, e.g. Pipette tips or vessels for sample preparation and handling of diluted protein and biomolecule solutions.
  • glass-based diagnostic tools e.g. Assay matrices
  • analytical tools e.g. Pipette tips or vessels for sample preparation and handling of diluted protein and biomolecule solutions.
  • the coatings provided according to the invention can, inter alia, improve the detection limit of assays and substantially reduce or avoid the loss of biomolecules by non-specific adsorption on the glass surface. They are not protein binding and stable to pharmaceutical stress test conditions such as autoclaving and / or heat sterilization. They correspond to coatings with PEG derivatives, but are far superior by the simple technical production of a coating with PEG derivatives, since the coating must not be done in the absence of moisture and in particular HPG (OH) coatings stable to the stress conditions for depyrogenation (heat sterilization > 200 ° C, 30 min). In addition, it has been found that even after prolonged storage times, usually occurring denaturation of biomolecules, in particular proteins, does not occur.
  • catalytically active proteins showed unchanged enzyme activity after storage in the polyglycerol-coated vessels, while a marked loss of enzyme activity was recorded after storage in untreated glass vessels. This is due, on the one hand, to the loss of enzyme mass due to non-specific adsorption on the uncoated vessel wall and, on the other hand, to denaturation and unfolding of the enzyme induced by the adsorption on the vessel wall.
  • Dialysis for the purification of macromolecules was carried out in dialysis tubing from Sigma (No. D-7884, diameter: 32 mm, molecular weight cut-off (MWCO) 1000 g mof 1 ) from benzoylated cellulose.
  • Phosphate buffered saline PBS, 10X concentrated, 90 gL 1 NaCI, 7.95 gL 1 Na 2 HPO 4 , and 1.44 gL 1 KH 2 PQ 4 , pH 7.4
  • PBS Phosphate buffered saline
  • the distilled water used was prepared using a Millipore water purification system with a minimum resistance of 18.0 M ⁇ cm 1 H NMR and 3 C NMR spectra were recorded at 25 ° C and a concentration of 100 gL "1 recorded on a Jeol ECX 400 NMR instrument at 400 MHz and 101 MHz, respectively.
  • the spectra obtained were calibrated to the peak of the deuterated solvent and the chemical shifts between potassium bromide plates recorded on a Nicolet Avator 320 FT-IR instrument in the range between 4000-600 cm "1 wavenumbers and were evaluated using the EZ OMNIC ESP software.
  • Linear, mono-amine-functionalized poly (methyl glycerol) and linear, mono-amine-functionalized poly (ethoxyethyl glycerol) as a precursor for linear polyglycerol were synthesized according to the literature [M. Weinhart, I. Grunwald, M. Wyszogrodzka, L. Gaetjen, A. Hartwig, R. Haag, Chem. - Asian J. 2010, 5, 1992].
  • Mono-amine-functionalized methoxypoly (ethylene glycol) (mPEG) was prepared via a three-step synthesis produced.
  • HPG Highly branched polyglycerol
  • Amine-functionalized HPG was prepared via standard etherification with A / A / dibenzyl-3-bromopropan-1-amine [AS Nagle, RN Salvatore, B.-D. Chong, K. Woon Jung, Tetrahedron Lett. 2000, 41, 301 1] modified to give HPG (4a) with a random dibenzylaminopropyl linker, as detected by ⁇ NMR spectroscopy. Deprotection of the amine groups by catalytic hydrogenation with Pd / C provided the corresponding aminopropyl-functionalized HPG (4b).
  • Mono-amine-functionalized poly (methyl glycerol) (1400 g-mol '1 , 8.72 mmol, 12.2 g) was added to 3- (triethoxysilyl) propyl isocyanate in dry THF (100 mL) according to coupled to general protocol and provided 1 1.4 g (82%) of 1 as a colorless oil after dialysis.
  • Mono-amine functionalized linear poly (ethoxyethyl glycerol) (2500 g-mor 1 , 4.0 mmol, 10 g) as a linear polyglycerol precursor was coupled to 3- (triethoxysilyl) propyl isocyanate in dry THF (100 mL) according to the general procedure and provided 9.6 g (87%) of the triethoxysilyl-functionalized linear poly (ethoxyethyl glycerol) s as a bright yellow oil after dialysis.
  • Compound 2 was stored and stored as a stock solution (0.1 gmL "1 ) in dry ethanol in the refrigerator under inert gas atmosphere and was thus stable for several months without to gel.
  • Triethoxysilyl modified methoxypoly (ethylene glycol) (mPEG, 6)
  • Mono-amine functionalized linear methoxypoly (ethylene glycol) (mPEG) (HOO g-mol "1 , 6.4 mmol, 7.0 g) was coupled to 3- (triethoxysilyl) propyl isocyanate in dry THF (50 mL) according to the general procedure and yielded 6.0 g (72%) of the triethoxysilyl-functionalized methoxypoly (ethylene glycol) (mPEG) as a colorless solid after dialysis.
  • the respective triethyoxsilyl-functionalized polymer was dissolved in ethanol at a concentration of 31.25 0 "2 ⁇ per mm 2 glass surface and with a catalytic amount of triethylamine (3.125-10 " 3 ⁇ per mm 2 glass surface) for 18 h at 70 ° C on the surface to be coated. Subsequently, the glass surfaces were thoroughly washed with ethanol to remove residues of unbound, physisorbed triethoxysilyl compound and dried in N 2 gas stream. For the final cross-linking of the surface bound oxysilanes, the coated glasses were heated to 100 ° C for 1 h under normal atmosphere, rinsed with water and ethanol, in N 2 -. Gas stream dried, and in the dark at room temperature until desired
  • Polyglycerol-coated, planar glass surfaces and non-planar glass vessels show a significantly reduced adsorption of proteins compared to uncoated glass.
  • the plasma proteins BSA and fibrinogen showed that their non - specific adsorption on linear polyglycerols (LPG (OMe) and LPG (OH)) as well as hyperbranched polyglycerines (HPG (OH)) within 4 hours (> 96% reduced adsorption in the Compared to uncoated glass) increases only slightly up to 24 hours (> 90% reduced adsorption compared to uncoated glass) and thus demonstrates the stability of the coating (see Fig. 1).
  • the determination was carried out by epifocal fluorescence microscopy.
  • the measured fluorescence intensities were correlated by means of a calibration curve.
  • HPG hyperbranched polyglycerol-coated glass vessels
  • PS 80 polysorbate 80
  • HPG (OH) modified vessels showed little change in the amount of adsorbed IgG1 when the tubes were heat sterilized both at 180 ° C and at 215 ° C (see Figures 3a and 3b).
  • vessels coated with linear poly (methyl glycerol) (LPG (OMe)), highly branched polyglycerol with methylated hydroxyl groups (HPG (OMe)) or mPEG showed an increase in protein adsorption after heat sterilization as compared to the corresponding unsterilized vessels .
  • LPG linear poly
  • HPG methylated hydroxyl groups
  • mPEG methylated hydroxyl groups

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Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Beschichten von Glasoberflächen für Biomoleküle und biologische Materialien, insbesondere von Glasgefäßen, das dadurch gekennzeichnet ist, dass die Glasoberfläche aktiviert wird und auf diese aktivierte Glasoberfläche ein Silyl-modifiziertes Polyglycerol gegeben wird, wobei das Silyl-modifizierte Polyglycerol so strukturiert ist, dass der Silyl-Linker über eine Harnstoffbindung an das Polyglycerol gekoppelt vorliegt, und über den Silyl-Linker eine kovalent gebundene Schicht an der Glasoberfläche gebildet wird. Der Silyl-Linker ist ausgewählt aus Trialkoxysilyl, Dialkoxyalkylsilyl oder Monoalkoxydialkylsilyl. Die so beschichtete Glasoberfläche ist unter thermischen Sterilisationsbedingungen stabil.

Description

Verfahren zur Herstellung von beschichteten Glasoberflächen
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von beschichteten Glasoberflächen, insbesondere von Glasgefäßen, die vorzugsweise für die Verpackung von Biopharmazeutika und andere pharmazeutische und biologische Materialien eingesetzt werden. Dazu gehören Materialien, wie Zellen, Bakterien oder Viren, oder Lösungen von Biomolekülen (z.B. Proteine, Enzyme, DNS) oder Arzneistoffen und z.B. in der Medizin, Biotechnologie oder Pharmazie Verwendung finden. Gegenstand der Erfindung sind auch entsprechend modifizierte Glasgefäße und Glasgerätschaften zur Handhabung von Biomoleküien oder biologischen Materialien. Erfindungsgemäß werden spezielle Silyl-modifizierte Polyglycerole, zur Oberflächenmodifizierung des Glases verwendet, vorzugsweise auf den Kontaktflächen von Glasgefäßen bzw. Gerätschaften. Insbesondere erlaubt das erfindungsgemäße Verfahren die Bereitstellung einer hitzesterilisationsfesten bzw. autoklavierbaren Antihaftbeschichtung auf Glasflächen für Biopharmazeutika.
Stand der Technik
Glasgefäße zählen zu den bislang am häufigsten eingesetzten Verpackungsmaterialien für Biomoleküle wie z.B. Protein-basierte Pharm azeutika. Dies ist begründet zum Einen durch kostengünstige Herstellung von Glas sowie zum Anderen durch zahlreichen vorteilhaften chemischen und physikalischen Eigenschaften dieses Materials wie z.B. hohe (Temperatur-) Stabilität und chemische Beständigkeit, Hydrophilie des Materials, nicht-toxische Eigenschaften, Unpermeabilität gegenüber Gasen, sowie die Anwendbarkeit verschiedener Sterilisationsverfahren ohne Zersetzung des Materials. Basierend auf variabler Glaszusammensetzung resultieren verschiedene Glasqualitäten, die sich hauptsächlich in der hydrolytischen Resistenz des Glases unterscheiden, was unterschiedlich starkes Ausdiffundieren von (Alkali-, Erdalkali-) Metallionen aus dem Glas in die Lösung zur Folge haben kann, wodurch wiederum die Stabilität und Funktionalität von Biomolekülen maßgeblich beeinträchtigt werden kann. Zudem sind Glasoberflächen unter physiologischen pH-Wert Bedingungen von Natur aus negativ geladen und begünstigen daher die nichtspezifische Adsorption von Proteinen auf der Gefäßwand über hauptsächlich ionische Wechselwirkungen. Derartige Adsorptionsprozesse sind in der Regel irreversibel und führen zum„Verlust" der Biomoleküle auf der Gefäßwand. In der Biotechnologie, Pharmaindustrie und dem Bereich„health care und life science" ist dieses Problem der Adsorption von Substanzen, insbesondere von Biomolekülen, lange bekannt, jedoch bislang unzureichend mittels geeigneter Lösungsansätze und vor allem kommerziell erhältlicher Produkte adressiert. Die Firma Schott bietet seit einiger Zeit eine kommerzielle Variante von Glasgefäßen für „Biopharmaceuticals" an, welche verbesserte biokompatible/bioinerte Eigenschaften aufweisen soll. Diese Glasgefäße sind mittels eines „Plasma Impulse Chemical Vapor Deposition" Verfahrens mit einer etwa 100-200 nm dicken, kovalent angebundenden, reinen Quarzglas (Si02)-Schicht ausgekleidet (DE 196 22 550 A1 ).
Im Vergleich zu Standardglas vermag eine solche Beschichtung zwar das Ausdiffundieren bestimmter Metallionen aus dem Glasmaterial in die Lösung und damit einhergehende pH- Wert-Änderungen der Lösung sowie Metallionen-induzierte Denaturierung von Biomolekülen verhindern, jedoch nicht die nicht-spezifische Adsorption von Biomolekülen. Auch die aufgebrachte Quarzglasschicht ist wie unbeschichtetes Glas unter physiologischen Bedingungen negativ geladen, so dass auch zwischen einer solchen Schicht und pharmazeutischen sowie biotechnologischen Substanzen, Materialien oder Formulierungen adhäsive elektrostatische Wechselwirkungen auftreten.
Auch Kunststoffbeschichtungen, z.B. Polyethylenglykol-Derivate (PEG) finden gegenwärtig weite Verbreitung bei der Beschichtung von biomedizinischen Geräten (J. Blümmel et al., Biomaterials, 28 (2007) 4739-4747). Jedoch sind diese Derivate oxidationsempfindlich und erlauben somit keine Hitzesterilisation bei Temperaturen > 200 °C, welche zur Entpyrogenisierung von Oberflächen zwingend notwendig sind. Entpyrogenisierte Gefäße zur Lagerung von Biopharmazeutika sind insbesondere dann wichtig, wenn die gelagerte Zubereitung für eine spätere intravenöse Applikation gedacht ist. Eine Beschichtung mit PEG ist technisch aufwändig, da in der Regel unter Schutzgasatmosphäre gearbeitet werden muss, um den Ausschluss von Feuchtigkeit zu gewährleisten. Das erfordert darüber hinaus auch das Arbeiten mit schlecht mit Wasser mischbaren Lösungsmitteln, z.B. Toluol, welches gesundheitsschädlich ist.
Beschreibung der Erfindung
Die Aufgabe der Erfindung bestand deshalb darin, geeignete Materialien für eine Antihaftbeschichtung zu finden und so bereitzustellen, dass die Beschichtung den Anforderungen auf dem Gebiet der Medizin und Pharmazie genügt, eine Adsorption von Biomolekülen oder biologischen Materialien komplett oder zumindest maßgeblich verhindert wird, und die beschichteten Glasoberflächen typischen pharmazeutischen und biologischen Sterilisationsbedingungen ausgesetzt werden können, ohne dass die Antihaftschicht in ihrer Funktion beeinträchtigt wird. Weiterhin sollen technisch einfache Beschichtungsverfahren zur Anwendung kommen, die keine Inertgasbedingungen erfordern.
Die Lösung der Aufgabe gelingt durch einer Beschichtung mit Silyl-modifizierten Polymeren auf Glycerolbasis an chemisch aktivierte Glasoberflächen, wobei der Silyl-Linker über eine Harnstoffbindung an die Polyglycerole gebunden vorliegt. Diese Silyl-modifizierten Polymere bilden eine kovalent gebundene Beschichtung an der Glasoberfläche vorzugsweise in Form einer onolage oder Multilage, die die Eigenschaft einer Antihaftschicht gegenüber Biomolekülen und biologischen Materialien besitzt und die gleichzeitig das Autoklavieren und/oder eine Hitzesterilisation übersteht, ohne dass ihre Funktion beeinträchtigt ist.
Silyl-Linker, die erfindungsgemäß Verwendung finden, sind ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Trialkoxysilyl, Dialkoxyalkylsilyl und Monoalkoxydialkylsilyl. Alkyl und Alkoxy umfassen vorzugsweise 1 bis 6 C-Atome. Besonders bevorzugt ist ein Triethoxysilyl-Linker.
Vorzugsweise weisen die beschichteten Oberflächen einen statischen Wasser-Kontaktwinkel von < 50° besonders bevorzugt < 30° auf.
Besonders bevorzugt werden hochverzweigte Polyglycerole (HPG(OH) bzw. hochverzweigte, methylierte HPG(OMe) erfindungsgemäß verwendet. Aber auch lineare, methylierte Polyglycerole (LPG(OMe)) oder lineare Polyglycerole (LPG(OH)) können erfindungsgemäß Verwendung finden.
Die Herstellung von HPGs und LPGs sowie deren proteinresistente Eigenschaften sind an sich bekannt. So kann z.B. HPG(OH) mittels einer anionischen Ring-öffnenden Polymerisation gemäß A. Sunder, R. Mühlhaupt, R. Haag, H. Frey, Adv. Mater. 2000, 12, 235 oder R. K. Kainthan, E. B. Muliawan, S. G. Hatzikiriakos and. D. E. Brooks, Macromolecules 2006, 39, 7708. synthetisiert werden während HPG(OMe) durch polymeranaloge Methylierung der terminalen OH-gruppen von HPG(OH) mit Methyliodid, wie sie dem Fachmann in der organischen Synthese bekannt ist, zugänglich ist. Die Herstellung von LPG(OMe) und LPG(OH) ist z.B. in US 2005/01 13560 A1 oder DE 10 2006 027 125 A1 beschrieben.
Es hat sich gezeigt, dass mit Polyglycerolen, die eine Harnstoffbindung zu einem Silyl-Linker aufweisen und über diesen Linker kovalent an aktivierte Glasoberflächen gekoppelt werden können, eine Beschichtung der Glasoberfläche auch ohne normalerweise erforderliche Schutzgasatmosphäre möglich ist, was das Beschichtungsverfahren erheblich vereinfacht, vor allem hinsichtlich eines sogenannten Up-Scaling Prozesses. Das Schutzgas verhindert normalerweise die unerwünschte wässrige Hydrolyse der Silylgruppen und deren anschließende Quervernetzung. Es wurde überraschend festgestellt, dass, wenn anstelle der ansonsten verwendeten aprotischen, unpolaren Lösungsmittel (z.B. Toluol), die eine geringe Wasseraffinität besitzen und somit ein wasserfreies Arbeiten erleichtern, ein polares protisches Lösungsmittel wie zum Beispiel primäre, niedrige Alkohole (Ethanol, Methanol etc.) verwendet werden, mit den erfindungsgemäß verwendeten Silyl-modifizierten Polyglycerinen auf Schutzgasatmosphäre während der Beschichtung verzichtet werden kann.
Das erfindungsgemäße Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, dass erfindungsgemäß verwendete Silyl-modifizierte Polyglycerole, vorzugsweise von HPG(OH), HPG(OMe), LPG(OMe) und LPG(OH), aus entsprechenden Mono-amin-funktionalisierten Precursor- Polyglycerolen durch Umsetzung mit den entsprechenden Silylpropylisocyanaten, [3- (Trialkoxy)silyl-propylisocyanat, 3-(Dialkoxyalkyl)silyl- propylisocyanat oder 3- (Monoalkoxydialkyi)silyl-propylisocyanat, vorzugsweise 3-(Triethoxysilyl)propylisocyanat] synthetisiert werden. Der Silyl-Rest wird so über eine stabile Harnstoffbindung an das Polyglycerol gebunden. Die so modifizierten Polyglycerole werden in einem Schritt an aktivierte Glasoberflächen gekoppelt.
Die Reinigung und Aktivierung der Glasoberflächen erfolgt z.B. durch eine 30 minütige Piranha Vorbehandlung oder Plasmaaktivierung, so dass reaktive Hydroxylgruppen an der Glasoberfläche entstehen. Anschließend können die so aktivierten Oberflächen z.B. mit Wasser und/oder einem Alkohol gewaschen und getrocknet werden. Die aktivierten Gefäße werden umgehend für den Silanisierungsprozess eingesetzt, wobei das Silyl-modifizierte Polyglycerol in einem polaren, organischen Lösungsmittel oder Lösungsmittelgemisch, vorzugsweise ein primärer Alkohol, gelöst wird und unter Erwärmen auf bevorzugte Temperaturen von 40 - 100°C zugegeben wird, ggf. in Anwesenheit einer katalysierend wirkenden organischen Base. Bevorzugt verwendete Alkohole sind Methanol, Ethanol, Propanol und/oder Butanol.
Verfahren zur Beschichtung sind dem Fachmann bekannt. So kann die Beschichtung durch Sprühen, Eintauchen, (Plasma-vermittelte) chemische Dampfbeschichtung, Verdampfen oder Sputtern auf die Oberfläche aufgebracht werden, wobei die Silan-Gruppen mit der aktivierten Oberfläche reagieren und kovalent gebunden werden.
Nichtgebundene Polymermoleküle mit nicht reagierten Silangruppen können z.B. durch Waschen mit dem organischen Lösungsmittel im Anschluss entfernt werden. Eine sich anschließende Temperaturnachbehandlung auf vorzugsweise 80 bis 120°C führt zur finalen Quervernetzung der oberflächengebunden Oxysilane und gewährleistet die feste kovalente Anbindung der Polyglycerol-Schicht als Monolayer (einstufige Schicht) oder auch als Multilayer mit Schichtdicken zwischen 1 -1000 nm.
Die bevorzugte Schichtdicke liegt zwischen 1 -15 nm für Monolagen und 50-200 nm für Multilagen.
Vorzugsweise werden zur Beschichtung mit Monolagen geringere Konzentrationen an z.B. Triethoxysilan-modifizierten Polymeren mit statistisch einem Triethoxysilan-Linker vorzugsweise 30-33*10"2 μΜ pro mm2, verwendet als für Beschichtungen mit Multilagen. Alternativ kann zur Beschichtung mit Multilagen auch die statistische Modifizierung der Polymere mit den entsprechenden Silylgruppen erhöht werden auf vorzugsweise 5-25% Modifizierung der Hydroxylgruppen mit Oberflächen-reaktiven Silylgruppen pro Polymer.
Eine so gewonnene pharmataugliche Antihaftschicht offenbart statische Kontaktwinkel zu Wasser, die bevorzugt zwischen 0° und 30° liegen für den Fall der stark hydrophilen Polymere HPG(OH) und LPG(OH) und zwischen 40° und 50° für die mehr hydrophoben Polymere HPG(OMe) und LPG(OMe). Sie übersteht eine Autoklavierung bei ca. 120°C für ca. 20 Minuten und/oder eine Hitzesterilisation von z.B. mindestens 180°C für ca. 120 Minuten bzw. eine Entpyrogenisierung bei Temperaturen > 200 °C für ca. 30 Minuten.
Entscheidend für die Anwendbarkeit derartig beschichteter Glasoberflächen ist die Möglichkeit der Sterilisation dieser mittels standardisierter Sterilisationsverfahren wie z.B. Hitzesterilisation (2 Stunden, 180°C) oder zur Entpyrogenisierug (0.5 Stunden, > 200 °C) oder Dampfdrucksterilisation (15-20 Minuten bei 121 °C und 1 oder 2 bar autoklaviert).
Glas im Sinne der Erfindung schließt neben den an sich bekannten Silikatgläsern wie z.B Borosilikatglas und Kalknatronglas auch silanisierte oder mit Quarzglas-beschichtete Oberflächen ein sowie Siliziumbasierte organische Gläser und andere Polymere auf Siliziumbasis wie z.B. Polydimethylsiloxan (POMS).
Besonders bevorzugte erfindungsgemäß verwendete Verbindungen zur Beschichtung von Glasoberflächen (von planaren und nicht planaren Gläsern) sind die mit den Formeln 1 bis 4 dargestellten Verbindungen - LPG(OMe) (1); LPG(OH) (2); HPG(OMe) (3) und HPG(OH) (4). Wiederholungseinheiten liegen bevorzugt zwischen 10 und 15000, besonders bevorzugt zwischen 10 und 80 für Poiyglycehne mit einem Verzweigungsgrad von 0-100%, wobei ein Verzeigungsgrad von 0% oder 50-70% besonders bevorzugt ist. Hexadecantriethylsilan (HDS, 5) und Monomethoxypolyethylen glycol (mPEG, 6) diente zum Vergleich als hydrophobe bzw. hydrophile Kontrolloberflächenbeschichtung.
Das anliegende Formelschema 1A und 1 B zeigt die erfindungsgemäße Beschichtung von aktiviertem Glas mit den bevorzugt genannten Verbindungen.
Eine Beschichtung von Glasoberflächen mit Triethoxysilyl-modifiziertem hochverzweigten Polyglycerin mit freien Hydroxylgruppen (HPG(OH)) ist besonders bevorzugt. So wurde bei mit HPG(OH) modifizierten Gefäßen z.B. keine Änderung der Menge an adsorbiertem lgG1 festgestellt, wenn die beschichteten Gefäße hitzesterilisiert waren im Vergleich zu unsterilisierten beschichteten Glasoberflächen.
Glasoberflächen, die mit linearem Poly(methyl glycerin) (LPG(OMe)) oder hochverzweigtem Polyglycerin mit methylierten Hydroxylgruppen (HPG(OMe)) beschichtet waren, zeigten zwar einen Anstieg der Proteinadsorption nach Hitzesterilisation im Vergleich zu den entsprechenden unsterilisierten Gefäßen. Jedoch überstanden auch sie das Autoklavieren ohne Beeinträchtigung der Protein-abweisenden Eigenschaften.
Im Vergleich zu unbeschichteten Glasmaterialien ist der Verlust an Biopharmazeutikum/Protein durch Adsorption an die Oberfläche/Gefäßinnenwand auch nach Hitzesterilisation noch mindestens um 50% reduziert.
Da die Silyl-modifizierten HPG(OH) Beschichtungen im Vergleich auch das Verfahren der Hitzesterilisation erlauben, vergrößern sie das potentielle Einsatzgebiet signifikant und sind deshalb besonders bevorzugt eingesetzte Beschichtungsmittel. Somit eignet sich HPG(OH) als Beschichtungsmaterial für Mehrwegglasgefäße bzw. Mehrwegglasgerätschaften. Weiterhin gewährleistet die hochverzweigte Struktur von HPG(OH) wegen des größeren sterischen Anspruches im Vergleich zu linearen Strukturen eine vollständigere Belegung der Oberfläche und somit eine besseren Abschirmung derselben im Vergleich zu linearen Beschichtungsmaterialien wie z.B. mPEG.
Mit dem erfindungsgemäßen Beschichtungsverfahren können sterilisierfeste Glasoberflächen von Glasplatten, in Glasgefäßen sowie Glasgerätschaften wie Glaspipetten oder Glaspipettenspitzen mit verringerter Adsorption von Biopharmazeutika und anderen pharmazeutischen und biologischen Materialien bereitgestellt werden. Derartig beschichtete Glasoberflächen sind von besonderem Interesse im Bereich Medizin, Pharmazie, Biologie, Biochemie und Biotechnologie. Biopharmazeutika sind z.B. Gerinnungsfaktoren, Fibrinolytika, Hormone, Hämatopoetische Wachstumsfaktoren Interferone, auf Interleukinen basierende Produkte, Impfstoffe, monoklonale Antikörper sowie sonstige Produkte, z.B. weitere therapeutische Enzyme/Proteine, Zellen, Bakterien oder Viren.
Die erfindungsgemäß verwendete Beschichtung mit Silyl-modifizierten Polyglycerolen ist z.B. geeignet für Verpackungsmaterialien und Aufbewahrungsgefäße, aber auch für sämtliche Glas-basierte Reaktionsgefäße und Arbeitsgeräte. Dazu gehören beispielsweise glasbasierte Diagnostiktools, z.B. Assay-Matrices, Analytik-Werkzeuge, z.B. Pipettenspitzen oder Gefäße für die Probenvorbereitung und das sogenannte Handling von verdünnten Protein- und Biomoleküllösungen.
Die erfindungsgemäß bereitgestellten Beschichtungen können u.a. die Nachweisgrenze von Assays verbessern und den Verlust von Biomolekülen durch unspezifische Adsorption an der Glasoberfläche wesentlich verringern bzw. vermeiden. Sie sind nicht proteinbindend wirksam und stabil gegenüber pharmazeutischen Stress-Testbedingunen, wie Autoklavieren und/oder Hitzesterilisation. Sie entsprechen Beschichtungen mit PEG-Derivaten, sind jedoch durch die einfache technische Herstellung einer Beschichtung mit PEG-Derivaten weit überlegen, da die Beschichtung nicht unter Ausschluss von Feuchtigkeit erfolgen muss und insbesondere HPG(OH)-Beschichtungen stabil gegenüber den Stressbedingungn zur Entpyrogenisierung (Hitzesterilisation > 200 °C, 30 min) sind. Darüber hinaus hat sich gezeigt, dass auch nach längeren Aufbewahrungszeiten, eine gewöhnlich einsetzende Denaturierung von Biomolekülen insbesondere Proteinen nicht eintritt. So zeigten z.B. katalytisch aktive Proteine unveränderte Enzymaktivität nach Lagerung in den Gefäßen mit Polyglycerin-Beschichtung während ein deutlicher Verlust der Enzymaktivität nach Lagerung in unbehandelten Glasgefäßen zu verzeichnen war. Dies ist einerseits auf den Verlust an Enzymmasse durch nicht-spezifische Adsorption auf der unbeschichteten Gefäßwand und andererseits auf eine Denaturierung und Entfaltung des Enzyms induziert durch die Adsorption auf der Gefäßwand zurückzuführen.
Anhand von Beispielen wird die Erfindung näher beschrieben.
Ausführungsbeispiele
Beispiel 1
Synthese von HPG(OH). HPG(OMe), LPG(OMe), LPG(OH) und mPEG
Alle verwendeten Chemikalien und Lösungsmittel hatten Reagenz- oder HPLC geeignete Qualität, wurden daher ohne weitere Aufreinigung eingesetzt und wurden von Sigma (Steinheim, Deutschland) bezogen, soweit nicht anders vermerkt. Hexadecyltriethyoxysilan (HDS) (95%) wurde von ABCR Chemicals (Karlsruhe, Deutschland) bezogen.
Dialyse zur Aufreinigung von Makromolekülen wurde in Dialyseschläuchen der Firma Sigma (No. D-7884, Durchmesser: 32 mm, Molgewichts cut-off (MWCO) 1000 g mof1) aus benzoylierter Cellulose durchgeführt. Phosphate buffered saline (PBS; 10 x konzentriert; 90 g-L"1 NaCI, 7.95 g-L'1 Na2HP04, and 1.44 gl'1 KH2PQ4; pH 7.4) wurde von Lonza (Köln, Deutschland) bezogen und wurde vor der Verwendung auf einfache Konzentration (1 x) mit MilliQ Wasser verdünnt. Das verwendete destillierte Wasser wurde mit Hilfe einer Millipore Wasseraufreinigungsanlage mit einem Minimumwiderstand von 18.0 MQcm hergestellt. 1H NMR and 3C NMR Spektren wurden bei 25 °C und einer Konzentration von 100 g-L"1 auf einem Jeol ECX 400 NMR Gerät bei 400 MHz bzw. 101 MHz aufgenommen. Die erhaltenen Spektren wurden auf den Peak des deuterierten Lösungsmittels kalibriert und die chemischen Verschiebungen zwischen Kaliumbromid-Platten auf einem Nicolet Avator 320 FT-IR Instrument im Bereich zwischen 4000-600 cm"1 Wellenzahlen aufgezeichnet und wurden mit Hilfe der Software EZ OMNIC ESP ausgewertet.
Lineares, mono-amin-funktionalisiertes Poly(methyl glycerin) und lineares, mono-amin- funktionalisiertes Poly(ethoxyethyl glycerin) als Precursor für lineares Polyglycerin wurden entsprechend der Literatur synthetisiert [M. Weinhart, I. Grunwald, M. Wyszogrodzka, L. Gaetjen, A. Hartwig, R. Haag, Chem. - Asian J. 2010, 5, 1992]. Mono-amine funktionalisiertes Methoxypoly(ethylen glykol) (mPEG) wurde über eine dreistufige Synthese hergestellt. Hierzu wurde die Hydroxylgruppe von mPEG (M = 1 100 g mol"1) entsprechend der Literatur zuerst mittels Methansulfonylchlorid zum Mesylat umgesetzt und anschließend mit Natriumazid zum entsprechenden Azid substituiert. Die anschließende Reduktion der Azidgruppe zum entsprechenden Amin erfolgte mittels katalytischer Hydrierung mit Pd/C [S. Roller, H. Zhou, R. Haag, Mol. Diversity 2005, 9, 305; A. L. LaFrate, K. E. Carlson, J. A. Katzenellenbogen, Bioorg. Med. Chem. 2009, 17].
Hochverzweigtes Polyglycerin (HPG) wurde mittels einer einstufigen anionischen, Ring- öffnenden Polymerisation synthetisiert [A. Sunder, R. Hanselmann, H. Frey, R. Mühlhaupt, Macromolecules 1999, 32, 4240; A. Sunder, R. Mühlhaupt, R. Haag, H. Frey, Adv. Mater. 2000, 12, 235]. Teilweise Amin-funktionalisiertes, methyliertes, HPG (3d) wurde mittels einer vierstufigen Synthese hergestellt. Hierzu wurden 5% der Hydroxylgruppe von HPG entsprechend der Literatur [S. Roller, H. Zhou, R. Haag, Mol. Diversity 2005, 9, 305] zuerst mittels Methansulfonylchlorid zum Mesylat (3a) umgesetzt und anschließend mit Natriumazid zum entsprechenden Azid (3b) substituiert. Die restlichen Hydroxylgruppen wurden mittels Methyliodid methyliert (3c). Die anschließende Reduktion der Azidgruppen zu den entsprechenden Aminen (3d) erfolgte mittels katalytischer Hydrierung mit Pd/C.
Figure imgf000009_0001
Synthese von methyliertem HPG (HPG(OMe)) mit statistisch 5% Amin-funktionalitäten
Azid-funktionalisiertes, methyliertes HPG (3c)
Zu Azid-funktionalisiertem HPG (3b) (2000 g mol"1, 12.3 g, 6.2 mmol) in trockenem DMSO (200 mL) wurde gepulvertes KOH (41.7 g, 744 mmol, 120 äq. (4 äq./OH)) gegeben. Die resultierende Suspension wurde für 10 min. stark gerührt und im Eisbad auf 0 °C abgekühlt. Anschließend wurde Methyliodid (52.8 g, 23.2 mL 372 mmol, 60 äq. (2 äq./OH)) langsam zugetropft und die Reaktionmischung bei Raumtemperatur für 24 h unter Argon gerührt. Die Reaktion wurde mit Wasser gequencht und die Reaktionsmischung unter reduziertem Druck aufkonzentriert. Anschließend wurde der Rückstand mit Wasser versetzt und 3 x mit DCM extrahiert. Nach Trocknen der vereinigten organischen Phasen über MgS04 und Entfernen des Lösemittels unter reduziertem Druck, wurde die Titelverbindung als viskoses Öl erhalten (12.7 g, 79%).
1H NMR (400 MHz; CDCI3): δ = 3.64-3.43 (m, 200 H, PG-Rückgrat, sekundäre -OMe); 3.34 (s, 43 H, primäre -OMe); 1.41 -1.34 (m, 2 H, CHgCHs-lnitiator); 0.81 (t, 3 H, CH2CH2-lnitiator) ppm. 13C NMR (700 MHz; CDCI3): δ = 79.5, 78.7, 72.4, 71.8, 70.7, 69.9 (HPG-Rückgrat, NHCH2CH2CH20); 59.3 (primäre -OMe); 58.0 (sekundäre -OMe); 51.6 (CH2N3); 23.7 (CH2CH3-lnitiator); 7.7 (CH2CH3-lnitiator) ppm. IR vmax/cm"1: 3361 ; 2876; 2098; 1460; 1355; 1274; 1 196; 1089; 961 ; 832; 677.
Amin-funktionalisiertes, methyliertes HPG (3d)
Azid-funktionalisiertes, methyliertes HPG (3c) (2600 g-mol"1 , 12.7 g, 4.9 mmol) wurde in Methanol (100 mL) gelöst, Pd/C (20 wt%, 2.5 g) zugegeben und die Reaktion bei Raumtemperatur für 3 Tage unter H2-Atmosphäre (5 bar) durchgeführt. Anschließend wurde das Reaktionsgemisch über Celite™ filtriert. Das Filtrat wurde unter reduziertem Druck aufkonzentriert wobei die Titelverbindung (1 1.3 g, 89%) als viskoses Öl erhalten wurde.
H NMR (400 MHz; CDCI3): δ = 3.64-3.42 (m, 200 H, PG-Rückgrat, sekundäre -OMe); 3.33 (s, 43 H, primäre -OMe); 1.36-1.32 (m, 2 H, ChbCHa-lnitiator); 0.81 (t, 3 H, CH2CH2-lnitiator) ppm. 13C NMR (700 MHz; CDCI3): δ = 81.2, 79.5, 79.2, 79.0, 78.7, 78.5, 72.5, 72.2, 71 .5, 70.9, 69.7 (HPG -Rückgrat); 59.1 (primäre -OMe); 57.9 (sekundäre -OMe); 50.7 (CHNH2); 42 8 (CH2NH2) 23.7 (CH2CH3-lnitiator); 7.7 (CH2CH3-lnitiator) ppm. IR vmax/cm"1: 3362; 2875; 1643; 1461 ; 1356; 1262; 1 196; 1085; 960; 832; 679.
Aminfunktionalisiertes HPG wurde über eine Standardveretherung mit A/,A/-Dibenzyl-3- bromopropan-1-amin [A. S. Nagle, R. N. Salvatore, B.-D. Chong, K. Woon Jung, Tetrahedron Lett. 2000, 41, 301 1] modifiziert wobei HPG (4a) mit statistisch einem Dibenzylaminopropyl- Linker erhalten wurde, wie mittels Ή NMR Spektroskopie nachgewiesen wurde. Entschützung der Amingruppen mittels katalytischer Hydrierung mit Pd/C lieferte das entsprechende Aminopropyl-funktionalisierte HPG (4b).
Figure imgf000011_0001
Synthese von HPG(OH) mit statistisch einem 3-Aminopropyl-Linker
Synthese von A ,A -dibenzylaminopropyl-funktionalisiertem HPG (4a)
HPG (2000 g-mol"1, 13.5 g, 6.75 mmol) wurde in trockenem DMF (100 mL) bei 60 °C gelöst, Natriumhydride (60% in Mineralöl, 0.67 g, 16.8 mmol, 2.5 äq.) wurde unter Argon Gegenstrom zugegeben und die resultierende Lösung wurde für 1 h gerührt. Eine Lösung von A/,/V-Dibenzyl-3-bromopropan-1-amin (4.3 g, 13.5 mmol, 2.0 äq.) in trockenem DMF (10 mL) wurde zur Polymerlösung gegeben und die Reaktionsmischung bei 60 °C für 24 h gerührt. Anschließend wurde das Lösungsmittel im Vakuum entfernt und der Rückstand wurde mittels Dialyse gegen Ethanol aufgereinigt. Nach Entfernen des Lösungsmittels unter reduziertem Druck wurde die Titelverbindung (12.2 g, 81%) als viskoses Öl erhalten.
1H NMR (400 MHz; MeOH-d4): δ = 7.38-7.18 (m, 10 H, Ar-H); 3.97-3.40 (m, 137 H, HPG- Rückgrat, NCH2CH2CH20); 3.38-3.33 (m, 4 H, Ar-CH2N); 2.57-2.45 (m, 2 H, BnsNChb) 1.83- 1.71 (m, 2 H, NCH2CH2CH2O); 1.44-1.31 (m, 2 H, CH >CH3-lnitiator); 0.93-0.84 (m, 3 H, CH2CH3-lnitiator) ppm. 13C NMR (101 MHz; MeOH-d4): δ = 140.9, 130.0, 129.3, 128.0 (Ar- C); 81.4, 79.7, 73.9, 72.4, 72.2, 70.6, 64.4, 62.6 (HPG-Rückgrat, NCH2CH2CH20); 59.4 (NCH2-Ar); 51.4 (Bn2NCH2) 44.6 ((CH2)4C-lnitiator); 28.3 (NHCH2CH2CH20); 23.7 (CH2CH3- Initiator); 8.1 (CH2CH3-lnitiator) ppm.
Synthese von Aminopropyl-funktionalisiertem HPG (4b)
Λ/,/ -Dibenzylaminopropyl-funktionalisiertes HPG (4a) (2237 g-mol"1, 12.0 g, 5.36 mmol) wurde in Methanol (100 mL) gelöst, Pd/C (10wt%, 1.2 g) wurde zugegeben und die Reaktion wurde bei Raumtemperatur für 3 Tage unter H2-Atmosphäre (5 bar) durchgeführt. Anschließend wurde das Reaktionsgemisch über Celite™ filtriert. Das Filtrat wurde unter reduziertem Druck aufkonzentriert wobei die Titelverbindung (10.5 g, 95%) als viskoses Öl erhalten wurde.
1H NMR (400 MHz; MeOH-d4): δ = 3.99-3.40 (m, 137 H, HPG-Rückgrat + NCH2CH2CH20); 2.93-2.83 (m, 2 H, NCH2CH2CH20); 1.91 -1 .74 (m, 2 H, NCH2CH2CH20); 1 .44-1.32 (m, 2 H, CH2CH3-lnitiator); 0.93-0.83 (m, 3 H, CH2CH3-lnitiator) ppm. 13C NMR (101 MHz; MeOH-d4): δ = 81.4, 79.7, 73.9, 72.4, 72.2, 70.6, 64.4, 62.6 (HPG-Rückgrat, NCH2CH2CH20); 44.6 ((CH2)4C-lnitiator); 40.1 (NH2CH2); 30.2 (NH2CH2CH2CH20); 23.7 (CH2CH3-lnitiator); 8.1 (CH2CH3-lnitiator) ppm.
Beispiel 2
Synthese von Triethoxysilyl modifizierten Polymeren
Das entsprechende Mono-amin-funktionalisierte Glycerin-basierte Polymer (1 äq.) gemäß Beispiel 1 wurde unter Inertgas-Atmosphäre in trockenem Lösungsmittel in einem Teflon®- Koiben gelöst. Triethylamin (3 äq) wurden zugegeben während die Lösung bei Raumtemperatur gerührt wurde und mit 3-(Triethoxysilyl)propylisocyanat (1.1 äq.) versetzt wurde. Die Reaktion wurde für weitere 24 h gerührt. Nach Filtration der Lösung und Einengung des Filtrats wurde das erhaltene Rohprodukt mittels Dialyse gegen Ethanol für 24 h weiter aufgereinigt, wobei das Lösungsmittel dreimal gewechselt wurde. Das aufgereinigte Produkt wurde eingeengt und im Hochvakuum getrocknet.
Figure imgf000012_0001
Triethoxysilyl modifizierte Polymere
Triethoxysilyl modifiziertes lineares Poly(methyl glycerin) (1)
Mono-amin-funktionalisiertes Poly(methyI glycerin) (1400 g-mol'1, 8.72 mmol, 12.2 g) wurde an 3-(Triethoxysilyl)propylisocyanat in trockenem THF (100 mL) entsprechend der allgemeinen Vorschrift gekuppelt und lieferte 1 1.4 g (82%) von 1 als ein farbloses Öl nach Dialyse.
1H NMR (400 MHz; CDCI3): δ = 5.08-4.68 (brs. NH); 4.96-3.84 (m, 1 H, CH(CH2OMe)OH); 3.77 (q, 6 H, SiOCHgCHs); 3.70-3.34 (m, 86 H, LPG-Rückgrat, NHCH2CH2CH20); 3.31 (s, 48 H, LPG(OMe)); 3.28-3.06 (m, 4 H, 2 x CH2NH); 2.31 (brs, 1 H, OH) 1.84-1.64 (m, 2 H, NHCH2CH2CH20); 1.63-1.47 (m, 2 H, SiCH2CÜCH2NH); 1.24-1.12 (m, 9 H, SiOCH2CH3); 0.59 (t, 2 H, SiCH^CH2CH2NH) ppm. 3C NMR (101 MHz; CDCI3): δ = 158.4 (C=0); 78.5,
73.6, 72.5, 71.0, 69.8, 69.3 (LPG-Rückgrat, NHCH2CH2CH20); 59.1 (LPG(OMe)); 58.2 (SiOCH2CH3); 42.8 (SiCH2CH2CH2NH); 38.4 (NHCH2CH2CH20); 27.4 (NHCH2CH2CH20); 23.7 (SiCH2CH2CH2NH); 18.2 (SiOCH2CH3); 7.6 (SiCH2CH2CH2NH) ppm. IR (KBr) vmax/cm"1: 3381 ; 2976; 2880; 2812; 1721 ; 1651 ; 1556; 1455; 1390; 1253; 1198; 1 1 15; 961 ; 863; 775.
Triethoxysilyl modifiziertes lineares Polyglycerin (2)
Mono-amin-funktionalisiertes lineares Poly(ethoxyethyl glycerin) (2500 g-mor1, 4.0 mmol, 10 g) als Vorläufer für lineares Polyglycerin wurde an 3-(Triethoxysilyl)pröpylisocyanat in trockenem THF (100 mL) entsprechend der allgemeinen Vorschrift gekuppelt und lieferte 9.6 g (87%) des Triethoxysilyl-funktionalisierten linearen Poly(ethoxyethyl glycerine)s als hell gelbes Öl nach Dialyse.
1H NMR (400 MHz; CDCI3): δ = 4.63 (d, 17 H, OCH(CH3)); 3.84 (brs, 1 H, OH); 3.74 (q, 6 H, SiOChbCHs); 3.70-3.25 (m, 122 H, LPG-Rückgrat, NHCH2CH2CH20); 3.27-3.02 (m, 4 H, 2 x CH2NH); 1.77-1.61 (m, 2 H, NHCH2CH2CH20); 1.61-1.42 (m, 2 H, SiCH2CH2CH2NH); 1.22 (d, 48 H, OCH(CH3)); 1.12 (t, 57 H, SiOCH2CHa, OCH2CH3); 0.56 (t, 2 H, SiCiH2CH2CH2NH) ppm. 3C NMR (101 MHz; CDCI3): δ = 158.6 (C=0); 99.7 (OC(CH3)H);
78.7, 72.5, 70.0, 64.8, 64.6, 62.6, 60.1 (LPG-Rückgrat, NHCH2CH2CH20); 58.2 (Si0CH2CH3); 42.5 (SiCH2CH2CH2NH); 37.5 (NHCH2CH2CH20); 27.3 (NHCH2CH2CH20);
23.1 (SiCH2CH2CH2NH); 19.6 (OCH(CH3)) 18.1 (SiOCHsCHs); 15.2 (OCH2CH3); 7.5 (SiCH2CH2CH2NH) ppm. IR (KBr) vmax/cirf1: 3372; 2922; 2875; 1641 ; 1566; 1454; 1381 ; 1263; 1074; 1043; 907; 879; 733.
Die anschließende Abspaltung der Ethoxyethylacetal-Seitenketten des Polymers (1.1 mmol, 3 g) in Gegenwart einiger Tropfen konzentrierter Trifluoroessigsäure in trockenem THF (20 ml) unter Inertgas-Atmosphäre wurde für 2 h bei Raumtemperatur unter kräftigem Rühren durchgeführt wobei die Titelverbindung nach und nach ausfiel. Die obere Flüssigkeitsschicht wurde dekantiert, das erhaltene Polymer wurde dreimal mit trockenem THF gewaschen und wurde anschließend im Hochvakuum getrocknet und lieferte 1.4 g (78%) der Titelverbindung als viskoses, farbloses Öl. Um eine Quervernetzung der vielen Hydroxyl-Gruppen des Polymers mit den Triethoxysilyl-Gruppen zu verhindern, wurde Verbindung 2 als Stammlösung (0.1 g-mL"1) in trockenem Ethanol im Kühlschrank unter Inertgas-Atmosphäre aufbewahrt und gelagert und war somit mehrere Monate stabil ohne zu Gelieren. 'Ή NMR (400 MHz; MeOH-d4): δ = 3.79-3.40 (m, 95 H, LPG-Rückgrat, SiOCH2CH3, NHCH2CH2CH2O); 3.21-2.97 (m, 4 H, 2 x CH2NH); 2.02-1.86 (m, 2 H, NHCH2CH2CH20); 1 .68-1.44 (m, 2 H, SiCHaCHgCHaNH); 1.14 (t, 9 H, SiOCH2CH3); 0.60 (t, 2 H, SiCH2CH2CH2NH) ppm. 13C NMR (101 MHz; MeOH-d4): δ = 158.3 (C=0); 81 .5, 70 6, 64.3, 62.6, 71 .0 (LPG-Rückgrat, NHCH2CH2CH20); 58.3 (SiOCH2CH3); 44.4 (SiCH2CH2CH2NH); 37.3 (NHCH2CH2CH20); 27.9 (NHCH2CH2CH20); 23.6 (SiCH2CH2CH2NH); 18.2 (SiOCH2CH3); 7.1 (SiCH2CH2CH2NH) ppm. IR (KBr) vmax/cnrf1: 3350; 2926; 2875; 1694; 1538; 1458; 1348; 1256; 1039; 979; 916; 857.
Triethoxysilyl modifiziertes, methyliertes HPG (3)
Amin-funktionalisiertes HPG(OMe) (3b) (2600 g mol"1, 1 .5 mmol, 4 g) wurde an 3- (Triethoxysilyl)propyl isocyanat in trockenem THF (100 mL) entsprechend der allgemeinen Vorschrift gekuppelt und lieferte 3.5 g (88%) methyliertes HPG mit statistisch einem Triethoxysilyl-Linker als viskoses öl.
1H NMR (700 MHz; CDCI3): δ = 5.17 (brs, 2H, 2 x NH); 3.73 (q, 6 H, SiOCH2CH3); 3.63-3.34 (m, 203 H, PG-Rückgrat, sekundäre -OMe); 3.29 (s, 43 H, primäre -OMe); 3.08-3.00 (m, 4 H, 2 x CH2NH); 1.54-147 (m, 2 H, SiCH2CH2CH2NH); 1 .32-1.26 (m, 2 H, CHgCHa-lnitiator); 0.76 (t, 3 H, CH2CH3-lnitiator); 0.54 (t, 2 H, SiCH2CH2CH2NH) ppm. 3C NMR (700 MHz; CDCI3): δ = 158.7 (C=Ö); 79.4, 78.7, 72.3, 71.7, 70.9, 69.8, (HPG -Rückgrat, NHCH2CH2CH20); 59.1 (primäre -OMe); 58.3 (OCH2CH3) ; 57.9 (sekundäre -OMe); 43.2 (NHCH2CH2CHO); 42.8 (SiCH2CH2CH2NH); 23.7 (CH2CH3-initiator); 23.0 (SiCH2CH2CH2NH); 18.3 (OCH2CH3); 7.7 (CH2CH3-lnitiator) ppm. IR vmax/cm"1: 3360; 2878; 1644; 1460; 1356; 1261 ; 1 196; 1085; 956; 915; 832; 683. Triethoxysilyl modifiziertes hochverzweigtes Polyglycerin (4)
Mono-amin-funktionalisiertes HPG (4b) (2000 g mol"1 , 4.45 mmol, 8.9 g) wurde an 3- (Triethoxysilyl)propylisocyanat in trockenem DMF (100 mL) entsprechend der allgemeinen Vorschrift gekuppelt und lieferte 8.2 g (82%) von 4 als leicht gelbes, viskoses Öl nach Dialyse. Um eine Quervernetzung der vielen Hydroxyl-Gruppen des Polymers mit den Triethoxysilyl-Gruppen zu verhindern, wurde Verbindung 3 als Stammlösung (0.1 g mL'1) in trockenem Ethanol im Kühlschrank unter Inertgas-Atmosphäre aufbewahrt und gelagert und war somit mehrere Monate stabil ohne zu Gelieren.
1H NMR (400 MHz; MeOH-d4): δ = 4.00-3.31 (m, 143 H, PG-Rückgrat, SiOCH2CH3, OCH2CH2CH2N); 3.26-3.06 (m, 4 H, 2 x CH2NH); 1 .80-1.68 (m, 2 H, NHCH2CH2CH20); 1 .67- 1 .50 (m, 2 H, SiCH2CH2CH2NH); 1 .46-1.33 (CH2CH3-lnitiator); 1.18 (t, 9 H, SiOCH2CH3); 0.95-0.83 (m, 3 H, CH2CHrlnitiator); 0.76-0.57 (m, 2 H, SiCH2CH2CH2NH) ppm. ,3C NMR (101 MHz; MeOH-d4): δ = 161 .2 (C=0); 81.4, 79.8, 74.0, 72.4, 72.2, 70.7, 64.4, 62.8 (HPG - Rückgrat, NHCH2CH2CH20); 58.4 (OCH2CH3); 44.6 (C(CH2)4-lnitiator); 43.7 (NHCH2CH2CH20); 36.7 (SiCH2CH2CH2NH); 28.2 (NHCH2CH2CH20); 24.8 (SiCH2CH2CH2NH); 23.7 (CH2CH3-lnitiator); 18.7 (OCHzCHs); 8.5 (SiCH2CH2CH2NH); 8.1 (CHzCHg-lnitiator) ppm. IR (KBr) vmax/cm"1: 3353; 2878; 1651 ; 1556; 1455; 1258; 1078; 878.
Triethoxysilyl modifiziertes Methoxypoly(ethylen glykol) (mPEG, 6)
Mono-amin-funktionalisiertes lineares Methoxypoly(ethylen glykol) (mPEG) (HOO g-mol"1, 6.4 mmol, 7.0 g) wurde an 3-(Triethoxysilyl)propylisocyanat in trockenem THF (50 ml_) entsprechend der allgemeinen Vorschrift gekuppelt und lieferte 6.0 g (72%) des Triethoxysilyl-funktionalisierten Methoxypoly(ethylen glykol) (mPEG) als farblosen Feststoff nach Dialyse.
H NMR (400 MHz; CDCI3): δ = 3.79 (q, 6 H, SiOCHgCHa); 3.70-3.52 (m, 1 10 H, PEG- backbone); 3.46-3.42 (m, 2 H, NHCHgCh^O); 3.42 (s, 3 H, PEG-Ojyle); 3.16-3.09 (m, 2 H, SiCH2CH2CH2NH); 2.24 (brs, 2 H, NH); 1.58-1.52 (m, 2 H, SiCH2CH2CH2NH); 1.23-1.17 (m, 9 H, OCH2CH3); 0.60 (t, 2 H, SiCH^CH2CH2NH) ppm. 3C NMR (101 MHz; CDCI3): δ = 158.3 (C=0); 71.7-70.3 (PEG-backbone); 58.8 (PEG-OMe); 58.2 (SiOCH2CH3); 42.7 (SiCH2CH2CH2NH); 40.1 (NHCH2GH20); 23.6 (SiCH2CH2CH2NH); 18.1 (SiOCH2CH3); 7.5 (SiCH2CH2CH2NH) ppm. IR (KBr) vmax/cm'1: 3424; 2881 ; 1645; 1559; 1467; 1385; 1345; 1281 ; 1249; 115; 953; 843; 794.
Beispiel 3
Allgemeine Vorschrift für die Glasbeschichtung
Menzel® Deckgläschen (18 x 18 x 0.13-0.16 mm) (VWR, Darmstadt, Deutschland), Nexterion® Glas B Objektträger (75.6 x 25 x 1 mm) (Schott, Jena, Deutschland) und Fiolax® klar Aufbewahrungsgefäße (Außendurchmesser: 17.5 ± 0.17 mm) (Schott, Jena, Deutschland) wurden durch 30-minütiges Einlegen der Gläser in frisch vorbereiteter Piranha- Lösung (H2S04:H202=3:1) gereinigt und chemisch aktiviert. Im Anschluss wurden die Gläser aufeinander folgend mit destilliertem Wasser und Ethanol gespült und schließlich im N2- Gasstrom getrocknet. Sofort nach der Aktivierung der Glasoberfläche wurde das entsprechende Glas für die Beschichtung mit dem jeweiligen Triethoxysilyl modifizierten Polymer verwendet.
Für die Beschichtung wurde das jeweilige Triethyoxsilyl-funktionalisierte Polymer in Ethanol gelöst und bei einer Konzentration von 31.25 0"2 Μ pro mm2 Glasoberfläche und mit einer katalytischen Menge Triethylamin (3.125- 10"3 μΜ pro mm2 Glasoberfläche) für 18 h bei 70 °C auf die zu beschichtende Oberfläche gegeben. Anschließend wurden die Glasoberflächen gründlich mit Ethanol gewaschen um Reste der nicht-gebundenem, physisorbierten Triethoxysilyl-Verbindung zu entfernen und wurde im N2-Gasstrom getrocknet. Für die finale Quervernetzung der Oberflächengebunden Oxysilane wurden die beschichteten Gläser auf 100 °C für 1 h unter Normalatmosphäre erhitzt, mit Wasser und Ethanol gespült, im N2- Gasstrom getrocknet, und im Dunkeln bei Raumtemperatur bis zur gewünschten
Verwendung aufbewahrt.
Beispiel 4
a) Proteinadsorption von 1 mg»mL"1 BSA-FITC und Fib-FITC in PBS fng»cm"2] auf beschichteten und unbeschichteten planaren Glasplättchen.
Polyglycerin-beschichtete, planare Glasoberflächen und nicht-planare Glasgefäße zeigen im Vergleich zu nicht beschichtetem Glas eine deutlich verringerte Adsorption von Proteinen. Anhand der Plasmaproteine BSA und Fibrinogen konnte gezeigt werden, dass deren unspezifische Adsorption auf mit linearen Polyglycerinen (LPG(OMe) und LPG(OH)) sowie hochverzweigten Polyglycerinen (HPG(OH)) im Zeitraum von 4 Stunden (> 96% verringerte Adsorption im Vergleich zu unbeschichtetem Glas) bis 24 Stunden (> 90% verringerte Adsorption im Vergleich zu unbeschichtetem Glas) nur geringfügig ansteigt und somit die Stabilität der Beschichtung belegt (vgl. Abb. 1 ). Die Bestimmung erfolgte mittels epifokaler Fluoreszenz Mikroskopie. Die gemessenen Fluoreszenzintensitäten wurden mit Hilfe einer Kalibrierungskurve korreliert. b) Adsorption das Antikörpers lqG1 in mg/m2 an mit hochverzweigtem Polyglycerin beschichteten Glasgefäßen (HPG(OH)-coated Fiolax® vial) sowie an standardmäßig verwendeten unbeschichteten Fiolax® Gefäßen bei unterschiedlicher lonenstärke (170 mM, 22 mM), unterschiedlichen pH-Werten und dem Zusatz von Polysorbat 80 (PS 80; 0.02 wt%) als Tensid im Falle der nicht beschichteten Gefäße. Darüber hinaus wurde mittels HPLC nach Desorption von adsorbiertem Protein mit Hilfe von Sodium Dodecylsulfat wie von Mathes und Friess beschrieben [J. Mathes, W. Friess W. Eur J Pharm Biopharm. 2011 , 78, 239] die Adsorption eines lgG1 Antikörpers an der Glasoberfläche von mit hochverzweigten Polyglycerin (HPG(OH)) beschichteten und nichtbeschichteten Fiolax6 Glasvials der Firma Schott über 24 h bestimmt. Es konnte gezeigt werden, dass die beschichteten Gefäße eine deutlich geringere Proteinadsorption sowohl bei niedrigem (pH 4), bei annähernd physiologischem pH-Wert (pH 7.2) und unterschiedlicher lonenstärke der Proteinlösung aufweisen. Gegenwärtig häufig zugesetzte Tenside (z.B. Polysorbat 80), welche die unspezifische Adsorption von Proteinen an Glasgefäßen verringern sollen, zeigten zwar den gewünschten Effekt bei unbeschichtetem Glas, konnten jedoch nicht die positive Wirkung von HPG als Beschichtungsmaterial erzielen (vgl. Abb. 2). c) Adsorption das Antikörpers lgG1 in mg/m2 an mit hochverzweigtem Polyglycerin (HPG(OH)), methylierten hochverzweiqtem Polyglycerin (HPG(OMe)) und linearem Poly(methyl glvcerin) (LPG(OMe)) beschichteten Glasgefäßen sowie an unbeschichteten Fiolax® Glasgefäßen bei unterschiedlicher lonenstärke (170 mM, 22 mM), unterschiedlichen pH-Werten und nach Hitzesterilisation sowie Dampfdrucksterilisation im Verleich zu Monomethoxypolvethylen glvcol (mPEG) beschichteten Glasgefäßen. Die Sterilisation der beschichteten Glasgefäße wurde mittels standardisierter Sterilisationsverfahren, nämlich Hitzesterilisation (2 Stunden, 180°C oder 30 Minuten, 215°C) oder Dampfdrucksterilisation (15 Minuten bei 121 °C und 2 bar autoklaviert) durchgeführt. Die mit HPG(OH) modifizierten Gefäße zeigten kaum eine Änderung der Menge an adsorbiertem lgG1 , wenn die Gefäße hitzesterilisiert wurden sowohl bei 180 °C als auch bei 215 °C (vgl. Abb. 3a und 3b). Im Gegensatz dazu zeigten Gefäße, die mit linearem Poly(methyl glycerin) (LPG(OMe)), hochverzweigtem Polyglycerin mit methylierten Hydroxylgruppen (HPG(OMe)) oder mPEG beschichtet waren, einen Anstieg der Proteinadsorption nach Hitzesterilisation im Vergleich zu den entsprechenden unsterilisierten Gefäßen. Im Vergleich zu unbeschichteten Gefäßen ist der Verlust an Protein durch Adsorption an die Gefäßwand jedoch selbst nach Hitzesterilisation trotz teilweisem thermischen Abbau der HPG(OMe) und LPG(OMe) Beschichtungen immer noch mindestens um 50% reduziert.
Dampfdruck-Sterilisation hatte nur eine geringe Auswirkung auf die Effektivität der polymeren bioinerten Beschichtung, so dass sämtliche Beschichtungen als autoklavierfest bezeichnet werden können. d) Adhäsion (cell number l oVcm2) vier verschiedener Bakterienstämme auf erfindungsaemäß hydrophilen HPG(OH), LPG(OME) und LPG(OH)-beschichteten Glasoberflächen im Vergleich zu unbeschichtetem bzw. hydrophob beschichtetem Glas (HDS).
Sowohl gram-positive als auch gram-negative Prokaryonten wie S. Aureus, P. Aeruginosa, A. Hydrophila und E. Coli K12 zeigen eine stark verringerte Adhäsionsneigung auf derartig beschichteten Glasoberflächen im Vergleich zu unbeschichteten bzw. hydrophob beschichteten Glasoberflächen (HDS) (vgl. Abb. 4). Solch eine gehinderte Adhäsion von Bakterien auf Polyglycerin-beschichteten Gefäßen birgt auch den potenziellen Nutzen, dass wenn derartig beschichtete Gefäße zur Lagerung und Verpackung von„Biopharmazeutika" verwendet werden, dadurch das potentielle Risiko einer bakteriellen Kontamination der Wirkstoffe über die standardmäßig angewendete Sterilisation hinaus reduziert werden kann.
Beispiel 5:
Bestimmung der statischen Wasserkontaktwinkel
Statische Kontaktwinkelmessungen wurden bei 20 °C mit MilliQ Wasser auf beschichteten und nicht-beschichteten Objektträgern durchgeführt wobei die sogenannte „sessile drop" Methode verwendet wurde. Die angegebenen Kontaktwinkel sind der Durchschnitt aus 5 unabhängigen Messungen mit einem Tropfenvolumen von je 2 μΙ_ auf unterschiedlichen Orten auf der zu untersuchenden Oberfläche wobei ein Young-Laplace Fitting zur Auswertung der Daten verwendet wurde. Die Messungen wurden mit einem Goniometer der Firma Dataphysics Contact Angle System OCA durchgeführt und die erhaltenen Bilder wurden digital mit der Software SCA 20 (Dataphysics), ersion 3.12.1 1 analysiert. Je niedriger der Wasserkontaktwinkel ist desto hydrophiler ist die Oberfläche bzw. die Oberflächenbeschichtung. Somit ist der Wasserkontaktwinkel bzw deren Änderung nach erfolgter Beschichtung ein einfacher Nachweis für die erfolgreiche Modifizierung der Oberfläche. Tabelle 1 fasst die Wasserkontaktwinkei verschiedener Polyglycerin- Beschichtungen zusammen.
Tabelle 1
Figure imgf000018_0001
HPG(OH) (4) 21.2 ± 1.1
HDS (5) 107.7 ± 0.8
unbeschichtetes Glas 45.8 ± 0.8

Claims

Verfahren zum Beschichten von Glasoberflächen, insbesondere von Glasgefäßen für Biomoleküle und biologische Materialien, dadurch gekennzeichnet, dass die Glasoberfläche aktiviert wird und auf diese aktivierte Glasoberfläche ein Silyl- modifiziertes Polyglycerol gegeben wird, wobei das modifizierte Polyglycerol so strukturiert ist, dass der oberflächenreaktive Silyl-Linker, der ausgewählt ist aus Trialkoxysilyl, Dialkoxyalkylsilyl oder Monoalkoxydialkylsilyl, über eine Harnstoffbindung an das Polyglycerol gekoppelt vorliegt, und über den Silyl-Linker eine kovalent gebundene Schicht an der Glasoberfläche gebildet wird.
Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass die zur Beschichtung verwendeten oberflächenreaktiven Silyl-modifizierten Polyglycerole aus entsprechenden Mono-amin-funktionalisierten Precursor-Polyglycerolen durch Umsetzung mit den entsprechenden Silyl-propylisocyanaten synthetisiert werden.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass als Polyglycerole hochverzweigte Polyglycerine mit freien Hydroxylgruppen (HPG(OH)) oder mit methylierten Hydroxylgruppen (HPG(OMe)), lineare Polymethylglycerine (LPG(OMe)) oder lineare Polyglycerolen (LPG(OH)) verwendet werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, das als Polyglycerole hochverzweigte Polyglycerine mit freien Hydroxylgruppen (HPG(OH)) verwendet werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass als Silyl-Linker ein Triethoxysilyl-Rest verwendet wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Aktivierung der Glasoberflächen durch eine Piranha-Behandlung, Behandlung mit stark alkalischer Lösung oder Plasmaaktivierung erfolgt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Beschichtung der aktivierten Glasoberflächen mit dem Silyl-modifizierten Polyglycerol in einem polaren protischen Lösungsmittel oder Lösungsmittelgemisch erfolgt, vorzugsweise einem Alkohol.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Glasoberflächen bei Temperaturen von 40 bis 100 °C beschichtet werden, nicht- gebundene Reste entfernt werden und zur finalen Quervernetzung eine Erwärmung auf Temperaturen von 80 bis 120°C erfolgt.
9. Glasgefäße, einschließlich Glasgerätschaften und mikrofluidische Kanäle, für Biomoleküle und biologische Materialien, wobei die Oberfläche, die zur Aufnahme der biologischen Materialien dient, mit einer Antihaftschicht für Biomoleküle versehen ist, die eine Autoklavierung und/oder eine Hitzsterilisation übersteht, wobei die Beschichtung eine Silyi-modifizierte Polyglycerolbeschichtung darstellt, in der der Silyl-Linker, der ausgewählt ist aus Trialkoxysilyl, Dialkoxyalkylsilyl oder Monoalkoxydialkylsilyl, über eine Harnstoffbindung an das Polyglycerol gekoppelt vorliegt.
10. Glasgefäß nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass eine Silyi-modifizierte Polyglycerolbeschichtung basierend auf hochverzweigten Polyglycerinen mit freien Hydroxylgruppen (HPG(OH)) vorliegt, vorzugsweise eine Triethoxysilyl-modifizierte
Polyglycerolbeschichtung.
1 1. Glasgefäß nach Anspruch 9 oder 10, dadurch gekennzeichnet, dass die Silyi- modifizierte Polyglycerolbeschichtung einen Kontaktwinkel zu Wasser zwischen 20 und 50° besitzt.
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