WO2013016836A1

WO2013016836A1 - Preparación de gel de fibrina útil como sistema de implante.

Info

Publication number: WO2013016836A1
Application number: PCT/CL2012/000039
Authority: WO
Inventors: Manuel Eduardo Young Anze; Caroline Ruth Weinstein Oppenheimer; Donald Irving BROWN GONZÁLEZ; Miguel Ángel FUENTES CHANDÍA; Ricardo Andrés CERIANI FERNÁNDEZ; Fernando Antonio ALBORNOZ MÁRQUEZ; Cristian Andrés ACEVEDO GUTIÉRREZ
Original assignee: Manuel Eduardo Young Anze; Caroline Ruth Weinstein Oppenheimer; Brown Gonzalez Donald Irving; Fuentes Chandia Miguel Angel; Ceriani Fernandez Ricardo Andres; Albornoz Marquez Fernando Antonio; Acevedo Gutierrez Cristian Andres
Priority date: 2011-08-03
Filing date: 2012-08-03
Publication date: 2013-02-07
Also published as: PE20141248A1; BR112014002628A2; IL230762A0; US20140242181A1; CO7020845A2; JP2014524269A; EP2740443A1; CL2011001870A1; EP2740443A4

Abstract

La presente invención se dirige a generar un gel de fibrina para la proliferación y vehiculización celular a partir de sangre del paciente o sangre compatible. El procedimiento consiste en tomar sangre del paciente usando citrato sódico como anticoagulante, separar el plasma citratado mediante centrifugación, y resuspender en él, las células a vehiculizar. A la suspensión obtenida se añade CaCl2 para formar el gel (ya sea como coágulo aislado o al interior de una matriz porosa de quitosano/gelatina/ácido hialurónico), y éste se cultiva en un incubador con fines de crecimiento celular. La aplicación del gel será para el crecimiento celular con fines de implante en lesiones cutáneas, de cartílago, gingivales y óseas entre otras, y en ingeniería de tejidos.

Description

PREPARACION DE GEL DE FIBRINA UTIL COMO SISTEMA DE IMPLANTE. MEMORIA DESCRIPTIVA La piel

La piel es un órgano constituido por tres capas celulares: epidermis, dermis e hipodermis, y por los anexos: pelo, uñas, glándulas sebáceas y sudoríparas (Castillo, 2001), como se muestra en la Figura 1. La epidermis es la capa más superficial de la piel y constituye la primera barrera de protección del cuerpo contra sustancias extrañas. Se encuentra constituida por dos grupos de células: queratinocitos o células no dendríticas, y células dendríticas (células de Merkel, de Langerhans y células indeterminadas) (Navarrete, 2003). La epidermis a su vez, está subdividida en 5 estratos:

- Estrato basal o germinativo: como su nombre lo indica, en éste encontramos células germinales necesarias para la regeneración de las capas de la epidermis. Está separada de la dermis por una delgada lámina llamada membrana basal.

Estrato espinoso: Las células comienzan a acumular una gran cantidad de desmosomas (o puentes celulares) en su superficie externa, lo que da una característica espinosa o de púa.

- Estrato granuloso: las células de este estrato acumulan granulos de queratohialina. Estos gránulos contienen lípidos, que junto a los desmosomas, ayudan a formar una barrera impermeable, que previenen en el cuerpo la pérdida de fluidos. Estrato lúcido: representa la transición entre el estrato granuloso y el estrato córneo, y se puede apreciar claramente en la epidermis gruesa (palmas de las manos y plantas de los pies).

Estrato córneo: debido a que las células continúan acumulando granulos de queratohialina (queratinización), se provoca la ruptura de la membrana lisosomal, y con ello, la liberación de enzimas lisosomales, que causan la muerte celular. Las células muertas y las células senescentes que contienen queratina madura, llamados corneocitos, forman el estrato córneo. Las células muertas gradualmente se comienzan a separar del resto, y posteriormente se pierden, proceso conocido como descamación (Haake y col., 2001). Entre la dermis y la epidermis existe una zona llamada unión dermoepidérmica, que posee 4 zonas principales: membrana plasmática de la célula basal, lámina lúcida, lámina densa y zona fibrosa (Hib, 2001).

Dermis

La dermis está situada debajo de la epidermis, y está constituida por tejido conectivo, sustancia fundamental, que junto con los glicosaminoglicanos y proteínas fibrilares forman la matriz extracelular, y células, principalmente fibroblastos, que son los responsables de producir colágeno y elastina, que dan

soporte y elasticidad a la piel (Green, 1991). También posee células del sistema inmune que ayudan en la defensa contra agentes patógenos. La dermis se subdivide en dos zonas:

Dermis papilar: contiene redes vasculares que cumplen dos importantes funciones: la primera es nutrir a la epidermis avascular, y la segunda, es termorregular. La red vascular se interdigita en áreas llamadas papilas dérmicas. En la dermis papilar, también encontramos terminaciones nerviosas sensoriales, como por ejemplo, el corpúsculo de Meissner.

Dermis reticular: consiste en un tejido conectivo denso e irregular. Es importante porque le confiere a la piel firmeza y elasticidad. Además, sirve de soporte a los anexos cutáneos, como glándulas y folículos pilosos (Haake y col., 2001). Hipodermis

Llamada también panículo adiposo o tejido celular subcutáneo. Está constituido por células grasas, que se conocen con el nombre de adipocitos, los cuales se disponen en lóbulos separados por tejido conectivo llamados septos o tabiques interlobulillares (Navarrete, 2003). En la hipodermis se encuentran: la red vascular profunda, porciones inferiores de algunos folículos pilosos, acinos de glándulas ecrinas y apocrinas, corpúsculos sensoriales de Vatter-Puccini, sensibles a cambios de presión y corpúsculos de Ruffíni, sensibles al calor.

Lesiones cutáneas

Dentro de las lesiones que pueden afectar a este órgano, las quemaduras constituyen una de las patologías que con mayor frecuencia ocupan las consultas de urgencia, siendo la variedad de trauma, la que deja en el paciente, en forma más habitual, graves y permanentes secuelas (Aguayo, 1999). Mundialmente, las quemaduras son un serio problema de salud pública. Hay más de 300 mil muertes cada año sólo por incendios. La muerte por quemaduras producto de incendios, está entre las 15 causas de muerte en niños y adultos jóvenes de entre 5 y 29 años. Además, millones de personas quedan con discapacidad o sufren desfiguramiento de por vida (WHO, 2008). De manera esquemática, se puede decir que en Chile, 50.000 personas al año sufren alguna quemadura, 5.000 de ellas se hospitalizan y 500 fallecen. De este total, dos tercios son niños, el grupo de más alto riesgo, junto con los mayores de sesenta años de edad (Castillo, 2003). La principal característica de las lesiones por quemaduras, es la pérdida de la cubierta cutánea, ya sea en forma parcial o total. En el caso de las quemaduras severas, hay pérdida de electrolitos y fluidos, e infección de la piel que puede llegar a desencadenar una infección sistémica (CIGNA Health Corporation, 2008).

Las quemaduras, según el daño causado al tejido, eran clasificadas tradicionalmente en:

- grado 1 o eritematosas, donde la lesión es muy superficial y se regenera en el lapso de una semana sin dejar cicatriz (esto es a nivel de epidermis) grado 2, cuando presentan flictenas (ampollas), donde la lesión abarca epidermis y la capa superficial de la dermis (papilar), y se regenera en un lapso de 8 a 14 días sin dejar cicatriz y,

quemaduras de tercer grado, donde la lesión ocupa el espesor total de la piel, esto es, epidermis, dermis e hipodermis, causando carbonización o un color blanco translúcido en la piel, y no se pueden regenerar por no existir elementos cutáneos para ello (Cienfuegos y col., 2003; Cuenca y Alvarez, 2003).

Sin embargo, un esquema más reciente ha sido descrito. Las lesiones que afectan sólo epidermis son llamadas superficiales. Las quemaduras, que también involucran dermis, son clasificadas como quemaduras de espesor parcial, y estas pueden ser superficiales o profundas (las primeras afectan la dermis papilar y las segundas, tanto dermis papilar como reticular). Las quemaduras que se extienden a través de todas las capas de la dermis y a través de tejido subcutáneo, son llamadas quemaduras de espesor total (Ehrenreich y Ruszczak, 2006). Las úlceras de piel representan otro tipo de lesión frecuente y de difícil tratamiento. Se producen, generalmente, debido a una estasis venosa, diabetes, vasculitis, u oclusión arterial. Se clasifican por estadios 1- 6; siendo el estadio 1 aquel en el que la úlcera no está formada realmente, la piel intacta está simplemente enrojecida, y el estadio 6 aquel en donde hay destrucción de capas externas de la piel (Bolívar-Flores y Kuri-Harcuch, 2000). Dentro de las úlceras de piel podemos encontrar las úlceras venosas, que representan entre el 80-90% del total de las úlceras vasculares. Son más frecuentes en mujeres, con una relación varón-mujer de 1-3. La cronicidad y la recidiva son sus características clínicas más relevantes, la mitad permanecen abiertas por encima de los nueve meses, un 20% lo están hasta los dos años, y un 10%> hasta los cinco, reapareciendo, dentro de los doce meses siguientes a su curación, un tercio de las inicialmente cicatrizadas (CIGNA Health Corporation, 2008). La enfermedad venosa es precursora de la hipertensión venosa (las úlceras por hipertensión venosa, constituyen el mayor porcentaje de entre el total de las vasculares, 75% al 90%), y un factor de riesgo para el posterior desarrollo de úlceras en las extremidades inferiores.

Las úlceras venosas de las extremidades inferiores, se transforman en un problema clínico frecuente, afectando entre el 1 y 2% de la población occidental (Castillo y col., 2004). La disminución de la circulación y las neuropatías, son la causa principal de úlceras de pie en diabéticos, y pueden llevar a la amputación de la extremidad (CIGNA Health Corporation, 2008). En su patogénesis, las alteraciones iniciales ocurren en la macrocirculación venosa, principalmente por reflujo y ocasionalmente por obstrucción. Estas alteraciones causan hipertensión venosa, la que afecta secundariamente la microcirculación, causando depósitos de fibrina pericapilar y activando citoquinas y proteasas que promueven la inflamación. Esto determina la aparición de lipodermatoesclerosis, consistente en un tejido fibroso, con escasa celularidad e irrigación y la consiguiente ulceración (Herouy y col., 2000).

Cicatrización de heridas

La cicatrización de heridas, es un proceso biológico dinámico que involucra complejas interacciones de eventos celulares, moleculares y bioquímicos (Lanza, 2000). En este proceso, ocurren interacciones entre las células de la epidermis y de la dermis, la matriz extracelular, la angiogénesis controlada, y proteínas derivadas del plasma, todo coordinado por una serie de citoquinas y factores de crecimiento (Harding y col., 2002). Este proceso, ha sido tradicionalmente dividido en tres fases distintas: inflamación, proliferación y remodelación (Schilling, 1976).

Hemostasis e inflamación

Esta etapa ocurre, inmediatamente, después de producida la lesión entre los días 4 y 6. El primer paso, es detener el sangrado. Hay contracción de los vasos sanguíneos dañados, y el endotelio y las plaquetas cercanas a la zona activan la vía intrínseca de la cascada de la coagulación. El coágulo formado, está compuesto por colágeno, plaquetas, trombina, y fibronectina (Broughton y col., 2006). Las células atrapadas en el coágulo, mayormente plaquetas, desencadenan la respuesta inflamatoria mediante la liberación de vasodilatadores y quimiotácticos, y la activación de la cascada complementaria (Clark, 1996). El coágulo de fibrina, sirve también como antesala para células invasoras como: neutro filos, monocitos, fibroblastos y células endoteliales (Kurkinen y col., 1980).

En la primera etapa de la inflamación, predominan los neutrófilos. Estos son atraídos al área de la herida por agentes quimiotácticos como: la interleuquina 1 (IL-1), el factor de necrosis tumoral (TNF-α), factor de crecimiento transformante (TGF-β), PF4 y productos bacteriales (Broughton y col., 2006; Tamariz y col, 2002). Los neutrófilos remueven bacterias y desechos celulares de la herida, mediante la liberación de enzimas proteolíticas que digieren las bacterias y el tejido muerto (Broughton y col., 2006). La matriz extracelular dañada es limpiada también por metaloproteinasas de matriz (MPP por sus siglas en inglés), las que son expresadas por queratinocitos, fibroblastos, monocitos y macrófagos en respuesta al TNF-α (Abraham y col., 2000). Posteriormente, el número de neutrófilos disminuye y estos son reemplazados por macrófagos. Estos macrófagos activados, actuarán como mediadores en la angiogénesis (sintetizando factor de crecimiento endotelial vascular [VEGF], factor de crecimiento de fibroblastos [FGF] y TNF-α), en la fibroplasia por la síntesis de TGF-β, factor de crecimiento epidemial [EGF], factor de crecimiento derivado de plaquetas [PDGF], IL-1 y TNF- α y por último, sintetizan óxido nítrico (NO), mediante la activación de la óxido nítrico sintasa inducible por IL-1 y TNF- α (Witte y Barbul, 2002). Los macrófagos cumplen un rol fundamental, y marcan la transición entre la fase inflamatoria y la proliferativa (Harding y col., 2002).

Fase Proliferativa

En esta fase ocurren la epitelización, angiogénesis y la formación de una matriz temporal, y esta etapa transcurre desde el día 4 al 14. Las células predominantes en esta fase, son los fibroblastos y las células endoteliales (Broughton y col., 2006). La epitelización es estimulada, en principio, por citoquinas inflamatorias (IL-1 y TNF-α). Los fibroblastos, por otra parte, sintetizan y secretan factor de crecimiento de queratinocitos (KGF-1 y KGF-2) e IL-6, los que estimulan a queratinocitos vecinos a migrar hacia la zona dañada, a proliferar, y diferenciarse en la epidermis (Smola y col., 1993; Broughton y col., 2006). Los fibroblastos migran al sitio de la herida desde tejidos cercanos, y se vuelven activos (PDGF y EGF son las principales señales para los fibroblastos), así comienzan a sintetizar colágeno, y proliferan para finalmente transformarse en miofibroblastos, que provocan la contracción de la herida (Sage, 2001). Para la formación de la matriz temporal, los fibroblastos (estimulados por PDGF) comienzan a sintetizar, además de colágeno, fibronectina y proteoglicanos como por ejemplo, el ácido hialurónico (Harding y col., 2002; Lynch y col., 1989). El TGF-β, induce también a los fibroblastos a sintetizar colágeno tipo I, disminuyendo también la producción de metaloproteinasas de matriz (MMP) e incrementando la producción de proteínas de adhesión celular (Goldman, 2004).

Los queratinocitos, por otra parte, secretan VEGF (también secretado por macrófagos, fibroblastos y plaquetas), que atrae células endoteliales localizadas en los alrededores, comenzando así, la formación de nuevos vasos capilares. Las células endoteliales, producen también óxido nítrico, que protege al tejido nuevo de los efectos tóxicos de la isquemia y de daños por reperfusión, provocando la vasodilatación del endotelio (Broughton y col., 2006). Fase de maduración y remodelamiento.

Clínicamente, la fase de maduración y remodelamiento es tal vez, la más importante, y va desde el día 8 hasta el año. La etapa final o de remodelación, se caracteriza por formación de la matriz extracelular, que inicialmente está compuesta por fibrina y fibronectina. Luego, los fibroblastos comienzan a sintetizar glicosaminoglicanos, proteoglicanos, y otras proteínas (Broughton y col., 2006). Esta matriz temporal es reemplazada, posteriormente, por una matriz más rígida y organizada compuesta principalmente por colágeno (en el tejido de granulación el colágeno tipo III alcanza el 30%, mientras que en la cicatriz madura está bajo el 10%). Las proteinasas presentes en la remodelación de la matriz, se ven reguladas por cambios en las concentraciones de TGF-β, PDGF, IL-1 y EGF.

La actividad de MMP es suprimida además, por inhibidores de MMP producidos por fibroblastos presentes en el tejido (Henry y Garner, 2003). La síntesis de colágeno continuará por al menos 4 a 5 semanas después de ocurrida la lesión (Diegelmann, 2003). El colágeno en la cicatriz, nunca estará tan organizado y estructurado (incluso después de un año), como el colágeno encontrado en la piel sana. La resistencia y firmeza de la piel tampoco volverá a ser 100% normal (Broughton y col., 2006). Posterior al cierre de la herida, el remodelamiento de la cicatriz resultante puede ser de meses o años, y deja como resultado, una reducción en la cantidad de células y una disminución del flujo sanguíneo en el tejido cicatrizado (Harding y col., 2002). En conclusión, la cicatrización de una lesión de espesor total, requiere la reepitelización desde los límites de la herida, mediante la proliferación y migración de queratinocitos, a través de una matriz extracelular temporal, convertida después en tejido de granulación, que será finalmente remodelado a neodermis (Clark, 1996; Tamariz y col., 2002).

Substitutos dérmicos

La necesidad de obtener rápido cierre de la herida en quemados extensos, hizo desarrollar métodos de expansión y reproducción de células de dermis y epidermis autólogas o heterólogas in vitro (Green y col., 1979) Es así, como hoy en día, es posible realizar un cultivo en serie de distintas fórmulas celulares (queratinocitos puros o mezclados con fibroblastos). A partir de una pequeña biopsia, la epidermis humana se puede cultivar en grandes cantidades de tres a cuatro semanas y usarse como autoinjertos, pudiendo cubrir la superficie corporal total de un adulto (Cuenca y Álvarez, 2003). El uso de autoinjertos y aloinjertos de epidermis cultivada, se ha constituido como parte de la terapia del paciente quemado. De hecho, las Guías Clínicas del Gran Quemado, elaboradas por expertos chilenos para guiar el tratamiento en el marco de las Garantías Explícitas de Salud, incluyen el uso de queratinocitos cultivados (MINSAL, 2007). Estudios clínicos demuestran que los aloinjertos de epidermis humana, cultivada in vitro, actúan como un aposito biológicamente activo, que reduce el

tiempo de epitelización en quemaduras de segundo grado profundo, zonas donadoras de autoinjertos, dermoabrasión y úlceras por venostasis o diabetes (Sosa y col., 1999). Es así, como hoy en día, están disponibles una serie de substitutos dérmicos, como se muestra en la Tabla 1 :

Tabla 1: Diferentes tipos de substitutos dérmicos (Dini y col., 2006).

En la actualidad, se han desarrollado una serie de biomateriales sintéticos que actúan como microambientes extracelulares, imitando las características reguladoras que tiene la matriz extracelular natural (ECMs).

Los biomateriales juegan un rol central en las estrategias modernas de la

medicina regenerativa y la ingeniería en tejidos, como diseño de un medio biofísico y bioquímico que dirige funciones y comportamiento celular. Esto puede facilitar la restauración de estructuras o funciones del tejido disfuncional o dañado.

Los biomateriales proporcionan así, un soporte provisional que interactúa biomolecularmente con las células, guiando espacial y temporalmente los complejos procesos multicelulares de formación y regeneración de tejidos (Lutolf y Hubbell, 2005; Bacákova y col., 2004). Por lo tanto, el fin de estos biomateriales es imitar, en cierto grado, los procesos que ocurren in vivo. El substituto dérmico o biomaterial sintético ideal, debe tener o cumplir con las siguientes características: ausencia de antígenicidad, compatibilidad con el tejido, ausencia de toxicidad local o sistémica, impermeabilidad frente a microorganismos exógenos, adherencia rápida y sostenida a la superficie de la herida, elasticidad, para permitir el movimiento del tejido, resistencia, debe ser traslúcido para permitir la directa observación de la cicatrización, tener un bajo costo, que cause mínima incomodidad en el paciente, que reduzca el tiempo de sanación, entre otros. (Ehrenreich y Ruszczak, 2006; Smith y col., 1988).

Los avances terapéuticos que se han logrado para los productos desarrollados por la ingeniería en tejidos, están basados en 3 estrategias:

el uso de células sin matriz (como el transplante de células autólogas o la terapia con células troncales)

el uso de polímeros sintéticos con o sin factores de crecimiento y citoquinas

el uso de una matriz tridimensional con células en ella (Jiménez y Jiménez, 2004).

Existe un gran número de estos sistemas experimentales disponibles. Estos van desde matrices derivadas de células o tejidos (Ej.: Matrigel), hidrogeles de polímero sintético, hasta matrices compuestas por proteínas recombinantes. También han sido desarrolladas superficies bioinertes, utilizando moléculas como proteína albúmina antiadhesiva, hidrogeles basados en ácido hialurónico o poli (hidroxil etil metacrilato), alcohol polivinílico, poliacrilamida, dextrán y particularmente polietilenglicol (PEG) (Bacákova y col., 2004).

Es así como, los biomateriales derivados de ECMs natural, pueden ser usados como soportes para células transplantadas, que serán posteriormente implantadas sobre tejido lesionado, y también para inducir la regeneración y remodelación in vivo. Por ejemplo, el colágeno y la fibrina como matrices, están clínicamente establecidas y aprobadas por la FDA (Food and Drug Administration), en el tratamiento de quemados, para la cicatrización de heridas y en reparación de tejidos, respectivamente (Lutolf y Hubbell, 2005; Van Dorp y col., 1998). Los productos a base de fibrina, contienen dos componentes aislados del plasma humano: fíbrinógeno y trombina. La combinación de estos dos componentes da como resultado, la formación de un coágulo de fibrina, que es usado para alcanzar la hemostasis, y el cierre de la herida en procesos quirúrgicos (Geer y col., 2002).

En un estudio realizado por Cox y col., 2004, se analizó el coágulo de fibrina como medio de transporte de fibroblastos dérmicos humanos, y además se evaluó, la proliferación y migración de estos en diferentes formulaciones de coágulos, variando las concentraciones de fíbrinógeno y trombina, llegando a la conclusión de que la variación en las concentraciones de ambos componentes, afectaba el comportamiento de los fibroblastos en los coágulos de fibrina tridimensionales.

El primer substituto dérmico disponible en el mercado, utilizó un colágeno análogo basado en el colágeno bovino y condroitin 6 - sulfato con una cubierta externa de silastic (Integra®) (Burke y col., 1981).

Dermagraft® es una modificación del substituto dérmico compuesto anteriormente, donde en lugar del colágeno bovino, fibroblastos obtenidos de prepucio de recién nacidos, son cultivados sobre una malla de nylon y cubiertos

con una capa exterior de silicona (Dermagraft Transitional Covering). Está diseñado para cubrir la capa dérmica de la piel y para estimular una mejora en el proceso de cicatrización (Mansbridge y col., 1998).

Existen también otros tipos de substitutos dérmicos, que incorporan tanto componentes epidérmicos como dérmicos (substitutos mixtos o compuestos). El primer substituto compuesto fue desarrollado por Ortec International Inc., e integraba fibroblastos y queratinocitos de recién nacidos, cultivados sobre una matriz porosa entrecruzada con colágeno bovino tipo 1. Sin embargo, el uso de este substituto es limitado, ya que la FDA lo ha aprobado sólo para dos indicaciones: el tratamiento de reconstrucción de mano en pacientes que padecen de epidermolisis bulosa distrófica recesiva y como ayuda en la cicatrización de zonas donadoras de autoinjertos en pacientes quemados (Pham y col., 2002; Eisenbud y col., 2004).

Grañskin (Apligraj®) también es un substituto mixto, pero con múltiples aplicaciones. Fue desarrollado para la cobertura de heridas de espesor total. Es un injerto mixto alogénico que consiste en células epidérmicas humanas, fibroblastos humanos y colágeno bovino tipo 1, que entrega 4 componentes: queratinocitos epidérmicos, un estrato córneo bien diferenciado, matriz extracelular y fibroblastos dérmicos alogénicos viables (Pham y col., 2002; Veves y col., 2001). Por otro lado, Mylan Laboratories, Inc., desarrolló Biobrane, que es un producto biosintético, constituido por un film de silicona ultradelgado y semipermeable, con fibras de nylon parcialmente embebidas en el film, unido químicamente a colágeno de origen porcino (UDL Labs, 2008). Es usado, principalmente, en pacientes con quemaduras de espesor parcial y en heridas relativamente frescas (<24 - 48 horas) (Gerding y col., 1990). Otro producto de la bioingeniería, que fue aprobado por la FDA en 1997, pero que posee un elevado costo, es TransCyte®, compuesto por fibroblastos humanos de recién nacidos, cultivados bajo condiciones asépticas sobre el componente de la malla de nylon de Biobrane. Los fibroblastos secretan en la malla, componentes de la matriz extracelular, como fibronectina, colágeno tipo 1, decorina y factores de crecimiento ligados a la matriz (Ehrenreich y Ruszczak, 2006; Noordenbos y col., 1999). Sin embargo, en la mayoría de los casos, es difícil argumentar el uso de estos costosos productos (por ejemplo en zonas donadoras de piel) cuando hay alternativas más económicas y efectivas, que ya están disponibles, como Biobrane y los implantes convencionales para la cobertura de heridas. En pacientes extensamente quemados, en donde las zonas donadoras de autoinjertos están limitadas o no son adecuadas (para poder utilizarlas se requiere dos o más semanas), podría justificarse el uso de biomateriales que proporcionarán una cobertura temporal de la herida, promoviendo así, una cicatrización más rápida y de mejor calidad (Sosa y col., 1999; Bar-Meir y col., 2006).

Existen, por el contrario, biomateriales de menor costo, y que han sido utilizados ampliamente en la Ingeniería de Tejidos, como es el caso del Quitosano y del Acido Hialurónico. El primero, es un carbohidrato complejo, biodegradable y no tóxico, derivado de la quitina, que ha demostrado tener actividad mucoadhesiva, esto lo convierte en un excelente agente hemostático (Wedmore y col., 2006). Además, posee otras propiedades biológicas (antibacteriano y antifúngico) y afecta la función de macrófagos, lo que ayuda a una rápida cicatrización. También, tiene capacidad para estimular la proliferación celular y la organización histoarquitectónica de los tejidos (Paul y Sharma, 2004; Fukasawa y col., 1992). Por otra parte, el Acido Hialurónico (HA), es un glicosaminoglicano que se encuentra en la piel normal en los espacios intercelulares de la epidermis, excepto en la capa granular y estrato córneo. Además de ser una matriz en la cual las células están embebidas, se descubrió que tiene numerosas funciones en la piel: puede retener agua en los tejidos, debido a esto cambia el volumen y compresibilidad dérmica; puede también mejorar la proliferación y diferenciación celular y la reparación del tejido dañado (Juhlin, 1997; Laurent y Fraser, 1992).

En el marco de un proyecto FONDEF (0211009) desarrollado por los inventores de la presente solicitud, se creó un sustituto dérmico denominado Sistema de Implante Integrado (SU), que consiste en un soporte polimérico que integra en su matriz queratinocitos y fibroblastos autólogos, los cuales son proporcionalmente combinados sobre fibrina que se polimeriza in situ, sobre una matriz compuesta por gelatina-quitosán-ácido hialurónico. El sistema desarrollado se denomina integrado, porque las células no se ubican en la superficie del soporte sino embebidas en él (Young y col., 2006). Este sistema ha demostrado una excelente adherencia a la zona de la lesión y, por otra parte, no se han observado reacciones de toxicidad ante los componentes del sistema.

Además, estudios publicados por los propios inventores de la presente solicitud muestran que células de piel encapsuladas en fibrina, exhiben un patrón de crecimiento diferente a células cultivadas en frascos de cultivo convencionales (Figura 2). Un inconveniente encontrado por el grupo de investigación, ha sido el alto costo de los materiales de grado clínico, que limitan los riesgos de contraer enfermedades infecciosas con estos materiales y que son indispensables para aplicar el SU en humanos. Entre estos materiales, el fibrinógeno y trombina han sido los que más exceden en precio al utilizar equivalentes aprobados para uso humano. Por este motivo, surge la necesidad de generar trombina autóloga, utilizando plasma del paciente como una forma de disminuir costos. Ello crea el requerimiento de estudiar las condiciones para crear un coágulo óptimo que permita el crecimiento celular, especialmente al interior del SIL

DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION

El problema técnico planteado en la presente solicitud consiste en proveer un producto y sistema preferentemente autólogo que permita inmovilizar, proliferar y vehiculizar células dentro de una matriz con fines de regeneración tisular.

La búsqueda de biomateriales que potencien el crecimiento celular es un fértil terreno. Se requieren materiales que imiten el medio extracelular de las células con sus características tridimensionales. Dentro de estos biomateriales se han utilizado colágeno, gelatina, alginato y otros materiales. Entre estos, el uso de fibrina ha demostrado extraordinarias propiedades para promover el crecimiento de células de piel. Sin embargo, en la aplicación clínica de estos cultivos para el tratamiento de lesiones cutáneas se encuentra con la desventaja que se debe utilizar sólo materiales de "grado clínico". Estos últimos existen y se denominan Tissucol® y Beriplast® en la clínica se usan como sellantes de fibrina en diferentes procedimientos quirúrgicos. Se ha comprobado estos productos mantienen las propiedades de promoción de crecimiento celular detectada con la combinación de trombina y fibrinógeno de grado investigación in vitro. No obstante lo anterior el costo de estos productos, dado los complejos análisis microbiológicos que requieren, los hace incompatible con la posibilidad de crear un producto comercial que contenga fibrina y permita cubrir extensas áreas de piel dañada. Además se requieren materiales que sean seguros para el ser humano, libres de componentes animales y de riesgos de transmisión de enfermedades conocidas y emergentes. Un producto de origen autólogo, siempre será más seguro desde el punto de vista microbiológico que uno heterólogo, puesto que aunque este contaminado, volverá al mismo hospedero. Por otra parte, desde el punto de vista inmunológico, los anticuerpos y otras proteínas presentes en el mismo serán las ya existentes en el individuo, eliminándose la posibilidad de rechazo inmunológico.

La presente invención se dirige a generar un gel de fibrina para proliferación y vehiculización celular a partir de la propia sangre del paciente o sangre compatible. La sangre en razón de 200 uL por cm de implante a preparar se toma usando citrato sódico como anticoagulante en una razón de 0,09g por mL de sangre. El plasma citratado es separado mediante centrifugación. Luego las células se resuspenden en este plasma. Para formar el gel ya sea como coágulo aislado o al interior de una matriz porosa se procede a agregar una solución de CaCl₂. El producto así desarrollado es de costo muy inferior a los fibrin glue comerciales y por el hecho de ser un producto autólogo elimina el riesgo de infecciones y de rechazo inmunológico, aún cuando puede ser complicado obtener grandes volúmenes de sangre de un paciente comprometido, esto se puede superar utilizando sangre compatible. Este sistema ha sido utilizado para el tratamiento de lesiones cutáneas con resultados positivos. La aplicación será para el crecimiento celular con fines de implante en lesiones cutáneas, de cartílago, gingivales y óseas, entre otras. Se puede prever que cualquier aplicación en el campo de la ingeniería de tejidos se puede valer de esta tecnología.

La novedad la constituye el incorporar las células a un coágulo de fibrina usando plasma en vez de fibrina y trombina purificadas. Los fibrin glue contienen ambos componentes y algunos otros de la sangre, pero no son equivalentes al plasma porque son purificados. Además incorporan aditivos, tales como inhibidores de proteasas que no están presentes en el plasma.

Todas las referencias mostradas son formas de generar el coágulo de fibrina, no formas de integrar las células a un coágulo de fibrina con fines de ingeniería de tejidos.

Existen numerosas publicaciones que avalan el potencial de crecer células en coágulos de fibrina. Para ello se adquiere fibrinógeno y trombina comercial o bien se usa preparados comerciales conocidos como fibrin glue, siendo los más populares el Tissucol (Baxter) o Beriplast (CSL Behring). Estos productos permiten suspender las células en trombina y luego se agrega el fibrinógeno para que se forme un coágulo que contiene las células. El problema es que para realizar esto con fines clínicos y comerciales se debe gastar mucho dinero por cuanto el producto de grado clínico es muy caro. Además es difícil estar 100 % seguro que no transmitirá algún virus o microorganismo desconocido para el cual no existan pruebas de detección con sensibilidad apropiada.

Surge así la idea de generar fibrina para crecimiento celular a partir de la propia sangre del paciente para formar el gel ya sea como coágulo aislado o al interior de una matriz porosa.

De acuerdo a lo anterior, el producto generado en la presente invención posee como principales ventajas que presenta un costo muy inferior a los "fibrin glue" comerciales y que por ser un producto autólogo elimina el riesgo de infecciones y de rechazo inmunológico. Por otro lado posee como desventaja el que puede ser complicado obtener grandes volúmenes de sangre de un paciente comprometido, lo que se resuelve utilizando sangre compatible.

Para el sustento de la invención se ha venido desarrollando un número de pruebas clínicas que incorporan las células en una matriz porosa mediante el uso de sangre autóloga. Este sistema ha sido utilizado para el tratamiento de lesiones cutáneas con resultados positivos.

Un objeto de la presente invención corresponde a la aplicación para crecimiento celular con fines de implante en lesiones cutáneas, de cartílago, gingivales, óseas, entre otras.

La literatura de patentes muestra productos homólogos que difieren de la invención en aspectos fundamentales. A continuación una descripción de lo más relevante conocido en patentes:

Beretta & Grippi en la patente US2009258056 y WO2007021344 y Beretta & Lodi US6368298, desarrollaron métodos para regenerar tejidos en un organismo vivo, el cual incluye el poner en contacto el área afectada con una red de fibrina sólida que contiene plaquetas que liberan factores de crecimiento El gel es acelular, a diferencia de la presente invención, y contiene plaquetas que provienen de la sangre del paciente. Las células que incorpora la presente invención, son preferentemente fibroblastos y queratinocitos obtenidos previamente desde una biopsia, cultivados en el laboratorio y vehiculizados en un gel de fibrina.

Del mismo modo Baugh & Lim en las patentes US2005152886, US2002159985 y US6444228, y Hirsch & Johnston en la patente EP0820314 describen métodos para obtener sellante de fibrina autólogo, el cual no contiene las células incorporadas sino tan sólo plaquetas. La patente publicada con el número US5185001 de Galanakis D. describe un kit que contiene todos los elementos para producir un coágulo de fibrina a partir de plasma autólogo con fines de ser utilizado con fines de inducir hemostasis (coagulación en una herida), pero no reporta la inclusión de células.

Por otra parte, en la solicitud Chilena CL 200201439 se describe la obtención de un sustituto dérmico a partir de plasma utilizando cloruro cálcico, durante la gelificación, pero al igual que las invenciones anteriormente descritas no se incorpora el componente celular proveniente de un cultivo. Se menciona que permite ser invadido por células y vasos sanguíneos, pero se refiere a aquellos del lecho de la herida y no proporcionados en forma exógena.

Adicionalmente, existe una cantidad importante de manuscritos científicos además de algunas patentes como las ya mencionadas que persiguen investigar y/o el mismo problema técnico, sin embargo, todos son formas de generar el coágulo de fibrina, no formas de integrar las células a un coágulo de fibrina con fines de ingeniería de tejidos. Todos los documentos al respecto se adjuntan más adelante en el ítem referencias, incluyendo aquellos ya discutidos en esta memoria.

EJEMPLOS

Los ejemplos que a continuación se señalan se incorporan a título exclusivamente ilustrativo para favorecer la comprensión del pliego y no significan que limiten en modo alguno los alcances de las reivindicaciones que se solicitan.

Ejemplo 1: Obtención y cultivo de fibroblastos humanos

Los fibroblastos humanos, se obtienen desde prepucios de cirugías debido a fimosis en menores de 6 años. La biopsia se lava en una placa Petri estéril con 5 mi de solución de Buffer Fosfato

Salino 0,1 M pH 7,4 (PBS) (GIBCO®), que contiene una mezcla de antibióticos penicilina/estreptomicina (100 U/mL /100 μg/mL, Invitrogen®) y anfotericina B 250 μg/mL

(Fungizone®, Invitrogen). Para obtener fibroblastos y queratinocitos por separado, la muestra se incuba en tripsina 0,5 %-EDTA 5,3 mM (GIBCO®), por 30 minutos a 37°C en incubador Thermo Forma®. Posteriormente, mediante la utilización de pinzas estériles, se separa mecánicamente, la dermis y la epidermis. La dermis, se trata por 20 minutos con colagenasa tipo

I (Invitrogen®) 2 mg/mL a 37 °C. Luego, la suspensión celular obtenida es centrifugada y el precipitado obtenido se lava con PBS para remover la enzima. Su viabilidad celular se determina mediante el colorante de exclusión azul de Tripán. Esto se realiza, mediante la observación microscópica de una alícuota de suspensión celular mezclada con el colorante azul de Tripán en proporción 1 : 1. Luego, esta suspensión se coloca en cámara de Neubauer y se cuenta las células viables mediante observación en microscopio invertido Lieder®. Los fibroblastos humanos obtenidos luego de la digestión enzimática, fueron resuspendidos en medio de cultivo Dulbecco 's Modified Eagle 's médium (DMEM, GIBCO®) suplementado con un 10% de suero bovino fetal (INVITROGEN®), 50% medio F12 de Ham (GIBCO®) y 10 \JUTDL Biomyc 1 (Biological Industries®) en frascos de cultivo T-25 (Falcon®), que fueron incubados en incubadora ThermoForma, en una atmósfera humidificada con 5% de C0₂ y a una temperatura de 37°C.

Ejemplo 2: Obtención y evaluación de coágulos fibrina de origen humano

Obtención del plasma'. El plasma se separa desde sangre entera recolectada en tubos con citrato de sodio al 3,2%, centrifugando a 453 x g por 5 minutos. El plasma separado en condiciones de esterilidad, bajo campana de bioseguridad, se almacena a -20°C hasta su utilización.

Prueba de coagulación mediante observación visual: Las pruebas iniciales de coagulación, se realizan en tubos de microcentrífuga, probando diferentes concentraciones de calcio, denominadas formulaciones (F). Para esto, se utiliza un volumen de plasma citratado constante de ΙΟΟμί con diferentes volúmenes de las diluciones de CaCl₂, para obtener distintas concentraciones finales del mismo, generándose 30 formulaciones, tal como se ilustra en la Tabla 2: Tabla 2. Formulaciones de coágulos según las concentraciones de CaCl₂.

Después de preparar las 30 formulaciones, éstas se incubaron con el volumen constante de plasma a 37°C durante 20 minutos. Se evalúa así, de manera visual, si hay o no coagulación en cada formulación. Además, cada coágulo se retira con pinzas del tubo de microcentrífuga para evaluar su resistencia mecánica, y escoger así las 6 mejores formulaciones, sobre la base de la existencia de coágulo y de que presenten mayor resistencia mecánica. Para la determinación del tiempo de coagulación se utiliza el coagulómetro (BBL Fibrosystem), que permite determinar, en forma más precisa, el tiempo en el que se forma el coágulo. Esta prueba se realiza sólo en las 6 formulaciones preseleccionadas en la etapa preliminar. La estabilidad del coágulo se determina en 6 coágulos de las formulaciones elegidas con medio de cultivo (DMEM, GIBCO®), suplementado con un 10% de suero bovino fetal (INVITROGEN®), 50% medio F12 de Ham (GIBCO®). Posteriormente, se incuban a 37°C. El grado de disgregación se evalúa visualmente al día 3 (Figura 3).

Ejemplo 3. Preparación de matriz polimérica

Preparación de polímero base: Para el polímero base se preparadan las siguientes soluciones: gelatina 1% p/v, quitosano 2% p/v en ácido acético 1% v/v, y ácido hialurónico 0,01% p/v y se sigue el siguiente protocolo: Se mezcla la solución de gelatina con la de quitosán y la de ácido hialurónico, y se homogeniza durante 30 minutos con agitador magnético a 50°C.

- . La mezcla se vierte en placas Petri que fueron refrigeradas a 4°C hasta la formación del gel.

- Después, se congela el gel lentamente a -20°C durante 8 horas.

Luego, el polímero se lleva a -80°C por 8 horas.

El polímero se sumerge lentamente en nitrógeno líquido durante 3 minutos.

Finalmente, se liofiliza por 48 horas en liofilizador Liobras LT01. Entrecruzamiento'. Para el entrecruzamiento del polímero base se realiza el siguiente procedimiento:

Se sumerge el liofilizado en MES 50 mM (Acido 2-Morfolinoetano sulfónico), por 30 minutos.

Luego, esta solución se descarta y se agrega solución entrecruzante compuesta por MES 50 mM, EDC 30 mM (l-etil-[3,3-dimetilaminopropil] carbodiimida) y NHS 8 mM (N- hidroxisuccinimida). Se deja reaccionar durante 2 horas.

Se lava posteriormente con etanol y se congela.

Una vez congelada, se sumerge en nitrógeno líquido por 3 minutos.

Finalmente, se liofiliza por 24 horas.

Ejemplo 4: Estudio del crecimiento y proliferación celular para superficies seleccionadas.

Para este experimento, se utiliza la técnica de MTT [(3-4,5-dimetiltiazolil-2) - 2,5 - difeniltetrazolio bromuro], que permite la cuantificación de células viables. Esta técnica se basa en la reducción del MTT, sólo por aquellas células

metabólicamente activas, en un compuesto llamado formazan, un cristal azulpurpúreo soluble, que puede ser cuantifícado mediante espectrofotometría a 540nm. Ensayo MTT: La obtención de fibroblastos para este ensayo se realiza de la siguiente forma:

Los frascos de cultivo T-75 (Falcon®) con fibroblastos, se lavan con PBS, para luego ser tripsinizados. La suspensión celular, se deposita en un tubo de centrífuga desechable de 50 mi, y centrifugada a 453xg por 5 minutos. Luego, el precipitado obtenido se resuspende para verificar el número de células viables.

Una vez realizado el conteo celular, se vuelve a centrifugar la suspensión, y una parte de las células se resuspende en medio de cultivo (DMEM, GIBCO®), suplementado con un 10% de suero bovino fetal (INVITROGEN®), 50% medio F12 de Ham (GIBCO®) y una mezcla de antibióticos penicilina/estreptomicina (100 U/ml/ 100μg/ml), INVITROGEN®), y la otra en plasma. Este ensayo se realiza en placas de 96 pocilios de fondo plano (Falcon®), donde se evalúa la proliferación de los fibroblastos, utilizando diferentes superficies para su cultivo. El ensayo se realiza desde el día 0 hasta el día 3, es decir, a las 0, 24, 48 y 72 horas, y cada condición se evalúa por triplicado con su control respectivo para cada día. Además, para el ensayo, sólo se considera las dos mejores formulaciones anteriormente seleccionadas.

Se detalla a continuación el ensayo MTT, para examinar la proliferación de fibroblastos sobre diferentes superficies:

Condiciones de experimentación (Figura 4):

Monocapa: los fibroblastos humanos resuspendidos en medio (5x10⁶ células por pocilio), se cultivan directamente al pocilio con 150μί de medio de cultivo.

Matriz Polimérica: se coloca la matriz polimérica en cada pocilio y se depositan los fibroblastos humanos resuspendidos en medio (5x10⁶ células por pocilio). Se agrega medio de cultivo hasta completar 150μΕ.

Coágulo F17: se depositan 30μί de plasma con fibroblastos humanos (5xl0⁶ células por pocilio), y a esto, se le agrega 45μΕ de CaCl₂ 30mM. Se incuba a 37°C hasta la formación del coágulo y luego se agrega medio de cultivo hasta completar 150μΕ. Coágulo F27: se depositan 30μί de plasma con fibroblastos humanos (5xl0⁶ células por pocilio), y a esto, se le agrega 22,5μΙ, de CaCl₂ 50mM. Se incuba a 37°C hasta la formación del coágulo, y luego se agrega medio de cultivo hasta completar 150μί.

SU con FI 7: sobre matriz polimérica se depositan 30μΙ, de plasma con fibroblastos humanos (5xl0⁶ células por pocilio), y 45μί de CaCl₂ 30mM. Se incuba a 37°C hasta la formación del coágulo, y luego se agrega medio de cultivo hasta completar 150μί.

SU con F27: sobre matriz polimérica se depositaron 30μΙ, de plasma con fibroblastos humanos (5xl0⁶ células por pocilio), y 22,5μί de CaCl₂ 50mM. Se incuba a 37°C hasta la formación del coágulo, y luego se agrega medio de cultivo hasta completar 150μί.

Procedimiento del MTT: Una vez montado el experimento con las diferentes condiciones de cultivo celular, se realiza el ensayo MTT para el día 0 (0 horas) para establecer valores de viabilidad celular al tiempo de inicio del experimento. Este procedimiento se repite posteriormente a las 24, 48 y 72 horas. El procedimiento consiste en:

Agregar 50μί de solución de MTT a cada pocilio correspondiente al día en evaluación e incubar a 37°C durante 4 horas.

Posteriormente, se extrae cada solución de los pocilios y se transfiere a tubos de microcentrífuga correspondiente para cada muestra.

A cada pocilio de le agrega 150μΕ de tripsina 10%. Se lleva nuevamente la placa a la incubadora a 37°C por 1 hora.

- Finalmente, se agrega 300μί de buffer de lisis a cada pocilio (para monocapa 400μΕ), se repipetea enérgicamente, y se transfiere la solución a cada tubo de microcentrífuga (esto se realizó en dos pasos, primero se agrega ΙΟΟμί ó 200μΙ,, según corresponda, y en una segunda etapa se agrega los 200μί restantes).

Los tubos se mantienen a -20°C hasta su cuantificación fotométrica. Para ello se descongelan los tubos de microcentrífuga con las muestras de cada día.

Una vez descongelados los tubos, se agitan enérgicamente mediante vórtex. Luego se aplica ultrasonido durante 30 minutos.

Los tubos se vuelven a homogenizar mediante vértex .

Se vuelve a aplicar ultrasonido por 30 minutos.

Posteriormente, se centrifuga a 17.949xg por 15 minutos.

- Cuidadosamente, se extraen los sobrenadantes libres de partículas de cada tubo, y se depositan 200μί de cada muestra en una placa de 96 pocilios.

Finalmente, la absorbancia se lee en lector de placas ELISA SENSISCAN (MERK®) a

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DESCRIPCION DE LAS FIGURAS

Figura 1: Estructura de la piel. (1) Pelo, (2) glándulas sudoríparas, (3) lámina

basal, (4) vasos sanguíneos (Hib, 2001)

Figura 2. Histología e Inmunohistoquímica de células microencapsuladas. A, una célula en una zona homogénea de fibrina teñida con azul de metileno (día de microencapsulación); B, célula en metafase ubicada cerca de la fibrina teñida con eritrosina (48 horas después de la microencapsulación); C, tres células embebidas en el gel de fibrina (24 horas después de la microencapsulación); D, un par de células ubicadas en los poros de la matriz de fibrina (48 horas después de la microencapsulación); E, grupo de células ubicadas dentro del gel de fibrina (96 horas después de la microencapsulación); F, ampliación del racimo de células de la Figura E (flechas) donde se observa una célula en metafase; G-I, Inmunohistoquímica de un racimo de células creciendo en un gel de fibrina; G, control con tinción Arteta; H, inmunolocalización para citoqueratina e I, inmunolocalización para vimentina (Acevedo y col., 2008).

Figura 3. Estudio de estabilidad de coágulos seleccionados (F17, F22, F23, F27). Panel A: apariencia a tiempo de inicio. Panel B: apariencia a los tres días post-incubación a 37°C.

Figura 4. Curvas de crecimiento para fibroblastos humanos, cultivados sobre las superficies mencionadas. Se indican diferencias estadísticamente significativas en crecimiento con respecto al día 0 (*) (ANOVA, p < 0,05).

Claims

REIVINDICACIONES

1. Proceso de preparación de un gel de fibrina autóloga o desde sangre compatible para proliferación y vehiculización celular CARACTERIZADO porque comprende los pasos de: a) Tomar una cantidad de sangre del mismo paciente, a razón de 200 DL por cm de implante a preparar, usando citrato sódico como anticoagulante en una concentración de 0,09 g por mL de sangre

b) Separar el plasma citratado mediante centrifugación a 3000rpm por diez minutos a 4°C. Re-suspender las células a vehiculizar en el plasma obtenido en el paso anterior- c) Agregar a la suspensión obtenida en el paso anterior una solución de CaCl₂ 10% para formar el gel ya sea como coágulo aislado o al interior de una matriz porosa.

Cultivar el gel en incubador a 37°C en ambiente humidificado y 5% de C0₂, con fines de crecimiento celular.

2. Proceso de acuerdo a la reivindicación 1, CARACTERIZADO en que la muestra de sangre del paciente o sangre compatible es mantenida no coagulada mediante citrato de sodio.

3. Proceso de acuerdo a la reivindicación 2, CARACTERIZADO en que la muestra de sangre del paciente o sangre compatible, es mantenida no coagulada preferentemente utilizando citrato de sodio.

4. Proceso de acuerdo a la reivindicación 3, CARACTERIZADO en que la muestra de sangre del paciente o sangre compatible es mantenida no coagulada preferentemente utilizando citrato de sodio en una relación de 2,5 mL de sangre con alrededor de 0,05 a 0,1 g/mL de citrato de sodio

5. Proceso de acuerdo a la reivindicación 3, CARACTERIZADO en que la muestra de sangre del paciente o sangre compatible es mantenida no coagulada preferentemente utilizando citrato de sodio en una relación de:

• ΙΟΟμΙ. de plasma citratado con ΙΟΟμΙ. de solución de CaCl₂ 30mM.

• ΙΟΟμί de plasma citratado con 150μί de solución de CaCl₂ 30mM

· · ΙΟΟμΙ de plasma citratado con 200μΙν de solución de CaCl₂ 3 OmM

• ΙΟΟμΙ. de plasma citratado con 75μί de solución de CaCl₂ 40mM.

• ΙΟΟμί de plasma citratado con ΙΟΟμί de solución de CaCl₂ 40mM.

• ΙΟΟμί de plasma citratado con 150μΙ. de solución de CaCl₂ 40mM.

• ΙΟΟμί de plasma citratado con 200μί de solución de CaCl₂ 40mM.

• 100 μί de plasma citratado con 5 Ομί de solución de CaCl₂ 5 OmM.

• 100 μί de plasma citratado con 75μΙ. de solución de CaCl₂ 50mM.

• 100 μΐ. de plasma citratado con ΙΟΟμΙ_^ de solución de CaCl₂ 50mM.

6. Proceso de acuerdo a la reivindicación 1, CARACTERIZADO porque la cantidad de sangre extraída al paciente o sangre compatible es entre alrededor de 2,5 mL a 250 mL.

7. Proceso de acuerdo a la reivindicación 6, CARACTERIZADO porque alrededor de 2,5 a 250 mL de sangre en citrato de sodio es sometida a centrifugación a 453 x g por 5 minutos.

8. Proceso de acuerdo a la reivindicación 7, CARACTERIZADO en que el producto de la centrifugación debe ser congelado a temperaturas entre -20°C a -86°C hasta su utilización.

9. Proceso de acuerdo a la reivindicación 1, CARACTERIZADO porque para obtener el gel de fibrina autóloga o de sangre compatible se requiere preparar una matriz polimérica de quitosano-gelatina-ácido hialurónico.

10. Gel de fibrina autóloga o de sangre compatible CARACTERIZADO porque es obtenido mediante el proceso de la reivindicación 1.

1 1. Uso del gel de fibrina autóloga o de sangre compatible CARACTERIZADO porque sirve para uso quirúrgico, sellamiento de heridas o lesiones cutáneas, lesiones de cartílago, gingivales u óseas, conección de componentes biológicos, reemplazamiento, integración de suturas quirúrgicas y cualquier aplicación en el campo de la ingeniería de tejidos