WO2013008723A1 - Ｍａｌｄｉ質量分析用マトリックス - Google Patents

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新藤　充
割石　博之
大典 三浦
由紀 藤村
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    • C07D215/38—Nitrogen atoms
    • C07D215/42—Nitrogen atoms attached in position 4
    • C07D215/44—Nitrogen atoms attached in position 4 with aryl radicals attached to said nitrogen atoms
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    • C07D219/00—Heterocyclic compounds containing acridine or hydrogenated acridine ring systems
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    • C07D219/08—Nitrogen atoms
    • C07D219/10—Nitrogen atoms attached in position 9

Definitions

  • the present invention relates to a matrix used for ionization of an analyte in matrix-assisted laser desorption ionization (MALDI) mass spectrometry.
  • MALDI matrix-assisted laser desorption ionization
  • Matrix-assisted laser desorption ionization (MALDI) mass spectrometry is a soft ionization mass spectrometry widely used for rapid analysis of biomolecules.
  • MALDI mass spectrometry is used, high-precision analysis of high molecular weight proteins and the like, which has been difficult with other ionization methods, is possible, and thus has been mainly used for biopolymer mass spectrometry.
  • a mixed crystal of an analyte and a matrix is prepared, and the analyte is ionized by irradiating it with laser light.
  • the matrix absorbs the light energy of the irradiated laser and ionizes, and at the same time, rapidly heats and vaporizes.
  • the sample molecules are not directly vaporized by laser irradiation, they are desorbed together with the matrix molecules surrounding the sample molecules.
  • the analyte is ionized by the transfer of protons and electrons between the ionized matrix molecules and the sample molecules. Since a nitrogen laser (wavelength 337 nm) or a YAG laser (wavelength 355 nm) is generally used as a laser source, a substance having an absorption band in this wavelength region is used for the matrix.
  • MALDI mass spectrometry has come to be used for the analysis of low molecular weight compounds. It can be used for rapid analysis and trace analysis, and it can be applied to molecular imaging, so it is expected to be applied to metabolomic analysis. Yes.
  • the success or failure of MALDI mass spectrometry depends largely on the performance of the matrix, and the demand for a matrix suitable for the analysis of low-molecular compounds is increasing.
  • Patent Document 1 proposes a 1H-tetrazole derivative as a matrix suitable for cationization of a low molecular compound.
  • Non-Patent Document 1 discloses that 9-aminoacridine is suitable as a matrix for negative ion mode MALDI mass spectrometry.
  • Patent Document 1 the 1H-tetrazole derivative described in Patent Document 1 is for positive ion mode MALDI mass spectrometry, and its applicability to the negative ion mode is not clear.
  • 9-aminoacridine described in Non-Patent Document 1 is currently the most common matrix for negative ion mode MALDI mass spectrometry, but there are many compounds that cannot be measured, and it is not necessarily an optimal matrix.
  • 9-aminoacridine described in Non-Patent Document 1 is currently the most common matrix for negative ion mode MALDI mass spectrometry, but there are many compounds that cannot be measured, and it is not necessarily an optimal matrix.
  • As described above in spite of increasing demand for a matrix for negative ion mode MALDI mass spectrometry targeting low molecular weight compounds, there is no general-purpose matrix yet.
  • the present invention has been made in view of such a problem, and an object of the present invention is to provide a matrix for MALDI mass spectrometry, which has a high ionization ability of a low-molecular compound and can perform negative ion mode measurement.
  • the present invention provides a matrix for MALDI mass spectrometry as described in [1] to [4] below.
  • a matrix for matrix-assisted laser desorption / ionization mass spectrometry A matrix for MALDI mass spectrometry comprising one or more compounds selected from the group consisting of compounds represented by the following general formula (I), (II) or (III) or salts thereof.
  • X is a carbon or nitrogen atom
  • R 1 is a group selected from the group consisting of a hydrogen atom, an alkyl group, an aryl group, a substituted aryl group, an arylalkyl group, a substituted arylalkyl group, a heteroaryl group and a substituted heteroaryl group (provided that R 1 and Except when both R 2 are hydrogen atoms).
  • R 2 is a group selected from the group consisting of hydrogen atom, alkyl group, alkoxyl group, NR 3 R 4 , halogen atom, nitro group, allyl group, aryl group, substituted aryl group, heteroaryl group and substituted heteroaryl group
  • R 3 and R 4 are each independently selected from the group consisting of a hydrogen atom, alkyl group, allyl group, aryl group, substituted aryl group, arylalkyl group, substituted arylalkyl group, heteroaryl group and substituted heteroaryl group Is a group to be
  • R 5 is a group selected from the group consisting of a hydrogen atom, an alkyl group, an allyl group, an aryl group, a substituted aryl group, an arylalkyl group, a substituted arylalkyl group, a heteroaryl group, and a substituted heteroaryl group
  • R 6 is a group selected from the group consisting of
  • the compound is represented by the following formulas (5), (17), (18), (21), (24), (30), (35), (36), (37) to (42).
  • a novel MALDI mass spectrometric analysis that has higher ionization ability than 9-aminoacridine and enables high-sensitivity mass spectrometry in negative ion mode for many low molecular weight compounds, particularly biological low molecular weight compounds.
  • a matrix is provided. Since the matrix for MALDI mass spectrometry of the present invention enables highly sensitive MALDI mass spectrometry for biomolecules and metabolites thereof, it can be suitably used for metabolomic analysis and the like.
  • 6 is a mass spectrum showing the result of MALDI mass spectrometry analysis of a mixture of anionic biological components (see Table 2) using 9-aminoanthracene (17) as a matrix.
  • 6 is a mass spectrum showing the results of MALDI mass spectrometry analysis of a mixture of anionic biological components (see Table 2) using 9-aminoacridine (9-AA) as a matrix.
  • 3 is a mass spectrum showing the result of blank measurement of 7-chloro-4- (N-benzylamino) quinoline (18).
  • 6 is a mass spectrum showing the result of MALDI mass spectrometry analysis of a mixture of anionic biological components (see Table 3) using 7-chloro-4- (N-benzylamino) quinoline (18) as a matrix.
  • 6 is a mass spectrum showing the result of MALDI mass spectrometry analysis of a mixture of anionic biological components (see Table 3) using 9-aminoacridine (9-AA) as a matrix.
  • 6 is a mass spectrum showing the result of MALDI mass spectrometry analysis of cis-cinnamic acid using 9-aminoacridine (9-AA) as a matrix.
  • 4 is a mass spectrum showing the result of MALDI mass spectrometry analysis of cis-cinnamic acid using 4- (Np-fluorobenzyl) amino-7-chloroquinoline (41) as a matrix.
  • 4 is a mass spectrum showing the results of MALDI mass spectrometry analysis of cis-cinnamic acid using 4- (Np-fluorobenzylamino) quinoline (42) as a matrix.
  • the matrix for MALDI mass spectrometry is a compound having a structure represented by the following general formula (I), (II) or (III) or a salt thereof.
  • X is a carbon or nitrogen atom
  • R 1 is a group selected from the group consisting of a hydrogen atom, an alkyl group, an aryl group, a substituted aryl group, an arylalkyl group, a substituted arylalkyl group, a heteroaryl group and a substituted heteroaryl group
  • R 2 is a group selected from the group consisting of hydrogen atom, alkyl group, alkoxyl group, NR 3 R 4 , halogen atom, nitro group, allyl group, aryl group, substituted aryl group, heteroaryl group and substituted heteroaryl group
  • R 3 and R 4 each independently comprises a hydrogen atom, an alkyl group, an allyl group, an aryl group, a substituted aryl group, an arylalkyl group, a substituted arylalkyl group, a heteroaryl group, and a substituted heteroaryl group
  • R 5 is a group selected from the group consisting of a hydrogen atom, an alkyl group, an allyl group, an aryl group, a substituted aryl group, an arylalkyl group, a substituted arylalkyl group, a heteroaryl group, and a substituted heteroaryl group
  • R 6 is a group selected from the group consisting of a hydrogen atom, alkyl group, alkoxyl group, NR 3 R 4 , halogen atom, nitro group, allyl group, aryl group, substituted aryl group, heteroaryl group and substituted heteroaryl group
  • R 3 and R 4 are each independently selected from the group consisting of a hydrogen atom, alkyl group, allyl group, aryl group, substituted aryl group, arylalkyl group, substituted arylalkyl group, heteroaryl group and substituted heteroaryl group Group.
  • Z is a carbon or nitrogen atom
  • R 7 and R 8 are each independently a group selected from the group consisting of a hydrogen atom and an amino group (NH 2 ) (except when both R 7 and R 8 are amino groups).
  • alkyl group examples include a linear, branched or cyclic alkyl group having 1 to 10 carbon atoms, preferably a methyl group, an ethyl group, a 1-propyl group, a 2-propyl group, a 1-butyl group.
  • alkoxyl group examples include those having a linear, branched or cyclic alkyl group having 1 to 10 carbon atoms, preferably a methoxy group, an ethoxy group, a 1-propyloxy group, a 2-propyloxy group.
  • aryl group examples include a phenyl group, a naphthyl group, an anthranyl group, and a phenanthryl group.
  • heteroaryl groups include pyrrolyl, pyridyl, imidazolyl, thiophenyl, quinolyl, and isoquinolyl groups.
  • substituent on the substituted aryl group and the substituted heteroaryl group are the same as those for R 2 and R 6 .
  • the halogen atom is any one of fluorine, chlorine, bromine and iodine, preferably fluorine, chlorine and bromine.
  • Preferred MALDI mass spectrometry matrices include the following formulas (5), (17), (18), (21), (24), (30), (35), (36), (37) to (42) And one or more compounds selected from the group consisting of compounds represented by
  • Some of the matrix for MALDI mass spectrometry are commercially available compounds, and those that are not commercially available can be synthesized in several steps from compounds that are commercially available using any known method.
  • the MALDI mass spectrometry matrix thus obtained can be handled in the same manner as a commonly used matrix.
  • a sample for measurement in MALDI mass spectrometry can be prepared by dissolving an analyte and a matrix in any appropriate solvent such as acetonitrile and THF, and dropping on a sample plate followed by drying.
  • the precipitated crystals were filtered with suction while washing with concentrated hydrochloric acid. Thereafter, the filtrate was added to 30 mL of 10% NaOH aqueous solution, stirred for 1 hour, and then suction filtered while washing with water. The obtained crude crystals were recrystallized from methanol. Yield 270 mg, 70%, magenta, acicular crystals, mp. 137.9 to 171.2 ° C.
  • Phenol (1.02 g, 10.8 mmol, 10 equivalents) was added to 3-methoxy-9-chloroacridine (262 mg, 1.08 mmol) and stirred at 70 ° C. for 1 hour, and then ammonium carbonate (207 mg, 2.16 mmol, 1 0.5 equivalent) was added, and the temperature was raised to 120 ° C. and stirred for 3 hours. After returning to normal temperature, acetone is added to reach 0 ° C., and the mixture is stirred for 1 hour. Next, 15 mL of 2.5 M NaOH was added, stirred for 1 hour, extracted with ethyl acetate, washed twice with water and saturated brine, dried over sodium sulfate, and concentrated. Recrystallized with methanol. Yield 194 mg, 80%, yellow, granular crystals, mp. 196.9-199.8 ° C.
  • 4,7-dichloroquinoline (1.98 g, 10 mmol) was added to 25 mL of phenol and stirred at 120 ° C., then the temperature was raised to 160 ° C., and p-fluorobenzylamine (1.61 g, 15 mmol, 1.5 equivalents) was added. added. After stirring for 6 hours, it returned to normal temperature, 30 mL of acetone was added, it was made 0 degreeC, and was stirred for 1 hour. Suction filtration was performed while washing the precipitated crystals with acetone.
  • Example of spectral analysis (1) Six types of samples in which a plurality of anionic compounds are mixed are prepared (Tables 1 to 6 below), and these mixtures are subjected to MALDI mass spectrometry in the negative ion mode to affect the ionization ability and peak intensity of each anionic compound. The effect of the matrix was evaluated. Each mixture and matrix were mixed at an arbitrary ratio, then air-dried on a stainless steel plate for MALDI, and this sample was measured with a MALDI mass spectrometer (MALDI-TOF-MS: AXIMA, Performance manufactured by Shimadzu Corporation).
  • FIG. 1 to FIG. 3 show the results of measuring MALDI mass spectrometry in negative ion mode using 9-aminoanthracene (17) as a matrix.
  • FIGS. 1 and 2 are mass spectra showing the results of a blank measurement without a sample. The peaks of proton desorbed ions [M ⁇ H] ⁇ (m / z 192) and M ⁇ ions (m / z) of the matrix are shown. z193) is observed. Other peaks are matrix-derived peaks that cannot be assigned.
  • FIG. 3 shows a MALDI mass spectrometric spectrum of a mixture of 34 types of anionic biocomponents such as carboxylic acid (see Table 2 above for the composition). Fumaric acid, succinic acid, itaconic acid, xanthine, phosphoenols Peaks of pyruvic acid and citric acid are observed.
  • FIG. 4 shows the result of MALDI mass spectrometry analysis of the same mixture with 9-aminoacridine (hereinafter abbreviated as 9AA), which is a typical matrix in the conventional negative ion mode measurement. Not observed. This clearly shows that 9-aminoanthracene is more useful than 9AA for detecting low molecular weight biological components in the negative ion mode.
  • 9AA 9-aminoacridine
  • FIG. 5 is a diagram showing the result of blank measurement when 7-chloro-4- (N-benzylamino) quinoline (18) is used as a matrix, and a prominent peak is observed between m / z 100 and 220. It has not been.
  • FIG. 6 shows MALDI mass spectrometry of about 30 anionic biocomponent mixtures (see Table 2 below for the composition) in negative ion mode using 7-chloro-4- (N-benzylamino) quinoline (18) as a matrix. Although the spectrum obtained as a result of the experiment is shown, significant peaks of nicotinic acid, adipic acid, quinolinic acid, azelaic acid, and sebacic acid are observed.
  • FIG. 7 shows a spectrum obtained as a result of MALDI mass spectrometry in a negative ion mode of a biological component mixture having the composition shown in Table 3 above using 9-aminoacridine (9-AA) as a matrix.
  • 9-AA 9-aminoacridine
  • 9-AA which is a matrix according to the prior art
  • the matrix compound created in the present invention ionizes most anionic compounds efficiently, with a wide range and high sensitivity. Prove that it can be detected. From these results, it can be seen that the compounds 5, 17, 18, 21, 24, 30, 35 and 36 have particularly high ionization ability. In particular, for compounds 17, 18, and 36, significant ionization ability was observed for many analytes.
  • DAB 2,5-dihydroxybenzoic acid
  • MALDI mass spectrometry measurement of low molecular weight biological components
  • 9-aminoacridine 9-AA
  • Non-patent document 1 9-aminoacridine
  • 9-aminoanthracene and its derivatives, 9-aminoquinoline and its derivatives, and 9-aminoacridine derivatives were synthesized, and they showed higher ionization ability and sensitivity than 9-aminoacridine.
  • a matrix suitable for the target biological component it is possible to avoid interference with peak detection due to the ion peak of the matrix itself. It is particularly useful for detection of specific trace biological components and bioimaging.
  • a fused polycyclic aromatic ring or fused polycyclic heterocycle and an amino group on the aromatic ring are desirable as the matrix conditions.
  • the condensed polycyclic aromatic ring anthracene, phenanthrene and the like are desirable.
  • condensed polycyclic heterocycle acridine and quinoline are desirable.
  • ionization ability and a sensitivity can be adjusted by converting the substituent on an aromatic ring and the substituent on an amino group.
  • the amino group is preferably primary or secondary.
  • the substituent on the amino group is preferably an allyl group, an aryl group, a benzyl group, or an alkyl group.
  • the salt (for example, hydrochloride) of these amines may be sufficient.
  • Substituents other than amino groups on the fused aromatic ring may be, but are not limited to, alkoxyl groups, amino groups, aryl groups, allyl groups, and nitro groups. All the compounds are commercially available or can be easily synthesized in several steps from commercially available raw materials.

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Abstract

　低分子化合物のイオン化能が高く、かつ負イオンモード測定が可能なＭＡＬＤＩ質量分析用マトリックスを提供する。　下記の一般式（Ｉ）、（II）または（III）で表される化合物またはそれらの塩からなる群より選択される１または複数の化合物を含む質量分析用マトリックス。　（Ｉ） （II）（III）Ｘ、ＺはＣまたはＮであり、Ｒ1、Ｒ5は、Ｈ、アルキル基、（置換）アリール基、（置換）アリールアルキル基、（置換）ヘテロアリール基からなる群より選択され、Ｒ2、Ｒ6は、Ｈ、アルキル基、アルコキシル基、アミノ基、ハロゲン原子、ニトロ基、アリル基、（置換）アリール基、（置換）ヘテロアリール基からなる群より選択され、Ｒ7、Ｒ8は、Ｈおよびアミノ基からなる群より選択される（Ｒ1＝Ｒ2＝Ｈである場合およびＲ7＝Ｒ8＝アミノ基である場合を除く。）。

Description

ＭＡＬＤＩ質量分析用マトリックス
　本発明は、マトリックス支援レーザー脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ）質量分析において分析物のイオン化に用いられるマトリックスに関する。
　マトリックス支援レーザー脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ）質量分析法は、生体分子の迅速な解析に広く用いられているソフトイオン化質量分析法である。ＭＡＬＤＩ質量分析法を用いると、他のイオン化法では困難であった高分子量のタンパク質等の高精度な解析が可能となるため、主として生体高分子の質量分析に用いられてきた。
　ＭＡＬＤＩ質量分析法では、分析物とマトリックスの混合結晶を調製し、それにレーザー光を照射することにより分析物のイオン化を行う。マトリックスは、照射されたレーザーの光エネルギーを吸収し、イオン化すると同時に急速加熱されて気化する。レーザー照射で直接試料分子が気化する事はないが、試料分子を取り囲んでいたマトリックス分子と共に脱離する。続いてイオン化したマトリックス分子と試料分子との間でプロトンや電子などの授受が起こる事によって、分析物をイオン化させる。レーザー源として、窒素レーザー（波長３３７ｎｍ）やＹＡＧレーザー（波長３５５ｎｍ）が一般的に用いられるため、マトリックスにはこの波長領域に吸収帯を持つ物質が使用される。
　近年、ＭＡＬＤＩ質量分析法は低分子化合物の分析にも用いられるようになり、迅速分析、微量分析で可能であり、分子イメージングの応用可能性もあることから、メタボローム解析への応用が期待されている。ＭＡＬＤＩ質量分析法の成否は、マトリックスの性能に負う部分が大きく、低分子化合物の解析に適したマトリックスの需要が高まりつつある。例えば、特許文献１には、１Ｈ－テトラゾール誘導体が、低分子化合物の陽イオン化に好適なマトリックスとして提案されている。
　特に、生体低分子には、カルボン酸、アミノ酸、リン酸エステル等のアニオン静の化合物が多く、陰イオンを検出するための負イオンモードに適したマトリックスの開発の重要性が増大しつつある。例えば、非特許文献１には、負イオンモードＭＡＬＤＩ質量分析用のマトリックスとして９－アミノアクリジンが好適であることが開示されている。
特開２０１０－２０４０５０号公報
「9-Amino acrydine as a matrix for negative mode matrix-assisted laser desorption/ionization」 Rachal L. Vermillion-Salsbury and David M. Hercules, Rapid Communications in Mass Spectrometry, 第16巻, 第16号, p.1,575-1581, 2002年8月30日発行、John Wiley & Sons社
　しかしながら、特許文献１記載の１Ｈ－テトラゾール誘導体は正イオンモードＭＡＬＤＩ質量分析用のものであり、負イオンモードへの適用可能性は明らかでない。また、非特許文献１記載の９－アミノアクリジンは、現在負イオンモードＭＡＬＤＩ質量分析用のマトリックスとして最も一般的であるが、測定できない化合物が多数あり、必ずしも最適のマトリックスではない。以上述べたように、低分子化合物を対象とする負イオンモードＭＡＬＤＩ質量分析用のマトリックスの需要が高まりつつあるにもかかわらず、汎用性を有するマトリックスは未だ存在しないのが現状である。
　本発明はかかる課題に鑑みてなされたものであり、低分子化合物のイオン化能が高く、かつ負イオンモード測定が可能なＭＡＬＤＩ質量分析用のマトリックスを提供することを目的とする。
　本発明は、下記の［１］～［４］記載のＭＡＬＤＩ質量分析用のマトリックスを提供する。
［１］　マトリックス支援レーザー脱離イオン化質量分析用のマトリックスであって、
　下記の一般式（Ｉ）、（II）または（III）で表される化合物またはそれらの塩からなる群より選択される１または複数の化合物を含むＭＡＬＤＩ質量分析用マトリックス。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
　なお、式（Ｉ）において、
　Ｘは炭素または窒素原子であり、
　Ｒ1は、水素原子、アルキル基、アリール基、置換アリール基、アリールアルキル基、置換アリールアルキル基、ヘテロアリール基および置換ヘテロアリール基からなる群より選択される基であり（ただし、Ｒ1およびＲ2が共に水素原子である場合を除く。）、
　Ｒ2は、水素原子、アルキル基、アルコキシル基、ＮＲ3Ｒ4、ハロゲン原子、ニトロ基、アリル基、アリール基、置換アリール基、ヘテロアリール基および置換ヘテロアリール基からなる群より選択される基であり、
　Ｒ3およびＲ4は、それぞれ独立して、水素原子、アルキル基、アリル基、アリール基、置換アリール基、アリールアルキル基、置換アリールアルキル基、ヘテロアリール基および置換ヘテロアリール基からなる群より選択される基であり、
　式（II）において、
　Ｒ5は、水素原子、アルキル基、アリル基、アリール基、置換アリール基、アリールアルキル基、置換アリールアルキル基、ヘテロアリール基および置換ヘテロアリール基からなる群より選択される基であり、
　Ｒ6は、水素原子、アルキル基、アルコキシル基、ＮＲ3Ｒ4、ハロゲン原子、ニトロ基、アリル基、アリール基、置換アリール基、ヘテロアリール基および置換ヘテロアリール基からなる群より選択される基であり、
　Ｒ3およびＲ4は、それぞれ独立して、水素原子、アルキル基、アリル基、アリール基、置換アリール基、アリールアルキル基、置換アリールアルキル基、ヘテロアリール基および置換ヘテロアリール基からなる群より選択される基であり、
　式（III）において、
　Ｚは炭素または窒素原子であり、
　Ｒ7およびＲ8は、それぞれ独立して、水素原子およびアミノ基からなる群より選択される基である（ただし、Ｒ7およびＲ8が共にアミノ基である場合を除く。）。
［２］　負イオンモード測定用のマトリックスである上記［１］記載のＭＡＬＤＩ質量分析用マトリックス。
［３］　分析物が分子量１０００以下の有機化合物である上記［１］または［２］記載のＭＡＬＤＩ質量分析用マトリックス。
［４］　前記化合物が、下記の式（５）、（１７）、（１８）、（２１）、（２４）、（３０）、（３５）、（３６）、（３７）～（４２）で表される化合物からなる群より選択される１または複数の化合物である上記［１］から［３］のいずれか１項記載のＭＡＬＤＩ質量分析用マトリックス。

Figure JPOXMLDOC01-appb-I000004
　本発明によると、多くの低分子化合物、特に生体低分子化合物について９－アミノアクリジンよりも高いイオン化能を有すると共に、負イオンモードでの高感度な質量分析を可能にする新規なＭＡＬＤＩ質量分析用マトリックスが提供される。本発明のＭＡＬＤＩ質量分析用マトリックスは、生体分子やその代謝産物について高感度なＭＡＬＤＩ質量分析を可能にするため、メタボローム解析等に好適に用いることができる。
９－アミノアントラセン（１７）のブランク測定の結果を示すマススペクトルである。 ９－アミノアントラセン（１７）のブランク測定の結果を示すマススペクトルである。 ９－アミノアントラセン（１７）をマトリックスとしてアニオン性生体成分の混合物（表２参照）のＭＡＬＤＩ質量分析を行った結果を示すマススペクトルである。 ９－アミノアクリジン（９－ＡＡ）をマトリックスとしてアニオン性生体成分の混合物（表２参照）のＭＡＬＤＩ質量分析を行った結果を示すマススペクトルである。 ７－クロロ－４－（Ｎ－ベンジルアミノ）キノリン（１８）のブランク測定の結果を示すマススペクトルである。 ７－クロロ－４－（Ｎ－ベンジルアミノ）キノリン（１８）をマトリックスとしてアニオン性生体成分の混合物（表３参照）のＭＡＬＤＩ質量分析を行った結果を示すマススペクトルである。 ９－アミノアクリジン（９－ＡＡ）をマトリックスとしてアニオン性生体成分の混合物（表３参照）のＭＡＬＤＩ質量分析を行った結果を示すマススペクトルである。 ９－アミノアクリジン（９－ＡＡ）をマトリックスとしてｃｉｓ－ケイ皮酸のＭＡＬＤＩ質量分析を行った結果を示すマススペクトルである。 アントラセン（３７）をマトリックスとしてｃｉｓ－ケイ皮酸のＭＡＬＤＩ質量分析を行った結果を示すマススペクトルである。 ２－アミノアントラセン（３８）をマトリックスとしてｃｉｓ－ケイ皮酸のＭＡＬＤＩ質量分析を行った結果を示すマススペクトルである。 アクリジン（３９）をマトリックスとしてｃｉｓ－ケイ皮酸のＭＡＬＤＩ質量分析を行った結果を示すマススペクトルである。 １－アミノアントラセン（４０）をマトリックスとしてｃｉｓ－ケイ皮酸のＭＡＬＤＩ質量分析を行った結果を示すマススペクトルである。 ４－（Ｎ－ｐ－フルオロベンジル）アミノ－７－クロロキノリン（４１）をマトリックスとしてｃｉｓ－ケイ皮酸のＭＡＬＤＩ質量分析を行った結果を示すマススペクトルである。 ４－（Ｎ－ｐ－フルオロベンジルアミノ）キノリン（４２）をマトリックスとしてｃｉｓ－ケイ皮酸のＭＡＬＤＩ質量分析を行った結果を示すマススペクトルである。
　本発明の一実施の形態に係るＭＡＬＤＩ質量分析用マトリックスは、下記の一般式（Ｉ）、（II）または（III）で表される構造を有する化合物またはそれらの塩である。
　なお、式（Ｉ）において、
　Ｘは炭素または窒素原子であり、
　Ｒ1は、水素原子、アルキル基、アリール（aryl）基、置換アリール基、アリールアルキル基、置換アリールアルキル基、ヘテロアリール基および置換ヘテロアリール基からなる群より選択される基であり、
　Ｒ2は、水素原子、アルキル基、アルコキシル基、ＮＲ3Ｒ4、ハロゲン原子、ニトロ基、アリル基、アリール基、置換アリール基、ヘテロアリール基および置換ヘテロアリール基からなる群より選択される基であり、
　Ｒ3およびＲ4は、それぞれ独立して、水素原子、アルキル基、アリル（allyl）基、アリール基、置換アリール基、アリールアルキル基、置換アリールアルキル基、ヘテロアリール基および置換ヘテロアリール基からなる群より選択される基である（ただし、Ｒ1およびＲ2が共に水素原子である場合を除く。）。
　式（II）において、
　Ｒ5は、水素原子、アルキル基、アリル基、アリール基、置換アリール基、アリールアルキル基、置換アリールアルキル基、ヘテロアリール基および置換ヘテロアリール基からなる群より選択される基であり、
　Ｒ6は、水素原子、アルキル基、アルコキシル基、ＮＲ3Ｒ4、ハロゲン原子、ニトロ基、アリル基、アリール基、置換アリール基、ヘテロアリール基および置換ヘテロアリール基からなる群より選択される基であり、
　Ｒ3およびＲ4は、それぞれ独立して、水素原子、アルキル基、アリル基、アリール基、置換アリール基、アリールアルキル基、置換アリールアルキル基、ヘテロアリール基および置換ヘテロアリール基からなる群より選択される基である。
　式（III）において、
　Ｚは炭素または窒素原子であり、
　Ｒ7およびＲ8は、それぞれ独立して、水素原子およびアミノ基（ＮＨ2）からなる群より選択される基である（ただし、Ｒ7およびＲ8が共にアミノ基である場合を除く。）。
　アルキル基の具体例としては、炭素数１～１０の直鎖、分岐鎖または環状アルキル基が挙げられ、好ましくは、メチル基、エチル基、１－プロピル基、２－プロピル基、１－ブチル基、２－ブチル基、ｔ－ブチル基、１－ペンチル基、シクロペンチル基、１－ヘキシル基、シクロヘキシル基であり、より好ましくはメチル基、エチル基、１－プロピル基、２－プロピル基である。
　アルコキシル基の具体例としては、炭素数１～１０の直鎖、分岐鎖または環状アルキル基を有するものが挙げられ、好ましくは、メトキシ基、エトキシ基、１－プロピルオキシ基、２－プロピルオキシ基、１－ブチルオキシ基、２－ブチルオキシ基、ｔ－ブチルオキシ基、１－ペンチルオキシ基、シクロペンチルオキシ基、１－ヘキシルオキシ基、シクロヘキシルオキシ基であり、より好ましくはメトキシ基、エトキシ基、１－プロピルオキシ基、２－プロピルオキシ基である。
　アリール基の具体例としては、フェニル基、ナフチル基、アントラニル基、フェナントリル基等が挙げられる。ヘテロアリール基の具体例としては、ピロリル基、ピリジル基、イミダゾリル基、チオフェニル基、キノリル基、イソキノリル基等が挙げられる。置換アリール基および置換ヘテロアリール基上の置換基の具体例は、Ｒ2およびＲ6の場合と同様である。
　ハロゲン原子は、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素のいずれかであり、好ましくは、フッ素、塩素、臭素である。
　好ましいＭＡＬＤＩ質量分析用マトリックスとしては、下記の式（５）、（１７）、（１８）、（２１）、（２４）、（３０）、（３５）、（３６）、（３７）～（４２）で表される化合物からなる群より選択される１または複数の化合物が挙げられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
　ＭＡＬＤＩ質量分析用マトリックスのうち一部は市販の化合物であり、市販されていないものについても、任意の公知の方法を用いて市販されている化合物より数工程で合成することができる。
　このようにして得られるＭＡＬＤＩ質量分析用マトリックスは、通常用いられているマトリックスと同様に取り扱うことができる。例えば、分析物とマトリックスを、アセトニトリル、ＴＨＦ等の任意の適当な溶媒に溶解し、サンプルプレート上に滴下後乾燥させることにより、ＭＡＬＤＩ質量分析法における測定用のサンプルを調製することができる。
マトリックスの合成
　下記の２～３６、４１、４２の３７種類の化合物を合成した。なお、下記の化学式のリストには、比較対象として用いた９－アミノアクリジン（９－ＡＡ）を併記している。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000010
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000011
　化合物３７（アントラセン）、３８（２－アミノアントラセン）、３９（アクリジン）、４０（１－アミノアントラセン）については、市販品を使用した。
（９－フェニルアミノ）アクリジン塩酸塩（４）および（９－フェニルアミノ）アクリジン（５）の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000012
（９－フェニルアミノ）アクリジン塩酸塩（４）の合成
　参考文献：Cope, H. Mutter, R.; Heal, W.; Pascoe, C.; Brown, P.; Pratt, S.; Chen, B. Europian Journal of Medicinal Chemistry, 2006, 41, 1124-1143.
　９－クロロアクリジン（１１０ｍｇ、０．５ｍｍｏｌ）にアニリン（５５．９ｍｇ、０．６ｍｍｏｌ、１．２当量）、１－メチル－２－ピロリドン（ＮＭＰ）２．５ｍＬ、濃塩酸を３滴、パスツールピペットを用いて加え、常温で６時間撹拌した。その後、酢酸エチル２０ｍＬを加え常温で１時間撹拌し、析出した結晶を酢酸エチルで洗いながら吸引濾過。メタノール／酢酸エチルで再結晶した。収量１０４ｍｇ、６８％。
　1H NMR (600 MHz, DMSO-d6) δ: 7.39-7.45 (m, 5H), 7.49-7.53 (m, 2H), 8.01 (dd, J = 12, 12 Hz, 2H), 8.10 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 8.24 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 13C NMR (100 MHz, DMSO-d6) δ: 113.62, 119.23, 123.74, 124.66, 125.76, 127.51, 129.96, 135.27, 140.09, 140.92, 155.24, MS (ESI) m/z : 271 (M+H)+ 
（９－フェニルアミノ）アクリジン（５）の合成
　次に、塩酸塩６３．５ｍｇ、ＮａＯＨ１２０ｍｇを水１．５ｍＬに加え１時間撹拌し、酢酸エチルで抽出し、水２回、飽和食塩水で洗浄後、硫酸ナトリウムで乾燥し濃縮。得られた結晶を酢酸エチルで再結晶した。収量３８．０ｍｇ、５７％、黄色、粒状結晶、ｍｐ．２２７．２～２２８．９℃。
９－（４－ブロモフェニルアミノ）アクリジン（１０）の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000013
　９－クロロアクリジン（１１０ｍｇ、０．５ｍｍｏｌ）に４－ブロモアニリン（１０３ｍｇ、０．６ｍｍｏｌ、１．２当量）、ＮＭＰ２．５ｍＬ、濃塩酸を３滴、パスツールピペットを用いて加え、常温で６時間撹拌した。その後、酢酸エチル２０ｍＬを加え常温で１時間撹拌し、析出した結晶を酢酸エチルで洗いながら吸引濾過。メタノール／アセトニトリルで再結晶した。収量１２７ｍｇ、６６％、ｍｐ．２３１．４℃。
　1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 7.41 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 7.52 (t, J = 8.8 Hz, 2H), 7.71 (d, J =  8.8 Hz, 2H), 8.02-8.10 (m, 4H), 8.25 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 13C NMR (100 MHz, DMSO-d6) δ: 114.10, 114.94, 119.30, 123.98, 125.74, 126.06, 132.63, 135.32, 140.11, 140.71, 154.96; MS (ESI) m/z: 349 (M+H)+  
　次に、塩酸塩７７ｍｇ、ＮａＯＨ１２０ｍｇを水１．５ｍＬに加え１時間撹拌し、酢酸エチルで抽出し、水２回、飽和食塩水で洗浄後、硫酸ナトリウムで乾燥し濃縮。得られた結晶を酢酸エチルで再結晶した。収量３６．３ｍｇ、５２％、黄色、粒状結晶、ｍｐ．２２０．７－２２１．９℃。
９－（４－クロロフェニルアミノ）アクリジン（１１）の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000014
　９－クロロアクリジン（１１０ｍｇ、０．５ｍｍｏｌ）に４－クロロアニリン（７６．５ｍｇ、０．６ｍｍｏｌ、１．２当量）、ＮＭＰ２．５ｍＬ、濃塩酸を３滴、パスツールピペットを用いて加え、常温で６時間撹拌した。その後、酢酸エチル２０ｍＬを加え常温で１時間撹拌し、析出した結晶を酢酸エチルで洗いながら吸引濾過。メタノールで再結晶した。収量（塩酸塩）１４９ｍｇ、８７％。
　1H NMR (400 MHz, DMSO) δ:7.46-7.51 (m, 4H), 7.56 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 8.02 (t, J = 8.8 Hz, 2H), 8.17 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 8.30 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 13C NMR (100 MHz, DMSO-d6) δ: 114.02, 119.28, 123.96, 125.77, 125.88, 129.72, 131.04, 135.30, 140.12, 155.04, MS (ESI) m/z: 305 (M+H)+
　次に、塩酸塩１４９ｍｇ、ＮａＯＨ２４０ｍｇを水３ｍＬに加え１時間撹拌し、酢酸エチルで抽出し、水２回、飽和食塩水で洗浄後、硫酸ナトリウムで乾燥し濃縮。アセトニトリルで再結晶した。収量５６．９ｍｇ、４３％、黄色、粒状結晶、ｍｐ．２０８．７～２０９．６℃。
９－（４－ニトロフェニルアミノ）アクリジン（１２）の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000015
　９－クロロアクリジン（１１０ｍｇ、０．５ｍｍｏｌ）に４－ニトロアニリン（８２．８ｍｇ、０．６ｍｍｏｌ、１．２当量）、ＮＭＰ２．５ｍＬ、濃塩酸を３滴、パスツールピペットを用いて加え、常温で６時間撹拌したその後、酢酸エチルを２０ｍＬ加え常温で１時間撹拌し、析出した結晶を酢酸エチルで洗いながら吸引濾過。収量（塩酸塩）１６７ｍｇ、９５％。
　1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 7.49 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 7.60 (t, J = 7.2 Hz, 2H), 8.10 (t, J = 7.2 Hz, 2H), 8.21-8.33 (m, 6H), MS (ESI) m/z: 316 (M+H)+
　次に、塩酸塩１６７ｍｇ、ＮａＯＨ２４０ｍｇを水３ｍＬに加え１時間撹拌し、酢酸エチルで抽出し、水２回、飽和食塩水で洗浄後、硫酸ナトリウムで乾燥し濃縮。得られた結晶をアセトニトリルで再結晶した。収量９６．７ｍｇ、６５％、赤橙色、針状結晶、ｍｐ．２１８．５～２２２．６℃。
９－（４－メトキシフェニルアミノ）アクリジン（１３）の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000016
　９－クロロアクリジン（１１０ｍｇ、０．５ｍｍｏｌ）に４－アニシジン（７３．８ｍｇ、０．６ｍｍｏｌ、１．２当量）、ＮＭＰ２．５ｍＬ、濃塩酸を３滴、パスツールピペットを用いて加え、常温で６時間撹拌した。その後、酢酸エチル２０ｍＬを加え常温で１時間撹拌し、析出した結晶を酢酸エチルで洗いながら吸引濾過。収量（塩酸塩）１５８ｍｇ、９４％。
　1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 3.84 (s, 3H), 7.10 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 7.42 (t, J = 8.8 Hz, 4H), 7.97 (t, J = 8.8 Hz, 2H), 8.10 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 8.24 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 13C NMR (100 MHz, DMSO-d6) δ: 55.46, 113.15, 115.11, 119.06, 123.49, 125.65, 126.40, 133.21, 135.05, 140.02, 155.31, 158.53, MS (ESI) m/z : 301 (M+H)+
　次に、塩酸塩１５８ｍｇ、ＮａＯＨ２４０ｍｇを水３ｍＬに加え１時間撹拌し、酢酸エチルで抽出し、水２回、飽和食塩水で洗浄後、硫酸ナトリウムで乾燥し濃縮。水／メタノールで再結晶した。収量７９．５ｍｇ、５６％、暗赤色、粒状結晶。
Ｎ－（４－メチルフェニル）アクリジン－９－アミン塩酸塩（１４）およびＮ－（４－メチルフェニル）アクリジン－９－アミン（３６）の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000017
９－（４－フルオロフェニルアミノ）アクリジン塩酸塩（１４）の合成
　９－クロロアクリジン（１１０ｍｇ、０．５ｍｍｏｌ）に４－フルオロアニリン（６６．７ｍｇ、０．６ｍｍｏｌ、１．２当量）、ＮＭＰ２．５ｍＬ、濃塩酸を３滴、パスツールピペットを用いて加え、常温で６時間撹拌した。その後、酢酸エチルを２０ｍＬ加え常温で１時間撹拌し、析出した結晶を酢酸エチルで洗いながら吸引濾過。アセトニトリルで再結晶した。収量１２５ｍｇ、７７％、黄色、針状結晶。
　1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 7.38 (t, J = 8.8 Hz, 2H), 7.45 (t, J = 7.6 Hz, 2H), 7.51-7.55 (m, 2H), 7.99 (t, J = 7.6 Hz, 2H), 8.16 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 8.26 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 13C NMR (100 MHz, DMSO-d6) δ: 113.49, 116.73 (d, J = 23 Hz), 119.18, 123.73, 125.73, 126.84 (d, J = 9.1 Hz), 135.16, 137.25, 140.08, 155.35, 160.73 (d, J = 246 Hz) ; MS (ESI) m/z: 289 (M+H)+
９－（４－フルオロフェニルアミノ）アクリジン（３６）の合成
　塩酸塩（１４）６４．８ｍｇ、ＮａＯＨ１２０ｍｇを水１．５ｍＬに加え１時間撹拌し、酢酸エチルで抽出し、水２回、飽和食塩水で洗浄後、硫酸ナトリウムで乾燥し濃縮。得られた結晶をアセトニトリルで再結晶した。収量３５．７ｍｇ、６２％、黄色、針状結晶、ｍｐ．１８３．５～１９６．１℃。
９－（４－メチルフェニルアミノ）アクリジン（１５）の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000018
　９－クロロアクリジン（１１０ｍｇ、０．５ｍｍｏｌ）　に４－トルイジン（６４．５ｍｇ、０．６ｍｍｏｌ、１．２当量）、ＮＭＰ　２．５ｍＬ、濃塩酸を３滴、パスツールピペットを用いて加え、常温で６時間撹拌した。その後、酢酸エチルを２０ｍＬを加え常温で１時間撹拌し、析出した結晶を酢酸エチルで洗いながら吸引濾過。収量（塩酸塩）１１７ｍｇ、８２％。
　1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ: 2.41 (s, 3H), 7.44 (t, J = 7.6 Hz, 4H), 7.97-8.06 (m, 8H), 8.23 (d, J = 9.6 Hz, 2H), MS (ESI) m/z: 285 (M+H)+
　塩酸塩１１７ｍｇ、ＮａＯＨ２４０ｍｇを水３ｍＬに加え１時間撹拌し、酢酸エチルで抽出し、水２回、飽和食塩水で洗浄後、硫酸ナトリウムで乾燥し濃縮。得られた結晶をアセトニトリルで再結晶した。収量６２．５ｍｇ、５４％、橙色、針状結晶、ｍｐ．１７２．７～１７４．３℃。
９－（ナフタレン－１－イル－アミノ）アクリジン（１６）の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000019
　９－クロロアクリジン（１１０ｍｇ、０．５ｍｍｏｌ）に１－ナフチルアミン（８５．９ｍｇ、０．６ｍｍｏｌ、１．２当量）、ＮＭＰ２．５ｍＬ、濃塩酸を３滴、パスツールピペットを用いて加え、常温で６時間撹拌した。その後、酢酸エチル２０ｍＬを加え常温で１時間撹拌し、析出した結晶を酢酸エチルで洗いながら吸引濾過。収量（塩酸塩）１１０ｍｇ、６９％。
　1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 7.35 (t, J = 7.6 Hz, 2H), 7.59-7.70 (m, 4H), 7.98 (t, J = 7.6 Hz, 2H), 8.07-8.17 (m, 7H), MS (ESI) m/z: 321 (M+H)+
　塩酸塩１１０ｍｇ、ＮａＯＨ２４０ｍｇを水３ｍＬに加え１時間撹拌し、酢酸エチルで抽出し、水２回、飽和食塩水で洗浄後、硫酸ナトリウムで乾燥し濃縮した。
９－アミノアントラセン（１７）の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000020
　参考文献：Adams, H.; Bawa, R. A.; McMillan, K. G.; Jones, S. Tetrahedron: Asymmetry, 2007, 18, 1003-1012
　９－ニトロアントラセン（４４６ｍｇ、２．００ｍｍｏｌ）を酢酸（９．６ｇ、１６０ｍｍｏｌ、８０当量）に加え、７０℃で１時間撹拌した後、ＳｎＣｌ2（１．８９ｇ、１０ｍｍｏｌ、５当量）を濃塩酸（７．３ｇ、２００ｍｍｏｌ、１００当量）に溶かした溶液をゆっくり加え、８０℃で１時間撹拌した後、析出した結晶を濃塩酸で洗いながら吸引濾過。その後、ろ物を１０％ＮａＯＨ水溶液３０ｍＬに加え、１時間撹拌した後、水で洗いながら吸引濾過した。得られた粗結晶をメタノールで再結晶した。収量２７０ｍｇ、７０％、赤紫色、針状結晶、ｍｐ．１３７．９～１７１．２℃。
　1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ：4.87 (s, 2H), 7.39 - 7.46 (m, 4H), 7.88 (s, 1H), 7.88 - 7.98 (m, 4H), MS (ESI) m/z: 194 (M+H)+
４－（Ｎ－ベンジル）アミノ－７－クロロキノリン（１８）の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000021
　参考文献：Pellegrini, S.; Grad, J-N.; Bousquet, T.; Pelinski, L. Tetrahedron Lett. 2011, 52, 1742-1744.
　de Souza, M. V. N.; Pais, K. C.; Kaiser, C. R.; Peralta, M. A.; Ferreira, M. de L.; Lourenco, M. C. S. Bioorganic and Medicinal Chemistry, 2009, 17, 1474-1480
　４，７－ジクロロキノリン（１．９８ｇ、１０ｍｍｏｌ）をフェノール２５ｍＬに加え１２０度で撹拌した後、１６０℃に上げベンジルアミン（１．６１ｇ、１５ｍｍｏｌ、１．５当量）を加えた後、１２時間撹拌した後、常温に戻し、アセトンを３０ｍＬ　加え、０℃にし１時間撹拌。析出した結晶をアセトンで洗いながら吸引濾過。得られた結晶を１０％ＮａＯＨ水溶液１００ｍＬに加え１時間撹拌し、クロロホルムで抽出し、水２回、飽和食塩水で洗浄後、硫酸ナトリウムで乾燥し濃縮。酢酸エチルで再結晶した。収量５５２ｍｇ、２１％、無色、針状結晶、ｍｐ．１７３．１～１７４．６℃。
　1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ: 4.53 (d, J = 5.2 Hz, 2H), 5.32 (s, 1H), 6.46 (d, J = 6.0 Hz, 1H), 7.34 - 7.40 (m, 6H), 7.69 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 7.98 (d, J = 2.0 Hz, 1H), 8.53 (d, J = 4.8 Hz, 1H), 13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ: 47.61, 99.70, 117.13, 120.84, 125.50, 127.59, 127.98, 129.01, 134.94, 137.19, 149.17, 149.41, 152.14, MS (ESI) m/z : 269 (M+H)+
４－（Ｎ－ベンジルアミノ）キノリン（１９）の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000022
　参考文献：浜名政和、船越和久、薬学雑誌、1964、84、42-47.
　４－（Ｎ－ベンジル）アミノ－７－クロロキノリン（４８５ｍｇ，１．８０ｍｍｏｌ）をメタノール１２ｍＬに溶かし、Ｐｄ／Ｃ（１０％、２５．５ｍｇ、０．０２４ｍｍｏｌ、０．０１当量）を加え常温・常圧で水素をバブリングしながら加えていき、３時間撹拌した。その後、セライト濾過し濃縮。次に１０％ＮａＯＨ水溶液３０ｍＬを加え１時間撹拌し、クロロホルムで抽出し、水２回、飽和食塩水で洗浄後、硫酸ナトリウムで乾燥し濃縮。アセトニトリルで再結晶した。収量３３５ｇ、６６％、無色、針状結晶、ｍｐ．１３１．５～１３２．２℃（文献値１１３－１１５℃（ベンゼン－石油ベンジン））。
　1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ:  4.54 (d, J = 4.8 Hz, 2H), 5.40 (s, 1H), 6.46 (d, J = 4.8 Hz, 1H), 7.35 - 7.45 (m, 6H), 7.64 (t, J = 7.6 Hz, 1H), 7.77 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 8.00 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 8.55 (d, J = 5.2 Hz, 1H), 13C NMR (100 MHz, CDCl3-d6) δ: 47.55, 99.39, 118.73, 119.26, 124.75, 127.54, 127.82, 128.93, 129.03, 130.07, 137.52, 148.46, 149.39, 151.11, MS (ESI) m/z : 235 (M+H)+
７－クロロ－４－（Ｎ－フェニルアミノ）キノリン（２０）の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000023
　参考文献：Chambers, R. A.; Pearson, D. E. J Org. Chem. 1963, 28, 3144-3147.
　Souza, M. Bioorganic and Medicinal Chemistry, 2009, 17, 1474-1480
　４，７－ジクロロキノリン（１．９８ｇ、１０ｍｍｏｌ）をフェノール　２５ｍＬに加え１２０度で撹拌した後、１６０度に上げアニリン（１．４０ｇ、１５ｍｍｏｌ、１．５当量）を加えた後、１２時間撹拌した後、常温に戻し、アセトンを加え、０℃にし１時間撹拌。析出した結晶をアセトンで洗いながら吸引濾過。得られた結晶を１０％　ＮａＯＨ　水溶液１００ｍＬに加え１時間撹拌し、クロロホルムで抽出し、水２回、飽和食塩水で洗浄後、硫酸ナトリウムで乾燥し濃縮。アセトニトリルで再結晶した。収量８８８ｍｇ、３５％、無色、粒状結晶。
　1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 6.92 (d, J = 6.0 Hz, 1H), 7.17 (t, J = 7.6 Hz, 1H),  7.36 - 7.46 (m, 4H), 7.58 (dd, J = 2.0 , 7.6 Hz, 1H), 7.90 (d, J = 2.0 Hz, 1H), 8.43 - 8.47 (m, 2H), 9.10 ppm (s, 1H), 13C NMR (100 MHz, DMSO) δ：101.71, 118.29, 122.64, 124.04, 124.42, 124.88, 127.65, 129.40, 133.85, 140.11, 147.95, 149.58, 151.95, MS (ESI) m/z : 255 (M+H)+
　２１
４－（Ｎ－フェニルアミノ）キノリン（２１）の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000024
　参考文献：Alan R. Katritzky,, A. R.; Tian-Bao Huang, T-B.; Voronkov, M. V. J. Org. Chem. 2001, 66, 1043-1045.
　Souza, M. Bioorganic and Medicinal Chemistry, 2009, 17, 1474-1480
　Ｎ－フェニル－７－クロロキノリン－４－アミン（１８０ｍｇ、０．７０９ｍｍｏｌ）をメタノール３０ｍＬに溶かし、Ｐｄ／Ｃ（１０％、１０ｍｇ、０．０００９ｍｍｏｌ、０．０１３当量）を加え常温・常圧で水素をバブリングしながら加えていき、３時間撹拌した。その後、セライト濾過し濃縮。次に１０％ＮａＯＨ水溶液１０ｍＬを加え１時間撹拌し、クロロホルムで抽出し、水２回、飽和食塩水で洗浄後、硫酸ナトリウムで乾燥し濃縮。アセトニトリルで再結晶した。収量５７．７ｍｇ、３７％、淡黄色、粒状結晶、ｍｐ．１９４．８～１９５．６℃（文献値ｍｐ．１９７～１９８℃）。
　1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ: 6.77 (s, 1H), 7.00 (d, J = 5.2 Hz, 1H), 7.19, (t, J = 6.8 Hz, 1H) 7.31 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 7.42 (t, J = 8.0 Hz, 2H), 7.50 (t, J = 8.0 Hz, 1H), 7.69 (t, J = 6.8 Hz, 1H), 7.95 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 8.05 (d, J = 8.8 Hz, 1H) 8.58 (d, J = 5.2 Hz, 1H), 13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ: 102.23, 119.57, 119.71, 122.60, 124.59, 125.32, 129.34, 129.68, 130.19, 139.87, 147.40, 149.13, 150.93, MS (ESI) m/z : 221 (M+H)+
４－ニトロ－２－（フェニルアミノ）安息香酸（２２）の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000025
　参考文献：Ullmann, F.; Wagner, C. Justus Liebigs Ann. Chem. 1907, 355, 359-371
　Ramage, R. WO2007/049057（2007年5月3日）
　アニリン（４．６６ｇ、０．０５ｍｏｌ、５当量）と２－クロロ－４－ニトロ安息香酸（２．０２ｇ、０．０１ｍｏｌ、１当量）との混合溶液に炭酸カリウム（１．６ｇ、０．０１２ｍｏｌ、１．１５当量）を加え１６０℃にし酢酸銅（９１ｍｇ、０．４５６ｍｍｏｌ）加えたのち、１８０℃で１０時間攪拌した。その後反応溶液に水３０ｍＬを加え、６Ｍの塩酸をｐＨ２になるまで加え１時間撹拌。乳鉢ですり潰した後、デシケーターで乾燥。シリカゲルカラム（シリカゲル４００ｇ）展開溶媒１％メタノール／クロロホルムで行った。アセトニトリルで再結晶した。収量、９１０ｍｇ、３５％、橙色、針状結晶、ｍｐ．２３２．９～２３４．０℃（文献値２３０℃）。
　1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 3.33 (broad, 1H), 7.22 (t, J = 7.6 Hz, 1H), 7.35 (d, J = 7.6 Hz, 2H), 7.43 - 7.52 (m, 3H), 7.82 (d, J = 2 Hz, 1H), 8.12 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 9.78 (broad, 1H), 13C NMR (100 MHz, DMSO-d6) δ: 107.52, 110.67, 117.04, 122.74, 124.71, 129.79, 133.58, 139.19, 147.84, 150.83, 168.64, MS (ESI) m/z: 257 (M-H)-
３－ニトロ－９－クロロアクリジン（２３）の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000026
　参考文献： Robert Faure, Jean-Pierre Galzy, Jacques Barbe, Abdel Lhatif Boukir, Emile-Jean Vincent, Gerard Boyer, Jose Elguero, Bull. Soc. Chim. Belges, 1991, 100, 639-646.
　Ramage, R. WO2007/049057（2007年5月3日）
　４－ニトロ－２－（フェニルアミノ）安息香酸（３６１ｍｇ、１．４ｍｍｏｌ）にオキシ塩化リン（５．３６ｇ、３５ｍｍｏｌ、２５当量）加え１３０℃で３０分攪拌した。その後、常温に冷ました後２８％のアンモニア水を塩基性になるまで加え、クロロホルムで抽出し、水２回、飽和食塩水で洗浄後、硫酸ナトリウムで乾燥し濃縮。酢酸エチルで再結晶した。収量１９２ｍｇ、５３％、黄色、ｍｐ．２１３．０～２１４．２℃（文献値２１３℃）。
　1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 7.35 (t, J = 8.0 Hz, 1H), 7.61 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 7.82 (t, J =  8.8 Hz, 1H), 7.96 (d, J = 9.6 Hz, 1H), 8.26 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 8.44 (dd, J = 2.8, 8.8 Hz, 2H), 13C NMR (100 MHz, DMSO-d6) δ: 113.34, 114.29, 117.72, 120.98, 122.21, 123.35, 126.09, 128.47, 134.42, 140.56, 141.28, 150.06, 176.20, MS (EI) m/z : 258 (M+H)+
３－ニトロ－９－アミノアクリジン（２８）の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000027
　参考文献： Ramage, R. WO2007/049057（2007年5月3日）
　３－ニトロ－９－クロロアクリジン（１１５ｍｇ、０．４４５ｍｍｏｌ）にフェノール（４１９ｍｇ、４．４５ｍｍｏｌ、１０当量）を加え７０℃で１時間攪拌し、その後炭酸アンモニウム６４ｍｇ（０．６６８ｍｍｏｌ、１．５当量）を加えたのち１２０℃まで温度を上げ６時間攪拌した。常温に戻した後、アセトンを加え０度にし、１時間撹拌。次に２．５Ｍ　ＮａＯＨ水溶液１５ｍＬを加え１時間撹拌後、酢酸エチルで抽出し、水２回、飽和食塩水で洗浄後、硫酸ナトリウムで乾燥し濃縮。メタノールで再結晶した。収量６８．３ｍｇ、６４％、赤色、ｍｐ．２１６．２℃（分解）。
　1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 7.45 (t, J = 8.0 Hz, 1H), 7.76 (t, J = 8.0 Hz, 1H), 7.91 (d, J =  8.8 Hz, 1H), 7.96 (dd, J = 3.2 , 8.8 Hz, 1H), 8.18 (broad, 2H), 8.46 (d, J = 8.8 Hz, 1H) 8.62-8.66 (m, 2H), 13C NMR (100 MHz, DMSO-d6) δ: 113.54, 113.62, 115.25, 123.35, 124.84, 126.07, 129.03, 131.13, 147.39, 148.23, 150.06, 150.71, MS (EI) m/z : 240 (M+H)+
７－クロロ－Ｎ－（４－フルオロフェニルアミノ）キノリン（２５）の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000028
　参考文献： Motiwala, F. Australian Journal of Chemistry 2007, 60, 369-374
　４，７－ジクロロキノリン（１．９８ｇ、１０ｍｍｏｌ）をフェノール　２５ｍＬに加え１２０度で撹拌した後、１７０℃に上げ、４－フルオロアニリン（１．６７ｇ、１５ｍｍｏｌ、１．５当量）を加えた後、１２時間撹拌した後、常温にさまし、アセトンを３０ｍＬ加え、０℃にし１時間撹拌。析出した結晶をアセトンで洗いながら吸引濾過。次に、ろ物を１０％ＮａＯＨ水溶液１００ｍＬに加え１時間撹拌し、クロロホルムで抽出し、水２回、飽和食塩水で洗浄後、硫酸ナトリウムで乾燥し濃縮。アセトニトリルで再結晶した。収量１．３５ｇ、５０％、紫色、粒状結晶。
　1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 6.78 (d, J = 5.2 Hz, 1H), 7.28 (t, J = 8.8 Hz, 2H), 7.39 (dd, J = 5.2, 8.8 Hz, 2H), 7.58 (dd, J = 2.0 , 9.6 Hz, 1H), 7.90 (d, J = 2.0 Hz, 1H), 8.40 - 8.46 (m, 2H), 9.08 (broad, 1H), 13C NMR (100 MHz, DMSO-d6) δ: 101.24, 116.13 (d, J = 22 Hz), 118.04, 124.59 (d, J = 59 Hz), 125.27 (d, J = 8.2 Hz), 127.66, 133.86, 136.27, 148.39, 148.50, 151.96, 158.89 (d, J = 242 Hz), 168.25, MS (ESI) m/z : 273 (M+H)+
Ｎ－（４－フルオロフェニル）キノリン－４－アミン（２６）の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000029
　７－クロロ－Ｎ－（４－フルオロフェニル）キノリン－４－アミン（１．２９ｇ、４．７４ｍｍｏｌ）を酢酸エチル３０ｍＬに溶かし、Ｐｄ／Ｃ（１０％、６５．６ｍｇ、０．０６１６ｍｍｏｌ、０．０１３当量）を加え、常温・常圧で水素をバブリングしながら加えていき、１０時間撹拌した。その後、セライト濾過し濃縮。次に１０％ＮａＯＨ水溶液１００ｍＬを加え１時間撹拌し、クロロホルムで抽出し、水２回、飽和食塩水で洗浄後、硫酸ナトリウムで乾燥し濃縮。アセトニトリルで再結晶した。収量６６２ｍｇ、５９％、無色、粒状結晶。
　1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 6.79 (d, J = 4.8 Hz, 1H), 7.27 (t, J = 8.8 Hz, 2H)7.40 (dd, J = 4.8,  8.8 Hz, 2H), 7.53 (t, J = 8.0 Hz, 2H), 7.70 (t, J = 8.0 Hz, 1H), 7.88 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 8.37 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 8.44 (d, J = 6.0 Hz, 1H), 8.93 ppm (broad, 1H), 13C NMR (100 MHz, DMSO-d6) δ: 100.94, 115.95, 116.17, 119.48, 121.95, 124.56, 125.00 (d, J = 8.2 Hz), 129.17, 136.72, 148.09, 148.84, 150.66, 158.69 (d, J = 241 Hz), MS (ESI) m/z : 239 (M+H)+
４－アミノキノリン（２７）の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000030
　参考文献：Souza, M. Bioorganic and Medicinal Chemistry 2009, 17, 1474-1480.
　４，７－ジクロロキノリン（１９８ｍｇ、１ｍｍｏｌ）をフェノール（１．８　ｍｌ、２０ｍｍｏｌ、２０当量）に溶かし、７０℃で１時間攪拌させた。その後、炭酸アンモニウム（１４４ｍｇ、１．５ｍｍｏｌ、１．５当量）を加えて１２０度で１時間３０分攪拌した後、常温にさまし、アセトンを加え、０℃にし１時間撹拌。析出した結晶をアセトンで洗いながら吸引濾過。次に、ろ物を１０％ＮａＯＨ水溶液１０ｍＬに加え１時間撹拌し、クロロホルムで抽出し、水２回、飽和食塩水で洗浄後、硫酸ナトリウムで乾燥し濃縮。シリカゲルカラム（シリカゲル：３０ｇ）展開溶媒５～２０％メタノール／クロロホルムで精製した。収量、１０３ｍｇ、５８％、暗赤色。
　次に４－アミノ－７－クロロキノリン（１０３ｍｇ、０．５７７ｍｍｏｌ）をメタノール１０ｍＬに溶かし、Ｐｄ／Ｃ（１０％、８．１６ｍｇ、０．０００８ｍｍｏｌ、０．０１３当量）を加え常温・常圧で水素をバブリングしながら加えていき、３時間撹拌した。その後、セライト濾過し濃縮。次に１０％ＮａＯＨ水溶液１０ｍＬを加え１時間撹拌し、クロロホルムで抽出し、水２回、飽和食塩水で洗浄後、硫酸ナトリウムで乾燥し濃縮。アセトニトリルで再結晶した。収量４２ｍｇ、５１％、無色、粒状結晶。
　1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 6.85 (d, J = 6.8 Hz, 1H), 7.68 (t, J = 6.8 Hz, 1H), 7.93-8.02 (m, 2H), 8.41 (d, J = 6.8 Hz, 1H), 8.52 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 9.14 (broad, 2H), 13C NMR (100 MHz, DMSO-d6) δ: 101.72, 115.95, 119.81, 123.82, 126.14, 133.76, 138.32, 141.34, 158.26, MS (ESI) m/z: 145 (M+H)+
３－メトキシ－９－アミノアクリジン（２９）の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000031
　４－メトキシ－２－（フェニルアミノ）安息香酸（５８４ｍｇ、２．４ｍｍｏｌ）にオキシ塩化リン（８．０９ｇ、５２．８ｍｍｏｌ、２２当量）加え１３０℃で３０分攪拌した。その後，常温に冷ました後２８％のアンモニア水を塩基性になるまで加え、クロロホルムで抽出し、水２回、飽和食塩水で洗浄後、硫酸ナトリウムで乾燥し濃縮した。得られた粗結晶をメタノールで再結晶した。収量３９１ｍｇ、６７％、淡黄色、ｍｐ．１６９．４－１６９．５℃。
　1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ: 4.01 (s, 3H), 7.30 (d, J = 10 Hz, 1H), 7.43 (s, 1H), 7.58 (t, J = 8.8 Hz, 1H), 7.79 (t, J = 8.0 Hz, 1H), 8.14 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 8.31 (d, J = 9.6 Hz, 1H), 8.39 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ: 55.65, 105.24, 120.39, 122.24, 123.13, 124.63, 125.74, 125.80, 128.99, 130.49, 140.88, 149.11, 150.66, 161.50 , MS (EI) m/z : 243 (M+H)+
３－メトキシ－９－アミノアクリジン（３１）の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000032
　３－メトキシ－９－クロロアクリジン（２６２ｍｇ、１．０８ｍｍｏｌ）にフェノール（１．０２ｇ、１０．８ｍｍｏｌ、１０当量）を加え７０℃で１時間攪拌し、その後炭酸アンモニウム（２０７ｍｇ、２．１６ｍｍｏｌ、１．５当量）を加えたのち１２０℃まで温度を上げ３時間攪拌した。常温に戻した後、アセトンを加え０℃にし、１時間撹拌。次に、２．５Ｍ　ＮａＯＨ１５ｍＬを加え１時間撹拌後、酢酸エチルで抽出し、水２回、飽和食塩水で洗浄後、硫酸ナトリウムで乾燥し濃縮。メタノールで再結晶した。収量１９４ｍｇ、８０％、黄色、粒状結晶、ｍｐ．１９６．９～１９９．８℃。
　1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 3.92 (s, 3H), 6.99 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 7.17 (s, 1H), 7.27 (t, J = 7.6 Hz, 1H), 7.62 (t, J = 8.8 Hz, 1H), 7.69 (broad, 2H), 7.77 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 8.31-8.37 ppm (m, 2H), 13C NMR (100 MHz, DMSO-d6) δ: 55.17, 105.45, 108.16, 112.78, 115.41, 120.87, 123.27, 124.81, 128.17, 129.77, 149.19, 149.82, 150.86, 160.62 ppm, MS (ESI) m/z : 225 (M+H)+
３－フェニル－９－クロロアクリジン（３４）の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000033
　２－（［１，１’－ビフェニル］－３－イルアミノ）安息香酸（８６８ｍｇ、３ｍｍｏｌ）にオキシ塩化リン（１１．５ｇ、７５ｍｍｏｌ、２５当量）加え，１３０度にし３０分撹拌した。その後、常温に冷ました後２８％のアンモニア水を塩基性になるまで加え、クロロホルムで抽出し、水２回、飽和食塩水で洗浄後、硫酸ナトリウムで乾燥し濃縮。アセトニトリルで再結晶した。収量５９３ｍｇ、６８％、淡黄色、針状結晶、ｍｐ．１０４．０～１０７．９℃。
　1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 7.36-7.38 (m, 2H), 7.54 (t, J = 6.8 Hz, 2H), 7.57-7.66 (m, 2H), 7.75-7.85 (m, 5H), 7.95 (dd, J = 2.0, 8.8 Hz, 1H), 13C NMR (100 MHz, DMSO-d6) δ: 124.70, 125.00, 125.23, 126.82, 126.85, 126.97, 127.02, 127.45, 127.69, 128.37, 129.12, 129.45, 129.55, 129.78, 130.16, 130.61, 130.67, MS (ESI) m/z : 290 (M+H)+
３－フェニル－９－アミノアクリジン（３５）の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000034
　３－フェニル－９－クロロアクリジン（２９０ｍｇ、１．００ｍｍｏｌ）にフェノール（９４１ｍｇ、１０ｍｍｏｌ、１０当量）を加え７０℃で１時間攪拌し、その後炭酸アンモニウム（１９２ｍｇ、２．００ｍｍｏｌ、２当量）を加えたのち１２０℃まで温度を上げ３時間攪拌した。常温に戻した後、アセトンを加え０℃にし，１時間撹拌。次に、２．５Ｍ　ＮａＯＨ１０ｍＬを加え１時間撹拌後、酢酸エチルで抽出し、水２回、飽和食塩水で洗浄後、硫酸ナトリウムで乾燥し濃縮。アセトニトリルで再結晶した。収量１９８ｍｇ、７３％、黄色、粒状結晶。
　1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 7.53-7.62 (m, 4H), 7.86-8.02 (m, 5H), 8.21 (s, 1H), 8.75 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 8.83 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 10.13 (broad, 2H), 13C NMR (100 MHz, DMSO-d6) δ: 110.68, 111.70, 115.44, 118.71, 122.81, 123.77, 124.88, 125.78, 127.24, 129.35, 135.48, 137.89, 139.58, 139.88, 146.44, 157.42,  MS (ESI) m/z : 271 (M+H)+
４－（Ｎ－ｐ－フルオロベンジル）アミノ－７－クロロキノリン（４１）の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000035
　４，７－ジクロロキノリン（１．９８ｇ、１０ｍｍｏｌ）をフェノール２５ｍＬに加え１２０℃で撹拌した後、１６０℃に昇温させ、ｐ－フルオロベンジルアミン（１．６１ｇ、１５ｍｍｏｌ、１．５当量）を加えた。６時間撹拌した後、常温に戻し、アセトン３０ｍＬを加え、０℃にし１時間撹拌した。析出した結晶をアセトンで洗いながら吸引濾過。得られた結晶を１０％ＮａＯＨ水溶液１００ｍＬに加え１時間撹拌し、クロロホルムで抽出し、水２回、飽和食塩水で洗浄後、硫酸ナトリウムで乾燥し濃縮。アセトニトリルで再結晶した。収量１．５２ｇ、収率５３％、無色、針状結晶、ｍｐ．１９４．９～１９６．０℃。
　IR (KBr) 3217 (NH) cm-1; 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 4.52 (d, J = 5.9 Hz, 2H), 6.34 (d, J = 5.9 Hz, 1H), 7.14 (t, J = 8.8 Hz), 7.41 - 7.49 (m, 3H), 7.79 (s, 1H), 8.03 (s, 1H), 8.31 - 8.33 (m, 2H), 13C NMR (100 MHz, DMSO-d6) δ: 47.79, 99.41, 115.06, 115.28, 117.51, 123.97, 124.30, 127.57, 128.83, 128.92, 133.45, 134.69, 134.71, 149.04, 149.78, 151.79, 159.99, 162.43; MS (EI) m/z : 286 (M+H)+ 
４－（Ｎ－ｐ－フルオロベンジルアミノ）キノリン（４２）の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000036
　４－（Ｎ－９－フルオロベンジル）アミノ－７－クロロキノリン（４１）（２８７ｍｇ，１ｍｍｏｌ）をメタノール２０ｍＬに溶かし、Ｐｄ／Ｃ（１０％、１１ｍｇ、０．０１ｍｍｏｌ、０．０１当量）を加え常温・常圧で水素をバブリングしながら加えていき、４時間撹拌した。その後、セライト濾過し濃縮。次に１０％ＮａＯＨ水溶液２０ｍＬを加え１時間撹拌し、クロロホルムで抽出し、水２回、飽和食塩水で洗浄後、硫酸ナトリウムで乾燥し濃縮。アセトニトリルで再結晶した。収量１７９ｍｇ、収率７１％、無色、針状結晶。ｍｐ．１８０．３～１８１．７℃。
　IR (KBr) 3221 (NH) cm-1; 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 4.53 (d, J = 5.8 Hz, 2H), 6.32 (d, J = 4.9 Hz, 1H), 7.14 (t, J = 8.8Hz), 7.40 - 7.46 (m, 3H), 7.61 (t, J = 8.8 Hz, 1H), 7.78 (d, J = 7.8 Hz, 1H), 7.89 (s, 1H), 8.26 - 8.31 (m, 2H), 13C NMR (100 MHz, DMSO-d6) δ: 44.79, 98.95, 115.03, 115.24, 118.90, 121.57, 124.00, 128.75, 128.83, 129.09, 134.97, 135.01, 148.28, 149.57, 150.54, 159.95, 162.38; MS (EI) m/z : 252 (M+H)+
スペクトル解析の実施例（１）
　複数のアニオン性化合物を混合した試料を６種類作成し（下記の表１～６）、これらの混合物について、負イオンモードでＭＡＬＤＩ質量分析を行い、各アニオン性化合物のイオン化能、ピーク強度に及ぼすマトリックスの効果を評価した。それぞれの混合物とマトリックスを任意の割合で混合したのち、ＭＡＬＤＩ用ステンレス製プレート上で風乾させ、この試料をＭＡＬＤＩ質量分析装置（島津製作所製　MALDI-TOF-MS:AXIMA,Performance）で測定した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000037
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000038
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000039
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000040
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000041
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000042
　マトリックスとして９－アミノアントラセン（１７）を用い、ＭＡＬＤＩ質量分析を負イオンモードで測定した結果を図１から図３に示す。図１および図２は、試料なしのブランク測定の結果を示すマススペクトルであるが、マトリックスのプロトン脱離イオン［Ｍ－Ｈ］-のピーク（ｍ／ｚ１９２）とＭ-イオンのピーク（ｍ／ｚ１９３）が観測される。その他のピークは帰属不可能なマトリックス由来ピークである。
　図３にはカルボン酸など計３４種のアニオン性生体成分の混合物（組成は上記の表２参照）のＭＡＬＤＩ質量分析スペクトルを示しているが、フマル酸、コハク酸、イタコン酸、キサンチン、ホスホエノールピルビン酸、クエン酸のピークが観察されている。
　一方、従来の負イオンモード測定での代表的マトリックスである９－アミノアクリジン（以下、９ＡＡと略す）で同じ混合物のＭＡＬＤＩ質量分析を行った結果を図４に示しているが、ほとんど質量ピークが観測されていない。このことから、負イオンモードにおける低分子量生体成分の検出に９－アミノアントラセンは９ＡＡよりも有用であることが明らかである。
　図５は、７－クロロ－４－（Ｎ－ベンジルアミノ）キノリン（１８）をマトリックスとした場合のブランク測定の結果を示す図であるが、ｍ／ｚ１００から２２０の間に顕著なピークは観測されていない。図６は、７－クロロ－４－（Ｎ－ベンジルアミノ）キノリン（１８）をマトリックスとして約３０種のアニオン性生体成分混合物（組成は下記の表２参照）を負イオンモードでＭＡＬＤＩ質量分析を行った結果得られたスペクトルを示しているが、ニコチン酸、アジピン酸、キノリン酸、アゼライン酸、セバシン酸の顕著なピークが観測されている。
　一方、図７には、９－アミノアクリジン（９－ＡＡ）をマトリックスとして上記の表３に示した組成を有する生体成分混合物を負イオンモードでＭＡＬＤＩ質量分析を行った結果得られたスペクトルを示しているが、アジピン酸及びキノリン酸の弱いピークが観測されているに過ぎず、明らかに、７－クロロ－４－（Ｎ－ベンジルアミノ）キノリン（１８）は９ＡＡよりマトリックスとして有用であることがわかる。
　上記の表１～６に示した６種類のアニオン性化合物の混合物について、種々のマトリックスを用いて負イオンモードでＭＡＬＤＩ質量分析を行い、９－ＡＡをマトリックスとして同様の測定を行った場合との比較を行い、各マトリックスと９－ＡＡを用いた場合に得られるピーク強度との比が大きい順に化合物の序列を作成した。上記の表１および表２に示す混合物についての測定結果より得られた序列を、それぞれ、表７および表８に示す。表中に記載の番号は、測定に用いたマトリクス化合物を示しており、本明細書中に記載しているマトリクス化合物番号を参照している。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000043
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000044
　従来技術に係るマトリックスである９－ＡＡを用いた場合、検出できない化合物が多数ある一方、本発明において創成したマトリクス化合物は、大半のアニオン性化合物を効率的にイオン化し、ワイドレンジかつ高感度に検出出来ることを証明した。これらの結果より、化合物５、１７、１８、２１、２４、３０、３５および３６について、特に高いイオン化能を有することがわかる。特に、化合物１７、１８、３６については、多くの分析物について顕著なイオン化能が認められた。
スペクトル解析の実施例（２）
　植物に対する作用物質であるｃｉｓ－ケイ皮酸およびそのアナローグ（表９参照）について、負イオンモードでＭＡＬＤＩ質量分析を行い、各アニオン性化合物のイオン化能、ピーク強度に及ぼすマトリックス化合物３７～４２の効果を評価した。それぞれのカルボン酸とマトリックスを任意の割合で混合したのち、ＭＡＬＤＩ用ステンレス製プレート上で風乾させ、この試料をＭＡＬＤＩ質量分析装置（島津製作所製　MALDI-TOF-MS:AXIMA,Performance）で測定した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000045
　ｃｉｓ－ケイ皮酸についての測定結果を図８～１４に示す。従来より負イオンモードでの測定においてマトリックスとして用いられている９－ＡＡを用いた場合には、図８に示すように十分なピーク強度（ｍ／ｚ＝１４７．０５：［Ｍ－１］-）が得られていないのに対し、化合物３７～４２をマトリックスとして用いた場合には、図９～１４に示すように、より高いイオン化能を有し、高感度でのＭＡＬＤＩ質量分析が可能であることがわかる。表９に示した他のカルボン酸についても、ｃｉｓ－ケイ皮酸の場合と同様に、９－ＡＡをマトリックスとして用いた場合には困難であった、負イオンモードにおける高感度ＭＡＬＤＩ質量分析が可能になった。
　低分子量生体成分のＭＡＬＤＩ質量分析測定において、マトリックスとして２，５－ジヒドロキシ安息香酸（ＤＨＢ）が良く用いられているが、イオン化能が高いとはいえず検出されない分子も多い。近年、負イオンモードでの測定において、マトリックスとして９－アミノアクリジン（９－ＡＡ）を用いる事で、比較的高感度に様々な低分子量生体成分を分析可能であることが示された（例えば、非特許文献１参照）。しかしながら、９－ＡＡでは測定不可能な化合物も多く、迅速かつ高感度を要求されるメタボローム解析にはより高性能なマトリックスの開発が望まれている。本発明において、９－アミノアントラセンとその誘導体、９－アミノキノリンとその誘導体、９－アミノアクリジン誘導体を合成し、それらが９－アミノアクリジンよりも高いイオン化能および感度を示し、従来、ＭＡＬＤＩ質量分析では検出困難であった生体由来低分子量化合物の検出に成功した。また、対象となる生体成分に適したマトリックスを選択することにより、マトリックス自身のイオンピークによるピークの検出の妨害を避けることができる。特定の微量生体成分の検出やバイオイメージングには特に有用である。
　これまでの結果から、マトリックスの条件として縮合多環式芳香環もしくは縮合多環式複素環及び芳香環上のアミノ基が望ましいという示唆が得られた。縮合多環式芳香環としてはアントラセン、フェナントレン等が望ましい。縮合多環式複素環としてはアクリジン、キノリンが望ましい。また、芳香環上の置換基およびアミノ基上の置換基を変換することで、イオン化能や感度を調整することができる。アミノ基としては１級もしくは２級が望ましい。アミノ基上の置換基としてはアリル基、アリール基、ベンジル基、アルキル基が望ましい。また、これらのアミンの塩（例えば塩酸塩）であってもよい。縮合芳香環上のアミノ基以外の置換基はアルコキシル基、アミノ基、アリール基、アリル基、ニトロ基であってもよいが、それらに限定されない。いずれの化合物も、市販されているか、市販の原料から数工程で容易に合成できる。

Claims (4)

  1. 　マトリックス支援レーザー脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ)質量分析用のマトリックスであって、
    　下記の一般式（Ｉ）、（II）または（III）で表される化合物またはそれらの塩からなる群より選択される１または複数の化合物を含むことを特徴とするＭＡＬＤＩ質量分析用マトリックス。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
     　なお、式（Ｉ）において、
    　Ｘは炭素または窒素原子であり、
    　Ｒ1は、水素原子、アルキル基、アリール基、置換アリール基、アリールアルキル基、置換アリールアルキル基、ヘテロアリール基および置換ヘテロアリール基からなる群より選択される基であり、
    　Ｒ2は、水素原子、アルキル基、アルコキシル基、ＮＲ3Ｒ4、ハロゲン原子、ニトロ基、アリル基、アリール基、置換アリール基、ヘテロアリール基および置換ヘテロアリール基からなる群より選択される基であり（ただし、Ｒ1およびＲ2が共に水素原子である場合を除く。）、
    　Ｒ3およびＲ4は、それぞれ独立して、水素原子、アルキル基、アリル基、アリール基、置換アリール基、アリールアルキル基、置換アリールアルキル基、ヘテロアリール基および置換ヘテロアリール基からなる群より選択される基であり、
    　式（II）において、
    　Ｒ5は、水素原子、アルキル基、アリル基、アリール基、置換アリール基、アリールアルキル基、置換アリールアルキル基、ヘテロアリール基および置換ヘテロアリール基からなる群より選択される基であり、
    　Ｒ6は、水素原子、アルキル基、アルコキシル基、ＮＲ3Ｒ4、ハロゲン原子、ニトロ基、アリル基、アリール基、置換アリール基、ヘテロアリール基および置換ヘテロアリール基からなる群より選択される基であり、
    　Ｒ3およびＲ4は、それぞれ独立して、水素原子、アルキル基、アリル基、アリール基、置換アリール基、アリールアルキル基、置換アリールアルキル基、ヘテロアリール基および置換ヘテロアリール基からなる群より選択される基であり、
    　式（III）において、
    　Ｚは炭素または窒素原子であり、
    　Ｒ7およびＲ8は、それぞれ独立して、水素原子およびアミノ基からなる群より選択される基である（ただし、Ｒ7およびＲ8が共にアミノ基である場合を除く。）。
  2. 　負イオンモード測定用のマトリックスであることを特徴とする請求項１記載のＭＡＬＤＩ質量分析用マトリックス。
  3. 　分析物が分子量１０００以下の有機化合物であることを特徴とする請求項１または２記載のＭＡＬＤＩ質量分析用マトリックス。
  4. 　前記化合物が、下記の式（５）、（１７）、（１８）、（２１）、（２４）、（３０）、（３５）、（３６）、（３７）～（４２）で表される化合物からなる群より選択される１または複数の化合物であることを特徴とする請求項１から３のいずれか１項記載のＭＡＬＤＩ質量分析用マトリックス。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
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