WO2012175774A1 - Utilización de biocápsulas de levadura como agentes fermentativos en la segunda fermentación alcohólica en botella y su aplicación para la elaboración de vino espumoso y bebidas alcohólicas espumosas - Google Patents

Utilización de biocápsulas de levadura como agentes fermentativos en la segunda fermentación alcohólica en botella y su aplicación para la elaboración de vino espumoso y bebidas alcohólicas espumosas Download PDF

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WO2012175774A1
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biocapsules
yeast
fermentation
bottle
wine
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Juan Carlos GARCÍA MAURICIO
Anna PUIG PUJOL
Mª Teresa GARCÍA MARTÍNEZ
Rafael Andrés PEINADO AMORES
Mª Nieves LOPÉZ DE LERMA EXTREMERA
Juan José MORENO VIGARA
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Universidad de Córdoba
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    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12GWINE; PREPARATION THEREOF; ALCOHOLIC BEVERAGES; PREPARATION OF ALCOHOLIC BEVERAGES NOT PROVIDED FOR IN SUBCLASSES C12C OR C12H
    • C12G1/00Preparation of wine or sparkling wine
    • C12G1/06Preparation of sparkling wine; Impregnation of wine with carbon dioxide
    • C12G1/064Preparation of sparkling wine; Impregnation of wine with carbon dioxide using enclosed yeast
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12GWINE; PREPARATION THEREOF; ALCOHOLIC BEVERAGES; PREPARATION OF ALCOHOLIC BEVERAGES NOT PROVIDED FOR IN SUBCLASSES C12C OR C12H
    • C12G2200/00Special features
    • C12G2200/05Use of particular microorganisms in the preparation of wine

Definitions

  • the present invention falls within the framework of Industrial Microbiology, providing technical optimization and qualitative of an existing manufacturing process.
  • the object of the invention is to cause the second fermentation in the bottle for the production of a sparkling alcoholic beverage, in particular for the production of sparkling wine, by the traditional method by means of a yeast system ( Saccharomyces cerevisiae or Saccharomyces bayanus ) co-immobilized naturally with a fungus of the species Penicillium chrysogenum .
  • yeast system Saccharomyces cerevisiae or Saccharomyces bayanus
  • the small spheres thus formed, biocapsules, present a series of technical advantages over existing immobilization systems and used for a similar purpose.
  • the sparkling wine is made from a second alcoholic fermentation of a base wine to which sugar is added and a strain of yeast of the species S. cerevisiae or S. bayanus selected for this purpose.
  • the fermentation of sparkling wine made by the traditional method or 'champenoise' is carried out inside commercially available 'champagne' bottles.
  • the yeasts When the second fermentation is completed and after a period of aging established by the regulatory body of each country for this type of alcoholic beverages, the yeasts must be completely extracted from the medium where they have been fermented to avoid turbidity of the product before leaving for market. This same procedure can also be used to obtain other sparkling alcoholic drinks fermented in bottles.
  • yeast cells are they find immobilized in a calcium alginate gel and concentrate on the Bottle neck quickly without shaking.
  • yeast cells for production of sparkling wine are immobilized in alginate spheres and subsequently they cover with a layer of calcium alginate in order to make sure that no cells are released from the fixed assets.
  • US5070019 describes a method of immobilization of yeasts in spheres of calcium alginate that improves the system proposed in EP0173915, where it is ensured that there is no calcium release to the environment that can cause precipitation crystalline
  • Patent ES2204316 describes the procedure for obtaining a new immobilization procedure for yeasts based on a natural and spontaneous co-immobilization between a yeast of the Saccharomyces cerevisiae species and a filamentous fungus of the Penicillium chrysogenum species without the need for external or compound supports binding chemicals, using appropriate conditions to favor symbiotic binding between the two microorganisms.
  • the present invention provides a method for carrying out the second alcoholic fermentation in a suitable container to contain a pressurized liquid, preferably a bottle, using this new system, yeast biocapsules co-immobilized naturally and spontaneously with a filamentous fungus of the species Penicillium chrysogenum , to obtain a sparkling alcoholic beverage, in particular sparkling wine, including champagnes and champagnes.
  • a pressurized liquid preferably a bottle
  • yeast biocapsules co-immobilized naturally and spontaneously with a filamentous fungus of the species Penicillium chrysogenum , to obtain a sparkling alcoholic beverage, in particular sparkling wine, including champagnes and champagnes.
  • This procedure allows, once the fermentation is complete, to remove the yeast used easily and efficiently.
  • the procedure avoids the use of external supports that can affect the catalytic activity of the yeast and / or transfer substances outside the product to be prepared.
  • the present invention relates to a process of obtaining a sparkling alcoholic beverage, characterized in that said method comprises a fermentation stage in a suitable container to contain a liquid under pressure using biocapsules comprising a yeast immobilized in a filamentous fungus.
  • the novelty of the present invention resides in apply a system of foaming alcoholic beverage cellular immobilization that uses an organism as an immobilization substrate alive (the mentioned filamentous fungus) instead of a physical-chemical support artificial that can yield substances outside the product you want to elaborate.
  • the present invention takes place in a suitable container to contain a liquid to pressure that allows the elimination of yeast and fungus biocapsules sedimented filamentous.
  • the suitable container used in The process of the present invention is a bottle, more preferably a 'champagne' type bottle.
  • the procedure of the present invention makes it possible to suppress the stage of removal and thinning of the bottles in the manufacture of sparkling beverages, since fermentation yeast is capable of sedimentation in the neck of the bottle by gravity before the process of disgust. Sedimentation without stirring before disgorgement allows savings considerable labor and time, since the sedimentation of yeasts immobilized in biocapsules is fast.
  • the present invention relates to a method of obtaining a sparkling wine, characterized in that said process comprises a fermentation stage in a suitable container for containing a pressurized liquid using biocapsules comprising a yeast immobilized in a filamentous fungus.
  • the suitable container used in the process of The present invention is a bottle, more preferably a type bottle 'champagne'
  • the yeast comprised in the biocapsules used in the process of the present invention may be a yeast of the genus Saccharomyces, preferably the yeast comprised in the biocapsules is chosen from Saccharomyces cerevisiae and Saccharomyces bayanus.
  • the filamentous fungus comprised in the biocapsules used in the process of the present invention may be a fungus of the genus Penicillium, preferably the filamentous fungus comprised in the biocapsules is Penicillium chrysogenum.
  • the culture medium used for spontaneous co-immobilization between the filamentous fungus and the yeast is not usable by the yeast, according to another aspect of the present invention, it is preferred that the fungus co-immobilize a minimum 1 x 10 6 yeast cells per ml of alcoholic base drink in the case of obtaining sparkling wine so that the necessary biocapsules are formed. In the particular case of using 750 ml bottles, this minimum number of yeast cells corresponds to 7.5 x 10 8 cells per bottle.
  • the fungus co-immobilizes a maximum amount of 2 x 10 6 yeast cells per ml of base wine so that the necessary biocapsules are formed. In the particular case of using 750 ml bottles, this minimum number of yeast cells corresponds to 1.5 x 10 9 cells per bottle.
  • Biocapsules once formed, can be collected in a 0.2 mm sieve and wash thoroughly with preferably cold water (between 6oC and 12oC). Water used for washing is partially recommended demineralized or deionized and sterile. The resulting biocapsules are can be submerged in distilled and sterile water at a temperature of 4 ° C for 4 weeks or even more without losing your activity or they can be immediately used for the production of sparkling wine.
  • the process according to the present invention can perform the inoculum of the biocapsules in each container, preferably in each bottle, which contains the wine and sugar to ferment by means of a funnel metal.
  • Yeasts immobilized in biocapsules can be different size depending on the weather and especially the stirring speed orbital to which your training has been done.
  • These biocapsules with larger size may present cracks on the surface due to a greater effect of the pressure inside the bottles due to its greater surface area of exposure, leading to the release of part of the yeast cells in the middle.
  • the inventors left the biocapsules more time in the training medium, preferably 14 days. This way you achieves a greater development of hyphae of the fungus, impacting on a greater consistency and resistance of the biocapsule wall.
  • biocapsules approximately 0.45 to 0.55 cm in diameter by applying a 150 rpm speed for a time interval between 7 and 14 days.
  • the number of biocapsules inoculated in each container depends on the diameter they have acquired. So, according to another preferred aspect of the present invention, the number of biocapsules per 750 ml bottle according to the description of the process of the present invention corresponds to: (a) 5 biocapsules / 750 ml if they have a diameter greater than 0.55 cm; (b) 20 ⁇ 2 biocapsules / 750 ml if the diameter is 0.45-0.55 cm and (c) of 180 to 200 biocapsules / 750 ml if the spheres have a diameter smaller than 0.45 cm
  • the biocapsules used in the procedure described in the This patent application has a diameter with a maximum dispersion of 10 mm In this way all the biocapsules of the container, and preferably of the same lot, settle at the same speed in the operation of 'putting in tip 'or clarification.
  • the process of the invention has the advantage that no foreign substance belonging to the immobilization support is released to the medium, that is, to the frothy alcoholic beverage produced. On the contrary it happens with the use of immobilized yeasts in calcium alginate beads where it has been detected a release of calcium to the medium, as demonstrated in the studies comparatives detailed in the examples of this invention.
  • the invention described herein offers the advantage of rapid settling by severity of yeasts immobilized in biocapsules: less than two minutes, saving the removal phase. This allows considerable economic savings, both in time and in labor.
  • the process according to this invention produces a Yeast immobilized in a simple way, which can be used for fermentation of sparkling alcoholic beverages, in particular sparkling wine, during which no clouding of the environment due to precipitations of crystals of tartrate or calcium malate or releases of yeast cells from their immobilization site.
  • the resulting foamy beverage has a turbidity value less than 0.7 NTU, equivalent to a transparent sparkling wine, ready for the final stages of disgorgement and labeling, before its release to the market.
  • the larger biocapsules settle more quickly by having a higher density. However, they have a lower surface / volume of nutrient exchange, which translates into a lower fermentative kinetics with respect to smaller biocapsules. In However, smaller biocapsules have a larger surface / volume of contact and, consequently, a greater fermentative kinetics.
  • the biocapsules used in the process of the present invention have a diameter of less than 10 mm, preferably between 2 and 3 mm.
  • the procedure described in this patent application is characterized in that the fermentation stage comprises the addition of yeast and fungus biocapsules filamentous to a fermentation medium comprising at least wine and sugar.
  • the product obtained by the process of the present invention is attached to a designation of origin, the characteristics of the base wine, added sugar and characteristics of the final product, must comply with the provisions of said regulation.
  • the examples shown in the present invention have been fulfilled the provisions of the regulation of the Cava Designation of Origin and its Regulatory Council (Order 14.11.91 (BOE 20.11.91) and modified by orders from 09.01.92 (BOE 16.02.02), 08.07.92 (BOE 21.07.92), 06.05.93 (BOE 19.05.93), 15.09.95 (BOE 23.09.95), 06.02.98 (BOE 12.02.98) and 23.02.07 (BOE 27.02.07).
  • the stage of fermentation comprised in the process of the present invention can take place in a temperature range between 10 oC and 16 oC.
  • the fermentation stage included in the process herein invention can take place in a period of 2 months, although the time of aging of the product made before the disgorgement phase is, by regulation, of a minimum of 9 months.
  • the fermentation stage included in the process herein invention may comprise sucrose as a source of sugar, preferably in a concentration between 20 and 25 g / l.
  • the fermentation stage included in the process herein invention may comprise a base wine with an alcoholic strength between 9.5% vol. and 11.5% vol.
  • the fermentation stage included in the process herein invention gives rise to a product with an alcoholic strength acquired between 10.8% vol. and 12.8% vol.
  • reaction medium of the fermentation stage comprised in the The process of the present invention is characterized by a pH between 2.8 and 3.3.
  • the reaction medium of the fermentation stage comprised in the The process of the present invention is characterized by total acidity minimum in tartaric acid of 5.5 g / l.
  • Figure 1 Evolution of the rate of production of CO 2 by immobilized yeast cells in calcium alginate beads, biocapsules and free cells (control) obtained in example 1.
  • Figure 2 Evolution of the rate of production of CO 2 by immobilized yeast cells in calcium alginate beads, biocapsules and free cells (control) obtained in Example 2.
  • Figure 3 Evolution of the rate of production of CO 2 by the immobilized yeast cells in calcium alginate beads, biocapsules and free cells (control) obtained in example 3.
  • Figure 4 Evolution of the rate of production of CO 2 by yeast cells immobilized in biocapsules of different sizes obtained in example 4.
  • Figure 5 Evolution of the rate of production of CO 2 by immobilized yeast cells in calcium alginate beads, biocapsules and free cells (control) at two fermentation temperatures obtained in example 5.
  • Example 1 Elaboration of sparkling wine 'cava': lot 1 .
  • the yeast used was the commercial strain Saccharomyces cerevisiae QA23 marketed by Lallemand BIO.
  • the base wine used presented the following characteristics: wine of the Denomination of Origin Cava, mixture of Macabeo (28.3%), Xarel ⁇ lo (29.2%), Parellada (25.8%) and Chardonnay varieties (16.7%); residual sugar: 0.3 g / L; alcoholic strength: 11% vol; pH: 3.06; acidity Total: 5.8 g / L (expressed in g / L of tartaric acid).
  • the inoculum concentration of each of the formats was calculated for each of the bottles, at the beginning of the second fermentation, there was a concentration of 1x10 6 cells / ml.
  • the sedimentation rate was checked once Once the fermentation is over and after a bottle aging period of one minimum of 9 months, regulatory in the Cava Designation of Origin.
  • the yeasts included in alginate spheres had a very sedimentation Fast: between 5 and 15 seconds, depending on the bottle. Those included in biocapsules they were a little slower but they did it in less than 2 minutes compared to the sedimentation of several days of the bottles made with cells free.
  • yeasts immobilized in biocapsules makes it possible to dispense with the Removal or thinning stage, being able to perform the disgorgement stage immediately.
  • Example 2 Elaboration of sparkling wine 'cava': lot 2 .
  • Example 1 was reproduced, but in this case the strain Sacccharomyces cerevisiae P29 (CECT 11770), isolated in the Penedés Designation of Origin, was used.
  • Figure 2 shows the evolution of the pressure at over time
  • the inoculum formats of yeasts in cells free and immobilized in biocapsules presented kinetics more or less parallel. Fermentation start-up with immobilized calcium alginate It was slower. The total duration of the fermentation, detected from Pressure stabilization time was 27 days for biocapsules, 35 for free cells and 63 days for cavas made with Yeasts included in calcium alginate beads.
  • Example 3 Elaboration of sparkling wine 'cava': lot 3 .
  • Figure 3 shows the evolution of the pressure in all three test cases.
  • the two inoculum formats with immobilized yeasts presented a period of adaptation to the upper environment (between 11 and 14 days) to which they presented free cells (7 days).
  • the second fermentation ended at 43 days for case of free yeasts and was delayed up to 52 days for the case of yeasts immobilized in alginate and biocapsules.
  • Example 4 Elaboration of sparkling wine 'cava' with biocapsules of different sizes.
  • Biocapsules obtained from S. cerevisae strain P29 and Penicillium chrysogenum were used .
  • the speed of orbital agitation, according to the procedure for obtaining biocapsules, was varied to achieve spheres of different sizes.
  • the base wine for making cava it was the same as in example 1 and 2, to which 22 g / L of sugar was added.
  • the number of biocapsules inoculated in each bottle depended on its diameter: (a) 5 biocapsules / 750 ml if they had a diameter greater than 0.5 cm; (b) 20 ⁇ 2 biocapsules / 750 ml if the diameter is approximately 0.5 cm, and (c) 180 to 200 biocapsules / 750 ml if the spheres They have a diameter of less than 0.5 cm.
  • the second fermentation took place at a temperature stable at 14 ° C.
  • Figure 4 shows the speed of fermentation of some representative bottles of these lots. In it she you can check that the ones that had the best fermentation kinetics were the corresponding to the inoculums with biocapsules less than 0.5 cm in diameter, secondly the bottle with spheres of approximately 0.5 cm in diameter and Finally, the one that was inoculated with larger biocapsules. This behavior can be explained by the surface / volume ratio and the number of spheres in each bottle: the bottles that contained more biocapsules although They were smaller in size and had a larger contact surface (and therefore, for the exchange of nutrients) with the medium to be fermented.
  • the present invention refers to different speeds of taking of foam, or of second fermentation, depending of the applied size of immobilized yeasts in biocapsules.
  • Example 5 Elaboration of sparkling wine 'cava' with biocapsules at two fermentation temperatures.
  • Example 2 S. cerevisiae strain P29, base wine described in Example 1 and three formats yeast inoculation also described in Example 1.
  • variable to experience was the influence that could have a second fermentation temperature considered limit: 10 ° C, against a standard temperature: 14oC.
  • Figure 5 shows the kinetics fermentative of the 6 cases studied. In both temperatures, yeasts immobilized in biocapsules and free yeasts had a behavior parallel, evolving at the same speed.
  • the yeast inoculums in Calcium alginate pearl format presented a delay both at the beginning as at the end of the fermentation with respect to the other two cases both at 10 ° C as at 14 ° C.
  • the present invention shows that wine yeasts immobilized in biocapsules can perfectly ferment temperature limits, behaving in the same way as inoculation Traditional yeast in free form.

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Abstract

Utilización de levaduras inmovilizadas en biocápsulas y su aplicación en la producción de vino espumoso elaborado a partir de la segunda fermentación alcohólica en botella realizada por estas levaduras. La invención comprende la obtención de las biocápsulas en una concentración apropiada y su aplicación como biocatalizador en un proceso fermentativo industrial particular.

Description

Utilización de biocápsulas de levadura como agentes fermentativos en la segunda fermentación alcohólica en botella y su aplicación para la elaboración de vino espumoso y bebidas alcohólicas espumosas
SECTOR TÉCNICO
La presente invención se encuadra dentro del marco de la Microbiología Industrial, proporcionando una optimización técnica y cualitativa de un proceso de elaboración ya existente.
De forma más concreta, el objeto de la invención consiste en provocar la segunda fermentación en botella para la elaboración de una bebida alcohólica espumosa, en particular para la elaboración de vino espumoso, por el método tradicional mediante un sistema de levaduras (Saccharomyces cerevisiae o Saccharomyces bayanus) co-inmovilizadas de manera natural con un hongo de la especie Penicillium chrysogenum. Las pequeñas esferas así formadas, biocápsulas, presentan una serie de ventajas técnicas respecto a los sistemas de inmovilización existentes y utilizados para un fin similar.
ESTADO DE LA TÉCNICA
El vino espumoso se elabora a partir de una segunda fermentación alcohólica de un vino base al cual se le añade azúcar y una cepa de levadura de la especie S. cerevisiae o S. bayanus seleccionada para este fin. La fermentación del vino espumoso elaborado por el método tradicional o 'champenoise' se realiza en el interior de botellas tipo 'champagne' disponibles comercialmente. Cuando la segunda fermentación se completa y después de un período de crianza que establece el organismo regulador de cada país para este tipo de bebidas alcohólicas, las levaduras han de extraerse completamente del medio donde han fermentado para evitar la turbidez del producto antes de su salida al mercado. Este mismo procedimiento también se puede utilizar para obtener otras bebidas alcohólicas espumosas fermentadas en botellas.
La eliminación de la levadura cuando la crianza ha terminado es complicada. Las botellas se colocan en posición inclinada en pupitres y se remueven repetitivamente durante un periodo sustancial de tiempo hasta que se consigue que los sedimentos de las levaduras se depositen en el cuello de la botella. Posteriormente en la etapa de degüelle, el cuello se congela, la botella se abre y los sedimentos de las levaduras congelados salen expulsados por la presión adquirida en el interior del recipiente (6 - 7 atmósferas). El removido es una operación larga que necesita una mano de obra importante para cada botella ya que tiene que ser manipulada durante muchos días (alrededor de 24 días).
Aunque se han diseñado sistemas automatizados de removido como los gyropalettesTM, esta operación conlleva la ocupación de un espacio físico importante en la bodega: de un 10-15 % en el caso de la clarificación en pupitres y de un 3-5 % en el caso del uso de un sistema automatizado.
Según la patente FR2432045 los procesos mencionados anteriormente pueden simplificarse. En FR2432045 las células de levaduras se encuentran inmovilizadas en un gel de alginato cálcico y se concentran en el cuello de la botella rápidamente sin necesidad de agitación. Según la patente ES8609469 (equivalente a EP0173915) las células de levadura para la producción de vino espumoso se inmovilizan en esferas de alginato y posteriormente se recubren con una capa de alginato cálcico con la finalidad de asegurarse de que no se liberen células desde el inmovilizado. Finalmente, según la patente US5070019 se describe un método de inmovilización de levaduras en esferas de alginato cálcico que mejora el sistema propuesto en EP0173915, donde se asegura que no existe liberación de calcio al medio que pueda provocar precipitaciones cristalinas.
Los sistemas de inmovilización de levaduras descritos anteriormente se han obtenido mediante soportes artificiales. La unión no natural a estos soportes puede afectar a la actividad catalítica de la levadura. La patente ES2204316 describe el procedimiento de obtención de un nuevo procedimiento de inmovilización para levaduras basado en una co-inmovilización natural y espontánea entre una levadura de la especie Saccharomyces cerevisiae y un hongo filamentoso de la especie Penicillium chrysogenum sin la necesidad de soportes externos o compuestos químicos de unión, utilizando condiciones apropiadas para favorecer la unión simbiótica entre los dos microorganismos.
La presente invención proporciona un procedimiento para realizar la segunda fermentación alcohólica en un recipiente adecuado para contener un líquido a presión, preferentemente una botella, utilizando este nuevo sistema, biocápsulas de levadura co-inmovilizadas de forma natural y espontánea con un hongo filamentoso de la especie Penicillium chrysogenum, para obtener una bebida alcohólica espumosa, en particular vino espumoso, incluidos los cavas y champagnes. Este procedimiento permite, una vez completada la fermentación, retirar la levadura utilizada de forma fácil y eficaz. Así mismo, el procedimiento evita la utilización de soportes externos que puedan afectar la actividad catalítica de la levadura y/o ceder sustancias ajenas al producto que se desea elaborar.
DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN
La presente invención se refiere a un procedimiento de obtención de una bebida alcohólica espumosa, caracterizado porque dicho procedimiento comprende una etapa de fermentación en un recipiente adecuado para contener un líquido a presión utilizando biocápsulas que comprenden una levadura inmovilizada en un hongo filamentoso.
La novedad de la presente invención reside en aplicar para la elaboración de una bebida alcohólica espumosa un sistema de inmovilización celular que utiliza como sustrato de inmovilización un organismo vivo (el citado hongo filamentoso) en lugar de un soporte físico-químico artificial que puede ceder sustancias ajenas al producto que se quiere elaborar.
De acuerdo con un aspecto preferente, la presente invención tiene lugar en un recipiente adecuado para contener un líquido a presión que permite la eliminación de las biocápsulas de levadura y hongo filamentoso sedimentadas. Preferentemente, el recipiente adecuado utilizado en el procedimiento de la presente invención es una botella, más preferentemente una botella tipo 'champagne'.
En particular, el procedimiento de la presente invención permite suprimir la etapa de removido y aclareo de las botellas en la fabricación de bebidas espumosas, ya que la levadura de fermentación es capaz de sedimentar en el cuello de la botella por gravedad antes del proceso de degüelle. La sedimentación sin removido antes del degüelle permite un ahorro considerable de mano de obra y tiempo, puesto que la sedimentación de levaduras inmovilizadas en biocápsulas es rápida.
De acuerdo con un aspecto preferente, la presente invención se refiere a un procedimiento de obtención de un vino espumoso, caracterizado porque dicho procedimiento comprende una etapa de fermentación en un recipiente adecuado para contener un líquido a presión utilizando biocápsulas que comprenden una levadura inmovilizada en un hongo filamentoso. Preferentemente, el recipiente adecuado utilizado en el procedimiento de la presente invención es una botella, más preferentemente una botella tipo 'champagne'.
De acuerdo con otro aspecto preferente adicional, la levadura comprendida en las biocápsulas utilizadas en el procedimiento de la presente invención puede ser una levadura del género Saccharomyces, preferentemente la levadura comprendida en las biocápsulas se elige entre Saccharomyces cerevisiae y Saccharomyces bayanus.
De acuerdo con otro aspecto preferente adicional, el hongo filamentoso comprendido en las biocápsulas utilizadas en el procedimiento de la presente invención puede ser un hongo del género Penicillium, preferentemente el hongo filamentoso comprendido en las biocápsulas es Penicillium chrysogenum.
El procedimiento de obtención de biocápsulas de levadura se ha descrito en la patente ES2204316. Sin embargo, la aplicación de las biocápsulas de levadura y hongo filamentoso al procedimiento de la presente invención hace necesario controlar el número de levaduras que se van a inmovilizar con el fin de asegurar un inóculo suficiente para cada recipiente de bebida alcohólica espumosa, preferentemente vino espumoso, que se va a producir; es decir, asegurar una conversión completa del azúcar en CO2 adquiriendo el recipiente en su interior una presión de 6-7 atmósferas.
Debido a que el medio de cultivo que se usa para la co-inmovilización espontánea entre el hongo filamentoso y la levadura no es utilizable por la levadura, de acuerdo con otro aspecto de la presente invención, se prefiere que el hongo co-inmovilice un mínimo de 1 x 106 células de levadura por ml de bebida alcohólica base en el caso de obtención de vino espumoso para que se formen las biocápsulas necesarias. En el caso particular de utilizar botellas de 750 ml, este número mínimo de células de levadura corresponde a 7,5 x 108 células por botella.
De acuerdo con otro aspecto preferente de la invención, el hongo co-inmoviliza una cantidad máxima de 2 x 106 células de levadura por ml de vino base para que se formen las biocápsulas necesarias. En el caso particular de utilizar botellas de 750 ml, este número mínimo de células de levadura corresponde a 1,5 x 109 células por botella.
Las biocápsulas, una vez formadas, pueden recogerse en un tamiz de 0,2 mm y lavarse abundantemente con agua preferiblemente fría (entre 6ºC y 12ºC). El agua empleada para el lavado se recomienda parcialmente desmineralizada o desionizada y estéril. Las biocápsulas así resultantes se pueden guardar sumergidas en agua destilada y estéril a una temperatura de 4ºC durante 4 semanas o incluso más sin perder su actividad o pueden ser inmediatamente usadas para la elaboración de vino espumoso.
Para proceder a la elaboración del vino espumoso, los materiales necesarios se encuentran descritos en una amplia bibliografía (ver ejemplo en: Tratado de enología. J. Hidalgo Togores. Tomo II, pp.: 945-994. Ediciones Mundi-Prensa, Madrid (2003).
El procedimiento según la presente invención puede realizar el inóculo de las biocápsulas en cada recipiente, preferentemente en cada botella, que contiene el vino y azúcar a fermentar mediante un embudo metálico.
Las levaduras inmovilizadas en biocápsulas pueden ser de distinto tamaño según el tiempo y sobre todo la velocidad de agitación orbital a la cual se haya realizado su formación.
De acuerdo con otro aspecto preferente, se consiguen biocápsulas de tamaño superior a 0,55 cm de diámetro a una velocidad de agitación de 100 rpm, preferentemente manteniéndolas en agitación durante un tiempo mínimo de 7 días y un tiempo máximo de 14 días. Estas biocápsulas con tamaño mayor pueden presentar fisuras en la superficie debido a un mayor efecto de la presión en el interior en las botellas debido a su mayor superficie de exposición, dando lugar a la liberación de parte de las células de levadura en el medio. Para solucionar este problema los inventores dejaron las biocápsulas más tiempo en el medio de formación, preferentemente 14 días. De esta forma se consigue un mayor desarrollo de las hifas del hongo, repercutiendo en una mayor consistencia y resistencia de la pared de las biocápsulas.
De acuerdo con otro aspecto preferente, se consiguen biocápsulas de aproximadamente entre 0,45 y 0,55 cm de diámetro aplicando una velocidad de 150 rpm durante un intervalo de tiempo entre 7 y 14 días.
De acuerdo con otro aspecto preferente, se consiguen biocápsulas de tamaño inferior a 0,45 cm de diámetro con una velocidad de agitación orbital de 200 rpm durante un intervalo de tiempo entre 7 y 14 días.
Aumentar el tiempo de formación de las biocápsulas entre 10 y 14 días antes de su inóculo en botella mejora la compactación del entramado de hifas del hongo filamentoso con lo que las esferas de biocápsulas adquirirán un aspecto liso, evitando la liberación de hifas al medio, es decir al producto que se desea.
El número de biocápsulas inoculadas en cada recipiente depende del diámetro que hayan adquirido. Así, de acuerdo con otro aspecto preferente de la presente invención, el número de biocápsulas por botella de 750 ml según la descripción del proceso de la presente invención corresponde a: (a) 5 biocápsulas/750 ml si presentan un diámetro superior a 0,55 cm; (b) 20 ± 2 biocápsulas/750 ml si el diámetro es 0,45-0,55 cm y (c) de 180 a 200 biocápsulas/750 ml si las esferas presentan un diámetro inferior a 0,45 cm.
De acuerdo con otro aspecto preferente de la presente invención, las biocápsulas utilizadas en el procedimiento descrito en la presente solicitud de patente tienen un diámetro con una dispersión máxima de 10 mm. De esta forma todas las biocápsulas del recipiente, y preferentemente del mismo lote, sedimenten a la misma velocidad en la operación de 'puesta en punta' o clarificación.
Las biocápsulas a lo largo del tiempo resisten el incremento de presión que se produce en el transcurso de la segunda fermentación en el interior del recipiente adecuado para contener líquidos a presión para la toma de espuma. Tanto las biocápsulas con un diámetro igual o inferior a 0,55 cm, como aquellas con un tamaño superior a 0,55 cm que permanecen 14 días en el medio de formación, no sufren ningún tipo de deformación ni rotura. Tampoco existe una liberación de células de levadura al medio ya que por el efecto de la presión quedan confinadas dentro de su soporte de inmovilización.
Si la fermentación tuviera lugar en depósitos abiertos, sin presión, las biocápsulas liberarían las células de levadura al exterior y se enturbiaría la matriz. Por ese motivo, el procedimiento de la presente invención tiene lugar en un sistema cerrado como, por ejemplo, son las botellas.
El proceso de la invención presenta la ventaja de que ninguna sustancia ajena perteneciente al soporte de inmovilización es liberada al medio, o sea, a la bebida alcohólica espumosa producida. Al contrario ocurre con el uso de levaduras inmovilizadas en perlas de alginato cálcico donde se ha detectado una liberación de calcio al medio, como se demuestra en los estudios comparativos detallados en los ejemplos de esta invención.
Una vez terminada la fermentación y justo antes de la fase de degüelle, las botellas se colocan en posición vertical boca abajo. La invención aquí descrita ofrece la ventaja de una rápida sedimentación por gravedad de las levaduras inmovilizadas en biocápsulas: menos de dos minutos, ahorrándose la fase de removido. Ello permite un ahorro económico considerable, tanto en tiempo como en mano de obra.
El proceso de acuerdo con esta invención produce un inmovilizado de levadura de una manera simple, que puede utilizarse para la fermentación de bebidas alcohólicas espumosas, en particular vino espumoso, durante la cual no se producen enturbiamientos del medio debidos a precipitaciones de cristales de tartrato o malato de calcio o liberaciones de las células de levaduras de su emplazamiento de inmovilización. De esta manera, se asegura que la bebida espumosa resultante presente un valor de turbidez inferior a los 0,7 NTU, equivalente a un vino espumoso transparente, listo para las etapas finales de degüelle y etiquetaje, antes de su salida al mercado.
Las biocápsulas de mayor tamaño sedimentan más rápidamente por tener una mayor densidad. Sin embargo, presentan una menor superficie/volumen de intercambio de nutrientes, lo que se traduce en una cinética fermentativa menor respecto a las biocápsulas de menor tamaño. En cambio, las biocápsulas de menor tamaño presentan una mayor superficie/volumen de contacto y, en consecuencia, una mayor cinética fermentativa.
De acuerdo con otro modo de realización preferente, las biocápsulas utilizadas en el procedimiento de la presente invención tienen un diámetro inferior a 10 mm, preferentemente entre 2 y 3 mm.
De acuerdo con otro aspecto preferente, el procedimiento descrito en esta solicitud de patente se caracteriza porque la etapa de fermentación comprende la adición de biocápsulas de levadura y hongo filamentoso a un medio de fermentación que comprende al menos vino y azúcar.
De acuerdo con otro aspecto preferente, el producto obtenido por el procedimiento de la presente invención se adscribe a una denominación de origen, las características del vino base, azúcar añadido y características del producto final, deberán cumplir con lo establecido en dicho reglamento. En los ejemplos mostrados en la presente invención se han cumplido las disposiciones del reglamento de la Denominación de Origen Cava y de su Consejo Regulador (Orden 14.11.91 (BOE 20.11.91) y modificado mediante órdenes de 09.01.92 (BOE 16.02.02), 08.07.92 (BOE 21.07.92), 06.05.93 (BOE 19.05.93), 15.09.95 (BOE 23.09.95), 06.02.98 (BOE 12.02.98) y 23.02.07 (BOE 27.02.07).
De acuerdo con otro aspecto preferente, la etapa de fermentación comprendida en el procedimiento de la presente invención puede tener lugar en un intervalo de temperatura de entre 10 ºC y 16 ºC.
De acuerdo con otra realización preferente adicional, la etapa de fermentación comprendida en el procedimiento de la presente invención puede tener lugar en un periodo de 2 meses, aunque el tiempo de crianza del producto elaborado antes de la fase de degüelle es, por reglamento, de un mínimo de 9 meses.
De acuerdo con otra realización preferente adicional, la etapa de fermentación comprendida en el procedimiento de la presente invención puede comprender sacarosa como fuente de azúcar, preferentemente en una concentración entre 20 y 25 g/l.
De acuerdo con otra realización preferente adicional, la etapa de fermentación comprendida en el procedimiento de la presente invención puede comprender un vino base con un grado alcohólico entre 9,5 % vol. y 11,5 % vol.
De acuerdo con otra realización preferente adicional, la etapa de fermentación comprendida en el procedimiento de la presente invención da lugar a un producto con un grado alcohólico adquirido entre 10,8 % vol. y 12,8 % vol.
De acuerdo con otra realización preferente adicional, el medio de reacción de la etapa de fermentación comprendida en el procedimiento de la presente invención se caracteriza por un pH entre 2,8 y 3,3.
De acuerdo con otra realización preferente adicional, el medio de reacción de la etapa de fermentación comprendida en el procedimiento de la presente invención se caracteriza por una acidez total mínima en ácido tartárico de 5,5 g/l.
Breve descripción de las figuras
Figura 1: Evolución de la velocidad de producción de CO2 por las células de levadura inmovilizadas en perlas de alginato cálcico, biocápsulas y células libres (testigo) obtenidas en el ejemplo 1.
Figura 2: Evolución de la velocidad de producción de CO2 por las células de levadura inmovilizadas en perlas de alginato cálcico, biocápsulas y células libres (testigo) obtenidas en el ejemplo 2.
Figura 3: Evolución de la velocidad de producción de CO2 por las células de levadura inmovilizadas en perlas de alginato cálcico, biocápsulas y células libres (testigo) obtenidas en el ejemplo 3.
Figura 4: Evolución de la velocidad de producción de CO2 por las células de levadura inmovilizadas en biocápsulas de diferente tamaño obtenidas en el ejemplo 4.
Figura 5: Evolución de la velocidad de producción de CO2 por las células de levadura inmovilizadas en perlas de alginato cálcico, biocápsulas y células libres (testigo) a dos temperaturas de fermentación obtenidas en el ejemplo 5.
EJEMPLOS
La presente invención se ilustra adicionalmente mediante los siguientes ejemplos, los cuales no deben considerarse, en absoluto, como limitantes del alcance de la invención.
Ejemplo 1:Elaboración de vino espumoso 'cava': lote 1.
La levadura utilizada fue la cepa comercial Saccharomyces cerevisiae QA23 comercializada por Lallemand BIO.
El vino base utilizado presentó las siguientes características: vino de la Denominación de Origen Cava, mezcla de las variedades Macabeo (28,3%), Xarel·lo (29,2%), Parellada (25,8%) y Chardonnay (16,7%); azúcar residual: 0,3 g/L; grado alcohólico: 11 % vol; pH: 3,06; acidez total: 5,8 g/L (expresados en g/L de ácido tartárico).
Al vino base se le adicionó 22 g/l de azúcar.
Para la segunda fermentación, se utilizaron tres formatos de levadura:
  1. (1) QA23 en forma de células libres.
  1. (2) QA23 inmovilizadas en alginato cálcico, preparado comercial con el nombre de Proelif. Se adicionaron 1,2 g/botella.
  1. (3) QA23 inmovilizadas en forma de biocápsulas, según lo explicado en la presente invención. El diámetro de las esferas utilizadas fue de entre 2 y 4 mm.
La concentración de los inóculos de cada uno de los formatos se calculó para que en cada una de las botellas, al inicio de la segunda fermentación, existiera una concentración de 1x106 células/ml.
Las botellas se dispusieron en posición horizontal y la segunda fermentación tuvo lugar en una cava a una temperatura de 16ºC. Se siguió la evolución de la presión de CO2 a lo largo del tiempo, cuyos resultados se muestran en la figura 1 adjunta.
Al comparar el efecto de la inmovilización sobre la cinética de fermentación, equivalente a la velocidad de producción de CO2 por las células de levaduras inmovilizadas y libres, se pudo comprobar que en el caso de las levaduras libres e inmovilizadas en biocápsulas el comportamiento fue paralelo, observando un incremento de la presión a partir del día 6. Sin embargo, las levaduras inmovilizadas en perlas de alginato cálcico fueron más lentas en fermentar: se observó un incremento de la presión a partir del día 29. El retraso observado puede deberse a un período de adaptación más largo al medio de fermentación o a fenómenos de difusión. La duración del proceso en el inóculo con células libres y en los inmovilizados en biocápsulas fue de unos 37 días, mientras que en alginato cálcico tardó 53 días.
La velocidad de sedimentación se comprobó una vez terminada la fermentación y transcurrido un periodo de crianza en botella de un mínimo de 9 meses, reglamentarios en la Denominación de Origen Cava. Las levaduras incluidas en esferas de alginato tuvieron una sedimentación muy rápida: entre 5 y 15 segundos, según la botella. Las incluidas en biocápsulas fueron un poco más lentas pero lo hicieron en menos de 2 minutos en comparación a la sedimentación de varios días de las botellas elaboradas con células libres. Así pues, según el ejemplo descrito sobre esta invención se demuestra que el uso de levaduras inmovilizadas en biocápsulas permite prescindir de la etapa de removido o aclareo, pudiendo efectuar la etapa de degüelle inmediatamente.
Los datos analíticos más representativos de los cavas una vez acabada la segunda fermentación, transcurridos 11 meses desde su inicio y una vez realizado el degüelle son los que se expresan en la Tabla 1.
Tabla 1. Análisis de los cavas del ejemplo 1
CEPA FORMATO Azúcar (g/L) Grado alcohólico (% vol) pH Acidez total (g/L) Acidez volátil (g/L) Ca (mg/L)
QA23 Libres 0,4 12,4 3,00 5,8 0,15 50
QA23 Alginato 1,5 12,25 3,05 5,8 0,19 60
QA23 Biocápsulas 0,5 12,35 3,02 5,4 0,15 50
El análisis enológico del producto resultante de las tres variantes de inóculo de levaduras mostró que el vino espumoso elaborado con levaduras inmovilizadas en perlas de alginato presentaba un contenido de calcio y azúcar superior a los otros dos sistemas de inóculo. Ello sugiere que los inmovilizados en biocápsulas, además de no liberar ningún tipo de sustancia al medio presentaban una la capacidad fermentativa superior respecto al otro formato de inmovilización testado y similar al de las células libres.
Ejemplo 2:Elaboración de vino espumoso 'cava': lote 2.
Se reprodujo el ejemplo 1, pero en este caso se usó la cepa Sacccharomyces cerevisiae P29 (CECT 11770), aislada en la Denominación de Origen Penedés.
Los resultados obtenidos fueron muy parecidos a los obtenidos con la cepa QA23.
La figura 2 muestra la evolución de la presión a lo largo del tiempo. De nuevo, los formatos de inóculo de las levaduras en células libres e inmovilizadas en biocápsulas presentaron cinéticas más o menos paralelas. El arranque de fermentación con inmovilizados en alginato cálcico fue más lento. La duración total de la fermentación, detectada a partir del momento de la estabilización de la presión, fue de 27 días para las biocápsulas, 35 para las células libres y 63 días para los cavas elaborados con levaduras incluidas en perlas de alginato cálcico.
La velocidad de sedimentación se repitió respecto al ejemplo 1.
Los parámetros enológicos más representativos de los cavas resultantes aparecen en la Tabla 2.
Tabla 2. Análisis de los cavas del ejemplo 2
CEPA FORMATO Azúcar (g/L) Grado alcohólico (% vol) pH Acidez total (g/L) Acidez volátil (g/L) Ca (mg/L)
P29 Libres 0,6 12,4 3,03 5,4 0,17 50
P29 Alginato 2 12,3 3,05 5,6 0,18 61
P29 Biocápsulas 0,3 12,45 3,01 5,6 0,17 49
De nuevo, los niveles del ión calcio y de azúcar presentaban la misma tendencia que en el ejemplo 1: mayor concentración de calcio y azúcar en los cavas elaborados a partir de levaduras inmovilizadas en alginato cálcico.
Ejemplo 3: Elaboración de vino espumoso 'cava': lote 3.
Se estudió el comportamiento de la misma cepa de levadura del ejemplo 2 pero partiendo de un vino base de distintas características: vino de la Denominación de Origen Cava, mezcla de las variedades Macabeo (30%), Xarel·lo (33%) y Parellada (37%); azúcar residual: 0,3 g/L; grado alcohólico: 10,85 % vol; pH: 2,96; acidez total: 6,0 g/L (expresados en g/L de ácido tartárico). La principal diferencia respecto al vino base de los ejemplos 1 y 2 era el pH por debajo de 3,00 que presentaba este vino, factor limitante que podía dificultar el funcionamiento de las levaduras para realizar la segunda fermentación.
En la figura 3 se puede observar la evolución de la presión en los tres casos de ensayo. En el vino base de estas características, los dos formatos de inóculo con levaduras inmovilizadas presentaron un periodo de adaptación al medio superior (entre 11 y 14 días) al que presentaron las células libres (7 días). La segunda fermentación terminó a los 43 días para el caso de las levaduras libres y se retrasó hasta los 52 días para el caso de las levaduras inmovilizadas en alginato y biocápsulas.
La velocidad de sedimentación se repitió respecto al ejemplo 1 y 2.
Los parámetros enológicos más representativos de los cavas resultantes aparecen en la Tabla 3.
Tabla 3. Análisis de los cavas del ejemplo 3
CEPA FORMATO Azúcar (g/L) Grado alcohólico (% vol) pH Acidez total (g/L) Acidez volátil (g/L) Ca (mg/L)
P29 Libres 0,9 12,2 2,96 5,5 0,16 43
P29 Alginato 2,9 12,1 2,97 5,8 0,18 56
P29 Biocápsulas 2 12,15 2,95 5,4 0,18 43
Siguiendo la misma tendencia de los otros dos ejemplos, el cava elaborado con perlas de alginato cálcico presentó concentraciones de calcio superiores. Respecto al azúcar fermentable, en los dos formatos de inmovilización se detectaron concentraciones más elevadas que en las botellas con células libres. Igual que en los ejemplos anteriores, el formato alginato fue el que contenía mayor cantidad.
Ejemplo 4: Elaboración de vino espumoso 'cava' con biocápsulas de distinto tamaño.
Se emplearon biocápsulas obtenidas a partir de S. cerevisae cepa P29 y Penicillium chrysogenum. La velocidad de agitación orbital, según el procedimiento de obtención de biocápsulas, se varió para conseguir esferas de distinto tamaño.
  • esferas entre 0,6 y 1 cm de diámetro a una velocidad de agitación de 100 rpm
  • esferas entre 0,55 y 0,45 cm de diámetro aplicando una velocidad de 150 rpm y
  • entre 0,2 y 0,3 cm de diámetro con una velocidad de agitación orbital de 200 rpm.
El vino base de partida para la elaboración de cava fue el mismo que el del ejemplo 1 y 2, al que se añadió 22 g/L de azúcar.
El número de biocápsulas inoculadas en cada botella dependió de su diámetro: (a) 5 biocápsulas/750 ml si presentaban un diámetro superior a 0,5 cm; (b) 20 ± 2 biocápsulas/750 ml si el diámetro es aproximadamente de 0,5 cm, y (c) de 180 a 200 biocápsulas/750 ml si las esferas presentan un diámetro inferior a 0,5 cm.
Con este número de biocápsulas se aseguraba un inóculo de 1x106 células/ml de vino base.
La segunda fermentación tuvo lugar a una temperatura estable de 14ºC.
En la figura 4 se muestra la velocidad de fermentación de algunas botellas representativas de estos lotes. En ella se puede comprobar que las que tuvieron mejor cinética de fermentación fueron las correspondientes a los inóculos con biocápsulas de menos de 0,5 cm de diámetro, en segundo lugar la botella con esferas de aproximadamente 0,5 cm de diámetro y por último la que se inoculó con biocápsulas de mayor tamaño. Este comportamiento puede explicarse por la relación superficie/volumen y el número de esferas en cada botella: las botellas que contenían más biocápsulas aunque de más pequeño tamaño presentaban una mayor superficie de contacto (y por tanto, de intercambio de nutrientes) con el medio a fermentar.
Así pues, la presente invención hace referencia a distintas velocidades de toma de espuma, o de segunda fermentación, dependiendo del tamaño aplicado de inmovilizados de levaduras en biocápsulas.
Las pruebas de sedimentación mostraron que las biocápsulas con un diámetro superior a 0,5 cm sedimentaban en el cuello de la botella a los 8 segundos, las botellas que contenían biocápsulas de 0,5 cm de diámetro sedimentaban totalmente entre 15 y 20 segundos y las de menos de 0,5 cm lo hacían entre 40 y 45 segundos.
Ejemplo 5: Elaboración de vino espumoso 'cava' con biocápsulas a dos temperaturas de fermentación.
El procedimiento de esta experiencia presenta los mismos condicionantes que los del ejemplo 2: cepa S. cerevisae P29, vino base descrito en el ejemplo 1 y tres formatos de inoculación de levaduras descritos también en el ejemplo 1.
La variable a experimentar fue la influencia que podía tener una temperatura de segunda fermentación considerada límite: 10ºC, frente a una temperatura estándar: 14ºC.
En la figura 5 se representan las cinéticas fermentativas de los 6 casos estudiados. En ambas temperaturas, las levaduras inmovilizadas en biocápsulas y las levaduras libres tuvieron un comportamiento paralelo, evolucionando a la misma velocidad. Los inóculos de levadura en formato de perlas de alginato cálcico presentaron un retraso tanto al inicio como al final de la fermentación respecto a los otros dos casos tanto a 10ºC como a 14ºC.
Por lo tanto, la presente invención muestra que las levaduras vínicas inmovilizadas en biocápsulas pueden fermentar perfectamente a temperaturas límites, comportándose de igual manera que la inoculación tradicional de levaduras en forma libre.

Claims (9)

  1. Procedimiento de obtención de una bebida alcohólica espumosa, caracterizado porque dicho procedimiento comprende una etapa de fermentación en un recipiente adecuado para contener un líquido a presión utilizando biocápsulas que comprenden una levadura inmovilizada en un hongo filamentoso.
  2. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque el recipiente adecuado para contener un líquido a presión es una botella.
  3. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la bebida alcóholica espumosa es un vino espumoso.
  4. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la levadura se elige entre Saccharomyces cerevisiae y Saccharomyces bayanus.
  5. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el hongo filamentoso es Penicillium chrysogenum.
  6. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5, caracterizado porque se adiciona una cantidad de biocápsulas adecuada para que número mínimo de células de levadura sea 1 x 106 células/ml de vino base.
  7. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque las biocápsulas tienen un diámetro con una dispersión máxima de 10 mm.
  8. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque las biopcápsulas tienen un diámetro inferior a 10 mm.
  9. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la etapa de fermentación comprende la adición de biocápsulas de levadura y hongo filamentoso a un medio de fermentación que comprende al menos vino y azúcar y se realiza dentro de una botella herméticamente cerrada.
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