WO2012175765A1

WO2012175765A1 - Método de valoración de virulencia de cepas de mycobacterium tuberculosis complex y uso de los agregados bacilares de cepas de mycobacterium tuberculosis complex en cultivo líquido para dicha valoración

Info

Publication number: WO2012175765A1
Application number: PCT/ES2012/000170
Authority: WO
Inventors: Clara PRATS SOLER; Isaac LLOPIS FUSTÉ; Daniel LÓPEZ CODINA; Neus CÁCERES CASADEMUNT; Cristina VILAPLANA MASSAGUER; Pere-Joan Cardona Iglesias
Original assignee: Universitat Politecnica de Catalunya UPC; Fundacio Institut dInvestigacio en Ciencies de la Salut Germans Trias i Pujol IGTP
Current assignee: Universitat Politecnica de Catalunya UPC; Fundacio Institut dInvestigacio en Ciencies de la Salut Germans Trias i Pujol IGTP
Priority date: 2011-06-22
Filing date: 2012-06-19
Publication date: 2012-12-27
Anticipated expiration: 2013-12-22
Also published as: ES2394900A1; ES2394900B1

Abstract

Método de valoración de virulencia de cepas de Mycobacterium tuberculosis complex y uso de los agregados bacilares de cepas de Mycobacterium tuberculosis complex en cultivo líquido para dicha valoración. El método propone valorar dicha virulencia a partir del análisis de una o más variables asociadas al tamaño de las agregaciones o agregados bacilares presentes en un cultivo in vitro de dichas cepas en medio líquido, donde dicha variable está relacionada con la velocidad de sedimentación de los agregados bacilares o es o está relacionada con las distribuciones de tamaño (equivalente a considerar las áreas que ocupan) de las agregaciones bacilares presentes en un cultivo in vitro de dichas cepas en medio líquido.

Description

Método de valoración de virulencia de cepas de Mycobacterium tuberculosis complex y uso de los agregados bacilares de cepas de Mycobacterium

tuberculosis complex en cultivo líquido para dicha valoración Campo de la técnica

La presente invención concierne a un método apto para valorar la virulencia de cepas de Mycobacterium tuberculosis complex, a partir del análisis de una o más variables asociadas al tamaño de las agregaciones o agregados bacilares presentes en un cultivo in vitro de dichas cepas en medio líquido.

En función del ejemplo de realización, dicha variable es o está relacionada con la velocidad de sedimentación de los agregados bacilares o es o está relacionada con las distribuciones de tamaño (equivalente a considerar las áreas que ocupan) de las agregaciones bacilares presentes en un cultivo in vitro de dichas cepas en medio líquido.

La invención propone también usar la velocidad de sedimentación y/o la distribución de tamaños de los agregados bacilares de una cierta cepa de Mycobacterium tuberculosis complex, en cultivo líquido para, tras su determinación proceder a la valoración de su virulencia.

La tuberculosis es una enfermedad ocasionada a partir de la infección por vía aérea (generalmente) de los macrófagos alveolares, por el bacilo Mycobacterium tuberculosis. En la mayoría de los casos, la inoculación del bacilo se convierte en una infección latente que puede permanecer durante años controlada gracias a la respuesta inmune del hospedador. Sin embargo, en un porcentaje de un 5%, la infección puede evolucionar hacia enfermedad años después de la inoculación. Este tipo de forma de tuberculosis, llamada post-primaria, se genera usualmente en los lóbulos pulmonares superiores. Esta zona, al tener una concentración de oxígeno más alta que en el resto del pulmón como consecuencia de una menor irrigación capilar, y debido a ello, también hay una menor vigilancia inmunológica contra posible microorganismos patógenos, favorece el crecimiento más rápido del bacilo antes que la respuesta inmune tenga lugar. Cuando ésta se desarrolla, tiene una intensidad mayor a la habitual, debido a la mayor carga bacilar que soporta el tejido.

Como consecuencia se genera un proceso necrótico que no puede ser estructurado, como sucede habitualmente, mediante tejido colágeno, con lo que se genera una licuefacción del tejido y consecuentemente se favorece el crecimiento extracelular del bacilo. De esta manera se perpetua el fenómeno de infección y destrucción de macrófagos y con ello de la destrucción de tejido que lleva a la producción de una gran lesión que llega a erosionar a los bronquios; como resultado se produce el drenaje del tejido licuefactado y la constitución de aerosoles infectados para poder infectar nuevos sujetos, dando lugar a lesión típica de la enfermedad tubeculosa: la lesión cavitada.

Así pues, se puede definir el concepto/parámetro virulencia en las cepas de Mycobacterium tuberculosis como aquella habilidad para crecer rápidamente en el pulmón cuando las condiciones son las adecuadas, para de esta manera generar una respuesta inflamatoria desmesurada y con ello la formación de licuefacción, que es el verdadero punto de partida de una destrucción del tejido importante y con ello la generación de la enfermedad.

Antecedentes de la invención Habitualmente el parámetro de virulencia de una cepa de Mycobacterium tuberculosis complex se ha determinado mediante la caracterización de la velocidad de crecimiento en cultivos in vitro en medios acelulares; o midiendo este parámetro en cultivos de macrófagos ex vivo. También se han utilizado modelos in vivo observando la capacidad de generar lesiones, ya sea en cuanto a número (en cobayas) o en extensión (en ratones).

La CA 2732750 describe un método para detectar una infección con Mycobacterium tuberculosis que comprende detectar la presencia de células CD8+T en una muestra biológica. Breve explicación de la invención

La presente invención concierne a un método de valoración de la virulencia de cepas de Mycobacterium tuberculosis complex, que comprende realizar las siguientes etapas:

M1 ) preparación de un cultivo in vitro en medio líquido de la cepa a analizar, formado por una suspensión líquida con agregados de bacilos de Mycobacterium tuberculosis;

M2) análisis de al menos una variable asociada al tamaño de dichos agregados de bacilos; y

M3) valoración de la virulencia de la cepa a analizar en función de al menos el valor o valores de dicha variable obtenidos mediante dicho análisis. Tras la optimización de un modelo de virulencia basado en la cuantificación de la velocidad de crecimiento en pulmón de ratones durante las dos primeras semanas de la infección tras la inoculación endovenosa de 10⁴ CFUs, se observó que, sorprendentemente, la mayor capacidad virulenta de una cepa se relacionaba con la distribución de tamaños de las agrupaciones bacilares contenidas en su cultivo en medio líquido en la fase tardía del crecimiento logarítmico.

Para un ejemplo de realización, la invención propone, en consecuencia, la determinación y el análisis de la distribución de tamaños y formas de las agrupaciones bacilares de una cierta cepa para la determinación de su potencial virulencia. El proceso a seguir para esta determinación comprende cuatro etapas básicas:

a) realizar dicha etapa M1 ) de preparación de un cultivo líquido de la cepa de Mycobacterium tuberculosis complex a estudiar, según el proceso estándar detallado más adelante;

b) preparación de varias muestras de cada una de las cepas a valorar, tras su crecimiento en el medio líquido hasta la fase tardía del crecimiento logarítmico,

c) determinación, mediante dicho análisis de la etapa M2), de la distribución de tamaños o áreas, y formas de las agrupaciones bacilares de la cepa mediante técnicas de análisis de imagen, técnicas citométricas u otras técnicas de determinación de tamaños que se consideren apropiadas, y

d) valoración, en la etapa M3), de la virulencia de la cepa en función de la distribución obtenida, conforme al siguiente criterio:

• en las cepas rápidas, o más virulentas, en las que se han observado más agregados grandes y menos bacilos libres la distribución es de tipo log-normal, con una frecuencia más alta de agregados de medida intermedia, y

• en las cepas lentas, o menos virulentas, en las que se observan más bacilos libres, la forma de la distribución es una exponencial decreciente.

Para ello, según dicho ejemplo de realización, se propone un método de obtención de muestras y análisis de imagen que permite determinar las distribuciones mencionadas (pasos M2 y M3 del proceso descrito), aunque la invención no se limita a este método, sino que abre la posibilidad de desarrollar otros métodos más eficaces para dicha determinación. Las etapas básicas de dicho método son: disposición de las muestras obtenidas (10 o más) sobre un portaobjetos de vidrio y utilización de un fijador de los bacilos y teñido de la muestra para identificación de los bacilos de Mycobacterium tuberculosis;

obtención de una serie de fotografías con aumento (100 o más aumentos), de cada portaobjetos, a través de microscopía óptica; y

tratamiento de las imágenes para permitir identificar los agregados bacilares

El tratamiento de las imágenes de la etapa iii) comprende, en una realización preferida, los pasos siguientes:

1 ) conversión de las partes representativas de las regiones bacilares en un color diferenciado del color del medio que las rodea;

2) cálculo mediante la ayuda de un programa informático del área total ocupada por cada agrupación bacilar y su excentricidad, obteniendo el área media de los agregados y el porcentaje de agregados pequeños (bacilos libres); y

3) obtención de una distribución de tamaños de los agregados bacilares de cada cepa analizada realizando la media de las distribuciones correspondientes a las diferentes fotografías de cada serie que proporcionan cuantas áreas existen en diferentes intervalos de valores.

Otros ejemplos de realización, o variantes del ejemplo de realización hasta aquí descrito, se hallan descritos en las reivindicaciones adjuntas 8 a 15. Para otro ejemplo de realización, alternativo o complementario al anteriormente descrito, del método propuesto por la presente invención, la etapa M1 ) comprende disponer el cultivo y el medio líquido en un contenedor o cubeta, y dicha variable es o está relacionada con la velocidad de sedimentación, en dicho contenedor, de los agregados de bacilos en dicha suspensión líquida, siendo dicha velocidad de sedimentación función de la distribución de tamaños de los agregados de bacilos, valorándose la virulencia de la cepa, en la etapa M3), en función de dicha velocidad de sedimentación.

Según una implementación de dicho ejemplo de realización, el análisis de la etapa M2) incluye detectar el patrón de velocidad de sedimentación de los agregados de bacilos en la suspensión líquida. Para realizar dicho análisis de la velocidad de sedimentación, el método de la invención comprende utilizar, preferentemente, técnicas de detección de absorbancia, aunque también es posible utilizar cualquier otra técnica considerada adecuada por un experto en la materia.

Otros aspectos de la invención conciernen a un uso de los agregados bacilares de cepas de Mycobacterium tuberculosis complex en cultivo líquido para la valoración de la virulencia de las cepas, que comprende determinar la distribución de tamaños ó áreas, y formas de los agregados bacilares de una cepa de Mycobacterium tuberculosis complex en cultivo líquido para la valoración de su virulencia, así como a un uso de los agregados bacilares de cepas de Mycobacterium tuberculosis complex en cultivo líquido para la valoración de la virulencia de las cepas, que comprende determinar la velocidad de sedimentación de los agregados bacilares de una cepa de Mycobacterium tuberculosis complex en cultivo líquido para la valoración de su virulencia.

Breve descripción de las figuras

La Fig. 1a es un histograma que refleja la proporción en % de los agregados o agrupaciones bacilares en el caso de unas cepas más virulentas y la Fig. 1b corresponde a una fotografía de 100 aumentos obtenida por microscopía óptica de dichos agregados, en donde los bacilos, debido a una tinción, están en un color distinto del color del medio, para un ejemplo de realización del método de la presente invención.

La Fig. 2a es un histograma equivalente pero correspondiente a unas agrupaciones bacilares menos virulentas, apreciando la distinta configuración del histograma. La Fig. 2b es una fotografía de 100 aumentos de los correspondientes agregados.

La Fig. 3 muestra, mediante unos diagramas estadísticos de oblicuidad (skewness), la asimetría de una y otra distribución de bacilos.

La Figura 4 muestra, mediante sendas gráficas que relacionan la absorbancia con el tiempo, los resultados obtenidos mediante simulación para dos cepas con distinto patrón de agregación (en negro y gris), considerando más o menos agregados presentes, los cuales muestran diferentes patrones de sedimentación, para otro ejemplo de realización del método propuesto por la presente invención.

Por último, en la Figura 5, en la imagen de la izquierda se presentan los resultados experimentales de sedimentación de dos cepas clínicas distintas reales, M2 (en gris) y GC (en negro), y en la imagen derecha se muestran los resultados del modelo correspondiente.

Descripción en detalle de la invención

En esta invención se propone, según un ejemplo de realización, el uso del análisis de la distribución de tamaños de las agrupaciones bacilares en un cultivo en medio líquido para determinar la potencial virulencia de una cepa. A continuación se describen con detalle los cuatro pasos del método desarrollado hasta el momento para la determinación de la dicha distribución. Como se ha mencionado anteriormente, los pasos 2 y 3 pueden variar en función de la técnica escogida para la determinación de las distribuciones de tamaños. Se exponen los pasos a seguir utilizando para la determinación de las distribuciones técnicas de análisis de imagen.

En primer lugar se presenta el método experimental utilizado, que comprende las etapas de cultivo in vitro y preparación de muestras. A continuación se describen las técnicas de análisis de imagen utilizadas. Finalmente se detalla el análisis a realizar de la distribuciones obtenidas para la valoración de la virulencia de las cepas.

1. Cultivo in vitro

Para cada cepa se cultivan 10⁷ bacilos en un frasco de vidrio de 250 el. que contiene 150 mi de medio líquido de crecimiento bacteriano del tipo Middlebrook 7H9 (medio que contiene las sales y los aminoácidos necesarios para que crezca el M.tuberculosis), el cual se complementa con 0.2% glicerol, 0.5% del preparado albúmina-dextrosa-catalasa y 0.05% del detergente Tween 80. El glicerol y el preparado albúmina-dextrosa-catalasa ofrecen la fuente de energía que la bacteria requiere para su crecimiento y el Tween 80 evita que se formen agregados bacilares suficientemente grandes para garantizar la homogeneidad durante la toma de la muestra. La concentración bacilar inicial del medio de cultivo es de 10⁵ bacilos/ml. Después el cultivo se mantiene en una incubadora a 37 °C en condiciones de agitación continua (120 rpm) y el tapón del frasco no se cierra por completo para permitir que las bacterias dispongan de oxígeno de forma ilimitada. 2. Preparación de muestras

Para cada punto de la cinética se depositan en un porta-objetos de cristal dos gotas (aproximadamente 20 μΙ) del cultivo bacteriano previamente agitado. Tan pronto como dichas gotas se secan se sumerge el porta-objetos en metanol durante diez minutos; el metanol actúa como fijador ya que engancha las bacterias al cristal y las inactiva de manera que dejan de ser nocivas. Posteriormente se tiñe la muestra con el método de Ziehl-Neelsen, en el que se distinguen los bacilos de Mycobacterium tuberculosis por teñido de color entre rosa y fucsia, quedando diferenciados del medio que los rodea.

Se realiza el proceso explicado en el párrafo anterior un total de 8-10 veces, y de cada porta-objetos se obtiene una fotografía de 100 aumentos a través de microscopía óptica (Nis Elements imaging software (Nikon, Japan)). Todas estas fotografías son en color, y en las mismas los bacilos, debido a la tinción, aparecen en un color diferente del medio Para una evaluación de la virulencia solamente es preciso utilizar las fotografías obtenidas al final de la fase exponencial de crecimiento (10 días).

3. Tratamiento de imágenes para obtener distribuciones y medidas Para comparar y distinguir las diferentes cepas se ha utilizado el programa

Matlab, versión 7.9.0.529, con el cual se puede hacer un tratamiento de imágenes suficiente. Se pueden utilizar otros programas de tratamiento de imágenes que permitan identificar los agregados bacilares y después poder extraer las características principales: medida y número.

El tratamiento aplicado consiste en convertir las fotografías en escala de grises, donde claramente las regiones bacilares son oscuras y el medio es claro, por tanto quedan diferenciadas. Entonces se realiza una conversión a blanco y negro, donde cada píxel gris por encima de un cierto umbral pasa a ser negro y en caso contrario pasa a ser blanco. Otras formas de hacerlo serían a partir de la fotografía original, utilizando el código RGB (colores primarios: red, green, blue) y aplicando que dentro de un rango del vector RGB sea contado como negro y fuera de este rango lo considere blanco.

De esta forma se obtienen un conjunto de agregados negros. De forma automática, el programa calcula el número de agregados por fotografía y el área total ocupada por bacilos. Después, de cada agregado, el programa determina su área y su excentricidad (es decir, su grado de alargamiento) y otras características que te definen su forma, las cuales pueden ser útiles para diferentes cálculos, a pesar de que para determinar la virulencia sólo se precisa el área. Como consecuencia de éste proceso se obtiene el área media de los agregados, el porcentaje de agregados pequeños (bacilos libres) o diferentes medidas que se puedan realizar.

Se observó que aparecen agregados muy pequeños (de la medida del

Mycobacterium tuberculosis: 0.2-6 pm²) y otros más grandes, formados por más de un bacilo. En ciertas situaciones se aprecian agregados con centenares o miles de bacilos. Por tanto, existe una gran diversidad de medidas, que es relevante ordenarla para entender qué sucede. Es necesario destacar que se extrae el área de los agregados en píxeles y, sabiendo la resolución de la cámara, es inmediato calcular el área en las unidades físicas correspondientes.

Como resultado de esto se obtiene la distribución de áreas de una determinada fotografía, cuantas áreas hay en diferentes intervalos de valores, de manera que toda esta diversidad se recoge dibujada en un sólo gráfico. También es interesante hacer la distribución de excentricidades (una variable que va de 0 a 1 , siendo 0 para círculos y 1 para una línea recta), donde es posible ver la distribución de elongaciones que tienen los agregados de cada fotografía. Se obtiene la distribución de tamaños haciendo la media de las distribuciones correspondientes a las diferentes fotografías de cada serie (8-10 fotografías). De esta forma se obtiene la distribución correspondiente a cada una de las cepas a analizar.

4. Correlación virulencia-distribución de tamaños

A través del procedimiento descrito hasta este punto se ha encontrado que existe una correlación importante entre la virulencia de las cepas clínicas y la forma de la distribución de medidas de los agregados de bacilos tuberculosos.

Se distinguen dos tipos de cepas:

• Las cepas rápidas, o más virulentas, en las que se han observado más agregados grandes y menos bacilos libres. La distribución es de tipo log- normal, con una frecuencia más alta de agregados de medida intermedia (Fig.

1a correspondiente a la fotografía de la Fig. 1b).

• Las cepas lentas, o menos virulentas, en las que se observan más bacilos libres. La distribución es una exponencial decreciente (Fig 2a correspondiente a la fotografía de la Fig. 2b).

Se conoce una herramienta estadística denominada skewness (oblicuidad), que permite, dada una distribución obtener su asimetría, y de forma directa nos distingue dos tipos de cepas. Un valor de skewness alto, significa que la cepa es poco virulenta, un valor bajo que es muy virulenta.

De la misma forma, se ha observado que la proporción de bacilos libres respecto al número de agregados totales es una variable correlacionada con la virulencia, si la proporción de bacilos libres es alta la cepa es poco virulenta, si es baja muy virulenta (Fig. 3).

Otro ejemplo de realización se basa en que la absorbancia de una cubeta llena de una suspensión líquida con agregados de bacilos de Mycobacterium tuberculosis no es constante, sino que decrece con el tiempo. Eso es debido a que los agregados van sedimentando y caen por debajo del detector de la luz transmitida que da lugar a la lectura de la absorbancia.

En los experimentos realizados con cultivos líquidos de diferentes cepas clínicas los presentes inventores han observado que los patrones de velocidad de sedimentación eran distintos.

Este comportamiento tiene un paralelismo con la distribución de agregados de bacilos determinada mediante técnicas de microscopía explicada anteriormente. Los presentes inventores sostienen que ambas informaciones son la misma porque, a pesar de que la sedimentación es un proceso físicamente complejo, un modelo sencillo de agregados cayendo a una velocidad constante proporcional a su tamaño (como rige la hidrodinámica) captura esencialmente el comportamiento experimental. En consecuencia, ambas técnicas son equivalentes, correspondiendo cada una de tales técnicas a diferentes ejemplos de realización del método propuesto por la presente invención.

En la Figura 4 se observa cómo tal modelo sencillo da resultados diferentes en la sedimentación para dos cepas con distinto patrón de agregación (en negro y gris), considerando más o menos agregados presentes. En el modelo se han readaptado los pasos de tiempo para simular tiempos experimentales, medidos en segundos (s).

En la Figura 5, en la imagen de la izquierda se presentan los resultados experimentales de sedimentación de dos cepas clínicas distintas reales, M2 (en gris) y GC (en negro), que fueron respectivamente consideradas como rápida y lenta de acuerdo a sus resultados en el ensayo de estudio de distribución de agregados mediante análisis de gotas. Cada una de ellas tiene una distribución de tamaños diferente (log-normal la M2 y exponencial la GC). Los resultados del modelo correspondiente, o modelización, se muestran a la derecha de la misma figura. En dicho modelo se asimilaron las distribuciones de tamaños experimentales para producir la sedimentación modelizada usando ecuaciones sencillas de dinámica de partículas en un fluido. La figura sirve para mostrar que el modelo se ajusta a la realidad determinada experimentalmente, por lo que a grandes rasgos comprendemos el fenómeno.

Los resultados presentados demuestran que la medida de la sedimentación de muestras de cultivos líquidos de Mycobacterium tuberculosis es un dato interesante para caracterizar diferentes cepas. Un experto en la materia podría introducir cambios y modificaciones en los ejemplos de realización descritos sin salirse del alcance de la invención según está definido en las reivindicaciones adjuntas, pudiéndose, por ejemplo, utilizar una técnica alternativa a la medida de la absorbancia para determinar los patrones de velocidad de sedimentación.

Claims

REIVINDICACIONES

1. - Método de valoración de la virulencia de cepas de Mycobacterium tuberculosis complex, caracterizado porque comprende realizar las siguientes etapas:

M3) valoración de la virulencia de la cepa a analizar en función de al menos el valor o valores de dicha variable obtenidos mediante dicho análisis.

2. - Método de valoración según la reivindicación 1 , caracterizado porque dicha etapa M1) comprende disponer dicho cultivo y medio líquido en un contenedor o cubeta, y porque dicha variable es o está relacionada con la velocidad de sedimentación, en dicho contenedor, de los agregados de bacilos en dicha suspensión líquida, siendo dicha velocidad de sedimentación función de la distribución de tamaños de los agregados de bacilos, valorándose la virulencia de la cepa, en la etapa M3), en función de dicha velocidad de sedimentación.

3. - Método de valoración según la reivindicación 2, caracterizado porque dicho análisis de la etapa M2) incluye detectar el patrón de velocidad de sedimentación de los agregados de bacilos en la suspensión líquida.

4. - Método de valoración según la reivindicación 2 ó 3, caracterizado porque comprende realizar dicho análisis de la velocidad de sedimentación mediante técnicas de detección de absorbancia.

5.- Método de valoración según la reivindicación 1 , caracterizado porque dicha variable es o está relacionada con la distribución de tamaños de los agregados de bacilos en dicha suspensión líquida.

6.- Método de valoración según la reivindicación 5, que se caracteriza por las siguientes etapas:

a) realizar dicha etapa M1 ) de preparación de un cultivo in vitro en medio líquido de la cepa a analizar;

b) obtención de varias muestras del cultivo en la fase tardía de su crecimiento logarítmico;

c) determinación, mediante dicho análisis de la etapa M2), de la distribución de tamaños o áreas, y formas de los agregados bacilares de las muestras y obtención de una distribución promedio de cada cepa; y d) valoración, en la etapa M3), a partir de la forma de dicha distribución de tamaños la virulencia, conforme al siguiente criterio:

• en las cepas rápidas, o más virulentas, en las que se han observado más agregados grandes y menos bacilos libres, la distribución es de tipo log-normal, con una frecuencia más alta de agregados de medida intermedia, y

7.- Método de valoración, según la reivindicación 6, caracterizado porque dicha determinación de las distribuciones de tamaños y forma de los agregados bacilares de las cepas de Mycobacterium tuberculosis a estudiar, cultivadas in vitro en medio líquido, se realiza mediante técnicas de análisis de imagen comprendiendo en relación con las etapas a) a c) citadas las siguientes operaciones:

i. preparación de varias muestras de cada una de las cepas a valorar, tras su crecimiento en un medio líquido hasta la fase tardía del crecimiento logarítmico, disponiéndolas sobre un portaobjetos de vidrio y utilización de un fijador de los bacilos y teñido de la muestra para identificación de los bacilos de Mycobacterium tuberculosis;

ii. obtención de una serie de fotografías con aumento, de cada portaobjetos, a través de microscopía óptica;

iii. tratamiento de las imágenes para permitir identificar los agregados bacilares mediante la conversión de las regiones bacilares en un color diferenciado del color del medio que las rodea;

y porque dicha valoración comprende las siguientes etapas:

iv. cálculo, mediante la ayuda de un programa informático, del área total ocupada por los bacilos en las imágenes, obteniendo el área media de los agregados y el porcentaje de agregados pequeños (bacilos libres); y v. obtención de una distribución de tamaños de los agregados bacilares de cada cepa analizada realizando la media de las distribuciones correspondientes a las diferentes fotografías de cada serie que proporcionan cuantas áreas existen en diferentes intervalos de valores.

8.- Método de valoración según la reivindicación 7, caracterizado porque el número mínimo de muestras por cepa es de 10.

9. - Método de valoración según la reivindicación 7, caracterizado porque se utiliza metanol como fijador de los bacilos y el teñido se realiza con el método de Ziehl- Neelsen.

10. - Método de valoración según la reivindicación 7, caracterizado porque el número de aumentos de las fotografías de microscopía óptica es de al menos 00.

11. - Método de valoración según la reivindicación 7, caracterizado porque el tratamiento de las fotografías para identificación de los agregados bacilares consiste en convertir su contenido a escala de grises, de manera que las regiones bacilares quedan oscuras y el medio resta claro, y para posteriormente ser convertido a blanco (medio) y negro (bacilos y agregados) en función de su tono de gris.

12. - Método de valoración según la reivindicación 7, caracterizado porque el tratamiento de las fotografías expresado para identificación de los agregados bacilares comprende una identificación de los agregados bacilares mediante código RGB, asignando un rango del vector RGB como negro (bacilos y agregados) y fuera del citado rango realizar una conversión a blanco (medio).

13. - Método de valoración según la reivindicación 6, caracterizado porque en la etapa c) se calcula, además del área indicada, la excentricidad, es decir el grado de alargamiento de cada agregado, que se toma en consideración para la etapa d).

14. - Método de valoración según la reivindicación 6 ó 7, caracterizado por llevar a cabo además una técnica estadística de skewness para calcular a partir de la distribución de tamaños la asimetría de la misma y porque un valor de skewness alto indica que la cepa es poco virulenta mientras que si dicho valor es bajo indica que la cepa es muy virulenta.

15. - Método de valoración según la reivindicación 6 ó 7 caracterizada porque se toma en consideración también la proporción de bacilos libres respecto al número de agregados, proporcionando una variable correlacionada con la virulencia y que informa de una cepa poco virulenta si dicha proporción de bacilos libres es alta y califica la cepa de alta virulencia si la indicada proporción es baja.

16. - Uso de los agregados bacilares de cepas de Mycobacterium tuberculosis complex en cultivo líquido para la valoración de la virulencia de las cepas, caracterizado porque comprende determinar la distribución de tamaños ó áreas, y formas de los agregados bacilares de una cepa de Mycobacterium tuberculosis complex en cultivo líquido para la valoración de su virulencia.

17. - Uso de los agregados bacilares de cepas de Mycobacterium tuberculosis complex en cultivo líquido para la valoración de la virulencia de las cepas, caracterizado porque comprende determinar la velocidad de sedimentación de los agregados bacilares de una cepa de Mycobacterium tuberculosis complex en cultivo líquido para la valoración de su virulencia.